JP2017519819A - 心筋内細胞送達及びサイトカイン投与による心筋症治療法 - Google Patents

Abstract

【課題】【解決手段】本発明は、骨髄穿刺により取得可能な細胞、又は複能性若しくは多能性前駆細胞と、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)とを、対象者における心筋症の治療法において同時に、個別に、又は連続して使用する複合調製物として含む組成物を提供し、細胞は、対象者の心筋に直接投与される。

Description

本発明は、特に心筋内への細胞の送達及び補助的なサイトカイン投与による心筋症治療に関する。

西洋諸国における心不全の主な原因の1つは、虚血性心疾患である。治療の進歩にもかかわらず、心不全により入院した患者の予後は依然として悪く、5年生存率は略50％であり、10年生存率は略10％である(Macintyre et al., 2000、Mosterd et al., 2001)。心不全の罹患率の増加は、患者、医療従事者、及び医療制度に重大な負担をもたらすことから、新しい治療の必要性は明らかである。

顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)は、前駆細胞の事前動員(pre-mobilisation)の目的で用いられることが多い強力なサイトカインである。幾つかの試験では、更に、G-CSF単独での治療が心機能の改善につながるかが調査されている。G-CSFによる心機能の改善を示唆する結果もあるが、殆どの試験は小規模であり、全体的な結果は混然としている(Hill et al., 2005、Wang et al., 2005、Honold et al., 2012、Joseph et al., 2005)。虚血性心筋症において自己前駆細胞を用いた第I/II相試験は、有望な結果を示しているが、これらの研究には介入の適切な比較群が欠けている場合が多い。サイトカイン療法を細胞療法への補助として用いることを評価した試験は僅かしかない(Jeevanantham et al., 2012、Fisher et al., 2014)。

本発明は、第II相臨床試験REGENERATE-IHDの成果に関する。本発明者らにより一部実施された無作為化プラセボ対照試験の研究デザイン(結果を含まず)は、当業者に公知であり、Yeo & Mathur (2009)に記載されており、clinicaltrials.govにおいて登録番号NCT00747708で入手することができる(https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00747708?term=NCT00747708&rank=1、2014年6月10日にアクセス)。この研究では、G-CSFを単独で用いたサイトカイン療法が、或いはこれを細胞治療(自己骨髄由来細胞の投与)と組み合わせた場合に、虚血性心筋症患者に対する改善効果を有するかについて初めて取り組むことを目指した。この試験では、更に、自己骨髄由来細胞の冠動脈内及び心筋内の送達経路の比較を、安全性及び有効性の両方について行うことを目指した。

試験の開始時には、多数の仮説を立てた。特に、自己細胞の冠動脈内及び心筋内注射経路の両方が、G-CSF投与のみの場合を超える心臓機能及び症状の改善をもたらすとした。更に、G-CSF投与は、細胞療法の不在下で、CD34+前駆細胞の循環の増加に起因する心臓機能及び症状を、ある程度改善すると仮定した。試験は2005年8月に開始され、最終データ収集日は、2012年5月となった。

REGENERATE-IHDと平行して、第II相臨床試験FOCUS-CCTRN(Perin et al., 2012)を、2009年3月から2011年11月まで実施した。研究デザイン及び試験結果は、当業者に公知であり、上記の公開内容に加えて、clinicaltrials.govにおいて登録番号NCT00824005で入手可能である(https://clinicaltrials.gov/ct2/show/study/NCT00824005?term=NCT00824005&rank=1、2014年6月10日にアクセス)。この試験では、心筋内経路で送達された自己骨髄由来細胞が、冠動脈疾患又は左心室機能障害及び限定的な心不全又はアンギナを有する患者において、心筋灌流、左心室収縮終期容積、又は最大酸素摂取量を改善するかを確定することを目指した。主要エンドポイント又は副次的エンドポイントにおける有意な改善は、著者らにより観察されなかった。

したがって、虚血性心筋症等の障害を治療するのに有効な治療法の必要性は、当該技術分野において依然として存在する。

本発明は、少なくとも部分的には、補助サイトカイン療法と虚血性心筋症患者の心筋に移植した自己骨髄由来細胞とのREGENERATE-IHD無作為化試験に基づいている。この試験では、1年の時点で心筋内(intramyocardial, IM)経路細胞治療プラス補助G-CSF群内において左室駆出率(left ventricular ejection fraction, LVEF)が4.99パーセントポイントの増加を示したことにより、主要エンドポイントが達成された。しかしながら、試験の最初の仮説に反して、LVEFにおけるこの改善の度合いは、IM細胞治療プラス補助G-CSF群のみにおいて見られ、重要な点として、他の何れの群(G-CSF投与のみ又はG-CSFと冠内(intracoronary, IC)経路で投与した細胞療法との併用)でも見られなかった。これも、IM経路での自己細胞療法を受ける患者が試験の主要エンドポイントでの改善を示さなかったFOCUS-CCTRN試験とは対照的である。

REGENERATE IHDのプロトコルは、追加としてG-CSFを投与し、IM送達細胞療法のみではない点だけでなく、細胞の調製及び送達に関する多数のパラメータにおいて、FOCUS-CCTRNのものとは異なっていた。前記パラメータは、Yeo & Mathur (2009)により公開された研究デザインには記載されておらず、clinicaltrials.gov(NCT00747708)において入手可能な研究方法では開示されていない。これらは、発明の詳細な説明(下記)において初めて明示される。前記パラメータによるG-CSF投与と細胞療法との組み合わせは、主にLVEFにより測定されるように、心機能の有意な改善をもたらすことが示されている。この効果は、前記特徴が欠如した方法であるFOCUS-CCTRN試験では見られない。

本発明の第1の態様によれば、骨髄穿刺により取得可能な細胞と顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)とを、対象者における心筋症の治療法において同時に、個別に、又は連続して使用する複合調製物として含む組成物が提供され、細胞は対象者の心筋に直接投与される。好ましくは、G-CSFは、皮下投与される。

本発明の第2の態様によれば、複能性又は多能性前駆細胞と顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)とを、対象者における心筋症の治療法において同時に、個別に、又は連続して使用する複合調製物として含む組成物が提供され、細胞は対象者の心筋に直接投与される。好ましくは、G-CSFは、皮下投与される。

他の態様は、請求の範囲に明示される。

図1は、研究デザインと試験の各段階での参加者数をまとめた研究のフローチャートである。 図2は、左室駆出率の主要エンドポイント解析を示す図である。治療群(A乃至F)のそれぞれにおいてCMR/CTを用いて測定した、ベースラインから1年の時点でのLVEFの変化の結果。A-末梢プラセボ、B-末梢G-CSFのみ、C-末梢G-CSF冠動脈内血清、D-末梢G-CSF+冠内(intracoronary)骨髄由来細胞(bone marrow-derived cells, BMC)、E-末梢G-CSF +心筋内血清、F-末梢G-CSF+心筋内BMC。心筋内BMC処置群(群F)において4.99パーセントポイントの有意な改善が観察された。*はp<0.05を示す。大きな黒丸は、ベースラインと1年後とにおける平均値をそれぞれグループ毎に示し、エラーバーは95％CIを示す。 図3は、NT pro-BNPの変化を示す図である。ベースラインと比較した6ヶ月の時点でのNT pro-BNPの変化を、対数スケール上で箱ひげ図(中央値及び範囲)を用いて表す。NT pro-BNPは、心筋内(IM)BMC群において有意に減少した。A-末梢プラセボ、B-末梢G-CSFのみ、C-末梢G-CSF+冠内血清、D-末梢G-CSF+冠内骨髄由来細胞(BMC)、E-末梢G-CSF+心筋内血清、F-末梢G-CSF+心筋内BMC、*はp<0.05を示す。 図4は、NYHAの変化を示す図である。ベースラインと比較した1年の時点での平均NYHAクラスを、治療群(上記A乃至F)それぞれについて示す。心筋内骨髄細胞(BMC)群では、NYHAクラスの有意な減少が認められた。*はp<0.05を示し、有意性は、ボンフェローニ補正による一元配置ANOVAを用いて多重比較を行い評価した。 図5は、手動骨髄穿刺処理中の遠心分離の前(A)及び後(B)の骨髄試料の概略図である。

