JP2019001774A - ゼラチン誘導体、架橋ゼラチンハイドロゲル及びその多孔体、ならびに、それらの製造方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】 架橋密度が高く、力学強度が高い架橋ゼラチンハイドロゲル及びその多孔体の製造に好ましいゼラチン誘導体、それを用いた架橋ゼラチンハイドロゲル及びその多孔体、ならびに、それらの製造方法を提供すること。【解決手段】 本発明のゼラチンに反応性基が導入されたゼラチン誘導体は、ゼラチンが有するアミノ基がメタクリロイル基と結合しており、ゼラチンが有するヒドロキシ基及びカルボキシル基がメタクリロイルグリセリルエステル基と結合している。【選択図】 図１
Description
本発明は、疾患や事故などの原因で損傷、失った皮膚や骨、軟骨、靭帯、筋肉、気管、食道、神経、血管、膀胱、心臓、肺、腎臓、膵臓、膵臓、肝臓等の生体組織・臓器を修復するために、それらの生体組織・臓器に分化して組織化する細胞を内包し、組織の再生を促進する、ゼラチン誘導体、架橋ゼラチンハイドロゲル及びその多孔体、ならびに、それらの製造方法に関するものである。
事故や病気などの原因で損傷を受けたり、失われたりした皮膚や骨、軟骨、靭帯、筋肉、気管、食道、神経、血管、膀胱、心臓、肺、腎臓、膵臓、膵臓、肝臓等の生体組織・臓器を修復し、治療するために、従来から人工臓器や臓器移植による治療が行われている。しかしながら、人工臓器の場合、天然臓器に比べ機能が十分ではないこと、人工物による磨耗・緩み・破損が生じるなどの問題点がある。生体臓器移植の場合、ドナーの不足という問題に加え、ドナーが他人の場合、免疫応答に起因する拒絶反応という問題や免疫抑制剤の使用に伴う合併症などの医学的リスクが少なからずある。このような問題点の存在により、現在では、生体組織工学の手法で生体組織や臓器を再生して治療する方法は、生体臓器移植と比較してドナーを必要としないことから、理想的であると考えられている。
生体組織工学の方法では、まず生体の細胞を生体外で増殖させ、生体細胞や組織の足場とするハイドロゲルに播種する。これを生体外で培養し、生体組織が形成された後、生体内に移植する。あるいは、生体細胞をハイドロゲルになるゾルと混合した後、欠損部位に注入し、ゲル化させて生体内で生体組織の再生を誘導する。そのため、生体組織の形成を誘導、促進するハイドロゲルは非常に重要な役割を果たしている。このハイドロゲルを形成する材料としては、細胞と混合するときにゾル状態で、細胞と混合した後、ゲル化する性質が要求される。また、生体に影響を及ぼさない性質としての生体適合性や、新しい生体組織が形成すると共に分解・吸収される生体吸収性が要求される。
組織再生のためのハイドロゲルとして、コラーゲンゲル、ゼラチンゲル、ヒアルロン酸ゲル、フィブリンゲル、アルギン酸ゲルなどが用いられる。これらの生体吸収性高分子のハイドロゲルの作製技術として、温度やｐＨ、カルシウム濃度、抗体・抗原反応、光反応などが挙げられる。例えば、コラーゲン水溶液は低温（例えば、４℃）では、ゾル状態で、体温の３７℃になると、ゲル化しハイドロゲルを形成する。アルギン酸はカルシウムイオンが存在しない条件下ではゾルで、カルシウムイオンを添加するとゲル化しハイドロゲルを形成する。また、ゼラチンの場合、ゼラチン分子の側鎖に架橋重合できるメタクリロイル基を導入し、開始剤の存在下で紫外線に露光により重合してハイドロゲルを形成する。しかしながら、これらのハイドロゲルの安定性及びハイドロゲルの力学強度は十分ではない（例えば、非特許文献１）。ハイドルゲル多孔体を作製するために、強度が高いハイドロゲルが必要となる。
また、ハイドロゲルに多孔質構造を導入するため、造孔剤が用いられる。造孔剤として利用されるのはアルギン酸ゲル粒子やゼラチンゲル粒子などである。しかしこれまで、アルギン酸ゲル粒子やゼラチンゲル粒子を作製するために、高濃度のカルシウムイオンや有機溶媒、食用油などが使用されていた（例えば、非特許文献２，３）。しかし、これらの作製条件は内包する細胞のバイアビリティーを低下させることが懸念されるので、細胞に影響を最小に抑えられるゲル粒子の作製方法が望まれる。また、ハイドロゲル多孔体は緻密なハイドロゲルより力学強度が低いので、ハイドロゲルの安定性を高めるため、架橋密度が高いことが望ましい。
Xiaomeng Li, Shangwu Chen, Jingchao Li, Xinlong Wang, Jing Zhang, Naoki Kawazoe, and Guoping Chen; 3D culture of chondrocytes in gelatin hydrogels with different stiffness. Polymers, 8, 269 (15 pages) (2016).
Hongzhi Zhou and Hockin H. K. Xu; The fast release of stem cells from alginate-fibrin microbeads in injectable scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials. 32(30):7503-7513 (2011).
Lei Zeng, Xiaofeng Chen, Qing Zhang, Feng Yu, Yuli Li, Yongchang Yao; Redifferentiation of dedifferentiated chondrocytes in a novel three-dimensional microcavitary hydrogel. J Biomed Mater Res A. 103(5):1693-702 (2015).
しかしながら、非特許文献１のようなメタクリロイル基を導入したゼラチンを用いて作製したゼラチンハイドロゲルの場合、ゼラチンのアミノ基に対してのみ無水メタメタクリル酸と反応させてメタクリロイル基を導入したので、紫外線照射による架橋重合による架橋密度は低く、形成されたハイドロゲルの力学強度は依然として低い。特に、ハイドロゲル多孔体を作製するために、形成したハイドロゲル多孔体の構造と形状を維持するために、高い力学強度のバルクハイドロゲルは必要である。
また、ハイドロゲル多孔体を作製するために用いられた未修飾のゼラチンゲル粒子を作製するために、有機溶媒や油などのゼラチンが溶解しない溶媒や液体が用いられてきた。有機溶媒や油などを用いる場合では、残留した有機溶媒や油は細胞に悪影響を与える懸念がある。さらに、ゼラチンゲル粒子に細胞を内包する際に、細胞とゼラチン水溶液の懸濁液を有機溶媒や油などに滴下、或いは添加してエマルションを調製する際に、有機溶媒や油などによる細胞のバイアビリティーへの悪影響が懸念される。細胞の活性に影響を与えない、細胞を内包するゼラチンゲル粒子の作製方法が望ましい。
本発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、架橋密度が高く、力学強度が高い架橋ゼラチンハイドロゲル及びその多孔体の製造に好ましいゼラチン誘導体、それを用いた架橋ゼラチンハイドロゲル及びその多孔体、ならびに、それらの製造方法を提供することを課題としている。また、温和で細胞毒性がない条件で、架橋密度が高く、力学強度が高くて、細胞を内包した架橋ゼラチンハイドロゲル及びその多孔体を提供することを課題としている。また、温和で細胞毒性がない条件で多孔質構造の造孔剤作製方法を提供することを課題としている。
本発明によるゼラチンに反応性基が導入されたゼラチン誘導体は、前記ゼラチンが有するアミノ基がメタクリロイル基と結合しており、前記ゼラチンが有するヒドロキシ基及びカルボキシル基がメタクリロイルグリセリルエステル基と結合しており、これにより上記課題を解決する。
前記メタクリロイル基の含有率は、前記ゼラチン誘導体１ｇに対して０．０１ｍｍｏｌ以上１０ｍｍｏｌ以下の範囲を満たし、前記メタクリロイルグリセリルエステル基の含有率は、前記ゼラチン誘導体１ｇに対して０．０１ｍｍｏｌ以上１０ｍｍｏｌ以下の範囲を満たしてもよい。
前記メタクリロイル基の含有率は、前記ゼラチン誘導体１ｇに対して０．１ｍｍｏｌ以上１ｍｍｏｌ以下の範囲を満たし、前記メタクリロイルグリセリルエステル基の含有率は、前記ゼラチン誘導体１ｇに対して０．１ｍｍｏｌ以上１ｍｍｏｌ以下の範囲を満たしてもよい。
前記ゼラチンは、動物の骨、動物の皮膚、魚骨、魚皮及び魚鱗の群から少なくとも１つ選択されてもよい。
本発明による上述のゼラチン誘導体を製造する方法は、ゼラチンをメタクリル酸無水物と反応させ、前記ゼラチンが有するアミノ基にメタクリロイル基を結合させたゼラチン一次修飾体を合成する工程と、前記ゼラチン一次修飾体をメタクリル酸グリシジルと反応させ、前記ゼラチン一次修飾体が有するヒドロキシ基とカルボキシ基とにメタクリロイルグリセリルエステル基を結合させたゼラチン二次修飾体である前記ゼラチン誘導体を合成する工程とを包含し、これにより上記課題を解決する。
前記ゼラチン一次修飾体を合成する工程は、１（ｗ／ｖ）％以上５０（ｗ／ｖ）％以下のゼラチン濃度を有するゼラチン水溶液に、前記ゼラチン水溶液に対する前記メタクリル酸無水物の体積比が１００００：１〜１：１を満たすように、前記メタクリル酸無水物を添加してもよい。
前記ゼラチン二次修飾体を合成する工程は、０．１（ｗ／ｖ）％以上４０（ｗ／ｖ）％以下のゼラチン一次修飾体濃度を有するゼラチン一次修飾体水溶液に、前記ゼラチン一次修飾体水溶液に対する前記メタクリル酸グリシジルの体積比が１００００：１〜１：１を満たすように、前記メタクリル酸無水物を添加してもよい。
前記ゼラチン一次修飾体水溶液は、２以上５以下、または、６．５以上８以下の範囲のｐＨを有してもよい。
本発明による架橋ゼラチンハイドロゲル及びその多孔体は、上述のゼラチン誘導体が架橋された架橋体を含有し、これにより上記課題を解決する。
前記ゼラチン誘導体の架橋密度は、０．０２ｍｏｌ／ｍ３以上１００００ｍｏｌ／ｍ３以下の範囲をしてもよい。
細胞を内包してもよい。
前記細胞は、軟骨細胞、骨芽細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、靭帯細胞、脂肪細胞、神経細胞、血管内皮細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、上皮細胞、肝細胞、膵β細胞、腎臓細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、脂肪由来間葉系幹細胞、神経幹細胞、胚性幹細胞、及び、人工多能性幹細胞からなる群から少なくとも１つ選択されてもよい。
