JP2018518961A - 無核細胞への物質の送達 - Google Patents

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Abstract

本発明の対象は、無核細胞（赤血球等）へ物質を送達する方法、システム、物品、及び技法を包含する。急速変形ベースのマイクロ流体システムを使用して、異なるサイズのマクロ分子による赤血球のローディングが示されていた。この技法を使用するいくつかの哺乳類細胞（癌細胞株及び線維芽細胞等）への送達は以前に実証されていたが、それらのデザインは、劇的に異なる物理的特性を有するＲＢＣと適合性がなかった。より小さな狭窄サイズ、早いスピード及び異なるバッファーの使用により、赤血球への送達を成功させることができる。単純でスケールアップ可能な様式で赤血球へロバストに送達することを可能にすることによって、本発明の対象を、物質を送達する様々な適用において実装して、赤血球疾患を研究すること及び／または治療法プラットフォームとして赤血球を使用することができる。関連する装置、システム、技法、及び物品も記載される。
【選択図】図１Ａ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年７月９日に出願された米国仮特許番号第６２／１９０，６７７号の優先権を主張し、その全体は参照により本明細書に援用される。
連邦政府による資金援助を受けた研究の記載
本発明は少なくとも一部が、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ(ＮＩＨ）によって授与されたＲ０１ＧＭ１０１４２０−０１Ａ１及びＮＩＨによって授与されたＲＣ１ＥＢ０１１１８７−０２の下で政府助成により行われた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
本明細書において記載される対象は、物質を無核細胞へ送達すること（例えばマクロ分子を赤血球細胞質へ送達すること）に関する。
成体ヒトはおよそ２０〜３０兆の赤血球（ＲＢＣ）を所定の時間で有し、ヒト身体中の細胞の総数のおよそ４分の１になり、全血液量の４０〜４５％を構成する。ＲＢＣは無核であり（例えば核を欠損する）、血中循環においておよそ１２７日の半減期を有する。この長い半減期及び相対存在量のために、ＲＢＣは新規治療法プラットフォームのための魅力的な候補となる。臨床的に有益な機能を提供するようなＲＢＣの修飾により、それらを使用して長期的な治療法上の利益を促進することができる。これらの治療法上の利益は、細胞内寄生生物（マラリアを引き起こすもの等）に対する治療の分野、及びＲＢＣ機能に影響する遺伝子欠損（例えば鎌型赤血球症）の治療において特に適用可能である。ＲＢＣの長い半減期は、合成担体よりも有意に長い薬物または治療の持続性を可能にすることができ、したがって薬物の持続放出の延長に加えて、最小の注入または投与を可能にする。赤血球はヒト身体中の大部分の部位にアクセスする能力を更に有し、特定の投与経路に制限され得る既存の治療レジメンの適用を拡張する可能性がある。更に、赤血球の寛容原性の性質に起因して、送達された物質は免疫応答を制御するために使用することができる。
しかしながら、赤血球の特有な構造的な特性及び生理学的な特性がそれらの細胞質の中へ物質を送達することを困難にするので、赤血球の修飾はいくつかの難題を提示する。従来の技法（単独でエレクトロポレーション及びリポフェクション等）は、修復機構及びエンドサイトーシス経路の欠損に起因して、これらの細胞タイプには効果がない場合がある。浸透圧ショックを使用する代替の方法は、赤血球を死滅させるかまたは著しく不安定にさせて、赤血球の半減期を著しく低減させ得る。それゆえ、細胞の生存率または機能の損失なしに、化合物をＲＢＣ及び他の無核細胞のサイトゾルへ送達することを可能にするシステム及び方法が当技術分野で必要とされている。
本明細書において記載される方法及びシステムは、他の方法に比較して、これらの細胞の生存率及び機能を維持しながらＲＢＣの浸透の障害を克服した。急速変形ベースのマイクロ流体システムを使用して、異なるサイズのマクロ分子による赤血球のローディングが示されていた。この技法を使用するいくつかの哺乳類細胞（癌細胞株及び線維芽細胞等）への送達は以前に実証されていたが、特定のそれらのマイクロ流体システムのデザインはＲＢＣと適合性がないが、これはプロセシングされる細胞タイプの劇的に異なる物理的特性に起因する。複数のパラメーターの最適化（より小さな狭窄サイズ、高圧、及び異なるバッファーのうちの１つまたは複数の使用が含まれる）を介して、物質をＲＢＣへ送達することに成功した。更に、本発明の対象は、特定の物質だけではなく、様々な物質（核酸、タンパク質、小分子薬物等）を無核細胞のサイトゾルへ送達することを可能にできる。単純でスケールアップ可能な様式でＲＢＣへロバストに送達することを可能にすることによって、本発明の対象を、物質を送達する様々な適用において実装して、赤血球疾患を研究し、治療法プラットフォームとしての赤血球の使用を促進することができる。
本発明の実施形態は、細胞膜における摂動を引き起こすためのマイクロ流体システムであって、内腔を画成し、バッファー中に懸濁された細胞がそれを介して通過できるように構成される、少なくとも１つのマイクロ流体チャネルを含み、該マイクロ流体チャネルが、長さ、深さ、及び幅を含む少なくとも１つの細胞変形狭窄を含み、該狭窄の幅が４μｍ未満である、該システムに関する。本開示のこの態様の一実施形態において、前記細胞は無核である。本開示のこの態様の一実施形態において、前記細胞は、赤血球（ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）、赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）、網状赤血球、または血小板のうちの１つまたは複数である。本開示のこの態様の更なる一実施形態において、バッファー中に懸濁された前記細胞は、非修飾血液を含む。本開示のこの態様の更なる一実施形態において、前記細胞は健康な細胞である。本開示のこの態様の一実施形態において、前記細胞は疾患細胞または感染細胞である。
本開示のある特定の実施形態は、細胞膜における摂動を引き起こすための本明細書において記載されるマイクロ流体システムであって、内腔を画成し、バッファー中に懸濁された細胞がそれを介して通過できるように構成される、少なくとも１つのマイクロ流体チャネルを含み、該マイクロ流体チャネルが、長さ、深さ、及び幅を含む少なくとも１つの細胞変形狭窄を含み、該狭窄の幅が４μｍ未満である、該システムに関する。本開示のこの態様のある特定の実施形態において、狭窄の幅は０．５μｍ〜４μｍである。本開示のこの態様の更なる実施形態において、狭窄の幅は３μｍ〜４μｍである。本開示のこの態様の更なる一実施形態において、狭窄の幅は細胞の最大直径未満である。本開示のこの態様のいくつかの実施形態において、幅は細胞の最大直径の約２０％〜約９９％である。本開示のこの態様の更なる一実施形態において、狭窄の長さは３０μｍ以下である。本開示のこの態様の更なる一実施形態において、長さは１０μｍ〜３０μｍである。本開示のこの態様のある特定の実施形態において、狭窄の長さは１０μｍ〜２０μｍである。本開示のこの態様の更なる一実施形態において、狭窄の深さは１μｍ〜１ｍｍである。さらなる実施形態において、狭窄の深さは約２０μｍである。本開示のこの態様のある特定の実施形態において、狭窄の深さ及び狭窄の幅は等しい。
本開示のある特定の実施形態は、細胞膜における摂動を引き起こすための本明細書において記載されるマイクロ流体システムであって、内腔を画成し、バッファー中に懸濁された細胞がそれを介して通過できるように構成される、少なくとも１つのマイクロ流体チャネルを含み、該マイクロ流体チャネルが、長さ、深さ、及び幅を含む少なくとも１つの細胞変形狭窄を含み、該狭窄の幅が４μｍ未満である、該システムに関する。本開示のこの態様のある特定の実施形態において、マイクロ流体システムは複数のマイクロ流体チャネルを含む。本開示のこの態様の更なる一実施形態において、マイクロ流体システムは、チャネルが並列して配置される複数のマイクロ流体を含む。本開示のこの態様のある特定の実施形態において、マイクロ流体システムは複数の細胞変形狭窄を含む。本開示のこの態様の更なる一実施形態において、マイクロ流体システムは、同じマイクロ流体チャネルにおいて連続して配置される、複数の細胞変形狭窄を含む。
本開示のある特定の実施形態は、細胞膜における摂動を引き起こすためのマイクロ流体システムであって、内腔を画成し、バッファー中に懸濁された細胞がそれを介して通過できるように構成される、少なくとも１つのマイクロ流体チャネルを含み、該マイクロ流体チャネルが、長さ、深さ、及び幅を含む少なくとも１つの細胞変形狭窄を含み、該狭窄の幅が４μｍ未満である、該システムを包含する。本開示のこの態様のある特定の実施形態は、バッファー中に懸濁された細胞を細胞変形狭窄を介して通過させるために、バッファーへ圧力を適用するように適合させた、細胞駆動装置を更に含む、マイクロ流体システムを含む。本開示のこの態様の更なる実施形態において、細胞駆動装置は、バッファーへ９０ｐｓｉを超える圧力を適用するように適合される。本開示のこの態様の更なる実施形態において、細胞駆動装置は、１２０ｐｓｉの圧力を適用するように適合される。本開示のこの態様のなお更なる実施形態において、細胞駆動装置は、圧力ポンプ、ガスボンベ、コンプレッサー、真空、シリンジ、シリンジポンプ、ペリスタポンプ、ピペット、ピストン、キャピラリーアクター、ヒト心臓、ヒト筋肉、重力、及びマイクロ流体ポンプを含む群から選択される。
本開示のある特定の実施形態は、細胞膜における摂動を引き起こすためのマイクロ流体システムであって、内腔を画成し、バッファー中に懸濁された細胞がそれを介して通過できるように構成される、少なくとも１つのマイクロ流体チャネルを含み、該マイクロ流体チャネルが、長さ、深さ、及び幅を含む少なくとも１つの細胞変形狭窄を含み、該狭窄の幅が４μｍ未満である、該システムを包含する。本開示のこの態様の更なる実施形態は、チャネルの横断面が、円形、楕円形、細長いスリット、正方形、六角形、及び三角形からなる群から選択される、マイクロ流体システムを包含する。
本開示のある特定の実施形態は、圧力を細胞へ適用してペイロードの通過に十分な大きさの該細胞の摂動を引き起こすように、バッファー中に懸濁された該細胞を細胞変形狭窄を含むマイクロ流体チャネルを介して通過させることであって、該狭窄の幅が４μｍ未満である、該通過させることと、該細胞が該狭窄を介して通過する前または後に所定時間にわたってペイロード含有溶液中で該細胞をインキュベーションすることと、を含む方法に関する。本開示のこの態様の更なる一実施形態において、細胞は無核（ａ ｎｕｃｌｅａｔｅ）である。本開示のこの態様のある特定の実施形態において、細胞は、赤血球、赤血球、網状赤血球、または血小板のうちの１つまたは複数である。本開示のこの態様の更なる一実施形態において、バッファー中に懸濁された細胞は非修飾血液を包含する。本開示のこの態様のある特定の実施形態において、細胞は健康な細胞である。本開示のこの態様のある特定の実施形態において、細胞は感染細胞または疾患細胞である。
