JP2017536454A - 皮膚の修復および/または再生において使用するためのヘパラン硫酸 - Google Patents
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Abstract
Description
・YCKNGGF(配列番号2)、または
・GHFKDPKRLYCKNGGF(配列番号1)
のいずれか1つのアミノ酸配列を有するかまたは該配列からなるペプチドまたはポリペプチドに結合可能である。
(i)固体支持体に付着したポリペプチド分子を有する固体支持体を提供すること、ここでポリペプチドは、アミノ酸配列YCKNGGFを有するヘパリン結合ドメインを含む;
(ii)ポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体の形成が可能になるように、グリコサミノグリカンを含む混合物と、該ポリペプチド分子を接触させること;
(iii)ポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体を混合物の残りから分離すること;
(iv)ポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体からグリコサミノグリカンを解離させること;
(v)解離したグリコサミノグリカンを収集すること
を含むことも可能である。
・YCKNGGF(配列番号2)、または
・GHFKDPKRLYCKNGGF(配列番号1)
より選択されるアミノ酸配列を含むかまたは該配列からなることも可能である。
本発明の1つの側面において、上述の側面記載のHS8を含む薬学的組成物または薬剤を提供する。該薬学的組成物または薬剤は、薬学的に許容されうるキャリアー、アジュバントまたは希釈剤をさらに含んでもよい。
(i)間葉系幹細胞を、in vitroで、HS8と接触させて、前記細胞が組織を形成するために十分な期間、培養し;
(ii)前記組織を収集し;
(iii)前記組織を、傷害または疾患部位で、患者体内に移植して、患者において、組織を修復するか置換するかまたは再生する
工程を含む、前記方法を提供する。
(i)HS8;および以下の一方または両方
(ii)FGF2タンパク質;
(iii)間葉系幹細胞
を含有する産物を提供する。医学的治療法は、in vivoの創傷治癒、結合組織の修復および/または再生、骨の修復および/または再生、ならびに/あるいは哺乳動物またはヒトにおける骨の修復および/または再生の方法を含んでもよい。産物は、場合によって、同時投与のための組み合わせ調製物として製剤化されてもよい。
本発明の別の側面において、皮膚移植、皮膚再構築または皮膚形成手術の方法であって、移植、再構築または形成手術の領域のまたは該領域に隣接した皮膚を、HS8を含む薬学的組成物の有効量と接触させる工程を含む前記方法を提供する。本発明の別の側面において、皮膚移植、皮膚再構築または皮膚形成手術の方法において使用するためのヘパラン硫酸HS8であって、該方法が、移植、再構築または形成手術の領域のまたは該領域に隣接した皮膚を、HS8を含む薬学的組成物の有効量と接触させる工程を含む、前記HS8を提供する。本発明の別の側面において、皮膚移植、皮膚再構築または皮膚形成手術の方法において使用するための薬剤製造におけるヘパラン硫酸HS8の使用であって、該方法が、移植、再構築または形成手術の領域のまたは該領域に隣接した皮膚を、HS8を含む薬学的組成物の有効量と接触させる工程を含む、前記使用を提供する。
本発明の1つの側面において、FGF2に対して高い結合アフィニティを有するGAGを提供する。より好ましくは、GAGはヘパラン硫酸(HS)である。1つの態様において、ブタ腸粘膜(Celsus Laboratories Inc、米国シンシナティより入手可能、例えばINW−08−045、ヘパラン硫酸I、Celsus Lab Inc、HO−03102、HO−10595、10x100mg)から得られるGAG混合物から、本明細書記載の方法論にしたがうことによって、HSを単離し、ここで、YCKNGGFのアミノ酸配列を含有するFGF2のヘパリン結合ドメインを含むポリペプチドを、固体支持体に付着させ、そしてGAG−ポリペプチド複合体を形成させる。GAG−ポリペプチド複合体からのGAG構成要素の解離は、「HS8」と称される、本明細書のユニークなHSの単離を導いた。1つの態様において、HS8は、ポリペプチドGHFKDPKRLYCKNGGF(配列番号1)を固体支持体に付着させて、GAG−ポリペプチド複合体を形成させ、そしてGAG−ポリペプチド複合体からGAG構成要素を解離させることによって単離されるHSである。
したがって、本発明の1つの側面において、HS8を提供する。HS8は、単離型または精製型であってもよい。別の側面において、HS8を含む培地を提供する。
これらの組織の1つの悪化を有する患者において、悪化部位へのHS8の投与を用いて、その部位での組織の成長、増殖および/または分化を刺激することも可能である。例えば、投与部位にまたはその近傍に存在する間葉系幹細胞の刺激は、好ましくはFGF2もまたその部位に存在する際に、間葉系幹細胞の増殖および適切な結合組織への分化を導き、それによって、損傷を受けた組織の置換/再生および傷害の治療を提供することも可能である。
増殖因子の安定性を増加させる方法であって、増殖因子を単離HS8と接触させる工程を含む、前記方法もまた提供する。
1. ヘパラン硫酸HS8。
3. アミノ酸配列YCKNGGF(配列番号2)を有するかまたは該配列からなるペプチドまたはポリペプチドに結合可能である、段落1または2記載のヘパラン硫酸HS8。
5. 段落1〜4のいずれか1つに記載の単離されたまたは実質的に精製されたヘパラン硫酸HS8であって、ヘパリンリアーゼI、IIおよびIIIで消化し、そして次いで、生じた二糖断片をキャピラリー電気泳動分析に供した後、ヘパラン硫酸HS8が:
6. 段落1〜4のいずれか1つに記載の単離されたまたは実質的に精製されたヘパラン硫酸HS8であって、ヘパリンリアーゼI、IIおよびIIIで消化し、そして次いで、生じた二糖断片をキャピラリー電気泳動分析に供した後、ヘパラン硫酸HS8が:
7. (i)固体支持体に付着したポリペプチド分子を有する固体支持体を提供すること、ここでポリペプチドは、アミノ酸配列YCKNGGFを有するヘパリン結合ドメインを含む;
(ii)ポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体の形成が可能になるように、グリコサミノグリカンを含む混合物と、該ポリペプチド分子を接触させること;
(iii)ポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体を混合物の残りから分離すること;
(iv)ポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体からグリコサミノグリカンを解離させること;
(v)解離したグリコサミノグリカンを収集すること
を含む方法によって得られる、段落1〜6のいずれか1つに記載の、ヘパラン硫酸HS8、あるいは単離された形態または実質的に精製された形態のヘパラン硫酸HS8。
9. グリコサミノグリカンを含む混合物が、ブタ腸粘膜から得られるヘパラン硫酸調製物である、段落7または8の方法。
11. 増殖因子、好ましくはFGF2をさらに含む、段落10の組成物。
12. 段落1〜9のいずれか1つに記載のヘパラン硫酸HS8を含む薬学的組成物または薬剤。
14. 医学的治療法において使用するための、段落12または13の薬学的組成物または薬剤。
16. 医学的治療法がin vivoでの創傷治癒法を含む、段落15記載のヘパラン硫酸HS8。
18. 方法が、組織、好ましくは骨組織の修復および/または再生を含む、組織に対する疾患、状態または傷害の治療のための薬剤製造における、段落1〜9のいずれか1つに記載のヘパラン硫酸HS8の使用。
21. 患者にFGF2タンパク質を投与する工程をさらに含む、段落19または20の方法。
24. 生体適合性移植物または装具を形成する方法であって、バイオマテリアルを、段落1〜9のいずれか1つに記載のヘパラン硫酸HS8でコーティングするかまたは含浸させる工程を含む、前記方法。
26. 前記ヘパラン硫酸HS8を骨折周囲の組織に投与する工程を含む、段落25の方法。
28. 前記ヘパラン硫酸が、ヘパラン硫酸および薬学的に許容されうるキャリアー、アジュバントまたは希釈剤を含む薬学的組成物または薬剤として製剤化される、段落25〜27のいずれか1つの方法。
37. 医学的治療法で同時に、別個に、または連続して使用するための、療法的有効量の:
(i)段落1〜9のいずれか1つ記載のヘパラン硫酸HS8;および以下の一方または両方
(ii)FGF2タンパク質;
(iii)間葉系幹細胞
を含有する産物。
本発明者らは、HS8と称される、ヘパラン硫酸分子の新規クラスを同定した。本発明者らは、HS8が、以下の好適な特性を有することを示している:
・HS8は、STRO1を発現する間葉系幹細胞(MSC)を濃縮する(図12、図14)。
・HS8を欠くヘパラン硫酸(HS8陰性分画)とは対照的に、HS8は、ヒトMSCの国際的に認識される定義と一致する表面マーカー発現パターンを有するヒトMSC集団を濃縮する(図22);
・HS8とhMSCの培養は、高レベルのCD49a、SSEA−4およびSTRO−1発現を有するヒトMSC集団を提供する(図22)。対照的に、hMSCへの培養補充物としてのFGF−2の添加は、STRO−1を発現するhMSCの比率に負に影響を及ぼし、そしてhMSCの多分化能の喪失を生じる(図22、23および25)。
・HS8は、FGF−2が仲介するMSC増殖を増進させる;
・HS8は、FGF−2が仲介するERK経路のシグナル伝達を維持する。
HS8
本発明は、HS8と称されるヘパラン硫酸分子クラスに関する。HS8分子は、FGF2のヘパリン結合ドメインに対応するポリペプチドに結合する、1またはそれより多いGAGを含有する化合物の混合物を濃縮する方法によって得られうる。特に、HS8分子は、アミノ酸配列YCKNGGFを含むかまたは該配列からなるFGF2のヘパラン結合ドメインに結合するヘパラン硫酸に関して濃縮することによって得られうる。濃縮プロセスを用いて、HS8を単離することも可能である。
本明細書に記載する方法論によって得られうることに加えて、HS8はまた、機能的にそして構造的にも定義されうる。
好ましくは、HS8はまた、100μM未満、より好ましくは50μM、40μM、30μM、20μM、または10μMの1つ未満のKDでFGF2タンパク質に結合する。HS8およびFGF2タンパク質の間の結合は、以下のアッセイ法によって決定可能である。