本発明による架橋ゼラチンハイドロゲルを製造する方法は、上述のゼラチン誘導体を用い架橋し、これにより上記課題を解決する。
前記ゼラチン誘導体及び光重合開始剤を含有する水溶液を調製する工程と、前記水溶液に紫外線を照射する工程とを包含してもよい。
前記水溶液を調製する工程によって得られた前記水溶液に細胞を懸濁させて細胞懸濁液を調製する工程をさらに包含し、前記水溶液に紫外線を照射する工程は、前記細胞懸濁液に紫外線を照射してもよい。
本発明による架橋ゼラチンハイドロゲル多孔体を製造する方法は、上述のゼラチン誘導体及びゲル粒子を用い架橋し、これにより上記課題を解決する。
前記ゼラチン誘導体及び光重合開始剤を含有する水溶液を調製する工程と、前記水溶液を調製する工程によって得られた前記水溶液にゼラチンハイドロゲルからなるゲル粒子を添加した混合物を調製する工程と、前記混合物に紫外線を照射する工程とを包含してもよい。
前記水溶液を調製する工程によって得られた前記水溶液に細胞を懸濁させて細胞懸濁液を調製する工程をさらに包含してもよい。
前記ゲル粒子は、細胞を内包してもよい。
前記細胞は、動物由来の動物細胞であってもよい。
前記メタクリロイル基の含有率は、前記ゼラチン誘導体１ｇに対して０．０１ｍｍｏｌ以上１０ｍｍｏｌ以下の範囲を満たし、前記メタクリロイルグリセリルエステル基の含有率は、前記ゼラチン誘導体１ｇに対して０．０１ｍｍｏｌ以上１０ｍｍｏｌ以下の範囲を満たしてもよい。
前記メタクリロイル基の含有率は、前記ゼラチン誘導体１ｇに対して０．１ｍｍｏｌ以上１ｍｍｏｌ以下の範囲を満たし、前記メタクリロイルグリセリルエステル基の含有率は、前記ゼラチン誘導体１ｇに対して０．１ｍｍｏｌ以上１ｍｍｏｌ以下の範囲を満たしてもよい。
前記ゼラチンは、動物の骨、動物の皮膚、魚骨、魚皮及び魚鱗の群から少なくとも１つ選択されてもよい。
本発明による上述のゼラチン誘導体を製造する方法は、ゼラチンをメタクリル酸無水物と反応させ、前記ゼラチンが有するアミノ基にメタクリロイル基を結合させたゼラチン一次修飾体を合成する工程と、前記ゼラチン一次修飾体をメタクリル酸グリシジルと反応させ、前記ゼラチン一次修飾体が有するヒドロキシ基とカルボキシ基とにメタクリロイルグリセリルエステル基を結合させたゼラチン二次修飾体である前記ゼラチン誘導体を合成する工程とを包含し、これにより上記課題を解決する。
前記ゼラチン一次修飾体を合成する工程は、１（ｗ／ｖ）％以上５０（ｗ／ｖ）％以下のゼラチン濃度を有するゼラチン水溶液に、前記ゼラチン水溶液に対する前記メタクリル酸無水物の体積比が１００００：１〜１：１を満たすように、前記メタクリル酸無水物を添加してもよい。
前記ゼラチン二次修飾体を合成する工程は、０．１（ｗ／ｖ）％以上４０（ｗ／ｖ）％以下のゼラチン一次修飾体濃度を有するゼラチン一次修飾体水溶液に、前記ゼラチン一次修飾体水溶液に対する前記メタクリル酸グリシジルの体積比が１００００：１〜１：１を満たすように、前記メタクリル酸無水物を添加してもよい。
前記ゼラチン一次修飾体水溶液は、２以上５以下、または、６．５以上８以下の範囲のｐＨを有してもよい。
本発明による架橋ゼラチンハイドロゲル及びその多孔体は、上述のゼラチン誘導体が架橋された架橋体を含有し、これにより上記課題を解決する。
前記ゼラチン誘導体の架橋密度は、０．０２ｍｏｌ／ｍ３以上１００００ｍｏｌ／ｍ３以下の範囲をしてもよい。
細胞を内包してもよい。
前記細胞は、軟骨細胞、骨芽細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、靭帯細胞、脂肪細胞、神経細胞、血管内皮細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、上皮細胞、肝細胞、膵β細胞、腎臓細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、脂肪由来間葉系幹細胞、神経幹細胞、胚性幹細胞、及び、人工多能性幹細胞からなる群から少なくとも１つ選択されてもよい。
本発明による架橋ゼラチンハイドロゲルを製造する方法は、上述のゼラチン誘導体を用い架橋し、これにより上記課題を解決する。
前記ゼラチン誘導体及び光重合開始剤を含有する水溶液を調製する工程と、前記水溶液に紫外線を照射する工程とを包含してもよい。
前記水溶液を調製する工程によって得られた前記水溶液に細胞を懸濁させて細胞懸濁液を調製する工程をさらに包含し、前記水溶液に紫外線を照射する工程は、前記細胞懸濁液に紫外線を照射してもよい。
本発明による架橋ゼラチンハイドロゲル多孔体を製造する方法は、上述のゼラチン誘導体及びゲル粒子を用い架橋し、これにより上記課題を解決する。
前記ゼラチン誘導体及び光重合開始剤を含有する水溶液を調製する工程と、前記水溶液を調製する工程によって得られた前記水溶液にゼラチンハイドロゲルからなるゲル粒子を添加した混合物を調製する工程と、前記混合物に紫外線を照射する工程とを包含してもよい。
前記水溶液を調製する工程によって得られた前記水溶液に細胞を懸濁させて細胞懸濁液を調製する工程をさらに包含してもよい。
前記ゲル粒子は、細胞を内包してもよい。
前記細胞は、動物由来の動物細胞であってもよい。
本発明のゼラチン誘導体は、アミノ基がメタクリロイル基と結合し、ゼラチンが有するヒドロキシ基及びカルボキシル基がメタクリロイルグリセリルエステル基と結合しており、紫外線照射により架橋重合できる反応性基が最大限に導入されている。本発明の架橋ゼラチンハイドロゲル及びその多孔体は、本発明のゼラチン誘導体を用いて製造されるので、架橋密度が高い。その結果、力学強度が高く、形状安定性にすぐれている。しかも細胞をハイドロゲルのバルクにも空孔にも播種できるので、より効率の高い組織再生が可能となる。
本発明の架橋ゼラチンハイドロゲル及びその多孔体の製造方法は、上述のゼラチン誘導体を用いるので、架橋密度が高く、力学強度が高く、形状安定性にすぐれた架橋ゼラチンハイドロゲル及びその多孔体を提供できる。また、温和で細胞毒性がない条件で、細胞を内包する架橋密度が高く、力学強度が高く、形状安定性にすぐれた架橋ゼラチンハイドロゲル及びその多孔体を容易に製造することができる。
以下、図面を参照しながら本発明の実施の形態を説明する。
（実施の形態１）
実施の形態１では、架橋密度が高く、力学強度が高い架橋ゼラチンハイドロゲルあるいはその多孔体を製造するに好ましい、ゼラチン誘導体について説明する。
（実施の形態１）
実施の形態１では、架橋密度が高く、力学強度が高い架橋ゼラチンハイドロゲルあるいはその多孔体を製造するに好ましい、ゼラチン誘導体について説明する。
図１は、本発明のゼラチン誘導体を模式的に示す図である。
本発明のゼラチン誘導体１００は、ゼラチン１１０において、ゼラチンが有するアミノ基がメタクリロイル基１２０と結合し、ゼラチンが有するヒドロキシ基及びカルボキシル基がメタクリロイルグリセリルエステル基１３０と結合している。これらメタクリロイル基１２０及びメタクリロイルグリセリルエステル基１３０は、いずれも、架橋重合可能な反応性基であり、本発明のゼラチン誘導体１００を用いて、架橋ゼラチンハイドロゲルを製造すれば、高い架橋密度及び高い力学的強度を達成し、形状安定性に優れた架橋ゼラチンハイドロゲルを提供できる。また、架橋ゼラチンハイドロゲルの製造時に、造孔剤を用いれば、高い架橋密度及び高い力学的強度を達成し、形状安定性に優れた架橋ゼラチンハイドロゲル多孔体を提供できる。また、架橋ゼラチンハイドロゲルの製造時に細胞を内包すれば、および／または、細胞を内包する造孔剤を用いれば、細胞を内包する架橋ゼラチンハイドロゲル及びその多孔体を提供できる。
本発明のゼラチン誘導体１００は、好ましくは、ゼラチン誘導体１ｇに対するメタクリロイル基１２０の含有率が０．０１ｍｍｏｌ以上１０ｍｍｏｌ以下の範囲を満たし、ゼラチン誘導体１ｇに対するメタクリロイルグリセリルエステル基１３０の含有率が、０．０１ｍｍｏｌ以上１０ｍｍｏｌ以下の範囲を満たす。これにより、架橋強度及び力学的強度を向上できる。
本発明のゼラチン誘導体１００は、より好ましくは、ゼラチン誘導体１ｇに対するメタクリロイル基１２０の含有率が０．１ｍｍｏｌ以上１ｍｍｏｌ以下の範囲を満たし、ゼラチン誘導体１ｇに対するメタクリロイルグリセリルエステル基１３０の含有率が、０．１ｍｍｏｌ以上１ｍｍｏｌ以下の範囲を満たす。これにより、架橋強度及び力学的強度を確実に向上できる。
上記のゼラチン１１０は、ブタやウシ、ヒツジ、ニワトリなどの動物の骨や皮膚などの組織、魚骨、魚皮、魚鱗の群から選択されるいずれか一の素材、或いは複数の素材に由来するゼラチンである。ゼラチン分子の分子量は、好ましくは、１００ダルトン以上１０，０００，０００ダルトン以下の範囲であり、この範囲であれば、水に溶解し、かつハイドロゲルを形成する。ゼラチン分子の分子量は、さらに望ましくは、５００ダルトン以上１，０００，０００ダルトン以下の範囲である。これにより、安定した形状、栄養分や老廃物などの拡散性を備えたハイドロゲルの形成に特に有利である。
なお、アミノ気に結合したメタクリロイル基１２０、ならびに、ヒドロキシ基及びカルボキシル基に結合したメタクリロイルグリセリルエステル基１３０の存在は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法によって容易に確認できる。また、メタクリロイル基およびメタクリロイルグリセリルエステル基の含有率は、ＮＭＲシグナルの積分値によって算出できる。
図２は、本発明のゼラチン誘導体を製造するフローチャートである。
図２を用いて、本発明のゼラチン誘導体１００の製造方法を説明する。以降では、分かりやすさのため、ゼラチン誘導体をゼラチン二次修飾体と称する。これは、後述するように、本発明のゼラチン誘導体はゼラチンに二段階にて反応性基を修飾（導入）させることによって得られるためである。
本発明のゼラチン二次修飾体の製造方法は、ゼラチンをメタクリル酸無水物と反応させ、ゼラチンが有するアミノ基にメタクリロイル基を結合させたゼラチン一次修飾体を合成する工程（図２のステップＳ２１０）、及び、ゼラチン一次修飾体をメタクリル酸グリシジルと反応させ、ゼラチン一次修飾体が有するヒドロキシ基とカルボキシル基とにメタクリロイルグリセリルエステル基を結合させたゼラチン二次修飾体を合成する工程（図２のステップＳ２２０）を含むことを特徴としている。