本開示のある特定の実施形態は、圧力を細胞へ適用してペイロードの通過に十分な大きさの該細胞の摂動を引き起こすように、バッファー中に懸濁された該細胞を細胞変形狭窄を含むマイクロ流体チャネルを介して通過させることであって、該狭窄の幅が４μｍ未満である、該通過させることと、該細胞が該狭窄を介して通過する前または後に所定時間にわたってペイロード含有溶液中で該細胞をインキュベーションすることと、を含む方法に関する。本開示のこの態様の更なる一実施形態において、狭窄の幅は０．５μｍ〜４μｍである。本開示のこの態様の更なる一実施形態において、狭窄の幅は３μｍ〜４μｍである。本開示のこの態様のある特定の実施形態において、狭窄の幅は細胞の最大直径未満である。本開示のこの態様のある特定の実施形態において、狭窄の幅は細胞の最大直径の約２０％〜約９９％である。
本開示のある特定の実施形態は、圧力を細胞へ適用してペイロードの通過に十分な大きさの該細胞の摂動を引き起こすように、バッファー中に懸濁された該細胞を細胞変形狭窄を含むマイクロ流体チャネルを介して通過させることであって、該狭窄の幅が４μｍ未満である、該通過させることと、該細胞が該狭窄を介して通過する前または後に所定時間にわたってペイロード含有溶液中で該細胞をインキュベーションすることと、を含む方法に関する。本開示のこの態様の更なる一実施形態において、細胞へ適用される圧力は９０ｐｓｉより大きい。本開示のこの態様の更なる一実施形態において、細胞へ適用される圧力は１２０ｐｓｉである。本開示のこの態様のある特定の実施形態において、バッファーは細胞を膨潤させる低張バッファーである。
本開示のある特定の実施形態は、圧力を細胞へ適用してペイロードの通過に十分な大きさの該細胞の摂動を引き起こすように、バッファー中に懸濁された該細胞を細胞変形狭窄を含むマイクロ流体チャネルを介して通過させることであって、該狭窄の幅が４μｍ未満である、該通過させることと、該細胞が該狭窄を介して通過する前または後に所定時間にわたってペイロード含有溶液中で該細胞をインキュベーションすることと、を含む方法に関する。本開示のこの態様の更なる一実施形態において、ペイロード含有溶液は、タンパク質、小分子、核酸、脂質、炭水化物、マクロ分子、ビタミン、ポリマー、蛍光色素、フルオロフォア、カーボンナノチューブ、量子ドット、ナノ粒子、またはステロイドのうちの１つまたは複数を含む。本開示のこの態様の更なる一実施形態において、ペイロード含有溶液はタンパク質またはデキストランポリマーを含む。本開示のこの態様のある特定の実施形態において、ペイロード含有溶液はタンパク質及びデキストランポリマーを含む。本開示のこの態様の更なる一実施形態において、ペイロード含有溶液は小分子またはタンパク質を含む。本開示のこの態様のある特定の実施形態において、ペイロード含有溶液は小分子及びタンパク質を含む。さらなる実施形態において、ペイロード含有溶液は、クロロキン、アトバクオン−プログアニル、アルテメテル／リメファントリン（ｌｙｍｅｆａｎｔｒｉｎｅ）、キニーネ硫酸塩、メフロキン、ヒドロキシクロロキン、プリマキン、キニジン、アルテスネート、アルテミシニン、スルファドキシン／プリメサミン（ｐｒｙｉｍｅｔｈａｍｉｎｅ）、アモジアキン、スルホンアミド、ハロファントリン、ドキシサイクリン、テトラサイクリン、クリンダマイシン、ヒドロキシ尿素、ハイドレア、ビタミンＥ、Ｌ−グルタミン、アシクロビル、ガンシクロビル、バラシクロビル、またはペンシクロビル、トリ−ペプチドもしくはテトラ−ペプチドのうちの１つまたは複数を含む。
本開示のある特定の実施形態は、圧力を細胞へ適用してペイロードの通過に十分な大きさの該細胞の摂動を引き起こすように、バッファー中に懸濁された該細胞を細胞変形狭窄を含むマイクロ流体チャネルを介して通過させることであって、該狭窄の幅が４μｍ未満である、該通過させることと、該細胞が該狭窄を介して通過する前または後に所定時間にわたってペイロード含有溶液中で該細胞をインキュベーションすることと、を含む方法に関する。本開示のこの態様の更なる一実施形態において、マイクロ流体チャネルの横断面は、円形、楕円形、細長いスリット、正方形、六角形、及び三角形からなる群から選択される。本開示のこの態様のある特定の実施形態において、ペイロード含有溶液中での細胞のインキュベーションは、０．０００１秒〜２０分間にわたって細胞をインキュベーションすることを含む。
本開示のある特定の実施形態は、感染または疾患を治療する方法であって、圧力を細胞へ適用してペイロードの通過に十分な大きさの該細胞の摂動を引き起こすように、バッファー中に懸濁された該細胞を細胞変形狭窄を含むマイクロ流体チャネルを介して通過させることであって、該狭窄の幅が４μｍ未満である、該通過させることと、該細胞が該狭窄を介して通過する前または後に所定時間にわたってペイロード含有溶液中で該細胞をインキュベーションすることと、該ペイロードが細胞内に含有されるように、該細胞の該摂動が停止するのを所定時間にわたって待機することと、該細胞の投与を、それを必要とする患者に行うことと、を含む、該方法に関する。本開示のこの態様の更なる一実施形態において、細胞は無核である。本開示のこの態様のある特定の実施形態において、細胞は、赤血球（ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）、赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）、網状赤血球、または血小板のうちの１つまたは複数である。本開示のこの態様の更なる一実施形態において、バッファー中に懸濁された細胞は非修飾血液を包含する。更なる実施形態において、細胞は健康な細胞である。ある特定の実施形態において、細胞は疾患細胞または感染細胞である。
本開示のある特定の実施形態は、感染または疾患を治療する方法であって、圧力を細胞へ適用してペイロードの通過に十分な大きさの該細胞の摂動を引き起こすように、バッファー中に懸濁された該細胞を細胞変形狭窄を含むマイクロ流体チャネルを介して通過させることであって、該狭窄の幅が４μｍ未満である、該通過させることと、該細胞が該狭窄を介して通過する前または後に所定時間にわたってペイロード含有溶液中で該細胞をインキュベーションすることと、該ペイロードが細胞内に含有されるように、該細胞の該摂動が停止するのを所定時間にわたって待機することと、該細胞の投与を、それを必要とする患者に行うことと、を含む、該方法に関する。本開示のこの態様の更なる一実施形態において、狭窄の幅は０．５μｍ〜４μｍである。本開示のこの態様の更なる一実施形態において、狭窄の幅は３μｍ〜４μｍである。本開示のこの態様のある特定の実施形態において、狭窄の幅は細胞の最大直径未満である。本開示のこの態様のある特定の実施形態において、狭窄の幅は細胞の最大直径の約２０％〜約９９％である。
本開示のある特定の実施形態は、感染または疾患を治療する方法であって、圧力を細胞へ適用してペイロードの通過に十分な大きさの該細胞の摂動を引き起こすように、バッファー中に懸濁された該細胞を細胞変形狭窄を含むマイクロ流体チャネルを介して通過させることであって、該狭窄の幅が４μｍ未満である、該通過させることと、該細胞が該狭窄を介して通過する前または後に所定時間にわたってペイロード含有溶液中で該細胞をインキュベーションすることと、該ペイロードが細胞内に含有されるように、該細胞の該摂動が停止するのを所定時間にわたって待機することと、該細胞の投与を、それを必要とする患者に行うことと、を含む、該方法に関する。本開示のこの態様の更なる実施形態において、細胞へ適用される圧力は９０ｐｓｉより大きい。本開示のこの態様のある特定の実施形態において、細胞へ適用される圧力は１２０ｐｓｉである。本開示のこの態様の更なる実施形態において、バッファーは細胞を膨潤させる低張バッファーである。本開示のこの態様のある特定の実施形態において、マイクロ流体チャネルの横断面は、円形、楕円形、細長いスリット、正方形、六角形、及び三角形からなる群から選択される。更なる実施形態において、ペイロード含有溶液中での細胞のインキュベーションは、０．０００１秒〜２０分間にわたって細胞をインキュベーションすることを含む。
本開示のある特定の実施形態は、感染または疾患を治療する方法であって、圧力を細胞へ適用してペイロードの通過に十分な大きさの該細胞の摂動を引き起こすように、バッファー中に懸濁された該細胞を細胞変形狭窄を含むマイクロ流体チャネルを介して通過させることであって、該狭窄の幅が４μｍ未満である、該通過させることと、該細胞が該狭窄を介して通過する前または後に所定時間にわたってペイロード含有溶液中で該細胞をインキュベーションすることと、該ペイロードが細胞内に含有されるように、該細胞の該摂動が停止するのを所定時間にわたって待機することと、該細胞の投与を、それを必要とする患者に行うことと、を含む、該方法に関する。更なる実施形態において、ペイロード含有溶液は、タンパク質、小分子、核酸、脂質、炭水化物、マクロ分子、ビタミン、ポリマー、蛍光色素、フルオロフォア、カーボンナノチューブ、量子ドット、ナノ粒子、またはステロイドのうちの１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態において、ペイロード含有溶液は小分子またはタンパク質を含む。ある特定の実施形態において、ペイロード含有溶液は小分子及びタンパク質を含む。ある特定の実施形態において、ペイロード含有溶液は、ヒドロキシ尿素、ハイドレア、ビタミンＥ、Ｌ−グルタミン、アシクロビル、ガンシクロビル、バラシクロビル、ペンシクロビル、トリ−ペプチド、またはテトラ−ペプチドのうちの１つまたは複数を含む。本開示のこの態様のある特定の実施形態において、細胞は鎌型赤血球症に冒された細胞である。更なる実施形態において、ペイロード含有溶液は、クロロキン、アトバクオン−プログアニル、アルテメテル／リメファントリン（ｌｙｍｅｆａｎｔｒｉｎｅ）、キニーネ硫酸塩、メフロキン、ヒドロキシクロロキン、プリマキン、キニジン、アルテスネート、アルテミシニン、スルファドキシン／プリメサミン（ｐｒｙｉｍｅｔｈａｍｉｎｅ）、アモジアキン、スルホンアミド、ハロファントリン、ドキシサイクリン、テトラサイクリン、またはクリンダマイシンのうちの１つまたは複数を含む。本開示のこの態様のある特定の実施形態において、細胞はマラリアを引き起こす寄生生物に感染している。更なる実施形態において、マラリアを引き起こす寄生生物はＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍである。