ヘパリンリアーゼI、IIおよびIIIで完了するまで消化し、そして次いで生じた二糖断片をキャピラリー電気泳動分析に供した後のHS8の二糖組成を図44および45に示す。
HS調製物のヘパリン・リアーゼ酵素での消化を、以下のように行うことも可能である:HS調製物(1mg)を各々、500μLの酢酸ナトリウム緩衝液(10mM酢酸カルシウムを含有する100mM、pH7.0)に溶解し、そして各2.5mUの3つの酵素を添加する;試料試験管を穏やかに反転しながら(9rpm)試料を37℃で一晩(24時間)インキュベーションし;さらに各2.5mUの3つの酵素を試料に添加し、試料試験管を穏やかに反転しながら(9rpm)、37℃でさらに48時間インキュベーションし;加熱(100℃、5分間)によって消化を停止し、そして次いで凍結乾燥し;消化物を500μLの水に再懸濁し、そしてアリコット(50μL)を分析のため採取する。
(i)支持体に付着したポリペプチド分子を有する固体支持体を提供すること、ここで、ポリペプチドがヘパリン結合ドメインを含む;
(ii)ポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体が形成可能であるように、グリコサミノグリカンを含む混合物と、該ポリペプチド分子を接触させること;
(iii)混合物の残りからポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体を分離すること;
(iv)ポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体から、グリコサミノグリカンを解離させること;
(v)解離したグリコサミノグリカンを収集すること
を含む、前記方法を提供した。
(i)支持体に付着したポリペプチド分子を有する固体支持体を提供すること、ここで、ポリペプチドがヘパリン結合ドメインを含む;
(ii)ポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体が形成可能であるように、グリコサミノグリカンを含む混合物と、該ポリペプチド分子を接触させること;
(iii)混合物の残りからポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体を分離すること;
(iv)ポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体から、グリコサミノグリカンを解離させること;
(v)解離したグリコサミノグリカンを収集すること;
(vi)ヘパリン結合ドメインのアミノ酸配列を含有するタンパク質が存在する細胞または組織に、収集したグリコサミノグリカンを添加すること;
(vii)細胞の増殖、細胞の分化、1またはそれより多いタンパク質マーカーの発現の1またはそれより多くを測定すること
を含む、前記方法を提供した。
固体支持体は、分子が、直接または間接的に、共有または非共有結合のいずれかを通じて付着可能である表面を有する任意の支持体であることも可能である。固体支持体には、表面に付着するプローブに物理的支持を提供することが可能な任意の支持材料が含まれることも可能である。これはマトリックス支持体であることも可能である。材料は、一般的に、表面へのプローブの付着に関連する条件、およびアッセイ実行中に遭遇するいかなる続く処理、取り扱い、またはプロセシングにも耐えることが可能である。材料は、天然存在、合成、または天然存在材料の修飾であることも可能である。固体支持体は、プラスチック材料(ポリマー、例えばポリ(塩化ビニル)、シクロ−オレフィン・コポリマー、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ(4−メチルブテン)、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリ(エチレンテレフタレート)、ポリテトラフルオロエチレン(PTFEまたはテフロン(登録商標))、ナイロン、ポリ(酪酸ビニル))等であることも可能であり、これら自体を用いるかまたは他の材料と組み合わせて用いることも可能である。さらなる剛性材料を考慮することも可能であり、例えばシリカを含むガラス、そしてさらに、例えばバイオガラスとして入手可能なガラスが含まれる。使用可能な他の材料には、多孔性材料、例えば制御孔ガラスビーズが含まれる。例えば表面上に取り込まれた、1またはそれより多い官能基、例えばアミノ、カルボキシル、チオール、またはヒドロキシル官能基を有することが可能な、当該技術分野に知られる任意の他の材料もまた意図される。
(a)in vitroで、HS8と接触させて、細胞および/または組織を培養し;
(b)細胞および/または組織を収集し;
(c)治療が必要なヒトまたは動物被験体内に細胞および/または組織を移植する
工程を含む、前記方法を提供することも可能である。
(a)HS8;
(b)幹細胞と組み合わせたHS8;
(c)HS8によって結合されるヘパリン結合ドメイン(例えば配列番号1)を含有するタンパク質と組み合わせたHS8;
(d)幹細胞およびHS8によって結合されるヘパリン結合ドメイン(例えば配列番号1)を含有するタンパク質と組み合わせたHS8;
(e)HS8と接触させた細胞または組織の培養から得られる組織または細胞
の1つを含むことも可能である。
別の側面において、本発明は、HS8を含む生物学的足場を提供する。いくつかの態様において、本発明の生物学的足場を、整形外科、血管、装具、皮膚および角膜適用に用いることも可能である。本発明が提供する生物学的足場には、長期放出薬剤送達デバイス、生体弁、生体弁膜(tissue valve leaflets)、薬剤溶出ステント、血管移植片、創傷治癒または皮膚移植片、ならびに整形外科装具、例えば骨、靱帯、腱、軟骨、および筋肉が含まれる。本発明の好ましい態様において、生物学的足場は、内部(および/または外部)表面が、カテーテルに付着した1またはそれより多いGAG化合物(HS8を含む)を含むカテーテルである。
(i)1またはそれより多いGAGを含む化合物の混合物であって、HS8に関して濃縮されている、前記混合物;および
(ii)FGF2
を含む、薬学的に許容されうる製剤を提供する。好ましい態様において、製剤は、1またはそれより多いGAGを含む化合物の混合物であって、緊密に混合されているHS8およびFGF2に関して濃縮されている、前記混合物を含み、そして治療が必要な患者に同時に投与される。
HS8と接触させる細胞には、幹細胞が含まれる。
HS8を、幹細胞の増殖および/または分化、ならびに/あるいは幹細胞の系譜拘束に用いることも可能である。
間葉系幹細胞(MSC)は、元来、骨髄から単離され、そして全部で104〜105の骨髄単核細胞(BMMNC)のうちのわずか1つとして存在する(Friedensteinら 1966)。これらの細胞は、CFU−F(コロニー形成単位線維芽細胞)集団をダビングする(dubbed)、単細胞前駆体に由来するコロニーを産生することが可能である。MSCは、現在、脂肪組織(GimbleおよびGuilak 2003;Zukら 2001)、臍帯血(Biebackら 2004;Ericesら 2000;Goodwinら 2001;Koglerら 2004;Wagnerら 2005)および筋肉(Jiangら 2002)を含む、多くの他の組織において同定されてきている。
本明細書において、用語「グリコサミノグリカン」および「GAG」は交換可能に用いられ、そしてオリゴ糖を含む分子の大きなコレクションを指すと理解され、ここで1またはそれより多いこれらの結合した糖は、アミノ置換基、またはその誘導体を所持する。GAGの例は、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、デルマタン硫酸、ヒアルロン酸およびヘパラン硫酸である。
ヘパラン硫酸プロテオグリカン(HSPG)は、プロテオグリカンの非常に多様な下位群に相当し、そしてタンパク質主鎖に共有結合したヘパラン硫酸グリコサミノグリカン側鎖で構成される。コアタンパク質は3つの主要な型:パールカンとして知られる分泌型、グリピカンとして知られる形質膜に係留された型、およびシンデカンとして知られる膜貫通型で存在する。これらは、哺乳動物細胞表面および大部分の細胞外マトリックスの普遍的な構成要素である。アグリン、またはアミロイド前駆体タンパク質などの他のタンパク質があり、この際、HS鎖は、より一般的に見られないコアに付着している可能性もある。
亜硝酸に基づくヘパラン硫酸の脱重合は、完了した際には、炭水化物鎖の個々の二糖構成要素への最終的な分解を導く。
ヘパリナーゼIIIは、グルクロニド結合で糖鎖を切断する。一連のヘパリナーゼ酵素(I、IIおよびIII)は、各々、特定の硫酸化認識部位で、特定のヘパラン硫酸配列を脱重合することによって、各々、相対的に特異的な活性を示す。ヘパリナーゼIは、HS鎖に沿ってNS領域でHS鎖を切断する。これは、硫酸化ドメインの破壊を導く。ヘパリナーゼIIIは、NAドメインでHSを脱重合し、炭水化物鎖の個々の硫酸化ドメインへの分離を生じる。ヘパリナーゼIIは、主に、HS鎖のNA/NS「肩」ドメインにおいて切断し、このドメインは多様な硫酸化パターンが見られる箇所である。注:ヘパリンポリマーの反復二糖主鎖は、アミノ糖グルコサミンに連結されたウロン酸である。「NS」は、アミノ糖が、C2、C6およびC3の他の基の硫酸化を可能にする、アミノ基上の硫酸基を所持することを意味する。「NA」は、アミノ基が硫酸化されておらず、そしてアセチル化されたままであることを示す。
皮膚の修復および/または再生におけるHS8の使用
本発明者らは、FGF−2をより特異的にターゲティングする、本明細書記載の精製HS調製物、HS8を開発した。本発明者らは、HS8が、FGF−2に増加したアフィニティを所持し、ヒト真皮線維芽細胞の増殖速度を増加させ、そして角化細胞および真皮線維芽細胞両方の引っ掻き傷アッセイ反応を誘発することを示している。HS8は、外傷、火傷、潰瘍または疾患後の皮膚の修復を誘導するアジュバントとして試験されるであろう。HS8は、全層切除創傷を含む、皮膚の慢性創傷を治療するために必要な増殖因子を安定化させ、そしてかつその量を減少させるアジュバントとして試験されるであろう。したがって、HS8は、医療制度の大きなそして増加しつつある損失であり、そして緊急のそして大きな満たされていない臨床的必要性である、糖尿病潰瘍などの非治癒性皮膚創傷の治療の有用な療法的ツールを提供する。