ゼラチン一次修飾体を合成する工程を詳細に説明する。まず、加温した水溶液にゼラチンを溶かし、ゼラチン水溶液を作製する。ゼラチンを溶かす前記の水溶液は、ｐＨが４〜１１のリン酸緩衝食塩水、または、ＨＥＰＥＳ緩衝液、食塩水、純水であるが、ｐＨが６〜８のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が望ましい。加温した水溶液の温度はゼラチンが溶ける温度で、３０℃〜８０℃であるが、望ましい温度は３５℃〜５５℃である。ゼラチンを加温した水溶液に溶かしたゼラチン水溶液の濃度は１〜５０（ｗ／ｖ）％で、望ましい濃度は５〜２０（ｗ／ｖ）％である。この範囲であれば、均一な撹拌が可能であるため、均一な修飾反応に有利である。
次いで、ゼラチン水溶液を撹拌しながら、メタクリル酸無水物を添加し、反応物と生成物（ここではゼラチン一次修飾体である）とが溶解する温度を保って、暗所で数時間反応させる。ここで、前記のメタクリル酸無水物の添加速度は好ましくは０．０１〜２０．０ｍＬ／ｍｉｎである。この範囲であれば、反応温度を一定に保つ上で有利である。さらに望ましい添加速度は０．１〜５．０ｍＬ／ｍｉｎである。ゼラチン水溶液に対して添加するメタクリル酸無水物の体積仕込み比は好ましくは１００００：１〜１：１である。この範囲であれば、ゼラチンのアミノ基修飾を可能にする。さらに望ましい仕込み比は１００：１〜２：１である。反応温度は３０℃〜８０℃であるが、望ましい温度は３５℃〜５５℃である。反応時間は１０分間〜９６時間であるが、望ましい反応時間は１時間〜４８時間である。
次いで、反応生成物を反応物と生成物とが溶解した状態の温度の純水で希釈し、透析膜を用いて反応物と生成物とが溶解する温度を保って純水中で透析する。これにより、塩類や未反応メタクリル酸無水物を除去し、合成したゼラチン一次修飾体が精製される。ここで、希釈用の純水は超純水であり得る。希釈用の純水の温度は反応物と生成物とが溶液のままで維持できる温度に保持され、好ましくは３０℃〜８０℃であるが、望ましい温度は３５℃〜６０℃である。生成物の精製に用いられる透析膜の分画分子量は合成したゼラチン一次修飾体と、未反応のメタクリル酸無水物及び塩類の低分子とを分離できる範囲でよい。
次いで、精製したゼラチン一次修飾体の水溶液を凍結乾燥し、ゼラチン一次修飾体の固形物を得てもよい。凍結乾燥時間は凍結物から水分を除去できる時間であれば特に制限はないが、例示的には、１日〜１か月である。望ましい凍結乾燥時間は２日〜２週間である。このようにして、ゼラチンが有するアミノ基にメタクリロイル基が結合したゼラチン一次修飾体が得られる。
ゼラチン二次修飾体を合成する工程を詳細に説明する。まず、ゼラチン一次修飾体を温水に溶かして水溶液を調製した後、水溶液のｐＨを調整する。前記のゼラチン一次修飾体を溶かす温水にはイオン交換水、蒸留水、超純水のいずれも用いることができる。水温はゼラチン一次修飾体を溶かす温度で２５℃〜８０℃であるが、望ましい温度は３５℃〜５５℃である。ゼラチン一次修飾体を温水に溶かしたゼラチン一次修飾体水溶液の濃度は０．１〜４０（ｗ／ｖ）％で、望ましい濃度は０．２〜２０（ｗ／ｖ）％である。この範囲であれば、流動性であるため均一な修飾反応に有利である。ゼラチン一次修飾体水溶液のｐＨを調製に用いる溶液は塩酸や硝酸、硫酸が挙げられるが、望ましいのは塩酸である。ｐＨ調製用の塩酸や硝酸、硫酸の濃度は０．１〜５Ｍで、望ましいのは０．２〜２Ｍである。水溶液のｐＨは、好ましくは１．０〜１０の範囲に調整される。この範囲であれば、後述するメタクリル酸グリシジルとの反応が生じる。なお望ましいｐＨは２〜５の範囲または６．５〜８の範囲である。
次に、メタクリル酸グリシジルを前記ゼラチン一次修飾体水溶液に添加し、反応物と生成物（ここではゼラチン二次修飾体である）とが溶解する温度を保って、暗所で数時間反応させる。前記のメタクリル酸グリシジルの添加速度は好ましくは０．０１〜２０．０ｍＬ／ｍｉｎである。この範囲であれば、反応温度を一定に保つのに有利である。さらに望ましい添加速度は０．１〜５．０ｍＬ／ｍｉｎである。ゼラチン一次修飾体水溶液に対して添加するメタクリル酸グリシジルの体積仕込み比は好ましくは１００００：１〜１：１である。この範囲であれば、ゼラチンのヒドロキシル基およびカルボキシル基の修飾を可能にする。さらに望ましい仕込み比は２５０：１〜３：１である。反応温度は３０℃〜８０℃であるが、望ましい温度は３５℃〜６０℃である。反応時間は１時間〜９６時間であるが、望ましい反応時間は２時間〜４８時間である。
次いで、反応物と生成物とが溶解した状態の温度の水で反応液を希釈し、透析膜を用いて反応物と生成物とが溶解する温度を保って、純水中で透析する。これにより、塩類、未反応メタクリル酸グリシジル、未反応のゼラチン一次修飾体を除去し、合成したゼラチン二次修飾体が精製される。ここで、希釈用の水にはイオン交換水、蒸留水、超純水のいずれも用いることができる。希釈用の水の温度は、反応物と生成物とが溶液のままで維持できる温度に保持され、好ましくは３０℃〜８０℃であるが、望ましい温度は３５℃〜６０℃である。生成物の精製に用いられる透析膜の分画分子量は合成したゼラチン二次修飾体と、未反応のメタクリル酸グリシジル、未反応のゼラチン一次修飾体及び塩類の低分子を分離できる範囲でよい。
次いで、精製したゼラチン二次修飾体の水溶液を凍結乾燥し、ゼラチン二次修飾体の固形物を得てもよい。凍結乾燥時間は凍結物から水分を除去できる時間であれば特に制限はないが、例示的には、１日〜１か月である。望ましい凍結乾燥時間は２日〜２週間である。このようにして、ゼラチン一次修飾体のヒドロキシ基とカルボキシル基とにメタクリロイル基及びメタクリロイルグリセリルエステル基が結合したゼラチン二次修飾体が得られる。
（実施の形態２）
実施の形態２では、ハイドロゲルに多孔質構造を形成させるために用いられる造孔剤の製造方法について説明する。
実施の形態２では、ハイドロゲルに多孔質構造を形成させるために用いられる造孔剤の製造方法について説明する。
（１）細胞を内包しないゲル粒子の製造方法
造孔剤として機能するゲル粒子の製造方法は、低温でゼラチンハイドロゲルを作製する工程、及び、得られたゼラチンハイドロゲルをゼラチンハイドロゲルの粒子（例えば、立方体粒子）に切断加工する工程を含むことを特徴としている。
造孔剤として機能するゲル粒子の製造方法は、低温でゼラチンハイドロゲルを作製する工程、及び、得られたゼラチンハイドロゲルをゼラチンハイドロゲルの粒子（例えば、立方体粒子）に切断加工する工程を含むことを特徴としている。
ゼラチンハイドロゲルを作製する工程を詳細に説明する。ゼラチンを、ゼラチンが溶ける温度の温水、リン酸緩衝食塩水、ＨＥＰＥＳ緩衝液、食塩水、細胞培養用の培地、或いはリン酸緩衝食塩水と培地との混合溶液に溶かし、ゼラチン水溶液を調製する。上記のゼラチン水溶液の温度は３７℃〜８０℃で、望ましい温度は４０℃〜６０℃である。ここでも、ゼラチンは、ブタやウシ、ヒツジ、ニワトリなどの動物の骨や皮膚などの組織、魚骨、魚皮、魚鱗の群から選択されるいずれか一の素材、或いは複数の素材に由来するゼラチンである。ゼラチン分子の分子量は、好ましくは、１００ダルトン以上１０，０００，０００ダルトン以下の範囲であり、この範囲であれば、水に溶解し、かつハイドロゲルを形成する。ゼラチン分子の分子量は、さらに望ましくは、５００ダルトン以上１，０００，０００ダルトン以下の範囲である。これにより、安定した形状、栄養分や老廃物などの拡散性を備えたハイドロゲルの形成に特に有利である。
上記の培地は細胞培養に用いる培地で、ダルベッコ変法イーグル培地やイーグル最小必須培地など１種類或いは数種類の混合培地でも良い。培地に血清が含まれていても含まれていなくても良い。血清が含まれる場合、血清の濃度は０．１〜５０％で、望ましい濃度は０．５〜２０％である。上記のリン酸緩衝食塩水と培地との混合溶液の場合、体積混合比は５０：１〜１：５０で、望ましい体積混合比は１０：１〜１：１０である。上記のゼラチン水溶液の濃度は好ましくは０．１〜５０（ｗ／ｖ）％である。この範囲であればハイドロゲルの形成が可能である。さらに望ましい濃度は０．５〜２０（ｗ／ｖ）％である。
次に、ゼラチン水溶液を濾過滅菌用のフィルターメンブレンで滅菌する。上記のゼラチン水溶液の濾過滅菌用のフィルターメンブレンの孔径は０．１〜０．５μｍで、望ましいフィルターメンブレンの孔径は０．１〜０．３μｍである。
濾過滅菌したゼラチン水溶液を低温でゲル化させ、ゼラチンハイドロゲルを形成させる。上記のゼラチン水溶液をゲル化させる温度はゼラチン水溶液をゲル化できる温度であれば特に制限はないが、好ましくは０．５℃〜３０℃の範囲の低温である。これによりハイドロゲルの形成が可能になる。なお望ましい温度は３℃〜１５℃である。このようにしてゼラチンハイドロゲルが作製される。本実施の形態において、低温とは上記範囲を意図している。
次にゼラチンハイドロゲルを切断加工する工程を詳細に説明する。形成したゼラチンハイドロゲルを薄く切断し、薄いゼラチンハイドロゲルのシートを得る。あるいは、ゼラチン水溶液を枠スペースの高さが低くて、枠スペースが広い枠の空間にピペットで注入し、低温でゲル化させ、枠スペースの高さと同じの薄いゼラチンハイドロゲルのシートを形成する。ここで、薄いゼラチンハイドロゲルのシートの厚みは２０μｍ〜２０００μｍで、望ましいのは５０μｍ〜１０００μｍである。ゼラチンハイドロゲルを薄く切断するには、カッターか糸を用いればよい。上記の枠スペースで薄いゼラチンハイドロゲルのシートを形成する場合の枠スペースはシリコーンゴム枠、ガラス枠、プラスチック枠などが利用できる。
次いで、薄いゼラチンハイドロゲルのシートを細断し、ゼラチンハイドロゲルの立方体粒子を作製する。形成したゼラチンハイドロゲルシートを細断するには、カッターか糸かメッシュを用いればよい。メッシュとしてナイロンメッシュやステンレスメッシュなどが利用できる。メッシュの網目サイズは２０μｍ×２０μｍ〜２０００μｍ×２０００μｍで良いが、望ましい網目サイズは５０μｍ×５０μｍ〜１０００μｍ×１０００μｍである。上記のゼラチンハイドロゲルの立方体粒子の一辺の長さは２０μｍ〜２０００μｍで良いが、望ましい網目サイズは５０μｍ〜１０００μｍである。このようにして、ゼラチンハイドロゲルからなる立方体粒子が作製される。このように得られた立方体粒子は、原料に用いたゼラチンは意図的に修飾されておらず、未修飾ゼラチン（純ゼラチンともいう）からなる。