本開示のある特定の実施形態は、感染または疾患を治療する方法であって、圧力を細胞へ適用してペイロードの通過に十分な大きさの該細胞の摂動を引き起こすように、バッファー中に懸濁された該細胞を細胞変形狭窄を含むマイクロ流体チャネルを介して通過させることであって、該狭窄の幅が４μｍ未満である、該通過させることと、該細胞が該狭窄を介して通過する前または後に所定時間にわたってペイロード含有溶液中で該細胞をインキュベーションすることと、該ペイロードが細胞内に含有されるように、該細胞の該摂動が停止するのを所定時間にわたって待機することと、該細胞の投与を、それを必要とする患者に行うことと、を含む、該方法に関する。ある特定の実施形態において、該細胞の投与を必要とする患者は鎌型赤血球症を患っている。ある特定の実施形態において、該細胞の投与を必要とする患者はマラリアを引き起こす寄生生物に感染している。ある特定の実施形態において、該細胞の投与を必要とする患者はＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍに感染している。
本明細書において記載される対象の１つまたは複数の変形形態の詳細は、以下の添付の図面及び記載中で示される。本明細書において記載される対象の他の特徴及び利点は、説明、図面、及び特許請求の範囲から明らかになる。
図１Ａ及び図１Ｂは、物質（マクロ分子等）を無核細胞（ＲＢＣ等）へ送達するために使用することができるマイクロ流体システム（５）の例を図示する。管状内腔を画成するチャネルを含む、マイクロ流体システム（５）が示される。マイクロ流体チャネルは、中心点（４０）、入口部分（３５）、及び出口部分（４５）を備えた狭窄（１５）を包含する。バッファー（２５）中に懸濁された細胞（２０）、狭窄（１５）を介して通過する細胞（２０１として示される）、摂動された細胞（２０２）、及びプロセシング後の膜が破壊されたままの時間（τ）も示される。また、図１Ｂには、送達物質（３０）及び送達された細胞（２０３）も示される。 図２Ａ及び図２Ｂは、物質（マクロ分子等）を無核細胞（ＲＢＣ等）へ送達するために使用することができるマイクロ流体システムの例を図示する。図２Ａには、長さ（Ｌ）及び幅（Ｗ）を備えた狭窄、ならびに狭窄の角度（α）を含む入口部分を含む、マイクロ流体チャネルが示される。プロセシング後の膜が破壊されたままの時間（τ）及び送達物質（正方形）も示される。図２Ｂには、長さ、幅、及び深さを備えた狭窄を含む、マイクロ流体チャネルの別の概観図が示される。 図３Ａ〜図３Ｃは、例示的なマイクロ流体システムを使用する、ＲＢＣへの物質の送達を図示する一連のプロット、及びＲＢＣへの物質の送達の間の赤血球の一連の画像を示す。７０ｋＤａのデキストラン−フルオレセイン（図３Ａ）及び１０ｋＤａのデキストラン−アロフィコシアニン（ＡＰＣ、図３Ｂ）が、２つのデバイスデザイン（１つは１０μｍの長さ−４μｍの幅の単一の狭窄を備えたもの（１０μｍ×４μｍ）、もう１つは３０μｍの長さ−５μｍの幅の５つの狭窄を並列で備えたもの（３０μｍ×５μｍ、×５））のうちの１つを使用して送達される。図３Ａ及び図３Ｂ中のヒストグラムインサートは、送達されない集団と比較した、送達された集団（Ｍ１、図３Ａ及びＭ７、図３Ｂ）を示す。図３Ｃは、寄生生物増殖の様々な期でのＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ寄生生物の同調培養により感染させたＲＢＣサンプルのギムザ染色のフィルム塗抹標本を示す。時点１（Ｔ１）はリング期寄生生物（侵入後＜１８時間）を反映し、時点２はトロホゾイト期寄生生物（＜Ｔ１＋８時間）を反映し、時点３はトロホゾイト期寄生生物（Ｔ１＋２２時間）、時点４はシゾント期寄生生物（Ｔ１＋３０時間）を反映する。 図４Ａ〜図４Ｂは、１０ｋＤａのデキストラン−ＡＰＣ（図４Ａ、左側パネル）、７０ｋＤａのデキストラン−フルオレセイン（図４Ａ、中央パネル）、及び組換えシアン融合タンパク質（ＣＦＰ）−黄色融合タンパク質（ＹＦＰ）融合物（６２ｋＤａのＣＦＰ−ＹＦＰ融合物）（図４Ａ、右側パネル）の、トロホゾイト期のＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ寄生生物に感染した（棒グラフの上部）または感染していない（棒グラフの下部）ＲＢＣへの、３０μｍ×５μｍ、×５のデザインによるマイクロ流体デバイスを使用する送達を図示する。図４Ｂは、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍに感染し処理されていないＲＢＣの写真を示す。 図５Ａ〜図５Ｂは、図１Ａ〜図１Ｂ及び図２Ａ〜図２Ｂ中で記載及び示された例示的マイクロ流体システム（図５Ａ）、脂質、ポリマー、ナノ粒子、ＲＮＡ、ＤＮＡ、抗体、タンパク質、不透過性小分子、及びフルオロフォアを含む例示的送達物質（図５Ｂ）を図示する。
様々な図面中の同様の参照記号は同様の要素を示す。
本明細書において記載される対象は、多くの技術的な利点を提供し、治療法プラットフォームとしてのＲＢＣの使用を可能にすることができる。赤血球は、血中循環中での長い半減期（最大１２７日）に起因して理想的な薬物担体であり得る。しかしながら、赤血球は、能動的膜回復プロセスの欠損（ｍＲＮＡを転写することができない等）（Ｓｈａｒｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｇｒ Ｂｉｏｌ（Ｃａｍｂ）．２０１４ Ａｐｒ；６（４）：４７０−４７５）、他の能動的プロセス（エンドサイトーシス等）の欠損に加えて、それらの柔軟な性質及び両凹面形に起因して操作することが特に困難であり得る。本発明の対象の例示的実装は、赤血球へ物質を送達するために、能動的エンドサイトーシスに依存せず、本明細書において記載されるシステムのための条件の特有の組み合わせを使用して、これらの難題を克服する。それゆえ、本発明は、能動的膜修復プロセスの欠損にもかかわらず、ＲＢＣがそれらの膜における摂動を回復させることができるという予想外の所見に、少なくとも部分的に基づく。
本開示は、物質を無核細胞（ＲＢＣ等）のサイトゾルへ送達できるマイクロ流体システム及び使用の方法に関する。特定の実施形態において、マイクロ流体システムは、内腔を画成し、バッファー中に懸濁された細胞がそれを介して通過することができるように構成される、少なくとも１つのマイクロ流体チャネルを含み、該マイクロ流体チャネルは、幅、深さ、及び長さを含む少なくとも１つの細胞変形狭窄を含み、該幅は４μｍ未満である。
本発明の実施形態は、化合物及び物質（例えばペイロードまたはカーゴ）を無核細胞（例えば赤血球）のサイトゾルへ送達する方法であって、圧力を無核細胞へ適用してペイロードの通過に十分な大きさの該無核細胞の摂動を引き起こすように、バッファー中に懸濁された該無核細胞を、細胞変形狭窄を含む本明細書において記載されるマイクロ流体チャネルを介して通過させることと、該細胞が該狭窄を介して通過した後に該ペイロードが該無核細胞のサイトゾルの中へ入ることを可能にする時間にわたってペイロード含有溶液中で該無核細胞をインキュベーションすることと、を含む、該方法にも関する。本発明の更なる実施形態は、感染または疾患を治療する方法であって、バッファー中に懸濁された無核細胞を細胞変形狭窄を含むマイクロ流体デバイスを介して通過させることと、所定時間にわたってペイロード含有溶液中で該細胞をインキュベーションすることと、該ペイロードが細胞内に含有されるように、該摂動が停止するのを待機することと、該細胞の投与を、それを必要とする患者に行うことと、を含む、該方法に関する。なお更なる実施形態において、前記ペイロード含有溶液は、マラリアまたは鎌型赤血球貧血症の治療において使用される薬物を含む。
この明細書中の各々の実施形態は、特別に明記しない限り、必要な変更を加えて他の全ての実施形態へ適用されるべきである。
本開示の詳細は、以下の添付の説明中で示される。本開示の実践または試験において、本明細書において記載されるものに類似するか等価である方法及び物質を使用することができるが、例示的な方法及び物質がここで記載される。本開示の他の特徴、対象物、及び利点は、説明及び特許請求の範囲から明らかになる。明細書及び添付された特許請求の範囲において、単数形は文脈が明確に指示しない限り複数も含む。特別に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって共通して理解されるものと同じ意味を有する。本明細書中で引用されるすべての特許及び出版物は、それらの全体を参照によって本明細書に援用される。
本明細書及び添付特許請求の範囲において使用される時、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」には、特別に内容が明確に指示しない限り複数の参照が含まれる。
本明細書において使用される時、「及び／または」という用語は、特別の指示のない限り、本開示において「及び」または「または」のいずれかであるように使用される。
「約」という用語は、本明細書において使用される時、本技術分野における当業者に容易に公知となるそれぞれの値についての通常の誤差範囲を指す。本明細書における値またはパラメーターの「約」への参照は、その値またはパラメーターそれ自体に関する実施形態を含む(記述する)。
本明細書を通して、文脈が特別に要求しない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語、または変形（「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等）は、明示された要素もしくは整数値、または要素もしくは整数値の群を包含するが、他の要素もしくは整数値、または要素もしくは整数値の群のいずれも除外しないことを示唆すると理解されることになる。
上述の記載及び特許請求の範囲において、「〜のうちの少なくとも１つ」または「〜のうちの１つまたは複数」等の語句は、接続して列挙される要素または特徴の後に出現し得る。「及び／または」という用語は、列挙される２つ以上の要素または特徴においても出現し得る。かかる語句は、特別にそれが使用される文脈によって黙示的または明確に否定されない限り、列挙された要素もしくは特徴のうちのいずれかを個別に、または他の列挙された要素もしくは特徴のいずれかと組み合わせた列挙された要素もしくは特徴のうちのいずれかを意味するように意図される。例えば、「Ａ及びＢのうちの少なくとも１つ」；「Ａ及びＢのうちの１つまたは複数」；及び「Ａ及び／またはＢ」という語句は、各々「Ａ単独、Ｂ単独、またはＡ及びＢを一緒に」を意味するように意図される。３つ以上の項目を含む列挙項目についても同様に解釈されることが意図される。例えば、「Ａ、Ｂ、及びＣのうちの少なくとも１つ」；「Ａ、Ｂ、及びＣのうちの１つまたは複数」；及び「Ａ、Ｂ、及び／またはＣ」という語句は、各々「Ａ単独、Ｂ単独、Ｃ単独、Ａ及びＢを一緒に、Ａ及びＣを一緒に、Ｂ及びＣを一緒に、またはＡ及びＢ及びＣを一緒に」を意味することが意図される。加えて、「に基づく」という用語の上述及び特許請求の範囲での使用は、列挙されていない特徴または要素も許容可能であるように、「〜に少なくとも部分的に基づく」を意味するように意図される。
マイクロ流体システム及びデバイス