上述したように、複合された、サイトカイン療法と虚血性心筋症患者の心筋に移植された自己骨髄由来細胞とのREGENERATE-IHD試験では、1年後にIM経路細胞治療+皮下G-CSF群において左室駆出率(LVEF)が4.99パーセントポイントの増加を示したことにより、主要エンドポイントが達成された。IM送達及び皮下G-CSF群における主要エンドポイントの達成は、ニューヨーク心臓協会(NYHA)機能クラスの臨床エンドポイントにおける改善、及び生化学マーカであるプロホルモン脳性ナトリウム利尿ペプチドN末端(NT pro-BNP)の低下によっても裏付けられる。CFUアッセイにより測定された細胞機能は、IM細胞群に見られるLVEFの変化と直接相関し、心機能における持続的な改善に細胞自体が機構的に関与しているという仮説を支持した。本発明者らの発見は、G-CSFのみでは進行した心不全患者に有益な効果は無いが、心筋内幹細胞注射との組み合わせが臨床的及び機能的パラメータを改善すると思われることを裏付けている。

G-CSFは、細胞動員の補助剤であると言われていることに加え、虚血性心筋症の独立した治療剤であるとされており、過去の小規模試験では、LVEFの改善との関連が示唆されている(Joseph et al., 2006)。REGENERATE-IHD試験は、単独のG-CSF治療が、この患者集団における心不全の機能的、臨床的、及び生化学的マーカに有益な効果を及ぼさないことを実証する最初の無作為化対照試験である。G-CSFを用いた以前の実証的試験は、適切な対照が欠如していたか、無作為化対照試験ではなかった(Hill et al., 2005、Wang et al., 2005、Honold et al., 2012、Joseph et al., 2005、Chih et al., 2012)。

REGENERATE-IHDでは、全ての介入アームがG-CSFを投与されたが、G-CSF及び心筋内細胞注射を受けた患者のみが有益性を示した。これは、IM経路による自己細胞療法を受けた患者が試験の主要エンドポイントにおいて改善を示さなかったFOCUS-CCTRN試験とは対照的である。他のパラメータ(下記)が異なるため、ここでは直接試験されていないが、これは、心不全患者での有益性を示すためには、IM細胞注射に加えてG-CSFが必要であることを示唆している可能性がある。

本発明者らは、心筋機能の改善に加えて、IM細胞処理プラス皮下G-CSF群における機能的及び生化学的パラメータの改善を観察した。まず、生活の質(QoL)の改善を伴う、1年の時点でのNYHA機能クラスの持続的な低下は、この群における運動能力の改善を示唆している。加えて同群では、このLVEFの改善を裏付けるNT pro-BNPの有意な改善が認められた。IC細胞処置群では、NYHA機能クラスの有意な改善、NT pro-BNPの有意な減少の傾向、及び特定のQoLパラメータの改善が見られたものの、客観的な心機能パラメータの改善が無く、臨床的有用性が生じる可能性は低い。

ベースライン特性及びLVEF(<30％)は、進行した虚血性心筋症の患者集団と一致していた。これらは群間でも合致していた。G-CSF治療後5日間に、(コロニー形成単位(CFU)により測定された)細胞の機能的能力の差は、群間に見られなかった。更に、IM細胞処置患者におけるCFUと駆出率との相関の肯定的な証拠は、無作為化試験においてこれまで観察されていなかった。これは、細胞機能と心機能との因果関係を初めて裏付けるものとなる。レジストリ研究におけるCFU数と死亡率との間には、これまで逆相関が示されていた。(Assmus et al., 2007)。

進行した心不全患者における自己細胞の使用は、処置前後に合併症を起こす確率が非常に低く、安全であると思われる。更に、IM群におけるトロポニンの上昇は、以前に公開された文献(Baldazzi et al., 2008)と一致しており、興味深いことに、プラセボアームに局在していると思われる。両方の介入、即ち、細胞のIM及びIC注入は、共に有意な不整脈の長期的リスクが低く、心不全の悪化による入院率が低く、更に主要有害心イベント(MACE)の割合が低い(試行全体で1年に僅か2件)という点において安全であると思われる。この試験はMACE又は死亡率の有意差を検出する能力を有していないが、データは、他の同様の試験と一致しており、慢性心不全患者における自己骨髄由来細胞の安全性及び実現可能性を再確認するものである。

試験の手順に関して、IM自己骨髄由来細胞療法の結果として心機能の改善が観察されなかったFENUS-CCTRNと、REGENERATE-IHDとが異なるのは、以下の特徴である。まず、G-CSFを用いた前処置によるサイトカイン療法(IM細胞送達前に皮下注射により5日間)が行われ、これはFOCUS-CCTRNには無い特徴である。次に、心筋の範囲は、6.9mV乃至11mVの単極電圧を有するNOGA^{(登録商標)}電気機械的マッピングにより注射部位として選択された。6.9mV未満の値は瘢痕組織の特徴であり、11mVを超える値は過活動状態にある心筋の範囲を示しており、FOCUS-CCTRNでは、最小値6.9mVのみが考慮され、注入可能な部位の選択に上限がない(Perin et al., 2012)。上記に加え、FOCUS-CCTRNでは、一旦単離された骨髄穿刺物を、閉鎖型の自動細胞処理システム(Sepax、Biosafe SA)により処理した(Perin et al., 2012)。対照的に、REGENERATE-IHDでは、手動の細胞処理プロトコルに従い(標準操作手順、実施例参照)、その基本的な特徴は、以下に明示している。FOCUS-CCTRNと比較して、上記のうち、独立して考慮される単一の変数は存在しないため、本発明者らは、試験方法の上記特徴を複合したものにより、主要エンドポイントの達成が可能になったと結論付けた。

本明細書での使用において、「治療法」は、「治療」と「予防」との両方を含む。

本明細書での使用において、「治療すること(treating)」及び「治療(treatment)」及び「治療する(to treat)」という用語は、診断された病的状態又は障害を治癒させる、その進行を減速させる、及び/又は、その進行を停止させる治療措置を示す。したがって、治療を必要とする者には、その障害を既に有する者が含まれる。必ずでは無いが、本発明者らが特に想定するように、同等又は同一のタイムスケールに亘り類似又は同一プロトコルに従う場合に、REGENERATE-IHD試験の主要エンドポイントが達成された時点で、対象者では、本発明による心筋症の「治療」が成功する。全ての患者に対する主要エンドポイントは、高度な心臓画像化(心臓磁気共鳴画像法(CMR)又はCMRが使用できない場合のコンピュータ断層撮影法(CT))を用いて測定した、ベースラインと比較した12ヶ月時点での左室駆出率(LVEF)の有意な変化とした。更に、対象者では、同等又は同一のタイムスケールに亘り類似又は同一プロトコルに従う場合に、好ましくは、主要エンドポイントの達成と組み合わせて、REGENERATE-IHD試験の1つ以上の副次的エンドポイントが達成された時点で、「治療」に成功したと見做してもよい。副次的エンドポイントには、NT-pro BNPと、NYHAと、生活の質(EQ5D^{(登録商標)}、SF-36^{(登録商標)}、及びMacNew^{(登録商標)}アンケートにより評価)と、コントラスト経胸壁心エコー(TTE)及び定量的左室造影(QLV)を用いて評価したLVEFとにおける、ベースラインと比較した6ヶ月時点での変化を含めた。1年の時点での追加の副次的エンドポイントは、ベースラインと比較したNYHAクラス、コントラストTTEにより測定したLVEF、及び生活の質における変化とした。