（２）細胞を内包するゲル粒子の製造方法
造孔剤として機能する細胞を内包したゲル粒子の製造方法は、低温で細胞を内包したゼラチンハイドロゲルを作製する工程、及び、得られた細胞を内包したゼラチンハイドロゲルを粒子（例えば立方体粒子）に切断加工する工程を含むことを特徴としている。細胞を内包したゼラチンハイドロゲルの立方体粒子を造孔剤として利用する場合、バルクのハイドロゲル内部に空孔を形成するとともに、形成した空孔内に細胞が残る。
造孔剤として機能する細胞を内包したゲル粒子の製造方法は、低温で細胞を内包したゼラチンハイドロゲルを作製する工程、及び、得られた細胞を内包したゼラチンハイドロゲルを粒子（例えば立方体粒子）に切断加工する工程を含むことを特徴としている。細胞を内包したゼラチンハイドロゲルの立方体粒子を造孔剤として利用する場合、バルクのハイドロゲル内部に空孔を形成するとともに、形成した空孔内に細胞が残る。
細胞を内包したゼラチンハイドロゲルを作製する工程を詳細に説明する。ゼラチン水溶液をフィルターメンブレンで滅菌するまでの工程は、上述の（１）のゼラチンハイドロゲルを作製する工程と同様であるため説明を省略する。濾過滅菌したゼラチン水溶液を、ゼラチン水溶液がゲル化しない温度でできるだけ低い温度に下げる。ここで、上記のゲル化しない温度でできるだけ低くする温度は３７℃である。この温度であればゲル化を防げる。
次いで、温度を下げたゼラチン水溶液に細胞を懸濁させる。細胞が懸濁したゼラチン水溶液を低温でゲル化させ、細胞を内包したゼラチンハイドロゲルを形成させる。上記のゼラチン水溶液の細胞懸濁液の細胞濃度は好ましくは１０３ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〜１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬの範囲である。この範囲であれば、均一な細胞分布と効率のよい増殖とを可能にする。さらに望ましい濃度は１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〜５×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬである。上記のゼラチン水溶液の細胞懸濁液をゲル化させる温度は、０．５℃〜３０℃であるが、望ましい温度は３℃〜１５℃である。このようにして、細胞を内包したゼラチンハイドロゲルが作製される。
上記の細胞には、ヒトやその他動物由来の細胞を用いることができる。組織から採集した軟骨細胞や骨芽細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、靭帯細胞、脂肪細胞、神経細胞、血管内皮細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、上皮細胞、肝細胞、膵β細胞、腎臓細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、脂肪由来間葉系幹細胞、神経幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞などの細胞をゼラチンハイドロゲルに内包できる。
次に細胞を内包したゼラチンハイドロゲルを切断加工する工程を行うが、上述の（１）のゼラチンハイドロゲルを切断する工程と同様であるため説明を省略する。このようにして、細胞を内包したゼラチンハイドロゲルからなる立方体粒子が作製される。
このようにして得た、細胞を内包しない／内包するゼラチンハイドロゲルからなる立方体粒子は、造粒剤として機能するため、実施の形態１で説明した本発明のゼラチン誘導体とともに用いれば、細胞を内包しない／内包する架橋ゼラチンハイドロゲル多孔体を提供できる。
なお、ここでは、細胞を内包しない／内包するゼラチンハイドロゲルを立方体粒子に切断するとして説明してきたが、切断後の形状は立方体に限定されない。例えば、直方体、円柱、球状など所望の多孔質構造に応じて粒子の形状は任意に設定される。この場合も、ゼラチンハイドロゲルは、粒子の長径が２０μｍ〜２０００μｍとなるように切断される。
（実施の形態３）
実施の形態３では、実施の形態１で説明したゼラチン誘導体（ゼラチン二次修飾体）、必要に応じて実施の形態２で説明したゲル粒子（細胞を内包する／内包しない）を用いて、架橋ゼラチンハイドロゲル及びその多孔体、ならびに、それらの製造方法について説明する。
実施の形態３では、実施の形態１で説明したゼラチン誘導体（ゼラチン二次修飾体）、必要に応じて実施の形態２で説明したゲル粒子（細胞を内包する／内包しない）を用いて、架橋ゼラチンハイドロゲル及びその多孔体、ならびに、それらの製造方法について説明する。
図３は、本発明のゼラチン誘導体を用いて得られる架橋ゼラチンハイドロゲル及びその多孔体のプロシージャを示すフローチャートである。
本発明のゼラチン誘導体１００（実施の形態１で説明したゼラチン誘導体１００）を用いることによって、細胞を内包しない架橋ゼラチンハイドロゲル３１０、細胞を内包する架橋ゼラチンハイドロゲル３２０、細胞を内包しない架橋ゼラチンハイドロゲル多孔体３３０、及び、細胞を内包する架橋ゼラチンハイドロゲル多孔体３４０が得られる。
いずれの架橋ゼラチンハイドロゲル及びその多孔体３１０、３２０、３３０、３４０も、高い架橋密度を有し、高い力学強度を有するので、形状安定性に優れている。例示的には、架橋ゼラチンハイドロゲル及びその多孔体３１０、３２０、３３０、３４０の架橋密度は、０．０２ｍｏｌ／ｍ３以上１００００ｍｏｌ／ｍ３以下の範囲を有する。この範囲の架橋密度を有せば、形状安定性に優れる。より好ましくは、架橋密度は、０．１ｍｏｌ／ｍ３以上４０００ｍｏｌ／ｍ３以下の範囲を有する。また、架橋ゼラチンハイドロゲル及びその多孔体３１０、３２０、３３０、３４０は、０．１ｋＰａ以上１０ｋＰａ以下の範囲の貯蔵弾性率を有し、高い力学的強度を有する。なお、架橋密度ｎは、例えば、ｎ＝Ｅ’／４ＲＴ（ここで、Ｅ’は動的貯蔵弾性率、Ｒは気体定数、Ｔは温度である）に基づいて算出できる。
図３によれば、本発明のゼラチン誘導体１００を用いれば、細胞を架橋ゼラチンハイドロゲルのバルクに、ハイドロゲルの空孔に、あるいは、その両方に播種できるので、より効率の高い組織再生を可能にする。細胞を内包する架橋ゼラチンハイドロゲル３２０やその多孔体３４０を、適当な大きさに切断し、移植体としてもよいし、培地で培養することによって、あるいは、動物に移植することによって組織を再生してもよい。
次に、架橋ゼラチンハイドロゲル及びその多孔体３１０、３２０、３３０、３４０のそれぞれの製造方法について説明する。
（１）細胞を内包しない架橋ゼラチンハイドロゲル３１０の製造方法（図３のプロシージャＡ）
架橋ゼラチンハイドロゲル３１０の製造方法は、本発明のゼラチン二次修飾体（ゼラチン誘導体）１００及び光重合開始剤を含有する水溶液を調製する工程、及び、この水溶液に紫外線を照射する工程を含むことを特徴としている。
（１）細胞を内包しない架橋ゼラチンハイドロゲル３１０の製造方法（図３のプロシージャＡ）
架橋ゼラチンハイドロゲル３１０の製造方法は、本発明のゼラチン二次修飾体（ゼラチン誘導体）１００及び光重合開始剤を含有する水溶液を調製する工程、及び、この水溶液に紫外線を照射する工程を含むことを特徴としている。
ゼラチン二次修飾体及び光重合開始剤の水溶液を調製する工程を詳細に説明する。水溶液は、例えば、２３℃以上３７℃以下、好ましくは２５℃以上３０℃以下に保持する。溶媒は、純水、リン酸緩衝食塩水、ＨＥＰＥＳ緩衝液、食塩水、細胞培養用の培地、或いはリン酸緩衝食塩水と培地の混合溶液を用いることができる。上記の培地とは細胞培養に用いる培地で、ダルベッコ変法イーグル培地やイーグル最小必須培地など１種類或いは数種類の混合培地でも良い。培地に血清が含まれていても含まれていなくても良い。血清の濃度は０．１〜５０％で、望ましい濃度は０．５〜２０％である。上記のリン酸緩衝食塩水と培地の混合溶液の体積混合比は５０：１〜１：５０で、望ましいのは１０：１〜１：１０である。
上記のゼラチン二次修飾体の水溶液の濃度はゼラチン二次修飾体の重量対溶液の体積の濃度で０．１〜５０（ｗ／ｖ）％である。これにより、ゲル化が促進する。望ましい濃度は０．５〜３０（ｗ／ｖ）％である。
上記の光重合開始剤は、例示的には、２−ヒドロキシ−１−（４−（ヒドロキシエトキシ）フェニル）−２−メチルｌ−１−プロパノン、過硫酸アンモニウムとＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンを含む混合液、または、過硫酸カリウムとＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンとを含む混合液であるが、望ましくは２−ヒドロキシ−１−（４−（ヒドロキシエトキシ）フェニル）−２−メチルｌ−１−プロパノンである。上記の光重合開始剤の濃度は光重合開始剤重量対溶液の体積の濃度で０．０１〜１０（ｗ／ｖ）％で、望ましいのは０．０５〜２（ｗ／ｖ）％である。これにより、重合を促進させる。
次いで、ゼラチン二次修飾体及び光重合開始剤を含有する水溶液を濾過滅菌用のフィルターメンブレンで滅菌する。上記のゼラチン水溶液の濾過滅菌用のフィルターメンブレンの孔径は０．１〜０．５μｍで、望ましいフィルターメンブレンの孔径は０．１〜０．３μｍである。
次にこの水溶液に紫外線を照射する工程を詳細に説明する。調製した水溶液を、例えば、２３℃以上３７℃以下、好ましくは２５℃以上３０℃以下に保持し、紫外線を照射する。これにより、水溶液が露光され、架橋重合反応が開始し、ゲル化する。ここで、紫外線の照射条件は、好ましくは、１０秒〜３０分間で、望ましいのは２０秒〜１０分間である。一定の厚みの架橋ゼラチンハイドロゲル３１０を作製する場合では、一定の厚さのスペース枠で隔てた２枚の石英カバーガラスの間にできた空間に前記のゼラチン二次修飾体と光重合開始剤の水溶液を注入し、紫外線を照射すればよい。
このようにして、細胞を有しない架橋ゼラチンヒドロゲル３１０が得られる。また、架橋ゼラチンヒドロゲル３１０を必要な大きさに切断して、適宜細胞を藩種させてもよい。一定の大きさに切断するには、カッターか糸かメッシュを用いればよい。
（２）細胞を内包する架橋ゼラチンハイドロゲル３２０の製造方法（図３のプロシージャＢ）