本明細書において使用される時、「マイクロ流体システム」は、低体積（例えばμＬ、ｎＬ、ｐＬ、ｆＬ）の流体が、小体積の液体の離散的な処理を達成するようにプロセシングされるシステムを指す。本明細書において記載されるある特定の実装には、マルチプレックス化、自動化、及びハイスループットスクリーニングが含まれる。流体（例えばバッファー、溶液、ペイロード含有溶液、または細胞懸濁物）は、移動されるか、混合されるか、分離されるか、またはそうでなければプロセシングされ得る。本明細書において記載されるある特定の実施形態において、マイクロ流体システムを使用して、バッファー中に懸濁された細胞へ機械的狭窄を適用し、ペイロードまたは化合物が細胞のサイトゾルに入ることを可能にする細胞における摂動（例えば穴）を誘導する。
本明細書において使用される時、「狭窄」は、入口部分、中心点、及び出口部分によって画成されるマイクロ流体チャネルの一部分を指し、この場合中心点は幅、長さ、及び深さによって画成される。本明細書において使用される時、「狭窄の幅」は、中心点でのマイクロ流体チャネルの幅を指す。いくつかの実施形態において、狭窄は約６μｍ未満の幅を有する。例えば、いくつかの実施形態において、狭窄は、約０．６μｍ、０．７μｍ、０．８μｍ、０．９μｍ、１μｍ、１．５μｍ未満、または２μｍ未満であり得る。いくつかの実施形態において、狭窄は約４μｍ未満の幅を有する。本発明のある特定の態様において、狭窄は約０．５μｍ〜約４μｍの幅を有する。更なる実施形態において、狭窄は約３μｍ〜４μｍの幅を有する。更なる実施形態において、狭窄は約２μｍ〜４μｍの幅を有する。更なる態様において、狭窄は約３．９μｍ以下の幅を有する。更なる態様において、狭窄は約３μｍの幅を有する。ある特定の実施形態において、単一細胞が一度で狭窄を介して通過するように、狭窄が構成される。
本明細書において使用される時、「狭窄の長さ」は、中心点でのマイクロ流体チャネルの長さを指す。本発明のある特定の態様において、狭窄の長さは約３０μｍ以下である。いくつかの実施形態において、狭窄の長さは約１０μｍ〜約３０μｍである。ある特定の実施形態において、狭窄の長さは約１０μｍ〜約２０μｍである。例えば、狭窄の長さは、約１１μｍ、１２μｍ、１３μｍ、１４μｍ、１５μｍ、２０μｍ、または約２５μｍ（１０μｍ〜３０μｍのすべての整数、小数、及び分数が含まれる）であり得る。狭窄の長さは、細胞が狭窄下にある時間の長さを増加させるように変動させることができる（例えば、より長い長さは所定の流速でより長い狭窄時間をもたらす）。狭窄の長さは、細胞が狭窄下にある時間の長さを減少させるように変動させることができる（例えば、より短い長さは所定の流速でより短い狭窄時間をもたらす）。
本明細書において使用される時、「狭窄の深さ」は、中心点でのマイクロ流体チャネルの深さを指す。狭窄の深さは、よりタイトな狭窄を提供し、それによって送達を促進するように調整することができる（狭窄の幅の調整に類似する）。いくつかの実施形態において、狭窄の深さは約１μｍ〜約１ｍｍ（１μｍ〜１ｍｍのすべての整数、小数、及び分数が含まれる）である。いくつかの実施形態において、深さは約２０μｍである。いくつかの実施形態において、深さはチャネルの全体にわたって一定である。ある特定の実施形態において、深さは狭窄点で減少して、細胞のより大きな狭窄をもたらす。いくつかの実施形態において、深さは狭窄点で増加されて、細胞のより少ない狭窄をもたらす。いくつかの実施形態において、狭窄の深さは狭窄の幅より大きい。ある特定の実施形態において、狭窄の深さは狭窄の幅未満である。いくつかの実施形態において、狭窄の深さ及び狭窄の幅は等しい。
本明細書において使用される時、マイクロ流体デバイスの寸法は、狭窄の長さ、幅、及び数によって表示される。例えば、狭窄の３０μｍの長さ、５μｍの幅、及び５つの狭窄を備えたマイクロ流体デバイスは、本明細書において３０×５×５（狭窄のＬ×Ｗ×＃）として表わされる。
いくつかの実施形態において、マイクロ流体システムは、少なくとも１つのマイクロ流体チャネルを含む少なくとも１つ狭窄を含む。いくつかの実施形態において、マイクロ流体システムは、各々少なくとも１つの狭窄を含む複数のマイクロ流体チャネルを含む。例えば、マイクロ流体システムは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、５０、１００、５００、１０００以上（１０〜５０、５０〜１００、１００〜５００、５００〜１０００等の整数がすべて含まれる）のマイクロ流体チャネルを含むことができる。ある特定の態様において、それぞれが１つの狭窄を含む複数のマイクロ流体チャネルは、並列して配置される。ある特定の態様において、それぞれが１つの狭窄を含む複数のマイクロ流体チャネルは、直線的に連続して配置される。本発明のある特定の態様において、マイクロ流体システムは、複数の狭窄を含む１つのマイクロ流体チャネルを含む。例えば、１つのマイクロ流体チャネルは、２、３、４、５、１０、２０以上の狭窄を含み得る。いくつかの実施形態において、マイクロ流体システムは、複数の狭窄を含む複数のマイクロ流体チャネルを含む。本発明のいくつかの態様において、複数の狭窄を含む複数のマイクロ流体チャネルは、並列して配置される。本発明のいくつかの態様において、複数の狭窄を含む複数のマイクロ流体チャネルは、直線的に連続して配置される。
入口部分は、チャネルの直径が狭窄の中心点に向かって減少する速度を増加または減少するように変動し得る「狭窄の角度」を含むことができる。狭窄の角度は、細胞がそれを介して通過するが、マイクロ流体システムの閉塞を最小限にするように変動させることができる。例えば、狭窄の角度は１〜１４０度であり得る。ある特定の実施形態において、狭窄の角度は１〜９０度であり得る。出口部分も、非一方向流をもたらし得る乱流／渦が生じる可能性を減少させる角度を含むことができる。例えば、出口部分の角度は１〜１４０度であり得る。ある特定の実施形態において、出口部分の角度は１〜９０度であり得る。
マイクロ流体チャネル、入口部分、中心点、及び出口部分の横断面は変動し得る。様々な横断面の非限定的例には、円形、楕円形、細長いスリット、正方形、六角形、または三角形の横断面が含まれる。
無核細胞（例えばＲＢＣ）が本明細書において記載されるマイクロ流体チャネルを介して通過する速度を変動させて、細胞への送達物質の送達を制御することもできる。例えば、細胞がマイクロ流体チャネルを通過する速度を調整することは、圧力が細胞へ適用される時間を変動させることができ、圧力が細胞へ適用される速度を変動させることができる。いくつかの実施形態において、細胞は少なくとも０．１ｍｍ／秒の速度でマイクロ流体システムを介して通過することができる。更なる実施形態において、細胞は、０．１ｍｍ／秒〜５ｍ／秒（すべてに整数及び小数が含まれる）の速度でマイクロ流体システムを介して通過することができる。なお更なる実施形態において、細胞は、１０ｍｍ／秒〜５００ｍｍ／秒（すべてに整数及び小数が含まれる）の速度でマイクロ流体システムを介して通過することができる。いくつかの実施形態において、細胞は、５メートル／秒を超える速度でシステムを介して通過することができる。
細胞は、圧力の適用によってマイクロ流体チャネルを介して移動させる（例えば、押される）。いくつかの実施形態において、前記圧力は細胞駆動装置によって適用される。本明細書において使用される時、細胞駆動装置は、狭窄を介して細胞を駆動するために、バッファーまたは溶液へ圧力または力を適用するデバイスまたは構成要素である。いくつかの実施形態において、圧力は細胞駆動装置によって注入口で適用され得る。いくつかの実施形態において、真空圧力は細胞駆動装置によって排出口で適用され得る。ある特定の実施形態において、細胞駆動装置は９０ｐｓｉを超える圧力を供給するように適合される。例えば、細胞駆動装置によって供給された圧力は、９１、９２、９３、９４、９５、１００、１１０、１２０、１３０、または１５０ｐｓｉを超え得る。更なる実施形態において、細胞駆動装置は、１２０ｐｓｉの圧力を適用するように適合される。ある特定の実施形態において、細胞駆動装置は、圧力ポンプ、ガスボンベ、コンプレッサー、真空ポンプ、シリンジポンプ、ペリスタポンプ、ピペット、ピストン、キャピラリーアクター、ヒト心臓、ヒト筋肉、重力、マイクロ流体ポンプ、及びシリンジからなる群から選択される。細胞駆動装置によって適用された圧力の修正も、細胞がマイクロ流体チャネルを介して通過する速度に影響する（例えば圧力の量の増加は細胞速度の増加をもたらすことになる）。
細胞（例えば無核細胞）が狭窄を介して通過する場合に、その膜は摂動され、膜の一時的破壊を引き起こし、周囲の媒質中に存在するペイロードの取り込みをもたらす。本明細書において使用される時、これらの一時的破壊は「摂動」と称される。本明細書において記載される方法によって生じる摂動は、細胞の外からの物質が細胞の中へ移動することを可能にする、細胞における割れ目である。摂動の非限定的例には、穴、裂け目、くぼみ、開口、孔、破れ目、隙間、または穿孔が含まれる。本明細書において記載される方法によって生じる摂動（例えば孔または穴）は、多量体孔構造（補体または細菌性溶血素によって形成されるもの等）を形成する、タンパク質サブユニットのアセンブリーの結果として形成されない。
無核細胞及び生理学
本明細書において使用される時、「無核細胞」は、核を欠損する細胞を指す。かかる細胞には、血小板、赤血球（ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）または赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）（本明細書において互換的に使用される）、及び網状赤血球が含まれ得るが、これらに限定されない。網状赤血球は、典型的にはヒト身体中の赤血球の約１％を構成する未成熟（例えば、まだ両凹面でない）赤血球である。網状赤血球も無核である。ある特定の実施形態において、本明細書において記載されるシステム及び方法は、無核細胞（例えばＲＢＣ、網状赤血球、及び／または血小板）の、濃縮された（例えば天然で見出されるよりも高いパーセンテージの全細胞集団を含む）集団、精製された集団、または単離された（例えばそれらの天然環境から、実質的に純粋なまたは均一の形状で）集団の処理及び／またはプロセシングに使用される。ある特定の実施形態において、本明細書において記載されるシステム及び方法は、ＲＢＣ、網状赤血球、血小板に加えて、他の血球を含有する全血の処理及び／またはプロセシングに使用される。これらの細胞タイプの精製または濃縮は、公知の方法（密度勾配システム（例えばＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、磁気細胞選別、または赤芽細胞及び赤芽球前駆細胞のインビトロの分化等）を使用して達成される。