本明細書での使用において、「心筋症」という用語は、当該技術分野で用いられる従来の意味を有し、即ち、一般に、何らかの理由で心筋(心臓の筋肉)の機能が低下することを意味する。「虚血性心筋症」は、一般には血液供給の欠如又は相対的欠乏による、心筋への不十分な酸素送達に起因する心筋の衰弱を示す。

本明細書での使用において、「心筋」という用語は、当該技術分野で用いられる従来の意味を有し、即ち、一般に、心臓の筋肉を意味する。本発明では、骨髄穿刺により取得可能な細胞を含む組成物を対象者の心筋へ直接投与することが想定され、これは、組成物が介在組織(例えば、冠動脈血管)を横断することなく、投与装置(特に、注入カテーテルが想定される)から心筋組織へ移送されることを意味する。「心筋内注射」は、注射による対象者の心筋への直接投与を示す。

本明細書での使用において、「骨髄」という用語は、当該技術分野で用いられる従来の意味を有し、即ち、一般に、骨空洞に存在する膠様組織を意味する。この組織は、赤色骨髄、即ち、特に成体幹細胞、前駆細胞(progenitor cells)、及び前駆細胞(precursor cells)の集団を含有する骨髄のサブセットを含む。細胞(特に自己細胞)に関連して本明細書において使用される「骨髄由来」という用語は、前記細胞が、骨髄から、特に対象者の骨髄の吸引により、抽出されたことを示す。

本明細書での使用において、「骨髄穿刺」という用語は、当該技術分野で用いられる従来の意味を有し、即ち、一般に、ある量の骨髄を(必ずでは無いが一般に液体の形態で)取り出すことを意味する。この手順により骨髄から取り出されることが当業者により合理的に予想される場合(換言すれば、細胞が穿刺前に骨髄に存在し、この手順により取り出し可能であると合理的に予想される場合)、細胞は、この手順により「取得可能」と見做してよく、加えて、このような細胞由来の細胞(例えば、生体内又は生体外増殖により得られた、このような細胞の子孫)は、このような(親)細胞より大きな系統限定(即ち分化)を有する場合でも、本発明の範囲に含まれる。したがって、骨髄穿刺により「取得可能」な細胞には、この手順により得られた細胞、この手順により得られることが当業者により合理的に予想される細胞、及び上記の何れかの子孫(特に生体内又は生体外での増殖により生じたもの)が含まれる。骨髄穿刺により取得可能な自己及び同種異系細胞は、共に本発明の範囲に含まれるが、特に自己由来細胞が想定されている。ヒト胚性幹細胞又はヒト胚の破壊により生じる任意の細胞は、本発明の範囲に含まれない。

本明細書での使用において、「複能性又は多能性前駆細胞」は、増殖を誘導可能であり、単一系統に限定されない(即ち単一の細胞型に分化することが約束されていない)未分化細胞を示す。本明細書での使用において、この用語は、当該技術分野で用いられる「幹細胞」という用語と相互に交換可能である。自己及び同種複能性又は多能性前駆細胞は、共に本発明の範囲に含まれるが、特に自己由来細胞が想定されている。しかしながら、ヒト胚性幹細胞又はヒト胚の破壊により生じる任意の細胞は、本発明の範囲に含まれない。上記の細胞は、自己維持が可能であり、これは、各細胞分裂により、1個の娘細胞も多系統分化が可能な細胞となることを意味する。この用語には、更に、上記細胞の子孫が含まれ、例えば、対象者から得られた試料由来の細胞を、例えば生体内又は生体外で増殖することにより得られた子孫も含まれる。複能性又は多能性前駆細胞は、多数の組織から取得可能だが、しかしながら、前記未分化細胞を含む成体組織、例えば膀胱、羊水及び/又は骨髄が特に想定され、骨髄は、特に想定されるソースとなる。複能性又は多能性前駆細胞は、例えば成体真皮線維芽細胞又は他の任意の適切な細胞型から、当該技術分野において公知の標準的な方法を用いて得られたもの等の誘導多能性幹細胞、又はそれに由来するもの(即ち、その子孫)であってもよい。

本明細書での使用において、「対象者」という用語は、限定では無いが、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、齧歯類等を含む任意の動物(例えば、哺乳動物)であって、本発明の使用による心筋症治療法を受けるものを示す。特に、ヒトの対象者が想定される。「患者」は、本明細書において、ヒトの対象者を示すために用いられる。

本明細書での使用において、「複能性又は多能性成体幹細胞」という用語は、例えば(前記細胞が同種である場合)対象者である出生後の生物に存在する又は出生後の生物から得られた(例えば、単離された)幹細胞であって、増殖を誘導可能であり、単一系統に限定されず(即ち単一の細胞型に分化することが約束されておらず)、同じ胚葉から異なる細胞型に分化することが可能な未分化の細胞である。上記の細胞は、自己維持が可能であり、これは、各細胞分裂により、1個の娘細胞も多系統分化が可能な細胞となることを意味する。対象者の骨髄から取得可能な造血幹細胞は、本発明による使用に特に想定される複能性又は多能性成体幹細胞の型である。

本明細書での使用において、「骨髄幹細胞」という用語は、骨髄に存在する多系統分化が可能な任意の成体幹細胞を示し、特に骨髄穿刺液の試料、例えば対象者から採取された試料に存在する、又はこうした試料から(少なくとも部分的に)単離し得るものを示す。

細胞(特に、骨髄幹細胞)に関連して本明細書で使用される「CD34+」という用語は、初期の造血及び血管関連組織に関連する細胞上で一般に発現される細胞間接着因子Cluster of Differentiation 34の、前記細胞の表面上での存在を示す。CD34+細胞は、当該技術分野において公知の多数の標準的方法、特にフローサイトメトリにより同定可能である。

本明細書での使用において、「内皮前駆細胞」という用語は、内皮細胞に分化する能力を有し、そのため特に脈管形成及び/又は血管恒常性に関与することが可能な前駆細胞を示す。

本明細書での使用において、「自己」という用語は、細胞に関して、当該技術分野で用いられる従来の意味を有し、即ち、一般に、細胞が対象者から(例えば、骨髄穿刺により)採取されたこと、又はそのような細胞に由来すること(例えば、患者から採取後、生体外で増殖された細胞の子孫)を意味する。

本明細書での使用において、「顆粒球コロニー刺激因子」(G-CSF)という用語は、当業者に理解されるように、当該技術分野で用いられる従来の意味を有する。一般に、G-CSFは、特に骨髄における造血前駆細胞の増殖及び分化を刺激する能力を有するサイトカインである。

本明細書での使用において、「パーセントポイント」という用語は、パーセンテージとして測定されるパラメータ(例えば、左室駆出率-LVEF)の絶対差を示す。一例として、ベースラインLVEFである30％から1年以内に4.99パーセントポイント増加した場合、最終LVEFは、34.99％であり、31.497％ではない。