架橋ゼラチンハイドロゲル３２０の製造方法は、本発明のゼラチン二次修飾体（ゼラチン誘導体）１００及び光重合開始剤を含有する水溶液を調製する工程、これに細胞を懸濁させた細胞懸濁液を調製する工程、及び、この細胞懸濁液に紫外線を照射する工程を含むことを特徴としている。
架橋ゼラチンハイドロゲル３２０の製造方法は、本発明のゼラチン二次修飾体（ゼラチン誘導体）１００及び光重合開始剤を含有する水溶液を調製する工程、これに細胞を懸濁させた細胞懸濁液を調製する工程、及び、この細胞懸濁液に紫外線を照射する工程を含むことを特徴としている。
ゼラチン二次修飾体及び光重合開始剤の水溶液を調製する工程は、上述の（１）の水溶液を調製する工程と同様であるため説明を省略する。得られた水溶液に細胞を懸濁させた細胞懸濁液を調製する工程では、ゼラチン二次修飾体と光重合開始剤との水溶液を濾過滅菌用のフィルターメンブレンで滅菌した後、水溶液の温度をできるだけ低く、例えば、２３℃以上３７℃以下、好ましくは２５℃以上３０℃以下に保持する。これにより水溶液のゲル化を防ぐ。温度を低くしたゼラチン二次修飾体と光重合開始剤との水溶液に細胞を添加し、細胞懸濁液を調製する。
上記の細胞懸濁液の細胞濃度は好ましくは１０３ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〜１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬの範囲である。この範囲であれば、均一な細胞分布と効率のよい増殖とを可能にする。さらに望ましい濃度は１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〜５×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬである。
上記の細胞には、ヒトやその他動物由来の細胞を用いることができる。組織から採集した軟骨細胞や骨芽細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、靭帯細胞、脂肪細胞、神経細胞、血管内皮細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、上皮細胞、肝細胞、膵β細胞、腎臓細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、脂肪由来間葉系幹細胞、神経幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞などの細胞をゼラチンハイドロゲルに内包できる。
次いで、この細胞懸濁液に紫外線を照射し、架橋重合を行う。なお、この細胞懸濁液に紫外線を照射する工程は、上述の（１）の水溶液に紫外線を照射する工程と同様であるため説明を省略する。このようにして、細胞を内包する架橋ゼラチンハイドロゲル３２０が得られる。ここでも、一定の厚みの架橋ゼラチンハイドロゲル３２０を作製する場合では、一定の厚さのスペース枠で隔てた２枚の石英カバーガラスの間にできた空間に前記の細胞懸濁液を注入し、紫外線を照射すればよい。
（３）細胞を内包しない架橋ゼラチンハイドロゲル多孔体３３０の製造方法（図３のプロシージャＣ）
架橋ゼラチンハイドロゲル多孔体３３０の製造方法は、本発明のゼラチン二次修飾体（ゼラチン誘導体）１００及び光重合開始剤を含有する水溶液を調製する工程、これにゲル粒子（実施の形態２で説明した細胞を内包しないゼラチンハイドロゲルからなる立方体粒子）を添加した混合物を調製する工程、及び、この混合物に紫外線を照射する工程を含むことを特徴としている。
架橋ゼラチンハイドロゲル多孔体３３０の製造方法は、本発明のゼラチン二次修飾体（ゼラチン誘導体）１００及び光重合開始剤を含有する水溶液を調製する工程、これにゲル粒子（実施の形態２で説明した細胞を内包しないゼラチンハイドロゲルからなる立方体粒子）を添加した混合物を調製する工程、及び、この混合物に紫外線を照射する工程を含むことを特徴としている。
ゼラチン二次修飾体及び光重合開始剤の水溶液を調製する工程は、上述の（１）の水溶液を調製する工程と同様であるため説明を省略する。得られた水溶液にゲル粒子を添加した混合物を調製する工程では、ゼラチン二次修飾体と光重合開始剤との水溶液を濾過滅菌用のフィルターメンブレンで滅菌した後、水溶液の温度をできるだけ低く、例えば、２３℃以上３７℃以下、好ましくは２５℃以上３０℃以下に保持する。これにより水溶液のゲル化を防ぐ。温度を低くしたゼラチン二次修飾体と光重合開始剤との水溶液にゲル粒子を添加し、混合物を調製する。上記のゼラチン二次修飾体と光重合開始剤の水溶液とゲル粒子との混合比率は、水溶液の体積とゲル粒子の分量との比率が１：５（ｖ／ｗ）〜５０：１（ｖ／ｗ）を満たすように混合される。これにより、所望の多孔質構造を有する架橋ゼラチンハイドロゲル多孔体が得られる。混合比率は、望ましくは１：２（ｖ／ｗ）〜５：１（ｖ／ｗ）である。
次いで、この混合物に紫外線を照射し、架橋重合を行う。なお、この混合物に紫外線を照射する工程は、上述の（１）の水溶液に紫外線を照射する工程と同様であるが、本発明のゼラチン誘導体のゲル化温度より高く、ゲル粒子（すなわち、純ゼラチン）のゲル化温度より低くなるように温度（実施例では２５℃）を保持して本発明のゼラチン誘導体の架橋重合を行う。架橋重合後、生成物をゲル粒子（純ゼラチン）のゾル−ゲル転移点（３７℃）以上にすると、純ゼラチン分子間の水素結合は切断され、ゲル粒子のみが溶解するので、多孔構造が形成される。このようにして、細胞を内包しない架橋ゼラチンハイドロゲル多孔体３３０が得られる。ここでも、一定の厚みの架橋ゼラチンハイドロゲル多孔体３３０を作製する場合では、一定の厚さのスペース枠で隔てた２枚の石英カバーガラスの間にできた空間に前記の混合物を注入し、紫外線に照射すればよい。
（４）細胞を内包する架橋ゼラチンハイドロゲル多孔体３４０の製造方法
架橋ゼラチンハイドロゲル多孔体３４０は、図３に示されるように、３つの異なるプロシージャＤ〜Ｆによって製造される。
架橋ゼラチンハイドロゲル多孔体３４０は、図３に示されるように、３つの異なるプロシージャＤ〜Ｆによって製造される。
（Ａ）図３のプロシージャＤの製造方法について説明する。
架橋ゼラチンハイドロゲル多孔体３４０の製造方法は、本発明のゼラチン二次修飾体（ゼラチン誘導体）１００及び光重合開始剤を含有する水溶液を調製する工程、これに細胞を懸濁させた細胞懸濁液を調製する工程、これにゲル粒子（実施の形態２で説明した細胞を内包しないゼラチンハイドロゲルからなる立方体粒子）を添加した混合物を調製する工程、及び、この混合物に紫外線を照射する工程を含むことを特徴としている。
架橋ゼラチンハイドロゲル多孔体３４０の製造方法は、本発明のゼラチン二次修飾体（ゼラチン誘導体）１００及び光重合開始剤を含有する水溶液を調製する工程、これに細胞を懸濁させた細胞懸濁液を調製する工程、これにゲル粒子（実施の形態２で説明した細胞を内包しないゼラチンハイドロゲルからなる立方体粒子）を添加した混合物を調製する工程、及び、この混合物に紫外線を照射する工程を含むことを特徴としている。
ここで、ゼラチン二次修飾体及び光重合開始剤を含有する水溶液を調製する工程は、上述の（１）の水溶液を調製する工程と同様である。得られた水溶液に細胞を懸濁させた細胞懸濁液を調製する工程は、上述の（２）の細胞懸濁液を調製する工程と同様である。細胞懸濁液にゲル粒子を添加した混合物を調製する工程は、上述の（３）の混合物を調製する工程と同様である。得られた混合物に紫外線を照射する工程は、上述の（３）の混合物に紫外線を照射する工程と同様である。したがって、以上の工程の説明を省略する。
このような工程の組み合わせによって、細胞を内包する架橋ゼラチンハイドロゲル多孔体３４０が得られる。なお、ここでも、一定の厚みの架橋ゼラチンハイドロゲル多孔体３４０を作製する場合では、一定の厚さのスペース枠で隔てた２枚の石英カバーガラスの間にできた空間に前記の混合物を注入し、紫外線を照射すればよい。
（Ｂ）図３のプロシージャＥの製造方法について説明する。
架橋ゼラチンハイドロゲル多孔体３４０の製造方法は、本発明のゼラチン二次修飾体（ゼラチン誘導体）１００及び光重合開始剤を含有する水溶液を調製する工程、これにゲル粒子（実施の形態２で説明した細胞を内包するゼラチンハイドロゲルからなる立方体粒子）を添加した混合物を調製する工程、及び、この混合物に紫外線を照射する工程を含むことを特徴としている。
架橋ゼラチンハイドロゲル多孔体３４０の製造方法は、本発明のゼラチン二次修飾体（ゼラチン誘導体）１００及び光重合開始剤を含有する水溶液を調製する工程、これにゲル粒子（実施の形態２で説明した細胞を内包するゼラチンハイドロゲルからなる立方体粒子）を添加した混合物を調製する工程、及び、この混合物に紫外線を照射する工程を含むことを特徴としている。
ここで、ゼラチン二次修飾体及び光重合開始剤を含有する水溶液を調製する工程は、上述の（１）の水溶液を調製する工程と同様である。得られた水溶液にゲル粒子を添加した混合物を調製する工程は、上述の（３）の混合物を調製する工程と同様であるが、細胞を内包するゲル粒子中に内容される細胞濃度は、細胞濃度は好ましくは１０３ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〜１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬの範囲である。さらに望ましい濃度は１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〜５×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬである。得られた混合物に紫外線を照射する工程は、上述の（３）の混合物に紫外線を照射する工程と同様である。したがって、以上の工程の説明を省略する。
このような工程の組み合わせによって、細胞を内包する架橋ゼラチンハイドロゲル多孔体３４０が得られる。なお、ここでも、一定の厚みの架橋ゼラチンハイドロゲル多孔体３４０を作製する場合では、一定の厚さのスペース枠で隔てた２枚の石英カバーガラスの間にできた空間に前記の混合物を注入し、紫外線を照射すればよい。
（Ｃ）図３のプロシージャＦの製造方法について説明する。
架橋ゼラチンハイドロゲル多孔体３４０の製造方法は、本発明のゼラチン二次修飾体（ゼラチン誘導体）１００及び光重合開始剤を含有する水溶液を調製する工程、これに細胞を懸濁させた細胞懸濁液を調製する工程、これにゲル粒子（実施の形態２で説明した細胞を内包するゼラチンハイドロゲルからなる立方体粒子）を添加した混合物を調製する工程、及び、この混合物に紫外線を照射する工程を含むことを特徴としている。