皮膚移植、再構築および形成手術
皮膚移植は、皮膚の移植を伴い、そしてしばしば皮膚の広い領域が、例えば火傷、皮膚癌または壊死性筋膜炎などの感染後で損傷を受けた外傷性創傷を治療するために用いられる。
活性化合物、HS8は単独で投与することも可能であるが、上に定義するような少なくとも1つの活性化合物を、限定されるわけではないが、薬学的に許容されうるキャリアー、アジュバント、賦形剤、希釈剤、充填剤、緩衝剤、保存剤、酸化防止剤、潤滑剤、安定化剤、可溶化剤、界面活性剤(例えば湿潤剤)、マスキング剤、着色剤、フレーバー剤、および甘味剤を含む当業者に周知の1またはそれより多い他の薬学的に許容されうる成分とともに含む薬学的製剤(例えば組成物、調製物、薬剤)として提示することが好ましい。製剤は、さらに、他の活性剤、例えば他の療法剤または予防剤を含んでもよい。
クリームは、典型的には、活性化合物および水中油クリーム基剤から調製される。望ましい場合、クリーム基剤の水性相には、例えば、少なくとも約30%w/wの多価アルコール、すなわち2またはそれより多いヒドロキシル基を有するアルコール、例えばプロピレングリコール、ブタン−1,3−ジオール、マンニトール、ソルビトール、グリセロールおよびポリエチレングリコールおよびその混合物が含まれることも可能である。
骨折
いくつかの側面において、本発明は、骨折を治療するためのHS8の療法的使用(ヒトおよび/または獣医学的)に関する。
本発明を限定するわけではないが、HS8の一次作用は、創傷部位内の、該部位に隣接する、または該部位内に遊走が誘導された細胞に対するものであることも可能であり、そして該作用は、間葉系幹細胞、骨幹細胞、プレ骨芽細胞または骨芽細胞、あるいは創傷床内に見られるかまたは遊走が誘導される任意の補助または血管原性細胞に対するものであることも可能である。
HS8の投与は、好ましくは、骨折を取り巻く組織に対するものである。これには、骨折が起きた骨組織への直接の投与も含まれうる。投与は、骨または骨折を取り巻く結合組織に対するもの、あるいは骨の近傍であり、そして骨に供給する血管系(例えば血管)であることも可能である。投与は、傷害部位に対して直接であってもよいし、そして初期創傷治癒によって形成される仮骨に対してであってもよい。本発明記載の薬剤および薬学的組成物は、多くの経路による投与用に製剤化されることも可能である。最も好ましくは、HS8は、注射用の流体または液体型で製剤化される。
本発明の薬学的組成物および薬剤は、HS8でコーティングされ、そして/または含浸されるバイオマテリアルの形を取ることも可能である。バイオマテリアルから移植物または装具を形成することも可能である。こうした移植物または装具を外科的に移植して、細胞移植、骨増殖、組織再生、組織再構築、および/または組織リモデリングを補助することも可能である。
HS8と組み合わせて使用するために適したバイオマテリアルの一例は、JAXTM骨空隙充填剤(Smith & Nephew)である。Jax顆粒は、高純度の硫酸カルシウムで構成され、そして形状を保持して、制御された顆粒内多孔および顆粒遊走安定性を伴って足場を提供する。Jax顆粒は体内で安全にそして完全に溶解する。
in vitroおよびin vivo使用の両方において、HS8を約500ng/mlまたはそれ未満、より好ましくは250ng/mlまたはそれ未満、100ng/mlまたはそれ未満、90ng/mlまたはそれ未満、80ng/mlまたはそれ未満、70ng/mlまたはそれ未満、60ng/mlまたはそれ未満、50ng/mlまたはそれ未満、40ng/mlまたはそれ未満、30ng/mlまたはそれ未満、20ng/mlまたはそれ未満、10ng/mlまたはそれ未満、5ng/mlまたはそれ未満;あるいは約100mgまたはそれ未満、50mgまたはそれ未満、40mgまたはそれ未満、30mgまたはそれ未満、20mgまたはそれ未満、10mgまたはそれ未満、5mgまたはそれ未満、4mgまたはそれ未満、3mgまたはそれ未満、2mgまたはそれ未満、あるいは1mgまたはそれ未満;あるいは約0.3〜5μg/ml、0.3〜4、0.3〜3、0.3〜2.5、0.3〜2、0.3〜1.5、0.3〜1.0、0.3〜0.9、0.3〜0.8、0.3〜0.7、0.3〜0.6、0.3〜0.5、0.3〜0.4、1〜2、1〜1.75、1〜1.5、1〜1.25、1.25〜2、1.5〜2、または1.75〜2μg/mlの1つの濃度または投薬量で用いることも可能である。
本明細書において、FGF2は、線維芽細胞増殖因子ファミリーのメンバーである、線維芽細胞増殖因子2(塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)またはFGF−βとしても知られる)を指す。
FGF2タンパク質は、任意の動物またはヒト、例えば非ヒト動物、例えばウサギ、モルモット、ラット、マウスまたは他の齧歯類(齧歯類目の任意の動物由来のものを含む)、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ(雌牛、例えば乳牛、またはウシ目の任意の動物を含む)、ウマ(ウマ目の任意の動物を含む)、ロバ、および非ヒト霊長類または他の非ヒト脊椎動物生物;および/または非ヒト哺乳動物;および/またはヒトからのものであるか、またはそれに由来することも可能である。
in vitroおよびin vivo使用の両方において、FGF2をHS8と組み合わせて用いることも可能である。本発明のいくつかの細胞培養法において、外因性HS2を培養に添加する。FGF2の適切な濃度または投薬量には、約500ng/mlまたはそれ未満、より好ましくは250ng/mlまたはそれ未満、100ng/mlまたはそれ未満、90ng/mlまたはそれ未満、80ng/mlまたはそれ未満、70ng/mlまたはそれ未満、60ng/mlまたはそれ未満、50ng/mlまたはそれ未満、40ng/mlまたはそれ未満、30ng/mlまたはそれ未満、20ng/mlまたはそれ未満、10ng/mlまたはそれ未満、5ng/mlまたはそれ未満;あるいは約100mgまたはそれ未満、50mgまたはそれ未満、40mgまたはそれ未満、30mgまたはそれ未満、20mgまたはそれ未満、10mgまたはそれ未満、5mgまたはそれ未満、4mgまたはそれ未満、3mgまたはそれ未満、2mgまたはそれ未満、あるいは1mgまたはそれ未満;あるいは約0.1〜5ng/ml、0.1〜0.2、0.1〜0.3、0.1〜0.4、0.1〜0.5、0.1〜0.6、0.1〜0.7、0.1〜0.8、0.1〜0.9、0.1〜1.0、0.1〜1.5、0.1〜0.2.0、0.1〜2.5、0.1〜3.0、0.1〜3.5、0.1〜4.0、0.1〜4.5、0.1〜5.0ng/mlの1つが含まれる
いくつかの態様において、HS16のin vitroおよびin vivoの使用は、外因性FGF2の添加を排除する。例えば、本発明のいくつかの細胞培養法において、外因性FGF2は培養に添加されない。
本明細書で用いるセクション見出しは、構成上の目的のみのためであり、そして記載する主題を限定するとは見なされないものとする。
本発明の1またはそれより多い態様の詳細を、例として、本発明を実行するために本発明者らが意図する最適な様式の特定の詳細を含めて、以下の付随する説明に示す。当業者には、本発明が、これらの具体的な詳細に限定されることなく実施可能であることが明らかであろう。
本発明者らは、診療所で容易に使用可能なヘパラン硫酸(HS)調製物のスケールアップに適した、商業的に入手可能なブタCelsusヘパラン硫酸供給源由来の新規FGF2結合性HSの精製を調べた。
間葉系幹細胞(MSC)
MSCは、in vitroで、骨形成性、軟骨形成性、脂肪形成性、筋肉形成性、および他の細胞系譜への分化を導くことが可能であるプラスチック接着性細胞と広く定義され、そして近年、International Society for Cytotherapy(Zulmaら, 2011)によって、「多分化能間葉系間質細胞」の名称もまた、MSCに対して使われるようになった。MSCは、骨髄、脂肪組織、真皮組織、椎間板、羊水、多様な歯科組織、ヒト胎盤および臍帯血に見出されている(Siら、2011およびZulmaら、2011)。MSCの療法的潜在能力が認識され、そして骨組織再生および非骨格組織再生などの多くの臨床的適用において、用いられてきている。近年、MSCの免疫抑制および抗炎症効果が記載された。これは、細胞表面上に主要組織適合性複合体I分子(MHC−1)を低レベルで発現することにより、MSCが弱い免疫原性を持つこと、TおよびBリンパ球両方の活性化および増殖を抑制可能であること、ならびに損傷を受けた組織を保護しながら、傷害を受けた組織の微小環境を調節することによる(Siら、2011およびZulmaら、2011)。MSCが仲介し、GVHDを治療するために有効に使用可能であるこの免疫抑制は、機構の種変動を有する(Renら、2009およびShiら、2010)。サイトカインにプライミングされるマウスMSCは、一酸化窒素(NO)によって仲介され、そしてヒトMSCのサイトカイン・プライミングは、インドールアミン2,3−ジオキシゲナーゼ(IDO)を通じて実行される。
ヘパリンは、マスト細胞中で産生され、そして貯蔵され、そしてこれに比較して、HSGAGは、すべての動物組織で見られ、そしてこれらはHS鎖が細胞表面またはECMタンパク質に結合する場合、プロテオグリカンとして存在可能である。HSは、代謝、輸送、情報伝達、細胞接着、細胞増殖および分化に影響を及ぼし、そしてすべての臓器系を補助する(Bishopら、2007およびGandhiら、2008)。ヘパリンおよびHSは、反復ウロン酸−(1→4)−D−グルコサミン二糖サブユニットからなる直鎖多糖である。ウロン酸は、D−グルクロン酸またはL−イズロン酸のいずれであってもよい。さらに、特定の場所での修飾は、異なるN−硫酸化、O−硫酸化およびN−アセチル化複合体配列を生じさせる[Oriら、2008]。ヘパリン中で最も豊富な二糖は、IdoA(2S)−(1→4)−GlcNS(6S)であり、したがって、鎖の長さ全体で高い負の電荷を生じさせ、これによってヘパリンはタンパク質への結合において、劣った選択性を示すかまたは選択性を示さない。他方で、HSは、最も一般的な型として、非硫酸化GlcA−(1→4)−GlcNA二糖を有し、非硫酸化NAドメインの分離ブロックおよび非常に硫酸化されたヘパリン様IdoA−(1→4)−GlcNS二糖のブロック(NSドメイン)を生じさせる。NAおよびNSドメインは、NA/NS遷移ドメインによって分離される。HS構造のこの多様性が、広範囲の生物学的機能の原因である。