本発明の組成物、キット、及び方法は、「パーツキット」、即ち、同時に、連続して、又は個別に2つ以上の成分を投与することを提供する。誤解を避けるために明記すると、キット/組成物の個々の成分を一緒にパッケージする必要はない(但し、これは本発明の一実施形態である)。また、これらを同時に投与する必要はない。本明細書での使用において、「個別」投与は、成分群が同じ全体的な投与計画(日数を含むことがある)の一部として投与されることを意味する。本明細書での使用において、「同時」とは、成分群が一緒に摂取されるか、又は単一の組成物として処方されることを意味する。 本明細書での使用において、「連続」とは、成分群がほぼ同時に、好ましくは互いに約1時間以内に投与されることを意味する。

本発明の第1の態様によれば、骨髄穿刺により取得可能な細胞と顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)とを、対象者における心筋症の治療法において同時に、個別に、又は連続して使用する複合調製物として含む組成物が提供され、細胞は対象者の心筋に直接投与される。好ましくは、G-CSFは、皮下投与される。前記第1の態様によれば、前記細胞は、骨髄穿刺により取得可能であることから、当該技術分野において記述されるような手順の任意の適切な実施形態により取得可能な細胞を含む。単なる一例として、骨髄は、対象者の後腸骨稜から取得することが可能であり、20乃至120ml、好ましくは30乃至100ml、より好ましくは40乃至80ml、最も好ましくは約50mlの骨髄を、前記腸骨稜上の2箇所、3箇所、4箇所、又はそれ以上の異なる部位から吸引し得る。骨髄穿刺液は、正しく取得された場合、所望の細胞を本質的に含む。

本発明の第2の態様によれば、複能性又は多能性前駆細胞と顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)とを、対象者における心筋症の治療法において同時に、個別に、又は連続して使用する複合調製物として含む組成物が提供され、細胞は対象者の心筋に直接投与される。好ましくは、G-CSFは、皮下投与される。

更に、前記第1又は第2の態様によれば、治療法は、好ましくは治療であり、対象者は、好ましくは虚血性心筋症であることが、例えば有資格臨床医により診断される。しかしながら、原因が非虚血性である心筋症も治療し得る。

更に、前記第2の態様によれば、上記細胞は、骨髄穿刺により取得可能となり得る。更に、前記第1又は第2の態様によれば、細胞は、好ましくは、骨髄穿刺により得られたものとなる。手順は、当該技術分野において利用可能な任意の適切な方法を用いて実施し得る。しかしながら、限定ではなく一例として、骨髄は、後腸骨稜から取得してよく、20乃至120ml、好ましくは30乃至100ml、より好ましくは40乃至80ml、最も好ましくは約50mlの骨髄を、前記腸骨稜上の2箇所、3箇所、4箇所、又はそれ以上の異なる部位から吸引し得る。骨髄穿刺液は、正しく取得された場合、所望の細胞を本質的に含み、以下に記載した正しい処理の後でも保持される。限定ではなく他の例として、末梢静脈血を対象者から取得し(例えば、20乃至50ml、好ましくは30乃至40ml、より好ましくは約36ml)、心筋内注射の前に自己細胞を懸濁させてもよい。

更に、前記第1又は第2の態様によれば、前記細胞は、複能性又は多能性成体幹細胞、好ましくはCD34+骨髄幹細胞を含み得る。理論に縛られることは望まないが、上記細胞型は、必ずではないが、本発明の有効性のために必要となり得る。

更に、前記第1又は第2の態様によれば、特に好適な実施形態において、前記細胞は自己由来である。

更に、前記第1又は第2の態様によれば、好ましくは、細胞は、例えば、MyoStar^TM注入カテーテルを用いて心筋へ直接経皮注射することにより、対象者の心筋に送達される。より好ましくは、前記経皮注射は、対象者の心臓(好ましくは左心室)の三次元電気機械的マッピングにより管理される。特に好ましい実施形態において、心筋への上記電気機械的マッピング及び経皮注射は、2014年6月10日現在NOGA^{(登録商標)} XP Cardiac Navigation Systemの商標名で販売されている機器、又はその適切な変形又は派生機器を備えたシステムにより実施されるが、全ての適切な3-D電気機械的マッピングシステムは、本発明の範囲内に含まれる。前記機器は、左心室の電気的及び機械的活動を同時に記録し、心筋バイアビリティのオンライン評価を可能にする。生存心筋、非生存心筋、気絶心筋、及び冬眠心筋を区別することが可能であり、壁運動を評価することができる。前記システムを用いることで、左心室のマッピングにより、心内膜単極電圧を評価し、最適な注入部位を選択することが可能となる。例えばNOGA^{(登録商標)}機器を含む3D電気機械的マッピングシステムを用いる場合、6.9mV乃至11mVの単極電圧を有する心筋の領域を注射部位として選択し、これにより瘢痕及び過活動組織を、それぞれ前記下限値及び上限値により除外することが最も好ましい。システムを用いて、任意の適切な回数の注射を個別の標的領域に実施してよく、例えば、少なくとも5回、好ましくは少なくとも6回、7回、8回、又は9回、最も好ましくは少なくとも10回の注射を実施し得る。注射の前記標的領域(又は位置)は、適切に間隔を空けてもよく、例えば、前記位置のうちの何れか2つの最小距離は、0.5乃至1.5cm、好ましくは0.8cm乃至1.2cm、より好ましくは約1cmであり、最も好ましくは前記位置のうちの何れか2つが少なくとも1cm離れている。限定ではなく一例として、懸濁細胞を含む注入液の総量約2mlを、上記注入回数に亘り使用し得る。心筋の壁厚に関して、(好ましくは上記システムにより)評価された電気機械的マッピングとして、5mm未満の壁厚を有する領域は、回避することが好ましい。

更に、前記第1又は第2の態様によれば、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)は、好ましくは皮下投与により、少なくとも2日間、3日間、4日間、又は5日間、最も好ましくは合計5日間に亘り、対象者に投与される。これは、当該技術分野において利用可能な標準的な方法を用いて実施し得る。用量は、2乃至20μg/kg/日、好ましくは5乃至15μg/kg/日、より好ましくは8乃至12μg/kg/日、最も好ましくは約10μg/kg/日となり得る。組換えヒトG-CSFは、本発明による使用に特に好ましい(例えば、2014年6月10日現在、中外製薬から入手可能なGranocyte^{(登録商標)}。当業者が入手可能な他の形態も使用し得る)。

更に、前記第1又は第2の態様によれば、細胞は、上記G-CSF投与期間の終了直後の3日又は2日以内、好ましくは1日以内の期間内に投与し得る。特に好適な一実施形態では、骨髄穿刺は、穿刺液に由来する細胞の投与の24時間前、より好ましくは12時間以内に実施される。

