JP2018510133A

JP2018510133A - プロバイオティクス組成物および使用方法

Info

Publication number: JP2018510133A
Application number: JP2017541283A
Authority: JP
Inventors: オークリー、ブライアン
Original assignee: ウェスタンユニバーシティオブヘルスサイエンス
Priority date: 2015-02-06
Filing date: 2016-02-04
Publication date: 2018-04-12
Also published as: EP3253396A4; AU2016215209A1; CA2973894A1; WO2016126954A1; CN107206032A; EP3253396A1; US20180021387A1

Abstract

成鳥家禽からの盲腸材料および食塩水を含む、鶏などの幼鳥家禽への経口投与のための組成物が開示される。本組成物は、強制経口投与により幼鳥にそれを投与することによって、家禽鳥類の体重増加を向上させるために使用し得る。本組成物はまた、家禽鳥類における飼料効率を高めるために使用され得る。成鳥家禽からの盲腸材料を用いて調製される家禽敷料、例えば鶏敷料への適用のための組成物がさらに開示される。本組成物は、病原菌による鶏腸定着を予防または軽減するために使用され得る。また、プロバイオティクス能力を有する細菌株を選択する方法も開示される。

Description

本発明は成鳥家禽からの盲腸材料を含むプロバイオティクス組成物およびそれらの使用方法に関する。

生体重ベースでの養鶏飼料コストは、過去１０年間で２倍超に増加しており（ＮａｔｉｏｎａｌＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｔａｔｉｓｔｉｃｓＳｅｒｖｉｃｅによる。）、今後も増加し続けることが見込まれる。飼料コストは一般に、総生産コストの少なくとも３分の２に相当する。給餌計画、飼料添加物および飼育の最適化によって、飼料転換率（ＦＣＲ）および成長率が大幅に改善され、飼料効率の基礎をなす遺伝的因子を理解することにおいて重要な進歩もあった。しかし、これらの因子をさらに改善する余地は限られていると見られ、飼料コストは既に高くなっているレベルから増加し続ける可能性があることから、ＦＣＲは鶏肉産業の成功のための重要なパラメーターである。水および土地は食糧供給にとって最も重要な制約であり、温室効果ガスの生成は地球環境への最大の脅威であると言われる。

家禽生産は陸生動物タンパク質生産の最も効率的な形態であるものの、現在これは、飼料中抗生物質を利用して腸内微生物叢を操作することで鳥の健康および食品安全性を最適化して達成されている。動物農業における抗生物質の使用が消費者および規制者によってますます否定的に認識されるようになっているため、腸内微生物叢を最適化することによってＦＣＲを改善するために微生物生態学およびＤＮＡ配列決定の分野における最新の技術的進歩を利用する時機に来ている。

動物宿主の栄養および健康のための胃腸（ＧＩ）微生物叢の重要性は、成長促進抗生物質（ＡＧＰ）の有効性および農業におけるそれらの長い使用歴によって実証されている。それらの正確な作用機序は殆ど知られていないが、ＡＧＰの成功から、ＧＩ微生物叢が栄養および健康を調整する（ＧＩ微生物叢が最適化されて、これらを改善し得る）ことが示唆される。家禽は自然に、何百もの細菌種および腸内容物１グラムあたり最大１０００億個の細胞を有する複雑なＧＩ微生物群を受け入れることに適応する。

プロバイオティクスは、生産力を向上させ、抗生物質への依存を減少させ、病原菌の腸での定着(colonization)を減少させる能力が実証されているため、非常に有望である。飼料中抗生物質のコストのうちの僅かなコストで、好都合なプロバイオティクス生物の規定された培養物を産生させることが可能であり、したがって、細菌接種物のこのような相対的な低コストについて産業界に対して即座の利益をもたらす可能性がある。したがって、現在、天然の微生物群およびその使用方法を模倣するプロバイオティクス組成物を開発することへのニーズがある。

このアプローチが病原体の定着も制限する場合、長期にわたる利益が可能となる。これは、概念的には、混合培養に基づく競争的排除（ＣＥ）製品の以前のバージョンと類似しているが、現在、次世代ＤＮＡ配列決定を使用してあらゆる接種物が完全に規定され得るという重要な違いがある。

健康な鶏は、それが曝露されている複雑な細菌群の非常に特異的で再現性のあるサブセットを選択する。生態学的な理論から、これらの共生細菌のそれぞれが胃腸管の生態学において固有の役割を進化させたことが示唆される。

