JP2017512491A - 体細胞可動要素の分析のための方法、およびその使用 - Google Patents
体細胞可動要素の分析のための方法、およびその使用 Download PDFInfo
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Abstract
Description
本出願は、2014年2月27日に出願された米国仮出願第61/945,791号の利益を主張し、その全体が参照によって本明細書に組込まれる。
この明細書において言及された全ての出版物、特許、および特許出願は、あたかも、個々の出版物、特許または特許出願それぞれが、参照によってその全体が組み入れられると特異的かつ個別的に表示されたのと同程度に、参照によって本出願に組込まれる。
MEI検出のための現在の全ゲノム方法は、全ゲノム配列決定およびバイオインフォマティクス解析を含む。MEI事象は、配列の一部がヒトの基準ゲノムにマッピングし、他の部分が適切にマッピングしない、「分割リード(split−reads)」を引き起こす。メイトペアリードまたはペアエンドリード(Mate pairs or paired end reads)は、DNA分子のマッピングされていないまたはリンクされた一部の位置を固定するための、1つのリードのすべてまたは一部を使用する能力を提供している。超並列配列決定(Massively parallel sequencing)は、冗長な質問(redundant interrogation)およびより大きなサンプリングを介する信頼度の増加を可能にする。しかしながら、その増加したサンプリングには、劇的なコストの増加が伴う。より深い配列決定深度は、MEI検出に関する感度に比例する。全ゲノム配列決定(WGS)の手法は、不要なデータおよび倫理的考察と同様にコストの増加に関する問題をもたらしているが、いくつかの場合においてサンプル全体にわたるMEI挿入部位の偏りのない検出という利点を有する。いくつかの場合では、これらの方法は、中性のMEIと疾患を引き起こすMEIとの間の差を判定するのに重要である、いくつかのMEI事象を定量化する能力を阻害するであろう配列特異的な増幅バイアスを導入する。
MEIの各ファミリーは、MEIの挿入末端で同様の配列を有している。例えば、Alusでは、反復配列の側方に位置する7bpの診断配列が存在し得る。末端の長さは、変わり得るおよび/またはいくつかの反復配列を有し得る。ALU配列には、polyA配列の伸長部分(stretches of)も存在し得る。polyA配列は、部分的に標的とされ得る。DR1およびDR2などの、配列相同性を有する直列反復領域も、標的とされ得る。より長いリード長(例えば、MiSeq 2x350リード)、ペアエンド配列決定のためのより長い挿入物(例えば500bpの挿入物)およびddNTP取り込みによる制御可能なフラグメント長を使用して、複数のプライマーは、可動要素のDR1およびDR2の領域の各鎖に設計され得る。例えば、可動要素(例えば、Alus、LINE、SVA、ウイルスMEIなど)の各末端で1kbの領域を標的とするために、複数の重複しないプライマーは、最末端(末端反復の近く)からより複雑な配列を介してより高い特異性を提供するように設計され得る。いくつかの場合では、少なくとも約3つのプライマーは、MEIの各隣接要素に使用され得る。PCRとは異なり、鎖置換ポリメラーゼを用いる線形プライマー伸長により、複数のプライミング部位は、互いに干渉しない。要素の各ファミリーは、生成される合成配列を介する配列決定によって要素タイプをすぐに識別するのに十分な配列の不一致を有し得る。各要素ファミリー内の複数のプライマーは、自己組織化のために一緒に識別され、ビニングされ(binned)得る。いくつかの場合では、リードは、重要遺伝子に対する妨害があるかどうか判断するのに十分な確実性を有してマッピングされ得る。その後、同じMEIのための複数のプライマーは、キメラ分子から生成された非MEI配列を単に比較することによって、同じMEI破壊事象の個別の確証として使用され得る。複数のプライミング事象(例えば、MEI当たり約3乃至約10)とともに、単一プライマーの各々は、ゲノムの複数のコピーから同じ事象の複数のコピーを生成する。天然の標識および3’合成標識は、鋳型の個別のサンプリングを判定し、事象をさらに確証するために使用され得る。興味深いことに、事象の相対的な時期(age)を判定するために、同じ方法が使用され得る。より古いMEI事象は、MEI配列自体内の切断された末端または突然変異を有する傾向があり、これらの事象は、典型的に、カット・アンド・ペーストまたはコピー・アンド・ペーストの作業に必要とされる挿入配列を欠くために、不活性なものとして示される。