架橋ゼラチンハイドロゲル多孔体３４０の製造方法は、本発明のゼラチン二次修飾体（ゼラチン誘導体）１００及び光重合開始剤を含有する水溶液を調製する工程、これに細胞を懸濁させた細胞懸濁液を調製する工程、これにゲル粒子（実施の形態２で説明した細胞を内包するゼラチンハイドロゲルからなる立方体粒子）を添加した混合物を調製する工程、及び、この混合物に紫外線を照射する工程を含むことを特徴としている。
ここで、ゼラチン二次修飾体及び光重合開始剤を含有する水溶液を調製する工程は、上述の（１）の水溶液を調製する工程と同様である。得られた水溶液に細胞を懸濁させた細胞懸濁液を調製する工程は、上述の（２）の細胞懸濁液を調製する工程と同様である。細胞懸濁液にゲル粒子を添加した混合物を調製する工程は、上述の（３）の混合物を調製する工程と同様である。得られた混合物に紫外線を照射する工程は、上述の（１）の水溶液に紫外線を照射する工程と同様である。したがって、以上の工程の説明を省略する。
このような工程の組み合わせによって、細胞を内包する架橋ゼラチンハイドロゲル多孔体３４０が得られる。なお、ここでも、一定の厚みの架橋ゼラチンハイドロゲル多孔体３４０を作製する場合では、一定の厚さのスペース枠で隔てた２枚の石英カバーガラスの間にできた空間に前記の混合物を注入し、紫外線を照射すればよい。
以下、具体的な実施例を用いて本発明を詳述するが、本発明がこれら実施例に何ら限定されるものではない。
＜実施例１＞
実施例１では、ブタ皮膚由来ゼラチンを用いて、アミノ基がメタクリロイル基（図１の１２０）と結合し、ゼラチンが有するヒドロキシ基及びカルボキシル基がメタクリロイルグリセリルエステル基（図１の１３０）と結合した本発明のゼラチン誘導体（以降では単にゼラチン二次修飾体）を合成した。
実施例１では、ブタ皮膚由来ゼラチンを用いて、アミノ基がメタクリロイル基（図１の１２０）と結合し、ゼラチンが有するヒドロキシ基及びカルボキシル基がメタクリロイルグリセリルエステル基（図１の１３０）と結合した本発明のゼラチン誘導体（以降では単にゼラチン二次修飾体）を合成した。
図４は、ゼラチン一次修飾体の合成工程（ａ）とゼラチン二次修飾体の合成工程（ｂ）とを示す図である。
図２に示すステップＳ２１０にしたがって、図４（ａ）の合成プロシージャに基づいてゼラチン一次修飾体（図４（ａ）ではＧｅｌＭＡと表記）を合成した。詳細には、ブタ皮膚由来ゼラチン５ｇ（分子量５０，０００〜１００，０００ダルトン）を５０℃で撹拌しながらＰＢＳに溶かし、１０（ｗ／ｖ）％のゼラチン溶液を得た。次に、メタクリル酸無水物５ｍＬを５０℃で撹拌しながら、０．５ｍＬ／ｍｉｎでゼラチン溶液に添加し、暗所で３時間反応させた。ここで、ゼラチン水溶液に対するメタクリル酸無水物の体積仕込み比は、１０：１であった。反応生成物を５０℃のＰＢＳに５倍希釈し、透析膜（分画分子量１２，０００〜１４，０００ダルトン）を用いて４０℃の超純水中で７日間透析することによって、塩類や未反応メタクリル酸無水物を除去し、反応生成物を精製した。
反応生成物の分子構造を１Ｈ ＮＭＲで解析した。１Ｈ ＮＭＲスペクトルは、周波数３００ＭＨｚ、単一の軸勾配逆プローブを有するＮＭＲ分光計を用いて測定した。測定の前に、反応生成物を、内部標準物質０．０５（ｗ／ｖ）％３−（トリメチルシリル）プロピオン酸−２，２，３，３−ｄ４酸ナトリウム塩を含む重水１ｍＬに４０℃で溶かした。反応生成物の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを図５に示す。
図５は、ゼラチン一次修飾体の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す図である。
図５中の５．４ｐｐｍと５．７ｐｐｍのシグナルは、メタクリレート基のビニルプロトンに帰属された。５．４ｐｐｍと５．７ｐｐｍのシグナル強度の和０．９２であった。このことから、得られた反応生成物は、アミノ基にメタクリロイル基が結合したゼラチン一次修飾体であることを確認した。
得られたゼラチン一次修飾体を７日間凍結乾燥し、固形物を得た。
図２に示すステップＳ２２０にしたがって、図４（ｂ）の合成プロシージャに基づいてゼラチン二次修飾体（図４（ｂ）ではＧｅｌＭＡＧＭＡと表記）を合成した。詳細には、先に得られたゼラチン一次修飾体とメタクリル酸グリシジルと反応させた。まず、ゼラチン一次修飾体２．５ｇを超純水に溶かして２（ｗ／ｖ）％の溶液を調製した後、１Ｍ ＨＣｌでｐＨを３．５に調整した。次に、メタクリル酸グリシジル５ｍＬを０．５ｍＬ／ｍｉｎで前記ゼラチン一次修飾体水溶液に添加し、５０℃で２４時間反応を行った。ここで、ゼラチン一次修飾体水溶液に対するメタクリル酸グリシジルの体積仕込み比は、２５：１であった。
得られた反応生成物を５０℃のＰＢＳに５倍希釈し、透析膜（分画分子量１２，０００〜１４，０００ダルトン）を用いて４０℃の超純水中で７日間透析し、塩類や未反応のメタクリル酸グリシジルを除去し、反応生成物を精製した。
反応生成物の分子構造を１Ｈ ＮＭＲで解析した。１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、周波数３００ ＭＨｚ、単一の軸勾配逆プローブを有するＮＭＲ分光計を用いて測定した。測定の前に、反応生成物を、内部標準物質０．０５（ｗ／ｖ）％３−（トリメチルシリル）プロピオン酸−２，２，３，３−ｄ４酸ナトリウム塩を含む重水１ｍＬに４０℃で溶かした。反応生成物の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを図６に示す。
図６は、ゼラチン二次修飾体の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す図である。
図６中の５．４ｐｐｍと５．７ｐｐｍのシグナルは、無水メタクリル酸に由来するメタクリレート基のビニルプロトン、５．８ｐｐｍと６．２ｐｐｍのシグナルは、メタクリル酸グリシジルに由来するメタクリレート基のビニルプロトンに帰属された。このことから、得られた反応生成物は、アミノ基がメタクリロイル基と結合し、ゼラチンが有するヒドロキシ基及びカルボキシル基がメタクリロイルグリセリルエステル基と結合したゼラチン二次修飾体（本発明のゼラチン誘導体）であることを確認した。
また、５．４ｐｐｍ、５．７ｐｐｍ、５．８ｐｐｍと６．２ｐｐｍのシグナル強度の和は１．７６であった。ゼラチン二次修飾体のメタクリレート基にあるビニル基由来のプロトンのシグナル強度の和は実施例１のゼラチン一次修飾体のメタクリレート基にあるビニルプロトンの値の約２倍になり、より多くの光反応性のメタクリレート基が導入されたことが分かった。ＮＭＲスペクトルからメタクリレート基およびメタクリロイルグリセリルエステル基の含有率は、ゼラチン二次修飾体１ｇに換算して、それぞれ、０．３５ｍｍｏｌおよび０．７０ｍｍｏｌであった。
精製したゼラチン二次修飾体を７日間凍結乾燥し、固形物を得た。以降の実施例では得られた固形物を用いた。
次に、ゼラチン二次修飾体水溶液のレオロジー的性質をレオメーターで測定し、ゾル−ゲル転移温度を測定した。ゼラチン二次修飾体を５０℃のＰＢＳに溶解して１０（ｗ／ｖ％）の水溶液を調製し、３００μＬを測定に用いた。直径５０ｍｍの平行プレート測定ジオメトリを利用し、一定振幅（γ＝５％）と周波数（１Ｈｚ）で温度掃引（３７℃〜２０℃、冷却速度は０．１５℃／ｍｉｎ）を行い、貯蔵弾性率（Ｇ’）と損失弾性率（Ｇ”）を測定した。ゼラチン二次修飾体水溶液の貯蔵弾性率（Ｇ’）と損失弾性率（Ｇ”）が温度依存性を図７に示す。
図７は、１０（ｗ／ｖ％）のゼラチン二次修飾体水溶液の貯蔵弾性率（Ｇ’）と損失弾性率（Ｇ”）の温度との関係図である。
ゾルからゲルへの転移温度は、貯蔵弾性率（Ｇ’）と損失弾性率（Ｇ”）の交点から決定した。ゼラチン二次修飾体水溶液のゾルからゲルへの転移温度は２２．７℃であった。ゼラチン二次修飾体水溶液のゾルからゲルへの転移温度は室温より低く、室温ではゼラチン二次修飾体水溶液はゲル化しなくなったため、取り扱いやすくなった。
＜実施例２＞
実施例２では、実施例１で合成したゼラチン二次修飾体を用いて、図３のプロシージャＡに基づいて架橋ゼラチンハイドロゲル（図３の３１０）を製造した。
実施例２では、実施例１で合成したゼラチン二次修飾体を用いて、図３のプロシージャＡに基づいて架橋ゼラチンハイドロゲル（図３の３１０）を製造した。
詳細には、ゼラチン二次修飾体（１０％、ｗ／ｖ）と光重合開始剤（２−ヒドロキシ−１−（４−（ヒドロキシエトキシ）フェニル）−２−メチルｌ−１−プロパノン）（０．５％、ｗ／ｖ）とを２５℃でＰＢＳ溶液に溶かして水溶液を調製した。この水溶液を濾過滅菌用のフィルターメンブレン（孔径：０．２２μｍ）で滅菌した。滅菌後、厚さ１．５ｍｍのシリコーンゴム枠で隔てた２枚の石英カバーガラスのすき間にこれら前記の水溶液をピペットで注入し、２５℃に保持し、紫外線を５分間照射することによって、架橋ゼラチンハイドロゲルを作製した。
得られた架橋ゼラチンハイドロゲルを直径１０ｍｍのディスク状に切断し、レオロジー試験に用いた。貯蔵弾性率は、１０ｍｍの平行プレートを備えたレオメーターで測定した。温度を３７℃にセットし、試験開始前にサンプルを３分間平衡化した。貯蔵弾性率は、一定の周波数（１Ｈｚ）と一定の縦ひずみ（５％）の下で振動せん断変形を与えて測定した。３つのサンプルを試験して平均値と標準偏差を計算した。その結果、貯蔵弾性率は３２９５．６±２７６．８Ｐａであり、高い力学的強度を有することが分かった。架橋密度を計算したところ、７０ｍｏｌ／ｍ３であった。
＜実施例３＞
実施例３では、実施例１で合成したゼラチン二次修飾体を用いて、図３のプロシージャＢに基づいて、軟骨細胞を内包する架橋ゼラチンハイドロゲル（図３の３２０）を製造した。
実施例３では、実施例１で合成したゼラチン二次修飾体を用いて、図３のプロシージャＢに基づいて、軟骨細胞を内包する架橋ゼラチンハイドロゲル（図３の３２０）を製造した。