さらに、敷料が、ブロイラーヒヨコに定着する微生物叢の主要源である豊富で（＞１億トン／ｇ）多様な（＞２００種の細菌属）微生物群を有することが知られているという事実にもかかわらず、現在の産業界の慣例では、商業用鶏舎で使用される敷料の微生物学およびブロイラーの腸内微生物叢に影響を及ぼすその可能性をほぼ完全に無視している。鳥の生産力に対する腸内微生物叢の影響を考慮すると、敷料の微生物学を管理しないことは、養鶏業の主要な側面が完全に成り行き任せとなってしまい、これは商業生産システムには適していない。衛生処理とそれに続く規定されたプロバイオティクス配合物の適用を通じた敷料の微生物学の管理によって、産業に大きな利益がもたらされ得る。

さらに、養鶏飼料添加物または栄養補助食品として提供されるプロバイオティクスの規制プロセスは、商業的に実行可能な製品が承認されるまで数年かかり得る。総じて、現在、家禽の腸内微生物叢に影響を及ぼすための、敷料に適用され得るプロバイオティクス組成物が必要とされている。このような組成物およびそれらの使用は、他の方法（例えば抗生物質）を用いるよりも効率的かつ低コストで、食品安全性の改善、飼料効率の向上および病原体定着の制限など、即時の、および長期間にわたる利益を有し得る。

本明細書は、ある実施形態において、成鳥家禽からの盲腸材料および食塩水を含む幼鳥家禽への経口投与に適した組成物であって、盲腸材料と食塩水の比が１：２〜１：４（ｖ／ｖ）である組成物を開示する。いくつかの実施形態において、盲腸物質は成鶏からのものであり、本組成物は幼鶏への経口投与に適している。いくつかの実施形態において、成鶏からの盲腸物質と食塩水との比は１：３である。

本明細書は、ある実施形態において、盲腸材料と食塩水の比が１：２〜１：４（ｖ／ｖ）の範囲である、成鳥家禽からの盲腸材料および食塩水を含む組成物を強制経口投与により幼鳥家禽に投与することを含む、家禽鳥類において体重増加を向上させる方法を開示する。いくつかの実施形態において、鶏における体重増加を向上させる開示方法は、成鶏からの盲腸材料および食塩水を含み、盲腸材料と食塩水との比が１：３である組成物を強制経口投与により幼鶏に投与することを含む。いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、孵化日のヒヨコに投与される。

本明細書は、ある実施形態において、成鳥家禽からの盲腸材料および食塩水を含み、盲腸材料と食塩水との比が１：２〜１：４（ｖ／ｖ）の範囲である組成物を強制経口投与により幼鳥家禽に投与することを含む、家禽鳥類における飼料効率を向上させる方法を開示する。いくつかの実施形態において、鶏における飼料効率を向上させる開示方法は、成鶏からの盲腸材料および食塩水を含み、盲腸材料と食塩水との比が１：３である組成物を強制経口投与により幼鶏に投与することを含む。

本明細書は、ある実施形態において、（ａ）成鳥家禽から盲腸材料を得ること；（ｂ）強制経口投与により、盲腸材料を幼鳥家禽に投与すること；（ｃ）接種された家禽鳥類から盲腸材料を得て、複数世代の鳥を通じてそれを連続継代すること；（ｄ）連続継代した盲腸材料を得ること；および（ｅ）連続継代した盲腸材料を食塩水中で懸濁することによって調製される、家禽敷料への適用に適した組成物を開示する。

本明細書は、ある実施形態において、（ａ）成鶏から盲腸材料を得ること；（ｂ）強制経口投与により、盲腸材料を幼鶏に投与すること；（ｃ）接種された鶏から盲腸材料を得て、複数世代の鳥を通じてそれを連続継代すること；（ｄ）連続継代した盲腸材料を得ること；および（ｅ）連続継代した盲腸材料を食塩水中で懸濁することによって調製される、鶏敷料への適用に適した組成物を開示する。

本明細書は、ある実施形態において、（ａ）成鶏から盲腸材料を得ること；（ｂ）強制経口投与により、盲腸材料を幼鶏に投与すること；（ｃ）接種された鶏から盲腸材料を得て、複数世代の鳥を通じてそれを連続継代すること；（ｄ）連続継代した盲腸材料を得ること；および（ｅ）連続継代した盲腸材料を食塩水中で懸濁することによって調製される組成物を鶏敷料に適用する段階を含む、病原菌による鶏腸定着を予防するかまたは軽減する方法を開示する。