個体の核酸サンプルを全ゲノムの定量的配列決定にさらす。MEI挿入部位は、2つの半数体ゲノムのコピーにつき1回の頻度で生じると識別され、それは、MEI挿入物を生成する事象が、個体の体細胞ではなく個体の先祖生殖系列において恐らく生じたことを示す。
実施例1の個体の核酸サンプルを、個体の血液から得る。個体の血液の核酸を分析し、相対的且つ絶対的なMEI挿入部位の頻度を判定する。
実施例1と2の個体の核酸サンプルを、推定上の癌腫瘍組織の切除の2年後に個体の血液から得る。個体の血液の核酸を分析し、相対的且つ絶対的なMEI挿入部位の頻度を判定する。第2のMEI挿入部位の頻度は、本来の全ゲノムMEI調査における頻度に留まることが観察される。
腫瘍に悩む個体の表現型的に健常な組織の第1の核酸サンプルを、全ゲノムの定量的配列決定にさらす。MEI挿入部位は、2つの半数体ゲノムのコピーにつき1回未満の頻度で生じると識別され、それは、個体の体細胞全てではないがいくつかにおいて事象が生じたことを示す。MEI挿入部位を試験し、いくつかのMEI挿入部位が、機能の損失が細胞周期調節、細胞増殖調節、または細胞分裂調節における欠点に関連付けられた遺伝子を妨害していたことを判定する。
実施例2−3のMEI挿入物境界を、医薬介入のソースとして使用する。MEI挿入物配列と挿入物に隣接するゲノム配列とを含む核酸分子を成長させる。この分子を、CRISPR核酸標的化複合体に包装し、該CRISPR核酸標的化複合体は、MEI挿入物配列および挿入に隣接するゲノムの配列に隣接する核酸を開裂するためにエンドヌクレアーゼを特異的に配向し、且つ他のMEI挿入部位を開裂しないものである。
実施例1と2の個体の核酸サンプルを、推定上の癌腫瘍組織の切除の2年後に個体の血液から得る。個体の血液の核酸を分析し、相対的且つ絶対的なMEI挿入部位の頻度を判定する。第2のMEI挿入部位の頻度は、本来の全ゲノムMEI調査における頻度に留まることが観察される。
実施例1と2の個体の核酸サンプルを、推定上の癌腫瘍組織の切除の2年後に個体の血液から得る。個体の血液の核酸を分析し、相対的且つ絶対的なMEI挿入部位の頻度を判定する。第2のMEI挿入部位の頻度は、本来の全ゲノムMEI調査における頻度に留まることが観察される。
個体の核酸サンプルを全ゲノムの定量的配列決定にさらす。MEI挿入部位は、2つの半数体ゲノムのコピーにつき1回の頻度で生じると識別され、それは、MEI挿入物を生成する事象が、個体の体細胞ではなく個体の先祖生殖系列において恐らく生じたことを示す。
個体の核酸サンプルを全ゲノムの定量的配列決定にさらす。MEI挿入部位は、2つの半数体ゲノムのコピーにつき1回の頻度で生じると識別され、それは、MEI挿入物を生成する事象が、個体の体細胞ではなく個体の先祖生殖系列において恐らく生じたことを示す。
個体の核酸サンプルを全ゲノムの定量的配列決定にさらす。MEI挿入部位は、2つの半数体ゲノムのコピーにつき1回の頻度で生じると識別され、それは、MEI挿入物を生成する事象が、個体の体細胞ではなく個体の先祖生殖系列において恐らく生じたことを示す。
Claims (89)
- 細胞増殖とタグ付された可動要素挿入物(MEI)を同定する方法であって、 該方法は、
第1の核酸サンプルにおいて第1のMEI挿入部位で定量的にMEIレベルを測定する工程;
第2の核酸サンプルにおいて第1のMEI挿入部位で定量的にMEIレベルを測定する工程;および
第1の核酸サンプルにおける第1のMEI挿入部位のMEIレベルが、第2の核酸サンプルにおける第1のMEI挿入部位のMEIレベルと実質的に異なる場合に、細胞増殖にタグ付けされたMEIをタグ付MEIとして第1のMEI挿入部位を同定する工程、