線維芽細胞増殖因子(FGF)は、ヒトにおいて22のメンバーを含む、ポリペプチド増殖因子の大きなファミリーである。これらは、FGF受容体(FGFR)として知られるFGF細胞表面受容体チロシンキナーゼのサブファミリーに結合し、そしてこれを活性化することによって、発生、分化、細胞増殖、血管形成および創傷治癒において大きな役割を果たす(Ornitzら、1996)。さらに、FGFは、最もよく研究されたヘパリン結合タンパク質の1つであり、そしてHSGAGは、FGFRとの直接分子会合によって、FGFシグナル伝達を制御する(Pellegrini、2001)。さらに、FGFR1を通じたFGF2シグナル伝達は、MSC拡大に重要である(Gronthosら、1999)。
タンパク質のヘパリン/HS結合部位において、共通の構造特徴があることが多様な研究によって認識されてきている(Gandhiら、2008;Hilemanら、1998およびOriら、2008)。CardinおよびWeintraubは、1989年に、21のヘパリン結合タンパク質を分析した後、ヘパリン結合ドメイン(HBD)を決定する最初の試みを行い、そして典型的なヘパリン結合部位が、配列XBBXBXまたはXBBBXXBX、式中、Bは陽性荷電アミノ酸(アルギニン、リジンおよび稀にヒスチジン)であり、そしてXはヒドロパシー(hydropathic)残基である、を有しうることを提唱した。次のコンセンサス配列TXXBXXTBXXXTBBは、いくつかのタンパク質のX線およびNMRを比較した後、Hilemanらによって1998年に導入された。この配列において、Tはターンを定義し、Bは塩基性アミノ酸(アルギニンまたはリジン)を定義し、そしてXはヒドロパシー残基を定義する。
造血細胞移植(HCT)は、血液学的悪性疾患を治療するために用いられる集中的療法であり、同種HCT法は年々増加しつつある(Ferraraら、2009)。HCTの主な合併症は、胃腸管、肝臓、皮膚、および肺に主に影響を及ぼす免疫学的障害であるGVHDである。Billingham、1966〜67によれば、GVHDが起こるには3つの必要条件が満たされる必要があり、すなわち、1)移植片が、Tリンパ球である免疫学的適格細胞を含有しなければならず、2)レシピエントが移植ドナーに存在しない組織抗原を発現しなければならず、そして3)患者が移植細胞を無効にするために有効な反応を開始させることが不可能でなければならない。GVHD病態生理は、骨髄破壊性条件付け措置を用いて、宿主防御骨髄を除去した際に始まる。宿主の抗原提示細胞は、損傷を受けた組織によって産生されるサイトカイン(TNFα、IL1、LPS)のために活性化される。この段階で同種HCTをひとたび行うと、ドナーT細胞が活性化され、それによってさらなるサイトカインが産生されて、細胞性および炎症性反応が導かれ、GVHDが生じる。非造血性幹細胞;MSCは、強力な免疫抑制作用のため、同種T細胞反応を減少させ、そしてGVHDを軽減させうる(Le Blancら、2008;Meulemanら、2009およびToubaiら、2009)。
細胞に基づく療法におけるhMSC使用の主な欠点は、すでに診療所で用いられてはいるが、十分な細胞数を達成することが困難であることである。骨髄単核細胞の0.01%〜0.0001%と同程度に低い可能性もあるほどhMSCが少数であるため、その広い使用が妨げられる。Caplan、2009は、骨髄を異なる年齢のドナーから得て、分散させ、培養フラスコに入れ、その後、CFU−Fを計数し、そして有核骨髄細胞あたりのMSCに対する年齢10年を示した。有核骨髄細胞あたりのMSCの顕著な減少が観察され、誕生から10代までに10倍減少し、そして10代からさらに年齢が上がるとさらに10倍の減少があった。明らかに、骨髄中のMSCの数は年齢とともに減少した。さらに、Caplanは、これらの減少が、若年層および成体で観察される骨折治癒率と平行して減少することを指摘した。これに比較して、骨髄中の造血幹細胞の力価は104有核骨髄細胞あたりほぼ1であり、個体の年齢を通じて一定のままであった。
研究者らは、hMSCを培養する際、骨髄微小環境を模倣することが可能であれば、臨床使用のための療法に適した数のhMSCを達成可能であると考えてきた。基本的に、模倣は、2つの広い方法によって達成可能であり、すなわち、hMSCをECMとともに増殖させること、および外因性増殖因子補充とともに増殖させることである。ECM基質を用いた場合、hMSC付着および累積細胞数の増加が観察された(Gruenertら、2007およびMatsubaraら、2004)が、拡大された細胞は幹細胞性を欠いていた(Coolら、2005)。さらに、FGF2は、一般的に、外因性増殖因子補充物として用いられ、これはまた、標準培地での対照と比較して、細胞数の顕著な増幅も示した(Lingら、2006およびSotiropoulouら、2006)。ECM基質とともに増殖させた細胞と一致して、FGF2とともに増殖させた細胞は、対照における多分化能hMSCと比較して、増加した量の分化した前駆細胞を有した(Gronthosら、1999およびWalshら、2000)。したがって、幹細胞性に不都合に影響を及ぼすことなく療法に適した数のhMSCを達成可能である、hMSCの増殖を促進する分子が同定されたことは、GVHDを軽減する、骨再生および骨髄移植のためのhMSCの臨床的使用において非常に有望であることが示された。
Nurcombeらは、1993年、HS GAGによって制御される、ネズミ神経前駆細胞に対するFGFの活性、およびこの相互作用が、FGF2のその受容体への結合の必要条件であることを示した。さらに、FGFへのHSGAGの結合には有意な相違があり、第9日、これらの細胞によって産生されるHS GAGは、FGF2に優先的に結合し、そして第11日までには、HSGAG結合はFGF1にシフトした。さらに、これらのユニークなヘパラン硫酸は、神経前駆細胞上の細胞表面受容体との相互作用を通じて、特異的受容体へのFGF2の結合を仲介する(Brickmanら、1995)。1988年、Brickmanらは、不死化胚性第10日マウス神経上皮2.3D細胞からの2つの別個のHSプールの単離および特徴付けによって、これらの知見をさらに補助した。1つのプールは、対数増殖期の細胞に由来し、これはFGF−2の活性を増加させ、そしてもう一方のプールは接触阻害および分化を経ている細胞に由来し、FGF1に対する優先性を有した。本発明者らの研究室によって以前記載されたように、HS2と称される胚性HS GAG調製物は、多分化能の有意な喪失を伴わずにhMSC増殖を増加させ、そしてin vivoで移植された際、マウスにおいて骨形成増加を導く。この証拠によって、ECM構成要素HS GAGは、多分化能に不都合に影響を及ぼすことなく、hMSCの増殖を改善させることが示唆される。したがって、FGF2への高い結合アフィニティを有し、HS2に比較して、臨床設定で使用されるように容易にスケールアップ可能である、細胞増殖に対するその活性を増強させる、HS変異体に対する特別な必要性がある。
カラムクロマトグラフィによる、FGF−2に対してより高い結合アフィニティを持つヘパラン硫酸(HS8)の単離
FGF2結合性HS2を精製する戦略と一致して、本発明者らは、診療所で容易に使用可能なHS調製物をスケールアップするため、商業的に入手可能なブタCelsusヘパラン硫酸供給源(Celsus Laboratories、米国)から別のFGF2結合性HSを精製する可能性を探る。表1に提示するこれらのペプチド配列のうち、FGF2−Gandhi−HBDと名付けられた、157GHFKDPKRLYCKNGGF172(Gandhiら、2008)を用いた。
ペプチド合成に際して、これらを3Hヘパリンアッセイに供し、ヘパリンに対するFGF2−HBDペプチドの結合能を試験した。既知の量のペプチドまたは飽和量のペプチドを同一のニトロセルロース膜上で乾燥させ、これをまず風乾し、そして次いで、真空オーブン中、80℃で45分間さらに乾燥させた。次いで、膜を1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄し、そしてカウントバイアル中、4%(w/v)ウシ血清アルブミン(BSA)/PBS中、0.1μCiの[3H]ヘパリン(Perkin Elmer、米国ボストン)と、16時間インキュベーションした。その後、膜を洗浄し、そしてPerkin Elmer Tri−Carb 2800 TCR液体シンチレーション分析装置によって、放射活性を決定した。
GAG結合アフィニティアッセイ
HS8を、96ウェルGAG結合プレート(Iduron、英国)を用い、FGF2および他のタンパク質(R&D Systems)への結合におけるアフィニティアッセイに供し、ここで、HS8+のFGF2への特異的結合を、ヘパリン(Sigma)、ブタCelsus HS(Celsus Laboratories、米国)およびHS8陰性分画に比較して測定した。GAGをGAG結合プレート(2.5〜10μg/ml)に一晩プレーティングし、そして標準アッセイ緩衝液(SAB)中、0.2%魚類ゼラチン(Sigma)で37℃で1時間ブロッキングした。
21歳のヒスパニック系男性ドナー由来のhMSCの2つの変種をこのアッセイに用い、これらは、磁気活性化細胞ソーティングによって単離されたSTRO1陽性細胞(第5〜7継代)および慣用的プラスチック接着によって単離されたHM21細胞(第5継代)であった。細胞を3000細胞/cm2植え付け密度で植え付け、そして24時間プレートに付着させた。次いで、50〜10000ng/mlの範囲の単独の培地補充物として用いた異なる濃度のHS8+、および陽性対照としての2.5ng/mlのヒト組換えFGF2(R&D Systems)を培地に添加した。培地交換を2または3日のいずれかで行った。STRO1細胞において、培地交換を2日ごとに行った、増加する濃度のHS8+は、生存細胞数を増加させ、そして第6日までに、対照に比較して、5000ng/mlが最高のカウントを生じた(図12)。対照的に、培地交換を3日ごとに行ったHM21細胞は、第6日までに、10000ng/mlで、対照に比較して,わずかにより高いカウントを示した(図13)。
本発明者らは、配列157GHFKDPKRLYCKNGGF172を用いて、ブタCelsus HSから、アフィニティクロマトグラフィによって、FGF2に対してより高いアフィニティ結合性であるHS(HS8)を調製した。
FGF2に特異的なHS(HS8)の単離