まず、仔牛のひざ関節軟骨から単離した初代軟骨細胞を３７℃、５％ＣＯ２で培養した。培養には、１０％ウシ胎児血清、４５００ｍｇ／Ｌブドウ糖、４ｍＭグルタミン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、０．４ｍＭのプロリン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム塩、５０μｇ／ｍＬアスコルビン酸を添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、７５ｃｍ２の組織培養フラスコを用いた。培地は、３日おきに交換した。継代培養を一回行った軟骨細胞をハイドロゲルに内包する実験に用いた。コンフルエンスに達した軟骨細胞をトリプシン／ＥＤＴＡ溶液で剥離し、細胞を遠心分離によって回収し、細胞数を血球計算器で計測した。
次に、実施例２と同様の手順で、ゼラチン二次修飾体（１０％、ｗ／ｖ）と光重合開始剤（０．５％、ｗ／ｖ）との水溶液を調製し、これに調製した軟骨細胞を懸濁させ、ゼラチン二次修飾体と光重合開始剤とを含有する軟骨細胞の細胞懸濁液を調製した。ここで、細胞懸濁液の細胞濃度は２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬであった。細胞懸濁液は２５℃に保持された。２枚の石英カバーガラスの間に厚さ１．５ｍｍのシリコーンゴム枠を挟んでできた空間に前記の細胞懸濁液をピペットで注入した。次いで、細胞懸濁液を２５℃に保持し、紫外線を５分間照射することにより、軟骨細胞を内包した架橋ゼラチンハイドロゲルを作製した。さらに、直径１０ｍｍのディスク状に切り抜き、Ｔ−フラスコ中で６０ｒｐｍの速度で振とうしながら２週間培養を行った。培地は２日おきに交換した。
架橋ゼラチンハイドロゲル中の生細胞をカルセイン−ＡＭ、死細胞をプロピジウムヨウ化物で染色し、軟骨細胞のバイアビリティーを評価した。架橋ゼラチンハイドロゲル作製直後及び２週間培養した後に、細胞を内包したディスク状の架橋ゼラチンハイドロゲルディスクをＰＢＳで３回洗浄し、カルセイン−ＡＭ（２μＭ）とプロピジウムヨウ化物（４μＭ）とを含む無血清培地で３７℃、１５分間インキュベートした。染色した細胞を共焦点レーザー顕微鏡で観察した。結果を図８に示す。
図８は、実施例３による軟骨細胞を内包した架橋ゼラチンハイドロゲルにおける細胞の生死染色の蛍光顕微鏡像を示す図である。
図８（ａ）は培養直前、（ｂ）は２週間培養後の細胞の生死染色の蛍光顕微鏡像を示す。図８はグレースケールで示されるが、明るく示される領域は生細胞を示し、死細胞を矢印で示す。
図８によれば、細胞を内包した直後、すなわち培養直前にはわずかな死細胞が検出されたが、２週間培養後には検出されなかった。一部の軟骨細胞は凝集して小さな凝集体を形成した。これらの結果から、細胞を内包した状態でゼラチン二次修飾体を架橋重合しても細胞のバイアビリティーに明らかな影響はなかった。得られた架橋ゼラチンハイドロゲルは高い細胞適合性をもつことから、本方法は軟骨細胞を内包した架橋ゼラチンハイドロゲルを作製するのに適していることが示された。
＜実施例４＞
実施例４では、実施例１で合成したゼラチン二次修飾体を用いて、図３のプロシージャＤに基づいて、軟骨細胞を内包する架橋ゼラチンハイドロゲル（図３の３４０）を製造した。実施例４では、細胞を内包しない、純粋な未修飾ゼラチンからなるハイドロゲル直方体粒子を架橋ゼラチンハイドロゲル多孔体の造孔剤として用いた。
実施例４では、実施例１で合成したゼラチン二次修飾体を用いて、図３のプロシージャＤに基づいて、軟骨細胞を内包する架橋ゼラチンハイドロゲル（図３の３４０）を製造した。実施例４では、細胞を内包しない、純粋な未修飾ゼラチンからなるハイドロゲル直方体粒子を架橋ゼラチンハイドロゲル多孔体の造孔剤として用いた。
未修飾ゼラチン（純ゼラチン）は３７℃でゲル−ゾル転移を起こす。未修飾ゼラチンからなるハイドロゲル直方体粒子は未修飾ゼラチンの水溶液から作製した。未修飾ゼラチンをＰＢＳとＤＭＥＭの混合溶液（体積比１：１）に溶かし、５（ｗ／ｖ）％のゼラチン溶液を作製した。本ゼラチン溶液を孔径０．２２μｍのフィルターメンブレンで濾過滅菌した。ゼラチン溶液を枠スペースが１００ｍｍ×２０ｍｍ×３００μｍのシリコーンゴム枠の空間にピペットで注入し、４℃でゲル化させた。形成した未修飾ゼラチンハイドロゲルを網目サイズ２５０μｍ×２５０μｍのナイロンメッシュに押し当てることによって、サイズが２５０×２５０×３００μｍの未修飾ゼラチンのハイドロゲル直方体粒子に切断加工した。切断後の様子を光学顕微鏡で観察した。観察結果を図９に示す。
図９は、ゼラチンハイドロゲルからなる直方体粒子の様子を示す光学顕微鏡写真である。
図９によれば、直方体粒子は、２５０×２５０×３００μｍを有することが分かった。
次に、実施例３と同様の手順で、ゼラチン二次修飾体（１０％、ｗ／ｖ）と光重合開始剤（０．５％、ｗ／ｖ）との水溶液を調製し、これに調製した軟骨細胞を懸濁させ、ゼラチン二次修飾体と光重合開始剤とを含有する軟骨細胞の細胞懸濁液を調製した。軟骨細胞の細胞懸濁液にゼラチンハイドロゲルからなる直方体粒子を添加した混合物を調製した。ここで、細胞懸濁液とハイドロゲル直方体粒子とが２：１（ｖ／ｗ）になるように混合し、混合物を２５℃に保持した。
厚さ１．５ｍｍのシリコーンゴム枠で隔てた２枚の石英カバーガラスの間に前記混合物をピペットで注入し、２５℃に保持し、紫外線を５分間照射した。これによりゼラチンハイドロゲルは架橋重合した。次いで、生成物を３７℃に保持し、ゲル粒子を溶解させた。架橋バルクハイドロゲルには細胞を含み、直方体粒子には細胞を含まない架橋ゼラチンハイドロゲル多孔体を作製した。この架橋ゼラチンハイドロゲル多孔体を直径６ｍｍのディスク状に切断した。架橋ゼラチンハイドロゲル多孔体の外観を観察した。観察結果を図１０に示す。
図１０は、実施例４による架橋ゼラチンハイドロゲル多孔体の外観を示す写真である。
図１０によれば、得られた架橋ゼラチンハイドロゲル多孔体は、培養直前は、透明で均一であった。次いで、細胞培養Ｔ−フラスコ中で６０ｒｐｍの速度で振とうしながら４週間培養を行った。培地は、２日おきに交換した。全ての工程は無菌状態で行われた。
架橋ゼラチンハイドロゲル多孔体中の軟骨細胞のバイアビリティーを実施例３と同様の手順で評価し、染色した細胞を共焦点レーザー顕微鏡で観察した。観察結果を図１１に示す。
図１１は、実施例４による軟骨細胞を内包した架橋ゼラチンハイドロゲル多孔体における細胞の生死染色の蛍光顕微鏡像を示す図である。
図１１（ａ）は培養直前、（ｂ）は４週間培養後の細胞の生死染色の蛍光顕微鏡像を示す。図１１によれば、細胞を内包した直後、すなわち培養直前にはわずかな死細胞（図中矢印で示す）が検出されたが、４週間培養後には死細胞は検出されなかった。特に、架橋ゼラチンハイドロゲル多孔体作製直後には軟骨細胞はバルク部分にのみに観察されたが、４週間培養後には空孔にも観察された。また、図１１（ｂ）によれば、軟骨細胞は凝集していることが確認された。
さらに、実施例４の架橋ゼラチンハイドロゲル多孔体をｉｎ ｖｉｔｒｏで１日間培養した後、ヌードマウスの背中皮下に４週間埋植し、軟骨組織の再生を行った。再生後の様子を図１２に示す。
図１２は、実施例４による架橋ゼラチンハイドロゲル多孔体で再生した軟骨組織の外観を示す写真である。
図１０と図１２との比較からわかるように、全体に光沢のある軟骨組織が再生された。
＜実施例５＞
実施例５では、実施例１で合成したゼラチン二次修飾体を用いて、図３のプロシージャＥに基づいて、軟骨細胞を内包する架橋ゼラチンハイドロゲル（図３の３４０）を製造した。実施例５では、細胞を内包する、純粋な未修飾ゼラチンからなるハイドロゲル直方体粒子を架橋ゼラチンハイドロゲル多孔体の造孔剤として用いた。
実施例５では、実施例１で合成したゼラチン二次修飾体を用いて、図３のプロシージャＥに基づいて、軟骨細胞を内包する架橋ゼラチンハイドロゲル（図３の３４０）を製造した。実施例５では、細胞を内包する、純粋な未修飾ゼラチンからなるハイドロゲル直方体粒子を架橋ゼラチンハイドロゲル多孔体の造孔剤として用いた。
実施例４と同様に、未修飾ゼラチンをＰＢＳとＤＭＥＭが体積比１：１の割合での混合溶液に溶解し、５（ｗ／ｖ）％のゼラチン溶液を作製した。本ゼラチン溶液を孔径０．２２μｍのフィルターメンブレンで濾過滅菌した。このゼラチン溶液に軟骨細胞を懸濁し、細胞懸濁液を調製した。細胞懸濁液の細胞濃度は４×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬであった。ゼラチン溶液の細胞懸濁液を１００ｍｍ×２０ｍｍ×３００μｍのシリコーンゴム枠の空間にピペットで注入し、４℃でゲル化した。形成した、軟骨細胞を内包した未修飾ゼラチンのハイドロゲルを網目サイズ２５０μｍ×２５０μｍのナイロンメッシュに押し当てることによって、サイズが２５０×２５０×３００μｍの軟骨細胞内包化未修飾ゼラチンのハイドロゲル直方体粒子に切断加工した。切断後の様子を光学顕微鏡で観察した。観察結果を図１３に示す。
図１３は、ゼラチンハイドロゲルからなる直方体粒子の様子を示す光学顕微鏡写真である。
図１３によれば、直方体粒子は、２５０×２５０×３００μｍを有することが分かった。
次に、実施例２と同様の手順で、ゼラチン二次修飾体と光重合開始剤とを含有する水溶液を調製し、これに実施例４と同様の手順で軟骨細胞内包ハイドロゲル直方体粒子を添加した混合物を調製し（混合割合は２：１（ｖ／ｗ）であった）、２５℃に保持した。
厚さ１．５ｍｍのシリコーンゴム枠で隔てた２枚の石英カバーガラスの間に前記混合物をピペットで注入し、２５℃に保持し、紫外線を５分間照射した。これによりゼラチンハイドロゲルは架橋重合した。次いで、生成物を３７℃に保持し、ゲル粒子を溶解させた。このようにして、架橋バルクハイドロゲルには細胞を含まず、ハイドロゲル直方体粒子には細胞を含む架橋ゼラチンハイドロゲル多孔体を作製した。このゼラチンハイドロゲルを直径６ｍｍのディスク状に切断した。架橋ゼラチンハイドロゲル多孔体の外観を観察した。観察結果を図１４に示す。
図１４は、実施例５による架橋ゼラチンハイドロゲル多孔体の外観を示す写真である。
図１４によれば、得られた架橋ゼラチンハイドロゲル多孔体は、培養直前は、透明で均一であった。次いで、実施例４と同様の条件で細胞培養を行い、架橋ゼラチンハイドロゲル多孔体中の軟骨細胞のバイアビリティーを実施例３と同様の手順で評価し、染色した細胞を共焦点レーザー顕微鏡で観察した。観察結果を図１５に示す。
図１５は、実施例５による軟骨細胞を内包した架橋ゼラチンハイドロゲル多孔体における細胞の生死染色の蛍光顕微鏡像を示す図である。