本明細書は、ある実施形態において、（ａ）成鳥家禽からの盲腸材料および（ｂ）食塩水を含み、（ａ）と（ｂ）との比が１：２〜１：４（ｖ／ｖ）の範囲である組成物を家禽の敷料に適用する段階を含む、病原菌による家禽腸定着を予防または軽減する方法を開示する。

本明細書は、ある実施形態において、家禽敷料と、（ａ）成鳥家禽からの盲腸材料および（ｂ）食塩水を含み、（ａ）と（ｂ）との比が１：２〜１：４（ｖ／ｖ）の範囲である組成物と、を含む敷料組成物を開示する。

本明細書は、ある実施形態において、ａ）盲腸内容物の懸濁液をクロロホルムと混合して胞子形成細菌について選択し、ｂ）遠心分離によって混合物からクロロホルムを除去し、食塩水で洗浄する段階を含む、プロバイオティクス能力がある細菌株を選択する方法を開示する。

本明細書は、ある実施形態において、（ａ）成鶏から盲腸材料を得ること；（ｂ）強制経口投与により、盲腸材料を幼鶏に投与すること；（ｃ）接種された鶏から盲腸材料を得て、複数世代の鳥を通じてそれを連続継代すること；（ｄ）連続継代した盲腸材料を得ること；（ｅ）連続継代した盲腸材料を食塩水中で懸濁すること；（ｆ）盲腸材料の懸濁液をクロロホルムと混合して、胞子形成細菌について選択すること；（ｇ）遠心分離により混合物からクロロホルムを除去すること；および（ｈ）食塩水で洗浄することによって調製され、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）の次の株：ｃ２−６−１２；ｃ１−８；ｍ１−１０−１５；ｍ２−９；ｍｇ２０−４；ｍ２０−１；ｃ２０−１およびｍ２０−５のうち１つ以上を含む、鶏敷料への適用に適した組成物を開示する。

図１は、雄（Ｍ）および雌（Ｆ）ヒヨコについて、接種ヒヨコと未接種ヒヨコの成長比較を示す。ヒヨコは、孵化日に単回接種（成鳥からの盲腸内容物の懸濁液０．２ｍＬ）を受け、商業的養鶏と本質的に同一である同一条件で飼育した。６週齢は典型的な商業的収穫（ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｈａｒｖｅｓｔ）時期に相当する。

図２は、接種ヒヨコと未接種ヒヨコとの飼料効率比較を示す。各点は１羽の鳥に相当する。Ｙ軸値は、回帰モデリングに基づいて予想される量に対する消費飼料の量として計算されるＲＦＩに相当する。予想されるよりも餌の消費が少ないので、値が低いほど、効率的な鳥に相当する。平均の差は、両側ｔ検定によって有意である（ｐ＜０．００１）。

図３は、接種鳥と未接種鳥とからの６週齢での盲腸微生物叢のＤＮＡフィンガープリントの比較を示す。各点は、１羽の鳥からの盲腸微生物群に相当する。プロットは、各盲腸微生物群の分類学的プロファイルが入力されている正準対応分析（ＣＣＡ）に相当する。グラフ空間における近接性は、盲腸の微生物叢の類似性に対応する。

図４は、属レベルに分類した場合の、接種鳥と未接種鳥とからの６週齢での盲腸微生物叢の分類学的組成を示す。

図５は、胞子形成細菌について選択するために盲腸内容物をクロロホルムに曝露する新規方法によって単離された家禽腸内細菌叢の重要なメンバーであることが知られているクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ）科に属する分離株のうち８つに対する最も近縁の既知の近縁種を示す１６ＳｒＲＮＡに基づく系統樹を示す。

図６は、ｃ２−６およびｃ１−８新規分離株によるＣ．パーフリンジェンス（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）の増殖阻害を示す。

本明細書中に記載の組成物は、ある実施形態において、幼鳥家禽への経口投与に適しており、（ａ）成鳥家禽からの盲腸材料および（ｂ）食塩水を含み、（ａ）と（ｂ）との比は１：２〜１：４（ｖ／ｖ）である。

