JP2019017305A - Method of producing hydrocarbons using microalga - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、微細藻類を用いる炭化水素の生産方法に関する。 The present invention relates to a hydrocarbon production method using microalgae.
世界のエネルギー需要の約85％が化石燃料により賄われているといわれる。常温で液体である石油は、利用しやすい燃料ではあるが、このまま使い続ければ50-60年ほどで尽きてしまうと見られている。近年、埋蔵量に限りがある石油に代わるものとして、生物が作り出す炭化水素が注目されている。 It is said that about 85% of the world's energy demand is covered by fossil fuels. Petroleum, which is liquid at room temperature, is an easy-to-use fuel, but it is expected to run out in about 50-60 years if it is used as it is. In recent years, hydrocarbons produced by living organisms have attracted attention as an alternative to petroleum with limited reserves.
微細藻類は、二酸化炭素（無機炭素）と光エネルギーと水があれば光合成を行い、炭化水素を含む有機物を生産することができる。ボツリオコッカス・ブラウニー（Botryococcus braunii）は、直鎖状の炭化水素を生産可能であり、藻類の中ではもっとも実用化が期待されているものの一つである。Botryococcus brauniiは淡水に生息する緑藻の一種であり、重油相当（C25-37）の長鎖の炭化水素を細胞内に油滴として蓄積するという特徴を有する（非特許文献１）。 Microalgae can produce organic matter containing hydrocarbons by photosynthesis if carbon dioxide (inorganic carbon), light energy and water are present. Botryococcus braunii is capable of producing straight chain hydrocarbons and is one of the most expected to be put to practical use among algae. Botryococcus braunii is a kind of green algae inhabiting fresh water, and has a feature of accumulating long-chain hydrocarbons equivalent to heavy oil (C25-37) as oil droplets in cells (Non-patent Document 1).
また、炭化水素生産能を有する新規微細藻類として、シュードコリシスチス・エリプソイディア・セキグチ・エト・クラノ ジェン・エト・エスピー・ノブ（Pseudochoricystis ellipsoidea Sekiguchi et Kurano gen.et sp.nov.）MBIC11204株およびMBIC11220が知られている（特許文献１）。MBIC11204株は、９種類の炭化水素を生産することが確認された。いずれも直鎖状の炭化水素であり、ｎ−ヘプタデセン（n-heptadecene;C17H34）、ｎ−ヘプタデカン（n-heptadecane;C17H36）、ｎ−オクタデセン（n-octadecene;C18H36）、ｎ−オクタデカン（n-octadecane;C18H38）、ｎ−ノナデセン（n-nonadecene;C19H38）、ｎ−ノナデカン（n-nonadecane;C19H40）の６種と、残り３種はｎ−エイコサジエン（n-eicosadiene;C20H38）で、二重結合が２ヶ所存在するが、いずれも二重結合の位置は特定されていない。また、MBIC11220株は、ｎ−ヘプタデセン（h-heptadecene;C17H34）、ｎ−ヘプタデカン（n-heptadecane;C17H36）、ｎ−ノナデセン（n-nonadecene;C19H38）、ｎ−ノナデカン（n-nonadecane;C19H40）の４種類の炭化水素を生産することが確認された。この微細藻類は淡水に生息し、生育温度域は15℃-30℃である。 In addition, as a novel microalgae having a hydrocarbon-producing ability, Pseudochoricystis ellipsoidea Sekiguchi et Kurano gen. Et sp. Nov. MBIC11204 and Pseudochoricystis ellipsoidea Sekiguchi et Kurano gen. Et sp. Nov. MBIC11220 is known (Patent Document 1). The MBIC11204 strain was confirmed to produce 9 types of hydrocarbons. All are straight-chain hydrocarbons, including n-heptadecene (C17H34), n-heptadecane (C17H36), n-octadecene (C18H36), n-octadecene (n-octadecene; C18H36) 6 types of octadecane (C18H38), n-nonadecene (C19H38) and n-nonadecane (C19H40), and the remaining 3 are n-eicosadiene (C20H38), which is a double bond. Exist in two places, but the position of the double bond is not specified in either case. The MBIC11220 strain is composed of n-heptadecene (C17H34), n-heptadecane (C17H36), n-nonadecene (C19H38), and n-nonadecane (C19H40). It was confirmed that it produces four types of hydrocarbons. These microalgae inhabit freshwater, and the growth temperature range is 15 ° C-30 ° C.
これまで検討されてきた微細藻類の生産する炭化水素には、不飽和のものが多く含まれている。不飽和炭化水素は酸化分解しやすく不安定である。そのため微細藻類の生産する炭化水素は、それのみでは燃料として使用できず、他の燃料に10%程度混合して利用することが行われている。石油と同様の組成で直鎖飽和炭化水素を合成する生物は、報告されていない。 The hydrocarbons produced by microalgae that have been studied so far contain many unsaturated ones. Unsaturated hydrocarbons are susceptible to oxidative decomposition and are unstable. For this reason, hydrocarbons produced by microalgae cannot be used alone as fuel, and are mixed with other fuels and used at about 10%. No organism has been reported that synthesizes linear saturated hydrocarbons with a composition similar to petroleum.
また、上記のBotryococcus brauniiは淡水性の緑藻であり、最適生育水温が20℃以上であるため、培養プラントの設置は、熱帯、亜熱帯、または温室のような施設内であって、かつ豊富な淡水が利用できる地域に限られる。炭化水素生産に用いる微細藻類としては、豊富に存在する海水で培養できるものが望ましく、さらに比較的低温でも十分に増殖できるものが望ましい。 In addition, the above-mentioned Botryococcus braunii is a freshwater green algae with an optimal growth temperature of 20 ° C or higher, so the culture plant is installed in a facility such as a tropical, subtropical, or greenhouse, and abundant freshwater. Is limited to areas where can be used. As the microalgae used for hydrocarbon production, those that can be cultured in abundant seawater are desirable, and those that can sufficiently grow even at relatively low temperatures are desirable.
発明者らは、海水サンプルから新規微細藻類株を分離し、その解析を行った。その結果、当該株が、イマントニア・ルツンダ（Imantonia rotunda）に属し、また予想外にも直鎖飽和炭化水素の生産能を有することを見出し、本発明を完成した。 The inventors isolated a novel microalgae strain from a seawater sample and analyzed it. As a result, it was found that the strain belongs to Imantonia rotunda and unexpectedly has the ability to produce linear saturated hydrocarbons, thereby completing the present invention.
本発明は、以下を提供する。
［１］ イマントニア（Imantonia）属に属し、下記(a)または(b)からなる18S rRNA遺伝子を有する微細藻類を培養し、培養物を得る工程、及び
培養物から炭化水素を採取する工程
を含む、炭化水素の製造方法：
(a)配列番号１に記載の配列からなるポリヌクレオチド、
(b)配列番号１に記載の配列と90％以上の同一性を有する配列からなるポリヌクレオチド。
［２］ 培養が、5-25℃で実施される、１に記載の製造方法。
［３］ 培養が、海水を含む環境で実施される、１または２に記載の製造方法。
［４］ 培養中の微細藻類の密度が、1×104cells/mL以上である、１から３のいずれか１項に記載の製造方法。
［５］ 炭化水素が、炭素数10-38の直鎖飽和炭化水素のいずれかを含む、１から４のいずれか１項に記載の製造方法。
［６］ １から５のいずれか１項に記載の製造方法で得られた炭化水素を用いることを特徴とする、燃料の製造方法。
［７］ イマントニア属に属し、下記(a)または(b)からなる18S rRNA遺伝子を有する微細藻類：
(a)配列番号１に記載の配列からなるポリヌクレオチド、
(b)配列番号１に記載の配列と95％以上の同一性を有する配列からなるポリヌクレオチド。
［８］ イマントニア・ルツンダ（Imantonia rotunda）FERM P-22332、または
イマントニア属に属し、下記(1)、(2)、(3)および(4)の科学的性質を有する、微細藻類：
(1)色は半透明で大きさは4-5μmである。
(2)2本の鞭毛を有し、遊泳性を有する。
(3)油滴を細胞内に蓄積することができる。
(4)細胞表面は、円石および有機鱗片は観察されず、滑らかである。
［９］ 単離された、７または８に記載の微細藻類。
［１０］ ７または８に記載の微細藻類の抽出物。
［１１］ ７から９のいずれか１項に記載の微細藻類の培養物であって、該微細藻類を1×104cells/mL以上の濃度で含む、培養物。
［１２］ 凍結、脱水または乾燥された、７から９のいずれか１項に記載された微細藻類または１１に記載の培養物。
［１３］ 炭化水素の製造に使用するための、Imantonia属に属し、下記(a)または(b)からなる18S rRNA遺伝子を有する微細藻類の培養物：
(a)配列番号１に記載の配列からなるポリヌクレオチド、
(b)配列番号１に記載の配列と90％以上の同一性を有する配列からなるポリヌクレオチド。
The present invention provides the following.
[1] It includes the steps of culturing microalgae belonging to the genus Imantonia and having the 18S rRNA gene consisting of the following (a) or (b), obtaining a culture, and collecting hydrocarbons from the culture Hydrocarbon production method:
(a) a polynucleotide comprising the sequence set forth in SEQ ID NO: 1,
(b) a polynucleotide comprising a sequence having 90% or more identity to the sequence of SEQ ID NO: 1.
[2] The production method according to 1, wherein the culture is performed at 5-25 ° C.
[3] The production method according to 1 or 2, wherein the culture is performed in an environment containing seawater.
[4] The production method according to any one of 1 to 3, wherein the density of the microalgae in culture is 1 × 10 4 cells / mL or more.
[5] The production method according to any one of 1 to 4, wherein the hydrocarbon includes any of linear saturated hydrocarbons having 10 to 38 carbon atoms.
[6] A method for producing fuel, comprising using the hydrocarbon obtained by the production method according to any one of 1 to 5.
[7] Microalgae belonging to the genus Imantonia and having an 18S rRNA gene consisting of the following (a) or (b):
(a) a polynucleotide comprising the sequence set forth in SEQ ID NO: 1,
(b) a polynucleotide comprising a sequence having 95% or more identity to the sequence described in SEQ ID NO: 1.