本発明者らは、FGF2に対してより高い結合アフィニティを有するHSであるHS8の単離を成功裡に達成したが、[3H]ヘパリンアッセイ、GAG結合アッセイ、およびLeeら、2007にしたがった細胞付着アッセイによって、他のFGF2 HBDペプチド配列(表1)をさらに試験するであろう。
HS8の結合アフィニティがGAG結合プレートによってすでに確認されており、そしてドットブロットアッセイおよびBIAcore T100を用いた動力学結合(Cainら、2005)によって、さらに検証されるであろう。
ELISA法由来の結果は、ウェスタンブロット法によってさらに確認されるであろう。
増殖アッセイの結果は、より多くのhMSC株を用いることによって、そしてまたより低い継代の細胞を用いることによって、さらに検証されるであろう。さらに、短期増殖アッセイは、BRDU(Roche)およびWST−1(Roche)試薬を用いることによって、実行されるであろう。
HS8の二糖分析は、Muraliら、2009にしたがった陰イオン交換クロマトグラフィを用いて行われるであろうし、そしてHS8の組成が明らかになりうる。
安定性アッセイは、SYPROアッセイおよびFGF2 quantikineアッセイとして行われるであろう。SYPROアッセイにおいて、FGF2タンパク質とGAGの相互作用は、特異的Syproオレンジ色素(Uniewiczら、2010)によって、タンパク質の変性温度として測定されるであろう。細胞培養におけるFGF2濃度を測定するため、FGF2 quantikineアッセイを製造者の推奨(R&D Systems Quantikine(登録商標)ELISAカタログ番号DFB50)にしたがって行うであろう。結果を図46に示す。
多分化能は、プラスチック接着、骨形成、脂肪形成および軟骨形成組織への分化、ならびに表面マーカーのFACSに関してチェックされるであろう(Dominiciら、2006)。CFU−Fアッセイは、骨髄吸引物、およびHS8を含みまたは含まずに拡大したhMSCで行われるであろう(Cawthon、2002およびGuillotら、2007)。hMSCの免疫調節活性を混合Tリンパ球アッセイによって評価するであろう。
単離しそしてHS8の存在下で増殖させた細胞を、マウス骨再生モデル(Zannettinoら、2010)において用い、そしてまた、GVHDの異種移植ヒトNOD−SCIDマウスモデル(Tiastoら、2007およびToubaiら、2009)において用いるであろう。
GAG結合プレート(Iduron)を用いて、FGF2に対する異なるGAGの結合能を評価した。ヘパリン結合性増殖因子(HBGF)BMP−2、FGF1、FGF2、FGF7、PDGF−BBおよびVEGFに関する異なるGAGの結合能もまた、GAG結合プレート(Iduron)を用いて評価した。用いた材料および方法論を以下に記載する。
1. 標準的アッセイ緩衝液(SAB)−100mM NaCl、50mM酢酸ナトリウム、0.2%v/v Tween20、pH7.2
2. ブロッキング緩衝液−0.4%魚類ゼラチン(Sigmaカタログ番号67041)+SAB
3. GAG結合プレート(Iduron、英国)
4. R&D Systems由来のタンパク質:BMP2−カタログ番号355BM、FGF1−カタログ番号231BC、FGF2−233FB、FGF7−カタログ番号251KG、PDGF BB−カタログ番号220BB、VEGF−カタログ番号293VE
5. R&D Systems由来の抗体:BMP2−カタログ番号BAM3552、FGF1−カタログ番号BAF232、FGF2−BAM233、FGF7−カタログ番号BAF251、PDGF BB−カタログ番号BAF220、VEGF−カタログ番号BAF293
6. ExtraAvidin−AP(Sigmaカタログ番号E2636)
7. Sigma FAST p−ニトロフェニルリン酸(Sigma、N2770)
方法
1. SABにGAGを溶解する(5μg/ml)
2. 200μlのGAG溶液/ウェルをGAG結合プレートに添加し、そして光から保護しながら、RTで一晩インキュベーションする
3. プレートを3x、250μl/ウェルのSABで注意深く洗浄する
4. 250μl/ウェルのブロッキング緩衝液とプレートを、光から保護しながら、37℃で1時間インキュベーションする
5. プレートを3x、250μl/ウェルのSABで注意深く洗浄する
6. タンパク質をブロッキング緩衝液に溶解し、そして連続希釈:0、0.781、1.56、3.125nMを行う
7. 200μl/ウェルの希釈タンパク質を、GAGコーティングプレートに分配し、そして37℃で2時間インキュベーションする
8. プレートを3x、250μl/ウェルのSABで注意深く洗浄する
9. 200μl/ウェルの250ng/mlのブロッキング溶液中のビオチン化一次抗体を添加し、そして37℃で1時間インキュベーションする
10. プレートを3x、250μl/ウェルのSABで注意深く洗浄する
11. 200μl/ウェルの220ng/mlのブロッキング溶液中のExtraAvidin−APを添加し、そして37℃で30分間インキュベーションする
12. プレートを3x、250μl/ウェルのSABで注意深く洗浄する
13. 200μl/ウェルの現像試薬:DI水中のSigma FAST p−ニトロフェニルリン酸を添加し、そしてRTで40分間インキュベーションする
14. 405nmで吸光度を読み取る
実施例4
BrdU取り込み増殖アッセイを行い、hMSC増殖に対するHS8の効果を確立した(プロトコルを以下に記載する)。
1. 細胞植え付け−190μlの培地/ウェル中、5000細胞(96ウェルプレート)
2. 培地−1000mg/L+10%ウシ胎児血清(FCS)+1% 2mM L−グルタミン+1%ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むDMEM
3. 37℃および5%CO2で6時間インキュベーションする
4. 6時間インキュベーションした後、レイアウトにおけるように指定したウェルに関して10μlの培地中、異なる用量の処理を加える
5. FGF2(ng/ml)およびGAG(μg/ml)−10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125
6. 処理を伴い、37℃および5%CO2で36時間インキュベーションする
7. BrdUを各ウェルに添加する
8. 細胞をBrdUで2時間、37℃および5%CO2で標識する(20μlのBrdU標識溶液/ウェルを添加する)
9. プレートを軽く叩くことによって、標識培地を除去する
10. 200μl/ウェルのFixDenatを細胞に添加し、そして15〜25℃で30分間インキュベーションする
11. 軽く振りそして叩くことによって、FixDenat溶液を完全に除去する
12. 100μl/ウェルの抗BrdU−POD作業溶液を添加し、そして15〜25℃で90分間インキュベーションする
13. 振り落とすことによって抗体コンジュゲートを除去し、そして250μl/ウェルの洗浄溶液(1xPBS)でウェルを3回リンスする
14. 軽く叩くことによって、洗浄溶液を除去する
15. 100μl/ウェルの基質溶液を添加し、そして15〜25℃で30分間インキュベーションする。
実施例5
FACSに基づく細胞増殖アッセイを行って、hMSC増殖に対するHS8の影響を確立した(プロトコルを以下に記載する)。
材料
1. HM20 hMSC−男性ヒスパニック系20歳のドナー(Lonzaより購入)
2. FGF2(R&D Systems カタログ番号233−FB−025)
3. 維持培地:DMEM(10mg/lグルコース)、10%FCS、1%Pen/Strp、2mM L−グルタミン
4. HS8(+)、バッチ2、HS8(−)バッチ2、ブタ粘膜ヘパラン硫酸(Celsus Laboratories、米国)、ヘパリン(Sigmaカタログ番号H3149)
5. Guava Flex試薬(Millipore)
方法
1. HM20細胞を24ウェルプレート上、500μl/ウェルの培地中、3000細胞/cm2でプレーティングする(第0日)
2. 第1日−500μlの新鮮な培地中、増加する濃度のFGF2(ng/ml)およびGAG(μg/ml)で培地交換する−10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.156。
4. 指定した時点で細胞を採取する(第2日、第4日および第6日)−100μlのトリプシンを用い、そして100μlの培地(t=第2日)または300μlの培地(第4日および第6日)で中和する
5. 細胞をGuava装置中でカウントした(Guava flex試薬:細胞懸濁物は1:200である)
実施例6−ヒト間葉系幹細胞単離
ヒト骨髄(BM)単核細胞の調製
ヒト骨髄(BM)の収集および密度勾配分離によるBM単核細胞の調製
1. インフォームドコンセントの後、およそ40mLのヒト骨髄(BM)を、健康な若い志願者(18〜40歳)から、後部腸骨稜(寛骨)からの吸引によって収集する。BMを直ちに保存剤不含、ナトリウム、ヘパリン含有50mL試験管に入れる。
3. 次いで、等体積のブロッキング緩衝液をBM吸引物に添加し、よく混合し、次いで、70μmのFalcon細胞濾過器を通じて濾過して、いかなる小さい塊および骨断片も取り除く。
6. 使い捨てプラスチックパスツールピペットを用いて、白血球バンドをすべての試験管から回収し、そして4x14mLポリプロピレン試験管内にプールする。
8. 緩衝液を吸引し、そして細胞を1つの試験管にプールする。
1. BMNC分画を、維持培地(DMEM、1g/lグルコース、10%FCS、2mM L−グルタミン、50U/mlペニシリンおよび50U/mlストレプトマイシン)中、15cmプレートに植え付け、そして最初の培地交換前に、細胞を3日間接着させる。
MACSの使用は、BMSSC集団の部分的精製、および全体の幹細胞収量の損失となる高い喪失を伴わない多数のBMMNCのプロセシングを可能にする。密度勾配遠心分離後、およそ1〜2x108単核細胞をBM吸引物40mLから回収する。免疫標識前に、BMMNCを0.5mLブロッキング緩衝液中に再懸濁し、そして氷上でおよそ30分間インキュベーションして、抗体のFc受容体仲介性結合の可能性を減少させる。
1. 400g、4℃で10分間遠心分離することによって、BMMNCをペレットにし、そして5x107 BMMNCあたり500μlのSTRO−1上清中に再懸濁し、そして時々穏やかに混合しながら、氷上で60分間インキュベーションする。
