JP2017221139A - 微生物凝集体のアレイ群生成装置および微生物凝集体のアレイ群の生成方法 - Google Patents

Abstract

【課題】基板上の望みの位置に微生物を整列配置させる微生物凝集体のアレイ群生成装置の提供。【解決手段】転写元基板上に並行整列した状態で固定された直鎖水溶性高分子と、当該直鎖水溶性高分子のセグメントを繋いで形成されたフィラメントを有すると共に、この直鎖水溶性高分子の内部に形成された微生物を内包する微生物アレイと、を備える微生物凝集体のアレイ群生成装置であって、前記転写元基板の微生物アレイ固定面を転写先基板と密着させて、前記微生物アレイを前記転写先基板に転写するように構成される、微生物凝集体のアレイ群生成装置。前記直鎖水溶性高分子は、ＤＮＡ、ポリペプチド、リボ核酸（ＲＮＡ）、アミロース、アクチンフィラメント、糖鎖、ポリペプチド、ポリアニリン、ポリピロール、ポリチオフェン、カーボンナノチューブ、ポリ−Ｌ−リジンから選ばれた少なくとも一種類の化合物からなるアレイ群生成装置。【選択図】図１

Description

本発明は、基板上の望みの位置に微生物を整列配置させる微生物凝集体のアレイ群生成装置および微生物凝集体のアレイ群の生成方法に関する。

研究および病院施設では、異なる種類の微生物1菌体あるいはコロニーを個別に認識することで、簡便で迅速なスクリーニング用途（微生物を用いるバイオアッセイ全般）に用いる微生物凝集体のアレイ群生成装置が望まれている。
ところで、現在の臨床分野での用途としては、細胞培養や組織培養が主流であるため、大量培養する技術が従来より提案されている。例えば、幹細胞治療では、患者の体内から幹細胞を抽出し、培養して数を増やす必要がある。そして、次の段階では、培養された幹細胞を点滴や注射器を使って患者の体に戻している。投与された幹細胞は患部に到達すると傷ついた組織を再生し、血管障害や腎臓病などに効果を発揮する。また、炎症やアレルギーを抑える物質を出すことで、ぜんそくなどの病気を改善する。そこで、幹細胞を大量培養することが必要であり、例えば特許文献１では、細胞培養基材として、コラーゲンやゼラチン等を含むナノファイバが提案されている。
しかし、この細胞培養の培養方法を微生物の培養に適用する場合には、微生物を1菌体あるいはコロニーとしてパターニングをする事はできず、小規模なパターニングには適していないという課題があった。

他方で、チャンバーに複数の窪み部を設け、ガラス基板により形成された空間部に多数の細胞検体を同時に検出して、異物排出活性検出を行うことが特許文献２で提案されている。この異物排出活性検出は、細菌の全ゲノム配列が判ってきた現在において、異物排出遺伝子の同定や異物排出タンパク質の阻害剤のスクリーニングに用いられている。
また、簡便且つ迅速に、抗菌薬に対する細菌または真菌の感受性を検査できる検査システムが特許文献３で提案されている。この検査システムを臨床検査に適用する場合は、対象となる細菌および真菌について、適切な抗菌薬の選択が早期に可能となるため、救命率の向上、不要な薬剤使用量の減少等の効果が期待でき、長期的に見れば、耐性菌の増加を抑制できる可能性がある。
しかし、特許文献２、３で提案されている検査システムを微生物の培養に適用する場合には、微生物を1菌体あるいはコロニーとしてパターニングをする事はできず、小規模なパターニングには適していないという課題があった。

例えば特許文献４や非特許文献１では、インクジェット印刷技術などを用いた微生物アレイの作製方法が提案されている。この微生物アレイの作製方法は、微生物分散液をインクジェットプリンターのインクタンクにインクの代わりに入れ、微生物分散液の液滴を基板上に噴射することで基板上に直接微生物を配置するものである。この作製方法を用いた場合、液滴吐出ヘッドの流路や吐出口における細胞の詰まり、操作過程において他の微生物が混ざるコンタミネーションの危険性、インクタンクなどの滴下溶液供給部に微生物を設置した状態での長期保存の困難さ、など多くの課題がある。

非特許文献２、３では、マイクロドロプレット法そしてマイクロコンタクトプリンティング法を用いた微生物アレイの作製方法が提案されている。しかし、当該微生物アレイの作製方法によると、少なくともリソグラフィ技術を用いて微細パターンを作る必要があり、製造設備が複雑化する。そこで、生産量が大量になる用途には適しているが、大量生産が見込めない用途では、もっと簡便な作製方法が望まれている。

ＷＯ２０１４／１９６５４９ 特開２００８−１０９８８３ ＷＯ２０１３／０３８９２５ 特開２００９−１３１２４０ 特開２０１０−０３６２９２

Bacterial Printing Press that Regenerates Its Ink: Contact-Printing Bacteria Using Hydrogel Stamps Langmuir 2005, 21, 6436-6442 Bacterial Printing Press that Regenerates Its Ink: Contact-Printing Bacteria Using Hydrogel Stamps, Langmuir 2005, 21, 6436-6442 Design of a large-scale femtoliter droplet array for single-cell analysis of drug-tolerant and drug-resistant bacteria, Frontiers in microbiology doi: 10.3389/fmicb.2013.00300