[8] Imantonia rotunda FERM P-22332, or the microalgae belonging to the genus Imantonia and having the following scientific properties (1), (2), (3) and (4):
(1) The color is translucent and the size is 4-5μm.
(2) Has two flagella and has swimming ability.
(3) Oil droplets can be accumulated in cells.
(4) The cell surface is smooth with no boulders and organic scales observed.
[9] The microalgae according to 7 or 8, which is isolated.
[10] The extract of microalgae according to 7 or 8.
[11] A culture of the microalgae according to any one of 7 to 9, which contains the microalgae at a concentration of 1 × 10 4 cells / mL or more.
[12] The microalgae according to any one of 7 to 9, or the culture according to 11, which has been frozen, dehydrated or dried.
[13] A microalgae culture belonging to the genus Imantonia and having an 18S rRNA gene consisting of the following (a) or (b) for use in the production of hydrocarbons:
(a) a polynucleotide comprising the sequence set forth in SEQ ID NO: 1,
(b) a polynucleotide comprising a sequence having 90% or more identity to the sequence of SEQ ID NO: 1.
本発明により、イマントニア（Imantonia）属に属する微細藻類を用いた、炭化水素の新規な製造方法が提供される。本発明の炭化水素の製造方法は、豊富に存在する海水を利用することができる。本発明の炭化水素の製造方法は、比較的低温で（例えば10-20℃において）実施することができる。
本発明の炭化水素の製造方法により、直鎖飽和炭化水素が製造できる。
The present invention provides a novel method for producing hydrocarbons using microalgae belonging to the genus Imantonia. The hydrocarbon production method of the present invention can utilize abundant seawater. The hydrocarbon production method of the present invention can be carried out at a relatively low temperature (for example, at 10-20 ° C.).
By the method for producing hydrocarbons of the present invention, linear saturated hydrocarbons can be produced.
本発明は、炭化水素生産性の微細藻類を用いる、炭化水素の製造方法を提供する。炭化水素とは、特に記載した場合を除き、炭素および水素からなる化合物、または脂肪酸、油脂（脂質ということもある。）等の種々の化合物における炭化水素部分をいう。炭化水素には、特定の数の炭素原子を含む、直鎖状、または分枝状の、脂肪族、脂環式または芳香族の炭化水素が含まれる。炭化水素に関し、CX-Yと表す場合、数値範囲X-Yは両端の数値を含む炭素原子の数の範囲を示している。C10-38（C10-C38と表されることもある。）の炭化水素とは、炭素数が10以上38以下の炭化水素から成る群から選択される、いずれかの炭化水素または炭化水素群を指す。 The present invention provides a method for producing hydrocarbons using hydrocarbon-producing microalgae. A hydrocarbon means a hydrocarbon moiety in various compounds such as a compound composed of carbon and hydrogen, or a fatty acid, an oil and fat (sometimes called a lipid), unless otherwise specified. Hydrocarbons include linear or branched, aliphatic, alicyclic or aromatic hydrocarbons containing the specified number of carbon atoms. Regarding hydrocarbons, when expressed as C XY , the numerical range XY indicates the range of the number of carbon atoms including numerical values at both ends. The hydrocarbon of C 10-38 (sometimes expressed as C 10 -C 38 ) is any hydrocarbon or hydrocarbon selected from the group consisting of hydrocarbons having 10 to 38 carbon atoms. Refers to the hydrogen group.
I. 微細藻類
本発明の製造方法においては、炭化水素生産性の微細藻類、より特定すれば、イマントニア属（Imantonia）に属する微細藻類を用いる。炭化水素生産能を有するImantoniaに属する微細藻類であれば、特に限定されないが、本発明に用いることのできる微細藻類の好ましい例は、イマントニア・ルツンダ（Imantonia rotunda）に分類される微細藻類である。
I. Microalgae In the production method of the present invention, hydrocarbon-producing microalgae, more specifically, microalgae belonging to the genus Imantonia are used. Although it will not specifically limit if it is a micro algae which belongs to Imantonia which has a hydrocarbon production ability, The preferable example of the micro algae which can be used for this invention is a micro algae classified into Imantonia rotunda (Imantonia rotunda).
〔新規株〕
好ましい態様においては、炭化水素生産性微細藻類として、本発明者らにより単離された新規な株を用いる。この株は、北極海、より詳細には70°00.06'N, 168°44.96'W, 深度10 mで採取された海水サンプルから単離され、形態観察、および18Sリボソーム遺伝子解析により、Imantonia rotundaに分類されることが分かった。この株は、受託番号FERM P-22332として、2017年4月11日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ １２０号室）に、国立研究開発法人海洋研究開発機構（日本国神奈川県横須賀市夏島町２−５）により、寄託されている。本発明により、このような本発明者らにより単離されたImantonia rotundaの新規な株が提供される。
[New shares]
In a preferred embodiment, a novel strain isolated by the present inventors is used as the hydrocarbon-producing microalgae. This strain was isolated from the Arctic Ocean and more specifically from seawater samples collected at 70 ° 00.06'N, 168 ° 44.96'W, 10 m depth, and obtained in Imantonia rotunda by morphological observation and 18S ribosomal gene analysis. It turns out that it is classified. This stock was assigned to the Patent Biological Depositary Center of the National Institute of Technology and Evaluation (as of April 11, 2017 (Room 2-5-8 Kazusa Kamashichi, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan) as of April 11, 2017 under the accession number FERM P-22332. Deposited by the Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology (2-5 Natsushimacho, Yokosuka City, Kanagawa Prefecture, Japan). The present invention provides a novel strain of Imantonia rotunda isolated by such inventors.
Imantonia rotunda受託番号FERM P-22332は、色は半透明で大きさは4-5μm、Haptiophytaに特徴的な２本の鞭毛を持ち、遊泳性がある。また、Emiliania huxleyi等に見られるLipid Bodyとよく似た油滴を細胞内に蓄積する。他のPrymnesiaceaeに見られるような細胞表面の円石および有機鱗片は観察されず、滑らかな表面を有する（図１および図２）。 Imantonia rotunda accession number FERM P-22332 is translucent in color, 4-5μm in size, has two flagella characteristic of Haptiophyta, and is swimming. In addition, oil droplets similar to Lipid Body found in Emiliania huxleyi etc. accumulate in the cells. Cell surface stones and organic scales as seen in other Prymnesiaceae are not observed and have a smooth surface (FIGS. 1 and 2).
Imantonia rotunda 受託番号FERM P-22332は、下記(1)-(5)の科学的性質を有する。
(1)色は半透明で大きさは4-5μmである。
(2)2本の鞭毛を有し、遊泳性を有する（図２）。
(3)油滴を細胞内に蓄積することができる（図２）。
(4)細胞表面は、円石および有機鱗片は観察されず、滑らかである（図１）。
(5)C10-38の直鎖飽和炭化水素を生産することができる。
Imantonia rotunda accession number FERM P-22332 has the following scientific properties (1)-(5).
(1) The color is translucent and the size is 4-5μm.
(2) It has two flagella and has swimming ability (FIG. 2).
(3) Oil droplets can be accumulated in cells (FIG. 2).
(4) The cell surface is smooth with no boulders and organic scales observed (FIG. 1).
(5) C 10-38 linear saturated hydrocarbon can be produced.
Imantonia rotunda 受託番号FERM P-22332はまた、下記の培養上の性質を有する。
(1)培地: L1培地(Guillard. R. R. L., Hargraves. P. E. Stichochrysis immobilis is a diatom. not a chrysophyte. Phycologia 32:234-236. (1993))により培養できる。他に、f/2培地（Guillard, R. R. L., Ryther, J. H. Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (Cleve) Gran. Can. J. Microbiol., 8, 229-239(1962)）でも培養できる。
(2)培養温度:10-20℃で培養できる。
(3)培養期間:2-4週間培養できる。
(4)培養方法:静置培養が適する。
(5)光要求性:下記の条件で培養することができる。
光条件：白色蛍光灯
光強度：10μmol/m2・s、または45μE
明暗周期:明期時間12時間/暗期時間12時間、または明期時間16時間/暗期時間8時間
Imantonia rotunda accession number FERM P-22332 also has the following culture properties:
(1) Medium: L1 medium (Guillard. RRL, Hargraves. PE Stichochrysis immobilis is a diatom. Not a chrysophyte. Phycologia 32: 234-236. (1993)). In addition, f / 2 medium (Guillard, RRL, Ryther, JH Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (Cleve) Gran. Can. J. Microbiol., 8, 229-239 (1962) ) Can also be cultured.
(2) Culture temperature: Can be cultured at 10-20 ° C.
(3) Culture period: Can be cultured for 2-4 weeks.
(4) Culture method: stationary culture is suitable.
(5) Light requirement: It can be cultured under the following conditions.
Light condition: White fluorescent light Light intensity: 10μmol / m 2 · s or 45μE
Light / dark cycle: Light period 12 hours / dark period 12 hours, or light period 16 hours / dark period 8 hours
L1培地は、下記の成分（終濃度）を海水に加えて、加熱滅菌することにより調製できる。 The L1 medium can be prepared by adding the following components (final concentration) to seawater and sterilizing by heating.
培地のpH（滅菌前）は、pH8.2とすることができる。加熱温度・時間は、120℃、15分とすることができる。長期保存のためには、継代培養することができる。継代培養は、上記と同じ培養条件で行い、上記のいずれかの培地で50倍に希釈することによって実施できる。植継間隔は、約2週間毎とすることができる。植継直後は、培養液が僅かに茶褐色に色づくことがある。培養中には、培養液の色調が濃くなることがある。植継直前には、米溶液の色調の増加が止まることがある。 The pH of the medium (before sterilization) can be adjusted to pH 8.2. The heating temperature and time can be 120 ° C. and 15 minutes. For long-term storage, it can be subcultured. The subculture can be performed under the same culture conditions as described above and diluted 50-fold with any of the above media. The transplanting interval can be about every 2 weeks. Immediately after transplanting, the culture solution may be slightly brownish. During the culture, the color of the culture solution may become dark. Immediately before planting, the increase in the color of the rice solution may stop.