を含むことを特徴とする方法。 - 前記第1の核酸サンプルおよび前記第2の核酸サンプルは、実質的に同様の量の核酸を含む、請求項1に記載の方法。
- 対照核酸は、第1の核酸サンプルおよび第2の核酸サンプル中に実質的に同様の量で存在する、請求項1または2に記載の方法。
- 第1のMEI挿入部位に隣接している配列を同定する工程を含む、請求項1−3のいずれか1項に記載の方法。
- 第1のMEI挿入部位に隣接している配列の欠損に対処する際の有効性と関連づけられた処置を選択する工程を含む、請求項4に記載の方法。
- 第1の核酸サンプルおよび第2の核酸サンプルは、第1の時点および第2の時点で共通の個体から取得される、請求項1−5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1の時点および第2の時点は、前記個体に投与される処置によって離される、請求項6に記載の方法。
- 前記処置は癌治療を含む、請求項7に記載の方法。
- 前記第1の時点および第2の時点は少なくとも6か月離される、請求項6に記載の方法。
- 前記第1の時点および第2の時点は少なくとも1年離される、請求項6に記載の方法。
- 前記第1の時点および第2の時点は少なくとも2年離される、請求項6に記載の方法。
- 前記第1の時点および第2の時点は少なくとも5年離される、請求項6に記載の方法。
- 前記第1の核酸サンプルおよび前記第2の核酸サンプルは、血液から抽出される、請求項1−12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1の核酸サンプルおよび前記第2の核酸サンプルは、循環する遊離核酸を含む、請求項1−13のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1の核酸サンプルおよび前記第2の核酸サンプルは、循環する遊離ゲノムDNAを含む、請求項1−14のいずれか1項に記載の方法。
- 第1の核酸サンプルは第1の位置で個体から取得され、第2の核酸サンプルは第2の位置で個体から取得される、請求項1−5のいずれか1項に記載の方法。
- 第1の位置は第1の癌組織を含む、請求項16に記載の方法。
- 第2の位置は健常組織を含む、請求項16または17に記載の方法。
- 第2の位置は第2の癌組織を含む、請求項16または17に記載の方法。
- 第2の癌組織および第1の癌組織は共通の癌に由来する、請求項19に記載の方法。
- 第1の核酸サンプル中の第1のMEI挿入部位の前記MEIレベルおよび第2の核酸サンプル中の第1のMEI挿入部位の前記MEIレベルを開示するレポートを生成する工程を含む、請求項1−20のいずれか1項に記載の方法。
- 前記レポートは前記個体に提供される、請求項21に記載の方法。
- 前記レポートは健康管理の専門家に提供される、請求項21に記載の方法。
- 前記レポートは秘密に製作される、請求項21に記載の方法。
- 可動要素挿入物(MEI)をモニタリングするレジメンであって、該レジメンは、
複数のMEI挿入境界を含む個体からゲノム配列情報を取得する工程;
発癌遺伝子に隣接している境界を同定するために複数のMEI挿入境界を調査する工程;
および発癌遺伝子に隣接しているMEI境界の量的存在率を経過観察する工程、
を含むことを特徴とするレジメン。 - 発癌遺伝子に隣接しているMEI境界の量的存在率を経過観察する前記工程は、
第1の時点で第1の血液サンプルを取得する工程、
第1の時点で第1の血液サンプル中のMEI境界の量的存在率を決定する工程、
第2の時点で第2の血液サンプルを取得する工程、および
第2の時点で第2の血液サンプル中のMEI境界の量的存在率を決定する工程、
を含む、請求項25に記載のレジメン。 - 発癌遺伝子に隣接しているMEI境界の量的存在率を経過観察する前記工程は、
第1の時点で第1の組織サンプルを取得する工程、
第1の時点で第1の組織サンプル中のMEI境界の量的存在率を決定する工程、
第2の時点で第2の組織サンプルを取得する工程、および
第2の時点で第2の組織サンプル中のMEI境界の量的存在率を決定する工程、
を含む、請求項25に記載のレジメン。 - 前記第1の組織サンプルおよび前記第2の組織サンプルは腫瘍組織を含む、請求項27に記載のレジメン。