本発明は、上記の課題を解決したもので、基板上の望みの位置に微生物を整列配置させる微生物凝集体のアレイ群生成装置および微生物凝集体のアレイ群の生成方法を提供することを目的とする。

本発明の微生物凝集体のアレイ群生成装置は、転写元基板上に並行整列した状態で固定された直鎖水溶性高分子と、当該直鎖水溶性高分子のセグメントを繋いで形成されたフィラメントを有すると共に、この直鎖水溶性高分子の内部に形成された微生物を内包する微生物アレイと、を備える微生物凝集体のアレイ群生成装置であって、前記転写元基板の微生物アレイ固定面を転写先基板と密着させて、前記微生物アレイを前記転写先基板に転写するように構成されたことを特徴とする。

本発明の微生物凝集体のアレイ群生成装置において、好ましくは、直鎖水溶性高分子は、ＤＮＡ、ポリペプチド、リボ核酸（ＲＮＡ）、アミロース、アクチンフィラメント、糖鎖、ポリペプチド、ポリアニリン、ポリピロール、ポリチオフェン、カーボンナノチューブ、ポリ−Ｌ−リジンからなる群から選ばれた少なくとも一種類の化合物からなるとよい。
本発明の微生物凝集体のアレイ群生成装置において、好ましくは、前記直鎖水溶性高分子がＤＮＡの場合は、当該ＤＮＡがＹＯＹＯ−１、アクリジンオレンジ、ビオチン、ＤＮＡ結合タンパク質、金属コロイド、半導体コロイドからなる群から選ばれた少なくとも一種類の分子で修飾されているとよい。

本発明の微生物凝集体のアレイ群生成装置において、好ましくは、直鎖水溶性高分子がＤＮＡ、ポリペプチド、リボ核酸（ＲＮＡ）からなる群から選ばれた少なくとも一種類の直鎖水溶性高分子の場合は、当該ＤＮＡ、ポリペプチド、リボ核酸（ＲＮＡ）の何れかを修飾する分子としては、アミロース、アクチンフィラメント、糖鎖、ポリペプチド、ポリアニリン、ポリピロール、ポリチオフェン、カーボンナノチューブ、ポリ−Ｌ−リジンからなる群から選ばれた少なくとも一種類の分子で修飾されているとよい。

本発明の微生物アレイの転写方法は、転写元基板上に並行整列した状態で固定された直鎖水溶性高分子を準備する工程と、当該直鎖水溶性高分子のセグメントを繋いで、フィラメントを形成させると共に、この直鎖水溶性高分子の内部に形成された微生物を内包する微生物アレイを準備する工程と、前記転写元基板の微生物アレイ固定面を前記転写先基板と密着させて、当該微生物アレイを前記転写先基板に転写する工程とを含むことを特徴とする。

本発明の微生物アレイの転写方法において、好ましくは、前記転写元基板は複数準備され、前記転写元基板毎に固有の直鎖水溶性高分子の配置と、当該直鎖水溶性高分子に内包された微生物アレイの配置を有し、前記転写元基板の一つを選択し、当該選択された転写元基板の微生物アレイ固定面を転写先基板と密着させて、当該微生物アレイを前記転写先基板に転写する工程とを含むことを特徴とする。

本発明の微生物凝集体のアレイ群生成装置によれば、水溶性生体高分子のＤＮＡナノファイバ中に内包される微生物は十分に保湿され、ＤＮＡナノファイバが整列固定（アレイ）される際に1個から十数個の塊としてＤＮＡナノファイバに沿って基板表面に固定される。これによれば、特別な機械装置を用いることなく、幅数μｍ、長さ1ｍｍ以上にわたり、微生物1個から十数個の凝集体がアレイ化された基板が３０分程度で完成する。
また、本発明の微生物凝集体のアレイ群生成装置によれば、作製される微生物アレイが他の基板表面に写し取る（転写印刷）ことが可能であり、転写印刷の繰り返しで同種または異種微生物アレイの集積化が可能である。微生物凝集体のアレイ群の生成方法では、作製される微生物アレイにおいて、同種の微生物コロニーは一方向のＤＮＡナノファイバラインに沿って配列するので、ラインの方向や長さを変えパターン化することで、異なる種類の微生物1菌体あるいはコロニーを個別に認識する用途に適している。本発明は小規模なパターニングに適するため、使用者が目的に応じて異種の微生物アレイのパターンを1チップに用意できる。またチップ自体は高価な材料を使用しないため、使い捨てが可能である。