図４および配列表にSEQ ID NO.:1には、Imantonia rotunda受託番号FERM P-22332の18S rRNA遺伝子のヌクレオチド配列（1763塩基長）を示した。この配列は、NCBIから提供されるBLASTプログラムによる解析では、Imantonia sp. MBIC10497 の18S rRNA遺伝子（Sequence ID: AB183605.1）とは1720/1725(99.71%)、Imantonia sp. MBIC10500の18S rRNA遺伝子（Sequence ID: AB183606.1）とは1720/1726(99.65%)同一であり、Imantonia sp. CCMP 1404の18S rRNA遺伝子（Sequence ID: AM491015.1）とは1720/1726(99.65%)同一であり、Imantonia rotunda, strain UIO 101の18S rRNA遺伝子（Sequence ID: AJ246267.1）とは1718/1726(99.54%)同一であり、Imantonia rotunda, strain ALGO HAP23の18S rRNA遺伝子（Sequence ID: AM491014.2）と1692/1696(99.76%)同一である。 In FIG. 4 and the sequence listing, SEQ ID NO.:1 shows the nucleotide sequence (1763 base length) of the 18S rRNA gene of Imantonia rotunda accession number FERM P-22332. According to the BLAST program provided by NCBI, this sequence is 1720/1725 (99.71%) from the 18S rRNA gene of Immantonia sp. MBIC10497 (Sequence ID: AB183605.1), and the 18S rRNA gene of Immantonia sp. MBIC10500 ( Sequence ID: AB183606.1) is identical to 1720/1726 (99.65%), Immantonia sp. CCMP 1404 18S rRNA gene (Sequence ID: AM491015.1) is identical to 1720/1726 (99.65%), Imantonia rotunda, strain UIO 101 18S rRNA gene (Sequence ID: AJ246267.1) is identical to 1718/1726 (99.54%) and Immantia rotunda, strain ALGO HAP23 18S rRNA gene (Sequence ID: AM491014.2) 1692/1696 (99.76%) are identical.
〔他の株〕
本発明の炭化水素の製造方法においては、上記の寄託株以外の、Imantonia rotundaに分類される微細藻類株を用いることができる。本発明者らの検討によると、Imantonia rotundaに分類される微細藻類は、上記の寄託株に限らず、原油と同様の組成のC10-38の直鎖飽和炭化水素を生産する能力が高いと考えられる。
[Other stocks]
In the method for producing hydrocarbons of the present invention, microalgae strains classified as Imantonia rotunda other than the deposited strains described above can be used. According to the study by the present inventors, the microalgae classified as Immantonia rotunda are not limited to the deposited strains described above, and have a high ability to produce C 10-38 linear saturated hydrocarbons having the same composition as crude oil. Conceivable.
Imantonia rotundaは、当該技術分野で公知の方法、例えば形態観察、18S rRNA遺伝子解析等に基づき、同定することができる。なお、本発明や本発明の実施態様を説明する際に、上記の寄託株を用いた場合を例に説明することがあるが、その説明は、Imantonia rotundaに分類される他の微細藻類株を用いた場合にもあてはまる。 Imantonia rotunda can be identified based on methods known in the art, such as morphological observation, 18S rRNA gene analysis, and the like. In the description of the present invention and embodiments of the present invention, there are cases where the above deposited strain is used as an example, but the explanation is based on other microalgae strains classified as Imantonia rotunda. This also applies when used.
好ましい態様においては、Imantonia属に属し、下記(a)または(b)からなる18S rRNA遺伝子を有する微細藻類を用いることができる：
(a)配列番号１に記載の配列からなるポリヌクレオチド、
(b)配列番号１に記載の配列と高い同一性を有する配列からなるポリヌクレオチド。
In a preferred embodiment, microalgae belonging to the genus Imantonia and having an 18S rRNA gene consisting of the following (a) or (b) can be used:
(a) a polynucleotide comprising the sequence set forth in SEQ ID NO: 1,
(b) A polynucleotide comprising a sequence having high identity to the sequence described in SEQ ID NO: 1.
高い同一性とは、たとえば90％以上であることをいい、好ましくは95％以上であり、より好ましくは98.0％以上であり、さらに好ましくは98.5％以上であり、さらに好ましくは99.0％以上であり、さらに好ましくは99.77％以上である。 High identity means, for example, 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 98.0% or more, further preferably 98.5% or more, and further preferably 99.0% or more. More preferably, it is 99.77% or more.
ヌクレオチド配列（塩基配列、または単に配列ということもある。）に関し、同一性とは、特に記載した場合を除き、２つの配列を最適の態様で整列させた場合に、２つの配列間で共有する一致したヌクレオチドの個数の百分率を意味する。同一性％は、（一致した位置の数／位置の全数）×100で算出でき、市販されているアルゴリズムを用いて計算することができる。また、このような計算は、当業者には周知のアルゴリズムまたはプログラム（例えば、BLASTN、BLASTP、BLASTX、ClustalW）により行うことができる。プログラムを用いる場合のパラメーターは、当業者であれば適切に設定することができ、また各プログラムのデフォルトパラメーターを用いてもよい。これらの解析方法の具体的な手法もまた、当業者には周知である。 With respect to nucleotide sequences (also referred to as base sequences or simply sequences), identity is shared between two sequences when the two sequences are aligned in an optimal manner, except as otherwise noted. It means the percentage of the number of matched nucleotides. The percent identity can be calculated by (number of matched positions / total number of positions) × 100, and can be calculated using commercially available algorithms. Further, such calculation can be performed by an algorithm or program (for example, BLASTN, BLASTP, BLASTX, ClustalW) well known to those skilled in the art. Those skilled in the art can appropriately set parameters when using a program, and the default parameters of each program may be used. Specific techniques for these analysis methods are also well known to those skilled in the art.
別の好ましい態様においては、Imantoniaに属し、下記(1)、(2)、(3)および(4)の科学的性質を有する、微細藻類を用いることができる。
(1)色は半透明で大きさは4-5μmである。
(2)2本の鞭毛を有し、遊泳性を有する。
(3)油滴を細胞内に蓄積することができる。
(4)細胞表面は、円石および有機鱗片は観察されず、滑らかである。
このような微細藻類であれば、C10-38の直鎖飽和炭化水素を生産することができると考えられる。
In another preferred embodiment, microalgae belonging to Imantonia and having the following scientific properties (1), (2), (3) and (4) can be used.
(1) The color is translucent and the size is 4-5μm.
(2) Has two flagella and has swimming ability.
(3) Oil droplets can be accumulated in cells.
(4) The cell surface is smooth with no boulders and organic scales observed.
Such microalgae are considered to be able to produce C 10-38 linear saturated hydrocarbons.
〔単離された微細藻類、微細藻類の抽出物、微細藻類の培養物〕
後述する本発明の炭化水素の製造方法には、単離された微細藻類を用いることもでき、また目的の炭化水素の製造を著しく妨げない限り、他の微生物と共存した状態にある微細藻類を用いることもできる。微細藻類に関し、単離とは、特に記載した場合を除き、複数の微生物からなる集団から、特定の微細藻類のみを取り出す（純粋培養する、純菌化する、ということもある。）操作をいう。Imantonia rotundaは自然界では他の微細藻類等と共存しており、単離されたImantonia rotundaは、天然には存在しない。本発明により、単離されたImantonia rotundaが提供される。
[Isolated microalgae, microalgae extract, microalgae culture]
In the method for producing hydrocarbons of the present invention to be described later, isolated microalgae can also be used, and unless the production of the target hydrocarbon is significantly hindered, microalgae coexisting with other microorganisms can be used. It can also be used. With regard to microalgae, isolation refers to an operation of taking out only specific microalgae from a group consisting of a plurality of microorganisms (in some cases, pure culture or pure sterilization), unless otherwise specified. . Imantonia rotunda coexists with other microalgae in nature, and isolated Imantonia rotunda does not exist in nature. The present invention provides isolated Imantonia rotunda.
本発明はまた、Imantonia rotundaの抽出物を提供する。抽出物には、圧搾物、抽出物の分画物、粗精製物、濃縮物、乾燥物、抽出物から単離または精製された特定の成分、例えば、核酸（DNA、およびRNA）、タンパク質、糖類、脂質等が含まれる。 The present invention also provides an extract of Imantonia rotunda. Extracts include pressed products, fractions of extracts, crude products, concentrates, dried products, specific components isolated or purified from extracts, such as nucleic acids (DNA and RNA), proteins, Sugars, lipids and the like are included.
抽出物の原料となるImantonia rotundaは、単離されたものであることが好ましい。単離されたImantonia rotundaから得られる抽出物は、重要な遺伝子、例えば直鎖飽和炭化水素の生合成に関わる遺伝子のクローニングなどにおいて、好適に用いることができると考えられるからである。 It is preferable that Imantonia rotunda used as the raw material of the extract is isolated. This is because the extract obtained from the isolated Imantonia rotunda can be suitably used for cloning important genes, for example, genes involved in the biosynthesis of linear saturated hydrocarbons.
Imantonia rotundaは自然界では、ごく低い密度で存在しており、炭化水素の製造に適した密度や、微細藻類の保存に適した密度では、天然には存在しない。本発明は、Imantonia rotundaを1×104cells/mL以上の密度で含む、培養物も提供する。培養物の好適な例の一つは、Imantonia rotundaを培養に適した密度、すなわち1x105cells/mL以上、好ましくは1x106cells/mL以上で含んだものである。培養物におけるImantonia rotundaの密度の上限は、特に限定されないが、培養または保存に適しているとの観点からは、5x109cells/ml以下であることが好ましく、1x109cells/ml以下がより好ましく、1x108cells/ml以下がさらに好ましい。培養物は、生きたImantonia rotundaの懸濁液の形態である場合があり、またその凍結物、脱水物または乾燥物であってもよい。 Imantonia rotunda exists in nature at a very low density and does not exist in nature at a density suitable for the production of hydrocarbons or for the preservation of microalgae. The present invention also provides a culture containing Imantonia rotunda at a density of 1 × 10 4 cells / mL or more. One suitable example of the culture contains Immantonia rotunda at a density suitable for culture, ie, 1 × 10 5 cells / mL or more, preferably 1 × 10 6 cells / mL or more. The upper limit of the density of Imantonia rotunda in culture is not particularly limited, and the viewpoint from the are suitable for cultivation or storage, preferably at most 5x10 9 cells / ml, more preferably less 1x10 9 cells / ml 1 × 10 8 cells / ml or less is more preferable. The culture may be in the form of a live suspension of Imantonia rotunda and may be frozen, dehydrated or dried.