- 発癌遺伝子の欠損に関連する癌に対処するための処置を選択する工程を含む、請求項25−28のいずれか1項に記載のレジメン。
- MEI挿入部位の量的存在率が、前記サンプル中において、第1の時点から第2の時点への閾値を越えて増加した場合に、発癌遺伝子の欠損に関連する癌に対処するための処置を施す工程を含む、請求項29に記載のレジメン。
- 閾値は10%の増加である、請求項30に記載のレジメン。
- 閾値は20%の増加である、請求項30に記載のレジメン。
- 閾値は30%の増加である、請求項30に記載のレジメン。
- 閾値は50%の増加である、請求項30に記載のレジメン。
- 第1の時点の前に、発癌遺伝子の欠損に関連する癌に対処するための処置の第1の投与量を投与する工程、および、MEI挿入部位の量的存在率が、サンプルにおいて、第1の時点から第2の時点への閾値よりも低く減少しない場合に、投与量を増加させる工程を含む、請求項29に記載のレジメン。
- 閾値は第1の時点の量の90%である、請求項35に記載のレジメン。
- 閾値は第1の時点の量の80%である、請求項35に記載のレジメン。
- 閾値は第1の時点の量の70%である、請求項35に記載のレジメン。
- 閾値は第1の時点の量の60%である、請求項35に記載のレジメン。
- 閾値は第1の時点の量の50%である、請求項35に記載のレジメン。
- 閾値は第1の時点の量の10%である、請求項35に記載のレジメン。
- 処置は化学療法を含む、請求項28−34のいずれか1項に記載のレジメン。
- 処置は放射線療法を含む、請求項28−34のいずれか1項に記載のレジメン。
- 処置は、MEI挿入に隣接している配列の欠損を標的とする薬剤を含む、請求項28−34のいずれか1項に記載のレジメン。
- 処置は、MEI挿入部位に隣接している配列によってエンコードされたタンパク質が関与する経路の誤調節を標的とする薬剤を含む、請求項28−34のいずれか1項に記載のレジメン。
- 処置は、特異的にMEI挿入接合部に結合する核酸を含む、請求項28−34のいずれか1項に記載のレジメン。
- 核酸はpiRNAを含む、請求項42に記載のレジメン。
- 核酸はsiRNAを含む、請求項42に記載のレジメン。
- 核酸はCRISPR核酸を含む、請求項42に記載のレジメン。
- 核酸は、MEI挿入境界のメチル化を導く、請求項42に記載のレジメン。
- 癌組織のインビボでの可視化のための組成物であって、該組成物は、検出要素に結合された発癌遺伝子に隣接しているMEI境界に及ぶ核酸プローブを含むことを特徴とする組成物。
- 検出要素は蛍光体を含む、請求項51に記載の組成物。
- 検出要素は光励起性成分を含む、請求項51に記載の組成物。
- プローブは細胞膜を通過する、請求項51‐53のいずれか1項に記載の組成物。
- プロ‐ブは細胞核膜を通過する、請求項51‐53のいずれか1項に記載の組成物。
- プローブ螢光は、発癌遺伝子に隣接しているMEI境界を含む標的核酸配列へのプローブ結合に依存する、請求項51‐53のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記プローブは携帯型の蛍光体励起装置によって視覚化される、請求項51‐56のいずれか1項に記載の組成物。
- ゲノム老化をモニタリングするための方法であって、該方法は、
第1の期間で第1の核酸サンプル中のMEI挿入部位の数を定量的に測定する工程;
第1の期間で第1の核酸サンプル中のMEI挿入部位の数を定量的に測定する工程;
および、MEI挿入境界の増加をゲノム老化の増加と相関させる工程、
を含むことを特徴とする方法。 - MEI挿入部位の数の10%の増加はゲノムの老化を示す、請求項58に記載の方法。
- MEI挿入部位の数の20%の増加はゲノムの老化を示す、請求項58に記載の方法。
- MEI挿入部位の数の30%の増加はゲノムの老化を示す、請求項58に記載の方法。
- MEI挿入部位の数の50%の増加はゲノムの老化を示す、請求項58に記載の方法。
- ゲノム老化が示された場合に、老化防止レジメンを推奨する工程を含む、請求項58‐62のいずれか1項に記載の方法。
- 老化防止レジメンはカロリー制限を含む、請求項63に記載の方法。
- 老化防止レジメンはNSAIDの投与を含む、請求項63に記載の方法。