本明細書中で使用される場合、「家禽」は、家畜化された鳥類、例えば、鶏、七面鳥、アヒルまたはガチョウである。家禽ＧＩ管の腸部分は、十二指腸、空腸上部、空腸下部、回腸および盲腸など、いくつかの部分を含む。一般に、盲腸は、小腸と大腸との間の接合部に付着している２つの行き止まりの袋状のものである。本明細書で使用される場合、「盲腸材料」は、合わせられ、粉砕され、および／またはホモジナイズされ得る盲腸の内容物および剥離物(scrapings)を含む。

本明細書中で使用される場合、「成鳥家禽」または「成鶏」は、孵化から２１日またはそれ以上経過した鳥、例えば、２８日齢、３５日齢または４２日齢などである。本明細書で使用される場合、「幼鳥家禽」または「幼鶏」は、孵化日〜７日齢である鳥である。

本明細書で使用される場合、「食塩水」は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）の水溶液である。いくつかの実施形態において、溶液中の塩化ナトリウムの濃度は約０．９％（ｗ／ｖ）である。食塩水は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）またはトリス緩衝食塩水などの緩衝食塩水であり得る。いくつかの実施形態において、盲腸材料と食塩水との比は、１：２、１：２．２５、１：２．５、１：２．７５、１：３、１：３．２５、１：３．５、１：３．７５または１：４（ｖ／ｖ）である。

いくつかの実施形態において、本明細書中で開示される組成物の盲腸材料は成鶏由来であり、盲腸材料と食塩水との比は１：３（ｖ／ｖ）であり、本組成物は幼鶏への経口投与に適している。

いくつかの実施形態において、本組成物は、例えば、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）が顕著に濃縮された細菌群、栄養素、アミノ酸、ビタミン、ミネラルおよび脂肪酸のうち１つ以上などの他の成分を含み得る。本明細書で使用される場合、「栄養素」は、生きている生物の生存および成長のためのエネルギーまたは構成材料を提供する食物または他の物質である。栄養素の例としては、炭水化物、タンパク質、ペプチドおよび脂肪が含まれるが限定されない。「アミノ酸」は、アミンおよびカルボキシル官能基の両方を含有する何らかの天然または非天然分子であり得る。

本明細書は、ある実施形態において、（ａ）成鳥家禽からの盲腸材料および（ｂ）食塩水を含み、（ａ）と（ｂ）との比が１：２〜１：４（ｖ／ｖ）の範囲である約０．２ｍＬの組成物を強制経口投与により幼鳥家禽に投与することを含む、家禽鳥類において体重増加を向上させる方法を開示する。盲腸材料は、数羽の成鳥家禽、例えば２、３、４、５羽またはそれ以上の成鳥から回収して、合わせてもよい。

別段の指定がない限り、「強制経口投与」は、チューブ、針またはカニューレを通して液体または物質を鳥の胃に送達するために使用される技術である。

本明細書は、いくつかの実施形態において、成鶏からの盲腸材料および食塩水を含み、盲腸材料と食塩水の比が１：３である約０．２ｍＬの組成物を強制経口投与により幼鶏に投与することを含む、鶏において体重増加を向上させる方法を開示する。いくつかの実施形態において、幼鶏は孵化日のヒヨコである。

本明細書は、ある実施形態において、（ａ）成鳥家禽からの盲腸材料および（ｂ）食塩水を含み、（ａ）と（ｂ）との比が１：２〜１：４（ｖ／ｖ）の範囲である約０．２ｍＬの組成物を強制経口投与により幼鳥家禽に投与することを含む、家禽鳥類において飼料効率を向上させる方法を開示する。

本明細書は、いくつかの実施形態において、成鶏からの盲腸材料および食塩水を含み、盲腸材料と食塩水の比が１：３である約０．２ｍＬの組成物を強制経口投与により幼鶏に投与することを含む、鶏における飼料効率を向上させる方法を開示する。いくつかの実施形態において、幼鶏は孵化日のヒヨコである。

本明細書は、いくつかの実施形態において、（ａ）成鳥家禽から盲腸材料を得ること；（ｂ）強制経口投与により、盲腸材料を幼鳥家禽に投与すること；（ｃ）接種された家禽鳥類から盲腸材料を得て、複数世代の鳥を通じてそれを連続継代すること；（ｄ）連続継代した盲腸材料を得ること；および（ｅ）連続継代した盲腸材料を食塩水中で懸濁することによって調製される、家禽敷料への適用に適した組成物を開示する。本明細書中で使用される場合、「家禽敷料」または「鶏敷料」は、養鶏場における寝床として使用される何らかの材料（例えば、養鶏場の床に広がる木屑、おがくずまたは藁など）およびことによると家禽の排泄物、こぼれた餌および／または羽毛の混合物である。本明細書中で使用される場合、別段の指定がない限り、「接種された」家禽鳥類または鶏は、本明細書中で開示される組成物の何れかを経口投与されたものである。