単離されたImantonia rotunda、抽出物の原料としてのImantonia rotunda、およびImantonia rotundaの培養物のそれぞれにおける、Imantonia rotundaの好ましい例は、次のものである：
・Imantonia属に属し、下記(a)または(b)からなる18S rRNA遺伝子を有する微細藻類：
(a)配列番号１に記載の配列からなるポリヌクレオチド、
(b)配列番号１に記載の配列と95％以上の同一性を有する配列からなるポリヌクレオチド。または
・Imantonia rotunda FERM P-22332、またはImantonia属に属し、下記(1)、(2)、(3)および(4)の科学的性質を有する、微細藻類：
(1)色は半透明で大きさは4-5μmである。
(2)2本の鞭毛を有し、遊泳性を有する。
(3)油滴を細胞内に蓄積することができる。
(4)細胞表面は、円石および有機鱗片は観察されず、滑らかである。
Preferred examples of Imantonia rotunda in each of isolated Imantonia rotunda, Imantonia rotunda as raw material for the extract, and cultures of Imantonia rotunda are as follows:
-Microalgae belonging to the genus Imantonia and having an 18S rRNA gene consisting of the following (a) or (b):
(a) a polynucleotide comprising the sequence set forth in SEQ ID NO: 1,
(b) a polynucleotide comprising a sequence having 95% or more identity to the sequence described in SEQ ID NO: 1. Or ・ Imantonia rotunda FERM P-22332, or microalgae belonging to the genus Imantonia and having the following scientific properties (1), (2), (3) and (4):
(1) The color is translucent and the size is 4-5μm.
(2) Has two flagella and has swimming ability.
(3) Oil droplets can be accumulated in cells.
(4) The cell surface is smooth with no boulders and organic scales observed.
〔ゲノムDNAの塩基配列〕
本発明はまた、Imantonia rotundaのゲノムDNAの塩基配列情報とその利用を提供する。本発明により、Imantonia rotundaの全ゲノムの配列情報が提供される。この配列情報を利用して、所望の炭化水素産生に関連する遺伝子を特定し、それらの遺伝子を利用することができる。ゲノム配列情報および特定の遺伝子の利用には、Imantonia rotundaの遺伝子の解析に有用なＤＮＡアレイを提供すること、遺伝子にコードされたタンパク質を製造すること、遺伝子が関連する炭化水素産生特性を示す藻類を育種すること、遺伝子を用いて形質転換し、増殖および炭化水素産生能に優れた微生物を得ること、形質転換した微生物を用いて炭化水素の製造を行うことが含まれる。
[Genomic DNA base sequence]
The present invention also provides nucleotide sequence information of the genomic DNA of Imantonia rotunda and its use. According to the present invention, sequence information of the whole genome of Imantonia rotunda is provided. Using this sequence information, genes related to the desired hydrocarbon production can be identified and used. Genome sequence information and use of specific genes include providing DNA arrays useful for the analysis of the genes of Imantonia rotunda, producing the proteins encoded by the genes, and algae exhibiting the relevant hydrocarbon production characteristics , Breeding with a gene, obtaining a microorganism excellent in growth and hydrocarbon production ability, and producing a hydrocarbon using the transformed microorganism.
II. 炭化水素の製造方法
本発明の炭化水素の製造方法は、
（１）微細藻類を培養し、培養物を得る工程、及び
（２）培養物から炭化水素を採取する工程
を含む。本発明の製造方法では、炭化水素は、脂肪酸、油脂等の種々の化合物における炭化水素部分として製造される場合がある。すなわち炭化水素の製造方法は、製造される炭化水素が油脂の炭化水素部分である場合は、油脂の製造方法、または油脂組成物の製造方法ということができる。
II. Hydrocarbon Production Method The hydrocarbon production method of the present invention comprises:
(1) culturing microalgae to obtain a culture, and (2) collecting hydrocarbons from the culture. In the production method of the present invention, the hydrocarbon may be produced as a hydrocarbon moiety in various compounds such as fatty acids and fats and oils. That is, the method for producing a hydrocarbon can be said to be a method for producing an oil or fat or a method for producing an oil or fat composition when the hydrocarbon to be produced is a hydrocarbon portion of the oil or fat.
〔微細藻類を培養し、培養物を得る工程〕
培養工程において、培地は、用いる微細藻類を培養できる限り、特に限定されず、公知の種々の培地を使用することができる。微細藻類の培養のための培地として、AF-6培地、Allen培地、BBM培地、C培地、CA培地、CAM培地、CB培地、CC培地、CHU培地、CSi培地、CT培地、CYT培地、D培地、ESM培地、f/2培地、HUT培地、M-11培地、MA培地、MAF-6培地、MF培地、MDM培地、MG培地、MGM培地、MKM培地、MNK培地、MW培地、P35培地、URO培地、VT培地、VTAC培地、VTYT培地、W培地、WESM培地、SW培地、SOT培地が知られている。
[Process of culturing microalgae to obtain a culture]
In the culturing step, the medium is not particularly limited as long as the microalgae used can be cultured, and various known media can be used. As medium for culturing microalgae, AF-6 medium, Allen medium, BBM medium, C medium, CA medium, CAM medium, CB medium, CC medium, CHU medium, CSi medium, CT medium, CYT medium, D medium , ESM medium, f / 2 medium, HUT medium, M-11 medium, MA medium, MAF-6 medium, MF medium, MDM medium, MG medium, MGM medium, MKM medium, MNK medium, MW medium, P35 medium, URO Medium, VT medium, VTAC medium, VTYT medium, W medium, WESM medium, SW medium, and SOT medium are known.
Imantonia rotundaは海生である。したがって、本発明の培養工程は、海水を含む環境で実施することができる。好ましい態様においては、上記の培地のうち、海水系のものを用いることができる。上記の培地のうち、AF-6培地、Allen培地、BBM培地、C培地、CA培地、CAM培地、CB培地、CC培地、CHU培地、CSi培地、CT培地、CYT培地、D培地、HUT培地、M-11培地、MA培地、MAF-6培地、MDM培地、MG培地、MGM培地、MW培地、P35培地、URO培地、VT培地、VTAC培地、VTYT培地、W培地、SW培地、SOT培地は淡水系であるが、これらを適宜改変して用いることもできる。海水を用いる場合、天然のもの（海の水）を用いてもよく、人工海水（海水の組成を模して人工的に調製された液体）を用いてもよい。天然海水は、水を主成分とし、通常、約3.5%の塩分（塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、硫酸カルシウム、塩化カリウム等）を含み、弱アルカリ性である。また「海水を含む環境」は、汽水（河口など淡水と海水が混じりあう水域の水）を用いる場合も包含する。天然の海水や汽水を用いる場合の採取地は、用いる微細藻類を培養できる限り、特に限定されない。培地中における海水や汽水の使用量（海水の割合、濃度）も、用いる微細藻類を培養できる限り、特に限定されない。海水または汽水に上記の培地と比較して不足している成分を追加することにより培地を調製してもよい。培地は、滅菌することができる。 Imantonia rotunda is marine. Therefore, the culture process of the present invention can be performed in an environment containing seawater. In a preferred embodiment, seawater-based media can be used among the above-mentioned media. Among the above media, AF-6 medium, Allen medium, BBM medium, C medium, CA medium, CAM medium, CB medium, CC medium, CHU medium, CSi medium, CT medium, CYT medium, D medium, HUT medium, M-11 medium, MA medium, MAF-6 medium, MDM medium, MG medium, MGM medium, MW medium, P35 medium, URO medium, VT medium, VTAC medium, VTYT medium, W medium, SW medium, SOT medium are fresh water Although these are systems, they can be appropriately modified and used. When seawater is used, natural water (sea water) may be used, or artificial seawater (liquid artificially prepared by imitating the composition of seawater) may be used. Natural seawater contains water as a main component and usually contains about 3.5% of salt (sodium chloride, magnesium chloride, magnesium sulfate, calcium sulfate, potassium chloride, etc.) and is weakly alkaline. The “environment including seawater” also includes the case of using brackish water (water in a water area where fresh water and seawater mix, such as estuaries). The collection place when using natural seawater or brackish water is not particularly limited as long as the microalgae used can be cultured. The amount of seawater and brackish water used in the medium (the ratio and concentration of seawater) is not particularly limited as long as the microalgae used can be cultured. You may prepare a culture medium by adding the component which is deficient compared with said culture medium to seawater or brackish water. The medium can be sterilized.
培地は、培養途中で適宜、追加、交換等することができ、前培養、本培養、増殖期、生産期等の工程に応じ、また培養途中の適当な時期に、変更してもよい。 The medium can be appropriately added or exchanged during the culture, and may be changed according to the steps such as pre-culture, main culture, growth phase, and production phase, or at an appropriate time during the culture.
培養工程において、培養温度（培地水温）は、用いる微細藻類を培養できる限り、特に限定されず、適宜とすることができる。Imantonia rotundaは比較的低温でも十分生育することができ、このような低温での培養は、中緯度帯や寒冷域での実施を容易にし、好ましい。 In the culturing step, the culture temperature (medium water temperature) is not particularly limited as long as the microalgae used can be cultured, and can be set appropriately. Imantonia rotunda can grow sufficiently even at a relatively low temperature, and such low-temperature culture is preferable because it can be easily carried out in the mid-latitude zone and the cold region.
好ましい態様においては、培養工程は、5℃以上25℃以下で行われる。10℃以上20℃以下で行われることがより好ましい。 In a preferred embodiment, the culturing step is performed at 5 ° C or more and 25 ° C or less. More preferably, it is carried out at 10 ° C. or higher and 20 ° C. or lower.