赤血球は全血液量の４０〜４５％を構成し、構造的及び機能的に特有であり、核のある細胞よりも柔軟である。ＲＢＣはヒト身体の全体にわたる酸素送達のための主要手段であり、赤血球の細胞質は酸素担体生体分子（ヘモグロビン）に富んでいる。それゆえ、ＲＢＣは大部分の細胞内小器官（核を含む）を欠損し、それは除核細胞と比較して、それらの物理的特性を有意に改変する。ＲＢＣの両凹面形もそれらのユニークな物理的特性に寄与する。ＲＢＣは、２〜２．５μｍの平均の円板の厚み及び中心で０．８〜１μｍの最小の厚みを備えた両凹面の円板である。この幾何学的構造は余剰の表面領域を提供し、表面領域を増加させずに形を変化させることを可能にする。
ＲＢＣの細胞膜は、生理的細胞機能（例えば表面変形能、安定性、柔軟性、接着、及び免疫認識）のために不可欠な特性の提供においても重要な役割を果たす。ほとんどすべての生物体及びウイルスの細胞膜中で見出される脂質二分子膜に加えて、ＲＢＣは、グリコアリックス（ｇｌｙｃｏａｌｙｘ）と称される、それらの外部上で被覆する、炭水化物に富む糖タンパク質−ポリサッカライドも含有する。このグリコカリックスの被覆は、いくつかの細菌、上皮細胞及びＲＢＣでのみ見出される。多孔層は、浸透への耐性があり、血管内血栓（例えばアテローム血栓症）及び他の疾患に対して保護する役割を果たす。ＲＢＣの脂質二分子膜内で、コレステロールは内葉と外葉との間で均一に分布し、５つの主要なリン脂質（ホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスホイノシトール、ホスファチジルセリン）は二分子膜の中で非対称的に分布する。リン脂質のこの非対称分布は、細胞の完全性及び機能のために重要である（例えばリン脂質の曝露は血管内皮細胞へのＲＢＣの接着を増強し、したがって微小血管系を介する正常な通過を阻止する）。
したがって、（１）両凹面の幾何学的構造、（２）変形への耐性を低減させる核または他の細胞内小器官の欠損、（３）高いヘモグロビン濃度を反映する細胞質粘度、（４）能動的膜修復プロセスの欠損、及び（５）特有な膜構成に起因して、ＲＢＣは哺乳類生物体の任意の他の細胞に存在しない変形能現象を有する。この現象は、それらが弾性体のように挙動し、それらの形を広汎に変化させることを可能にし、これは年齢により変化する特徴である。
ＲＢＣは老化するにつれて、剛性を変化させる。スペクトリンとのヘモグロビンの非還元性の複合体形成は、ＲＢＣについてのインビボの老化作用の顕著なマーカーであり、ＲＢＣ剛性の増加、変形能、エキノサイトーシス、及び赤血球貪食の減少と密接に相関し得る（Ａｇｉｎｇ ａｎｄ ｄｅａｔｈ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｍａｔｕｒｅ ｒｅｄ ｃｅｌｌｓ：ｆｒｏｍ ｂａｓｉｃ ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｏ ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ｐｒａｃｔｉｃｅ；Ｍａｒｉａｎｎａ Ｈ．Ａｎｔｏｎｅｌｏｕ，Ａｎａｓｔａｓｉｏｓ Ｇ．Ｋｒｉｅｂａｒｄｉｓ，ａｎｄ Ｉｓｓｉｄｏｒａ Ｓ．Ｐａｐａｓｓｉｄｅｒｒ；Ｂｌｏｏｄ Ｔｒａｎｓｆｕｓ．２０１０ Ｊｕｎ；８（Ｓｕｐｐｌ ３）：ｓ３９−ｓ４７）。
本明細書において記載されるマイクロ流体システムによるＲＢＣのプロセシングの成功は、予想外の実験結果であった。このシステムは、細胞膜における摂動の機械的導入を介して細胞のサイトゾルへ物質を導入し、これにより、物質が通過し、細胞膜完全性の回復後に細胞内に残存することが可能になる。したがって、本明細書において記載されるシステムによるＲＢＣのプロセシングの成功（それは細胞膜の修復の成功に依存する）は、能動的膜修復プロセスの欠損にもかかわらずＲＢＣで起こった。
カーゴの送達のための無核細胞のプロセシング
上述のように、ＲＢＣの形は他の哺乳類細胞とは異なる。それらの非対称性の両凹面の形の結果として、ＲＢＣは異なる方向で狭窄に入り通過する能力を有する。この特性は、他の細胞（懸濁中にある場合多かれ少なかれ球形を有する）で存在しない。これは送達の観点から予想外の要素である。例えば、ＲＢＣの最も幅広い寸法で、本明細書において記載されるマイクロ流体デバイスの狭窄を介して進むＲＢＣは、細胞膜が破壊される可能性がより高く、一方で、ＲＢＣの最も狭い寸法で、狭窄を介して進むＲＢＣは細胞膜が破壊される可能性はより低い。したがって、本明細書において記載されるマイクロ流体デバイス及びシステムの狭窄の寸法の範囲は、かかる特有な特徴及び寸法（例えばＲＢＣ等の無核の非対称の細胞）の細胞により作業する際の困難さを克服するために、初期の立体配置よりも少ない。いくつかの実施形態において、無核細胞は、マイクロ流体チャネルが少なくとも約６μｍ以下の幅を備えた狭窄を含む、本明細書において記載されるマイクロ流体システムによりプロセシングされる。例えば、ＲＢＣは、約１、２、３、４、５、または約６μｍの狭窄の幅によりプロセシングされ得る。他の実施形態において、狭窄の幅は１μｍ〜４μｍである。更なる実施形態において、狭窄の幅は２μｍ〜４μｍである。
本明細書において使用される時、「バッファー」は、細胞がプロセシングされるように懸濁するのに使用される標準的なバッファーまたは標準的な生理学的に適合性のあるバッファー溶液を指す。バッファーは当技術分野において共通して使用される任意のバッファーであり得、それらには、マレイン酸、リン酸、クエン酸、リンゴ酸、蟻酸、乳酸、コハク酸、酢酸、ピバル酸、リン酸、Ｌ−ヒスチジン、ＭＥＳ、ビス−トリス、ＭＯＰＳＯ、ＰＩＰＥＳ、イミダゾール、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＴＥＡ、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、Ｎａ２ＣＯ３、またはＮａＨＣＯ３が含まれるが、これらに限定されない。バッファー溶液の非限定的例には、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、及び細胞培養において共通して使用される培地（ＲＰＭＩ、ＤＭＥＭまたはＩＭＤＭ等）が含まれる。いくつかの実施形態において、低張バッファー及び／または低浸透圧バッファーがＲＢＣに膨潤を引き起こすことで、ＲＢＣがデバイスを介して進行する時に圧迫に対してより感受性になり、機械的変形を使用する膜の孔形成をより受けやすくなるので、低張バッファー及び／または低浸透圧バッファーは有利である。
界面活性剤も、操作の間にマイクロ流体チャネルの閉塞を低減させるために、バッファーへ添加され得る。界面活性剤は、とりわけポロキサマー、動物起源血清、及びアルブミンタンパク質を含むことができる。
本明細書において記載されるある特定の実施形態において、正常なＲＢＣ、及び改変されたＲＢＣ（例えば疾患があるかまたは感染した）の両方は、本明細書において記載されるマイクロ流体システムを使用して、効果的にプロセシングされる。「正常な」ＲＢＣは、健康で改変されていないＲＢＣ（遺伝的もしくは非遺伝的な異常に冒されていないか、またはウイルス、細菌、もしくは寄生生物等の病原体に感染していないもの等）を指す。正常なＲＢＣは、健康な個体（病原体に感染せず疾患を患わない個体等）から得ることができる。正常なＲＢＣはエクスビボ培養系から得ることができ、この場合、もたらされたＲＢＣ集団は任意の病原体に感染せず、疾患状態を模倣するように実験的に改変されない。「改変された」ＲＢＣは、感染したＲＢＣまたは疾患のあるＲＢＣを指す。「感染したＲＢＣ」は、細菌、ウイルス、または寄生生物（例えばＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）に感染したＲＢＣまたはＲＢＣの集団を指すことができる。「疾患のあるＲＢＣ」は、ＲＢＣの機能、数、または生存率の減少をもたらす遺伝的または非遺伝的な異常（例えば鎌型赤血球貧血症）に冒されたＲＢＣまたはＲＢＣの集団を指すことができる。改変されたＲＢＣ（例えば感染したＲＢＣまたは疾患のあるＲＢＣ）は、感染または疾患を患う個体から得ることができる。改変されたＲＢＣはエクスビボ培養系から得ることができ、そこで、ＲＢＣのもたらされた集団は病原体（例えばＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）へ曝露されるか、または疾患状態を模倣するように実験的に改変される。
ある特定の実施形態において、正常な（例えば感染していないかまたは疾患のない）ＲＢＣ、及び改変された（例えば感染したかまたは疾患がある）ＲＢＣの両方は、本明細書において記載されるマイクロ流体システムにより処理することに成功し、カーゴはＲＢＣの両方の集団へ効果的に送達される。例えば、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍに感染したＲＢＣ及びＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍに感染していないＲＢＣは処理に成功し、カーゴ送達のレベルは２つの集団の間で同等であった。ある特定の実施形態において、改変されたＲＢＣと比較して、正常なＲＢＣにおけるカーゴ送達のレベルは増加される。ある特定の実施形態において、改変されたＲＢＣと比較して、正常なＲＢＣにおけるカーゴ送達のレベルは減少される。
本明細書において使用される時、「ペイロード」は、無核細胞（例えばＲＢＣ）へ送達される物質を指す。「ペイロード」、「カーゴ」、「送達物質」、及び「化合物」は、本明細書において互換的に使用される。いくつかの実施形態において、ペイロードは、タンパク質、小分子、核酸（例えばＲＮＡ及び／またはＤＮＡ）、脂質、炭水化物、マクロ分子、ビタミン、ポリマー、蛍光色素及びフルオロフォア、カーボンナノチューブ、量子ドット、ナノ粒子、ならびにステロイドを指し得る。いくつかの実施形態において、ペイロードは、タンパク質または小分子薬物を指し得る。薬物と共に送達されるＲＢＣは、身体中の長期的な薬物担体として作用することができる。いくつかの実施形態において、タンパク質または小分子薬物をマラリアを引き起こす寄生生物に感染した細胞（例えばＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍに感染したＲＢＣ）の中へ送達して、マラリアを患う対象への臨床利益を付与する。ある特定の実施形態において、小分子薬物、例えばプリンベースの抗ウイルス剤（ＤｅＢｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌｓ Ｍｏｌ．Ｄｉｓ．３１：２８６−２９０；参照により本明細書に援用される）、またはペプチド、例えばトリ−ペプチドまたはテトラ−ペプチド（Ｖｏｔａｎｏ ｅｔ ａｌ．，１９７７，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９６：１２１６−１２１９；参照により本明細書に援用される）は、鎌型赤血球貧血症を患う対象への臨床利益を付与するために、鎌型赤血球貧血症に冒されたＲＢＣへ送達される。