家禽盲腸材料は、例えば、鳥のＧＩ管を摘出し、複数の盲腸または１つの盲腸を切り取り、盲腸の内容物または剥離物(scrapings)を粉砕、ホモジナイズおよび／または合わせることによって得ることができる。

ＧＩ細菌の特定のセットに対する鶏による選択は、細菌と宿主との間の複雑な免疫介在性のやり取りから生じる。この現象は、一貫しており、再現性がある。本発明は、連続継代を用いることによりこの現象を利用し、これにより、家禽または鶏自体を使用して幼鳥家禽またはヒヨコに提供され得る特定の群について選択して、成長能力を向上させることによって、特定の培地を明確化することの困難性を回避する。

本明細書は、いくつかの実施形態において、（ａ）成鶏から盲腸材料を得ること；（ｂ）強制経口投与により、盲腸材料を幼鶏に投与すること；（ｃ）接種された鶏から盲腸材料を得て、複数世代の鳥を通じてそれを連続継代すること；（ｄ）連続継代した盲腸材料を得ること；および（ｅ）連続継代した盲腸材料を食塩水中で懸濁することによって調製される、鶏敷料への適用に適した組成物を開示する。ある実施形態において、段階（ｂ）の幼鶏は孵化日のヒヨコである。段階（ｃ）の連続継代は、少なくとも３セットのヒヨコを通じて行い得る。

本明細書は、いくつかの実施形態において、本組成物を鶏敷料に適用する段階を含む、病原菌による鶏腸定着を予防または軽減する方法を開示する。本組成物は、例えば、敷料と混合するかまたは敷料上にそれらを噴霧することによって適用し得る。例えば、本組成物は、エアロゾルスプレーが１ｃｍ^２あたり１０^８個のプロバイオティクス細胞を含有するエアロゾルとして噴霧され得る。家禽および／またはヒトに対して病原性である細菌としては、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、クロストリジウム・セプチカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｓｅｐｔｉｃｕｍ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）およびカンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）が挙げられるが限定されない。

本明細書は、ある実施形態において、（ａ）成鳥家禽からの盲腸材料および（ｂ）食塩水を含み、（ａ）と（ｂ）との比が１：２〜１：４（ｖ／ｖ）の範囲である組成物を家禽の敷料に適用する段階を含む、病原菌による家禽腸定着を予防または軽減する方法を開示する。いくつかの実施形態において、盲腸材料と食塩水との比は、１：２、１：２．２５、１：２．５、１：２．７５、１：３、１：３．２５、１：３．５、１：３．７５または１：４（ｖ／ｖ）である。本組成物は、例えば、敷料と混合するかまたは敷料上にそれらを噴霧することによって適用し得る。いくつかの実施形態において、本組成物は、敷料上に直接エアロゾル噴霧することによって適用され、エアロゾルスプレーは、約１０^８個のプロバイオティクス細胞／ｃｍ^２を含む。

本明細書は、いくつかの実施形態において、家禽敷料と、（ａ）成鳥家禽からの盲腸材料および（ｂ）食塩水を含み、（ａ）と（ｂ）との比が１：２〜１：４（ｖ／ｖ）の範囲である組成物と、を含む敷料組成物を開示する。いくつかの実施形態において、盲腸材料と食塩水との比は、１：２、１：２．２５、１：２．５、１：２．７５、１：３、１：３．２５、１：３．５、１：３．７５または１：４（ｖ／ｖ）である。

本明細書は、いくつかの実施形態において、ａ）盲腸内容物の懸濁液をクロロホルムと混合して胞子形成細菌について選択し、ｂ）遠心分離によって混合物からクロロホルムを除去し、食塩水で洗浄する段階を含む、プロバイオティクス能力がある細菌株について選択する方法を開示する。本明細書で使用される場合、「プロバイオティクス」または「プロバイオティクス能力を有する細菌株」は、宿主に有益な健康効果を与える、生きている微生物（例えば細菌）である。