培養工程において、微細藻類の密度は、用いる微細藻類に応じ、適宜とすることができる。培養初期において、微細藻類の密度は、例えば1ｘ103cells/ml以上であり、好ましくは1ｘ104cells/ml以上であり、より好ましくは1ｘ105cells/ml以上である。培養時の微細藻類密度の上限は、培養条件にもよるが、5ｘ109cells/ml以下が好ましく、1ｘ109cells/ml以下がより好ましく、1ｘ108cells/ml以下がさらに好ましい。 In the culturing step, the density of the microalgae can be appropriately determined according to the microalgae used. In the initial stage of culture, the density of microalgae is, for example, 1 × 10 3 cells / ml or more, preferably 1 × 10 4 cells / ml or more, more preferably 1 × 10 5 cells / ml or more. The upper limit of the microalgae density during culturing, depending on the culture conditions, preferably less 5x10 9 cells / ml, more preferably less 1x10 9 cells / ml, more preferably less 1x10 8 cells / ml.
培養工程において、光源は、用いる微細藻類を培養できる限り、特に限定されず、公知の種々の光源を使用することができる。微細藻類の培養に用いることのできる光源としては、太陽光、ＬＥＤ、蛍光灯、白熱球、キセノンランプ、ハロゲンランプ等が知られている。好ましい態様においては、上記の培地のうち、自然エネルギーである太陽光、発光効率のよいＬＥＤ、簡便に利用できる蛍光灯を用いてもよい。光量、および明暗条件は、用いる微細藻類に応じ、適宜とすることができる。 In the culturing step, the light source is not particularly limited as long as the microalgae used can be cultured, and various known light sources can be used. As light sources that can be used for culturing microalgae, sunlight, LEDs, fluorescent lamps, incandescent bulbs, xenon lamps, halogen lamps, and the like are known. In a preferred embodiment, among the above-mentioned culture medium, natural energy such as sunlight, LEDs with high luminous efficiency, and fluorescent lamps that can be easily used may be used. The amount of light and the light / dark conditions can be appropriately determined according to the microalgae used.
培養は静置培養とすることができるが、必要に応じ、撹拌を行ってもよい。微細藻類の培養には、二酸化炭素が必要であるが、大気中の二酸化炭素を利用することができ、また、大気よりも高濃度の二酸化炭素を含む環境を利用することもできる。 The culture can be stationary culture, but may be agitated if necessary. Carbon dioxide is necessary for culturing microalgae, but carbon dioxide in the atmosphere can be used, and an environment containing carbon dioxide at a higher concentration than the atmosphere can also be used.
培養中の培地のpHは、微細藻類の種類に応じ、適宜とすることができるが、培養開始時の培地は、通常4-8の範囲にあり、5-7の範囲にあることが好ましい。培地のpHは、培養に伴って変化する場合がある。そのため、pH緩衝作用のある培地成分を培地中に添加することができる。また、培養期間中に、pH調整作用のある成分を適宜添加してもよい。 The pH of the medium during the cultivation can be appropriately determined according to the type of microalgae, but the medium at the start of the cultivation is usually in the range of 4-8, preferably in the range of 5-7. The pH of the medium may change with culture. Therefore, a medium component having a pH buffering action can be added to the medium. Moreover, you may add suitably the component which has pH adjustment effect | action during a culture | cultivation period.
培養工程は、微細藻類が十分に増殖するまで行うことができ、また対数増殖期を経た微細藻類の増殖がほぼ停止した後、微細藻類内での炭化水素の蓄積を十分とするために、さらに継続して数日間行うことができる。培養期間は、用いる微細藻類の種類や開始時の微細藻類の量に応じて、適宜とすることができるが、0.1-10ｘ106cells/mlで開始した場合、3日以上数か月以下であり、5日以上1か月以下であることが好ましく、7日以上21日以下であることがさらに好ましい。 The culture process can be performed until the microalgae sufficiently proliferate, and after the growth of the microalgae through the logarithmic growth phase has almost stopped, in order to sufficiently accumulate hydrocarbons in the microalgae, It can be continued for several days. The culture period can be set as appropriate depending on the type of microalgae used and the amount of microalgae at the start, but when starting at 0.1-10x10 6 cells / ml, it is 3 days or more and several months or less. It is preferably 5 days or more and 1 month or less, and more preferably 7 days or more and 21 days or less.
〔培養物から炭化水素を採取する工程〕
培養工程により得られた培養物は、必要に応じ、濃縮し、乾燥し、細胞内の炭化水素を採取することができる。本工程は、培養工程で得られた水性スラリーを濃縮する、水性スラリー濃縮工程をさらに含んでもよい。濃縮する手段としては、例えば、濾過を挙げることができる。培養工程で得られた微細藻類の懸濁液を、微細藻類細胞を通過させない程度の孔径（好ましくは1-100μm）を有するメッシュを用いて濾過することにより培地の一部を除去し、濃縮された形態とすることが好ましい。ここで、微細藻類により生産された炭化水素は、通常細胞質中に蓄積されるので、培地を濾液として除去しても、炭化水素の収量を減少させることはない。濃縮することにより、炭化水素抽出工程において、効率的に炭化水素を抽出することができる。濃縮物は、必要に応じさらに含水率を下げ、乾燥してもよい。
[Step of collecting hydrocarbons from the culture]
The culture obtained by the culturing step can be concentrated and dried as necessary to collect intracellular hydrocarbons. This step may further include an aqueous slurry concentration step of concentrating the aqueous slurry obtained in the culturing step. Examples of the means for concentrating include filtration. A portion of the medium is removed and concentrated by filtering the microalgae suspension obtained in the culturing process using a mesh having a pore size (preferably 1-100 μm) that does not allow microalgae cells to pass through. It is preferable to adopt the form. Here, since hydrocarbons produced by microalgae are usually accumulated in the cytoplasm, removal of the medium as a filtrate does not reduce the yield of hydrocarbons. By concentrating, hydrocarbons can be extracted efficiently in the hydrocarbon extraction step. The concentrate may be further reduced in water content and dried as necessary.
濃縮物からの炭化水素の採取方法は、同様の目的の公知の方法を適宜適用することができる。例えば、超音波処理によって微細藻類を破砕し、あるいはプロテアーゼや酵素などによって微細藻類を溶解した後、適切な有機溶媒を用いて抽出する方法がある（例えば、特表2010-530741に記載の方法）。本発明でもこの様な方法を用いることができる。炭化水素の抽出に用いられる溶媒は、微細藻類が生産する炭化水素を溶解し得るものであれば特に限定されない。具体的には、低極性又は非極性の水非混和性媒体であればよく、n-ヘキサン（以下、単にヘキサンと記載することもある。）、またはn-ヘプタンのようなC6-10脂肪族もしくは脂環式炭化水素、またはベンゼンのようなC6-10芳香族炭化水素が好ましく、ヘキサンまたはn-ヘプタンがより好ましい。抽出のために濃縮物と溶媒とを接触させる時間は、10分以上であることが好ましく、10-180分の範囲であることがより好ましく、10-120分の範囲であることが特に好ましい。上記の条件で本工程を実施することにより、炭化水素の抽出効率を高めて炭化水素の収量を向上させることが可能となる。 As a method for collecting hydrocarbons from the concentrate, a known method for the same purpose can be appropriately applied. For example, there is a method in which microalgae are crushed by ultrasonic treatment, or microalgae are dissolved by protease or enzyme and then extracted using an appropriate organic solvent (for example, the method described in JP 2010-530741) . Such a method can also be used in the present invention. The solvent used for hydrocarbon extraction is not particularly limited as long as it can dissolve hydrocarbons produced by microalgae. Specifically, it may be a low-polar or non-polar water-immiscible medium, and C 6-10 fat such as n-hexane (hereinafter sometimes simply referred to as hexane) or n-heptane. An aromatic or alicyclic hydrocarbon, or a C 6-10 aromatic hydrocarbon such as benzene is preferred, and hexane or n-heptane is more preferred. The time for bringing the concentrate into contact with the solvent for extraction is preferably 10 minutes or more, more preferably in the range of 10-180 minutes, and particularly preferably in the range of 10-120 minutes. By carrying out this step under the above conditions, it becomes possible to increase the extraction efficiency of hydrocarbons and improve the yield of hydrocarbons.
炭化水素の抽出に用いられる油性媒体の量が増大すると、炭化水素の収量は向上するが、コストおよび環境負荷の観点からは好ましくない。そのため、微細藻類の乾燥質量に対する抽出溶媒の質量比は、15以下であることが好ましく、0.1-15の範囲であることがより好ましく、0.5-15の範囲であることがさらに好ましく、0.5-6の範囲であることがさらに好ましく、1-6の範囲であることがさらに好ましい。抽出された炭化水素は、減圧蒸発又は分別蒸留等の分離手段によって溶媒と分離することができる。 Increasing the amount of oily medium used for extraction of hydrocarbons improves the yield of hydrocarbons, but is not preferable from the viewpoint of cost and environmental burden. Therefore, the mass ratio of the extraction solvent to the dry mass of microalgae is preferably 15 or less, more preferably in the range of 0.1-15, further preferably in the range of 0.5-15, Is more preferably in the range of 1-6. The extracted hydrocarbon can be separated from the solvent by separation means such as vacuum evaporation or fractional distillation.
抽出した炭化水素がクロロフィルなどの不純物を含む場合は、精製を行ってもよい。精製は、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによるもの、蒸留（例えば、特表2010-539300に記載の蒸留方法）によるものなどがある。本発明でもこの様な方法を用いることができる。 If the extracted hydrocarbon contains impurities such as chlorophyll, purification may be performed. Purification includes silica gel column chromatography and distillation (for example, the distillation method described in JP-T 2010-539300). Such a method can also be used in the present invention.