いくつかの実施形態において、感染した細胞は、マラリアを引き起こす寄生生物に感染した細胞を指す。かかる寄生生物はＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ属中で見出され、それらには、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐ．ｖｉｖａｘ、Ｐ．ｏｖａｌｅ、Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ、及びＰ．ｋｎｏｗｌｅｓｉが含まれ得る。更なる実施形態において、感染した細胞は、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍに感染した細胞を指す。いくつかの実施形態において、疾患のある細胞は、貧血（鉄欠乏性貧血、再生不良性貧血、サラセミア、及び鎌型赤血球貧血症が含まれる）、真性赤血球増加症、及び血小板減少症（特発性血小板減少性紫斑病が含まれる）に冒された細胞（例えば無核細胞）を指す。更なる実施形態において、疾患のある細胞は、鎌型赤血球貧血症に冒された細胞を指す。
マラリアを引き起こす寄生生物に感染したＲＢＣ（例えばＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍに感染したＲＢＣ）へ送達することができる、マラリアの治療において使用される薬物の非限定的例には、クロロキン（Ａｒａｌｅｎ(商標）としても公知）、アトバクオン−プログアニル（Ｍａｌａｒｏｎｅとしても公知）、アルテメテル／リメファントリン（ｌｙｍｅｆａｎｔｒｉｎｅ）（Ｃｏａｒｔｅｍとしても公知）、キニーネ硫酸塩（Ｑｕａｌａｑｕｉｎ、ＱＭ−２６０、及びＱｕｉｎａｍｍとしても公知）、メフロキン（Ｌａｒｉａｍとしても公知）、ヒドロキシクロロキン（Ｐｌａｑｕｉｎｅｉｌ Ｓｕｌｆａｔｅ及びＱｕｎｉｅｐｒｏｘとしても公知）、プリマキン、キニジン（Ｑｕｉｎ−Ｇ、Ｃａｒｄｉｏｑｕｉｎ、Ｑｕｉｎｏｒａ、Ｑｕｉｎｉｄｅｘ Ｅｘｔｅｎｔａｂｓ、Ｑｕｉｎａｇｌｕｔｅ Ｄｕｒａ−Ｔａｂｓ、Ｑｕｉｎ−Ｒｅｌｅａｓｅとしても公知）、アルテスネート、アルテミシニン、スルファドキシン／プリメサミン（ｐｒｙｉｍｅｔｈａｍｉｎｅ）（ファンシダールとしても公知）、アモジアキン、スルホンアミド、及びハロファントリン（Ｈａｌｆａｎとしても公知）が含まれる。マラリアを引き起こす寄生生物に感染したＲＢＣ（例えばＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍに感染したＲＢＣ）へ、抗生物質（ドキシサイクリン、テトラサイクリン、及びクリンダマイシン等）も送達することができる。
いくつかの実施形態において、タンパク質及び／または酵素は鎌型赤血球症の治療のためにＲＢＣへ送達される。鎌型赤血球貧血症に冒されたＲＢＣへ送達することができる、鎌型赤血球症（例えば鎌型赤血球貧血症）の治療において使用される薬物の非限定的例には、ヒドロキシ尿素、ハイドレア、ビタミンＥ、ドロキサ（ｄｒｏｘｉａ）、Ａｑｕａｌ Ｓｏｌ Ｅ、Ｌ−グルタミン、Ａｑｕａｖｉｔｅ Ｅ、ＧｌｕｔａＳｏｌｖｅ、Ａｌｐｈａ Ｅ、Ｅ−４００ ｃｌｅａｒ、Ｎｕｔｒ Ｅ Ｓｏｌ、Ｅ−６００、Ｅ Ｇｅｍｓ、Ａｑｕａ Ｅ、Ａｑｕａ Ｇｅｍ Ｅ、ＳＹＭＰＴ−ＸＧ、Ｎｕｔｒｅｓｔｏｒｅ、プリンベースの抗ウイルス剤（アシクロビル、ガンシクロビル、バラシクロビル、ペンシクロビルが含まれる）、ならびにトリ−ペプチド及びテトラ−ペプチドが含まれる。
いくつかの実施形態において、ペイロードは、必ずしもＲＢＣ自体の集団に影響するわけではない病態を治療するためにＲＢＣの集団へ送達される。かかる実施形態において、ＲＢＣは、長期薬物担体または「薬物デポー」として作用することができる。本明細書において使用される時、「薬物デポー」は、本明細書において記載されるマイクロ流体システムによってプロセシングされ、生物体の全体にわたって徐々に放出されるペイロード、化合物、またはカーゴを含有する長期的な循環ＲＢＣ集団を指す。薬物デポーを含むＲＢＣの集団は、感染した及び／もしくは疾患のあるもの、感染していない及び／もしくは疾患のないもの、または感染した及び／もしくは疾患のあるものと感染していない及び／もしくは疾患のあるものの組合せであり得る。ＲＢＣの半減期はおよそ１２７日である。したがって、少なくとも薬物デポーＲＢＣの集団の一部分は、約２５４日間存続することができる。いくつかの実施形態において、薬物デポーＲＢＣの集団は治療の間に所定の時点で補充することができる。いくつかの実施形態において、薬物デポーＲＢＣの集団は治療の間に所定の時点で２回以上補充することができる。例えば、薬物デポーＲＢＣは、治療の間に２、３、４、５、６、７、８、９、１０回以上補充することができる。いくつかの実施形態において、薬物デポーとして使用されるＲＢＣの数は、経時的に放出されるペイロードの濃度を増加させるように増加させることができる。いくつかの実施形態において、薬物デポーとして使用されるＲＢＣへ送達されるペイロードの濃度は、経時的に放出されるペイロードの濃度を増加させるために増加させることができる。薬物デポーＲＢＣは、多数の疾患または障害（癌が含まれるがこれらに限定されない）の治療のために使用することができる。
いくつかの実施形態において、ＲＢＣ薬物デポーは単一治療として疾患または障害のために使用することができる。いくつかの実施形態において、ＲＢＣ薬物デポーは、所定の疾患または障害のための従来療法と組み合わせて使用することができる。いくつかの実施形態において、ＲＢＣ薬物デポーは、所定の疾患または障害のための従来療法の完了後に維持療法として利用することができる。更なる実施形態において、ＲＢＣ薬物デポーは、従来療法の開始の前に利用することができる。いくつかの実施形態において、ＲＢＣ薬物デポーは、所定の疾患または障害のための従来療法の開始の前及び完了の後の両方で、利用することができる。更なる実施形態において、ＲＢＣ薬物デポーは、疾患または障害の発症を防止するために、疾患または障害の発症の前に利用することができる。
本明細書において使用される時、「患者」には、サンプルを取得することができる任意の哺乳類対象が含まれる。ある特定の実施形態において、哺乳類はヒトである。本開示の方法は、非ヒト霊長類（例えばサル、ヒヒ、及びチンパンジー）、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、ブタ、ウサギ、ヤギ、シカ、ヒツジ、フェレット、アレチネズミ、モルモット、ハムスター、コウモリ、鳥類（例えばニワトリ、シチメンチョウ、及びアヒル）、魚類及び爬虫類の治療のためにも用いることができる。本明細書において使用される時、「それを必要とする患者（ｐａｔｉｅｎｔ ｉｎ ｎｅｅｄ ｔｈｅｒｅｏｆ）」は、疾患または感染（癌が含まれるがこれらに限定されない）を患う患者である。
いくつかの実施形態において、細胞は、本明細書において記載されるマイクロ流体システムによるプロセシングを受けた後に、ペイロード含有溶液またはバッファー中である時間にわたってインキュベーションされる。例えば、細胞は、１〜１０分以上にわたってペイロード含有溶液またはバッファー中でインキュベーションされ得る。それゆえ、インキュベーション時間は、２、３、４、５、６、７、８、または９分以上（またはその任意の小数）であり得る。いくつかの実施形態において、インキュベーション時間は、１５、２０、３０、６０分間以上である。ある特定の実施形態において、細胞は、本明細書において記載されるマイクロ流体システムによるプロセシングを受ける前に、ペイロード含有溶液またはバッファー中である時間にわたってインキュベーションされる。ある特定の実施形態において、細胞は、ペイロード含有溶液またはバッファー中にある間に、本明細書において記載されるようにプロセシングされる。
本明細書において記載されるデバイス、技術、及び方法は、例えば研究室、集中化製造施設、または細胞プロセシング施設においてエクスビボで実装される。更なる実施形態において、デバイス、技術、及び方法は臨床システムとして使用され、そこで、患者サンプル（例えば血液サンプル、または分画された血球集団）は、本明細書において記載されるマイクロ流体デバイス、または患者細胞（例えばＲＢＣ）へ分子を送達するのに適切なサイズの狭窄を含むように適合させたシリンジを使用してプロセシングされる。かかるシステムは臨床の透析システムに類似する。
実施例１：無核細胞への物質の送達のためのマイクロ流体システムの最適化
無核細胞へ様々な化合物を送達することができるマイクロ流体システムが構築された。後述されるように、これらのマイクロ流体システムは、ペイロード（例えば化合物またはマクロ分子）が細胞膜を介し、サイトゾルの中へ通過し、細胞送達をもたらすのに十分な大きさの細胞の摂動を引き起こすように構成された狭窄を介して、バッファー中に懸濁された無核細胞が通過することを可能にするように構築された。図１Ａ及び図１Ｂ中で示されるように、マイクロ流体システム（５）は管状内腔を画成するチャネルを含む。マイクロ流体チャネルは、単一の細胞（２０）のみが一度で狭窄を介して通過することができるように構成できる狭窄（１５）を含む。細胞は、送達物質（３０）も含むバッファー（２５）中に懸濁されているチャネルを介して通過することができるが、細胞が狭窄を介して通過する前または後に、送達物質をバッファーへ添加することができる。細胞が狭窄に接近し通過する時、狭窄は細胞へ圧力（例えば機械的圧縮）を適用し、それによって細胞（細胞２０１として示される）を圧迫する。狭窄によって細胞へ適用された圧力は、細胞膜中に摂動（例えば穴）を引き起こし、細胞（２０２）の摂動をもたらす。一旦細胞が狭窄を介して通過すると、摂動された細胞は、摂動を介してバッファー中の物質（送達物質が含まれる）を取り込み始め、細胞（２０３）の送達をもたらす。細胞膜は経時的に回復し、少なくとも送達物質の一部分は細胞の内部で捕捉されたままである。
マイクロ流体システムが物質をサイトゾルへ送達するために無核細胞（例えばＲＢＣ）を変形させる能力は、狭窄の中心点を画成するパラメーター（例えば幅、長さ、及び深さ）、狭窄を介して細胞を押し進めるためにバッファーへ適用された圧力、及びバッファーの性質の修飾を介して最適化された。図２Ａ〜２Ｂ中で図示されるように、狭窄は入口部分、中心点、及び出口部分を含む。狭窄の中心点は、３つの測定値、すなわち長さ（Ｌ）、幅（Ｗ）、及び深さによって画成される。物質をＲＢＣへ最適に送達するには、４μｍ未満の幅が必要であった。更に、９０ポンド／インチ２（ｐｓｉ）を超える（例えば１２０ｐｓｉ）圧力は、ペイロードが細胞膜を介し、サイトゾルの中へ通過するのに十分な摂動をもたらした。機械的狭窄を利用して物質をＲＢＣへ送達することの１つの難題は、ＲＢＣが非対称性の両凹面の形であることである。この形は狭い寸法及び幅広い寸法を有するＲＢＣをもたらし、一方で、他の多くの細胞は懸濁されている間に比較的球状の形を有する。結果的に、ホメオスタシス状態のＲＢＣは異なる方向で狭窄を介して通過することができ、マイクロ流体システムの有効性を低減させる可能性がある。この難題は、ＲＢＣを膨潤させより球形で存在させる低張バッファー（例えばＰＢＳ）の使用により克服することができる。低張バッファーの使用は、本明細書において記載されるマイクロ流体システムの有効性に対するＲＢＣの非対称形の影響を緩和することができる。加えて、複数のマイクロ流体チャネル及び狭窄の連続したまたは並列した配置は、物質をＲＢＣへ送達することができる本明細書において記載されるマイクロ流体システムの開発を可能にした。