本明細書は、いくつかの実施形態において、（ａ）成鶏から盲腸材料を得ること；（ｂ）強制経口投与により、盲腸材料を幼鶏に投与すること；（ｃ）接種された鶏から盲腸材料を得て、複数世代の鳥を通じてそれを連続継代すること；（ｄ）連続継代した盲腸材料を得ること；（ｅ）連続継代した盲腸材料を食塩水中で懸濁すること；（ｆ）盲腸材料の懸濁液をクロロホルムと混合して、胞子形成細菌について選択すること；（ｇ）遠心分離により混合物からクロロホルムを除去すること；および（ｈ）食塩水で洗浄することによって調製され、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）の次の株：ｃ２−６−１２；ｃ１−８；ｍ１−１０−１５；ｍ２−９；ｍｇ２０−４；ｍ２０−１；ｃ２０−１およびｍ２０−５のうち１つ以上を含む、鶏敷料への適用に適した組成物を開示する。

本明細書中で開示される組成物および方法を実施するための以下の成分、工程および手順は、上記のものに対応する。以下の手順は、成鶏由来の盲腸材料を含む組成物および方法ならびにその作製および使用方法の特に例示的で非限定的な実施形態とともに記載する。

成鶏の微生物叢を接種したヒヨコと未接種ヒヨコとの成長比較。成鶏の盲腸材料から調製した接種物の有効性を検証するためにいくつかの実験を行った。盲腸材料をその日に孵化したヒヨコに投与した。

盲腸材料を得るために、成鳥のＧＩ管を摘出し、盲腸を切り取った。次いで、盲腸部分を内容物および剥離物としてホモジナイズし、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）と３：１で混合し、鳥１羽あたり０．２ｍＬを強制経口投与することによって孵化日のヒヨコに接種するために使用した。鳥は１週間間隔で体重測定し、ＲＦＩ値は実験の最後の２週間にわたり鳥ごとに計算した。

およそ８０羽の新しく孵化したヒヨコを、２つの群、成鶏からの盲腸材料接種群および未接種対照群、に分けた。次いで、それらの鳥を典型的な養鶏条件である平飼い飼育場で６週間飼育した。６週間の成長期間にわたって、成鳥からの接種物を投与されたヒヨコは、体重増加（図１）および飼料効率（図２）において有意な向上を示した。それらはまた、接種から６週間後でも、ＧＩ微生物叢の分類学的組成が顕著に異なっていた（図３および図４）。

腸内プロバイオティクス細菌の同定および培養。孵化から７、２１および４１日後に、業務用鶏の中腸および盲腸から試料を回収した。次いで、試料をクロロホルムで処理して栄養細菌細胞を除去し、嫌気性条件下で培養した。簡単に説明すると、糞便をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に懸濁し、室温で６０分間振盪しながらクロロホルムと混合した。２５００ｒｐｍで２０分間の遠心分離によってクロロホルムを分離し、処理した試料を培養のためにピペットで取り出した。試料を３つの異なる培地上で培養し、純培養コロニーが得られるまで移した。ゲノムＤＮＡに対して、ＰＥ２５０リードでＩｌｌｕｍｉｎａＭｉＳｅｑ機器上で配列決定を行い、標準的なゲノムツールを用いてデータを処理した。

およそ４０個の分離株が得られ、いくつかの方法で特徴評価を行った。最初に、これらの分離株を試験して、様々なヒトおよび動物の病原体の増殖を阻害し得るか否かを調べた。盲腸試料からの８種類の分離株および中腸試料からの５種類は、Ｃ．パーフリンジェンス（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、Ｃ．セプチカム（Ｃ．ｓｅｐｔｉｃｕｍ）またはＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＮＡＰ１株のうち少なくとも１つの増殖を阻害した。

これらの分離株を分類学的に同定するために、発明者らはそれらの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を配列決定し、最先端かつ包括的なデータベースのいくつかを使用して、最も密接に関連する既知の配列を同定した。８種類の固有の分離株がクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅ）科に属しており（図５）、さらなる特徴評価のためにこれらを選択した。特に、最も近い近縁種との配列同一性が＜９７％の許容種の定義を使用して、２つの純粋培養物は、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属のクラスターＩ内の新規の可能性がある種に相当する。株ｃ２−６は、Ｃ．ブチリカム（Ｃ．Ｂｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）と最も密接に関連し（９６．９％同一性）、株ｃ１−８は、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）種ＫＤ−３１と最も密接に関連する（９５．４％同一；図５）。ここで培養された新しい各分離株（太字または赤字で示される）については、株名が示され、その後にその最も近い近縁種に対する１６Ｓ遺伝子のパーセント同一性が続く。赤色の２種類の株（図５）は、＜９７％同一性の種のカットオフの許容される規則に基づいて、新規の種に相当する可能性がある。