本発明者らの検討によると、Imantonia rotundaの培養物には、C10-38の直鎖飽和炭化水素が含まれる。詳細には、n-デカン（n-decane）C10H22、n-ウンデカン（n-undecane）C11H24、n-ドデカン（n-dodecane）C12H26、n-トリデカン（n-tridecane）C13H28、n-テトラデカン（n-tetradecane）C14H30、n-ペンタデカン（n-pentadecane）C15H32、n-ヘキサデカン（n-hexadecane）C16H34、n-ヘプタデカン（n-heptadecane）C17H36、n-オクタデカン（n-octadecane）C18H38、n-ノナデカン（n-nonadecane）C19H40、n-エイコサン（n-icosane）C20H42、n-ヘンエイコサン（n-heneicosane）C21H44、n-ドコサン（n-docosane）C22H46、n-トリコサン（n-tricosane）C23H48、n-テトラコサン（n-tetracosane）C24H50、n-ペンタコサン（n-pentacosane）C25H52、n-ヘキサコサン（n-hexacosane）C26H54、n-ヘプタコサン（n-heptacosane）C27H56、n-オクタコサン（n-octacosane）C28H58、n-ノナコサン（n-nonacosane）C29H60、n-トリアコンタン（n-triacontane）C30H62、n-ヘントリアコンタン（n-hentriacontane）C31H64、n-ドトリアコンタン（n-dotriacontane）C32H66、n-トリトリアコンタン（n-tritriacontane）C33H68、n-テトラトリアコンタン（n-tetratriacontane）C34H70、n-ペンタトリアコンタン（n-pentatriacontane）C35H72、n-ヘキサトリアコンタン（n-hexatriacontane）C36H74、n-ヘプタトリアコンタン（n-heptatriacontane）C37H76、n-オクタトリアコンタン（n-octatriacontane）C38H78が含まれることが確認された。また各炭化水素の量は、0.1-30 ng/g dry cellであると確認された。 According to the study by the present inventors, the culture of Imantonia rotunda contains C 10-38 linear saturated hydrocarbon. Specifically, n-decane C 10 H 22 , n-undecane C 11 H 24 , n-dodecane C 12 H 26 , n-tridecane ) C 13 H 28 , n-tetradecane C 14 H 30 , n-pentadecane C 15 H 32 , n-hexadecane C 16 H 34 , n-heptadecane (n -heptadecane) C 17 H 36 , n-octadecane C 18 H 38 , n-nonadecane C 19 H 40 , n-icosane C 20 H 42 , n-heneicosane (N-heneicosane) C 21 H 44 , n-docosane C 22 H 46 , n-tricosane C 23 H 48 , n-tetracosane C 24 H 50 , n N-pentacosane C 25 H 52 , n-hexacosane C 26 H 54 , n-heptacosane C 27 H 56 , n-octacosane C 28 H 58 , n- nonacosane (n-nonacosane) C 29 H 60, n- tri Underlying motive (n-triacontane) C 30 H 62, n- hentriacontane (n-hentriacontane) C 31 H 64, n- dotriacontanoic (n-dotriacontane) C 32 H 66, n- tritriacontanoic (n-tritriacontane ) C 33 H 68 , n-tetratriacontane C 34 H 70 , n-pentatriacontane C 35 H 72 , n-hexatriacontane C 36 H 74 N-heptatriacontane C 37 H 76 and n-octatriacontane C 38 H 78 were confirmed to be contained. The amount of each hydrocarbon was confirmed to be 0.1-30 ng / g dry cell.
Imantonia rotundaが、直鎖飽和炭化水素を生産可能なことはこれまで知られていなかった。また、このような原油に近い組成の炭化水素を生産可能な微細藻類は、これまで知られていなかった。 It has not been known so far that Imantonia rotunda can produce linear saturated hydrocarbons. Moreover, the microalgae which can produce the hydrocarbon of the composition close | similar to such crude oil were not known until now.
得られた炭化水素は、ジェットエンジン燃料として、ガソリンエンジン燃料として、またはディーゼルエンジン燃料として用いることができる。得られた炭化水素は、他の燃料と混合してもよく、また原油に近い組成を有するので、他の燃料と混合することなく、燃料として使用することができる。 The resulting hydrocarbons can be used as jet engine fuel, gasoline engine fuel, or diesel engine fuel. The obtained hydrocarbon may be mixed with other fuels and has a composition close to that of crude oil, so that it can be used as a fuel without mixing with other fuels.
下表に、寄託株に代表されるImantonia rotundaの特徴を、従来の炭化水素生産性微細藻類の代表であるBotryococcus brauniiと比較してまとめた。 The following table summarizes the characteristics of Imantonia rotunda represented by the deposited strain compared to Botryococcus braunii, which is a representative of conventional hydrocarbon-producing microalgae.
以下の実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例によって限定されるものではない。 The present invention will be described more specifically with reference to the following examples. However, the present invention is not limited to the following examples.
I. 新規株の単離、同定
下記にしたがって、新規な株を単離し、シングルクローン化し、同定した。
〔新規株の単離方法〕
1. 70°00.06'N, 168°44.96'W, 深度10 mで採取された海水サンプル20 mLを使用した。
2. 1.の海水に酸化ゲルマニウムを終濃度1mg/Lになるように加えたx1/10 MNK培地180 mL（組成は表３参照）を添加し、蛍光灯の光照射下（光強度：45μE、明：16時間、暗：8時間）、約4℃で浮遊培養フラスコを用い、静置培養する。この時24時間ごとに攪拌する。
3. 2.のサンプルを改変ESM培地（組成は表４参照）で適宜希釈し，蛍光灯の光照射下，約4℃で静置培養する。24時間ごとに攪拌する。
4. 単離株となったことを確認するには、顕鏡観察および18Sリボソーム遺伝子解析によって行う。クローン株の確立にはフローサイトメトリーを使用することができる。
I. Isolation and identification of new strains New strains were isolated, single cloned and identified according to the following.
[Method of isolating new strain]
1. 20 mL of seawater sample collected at 70 ° 00.06'N, 168 ° 44.96'W, depth 10 m was used.
2. Add 180 mL of x1 / 10 MNK medium (composition is shown in Table 3) with germanium oxide added to the seawater of 1 to a final concentration of 1 mg / L, and irradiate with fluorescent light (light intensity: 45 μE) , Light: 16 hours, dark: 8 hours), static culture at about 4 ° C using a suspension culture flask. At this time, stir every 24 hours.
3. Dilute the sample in 2. appropriately with modified ESM medium (see Table 4 for composition), and incubate at 4 ° C under fluorescent light irradiation. Stir every 24 hours.
4. To confirm that it has become an isolated strain, perform microscopic observation and 18S ribosomal gene analysis. Flow cytometry can be used to establish clonal lines.
〔シングルクローン化〕
1. 2.1%のLow melting agar (#16520-050 Invitrogen)をオートクレーブにかけて、少し冷ます（65℃-90℃）。
2. 1mlのAgarを9mlのESM培地と混ぜ、素早く混合する。
3. 0.5mlの培養液を加えて素早く混ぜ、シャーレに流し込んで4℃の冷蔵庫で固める（培養液は1000倍、1万倍、10万倍希釈）
4. 2-3週間程度でコロニーが現れる
5. 顕微鏡下でコロニーをつつき、1mlのESM培地へ植え継ぐ（20-30本程度）
6. 2-3週間後、10％程度の培地にImantonia rotundaが増殖する。
[Single cloning]
1. Apply 2.1% Low melting agar (# 16520-050 Invitrogen) to the autoclave and allow it to cool slightly (65 ℃ -90 ℃).
2. Mix 1 ml Agar with 9 ml ESM medium and mix quickly.
3. Add 0.5 ml of the culture solution, mix quickly, pour into a petri dish and harden in a refrigerator at 4 ° C (culture solution diluted 1000 times, 10,000 times, 100,000 times)
4. Colonies appear in about 2-3 weeks
5. Pick a colony under a microscope and transfer it to 1ml ESM medium (about 20-30)
6. After 2-3 weeks, Imantonia rotunda grows in about 10% medium.
〔特徴観察〕
得られたImantonia rotundaの新規な株の形態を観察した。
[Characteristic observation]
The morphology of the new strain of Imantonia rotunda obtained was observed.
グルタルアルデヒドによる一次固定・自然乾燥法による試料をFE-SEM観察に供した。細胞表面に円石および有機鱗片は観察されない。滑らかな表面を有する（図１）。 Samples by primary fixation and natural drying with glutaraldehyde were subjected to FE-SEM observation. No boulders or organic scales are observed on the cell surface. It has a smooth surface (Figure 1).
得られた株は、ハプト藻に特徴的な２本の鞭毛を持ち、遊泳性である。またEmiliania huxleyiなどに見られるLipid Bodyとよく似た油滴を細胞内に蓄積している（図２）。 The obtained strain has two flagella characteristic of haptophyta and is swimming. In addition, oil droplets similar to Lipid Body found in Emiliania huxleyi are accumulated in the cells (Fig. 2).
得られた株を、前培養の後、10℃、15℃、20℃の各水温で浮遊培養フラスコを用い8日間静置培養した。いずれの水温で培養したものにも、細胞内油滴が観られる（図３）。 The obtained strain was pre-cultured and then statically cultured for 8 days at 10 ° C., 15 ° C., and 20 ° C. using a floating culture flask. Intracellular oil droplets are observed in the cells cultured at any water temperature (FIG. 3).
〔18S rRNAによる分子系統解析〕
単離株の培養液より細胞を回収し、DNA抽出(Qiagen Plant Dneasy plant kit miniを使用)を行い、18S rRNAプライマーによってPCR増幅し、ダイレクトシーケンス法により配列を決定した。決定した配列を、図４および配列表にSEQ ID NO.:1として示した。
[Molecular phylogenetic analysis using 18S rRNA]
Cells were collected from the culture broth of the isolated strain, extracted with DNA (using Qiagen Plant Dneasy plant kit mini), PCR amplified with 18S rRNA primers, and sequenced by direct sequencing. The determined sequence is shown as SEQ ID NO.:1 in FIG. 4 and the sequence listing.