更に、前記第1又は第2の態様によれば、対象者から取得した試料が生じる骨髄穿刺に続いて、前記試料に対する非自動(即ち、手動)処理方法を行ってよく、したがって、本発明により使用する細胞は、前記方法により、好ましくは取得可能であり、より好ましくは取得されている。前記方法は、単核細胞が血漿及び無核細胞から実質的に分離されるような(更に、例えば吸引である標準的手法を用いて除去可能となるような)試料の遠心分離を含む。(図5Bに例示したように)必要な効果を達成する当業者に利用可能な任意の適切な遠心分離法を使用し得る。限定ではなく一例として、適切な密度勾配を1000乃至3000rpmで10乃至50分間、好ましくは1500乃至2500rpmで20乃至40分間使用する遠心分離を用いてよく、1900rpmで30分間が特に好適となる。好ましくは、上記のような遠心分離レジメンを用いて、単核細胞の実質的な分離を達成するのに十分なモル浸透圧及び密度を有する、多糖類を含む溶液中の試料により遠心分離を実施する。適切な例には、浸透圧280±15mOsm及び密度1.077±0.001g/mlの「Lymphoprep^TM(リンホプレップ)」(2014年6月10日現在STEMCELL Technologiesから入手可能)が含まれる。好ましくは、試料を前記遠心分離の前に濾過し(例えば、細孔サイズが50乃至500μm、好ましくは100乃至400μm、より好ましくは150乃至300μm、最も好ましくは200μmのフィルタ)、より好ましくは、試料を濾過後、遠心分離前に洗浄する(好ましくは生理食塩水中、例えば0.1乃至2％、好ましくは0.9％)。前記遠心分離に続いて、試料は、順次、ステップ(a)乃至(d)、及び任意にステップ(e)により、更に処理してよく、ステップ(a)は、前記単核細胞の遠心分離による細胞ペレットの作成を含み(例えば、1500乃至3500rpmで5乃至15分間、好ましくは2000乃至3000rpmで8乃至12分間、より好ましくは2500rpmで10分間)、ステップ(b)は、前記細胞ペレットの再懸濁を含み(好ましくは生理食塩水中、例えば0.1乃至2％、好ましくは0.9％)、ステップ(c)は、前記再懸濁細胞ペレットの更なる遠心分離による別の細胞ペレットの作成を含み(例えば、1500乃至3500rpmで5乃至15分間、好ましくは2000乃至3000rpmで8乃至12分間、より好ましくは2500rpmで10分間)、ステップ(d)は、前記別の細胞ペレットの再懸濁を含み(好ましくは生理食塩水中、例えば0.1乃至2％、好ましくは0.9％)、工程(e)は、注入液が所望の量になるように(上述したように、例えば2ml)、対象者から得られた自己血清中での(d)において得られた懸濁液の希釈を含む。特定の一実施形態において、処理方法は、好ましくは、実施例(下記)に記載した標準操作手順に実質的に従って、好ましくは従って、実施される。

本発明の他の態様によれば、心筋症の治療及び/又は予防を、その予防又は治療を必要とする対象者において行う方法が提供され、前記方法は、治療有効量のG-CSF及び骨髄穿刺により取得可能な細胞、又は複能性若しくは多能性前駆細胞を投与することを含み、細胞は、心筋に直接投与され、前記方法は、本発明の第1及び第2の態様に適用可能なものと同じ任意の好適な特徴を有する。

本発明の他の態様によれば、骨髄穿刺により取得可能な細胞、又は複能性若しくは多能性前駆細胞と、G-CSFと、細胞の心筋への直接投与を明記する使用説明書とを含む無菌要素を、好ましくは、細胞を心筋に直接送達するように構成された注射器に加えて備え、 好ましくは、更に心臓(好ましくは左心室)の三次元電気機械的マッピング用のシステムに加えて備えるキット(好ましくは、キット全体が無菌)が提供される。

次に、本発明を、以下の非限定的な実施例を参照して説明する。本発明を実施する方法に関する更なる情報について、発明の詳細な説明に記載のものと併せて、実施例を参照し得る。

REGENERATE-IHD試験方法

REGENERATE-IHD試験は、医師主導単一施設無作為化プラセボ対照試験である。この試験では、G-CSF投与を単独で、更に自己骨髄由来細胞(BMC)の冠内注射又は心筋内注射の何れかと組み合わせて、対応するプラセボ対照(血清)と比較して評価を行った。安全性と実現可能性に対処するパイロット研究の後、地域研究倫理委員会は、プロトコル(REC番号04/Q0603/13)を承認し、試験は、ヘルシンキ宣言に従って実施された。試験は、clinicaltrials.gov(NCT00747708)及びEuropean Clinical Trials Register(EudraCT no.2005-002706-27)に登録された。試験に含める前に、各患者からは書面による同意を得て、全ての有害事象を独立した安全監視委員会に報告した。

地域の心不全を扱う病院から心不全の確定診断をされた患者を試験に募集した。 以下の条件の全てを満たす患者を含めた:虚血性心疾患に続発する心不全の確定診断、少なくとも6ヶ月間の最大限の医学療法に基づき確定したもの、左心室収縮期機能障害が報告されているもの、NYHA II乃至IV、及び他の治療選択肢がないもの。除外基準には、過去6ヶ月以内の急性冠症候群、心原性ショック、心房細動、腎機能障害(血清クレアチニン>200μmol/l)、平均余命1年未満の重篤な合併症、骨髄穿刺の禁忌、慢性炎症性疾患、活動性感染症と、ヒト免疫不全ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、梅毒、又はHTLV(ヒトT細胞リンパ芽球性ウイルス)による既知の感染又は感染リスクの高い生活習慣とを含めた。

試験への同意後、患者を専用の試験ソフトウェアシステム(IHD Clinical、英国ハートフォードシャ、ビショップス・ストートフォード)(1:1:1-単純無作為化アルゴリズム)を用いて3アームのうちの1つに無作為に割り付けた。末梢アームには、生理食塩水又は皮下G-CSF(10μg/kg/d)を与えた。介入アームには、皮下G-CSF(10μg/kg/d)を5日間与えた後、骨髄を採取し、細胞又は血清を冠内又は心筋内経路(NOGA^{(登録商標)}システム)により同日に注射した(図1)。

組換えヒトG-CSF(Granocyte(登録商標)、中外製薬、英国)を10μg/kg/日の用量で5日間連続して皮下投与した後、6日目に骨髄を採取した。患者は、毎日行われる定期血液検査を受けると共に、CD34+細胞数推定のために試料を採取された。

骨髄は、後腸骨稜から取得した。50mlの骨髄を、腸骨稜上の3つの別々の部位からヘパリン処理シリンジに等しく吸引した。末梢静脈血36mlを骨髄採取の直前に採取し、心筋内注射用の自己血清を取得した。血液及び骨髄試料は、優良臨床試験基準(Good Clinical Practice)認可の幹細胞研究室へ直ちに配送し処理を行った。BMSCの単離及び特徴付けは、指定の検査技師により実施された。

骨髄試料は、次の標準操作手順により手動で処理した。 簡単に言えば、骨髄試料を密度勾配媒体(Axis Shield、ノルウェー、オスロ)上で層状とし、2500rpmで30分間遠心分離した。単核細胞画分を抽出し、0.9％生理食塩水(Baxter、英国ノーフォーク)中で3回の洗浄サイクルを施した。詳細は以下の標準的操作手順に記載した。細胞は、心筋内注射用の自己血清2mlに再懸濁した。

対照群の注射は、自己血清2mlのみで構成した。試料は、手順全体で室温に維持し、幹細胞/前駆細胞懸濁液又はプラセボの最終注入液は、心筋内又は冠内注射手順のために、ロンドンチェスト病院の心臓カテーテル検査室に輸送した。細胞調製物の生存率は、注入直前に7-AAD(7-アミノアクチノマイシンD)染色により確認し、細胞処置群では、98.4±0.7％となった。

骨髄及び末梢血循環前駆細胞(CD34+細胞及び内皮前駆細胞(EPC))は、フローサイトメトリを用いて特徴付けた。全てのフローサイトメトリ解析は、BD FACSCanto Flow Cytometerを用いて、BD FACSDiva v5.0.3ソフトウェア(BD Biosciences)により行った。HSC集団の同定のため、細胞を、ヒトCD45に対するフルオレセインイソチオシアナート(FITC)標識抗体(BD Biosciences、ベルギー、Erembodegem-AALST)及びヒトCD34)に対するフィコエリトリン(PE)-103標識抗体(BD Biosciences)と共に室温で15分間インキュベートした。