最後に、これら２種類の新規である可能性があるクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）種をさらに特徴評価するために、そのゲノム全体を配列決定した。これらの２種類の株のゲノム配列決定は、これまでに、いくつかのバクテリオファージホリンおよびエンドリシン遺伝子を含むいくつかの興味深い特徴を明らかにした。ゲノム配列から、別の分類学的マーカー遺伝子（ハウスキーピング遺伝子であるｃｐｎ６０）に対する配列を得ることが可能であった。この分析から、ｃ２−６がＣ．アカロペルブチルアセトニカム（Ｃ．ａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ）およびＣ．ベイジェリンキイ（Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）に最も密接に関連し、ｃ１−８がキチン分解性Ｃ．アラプトリフィカム（Ｃ．ａｒａｐｕｔｒｉｆｉｃｕｍ）、Ｃ．セラツム（Ｃ．ｃｅｌａｔｕｍ）およびＣ．ブチリカム（Ｃ．ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）に最も類似していることが示された。

潜在的なプロバイオティクス細菌の、培養に基づく選択濃縮スキーム。クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）を健康な鶏の盲腸から選択的に単離するために、選択的培養スキームを実施し、前の実施例に記載のように、およそ４０株を純粋培養に導入した。簡潔に述べると、ホルムアルデヒド、エタノールおよび／または熱への曝露を使用して、栄養細胞を死滅させ、様々な増殖培地上に播種した胞子形成細菌について選択した。得られた分離株の予備的な系統学的配置（１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列に基づく。）は、殆どの株がクロストリジウム目（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ）に属することを示した。特に興味深いのは、最も近い既知の近縁種に対する低い（種識別に対する経験則として＜９７％の配列類似性カットオフ）１６ＳｒＲＮＡ相同性に基づいて同定された、いくつかの新規の可能性がある分類群である。

病原体の競合的排除についてそれらの可能性を評価するために、新規に回収された分離株を共通の腸病原体のパネルに対して試験した。既知の病原体Ｃ．パーフリンジェンス（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、Ｃ．セプチカム（Ｃ．ｓｅｐｔｉｃｕｍ）またはＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＮＡＰ１株のうち少なくとも１つの増殖阻害が、盲腸からの発明者らの新規分離株のうち８種類および中腸試料からの５種類に対して観察された（図６）。クリアランスの区域によって示されるように、Ｃ．パーフリンジェンス（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）の菌叢上に置かれた場合、推定新規分離株ｃ２−６およびｃ１−８（図８の左上および右上）は抗菌特性を示した。前の実施例で報告したように、別の分類学的マーカー遺伝子（ｃｐｎ６０、ハウスキーピング遺伝子）の配列を得ることが可能であり、ここでｃ２−６はＣ．サッカロペルブチルアセトニカム（Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ）およびＣ．ベイジェリンキイ（Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）に最も密接に関連しており、ｃ１−８はキチン分解性Ｃ．パラプトリフィカム（Ｃ．ｐａｒａｐｕｔｒｉｆｉｃｕｍ）、Ｃ．セラツム（Ｃ．ｃｅｌａｔｕｍ）およびＣ．ブチリカム（Ｃ．ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）と最も類似していることが示された（図５）。

家禽敷料へのプロバイオティクスの適用。微生物集団を減少させるために、二酸化塩素（ＣｌＯ２）顆粒を敷料に適用した。ＣｌＯ２およびプロバイオティクス添加で処理したかまたはそれで処置しなかった敷料を用いて、１回の処置あたりおよそ５０羽のヒヨコ（合計２００羽）を２元要因配置実験（ｔｗｏ−ｗａｙｆａｃｔｏｒｉａｌｄｅｓｉｇｎ）に供した。盲腸内容物を１週齢で回収または入手し、それを次のセットのヒヨコ用の強制経口投与物として使用して、いくつかのセットのヒヨコを通して盲腸内容物を連続的に継代することにより、プロバイオティクス培養物を得た。