NCBIから提供されるBLASTプログラムによる解析では、Imantonia sp. MBIC10497 の18S rRNA遺伝子（Sequence ID: AB183605.1）とは1720/1725(99.71%)、Imantonia sp. MBIC10500の18S rRNA遺伝子（Sequence ID: AB183606.1）とは1720/1726(99.65%)同一であり、Imantonia sp. CCMP 1404の18S rRNA遺伝子（Sequence ID: AM491015.1）とは1720/1726(99.65%)同一であり、Imantonia rotunda, strain UIO 101の18S rRNA遺伝子（Sequence ID: AJ246267.1）とは1718/1726(99.54%)同一であり、Imantonia rotunda, strain ALGO HAP23の18S rRNA遺伝子（Sequence ID: AM491014.2）と1692/1696(99.76%)同一であった。 According to the analysis by the BLAST program provided by NCBI, the 18S rRNA gene (Sequence ID: AB183605.1) of Immantonia sp. MBIC10497 is 1720/1725 (99.71%), and the 18S rRNA gene of Immantonia sp. MBIC10500 (Sequence ID: AB183606 .1) is identical to 1720/1726 (99.65%), is identical to Immantonia sp. CCMP 1404 18S rRNA gene (Sequence ID: AM491015.1) and is identical to 1720/1726 (99.65%), Immantonia rotunda, strain The 18S rRNA gene of UIO 101 (Sequence ID: AJ246267.1) is identical to 1718/1726 (99.54%), and the 18S rRNA gene (Sequence ID: AM491014.2) and 1692/1696 (Imantonia rotunda, strain ALGO HAP23) 99.76%) were identical.
また、得られた配列から、ハプト藻類の18S rRNA配列ライブラリーの配列を用いて系統樹を作成した。18S rRNA配列と系統解析ソフトMEGA 5.2.2を用いてアライメントを確認後、作成した系統樹を図５に示す。系統樹の妥当性は(Fabien et al. 2009,Edvardsen et al. 2011)の報告と比較し、検証した。新規株は、Imantonia rotundaであると考えられる。新規単離株は、受託番号 FERM P-22332として所定の寄託機関に特許寄託された。 In addition, a phylogenetic tree was created from the obtained sequences using the sequences of the 18S rRNA sequence library of haptoalgae. Fig. 5 shows the phylogenetic tree created after confirmation of alignment using 18S rRNA sequence and phylogenetic analysis software MEGA 5.2.2. The validity of the phylogenetic tree was verified by comparing with the report of (Fabien et al. 2009, Edvardsen et al. 2011). The new strain is believed to be Imantonia rotunda. The new isolate was patent deposited with the designated depository under the deposit number FERM P-22332.
II. 炭化水素の抽出および定量方法
下記にしたがって、単離株（受託番号FERM P-22332）から炭化水素を抽出し、定量した。
II. Hydrocarbon Extraction and Quantification Method Hydrocarbons were extracted from the isolate (Accession No. FERM P-22332) and quantified according to the following.
〔炭化水素の抽出方法〕
器具は極力ガラス製を使用し、予め塩酸洗浄し、450℃で3-4時間焼成の後、使用する。溶媒抽出の過程のみステンレス製容器を使用する。
1. Imantonia rotundaの乾燥細胞を10mg-100mg程度溶媒抽出用のステンレス製セルに分取する。細胞の成長ステージや培養条件により、単位細胞あたりの脂質量は異なってくるため、用いる細胞量は適宜調整する。
2. 高速溶媒抽出装置（ASE-200, DIONEX Japan Ltd.）にて100℃、1500psi (=10343kPa)で20分の条件下にてジクロロメタンとメタノール（9：1容量比）の混合溶媒を用いて全脂質を抽出する。
3. 抽出した脂質を含む上記ジクロロメタン・メタノール混合溶媒を濃縮し、そこに0.5規定の水酸化カリウム／メタノール溶液を加え、80℃で2時間けん化（脂質を酸の塩とアルコールに加水分解する過程）を行う。
4. 3.の溶液を冷まし、ガラス瓶にヘキサンを加えて2分間よく振とうさせ、ヘキサンに脂質成分を溶解させたのち、ヘキサン画分をパスツールピペットでガラス製の試験管に取り出す（この作業をさらに２回繰り返す）。
5. 4.のヘキサンフラクションを1ml程度になるまで濃縮する。
6. 5.をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Rapid Trace SPE Workstation（登録商標）, Zymark Corp.）に、5.のサンプルを添加し、カラムにヘキサンを通す。
7. 6.のヘキサンフラクションを濃縮し、ガラス製カラム（HP-5MS, 長さ60m, 内径0.32mm, 膜厚0.25μm）を搭載したガスクロマトグラフィーにて検出した。ガスクロマトグラフの条件は、装置：Agilent6890N, Agilent Technologies Inc、注入モード：オンカラムインジェクター、注入口温度：トラックオーブン、注入量：2.5μl、カラム流量：2.3ml/min、昇温プログラム：60℃-10℃/min-120℃-5℃/min-310℃（22min）FID検出器付き
[Hydrocarbon extraction method]
The instrument should be made of glass as much as possible, washed with hydrochloric acid in advance, and baked at 450 ° C for 3-4 hours before use. Use stainless steel containers only during the solvent extraction process.
1. Distribute 10 to 100 mg of dried Imantonia rotunda cells into a stainless steel cell for solvent extraction. Since the amount of lipid per unit cell varies depending on the cell growth stage and culture conditions, the amount of cells to be used is appropriately adjusted.
2. Using a mixed solvent of dichloromethane and methanol (9: 1 volume ratio) at 100 ° C and 1500 psi (= 10343kPa) for 20 minutes with a high-speed solvent extraction system (ASE-200, DIONEX Japan Ltd.) Extract total lipids.
3. Concentrate the dichloromethane / methanol mixed solvent containing the extracted lipid, add 0.5N potassium hydroxide / methanol solution, and saponify at 80 ° C for 2 hours (the process of hydrolyzing lipid into acid salt and alcohol) )I do.
4. Cool the solution in 3., add hexane to the glass bottle, shake well for 2 minutes, dissolve the lipid component in hexane, and take out the hexane fraction with a Pasteur pipette into a glass test tube. Repeat two more times).
5. Concentrate the hexane fraction from 4 to about 1 ml.
6. Add the sample of 5 to silica gel column chromatography (Rapid Trace SPE Workstation (registered trademark), Zymark Corp.), and pass hexane through the column.
7. The hexane fraction of 6. was concentrated and detected by gas chromatography equipped with a glass column (HP-5MS, length 60 m, inner diameter 0.32 mm, film thickness 0.25 μm). The conditions of the gas chromatograph are as follows: Instrument: Agilent 6890N, Agilent Technologies Inc, Injection mode: On-column injector, Inlet temperature: Track oven, Injection volume: 2.5 μl, Column flow rate: 2.3 ml / min, Temperature rising program: 60 ° C-10 ° C / min-120 ℃ -5 ℃ / min-310 ℃ （22min） with FID detector
〔炭化水素の同定〕
炭化水素の同定には、ガスクロマトグラフ質量分析計を用いた。同定の確度を高める為に２機関で実施した。
[Identification of hydrocarbon]
A gas chromatograph mass spectrometer was used to identify hydrocarbons. In order to increase the accuracy of identification, it was conducted by two institutions.
海洋研究開発機構：Agilent5973GC/MSD質量分析計。装置の条件は、注入モード：オンカラムインジェクター、注入口温度：トラックオーブン、カラム：HP-5MS（長さ60m, 内径0.25mm, 膜厚0.25μm）、注入量：2.5μl、カラム流量：2.3ml/min、昇温プログラム：60℃-10℃/min-120℃-5℃/min-310℃（42min）、質量分析計条件はイオン化法、イオン源温度230℃、四重極温度：150℃、質量分析モード：スキャンモード、質量レンジ：m/z 50-700 (EI) Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology: Agilent5973GC / MSD mass spectrometer. The conditions of the equipment are: injection mode: on-column injector, inlet temperature: track oven, column: HP-5MS (length 60m, inner diameter 0.25mm, film thickness 0.25μm), injection volume: 2.5μl, column flow rate: 2.3ml / min, temperature rising program: 60 ℃ -10 ℃ / min-120 ℃ -5 ℃ / min-310 ℃ (42min), mass spectrometer conditions are ionization method, ion source temperature 230 ℃, quadrupole temperature: 150 ℃, Mass analysis mode: Scan mode, Mass range: m / z 50-700 (EI)
アジレントテクノロジー（株）アプリケーションセンター：Agilent7200GC/Q-TOF質量分析計を用いた。装置の条件は、注入モード：スプリットレス、注入口温度：320℃、カラム：DB-5ms（長さ30m, 内径0.25mm, 膜厚0.25μm）、注入量：1μl、カラム流量：1.2ml/ml、昇温プログラム：60℃（5min）-20℃/min-130℃-4℃/min-320℃（20min）、質量分析計条件はイオン化法：EI, PCI（メタン1ml/min）、イオン源温度280℃（EI）200℃（PCI）、四重極温度：150℃、質量分析モード：TOF、質量レンジ：m/z 35-800 (EI)、m/z 75-800 (PCI) Agilent Technology Inc. Application Center: An Agilent 7200GC / Q-TOF mass spectrometer was used. The conditions of the equipment are: injection mode: splitless, inlet temperature: 320 ° C, column: DB-5ms (length 30m, inner diameter 0.25mm, film thickness 0.25μm), injection volume: 1μl, column flow rate: 1.2ml / ml , Temperature rising program: 60 ℃ (5min) -20 ℃ / min-130 ℃ -4 ℃ / min-320 ℃ (20min), Mass spectrometer conditions are ionization method: EI, PCI (methane 1ml / min), ion source Temperature 280 ℃ (EI) 200 ℃ (PCI), Quadrupole temperature: 150 ℃, Mass spectrometry mode: TOF, Mass range: m / z 35-800 (EI), m / z 75-800 (PCI)
〔炭化水素の定量〕
炭化水素の定量には、ガスクロマトグラフを用いた。C10 - C38の炭化水素標準物質 (GLScience Inc.)を用い、各炭化水素のFID検出器感度と濃度の関係の検量線を作成し、試料に含まれる各炭化水素の濃度計算を行った。5α-cholestane (GLScience Inc.)を内部標準に用いて回収率を求めた。上記一連の実験による炭化水素の回収率は、C10-C14の炭化水素で60-70％、C15以上の炭化水素で95％以上であり、繰り返し精度はC10-C38炭化水素について濃度の3％以内である。
[Quantification of hydrocarbons]
A gas chromatograph was used for quantification of hydrocarbons. Using a C 10 -C 38 hydrocarbon standard (GLScience Inc.), a calibration curve was created for the relationship between FID detector sensitivity and concentration for each hydrocarbon, and the concentration of each hydrocarbon contained in the sample was calculated. . The recovery rate was determined using 5α-cholestane (GLScience Inc.) as an internal standard. The hydrocarbon recovery rate from the above series of experiments is 60-70% for C 10 -C 14 hydrocarbons and 95% for C 15 and higher hydrocarbons, and the repeatability is about C 10 -C 38 hydrocarbons. Within 3% of concentration.