実施例２：ＲＢＣへの物質の送達
物質をヒトＲＢＣへ送達する本明細書において記載されるマイクロ流体デバイスの能力を、蛍光標識されたデキストランポリマー及び蛍光融合タンパク質を使用して試験した。簡潔には、ヒトＲＢＣを新鮮血から単離し、完全増殖培地中で培養した。ＲＢＣをＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍにより感染させた。細胞を４つの異なる感染後の時点で採取した。図３Ｃは、ギムザにより染色された赤血球サンプルの薄フィルム塗抹標本を示し、様々な増殖期のマラリア原虫を強調する。時点１はリング期寄生生物（侵入後＜１８時間）を反映し、時点２はトロホゾイト期寄生生物（＜Ｔ１＋８時間）を反映し、時点３はトロホゾイト期寄生生物（Ｔ１＋２２時間）、時点４はシゾント期寄生生物（Ｔ１＋３０時間）を反映する。感染の異なる期のＲＢＣを示された時点で採取し、１ｘ１０８細胞／ｍＬの密度でＰＢＳ中に懸濁した。Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍへ曝露された所定のサンプルは、感染細胞及び非感染細胞の両方を有していた。７０ｋＤａのフルオレセインに標識されたデキストランまたは１０ｋＤａのＡＰＣに標識されたデキストランを、２つのデザインのうちの１つによるマイクロ流体システムを使用して、感染ＲＢＣ及び非感染ＲＢＣの懸濁液へ送達した。１つのマイクロ流体システムデザインは、１０μｍの長さ及び４μｍの幅を備えた単一の狭窄を含んでいた（１０×４）。他のマイクロ流体システムデザインは、各々３０μｍの長さ及び５μｍの幅を備えた、並列して配置された５つの狭窄を含んでいた（３０×５×５）。
７０ｋＤａのＦＩＴＣ標識デキストラン（図３Ａ）または１０ｋＤａのＡＰＣ標識デキストラン（図３Ｂ）を、増殖の時点１〜４の非感染除核赤血球及び感染除核赤血球の混合集団の中へロードする、各々のマイクロ流体デザインの能力を、フローサイトメトリーによって測定した。各々の実験において、注入口の細胞（狭窄を介して通過しなかったが、蛍光送達物質へ曝露された細胞）を、物質の受動的取り込みについての陰性対照として分析した。図３Ａ及び図３Ｂ中に含まれるヒストグラムは、送達されない群と比べた送達された集団の出現を図示する。より高い蛍光強度を備えたより小さなピークが送達された集団を表わす一方で、より大きなヒストグラムピークは送達されない集団を表わす。
７０ｋＤａデキストラン−フルオレセインコンジュゲート（図３Ａ）及び１０ｋＤａのデキストラン−ＡＰＣコンジュゲート（図３Ｂ）の両方のローディングは、トロホゾイト期（時点３）の寄生生物による３０×５×５チャネルの幾何学的構造で最大であった。１０ｋＤａのデキストラン−ＡＰＣの送達は、７０ｋＤａのデキストラン−フルオレセインの送達よりも、高いパーセンテージのＲＢＣの送達をもたらされるが、これは送達物質のより小さなサイズに起因する可能性が高い。これらのマイクロ流体システムがＲＢＣへの物質の送達を成功させる能力は、予想外の実験結果であった。ＲＢＣは、誘導された摂動の停止及び膜完全性の回復を支援する能動的膜修復プロセスを欠損することが公知である。しかしながら、ＲＢＣのサイトゾルへの物質の送達は、これらの能動的プロセスの非存在下において成功した。
上で同定された条件（トロホゾイト期の寄生生物及び３０×５×５の幾何学的構造）を使用して、ＡＰＣ及びフルオレセインデキストランコンジュゲート及び６２ｋＤａの組換えタンパク質（シアン融合タンパク質（ＣＦＰ）−黄色融合タンパク質（ＹＦＰ）融合物（ＣＦＰ−ＹＦＰ融合物））の、寄生ＲＢＣ対非寄生ＲＢＣの中へのローディングを測定した。ＣＦＰ−ＹＦＰ融合タンパク質は荷電し球状であり、臨床利益を付与するために送達することができる多数のタンパク質に典型的な定義された三次元構造を有し、したがって生理的に意義のあるタンパク質の送達を模倣するために使用された。ＲＢＣをマラリアにより感染させ、分析のために増殖のトロホゾイト期で細胞を採取した。Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍに感染させた実験群（＋Ｐｆ）は、感染ＲＢＣ及び非感染ＲＢＣを含んでいた。Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍへ曝露されなかった別の群を陰性対照（−Ｐｆ）として使用した。図４Ｂは染色したＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ感染細胞の写真である。これらのデータは、様々な物理的特性（例えばサイズ、３Ｄ構造、及び電荷）の物質の送達の成功を実証し、感染ＲＢＣ及び非感染ＲＢＣの処理に成功することができ、カーゴを本明細書において記載されるマイクロ流体システムを使用して送達できたことを更に示す。この結果は、ＲＢＣの寄生生物感染（及び細胞中の寄生生物の複製）により、非感染細胞と比較して、感染細胞がより柔軟ではなくなる事実を鑑みると意外であった。これらのデータは、上述のマイクロ流体デバイス及びシステムを使用して、図５中で示されるように脂質、ポリマー、ナノ粒子、ＲＮＡ、ＤＮＡ、抗体、タンパク質、不透過性小分子、及びフルオロフォアを含む広範囲の物質を送達できることも示す。
本明細書において記載される対象は、所望される立体配置に依存して、システム、装置、方法、及び／または物品で実施することができる。前述の記載中で示される実装が、本明細書において記載される対象と整合性のあるすべての実装を表わすとは限らない。その代りに、それらは、記載される対象に関連する態様と整合性のある単なる例である。いくつかの変動が詳細に上で記載されたが、他の修飾または追加も可能であり、それらには、狭窄デザイン、狭窄に入る細胞の進入角度、狭窄の深さ、ＲＢＣのステージ及び年齢の選択、バッファー、細胞方向性、スピード、温度、膜安定化／不安定試薬（コレステロール及びプルロニック等）の存在等の修飾が含まれる。本発明の対象は、研究室または集中化製造施設へ限定されないが、臨床システムとして実装することができ、それは透析機に類似して、患者サンプルをインラインでプロセシングすることができる。シリンジタイプの実装も実行可能である。本発明の対象は、ＲＢＣ（赤血球及び網状赤血球が含まれる）、精製されたＲＢＣ、及び非修飾血液（例えば限定的なプロセシングを受けた血液）に対して使用することができる。
他の実装を実行することができる。特に、更なる特徴及び／または変動は、本明細書において示されたものに加えて提供することができる。例えば、上記の実装は、開示された特徴の様々な組み合わせ及び小組み合わせ、ならびに／または上で開示された、いくつかの更なる特徴の組み合わせ及び小組み合わせを対象とすることができる。加えて、添付の図面及び／または本明細書において記載されるもの中で描写されるロジックフローは、所望される結果の達成に、示される特定の順序または連続的な順序を必ずしも要求しない。他の実装は、以下の特許請求の範囲の範囲内のものであり得る。

Claims (74)

  1. 細胞膜における摂動を引き起こすためのマイクロ流体システムであって、
    内腔を画成し、バッファー中に懸濁された細胞がそれを介して通過できるように構成される、少なくとも１つのマイクロ流体チャネルを含み、前記マイクロ流体チャネルが、長さ、深さ、及び幅を含む少なくとも１つの細胞変形狭窄を含み、前記狭窄の幅が４μｍ未満である、
    前記システム。
  2. 前記細胞が無核である、請求項１に記載のマイクロ流体システム。
  3. 前記細胞が、赤血球、網状赤血球、または血小板のうちの１つまたは複数である、請求項２に記載のマイクロ流体システム。
  4. バッファー中に懸濁された前記細胞が非修飾血液を含む、先行請求項のいずれか一項に記載のマイクロ流体システム。
  5. 前記細胞が健康な細胞である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のマイクロ流体システム。
  6. 前記細胞が疾患細胞または感染細胞である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のマイクロ流体システム。
  7. 前記幅が０．５μｍ〜４μｍである、請求項１〜６のいずれか一項に記載のマイクロ流体システム。
  8. 前記幅が３μｍ〜４μｍである、請求項７に記載のマイクロ流体システム。
  9. 前記幅が前記細胞の最大直径未満である、請求項７または８に記載のマイクロ流体システム。
  10. 前記幅が前記細胞の最大直径の約２０％〜約９９％である、請求項７〜９のいずれか一項に記載のマイクロ流体システム。
  11. 前記長さが３０μｍ以下である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のマイクロ流体システム。
  12. 前記長さが１０μｍ〜３０μｍである、請求項１１に記載のマイクロ流体システム。
  13. 前記長さが１０μｍ〜２０μｍである、請求項１１または１２に記載のマイクロ流体システム。
  14. 前記深さが１μｍ〜１ｍｍである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のマイクロ流体システム。
  15. 前記深さが１μｍ〜２０μｍである、請求項１４に記載のマイクロ流体システム。
  16. 前記深さが２０μｍである、請求項１４または１５に記載のマイクロ流体システム。
  17. 前記深さ及び前記幅が等しい、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載のマイクロ流体システム。
  18. 複数のマイクロ流体チャネルを含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のマイクロ流体システム。
  19. 前記複数のマイクロ流体チャネルが並列して配置される、請求項１８に記載のマイクロ流体システム。
  20. 複数の細胞変形狭窄を含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のマイクロ流体システム。
  21. 前記複数の細胞変形狭窄が、同じマイクロ流体チャネル中で連続して配置される、請求項２０に記載のマイクロ流体システム。
  22. 前記バッファー中に懸濁された前記細胞が前記細胞変形狭窄を介して通過するように、前記バッファーへ圧力を適用するように適合させた、細胞駆動装置を更に含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のマイクロ流体システム。