最初に試料を、マウス血清IgG(Sigma、英国ドーセット)と共に15分間4℃で、CD133に対するアロフィコシアニン(APC)標識抗体(Miltenyi Biotec、英国サリー)とVEGFR-2に対するPE標識抗体(R&D Systems、英国アビンドン)とを含む抗体カクテルと一緒にインキュベートすることで分析してEPCを特徴づけ、かつ、CD2、CD13、及びCD22に対するFITC標識モノクローナル抗体(Beckman Coulter、英国ハイウィカム)で系統陰性の非前駆細胞を同定することにより、その含有を排除した。最終的なEPC計数において生存不能細胞を確実に排除するため、細胞を、PerCP-Cy5標識7AAD染料(BD Biosciences)と共に更にインキュベートした。次に、細胞を室温で15分間、2mlのPharm Lyse^TM緩衝液(BD Biosciences)と共にインキュベートし、赤血球を溶解させた。試料をリン酸緩衝生理食塩水で1回洗浄し、20μlのAccucountフローサイトメトリービーズ(Saxon Europe、英国ケルソー)を分析前に添加した。

CD34+細胞の機能解析は、コロニー形成単位(CFU-GM)アッセイを用いて実施した。BM-MNC(1皿当たり2×10⁴)、0日目の末梢血単核細胞(MNC)(1皿当たり2×10⁵)、及び6日目の末梢血MNC(1皿当たり2×10⁴)を3重で調製して、メチルセルロースプレート内に播種した(Methocult H4534、幹細胞因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、及びインターロイキン-3を含む、Stem Cell Technologies)。プレートを位相差顕微鏡で検査し、顆粒球マクロファージコロニー形成単位(CFU GM、コロニー>50細胞)を14日間のインキュベーション後に計数した。結果は、3連の結果の平均から得た。

心筋内注射は、NOGA^{(登録商標)}マッピングシステム及びMyoStar^TM注入カテーテルを用いて行った。大腿動脈アクセス(8Frシース)後、体重により調節したヘパリンのボーラス用量を、通常の手順により与えた。LVEFを評価し、更に心筋内注射をガイドするために、LV血管造影を最初に行った。次に、患者に対して、NOGA^{(登録商標)} XP Cardiac Navigation System(Biologics Delivery Systems Group、Cordis Corporation、米国カリフォルニア州ダイヤモンド・バー)を用いてLV電気機械マッピングを実施し、瘢痕領域(単極電圧<6.9mV)と、周囲の生存可能だが冬眠状態にある心筋の境界を定め、単極電圧が11mVを超える心筋領域を回避した(過活動性心筋)。これは、LV血管造影図上の壁ジスキネジアの領域と相関していた。直接心筋内注射は、MyoStar^TM注入カテーテル(Biologics Delivery Systems Group、Cordis Corporation、米国カリフォルニア州ダイヤモンド・バー)により、以前の記述通りに行った(Perin et al., 2004、Perin et al., 2002)。合計2mlの注入液を、略1cmの間隔で10箇所の標的領域に亘り等しく送達した。壁厚5mm未満の心筋の領域は回避した。電気機械的マッピングデータ(単極電圧及び局所線形短縮(local linear shortening))は、6ヶ月間の追跡で実施されたフォローアップマッピング手順と比較できるように記録した。

全ての患者に対する主要エンドポイントは、高度な心臓画像化(心臓磁気共鳴画像法(CMR)又はCMRが使用できない場合のコンピュータ断層撮影法(CT))を用いて測定した、ベースラインと比較した12ヶ月時点での左室駆出率(LVEF)の変化とした。副次的エンドポイントには、NT-pro BNPと、NYHAと、生活の質(EQ5D^{(登録商標)}、SF-36^{(登録商標)}、及びMacNew^{(登録商標)}アンケートにより評価)と、コントラスト経胸壁心エコー(TTE)及び定量的左室造影(QLV)(IC及びIM群のみ)を用いて評価したLVEFとにおける、ベースラインと比較した6ヶ月時点での変化を含めた。1年時点での追加の副次的エンドポイントは、ベースラインと比較したNYHAクラス、コントラストTTEにより測定したLVEF、及び生活の質(QoL)における変化とした。主要有害心イベント(MACE、心臓死、心筋梗塞(MI)、経皮的冠動脈インターベンション(PCI)、又はCABGとして定義される)又は任意の有意な不整脈(症候性心室頻拍又は生存心臓死として定義される)を6ヶ月及び1年の時点で評価した。

CMR又はCMRを受けることができない者(例えば、心臓機器、閉所恐怖症)に対する心臓CTは、ベースライン及び12ヶ月の時点で行った。左心室全体を網羅した多相心臓データセットは、標準的なプロトコルを用いて取得した。

倫理委員会が要求するパイロット研究の後、この研究は、主要エンドポイントにおける群の改善、即ち現代の細胞療法の試験で見られる変化に基づく12ヶ月時点でのLVEFの変化において、3.5パーセントポイントの増加を検出する検出力とした。検出力90％、有意水準5％、及び推定観測内誤差4％に基づいて、各群における必要患者数は、11人と計算された。11人の患者が1年の時点で主要エンドポイントに到達する状態を確保するためには、更に1群当たり4人が必要になると推定され、結果として1処置群当たり15人の規模となった。

対応t検定を用いて、LVEFにおける群内変化の任意の統計的有意性を検出した。連続変数を用いた追加分析として、適切なパラメトリック検定(対応のある独立試料に対する対応t検定、対応のないデータに対するt検定、多重比較のための一方向ANOVA)及びノンパラメトリック検定(対応のあるデータ対するウィルコクソン符号順位検定及び対応のないデータに対するマン・ホイットニー)を用いた。χ二乗検定又はフィッシャーの正確確率検定を、カテゴリ変数に用いた。ピアソンの線形回帰を、LVEFと細胞機能変数との比較に用いた。値は、特に記載がない限り、平均±SDとして示している。p値は、全て両側検定のもので、p<0.05が統計的有意性を示すものとした。統計解析は、SPSS^{(登録商標)}バージョン21(IBM)及びGraphpad Prism^{(登録商標)}バージョン5.0(GraphPad Software、カリフォルニア州サンディエゴ)を用いて作成したグラフを用いて行った。解析は、試験統計家によるレビューを受けた。

REGENERATE-IHD試験結果

英国全体の心不全を扱う病院から合計1133人の患者が照会された。以下の理由により、1028人が不適格となった:心不全の病因が非虚血性(n=79)、LVEFがNYHA<II/正常(n=236)、心房細動(n=27)、試験への参加の拒否(n=389)、正式同意前の死亡(n=53)、並びに心臓弁膜症及び腎機能障害を含む他の併存症(n=244)。無作為化した105人の患者のうち、90人に対して、割り当ての試験介入を行った(図1)。

患者集団の平均年齢は、62.86±9.7歳であり、大部分の患者は男性(95.6％)であった。ベースライン特性は、グループ間で類似しており、平均LVEFが30.6±1.1％、平均NT-pro-BNPが898.9±131.4pg/ml、97.8％の患者がNYHAクラスII/IIIであった。ベースラインでの患者の人口統計を表1に示す。大部分の患者は、(ESCガイドラインによる)最適な医学療法を受けており、処方薬剤又は埋め込みデバイス療法において群間に有意な差は無かった。