6. カラムを磁場から回収した後、カラムをMACS緩衝液でフラッシュすることによって、STRO−1+細胞(陽性分画)を新鮮な2mLポリプロピレン試験管内に回収する。次いで、STRO−1+細胞をカウントし、そして二色FACSのためにプロセシングする。
9. この時点で、部分的に精製されたSTRO−1+BMSSCを培養拡大してもよいし、またはさらに二色FACSによって精製してもよい。
ヒト骨髄吸引物におけるCFU−Fコロニーの予期される発生率は、プレーティングした105細胞あたり、およそ5〜10 CFU−Fである。
3. 次いで、固定した培養を0.1%(w/v)トルイジンブルー(1%パラホルムアルデヒド溶液中)で1時間染色し、次いで、水道水でリンスし、そして乾燥させる。50細胞より大きい凝集物をCFU−Fとしてスコア付けする。
すべての測定可能なCFU−Fが、STRO−1+BMMNC分画に含有される一方、BMSSCは、総STRO−1+集団の2%未満にしか相当しない。大部分のSTRO−1+細胞は、グリコホリン−A+有核赤血球およびある程度のCD19+ B細胞である。したがって、STRO−1発現のみに基づくBMSSCの選択は、CFU−Fの部分的な濃縮しか生じない(およそ10倍)。クローン原性BMSSCは、すべて、STRO−1明細胞分画に含有され、これはさらに、有核赤血球およびリンパ球上には存在しないマーカー、特にCD106およびCD146の発現に基づいて、二色FACSによって区別されうる。以下に記載する方法は、総STRO−1+細胞分画、STRO−1明/CD106+ BMMSC(1.4%±0.3;n=20)の少数の下位集団の単離を可能にし、ここで、プレーティングされた2〜3細胞のうち1つが、CFU−Fを形成する能力を有する。この濃縮レベルは、未分画BMMNC(プレーティングされた10,000細胞あたり1 CFU−F)で観察されるCFU−Fの平均発生率よりほぼ5,000倍高い。
1. 免疫標識前に、MACS単離STRO−1+細胞BMMNC(1x108 BMMNCから、ルーチンに2〜5x106細胞)を、2色免疫蛍光およびFACS用の調製において、0.5mL HHFに再懸濁する。
(i)一次抗体なし(二重陰性対照)、氷上に維持
(ii)ストレプトアビジン−FITCコンジュゲート(HFF中、1/100希釈)、氷上で30分間インキュベーション(FITC対照)。次いで、細胞をHHFで2回洗浄する。
血清豊富培地
1. STRO−1明/CD106+単離BMSSC集団(cm2あたり、1〜3x104)を、20%ウシ胎児血清、100μM l−アスコルビン酸−2−リン酸、2mM l−グルタミン、50U/mLペニシリンおよび50μg/mLストレプトマイシンを補充したイーグル培地のα修飾(α−MEM)を含有する組織培養フラスコまたはプレート中、4%CO2中、>90%の相対湿度で、37℃で2週間培養する。培養が80〜90%の集密を達成したら、初代BMSSC集団を継代する。
4. BMMSC単細胞懸濁物をプールし、そして10%FBS、100μM l−アスコルビン酸−2−リン酸、2mM l−グルタミン、50U/mLペニシリンおよび50μg/mLストレプトマイシンを補充したα−MEM増殖培地中、cm2あたり0.5〜1.0x104で再度植え付け、そして5%CO2中、>90%の相対湿度で、37℃でインキュベーションする。培地を吸引し、そして新鮮に調製し、37℃に温めた等量の培地と交換することによって、培養に2回給餌する。
この方法は、造血前駆細胞の増殖のために最初に開発された血清枯渇培地(SDM)の修飾である。
ex vivo拡大MSCの凍結保存
1. ルーチンに、上述のようなトリプシン/EDTA消化によって、培養拡大されたMPCの単細胞懸濁物を調製する。次いで、細胞を希釈し、そして冷HFF中で洗浄する。
以下に記載する方法論を用いて、hMSCのCFU−F特性を評価した。4継代に渡って、非補充対照培地の1つにおいてhMSCを増殖させ、そして次いで、非補充対照培地、あるいはヘパリン(1.25μg/ml)、Celsus HS(1.25μg/ml)、HS8−(1.25μg/ml)、HS8(HS8+)(1.25μg/ml)またはHS8(HS8+)(2.5μg/ml)の1つを加えた対照培地の1つにおいて増殖させた。
1. hMSC−(Lonzaより購入)
2. 維持培地:DMEM(1000mg/Lグルコース)、10%FCS、1%Pen/Strep、2mM L−グルタミン。
方法
1. MSCを、100x15mmペトリ皿中、150細胞/cm2で、10ml/プレート維持培地を用い、3つ組でプレーティングする。
3. 第14日、プレートを以下のようにクリスタルバイオレット(100%メタノール中、0.5%)で染色した。
b. 10ml/プレートのクリスタルバイオレットを添加し、そして30分間インキュベーションする。
d. 他のコロニーと接触していない、50より多い細胞を含むコロニーを計数した。
MSCが骨(骨形成)および脂肪(脂肪形成)に分化する能力に関して、以下に記載する方法論にしたがってアッセイすることによって、MSCの多分化能特性の維持を試験した。結果を図25に示す。
第4継代細胞(P4)−正常維持培地中で培養したhMSC
第7継代細胞(P7)−以下の処理の1つを含有する正常維持培地中のP4〜P7まで培養したhMSC
・HS8(HS8(+)) 2.5μg/mL
・HS8(−) 1.25μg/mL
・Celsus HS 1.25μg/ml
・ヘパリン 1.25μg/ml
・FGF2 1.25μg/ml
骨形成分化
材料
1. hMSC−(Lonzaより購入)
2. 維持培地:DMEM(1000mg/Lグルコース)、10%FCS、1%Pen/Strep、2mM L−グルタミン
3. 処理維持培地:DMEM(1000mg/Lグルコース)、10%FCS、1%Pen/Strep、2mM L−グルタミン、10nMデキサメタゾン、10mM β−グリセロール−リン酸および25μg/mL L−アスコルビン酸−2−リン酸
4. PBS中のパラホルムアルデヒド4%
5. アリザリンレッド溶液:100mL H2O中、1.37g;pH4.1〜4.3
方法
1. 細胞を6ウェルプレート中に24時間植え付けた(3,000細胞/cm2)
2. 対照ウェルの培地を維持培地に交換した
3. 処理ウェルの培地を、10nMデキサメタゾン、10mM β−グリセロール−リン酸および25μg/mL L−アスコルビン酸−2−リン酸を含有する維持培地に交換した
4. 次いで、すべての細胞を3日ごとに培地交換しながら28日間培養した。
a. PBSで3回洗浄する
b. 4%パラホルムアルデヒドで10分間細胞を固定する
c. ddH2Oで3回洗浄する
d. アリザリンレッド溶液を細胞に添加し、そしてゆっくりと振盪しながら30分間インキュベーションする
e. ddH2Oで3回洗浄する
f. 染色した細胞を風乾する
脂肪形成分化
材料
1. hMSC−(Lonzaより購入)
2. 脂肪細胞維持培地:DMEM(4500mg/Lグルコース)、10%FCS、1%Pen/Strep、2mM L−グルタミン
3. 脂肪細胞処理培地:DMEM(4500mg/Lグルコース)、10%FCS、1%Pen/Strep、2mM L−グルタミン、1μMデキサメタゾン、10μMインスリン、20μMインドメタジンおよび115μg/mL 3−イソブチル−1−メチルキサンチン
4. PBS中のパラホルムアルデヒド4%
5. オイルレッドO溶液:60%イソプロパノール中、0.36%
方法
1. 細胞を3つ組で、6ウェルプレート中に植え付けた(18,000細胞/cm2)
2. 細胞を集密まで培養した
3. 対照ウェルの培地を、脂肪細胞維持培地に交換した(4500mg/mLグルコース)
4. 処理ウェルの培地を、1μMデキサメタゾン、10μMインスリン、20μMインドメタジンおよび115μg/mL 3−イソブチル−1−メチルキサンチンを含有する脂肪細胞処理培地に交換した
5. 続いて、3日ごとに培地交換しながら28日間培養した。
a. PBSで3回洗浄する
b. 4%パラホルムアルデヒドで60分間細胞を固定する
c. ddH2Oで1回洗浄する
d. オイルレッドO溶液を細胞に添加し、そしてゆっくりと振盪しながら1時間インキュベーションする
e. 60%イソプロパノールで2回洗浄する
f. ddH2Oで3〜5回洗浄する
g. プレート上のddH2Oを残すか、または染色した細胞を風乾する
実施例9
以下に記載する方法論を用いて、FGF−2が仲介するhMSC増殖に対するHS8の影響を調べた。HS8は、FGF−2が仲介するMSC増殖を増進させることが見出された(図26)。
第4継代細胞−以下の処理の1つを伴い、そして伴わずに、正常維持培地中で培養したhMSC:
・FGF2 0.156ng/mLのみ
・FGF2 0.156ng/mLと、多様な用量のHS8(+)
細胞増殖プロトコル
材料
1. hMSC−(Lonzaより購入)
2. FGF2(R&D Systems、カタログ番号233−FB−025)。
4. HS8(HS8(+)),HS8(−)、ブタ粘膜ヘパラン硫酸(Celsus Laboratories、米国)、ヘパリン(Sigmaカタログ番号H3149)。
方法
1. 細胞を24ウェルプレート上、500μl/ウェル培地中で3000細胞/cm2でプレーティングする(第0日)。
3. 培地を2日ごとに交換する
4. 第4日に100μlのトリプシンで細胞を採取し、そして300μlの培地で中和する
5. GUAVA装置中で細胞をカウントする(Guava flex試薬:細胞懸濁物は1:200である)。
以下に記載する方法論を用いて、ERK経路を通じたFGF−2シグナル伝達に対するHS8の影響を調べた。HS8は、ERK1/2およびFRS2aのリン酸化によって測定されるように、ERK経路のFGF2が仲介するシグナル伝達を増進させる/維持することが見出された(図27)。
P4−以下の処理を伴い、そして伴わずに、正常維持培地中でhMSCを培養した:
・FGF2 0.312ng/mLのみ
・HS8(HS8(+)) 2.5μg/mL
ウェスタンブロット
材料
1. hMSC−(Lonzaより購入)
2. FGF2(R&D Systems、カタログ番号233−FB−025)。
4. 血清不含培地:DMEM(1000mg/Lグルコース)、0.2%FCS、1%Pen/Strep、2mM L−グルタミン
5. ホスホ−FRS2aに対する抗体(Cell Signaling カタログ番号3861) TBST中の5%BSA中、1:1000
6. ホスホ−ERK1/2に対する抗体(Cell Signaling カタログ番号9106L) TBST中の5%BSA中、1:2000