〔分析結果〕
得られた株（受託番号FERM P-22332）についての以上の分析の結果、試料に含まれる成分とその乾燥細胞重量あたりの濃度を下表に示した。また得られた炭化水素のクロマトグラムを図６に示した。
〔result of analysis〕
As a result of the above analysis on the obtained strain (Accession No. FERM P-22332), the components contained in the sample and their concentrations per dry cell weight are shown in the table below. The chromatogram of the obtained hydrocarbon is shown in FIG.
Imantonia rotundaの細胞から得られた炭化水素は、石油とよく似た組成を示すことが分かった。 Hydrocarbons obtained from Imantonia rotunda cells were found to be similar in composition to petroleum.
III. 培養実験 III. Culture experiments
得られた株（受託番号FERM P-22332）について、培養条件等を検討した。 The culture conditions and the like of the obtained strain (Accession No. FERM P-22332) were examined.
〔方法〕
I.の項の1.- 3.の記載にしたがい前培養を行った株（受託番号FERM P-22332）を浮遊培養フラスコに入れて、10℃、15℃、または20℃で、静置培養した。改変ESM培地（組成は表４参照）を用い、蛍光灯の光照射下（光強度：45μE、明：16時間、暗：8時間）、24時間ごとに攪拌した。細胞量は、750nmの波長で測定される光学密度（OD750：750nmの波長でこれらの培養水を照らした際、どのくらい光強度が弱まるかを測定する）により算出した。
〔Method〕
Place the strain (Accession No. FERM P-22332) that had been pre-cultured as described in 1.- 3. of Section I. into a suspension culture flask and place it at 10 ℃, 15 ℃, or 20 ℃. did. Using a modified ESM medium (see Table 4 for the composition), the mixture was stirred every 24 hours under light irradiation of a fluorescent lamp (light intensity: 45 μE, light: 16 hours, dark: 8 hours). The amount of cells was calculated from the optical density measured at a wavelength of 750 nm (OD750: measure how much the light intensity decreases when these culture waters are illuminated at a wavelength of 750 nm).
〔結果〕
各温度における増殖特性を、下表および図７に示した。また、無極性画分(100%n-ヘキサン）のGC-FIDクロマトグラムを図８に示した。
〔result〕
The growth characteristics at each temperature are shown in the table below and FIG. A GC-FID chromatogram of the nonpolar fraction (100% n-hexane) is shown in FIG.
短期間（2-4日目）であれば、水温が高いほうがよく増殖したが、10日目頃には10℃の培養も他の水温に匹敵する細胞数となった。また、GC-FIDクロマトグラムから、10-20℃のどの水温でも炭化水素を合成することが分かった。 In the short period (2-4 days), the higher the water temperature, the better the growth. On the 10th day, the culture at 10 ° C. had cell numbers comparable to other water temperatures. GC-FID chromatograms showed that hydrocarbons were synthesized at any water temperature of 10-20 ° C.
IV. ゲノムDNA塩基配列の決定
得られた株（受託番号FERM P-22332）のゲノムDNAの塩基配列を特定した。
Imantonia細胞を、20mlのL1培地、培養温度15℃、光量10μEの白色蛍光灯下で培養し、回収した細胞からゲノムDNAをQiagen社 Genome Tipを用いて精製した。
得られたゲノムDNAをPacbio社RSIIシークエンサーを用いてシークエンスした。シークエンス作業はマクロジェン株式会社に委託した。
IV. Determination of genomic DNA base sequence The genomic DNA base sequence of the obtained strain (Accession No. FERM P-22332) was identified.
Imantonia cells were cultured under a white fluorescent lamp with 20 ml of L1 medium, a culture temperature of 15 ° C. and a light intensity of 10 μE, and genomic DNA was purified from the collected cells using Qiagen Genome Tip.
The obtained genomic DNA was sequenced using a Pacbio RSII sequencer. The sequence work was entrusted to Macrogen Corporation.
DNA Polymerase Binding kit P6v2試薬を使用し、SMRT cell 8PacV3 8セル分のfastq形式のシークエンスデータを取得した。合計、1,065,602リード、9,633,300,629 bpの配列が得られた。これらの配列をcanu v1.5(Koren S. et al., 2017 Genome Res.)を用いてアセンブルし、得られた配列に対し、アセンブルに使用した配列をPacbio社配布のSMRT analysis v4.0.0パッケージのpbalignを使用してマッピングし、quiverを使用してアセンブル配列の補正を行った。続いて、Kapa社 Hyper prep kitを使用し、ゲノムDNAからシークエンスライブラリーを調整し、豊橋技術科学大学設置のillumina社MiSeqシークエンサーを用いてシークエンスした。試薬はMiSeq reagent kit v3 600 cycle kitを用い、ライブラリの両端300bpをシークエンスした。リード後半のクオリティの低い配列をfastx tool kit(http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit)を用いて除去し、得られたリードをbwa 0.7.15(Li H. et al., 2009 Bioinformatics)を使用してquiver補正済みの配列に対してマッピングし、ユニークにリードがマップされた領域について、pilon(Walker B. J. et al., 2014 PLoS One)を使用してアセンブル配列の更なる補正を行った。最終的に、合計86,826,871bp、コンティグ数157、最大コンティグ長4,705,222bp、平均コンティグ長553,037bp、N50コンティグ長1,851,323bp、GC含量66.75%のゲノムの塩基配列を取得した。 DNA polymerase binding kit P6v2 reagent was used to obtain fastq format sequence data for 8 cells of SMRT cell 8PacV3. A total of 1,065,602 reads and 9,633,300,629 bp sequences were obtained. These sequences were assembled using canu v1.5 (Koren S. et al., 2017 Genome Res.), And the resulting sequences were used to assemble SMRT analysis v4.0.0 package distributed by Pacbio. The mapping was done using pbalign, and the assembly sequence was corrected using quiver. Subsequently, using a Kapa Hyper prep kit, a sequence library was prepared from genomic DNA, and sequenced using the illumina MiSeq sequencer installed at Toyohashi University of Technology. The reagent used was MiSeq reagent kit v3 600 cycle kit, and 300 bp of both ends of the library were sequenced. The low-quality sequence in the latter half of the read was removed using fastx tool kit (http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit), and the resulting read was bwa 0.7.15 (Li H. et al., 2009 Bioinformatics) Was used to map to quiver-corrected sequences, and for regions with unique reads mapped, pilon (Walker BJ et al., 2014 PLoS One) was used to further correct the assembled sequence. . Finally, a genomic base sequence having a total of 86,826,871 bp, a contig number of 157, a maximum contig length of 4,705,222 bp, an average contig length of 553,037 bp, an N50 contig length of 1,851,323 bp, and a GC content of 66.75% was obtained.
SEQ ID NO.:1, 18S rRNA of Imantonia rotunda FERM P-22332
SEQ ID NOs.:2-158, genome DNA of Imantonia rotunda FERM P-22332
SEQ ID NO.:1, 18S rRNA of Imantonia rotunda FERM P-22332
SEQ ID NOs.:2-158, genome DNA of Imantonia rotunda FERM P-22332
Claims (13)
培養物から炭化水素を採取する工程
を含む、炭化水素の製造方法：
(a)配列番号１に記載の配列からなるポリヌクレオチド、
(b)配列番号１に記載の配列と90％以上の同一性を有する配列からなるポリヌクレオチド。 Hydrocarbons comprising the steps of culturing microalgae belonging to the genus Imantonia and having an 18S rRNA gene comprising the following (a) or (b) to obtain a culture, and collecting hydrocarbons from the culture: Manufacturing method:
(a) a polynucleotide comprising the sequence set forth in SEQ ID NO: 1,
(b) a polynucleotide comprising a sequence having 90% or more identity to the sequence of SEQ ID NO: 1.
(a)配列番号１に記載の配列からなるポリヌクレオチド、
(b)配列番号１に記載の配列と95％以上の同一性を有する配列からなるポリヌクレオチド。 Microalgae belonging to the genus Imantonia and having an 18S rRNA gene consisting of the following (a) or (b):
(a) a polynucleotide comprising the sequence set forth in SEQ ID NO: 1,
(b) a polynucleotide comprising a sequence having 95% or more identity to the sequence described in SEQ ID NO: 1.
イマントニア属に属し、下記(1)、(2)、(3)および(4)の科学的性質を有する、微細藻類：
(1)色は半透明で大きさは4-5μmである。
(2)2本の鞭毛を有し、遊泳性を有する。
(3)油滴を細胞内に蓄積することができる。
(4)細胞表面は、円石および有機鱗片は観察されず、滑らかである。 Imantonia rotunda FERM P-22332, or the microalgae belonging to the genus Imantonia and having the following scientific properties (1), (2), (3) and (4):
(1) The color is translucent and the size is 4-5μm.
(2) Has two flagella and has swimming ability.
(3) Oil droplets can be accumulated in cells.
(4) The cell surface is smooth with no boulders and organic scales observed.
(a)配列番号１に記載の配列からなるポリヌクレオチド、
(b)配列番号１に記載の配列と90％以上の同一性を有する配列からなるポリヌクレオチド。 A culture of microalgae belonging to the genus Imantonia and having an 18S rRNA gene consisting of the following (a) or (b) for use in the production of hydrocarbons:
(a) a polynucleotide comprising the sequence set forth in SEQ ID NO: 1,
(b) a polynucleotide comprising a sequence having 90% or more identity to the sequence of SEQ ID NO: 1.
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