合計82人の患者を、1年の時点で主要エンドポイントについて評価した。1年の時点でIMアームにおいて、BMC群では14人が評価され(1人はLVADを受けた)、IMプラセボ群では13人が評価された(1人は死亡、1人は追跡不能)。ICアームにおいて、BMC群では15人全て、プラセボ群では13人(1人は死亡、1人はCTスキャン分析不可能)が、主要エンドポイントについて評価された。末梢群において、G-CSF群では13人(1人は死亡、1人はCTスキャン分析不可能)、プラセボ群では14人(1人は追跡不能)が、主要エンドポイントについて評価された。

IM BMC群で治療された患者のみが、LVEFの変化の主要エンドポイントを満たした(4.99パーセントポイントの増加、95％CI:0.33-9.6％、p=0.038)。末梢プラセボアームと比較した事後解析では、5.97パーセントポイントの絶対変化(p=0.035)がLVEFにおいて見られた。IM血清群ではLVEFの改善傾向が見られたが{4.15パーセントポイント(95％CI:-3.3-11.6％)}、有意性には達しなかった。重要な点として、IC細胞処置群では変化が見られなかった(0.66％ポイント、95％CI:-2.4-3.7％、p=0.649)。末梢アームでは、GCSF(-1.25パーセントポイント、95％CI:-5.4-2.9％、p=0.520)及びプラセボ(-0.98％ポイント、95％CI:-4.4-2.5％、p=0.551)の両群においてLVEFが減少した。IM BMC群における心機能の改善は、心エコー検査を用いても見られた(図S2、補足データ)。何れの治療群においても、経時的なLV拡張末期容量又は収縮末期容量(LVEDV、LVESV)に有意な変化はなかった。

血液分析を、ベースライン及び6ヶ月時点の試料に対して患者毎に実施した。統計分析は、非正規分布により全NT pro-BNP値の対数変換後に行った。6ヶ月の時点で、IM BMC群の患者のみが、NT pro-BNPの有意な低下を示した(977.5±866.8乃至768.4±754.4、p=0.018)。残りの群は、6ヶ月の時点でNT-proBNPレベルに有意な変化を示さなかった(図3)。

IM BMC群において、NYHAクラスが6ヵ月の時点で有意に改善し(2.57乃至2.00、p=0.025)、1年の時点で維持された(2.57乃至2.07、p=0.047)。IM血清群では、NYHAの有意な減少(2.23乃至1.77、p=0.022)が6ヶ月の時点に見られたが、1年の時点では持続しなかった(2.23乃至2.08、p=0.420)。他の全てのグループでは、ベースラインから6ヶ月の時点又はベースラインから1年の時点で、NYHAクラスにおける有意な変化は見られなかった(図4)。 ベースラインCCSクラスは、全てのグループで同様であり、何れのグループにおいても6ヶ月又は1年の時点でCCSクラスに有意な変化はなかった。

IM BMCグループは、1年の時点でのSF36^{(登録商標)}アンケートの身体的健康スコアで評価したQoLにおいて改善を示し、他のアンケートでは有意な改善は見られなかった。これと比較して、IMプラセボ群では、1年の時点で何れのアンケートでも有意な改善は認められなかった。IC BMC群では、MacNew^{(登録商標)}及びEQ5D VASの両方が1年の時点で有意に改善した一方、プラセボ群では、SF36^{(登録商標)}の身体的健康スコアが1年の時点で改善したが、しかしながら、これにはSF36^{(登録商標)}の精神的健康スコアでの相反する有意な減少が伴った。末梢アームでは、何れの群も1年の時点でQoLの有意な改善を示さなかった。

2つの細胞群に注入した細胞の総数は、15.3×10⁶乃至296.1×10⁶BMMNCの範囲となった。処理した細胞の平均生存率は、98.2％となった。IM BMC群では、CFU-GMコロニー数とLVEFの改善との間に有意な相関が観察された(Pearson r=0.79、p=0.02)。IC BMC群における骨髄CFU-GMとLVEFの変化との間に有意な相関は観察されなかった。

IMアームでは処置後にトロポニンの僅かな増加が検出されたが(0.02±0.04、p=0.007)、しかしながら、治療群による分析では、IM BMC群において有意なトロポニンの上昇が無く(0.01±0.04、p=0.228)、増加がIMプラセボ群(0.03±0.04、p=0.013)に限定されることが分かった。臨床的に、この上昇は有意ではなく、クレアチンキナーゼの有意な上昇と関連していなかった(85.1乃至129.5、p=0.102)。重要な点として、臨床的事象は、処置中に発生しなかった。心筋酵素の有意な増加は、他の治療アームでは見られなかった。処置合併症を起こす確率(p=0.363)、有意な不整脈(p>0.999)、又はMACE率(p>0.999)に、群間で有意差は認められなかった。MACE率は全ての群で低かった(G-CSF群での心血管死が1件及びICプラセボ群におけるMIが1件)。

骨髄処理標準操作手順
1.骨髄をCell Culture Laboratoryへ通す。
2.採取物を200μmフィルタに通し、1つのバッグにプールする。フィルタラインを0.9％生理食塩水でフラッシュする。
3.滅菌針と5mLシリンジとを用いて骨髄採取物3mlを取り出し、採取物がよく混合された状態を確保する(注射部位に70％滅菌濾過エタノールを噴霧)。
4.採取物1mlを2mlラベルのクライオバイアル1本に計数前の手順のために入れ、1mlずつ「Bact Alert」とラベルされた培養ボトルに入れる。
5.適切な数のチューブラックを拭き、エタノールをスプレーし、層流キャビネットに入れる。
6.層流キャビネット内で、適切な量の50mlコニカルチューブにラベル付けし、各チューブに25mlの骨髄が入るようにする。
7.50mlチューブのスクリューキャップを慎重に取り外し、キャビネット内に逆さにして置き、シリンジ及び充填管を用いて25mlの「Lymphoprep」(浸透圧と密度(280±15mOsm、1.077±0.001g/ml)の多糖類)を加える。
8.骨髄を50ml取り出して、充填管を加え、骨髄を「Lymphoprep」上で注意深く層状にして、混合が起こらない状態とする(図5a参照)。
9.全ての骨髄を「Lymphoprep」上に重ねた後、蓋をしっかりとねじ戻す。
10.Cell Processing Labの遠心分離機を用いて、チューブを1900rpmで30分間、ブレーキを「1」に設定して遠心分離する。ブレーキは掛けない。
11.チューブを遠心分離機から慎重に取り出し、層流キャビネットに戻す。遠心分離後、単核細胞が別個の帯を形成する(図5b参照)。4乃至8本以上の50mlチューブにラベル付けする。
12.層流キャビネットにおいて、滅菌したパスツールピペットを用いて、単核細胞の明瞭な帯を吸引し、空の50mlチューブに移す。帯が全て吸引されるまで繰り返し、廃棄物を捨てる。帯の両側から取り出す量が多すぎる方が、取り出す量が少なすぎて細胞を失うリスクを冒すよりも良い。図5参照。
13.細胞の帯が全て新しいチューブに移されるまで、これを全てのチューブで繰り返す。
14.これらのチューブを2500rpmで10分間遠心分離する。チューブを層流キャビネットに戻し、慎重に上清を滅菌50mlチューブに取り出す。
15.各細胞ペレットに、滅菌したパスツールピペットを用いて3乃至5mlの0.9％生理食塩水を加え再懸濁する。
16.細胞懸濁液を1本のチューブに移し、チューブを更に2回洗浄する。
17.完了後、空のチューブを捨てる。
18.残りのチューブを50mlレベルまで充填し、2500rpmで10分間遠心分離する。層流キャビネット内で上清を除去して捨てる。
19.無作為化群に応じて、細胞ペレットを0.9％生理食塩水に13ml又は5mlまで再懸濁する。
20.細胞懸濁液1mlを「Bact Alert」ボトルのそれぞれに加え、1mlを分析用にクライオバイアルに加える。
21.必要量をシリンジに取り、内容物が見えないようにラベルで包む。患者の詳細のラベルを付ける:試験番号、生年月日、固有認識番号、日付、及び量。
22.シリンジに開封防止シリンジキャップを取り付け、付属の滅菌紙袋に入れる。オーバーラップバッグとヒートシールに入れる。クールバッグですぐに輸送するために準備領域を通して配布する。
23.使用したロット番号及び心臓試験解析結果ワークシートを記録する。