7. 総ERK1/2に対する抗体(Cell Signaling カタログ番号9102L) TBST中の5%BSA中、1:1000
8. アクチンに対する抗体(Millipore Chemicon カタログ番号MAB1501R) TBST中の5%BSA中、1:8000
方法
1. 細胞を6ウェルプレート上、維持培地中で10,000細胞/cm2でプレーティングする
2. 第1日:培地を、2mL/ウェルの血清不含培地に交換する
3. 第3日:ウェルに処理を添加する。必要な量のHS8(+)および/またはFGF2を血清不含培地に投薬し、そして10μL/ウェルで添加する
4. 異なる時点(30分および24時間)で、1.5X laemmli緩衝液で100μL/ウェルで細胞を採取する
5. 溶解物を95℃で5分間加熱し、そして−20℃で保存する
6. 試料を1回のみ凍結融解する
7. 20μL/ウェルの試料を、Novex 4〜12%Bis−Tris SDS PAGEゲル、10ウェル(Invitrogen、カタログ番号NP0335BOX)の各レーンに装填する
8. 1X MOPS緩衝液で、180Vで50分間ゲルを泳動した
9. 次いで、分離されたタンパク質バンドを、1xトランスファー緩衝液中、100Vで1時間30分間、ニトロセルロース膜にトランスファーした。
11. TBST中の5%BSAまたは5%脱脂乳のいずれかで、室温で30分間〜1時間、ゆっくりと振盪しながら膜をブロッキングした
12. 次いで、推奨される希釈の一次抗体を、ゆっくりと振盪しながら、4℃で一晩インキュベーションした
13. 次いで、ブロットをTBSTで各5分間、3回洗浄した
14. 次いで、推奨される希釈の二次抗体を、ゆっくりと振盪しながら、室温で1時間〜2時間インキュベーションした
15. ブロットをTBSTで各5分間、3回洗浄した
16. 化学発光試薬とブロットをインキュベーションし、そして暗室でバンド視覚化のため、X線フィルムの現像を進めた。
HS8の試料を分析前に−20℃で保存した。化学シフト比較および定量化に用いる内部標準tBuOH(200μL、δ1.24ppm)を含有するD2O(600μL)に溶解することによって、NMR分析を完了した。Celsus HSを、〜1、4および7mg量に正確に重量測定し、作業D2O/tBuOH溶液中で調製し、そしてHS8と同じ実行で分析した。標準溶液の線適合(line fitting)は、内部標準に比較して、アセチルメチル領域、領域δ3.15〜3.25ppmおよびアノマー領域δ5.15〜5.65ppmの最低フィールド部分の統合(integration)のため、0.995またはそれより優れた回帰を生じた。
HS8 1H NMRのメチンおよびメチレン領域のより緊密な検査によって、Celsus HSおよびHS3に比較して、相違が示された(図32)。
実施例12−HS8および他のHS調製物のHPLC−SEC−RI
ヘパラン硫酸調製物(およそ1mg、正確に重量測定)を、水中、2mg/mLで調製した。これらの調製物のヘパリンリアーゼI、IIおよびIII消化は、水中の2mg/mLであった。溶液を遠心分離し(14000g、2分間)、そして200μLアリコットを分析のために採取した。
以下に記載するプロトコルを用いて、FGF2のアミノ酸配列由来の配列番号1のヘパリン結合能を評価した。結果を図37に示す。
(1)ペプチド:
Gandhiら(HS8)−Nanyang Technology Universityによって製造
GHFKDPKRLYCKNGGF−Ahx−(K)ビオチン
(2)3Hヘパリン0.1μCi(Perkin Elmer、米国ボストン)
(3)ニトロセルロース膜(Bio−Rad、米国)
(4)ウシ血清アルブミン4%(w/v)、PBS中
(5)真空オーブン(Thermo Fisher Scientific、米国)
(6)Tri−Carb 2800 TCR液体シンチレーション分析装置(Perkin Elmer、米国ボストン)
方法
(1)PBSでFGF2−HBD−ペプチドを望ましい濃度(4.66x10−9、9.32x10−9、1.86x10−8、3.73x10−8モル)に調製する
(2)既知の濃度のペプチドに、二連の同一のニトロセルロース膜を浸す
(3)膜を1時間風乾する
(4)真空オーブン中、80℃で45分間、さらに乾燥させる
(5)膜をPBSで3回洗浄する
(6)3Hヘパリン0.1μCiを膜に添加し、そしてシンチレーション計測バイアル中で16時間インキュベーションする
(7)膜をPBSで4回洗浄する
(8)Tri−Carb 2800 TCR液体シンチレーション分析装置(Perkin Elmer、米国ボストン)で放射活性を決定する
実施例14
以下に記載するプロトコルを用いて、ヘパリン結合ドメインペプチド配列番号1が、固定されたヘパリンに結合する能力を評価した。結果を図38に示す。
1. 標準アッセイ緩衝液(SAB)−100mM NaCl、50mM酢酸ナトリウム、0.2%v/v Tween 20、pH7.2
2. ブロッキング緩衝液−0.4%魚類ゼラチン(Sigmaカタログ番号67041)+SAB
3. GAG結合プレート(Iduron、英国)
4. ペプチド:
Gandhiら(HS8)−Nanyang Technology Universityによって製造
GHFKDPKRLYCKNGGF−Ahx−(K)ビオチン
5. ExtraAvidin−AP(Sigmaカタログ番号E2636)
6. Sigma FAST p−ニトロフェニルリン酸(Sigma、N2770)
方法
1. SABにヘパリンを溶解する(5μg/ml)
2. 200μlのヘパリン溶液/ウェルをGAG結合プレートに添加し、そして光から保護しながら、RTで一晩インキュベーションする
3. プレートを3x、250μl/ウェルのSABで注意深く洗浄する
4. 250μl/ウェルのブロッキング緩衝液とプレートを、光から保護しながら、37℃で1時間インキュベーションする
5. プレートを3x、250μl/ウェルのSABで注意深く洗浄する
6. ペプチドをブロッキング緩衝液に溶解し、そして連続希釈:0、50、100、200nMを行う
7. 200μl/ウェルの希釈タンパク質を、GAGコーティングプレートに分配し、そして37℃で2時間インキュベーションする
8. プレートを3x、250μl/ウェルのSABで注意深く洗浄する
9. 200μl/ウェルの220ng/mlのブロッキング溶液中のExtraAvidin−APを添加し、そして37℃で30分間インキュベーションする
10. プレートを3x、250μl/ウェルのSABで注意深く洗浄する
11. 200μl/ウェルの現像試薬:DI水中のSigma FAST p−ニトロフェニルリン酸を添加し、そしてRTで40分間インキュベーションする
12. 405nmで吸光度を読み取る
実施例15
HS8に結合する能力に関して、FGF−2を評価した。これを、未精製出発HS(HS−PMブタ粘膜)または糖不含との結合に比較した。結果を図39に示す。
1. 標準アッセイ緩衝液(SAB)−100mM NaCl、50mM酢酸ナトリウム、0.2%v/v Tween20、pH7.2
2. ブロッキング緩衝液−0.4%魚類ゼラチン(Sigmaカタログ番号67041)+SAB
3. GAG結合プレート(Iduron、英国)
4. R&D Systems由来のタンパク質:FGF2−233FB
5. R&D Systems由来の抗体:FGF2−BAM233
6. ExtraAvidin−AP(Sigmaカタログ番号E2636)
7. Sigma FAST p−ニトロフェニルリン酸(Sigma、N2770)
方法
1. SABにGAGを溶解する(5μg/ml)
2. 200μlのGAG溶液/ウェルをGAG結合プレートに添加し、そして光から保護しながら、RTで一晩インキュベーションする
3. プレートを3x、250μl/ウェルのSABで注意深く洗浄する
4. 250μl/ウェルのブロッキング緩衝液とプレートを、光から保護しながら、37℃で1時間インキュベーションする
5. プレートを3x、250μl/ウェルのSABで注意深く洗浄する
6. タンパク質をブロッキング緩衝液に溶解し、そして連続希釈:0、0.781、1.56、3.125nMを行う
7. 200μl/ウェルの希釈タンパク質を、GAGコーティングプレートに分配し、そして37℃で2時間インキュベーションする
8. プレートを3x、250μl/ウェルのSABで注意深く洗浄する
9. 200μl/ウェルの250ng/mlのブロッキング溶液中のビオチン化一次抗体を添加し、そして37℃で1時間インキュベーションする
10. プレートを3x、250μl/ウェルのSABで注意深く洗浄する
11. 200μl/ウェルの220ng/mlのブロッキング溶液中のExtraAvidin−APを添加し、そして37℃で30分間インキュベーションする
12. プレートを3x、250μl/ウェルのSABで注意深く洗浄する
13. 200μl/ウェルの現像試薬:DI水中のSigma FAST p−ニトロフェニルリン酸を添加し、そしてRTで40分間インキュベーションする
14. 405nmで吸光度を読み取る
実施例16
HS8の存在下で、6日間に渡って、プラスチック接着性間葉系幹細胞の増殖を分析した。結果を図40に示す。
材料
1. HM20 hMSC−男性ヒスパニック系20歳のドナー(Lonzaより購入)
2. FGF2(R&D Systems カタログ番号233−FB−025)
3. 維持培地:DMEM(1000mg/lグルコース)、10%FCS、1%Pen/Strp、2mM L−グルタミン
4. HS8
5. Guava Flex試薬(Millipore)
方法
1. HM20細胞を、24ウェルプレート上、500μl/ウェルの培地中、3000細胞/cm2でプレーティングする(第0日)
2. 第1日−GAG(μg/ml)−2.5および0.5で培地交換する
3. 培地を2日ごとに交換する
4. 指定した時点で細胞を採取する(第6日)−100μlのトリプシンを用い、そして300μlの培地で中和する
5. 細胞をGuava装置中でカウントした(Guava flex試薬:細胞懸濁物は1:200である)
実施例17
未精製Celsus出発HS(HS−PM)、または非結合HSフロースルー(HS8−)に比較した際の、単離HS8の存在下で36時間に渡るSTRO−1単離間葉系幹細胞の増殖を、以下に記載するように、BrDU取り込みによって測定した。結果を図41に示す(図中、HS8G=HS8)
プロトコル(細胞増殖ELISA、BrdU(比色)、Roche)
1. 細胞植え付け−190μlの培地/ウェル中、5000細胞(96ウェルプレート)