図１５（ａ）は培養直前、（ｂ）は４週間培養後の細胞の生死染色の蛍光顕微鏡像を示す。図１５によれば、細胞を内包した直後、すなわち培養直前にはわずかな死細胞（図中矢印で示す）が検出されたが、４週間培養後には死細胞は検出されなかった。特に、架橋ゼラチンハイドロゲル多孔体作製直後にも４週間培養した後でも、軟骨細胞は架橋ゼラチンハイドロゲル多孔体の空孔のみで観察された。また、図１５（ｂ）によれば、軟骨細胞は凝集していることが確認された。
さらに、実施例４と同様に、実施例５の架橋ゼラチンハイドロゲル多孔体をｉｎ ｖｉｔｒｏで１日間培養した後、ヌードマウスの背中皮下に４週間埋植し、軟骨組織の再生を行った。再生後の様子を図１６に示す。
図１６は、実施例５による架橋ゼラチンハイドロゲル多孔体で再生した軟骨組織の外観を示す写真である。
図１４と図１６との比較からわかるように、全体に光沢のある軟骨組織が再生された。
＜実施例６＞
実施例６では、実施例１で合成したゼラチン二次修飾体を用いて、図３のプロシージャＦに基づいて、軟骨細胞を内包する架橋ゼラチンハイドロゲル（図３の３４０）を製造した。実施例６では、実施例５と同様に、細胞を内包する、純粋な未修飾ゼラチンからなるハイドロゲル直方体粒子を架橋ゼラチンハイドロゲル多孔体の造孔剤として用いた。
実施例６では、実施例１で合成したゼラチン二次修飾体を用いて、図３のプロシージャＦに基づいて、軟骨細胞を内包する架橋ゼラチンハイドロゲル（図３の３４０）を製造した。実施例６では、実施例５と同様に、細胞を内包する、純粋な未修飾ゼラチンからなるハイドロゲル直方体粒子を架橋ゼラチンハイドロゲル多孔体の造孔剤として用いた。
実施例３と同様の手順で、ゼラチン二次修飾体（１０％、ｗ／ｖ）と光重合開始剤（０．５％、ｗ／ｖ）との水溶液を調製し、これに調製した軟骨細胞を懸濁させ、ゼラチン二次修飾体と光重合開始剤とを含有する軟骨細胞の細胞懸濁液を調製した。ここで、細胞懸濁液の細胞濃度は１．３４×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬであった。次いで、実施例５と同様の手順で、軟骨細胞内包ハイドロゲル直方体粒子を添加した混合物を調製（混合割合は２：１（ｖ／ｗ）であった）し、２５℃に保持した。ここで、直方体粒子を作製するための細胞懸濁液の細胞濃度は１．３３×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬであった。
厚さ１．５ｍｍのシリコーンゴム枠で隔てた２枚の石英カバーガラスの間に前記混合物をピペットで注入し、２５℃に保持し、紫外線を５分間照射した。これによりゼラチンハイドロゲルは架橋重合した。次いで、生成物を３７℃に保持し、ゲル粒子を溶解させた。このようにして、架橋バルクハイドロゲルにも、ハイドロゲル直方体粒子にも細胞を含む架橋ゼラチンハイドロゲル多孔体を作製した。このゼラチンハイドロゲルを直径６ｍｍのディスク状に切断した。架橋ゼラチンハイドロゲル多孔体の外観を観察した。観察結果を図１７に示す。
図１７は、実施例６による架橋ゼラチンハイドロゲル多孔体の外観を示す写真である。
図１７によれば、得られた架橋ゼラチンハイドロゲル多孔体は、培養直前は、透明で均一であった。次いで、実施例４と同様の条件で細胞培養を行い、架橋ゼラチンハイドロゲル多孔体中の軟骨細胞のバイアビリティーを実施例３と同様の手順で評価し、染色した細胞を共焦点レーザー顕微鏡で観察した。観察結果を図１８に示す。
図１８は、実施例６による軟骨細胞を内包した架橋ゼラチンハイドロゲル多孔体における細胞の生死染色の蛍光顕微鏡像を示す図である。
図１８（ａ）は培養直前、（ｂ）は４週間培養後の細胞の生死染色の蛍光顕微鏡像を示す。図１８によれば、細胞を内包した直後、すなわち培養直前にはわずかな死細胞（図中矢印で示す）が検出されたが、４週間培養後には死細胞は検出されなかった。特に、架橋ゼラチンハイドロゲル多孔体作製直後には、軟骨細胞はハイドロゲル多孔体のバルク部位と空孔の両方で観察され、均一に分布していたが、４週間培養後、空孔内の軟骨細胞は凝集した。
さらに、実施例４と同様に、実施例６の架橋ゼラチンハイドロゲル多孔体をｉｎ ｖｉｔｒｏで１日間培養した後、ヌードマウスの背中皮下に４週間埋植し、軟骨組織の再生を行った。再生後の様子を図１９に示す。
図１９は、実施例６による架橋ゼラチンハイドロゲル多孔体で再生した軟骨組織の外観を示す写真である。
図１７と図１９との比較からわかるように、全体に光沢のある軟骨組織が再生された。
本発明のゼラチン誘導体（ゼラチン二次修飾体）は、アミノ基がメタクリロイル基と結合し、ゼラチンが有するヒドロキシ基及びカルボキシル基がメタクリロイルグリセリルエステル基と結合しており、紫外線照射により架橋重合できる反応性基が最大限に導入されている。本発明の架橋ゼラチンハイドロゲル及びその多孔体は、本発明のゼラチン誘導体を用いて製造されるので、力学強度が高く、形状安定性にすぐれている。これにより、荷重部位へのインジェクタブルゲルとしての用途に加え、生体組織工学的手法による組織再生にも用いることが可能である。しかも、ハイドロゲルのバルクにも空孔にも細胞を播種することができるため、より効率よい組織再生が可能となり、治癒期間の短縮が期待できる。よって、本発明の架橋ゼラチンハイドロゲル及びその多孔体は、組織欠損を治療するのに極めて有用である。
１００ ゼラチン誘導体
１１０ ゼラチン
１２０ メタクリロイル基
１３０ メタクリロイルグリセリルエステル基
１１０ ゼラチン
１２０ メタクリロイル基
１３０ メタクリロイルグリセリルエステル基
Claims (20)
- ゼラチンに反応性基が導入されたゼラチン誘導体であって、
前記ゼラチンが有するアミノ基がメタクリロイル基と結合しており、
前記ゼラチンが有するヒドロキシ基及びカルボキシル基がメタクリロイルグリセリルエステル基と結合している、ゼラチン誘導体。 - 前記メタクリロイル基の含有率は、前記ゼラチン誘導体１ｇに対して０．０１ｍｍｏｌ以上１０ｍｍｏｌ以下の範囲を満たし、
前記メタクリロイルグリセリルエステル基の含有率は、前記ゼラチン誘導体１ｇに対して０．０１ｍｍｏｌ以上１０ｍｍｏｌ以下の範囲を満たす、請求項１に記載のゼラチン誘導体。 - 前記メタクリロイル基の含有率は、前記ゼラチン誘導体１ｇに対して０．１ｍｍｏｌ以上１ｍｍｏｌ以下の範囲を満たし、
前記メタクリロイルグリセリルエステル基の含有率は、前記ゼラチン誘導体１ｇに対して０．１ｍｍｏｌ以上１ｍｍｏｌ以下の範囲を満たす、請求項２に記載のゼラチン誘導体。 - 前記ゼラチンは、動物の骨、動物の皮膚、魚骨、魚皮及び魚鱗の群から少なくとも１つ選択される、請求項１に記載のゼラチン誘導体。
- 請求項１〜４のいずれかに記載のゼラチン誘導体を製造する方法であって、
ゼラチンをメタクリル酸無水物と反応させ、前記ゼラチンが有するアミノ基にメタクリロイル基を結合させたゼラチン一次修飾体を合成する工程と、
前記ゼラチン一次修飾体をメタクリル酸グリシジルと反応させ、前記ゼラチン一次修飾体が有するヒドロキシ基とカルボキシ基とにメタクリロイルグリセリルエステル基を結合させたゼラチン二次修飾体である前記ゼラチン誘導体を合成する工程と
を包含する、方法。 - 前記ゼラチン一次修飾体を合成する工程は、１（ｗ／ｖ）％以上５０（ｗ／ｖ）％以下のゼラチン濃度を有するゼラチン水溶液に、前記ゼラチン水溶液に対する前記メタクリル酸無水物の体積比が１００００：１〜１：１を満たすように、前記メタクリル酸無水物を添加する、請求項５に記載の方法。
- 前記ゼラチン二次修飾体を合成する工程は、０．１（ｗ／ｖ）％以上４０（ｗ／ｖ）％以下のゼラチン一次修飾体濃度を有するゼラチン一次修飾体水溶液に、前記ゼラチン一次修飾体水溶液に対する前記メタクリル酸グリシジルの体積比が１００００：１〜１：１を満たすように、前記メタクリル酸無水物を添加する、請求項５に記載の方法。
- 前記ゼラチン一次修飾体水溶液は、２以上５以下、または、６．５以上８以下の範囲のｐＨを有する、請求項７に記載の方法。
- 架橋ゼラチンハイドロゲル及びその多孔体であって、
請求項１〜４のいずれかに記載のゼラチン誘導体が架橋された架橋体を含有する、架橋ゼラチンハイドロゲル及びその多孔体。 - 前記ゼラチン誘導体の架橋密度は、０．０２ｍｏｌ／ｍ３以上１００００ｍｏｌ／ｍ３以下の範囲を有する、請求項９に記載の架橋ゼラチンハイドロゲル及びその多孔体。
- 細胞を内包する、請求項９に記載の架橋ゼラチンハイドロゲル及びその多孔体。
- 前記細胞は、軟骨細胞、骨芽細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、靭帯細胞、脂肪細胞、神経細胞、血管内皮細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、上皮細胞、肝細胞、膵β細胞、腎臓細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、脂肪由来間葉系幹細胞、神経幹細胞、胚性幹細胞、及び、人工多能性幹細胞からなる群から少なくとも１つ選択される、請求項１１に記載の架橋ゼラチンハイドロゲル及びその多孔体。
- 架橋ゼラチンハイドロゲルを製造する方法であって、
請求項１〜４のいずれかに記載のゼラチン誘導体を用い架橋する、方法。 - 前記ゼラチン誘導体及び光重合開始剤を含有する水溶液を調製する工程と、
前記水溶液に紫外線を照射する工程と
を包含する、請求項１３に記載の方法。 - 前記水溶液を調製する工程によって得られた前記水溶液に細胞を懸濁させて細胞懸濁液を調製する工程をさらに包含し、
前記水溶液に紫外線を照射する工程は、前記細胞懸濁液に紫外線を照射する、請求項１４に記載の方法。 - 架橋ゼラチンハイドロゲル多孔体を製造する方法であって、
請求項１〜４のいずれかに記載のゼラチン誘導体及びゲル粒子を用い架橋する、方法。 - 前記ゼラチン誘導体及び光重合開始剤を含有する水溶液を調製する工程と、
前記水溶液を調製する工程によって得られた前記水溶液にゼラチンハイドロゲルからなるゲル粒子を添加した混合物を調製する工程と、
前記混合物に紫外線を照射する工程と
を包含する、請求項１６に記載の方法。 - 前記水溶液を調製する工程によって得られた前記水溶液に細胞を懸濁させて細胞懸濁液を調製する工程をさらに包含する、請求項１７に記載の方法。
- 前記ゲル粒子は、細胞を内包する、請求項１７または１８に記載の方法。
- 前記細胞は、動物由来の動物細胞である、請求項１５、１８または１９のいずれかに記載の方法。
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