- 老化防止レジメンはDNAメチラーゼの投与を含む、請求項63に記載の方法。
- 老化防止レジメンは逆転写酵素阻害剤の投与を含む、請求項63に記載の方法。
- 老化防止レジメンはレトロウイルス阻害剤の投与を含む、請求項63に記載の方法。
- 老化防止レジメンはHIV阻害剤の投与を含む、請求項63に記載の方法。
- 老化防止レジメンはAZTの投与を含む、請求項63に記載の方法。
- 老化防止レジメンはHBV阻害剤の投与を含む、請求項63に記載の方法。
- 老化防止レジメンはリバビリンの投与を含む、請求項63に記載の方法。
- 老化防止レジメンはトランスポサーゼ阻害剤の投与を含む、請求項63に記載の方法。
- 第1の核酸サンプルおよび第2の核酸サンプルを比較する方法であって、該方法は、
前記第1の核酸サンプルの複数のMEI境界に対する可動要素挿入物(MEI)の境界配列を取得する工程;
前記第2の核酸サンプル中の前記複数のMEI境界の存在を分析する工程;
および、前記第2の核酸サンプルが、前記第1の核酸サンプル中に存在するMEI境界配列を欠いている場合に、前記第1の核酸サンプルと異なるものとして前記第2の核酸サンプルを同定する工程、
を含むことを特徴とする方法。 - 前記第2の核酸サンプルが、前記第1の核酸サンプル中には存在しないMEI境界配列を含む場合に、前記第1の核酸サンプルと異なるものとして前記第2の核酸サンプルを同定する工程を含む、請求項74に記載の方法。
- 前記第1の核酸サンプルの複数のMEI境界に対する可動要素挿入物(MEI)の境界配列を取得する工程は、前記第1の核酸サンプルの全ゲノム配列決定を実行する工程を含む、請求項74に記載の方法。
- 前記第1の核酸サンプルの複数のMEI境界に対する可動要素挿入物(MEI)の境界配列を取得する工程は、前記第1の核酸サンプルの前記複数のMEI境界の標的とされた配列決定を実行する工程を含む、請求項74に記載の方法。
- 前記第2の核酸サンプル中の前記複数のMEI境界の存在を分析する工程は、前記第2の核酸サンプルの全ゲノム配列決定を実行する工程を含む、請求項74‐77のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第2の核酸サンプル中の前記複数のMEI境界の存在を分析する工程は、前記第2の核酸サンプルの前記複数のMEI境界の標的とされた配列決定を実行する工程を含む、請求項74‐77のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第2の核酸サンプルの前記複数のMEI境界の標的とされた配列決定を実行する工程は、前記第1の核酸サンプルの各MEI挿入部位を特異的に増殖させるプライマを含むプライマのパネルに、前記第2の核酸サンプルを接触させる工程を含む、請求項79に記載の方法。
- 前記第2の核酸サンプルの前記複数のMEI境界の標的とされた配列決定を実行する工程は、前記第1の核酸サンプルの各MEI挿入部位に対し特異的にアニールするプローブを含むプローブのパネルに、前記第2の核酸サンプルを接触させる工程を含む、請求項79のいずれか1項に記載の方法。
- プローブのパネルは、基質に結合されたプローブが基質に結合されていないプローブに対し差分的に視覚化可能であるように蛍光体へ結合された、少なくとも1つのプローブを含む、請求項81に記載の方法。
- 前記第2のサンプルが法医学のサンプルを含む、請求項74−82のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第2のサンプルが植物サンプルを含む、請求項74−82のいずれか1項に記載の方法。
- 前記植物サンプルは植物収穫物サンプルである、請求項84に記載の方法。
- 前記第2のサンプルは生物学的に危険な物質を含む、請求項74−82に記載の方法。
- 老化関連のゲノムの劣化の遅延に使用される組成物であって、該組成物は、可動要素挿入物を阻害する薬剤を含むことを特徴とする組成物。
- 前記組成物は逆転写酵素阻害剤を含む、請求項87に記載の組成物。
- 前記組成剤はレトロウイルス阻害剤を含む、請求項87に記載の組成物。
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