  23. 前記細胞駆動装置が、前記バッファーへ９０ｐｓｉを超える圧力を適用するように適合される、請求項２２に記載のマイクロ流体システム。
  24. 前記細胞駆動装置が１２０ｐｓｉの圧力を適用するように適合される、請求項２３に記載のマイクロ流体システム。
  25. 前記細胞駆動装置が、圧力ポンプ、気体ボンベ、コンプレッサー、真空ポンプ、シリンジ、シリンジポンプ、ペリスタポンプ、ピペット、ピストン、キャピラリーアクター、ヒト心臓、ヒト筋肉、重力、マイクロ流体ポンプ、及びシリンジを含む群から選択される、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載のマイクロ流体システム。
  26. 前記チャネルの横断面が、円形、楕円形、細長いスリット、正方形、六角形、及び三角形からなる群から選択される、請求項１〜２５のいずれか一項に記載のマイクロ流体システム。
  27. 圧力を細胞へ適用してペイロードの通過に十分な大きさの前記細胞の摂動を引き起こすように、バッファー中に懸濁された前記細胞を細胞変形狭窄を含むマイクロ流体チャネルを介して通過させるステップであって、前記狭窄の幅が４μｍ未満である、前記通過させるステップと、
    前記細胞が前記狭窄を介して通過する前または後に所定時間にわたってペイロード含有溶液中で前記細胞をインキュベーションするステップと、
    を含む方法。
  28. 前記細胞が無核である、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記細胞が、赤血球（ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）、赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）、網状赤血球、及び血小板のうちの１つまたは複数である、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記細胞が健康な細胞である、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記細胞が感染細胞または疾患細胞である、請求項２７〜３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. バッファー中に懸濁された前記細胞が非修飾血液を包含する、請求項２７〜３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記幅が０．５μｍ〜４μｍである、請求項２７〜３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記幅が３μｍ〜４μｍである、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記幅が前記細胞の最大直径未満である、請求項３３または３４に記載の方法。
  36. 前記幅が前記細胞の最大直径の約２０％〜約９９％である、請求項３３〜３５のいずれか一項に記載の方法。
  37. 前記細胞へ適用される前記圧力が９０ｐｓｉより大きい、請求項２７〜３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. 前記細胞へ適用される前記圧力が１２０ｐｓｉである、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記バッファーが前記細胞を膨潤させる低張バッファーである、請求項２７〜３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記ペイロード含有溶液が、タンパク質、小分子、核酸、脂質、炭水化物、マクロ分子、ビタミン、ポリマー、蛍光色素、フルオロフォア、カーボンナノチューブ、量子ドット、ナノ粒子、及びステロイドのうちの１つまたは複数を含む、請求項２７〜３９のいずれか一項に記載の方法。
  41. 前記ペイロード含有溶液がタンパク質またはデキストランポリマーを含む、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記ペイロード含有溶液がタンパク質及びデキストランポリマーを含む、請求項４０に記載の方法。
  43. 前記ペイロード含有溶液が小分子またはタンパク質を含む、請求項４０に記載の方法。
  44. 前記ペイロード含有溶液が小分子及びタンパク質を含む、請求項４０に記載の方法。
  45. 前記ペイロード含有溶液が、クロロキン、アトバクオン−プログアニル、アルテメテル／リメファントリン（ｌｙｍｅｆａｎｔｒｉｎｅ）、キニーネ硫酸塩、メフロキン、ヒドロキシクロロキン、プリマキン、キニジン、アルテスネート、アルテミシニン、スルファドキシン／プリメサミン（ｐｒｙｉｍｅｔｈａｍｉｎｅ）、アモジアキン、スルホンアミド、ハロファントリン、ドキシサイクリン、テトラサイクリン、クリンダマイシン、ヒドロキシ尿素、ハイドレア、ビタミンＥ、Ｌ−グルタミン、アシクロビル、ガンシクロビル、バラシクロビル、ペンシクロビル、トリ−ペプチド、またはテトラ−ペプチドのうちの１つまたは複数を含む、請求項４０〜４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記マイクロ流体チャネルの横断面が、円形、楕円形、細長いスリット、正方形、六角形、及び三角形からなる群から選択される、請求項２７〜４５のいずれか一項に記載の方法。
  47. ペイロード含有溶液中での前記細胞のインキュベーションが、０．０００１秒〜２０分間にわたって前記細胞をインキュベーションすることを含む、請求項２７〜４６のいずれか一項に記載の方法。
  48. 感染または疾患を治療する方法であって、
    圧力を細胞へ適用してペイロードの通過に十分な大きさの前記細胞の摂動を引き起こすように、バッファー中に懸濁された前記細胞を細胞変形狭窄を含むマイクロ流体チャネルを介して通過させるステップであって、前記狭窄の幅が４μｍ未満である、前記通過させるステップと；
    前記細胞が前記狭窄を介して通過する前または後に所定時間にわたってペイロード含有溶液中で前記細胞をインキュベーションするステップと；
    前記ペイロードが細胞内に含有されるように、前記細胞の摂動が停止するのを所定時間にわたって待機するステップと；
    前記細胞の投与を、それを必要とする患者に行うことと、
    を含む、前記方法。
  49. 前記細胞が無核である、請求項４８に記載の方法。
  50. 前記細胞が、赤血球（ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）、赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）、網状赤血球のうちの１つまたは複数である、請求項４８または４９に記載の方法。
  51. バッファー中に懸濁された前記細胞が非修飾血液を包含する、請求項４８〜５０のいずれか一項に記載の方法。
  52. 前記細胞が健康な細胞である、請求項４８〜５１のいずれか一項に記載の方法。
  53. 前記細胞が疾患細胞または感染細胞である、請求項４８〜５２のいずれか一項に記載の方法。
  54. 前記幅が０．５μｍ〜４μｍである、請求項４８〜５３のいずれか一項に記載の方法。
  55. 前記幅は３μｍ〜４μｍである、請求項５４に記載の方法。
  56. 前記幅が前記細胞の最大直径未満である、請求項５４または５５に記載の方法。
  57. 前記幅が前記細胞の最大直径の約２０％〜約９９％である、請求項５４〜５６のいずれか一項に記載の方法。
  58. 前記細胞へ適用される前記圧力が９０ｐｓｉより大きい、請求項４８〜５７のいずれか一項に記載の方法。
  59. 前記細胞へ適用される前記圧力が１２０ｐｓｉである、請求項５８に記載の方法。
  60. 前記バッファーが前記細胞を膨潤させる低張バッファーである、請求項４８〜５９のいずれか一項に記載の方法。
  61. 前記マイクロ流体チャネルの横断面が、円形、楕円形、細長いスリット、正方形、六角形、及び三角形からなる群から選択される、請求項４８〜６０のいずれか一項に記載の方法。
  62. ペイロード含有溶液中での前記細胞のインキュベーションが、０．０００１秒〜２０分間にわたって前記細胞をインキュベーションすることを含む、請求項４８〜６１のいずれか一項に記載の方法。
  63. 前記ペイロード含有溶液が、タンパク質、小分子、核酸、脂質、炭水化物、マクロ分子、ビタミン、ポリマー、蛍光色素、フルオロフォア、カーボンナノチューブ、量子ドット、ナノ粒子、及びステロイドのうちの１つまたは複数を含む、請求項４８〜６２のいずれか一項に記載の方法。
  64. 前記ペイロード含有溶液が小分子またはタンパク質を含む、請求項６３に記載の方法。
  65. 前記ペイロード含有溶液が小分子及びタンパク質を含む、請求項６３に記載の方法。
  66. 前記ペイロード含有溶液が、ヒドロキシ尿素、ハイドレア、ビタミンＥ、Ｌ−グルタミン、アシクロビル、ガンシクロビル、バラシクロビル、ペンシクロビル、トリ−ペプチド、またはテトラ−ペプチドのうちの１つまたは複数を含む、請求項６３〜６５のいずれか一項に記載の方法。
  67. 前記細胞が鎌型赤血球症に冒された細胞である、請求項４８〜６６のいずれか一項に記載の方法。
  68. 前記ペイロード含有溶液が、クロロキン、アトバクオン−プログアニル、アルテメテル／リメファントリン（ｌｙｍｅｆａｎｔｒｉｎｅ）、キニーネ硫酸塩、メフロキン、ヒドロキシクロロキン、プリマキン、キニジン、アルテスネート、アルテミシニン、スルファドキシン／プリメサミン（ｐｒｙｉｍｅｔｈａｍｉｎｅ）、アモジアキン、スルホンアミド、ハロファントリン、ドキシサイクリン、テトラサイクリン、またはクリンダマイシンのうちの１つまたは複数を含む、請求項６３〜６５のいずれか一項に記載の方法。
  69. 前記細胞がマラリアを引き起こす寄生生物に感染している、請求項４８〜６５、及び６８のいずれか一項に記載の方法。
  70. 前記マラリアを引き起こす寄生生物がＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍである、請求項６９に記載の方法。
  71. 前記細胞の投与を必要とする前記患者が癌を患っている、請求項４８〜７０のいずれか一項に記載の方法。
  72. 前記細胞の投与を必要とする前記患者が鎌型赤血球症を患っている、請求項７１に記載の方法。
  73. 前記患者がマラリアを引き起こす寄生生物に感染している、請求項７１に記載の方法。
  74. 前記マラリアを引き起こす寄生生物がＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍである、請求項７３に記載の方法。
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