Claims

（ａ）成鳥家禽からの盲腸材料および（ｂ）食塩水を含み、（ａ）と（ｂ）との比が１：２〜１：４（ｖ／ｖ）の範囲である、幼鳥家禽への経口投与に適している組成物。
前記盲腸材料が成鶏由来であり、（ａ）と（ｂ）との比が１：３であり、幼鶏への経口投与に適している、請求項１に記載の組成物。
バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）が有意に濃縮された細菌群、栄養素、アミノ酸、ビタミン、ミネラルおよび脂肪酸のうち１つ以上をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
強制経口投与により幼鳥家禽に請求項１に記載の組成物を約０．２ｍＬ投与することを含む、家禽鳥類において体重増加を向上させる方法。
強制経口投与により幼鶏に請求項２に記載の組成物を約０．２ｍＬ投与することを含む、鶏において体重増加を向上させる方法。
前記幼鶏が孵化日のヒヨコである、請求項５に記載の方法。
強制経口投与によって幼鳥家禽に請求項１に記載の組成物約０．２ｍＬを投与することを含む、家禽鳥類において飼料効率を高める方法。
強制経口投与によって幼鶏に請求項２に記載の組成物約０．２ｍＬを投与することを含む、鶏において飼料効率を高める方法。
前記幼鶏が、孵化日のヒヨコである、請求項８に記載の方法。
（ａ）成鳥家禽から盲腸材料を得ること；（ｂ）強制経口投与により、前記盲腸材料を幼鳥家禽に投与すること；（ｃ）前記接種された家禽鳥類から前記盲腸材料を得て、複数世代の鳥を通じてそれを連続継代すること；（ｄ）前記連続継代した盲腸材料を得ること；および（ｅ）前記連続継代した盲腸材料を食塩水中で懸濁することによって調製される、家禽敷料への適用に適した組成物。
（ａ）成鶏から前記盲腸材料を得ること；（ｂ）強制経口投与により、前記盲腸材料を幼鶏に投与すること；（ｃ）前記接種された鶏から前記盲腸材料を得て、複数世代の鳥を通じてそれを連続継代すること；（ｄ）前記連続継代した盲腸材料を得ること；および（ｅ）前記連続継代した盲腸材料を食塩水中で懸濁することによって調製される、鶏敷料への適用に適した組成物。
段階（ｂ）における前記幼鶏が孵化日のヒヨコであり、段階（ｃ）における前記連続継代が少なくとも３セットのヒヨコを通じて行われる、請求項１１に記載の組成物。
請求項１１に記載の組成物を前記鶏敷料に適用する段階を含む、病原菌の鶏腸定着を予防または軽減する方法。
請求項１に記載の組成物を前記家禽敷料に適用する段階を含む、病原菌の家禽腸定着を予防または軽減する方法。
前記組成物が、エアロゾルスプレーによって前記家禽敷料に適用され、前記エアロゾルスプレーが１ｃｍ^２あたり約１０^８個のプロバイオティクス細胞を含む、請求項１４に記載の方法。
家禽敷料と、（ａ）成鳥家禽からの盲腸材料および（ｂ）食塩水を含み、（ａ）と（ｂ）との比が１：２〜１：４（ｖ／ｖ）の範囲である組成物と、を含む敷料組成物。
ａ）盲腸内容物の懸濁液をクロロホルムと混合して胞子形成細菌について選択し、ｂ）遠心分離によって前記混合物から前記クロロホルムを除去し、食塩水で洗浄する段階を含む、プロバイオティクス能力がある細菌株を選択する方法。
（ａ）成鶏から前記盲腸材料を得ること；（ｂ）強制経口投与により、前記盲腸材料を幼鶏に投与すること；（ｃ）前記接種された鶏から前記盲腸材料を得て、複数世代の鳥を通じてそれを連続継代すること；（ｄ）前記連続継代した盲腸材料を得ること；（ｅ）前記連続継代した盲腸材料を食塩水中で懸濁すること；（ｆ）前記盲腸材料の前記懸濁液をクロロホルムと混合して、胞子形成細菌について選択すること；（ｇ）遠心分離により前記混合物から前記クロロホルムを除去すること；および（ｈ）食塩水で洗浄することによって調製され、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）の次の株：ｃ２−６−１２；ｃ１−８；ｍ１−１０−１５；ｍ２−９；ｍｇ２０−４；ｍ２０−１；ｃ２０−１およびｍ２０−５のうち１つ以上を含む、鶏敷料への適用に適した組成物。