参考文献
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[図1]
Assessed for eligibility: 適格性の評価
Exclusions: 除外
Reasons: 理由
NYHA<LVEF normal: NYHA<LVEF正常
No informed concent: インフォームド・コンセント無し
Predominant valvular heart disease: 優勢な心臓弁膜症
Non-ischaemic: 非虚血性
Other (comorbidities, frailty): その他(併存症、虚弱)
Renal function: 腎機能
Randomised: 無作為化
PERIPHERAL: 末梢
Randomised: 無作為化
Received G-CSF/placebo: G-CSF/プラセボ投与
withdrawn: 脱落
INTRACORONARY: 冠動脈内
Received cells/placebo: 細胞/プラセボ投与
INTRAMYOCARDIAL: 心筋内
Allocated: 割り当て
Received: 投与
Stem Cells: 幹細胞
Placebo: プラセボ
Allocation: 割り当て
Completed follow-up: 追跡完了
Lost to follow-up/DNA: 追跡不能/データなし
6 month follow-up: 6ヶ月追跡
1 year follow-up-primary endpoint: 主要エンドポイント1年追跡
[図2、3、4]
Baseline: ベースライン
1 year: 1年
Time: 時間
6 months: 6ヶ月
NYHA Class: NYHAクラス
[図5]
Bone Marrow: 骨髄
Lymphoprep: リンホプレップ Layered bone marrow: 層状の骨髄
Plasma: 血漿
Mononuclear Cell Band: 単核細胞帯
Red Cells etc.: 赤血球等
Centrifuged bone marrow: 遠心分離後の骨髄

Claims (26)

1. 骨髄穿刺により取得可能な細胞と顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)とを、対象者における心筋症の治療法において同時に、個別に、又は連続して使用する複合調製物として含む組成物であって、前記細胞は、前記対象者の心筋に直接投与される、組成物。
2. 複能性又は多能性前駆細胞と顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)とを、対象者における心筋症の治療法において同時に、個別に、又は連続して使用する複合調製物として含む組成物であって、前記細胞は、前記対象者の心筋に直接投与される、組成物。
3. 前記細胞は、骨髄穿刺により取得可能であり、好ましくは取得されている請求項1又は2記載の使用のための組成物。
4. 前記心筋症は、虚血性心筋症である、何れかの先行請求項に記載の使用のための組成物。
5. 前記心筋症は、原因が非虚血性である、請求項1乃至3の何れかに記載の使用のための組成物
6. 前記細胞は、複能性又は多能性成体幹細胞、好ましくはCD34+骨髄幹細胞を含む、何れかの先行請求項に記載の使用のための組成物。
7. 前記細胞は、自己由来である、何れかの先行請求項に記載の使用のための組成物。
8. 前記細胞は、経皮心筋内注射により投与される、何れかの先行請求項に記載の使用のための組成物。
9. 前記細胞の投与の前に、対象者の心臓、好ましくは左心室の三次元電気機械的マッピングを実施し、マッピングの結果を用いて投与部位又は投与部位群が決定される、何れかの先行請求項に記載の使用のための組成物。
10. 前記細胞は、前記電気機械的マッピングにより決定された、6.9mV乃至11mVの単極電圧を有する心筋の少なくとも1つの領域に直接投与される、請求項9記載の使用のための組成物。
11. 前記細胞は、前記電気機械的マッピングにより決定された、少なくとも5mmの心筋壁厚を有する少なくとも1箇所の心筋の領域に直接投与される、請求項9又は10記載の使用のための組成物。
12. 前記細胞は、心筋内の少なくとも5箇所、好ましくは少なくとも10箇所の異なる場所に投与され、前記場所のうち任意の2箇所間の最小距離は、約1cmである、請求項9乃至11の何れかに記載の使用のための組成物。
13. 前記電気機械的マッピング及び経皮心筋内注射は、2014年6月10日現在、NOGA XP Cardiac Navigation Systemの商標名で販売されている機器を含むシステムにより実施されている、請求項8乃至12の何れかに記載の使用のための組成物。
14. 前記G-CSFは、皮下投与される、何れかの先行請求項に記載の使用のための組成物。
15. 前記G-CSFは、少なくとも5日の期間に亘り投与される、何れかの先行請求項に記載の使用のための組成物。
16. 前記細胞は、G-CSF投与終了直後の1日以内に投与される、何れかの先行請求項に記載の使用のための組成物。
17. 骨髄穿刺により得られた前記細胞は、非自動方法により取得可能であり、前記非自動方法は、骨髄穿刺後、単核細胞が血漿及び無核細胞から実質的に分離されるように実施される、骨髄穿刺により対象者から得られた試料の遠心分離を含む、請求項3乃至16の何れかに記載の使用のための組成物。
18. 前記遠心分離は、多糖類を含む溶液中にある時に試料に対して実施され、前記溶液は、単核細胞を血漿及び無核細胞から実質的に分離するのに十分な浸透圧及び密度を有する、請求項17記載の使用のための組成物。
19. 前記方法は、濾過と生理食塩水による前記試料の洗浄とを、その遠心分離前に含む、請求項17又は18記載の使用のための組成物。
20. 前記方法は、更に、前記細胞の投与前に、ステップ(a)乃至(d)、及び任意にステップ(e)を含み、即ち、
    (a)前記単核細胞の遠心分離による細胞ペレットの作成と、
    (b)好ましくは生理食塩水中での前記細胞ペレットの再懸濁と、
    (c)前記再懸濁細胞ペレットの更なる遠心分離による別の細胞ペレットの作成と、
    (d)好ましくは生理食塩水中での前記別の細胞ペレットの再懸濁と、
    (e)対象者から得られた自己血清中での(d)で得られた懸濁液の希釈と、を含む、請求項17乃至19の何れかに記載の使用のための組成物。
21. 骨髄穿刺により取得可能な細胞、又は複能性若しくは多能性前駆細胞と、G-CSFと、前記細胞の心筋への直接投与を明記する使用説明書とを含む無菌要素を備えるキット。
22. 骨髄穿刺により取得可能な細胞、又は複能性若しくは多能性前駆細胞と、G-CSFと、前記細胞を心筋に直接送達するように構成された注射器とを含む無菌要素を備えるキット。
23. 更に、心臓、好ましくは左心室の三次元電気機械的マッピング用のシステムを含む、請求項22記載の無菌要素を備えるキット。
24. 心筋症の治療又は予防を、そのような治療又は予防を必要とする対象者において行う方法であって、治療有効量の顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)及び骨髄穿刺により取得可能な細胞を前記対象者に投与することを含み、前記細胞は、前記対象者の心筋に直接投与される、方法。
25. 心筋症の治療又は予防を、そのような治療又は予防を必要とする対象者において行う方法であって、治療有効量の顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)及び複能性又は多能性前駆細胞を前記対象者に投与することを含み、前記細胞は、前記対象者の心筋に直接投与される、方法。
26. 請求項3乃至20記載の追加の特徴の何れかを有する、請求項24又は25に記載の方法。