2. 培地−アルファMEM+10%ウシ胎児血清(FCS)+1% 2mM L−グルタミン+1%ペニシリンおよびストレプトマイシン+100nM L−グルタミン酸
3. 37℃および5%CO2で6時間インキュベーションする
4. 6時間インキュベーションした後、レイアウトにおけるように指定したウェルに関して10μlの培地中、異なる用量の処理を加える
5. GAG(μg/ml)−10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125
6. 処理を伴い、37℃および5%CO2で36時間インキュベーションする
7. BrdUを各ウェルに添加する
8. 細胞をBrdUで2時間、37℃および5%CO2で標識する(20μlのBrdU標識溶液/ウェルを添加する)
9. プレートを軽く叩くことによって、標識培地を除去する
10. 200μl/ウェルのFixDenatを細胞に添加し、そして15〜25℃で30分間インキュベーションする
11. 軽く振りそして叩くことによって、FixDenat溶液を完全に除去する
12. 100μl/ウェルの抗BrdU−POD作業溶液を添加し、そして15〜25℃で90分間インキュベーションする
13. 振り落とすことによって抗体コンジュゲートを除去し、そして250μl/ウェルの洗浄溶液(1xPBS)でウェルを3回リンスする
14. 軽く叩くことによって、洗浄溶液を除去する
15. 100μl/ウェルの基質溶液を添加し、そして15〜25℃で30分間インキュベーションする。
実施例18−二糖のキャピラリー電気泳動(CE)分析
ヘパラン硫酸(HS)は、Celsus Laboratories Inc由来であった(HO−03103、ロット#HO−10697)。細菌ヘパリナーゼにより、高品質ブタヘパリンを消化して得られる二糖標準(ΔUA,2S−GlcNS,6S; ΔUA,2S−GlcNS、ΔUA,2S−GlcNAc,6S、ΔUA−GlcNS,6S、ΔUA−GlcNS、UA−GlcNAc、ΔUA,2S−GlcNAc、ΔUA−GlcNAc,6S、ΔUA,2S−GlcN、ΔUA,2S−GlcN,6S、ΔUA−GlcN,6S、ΔUA−GlcN カタログ番号HD001〜HD013、Iduron Ltd、英国マンチェスター)を、Iduron Ltd、英国マンチェスターより購入した。非天然存在二硫酸化二糖の合成誘導体(ΔUA,2S−GlcNCOEt,6S)もまた、内部標準として使用するために、Iduronから購入した。ヘパリンオリゴ糖(dp4、dp6、dp8、dp10、dp12(カタログ番号HO04、HO06、HO08、HO10、HO12))および選択的脱硫酸化ヘパリン標準(2−O、6−OおよびN−脱硫酸化ヘパリン)(カタログ番号DSH001/2、DSH002/6、DSH003/N、Iduron Ltd、英国マンチェスター)もまた、Iduron Ltd、英国マンチェスターより購入した。
HS調製物(1mg)を各々、500μLの酢酸ナトリウム緩衝液(10mM酢酸カルシウムを含有する100mM、pH7.0)に溶解し、そして3つの酵素各2.5mUを添加した。試験管を穏やかに反転しながら(9rpm)、試料を37℃で一晩(24時間)インキュベーションした。3つの酵素をさらに各2.5mU、試料に添加して、試験管を穏やかに反転しながら(9rpm)これを37℃でさらに48時間インキュベーションした。加熱(100℃、5分間)によって消化を停止し、そして次いで凍結乾燥した。消化を500μLの水に再懸濁し、そしてCEによる分析のため、アリコット(50μL)を採取した。
20mM H3PO4の水溶液を20mM Na2HPO4・12H2Oの溶液に添加してpH3.5を生じることによって、キャピラリー電気泳動操作緩衝液を作製した。カラム洗浄液は、100mM NaOH(50%w/w NaOHから希釈)であった。0.2μm酢酸セルロース膜フィルター(47mmφ;Schleicher and Schunell、ドイツ・ダッセル)を取り付けたMilliporeフィルター装置を用いて、操作緩衝液およびカラム洗浄液両方を濾過した。水に二糖を溶解することによって(1mg/mL)、12の二糖標準のストック溶液を調製した。標準のための較正曲線を決定するため、すべての12の標準を含有する混合物を調製した。12の標準混合物のストック溶液は、10μg/100μLの各二糖を含有し、そして10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125μg/100μLを含有する希釈シリーズを調製した;2.5μgの内部標準(ΔUA,2S−GlcNCOEt,6S)を含む。HSの消化を水で希釈し(50μL/mL)、そして同じ内部標準を各試料に添加した(2.5μg)。溶液を凍結乾燥し、そして水に再懸濁した(1mL)。PTFE親水性使い捨てシリンジフィルター装置(0.2μm;13mmφ;Advantec、東洋濾紙株式会社、日本)を用いて、試料を濾過した。
HS8がFGF2に優先的に結合し、そしてhMSCの増殖速度を増加させることが同定されたため、本発明者らはさらに、HS8活性の機構を調べた。
ブタ皮膚創傷治癒プロトコル
5匹の成体マイクロブタの背中に、全層切除創傷を生成した。麻酔したブタの背中の体毛を剃り、そしてポピドンヨード溶液で清浄化した。1日、3日、7日、9日、13日および15日の実験時点を提供するため、6および10mm生検パンチを用いて、入子式の創傷を生成した。全実験時点には、3つの創傷セットが必要である。最初の3つの創傷を6mm生検パンチで作製した。第1日、3日および7日に、各創傷を10mm生検パンチでくり抜いた。第16日に、10mm創傷は、9日、13日、および15日の時点を提供するであろう。
Claims (16)
- 皮膚の修復および/または再生の療法的方法において使用するためのヘパラン硫酸HS8。
- 皮膚の修復および/または再生の療法的方法において使用するための薬剤製造におけるヘパラン硫酸HS8の使用。
- 請求項1の皮膚の修復および/または再生の療法的方法において使用するためのHS8あるいは請求項2の使用であって、療法的方法が、場合によって皮膚火傷、潰瘍、切除創傷、切り傷、刺し傷または穿刺傷より選択される、皮膚創傷または瘢痕の治療を含む、前記HS8またはその使用。
- 請求項1の皮膚の修復および/または再生の療法的方法において使用するためのHS8あるいは請求項2の使用であって、療法的方法が、皮膚移植治癒、皮膚再構築、または皮膚形成手術を含む、前記HS8またはその使用。
- ヘパラン硫酸HS8を含む薬学的組成物の有効量と、皮膚創傷を接触させる工程を含む、皮膚創傷を治癒させる方法。
- ヘパラン硫酸HS8の療法的有効量を被験体に投与し、創傷部位で皮膚の修復および/または再生を導く工程を含む、皮膚創傷を有する被験体を治療する方法。
- 皮膚創傷が、皮膚火傷、潰瘍、切除創傷、切り傷、刺し傷または穿刺傷である、請求項5または6の方法。
- 皮膚移植、皮膚再構築、または皮膚形成手術の方法であって、HS8を含む薬学的組成物の有効量と、移植、再構築または形成手術の領域のまたは該領域に隣接した皮膚を接触させる工程を含む、前記方法。
- 皮膚の修復および/または再生の療法的方法において使用するためのHS8、先行する請求項のいずれか一項の使用または方法であって、HS8、薬剤または薬学的組成物が、局所または経皮投与のために製剤化される、前記HS8、使用または方法。
- 皮膚の修復および/または再生の療法的方法において使用するためのHS8、先行する請求項のいずれか一項の使用または方法であって、HS8、薬剤または薬学的組成物が、ジェル、スプレー、ペースト、軟膏、クリーム、ローション、膏薬(salve)、オイル、水溶液、懸濁物、分散物、パッチ、絆創膏、包帯、ドレッシング剤、デポ剤またはリザーバーとして製剤化される、前記HS8、使用または方法。
- 皮膚の修復および/または再生の療法的方法において使用するためのHS8、先行する請求項のいずれか一項の使用または方法であって、方法が、増殖因子、好ましくはFGF2、および/または間葉系幹細胞の投与をさらに含む、前記HS8、使用または方法。
- 皮膚の修復および/または再生の療法的方法において使用するためのHS8、先行する請求項のいずれか一項の使用または方法であって、HS8、薬剤または薬学的組成物が、増殖因子、好ましくはFGF2、および/または間葉系幹細胞との組み合わせ調製物として製剤化される、前記HS8、使用または方法。
- 皮膚の修復および/または再生の療法的方法において使用するためのHS8、先行する請求項のいずれか一項の使用または方法であって、ヘパラン硫酸HS8が単離型または実質的に精製された形態で提供される、前記HS8、使用または方法。
- 皮膚の修復および/または再生の療法的方法において使用するためのHS8、先行する請求項のいずれか一項の使用または方法であって、ヘパラン硫酸HS8がアミノ酸配列YCKNGGF(配列番号2)またはGHFKDPKRLYCKNGGF(配列番号1)を有するかまたは該配列からなるペプチドまたはポリペプチドに結合可能である、前記HS8、使用または方法。
- 皮膚の修復および/または再生の療法的方法において使用するためのHS8、先行する請求項のいずれか一項の使用または方法であって、ヘパリンリアーゼI、IIおよびIIIで消化し、そして次いで生じた二糖断片をキャピラリー電気泳動分析に供した後、ヘパラン硫酸HS8が:
- 皮膚の修復および/または再生の療法的方法において使用するためのHS8、先行する請求項のいずれか一項の使用または方法であって、HS8が:
(i)固体支持体に付着したポリペプチド分子を有する固体支持体を提供すること、ここでポリペプチドは、アミノ酸配列YCKNGGFを有するヘパリン結合ドメインを含む;
(ii)ポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体の形成が可能になるように、グリコサミノグリカンを含む混合物と、該ポリペプチド分子を接触させること;
(iii)ポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体を混合物の残りから分離すること;
(iv)ポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体からグリコサミノグリカンを解離させること;
(v)解離したグリコサミノグリカンを収集すること
を含む方法によって得られる、前記HS8、使用または方法。
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