本発明の一実施例を示す微生物アレイの顕微鏡写真で、（Ａ）は明視野光学顕微鏡像、（Ｂ）は蛍光顕微鏡像を示している。 図１の微生物アレイの拡大顕微鏡写真で、（Ａ）は明視野光学顕微鏡像、（Ｂ）は蛍光顕微鏡像を示している。 本発明の一実施例を示す微生物アレイの２次元パターンの顕微鏡写真である。 本発明の一実施例を示す微生物アレイの電子顕微鏡写真である。 図４の微生物アレイの拡大電子顕微鏡写真である。 本発明の一実施例を示す微生物アレイの蛍光顕微鏡写真である。 ＤＮＡナノファイバに内包された微生物の模式図である。 溶媒蒸発によるＤＮＡナノファイバの作製と、そのアレイ化方法を示す模式図である。

直鎖高分子としてＤＮＡに限定されないが、ポリペプチド、リボ核酸（ＲＮＡ）、アミロース、アクチンフィラメント、糖鎖などがあげられる。また生理活性を持つ分子（ポリペプチドなど）、導電性を持つ分子（例えば、ポリアニリン、ポリピロール、ポリチオフェン、カーボンナノチューブなど）、光学活性を持つ分子（ポリ−Ｌ−リジンなど）などの特定の機能をもつ分子を用いてもよい。
直鎖高分子は別種の分子で修飾されていてもよい。別種の分子としては特に限定されないが、ＤＮＡを修飾する分子としてＹＯＹＯ−１、アクリジンオレンジ、ビオチン、ＤＮＡ結合タンパク質、金属コロイド、半導体コロイドなどがあげられる。また別種分子としては、生理活性を持つ分子（例えば、アミロース、アミノペクチンなど）、導電性を持つ分子（ポリアニリン、ポリピロール、ポリチオフェン、カーボンナノチューブなど）、光学活性を持つ分子（ポリ−Ｌ−リジンなど）などの特定の機能を持つ分子を用いてもよい。

並行整列した状態での分子の固定は分子の種類に応じて行う。例えば、固定する分子がＤＮＡの場合、ＤＮＡを保護するための緩衝役（水溶液）中に懸濁し、この懸濁液とエタノールの混合液を基板上に滴下し拡げればよい。基板上に拡がった混合液中に含まれるＤＮＡは混合液中のエタノールの蒸発に伴い、気液界面移動が生じ基板表面上に伸張された状態で固定される。またこの時いく本かのＤＮＡは一つに束ねられ、数百μｍの長さとなる。溶液中のＤＮＡ濃度は０．１から１００ｎｇ／μＬであるが、下限値未満では長いナノワイヤができない。上限値を越えるとワイヤの並行整列が起こらない。

そこで好ましくは３〜１０ｎｇ／μＬ程度が適当であり、特に好ましくは４〜５ｎｇ／μＬ程度が適当である。滴下する混合液の量はＤＮＡ懸濁液1に対して４倍体積以上のエタノールを含むが、ＤＮＡ懸濁液は１μＬとエタノール４μＬで合わせて５μＬ程度が適当である。またエタノール以外の溶媒（例えば、テトラヒドロフラン、アセトン、イソプロパノール）を使用してもよい。ＤＮＡ以外の分子についても、上記に準じた方法により基板上に固定することができる。
上記のような各種の直鎖高分子及びその表面修飾分子においても、濃度を調整することでＤＮＡと同様な現象が予想できる。

同一基板上への固定は複数回繰り返すことができる。これにより、同一基板上に固定されるＤＮＡの密度の制御が可能である。また別の直鎖高分子を上記方法で固定することで異なる直鎖高分子を段階的に固定することが可能である。
基板表面に固定されたＤＮＡは別基板に転写させることができる。転写元基板および転写先基板は特に限定されないが、一方の基板は分子固定面を密着させるために必要な表面の柔軟性を有し、かつ化学反応性が低い基板が適当である。例えば転写基板としてポリジメチルシロキサンまたはポリジメチルシランを基材としたシリコーンゴムを用いた場合には、転写先基板としてガラス、シリコンウェハを用いる。転写元基板には、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）またはポリジメチルシランを基材としたシリコーンゴムを用いると良い。
転写先基板には、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）またはポリジメチルシランを基材としたシリコーンゴムよりも、ナノワイヤに対して強い相互作用を有する基板材料を用いると良く、例えばガラス、雲母、シリコンウェハ、グラファイト等が用いられる。

図８は、溶媒蒸発によるＤＮＡナノファイバの作製と、そのアレイ化方法を示す模式図で、（Ａ）はスライドガラス、（Ｂ）は転写元基板の拡大図、（Ｃ）は転写元基板での溶媒蒸発による界面移動を説明する高さ方向の断面図である。ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）シートを適当な大きさにカット（例えば２ｍｍ×８ｍｍ程度）し、これを転写元基板とした。この基板をスライドガラスに固定し、λファージＤＮＡ溶液（濃度４．５ｎｇ／μＬ）１μＬとエタノール溶液５μＬの混合溶液を滴下し、スライドガラスごと傾け放置した。このとき溶液中の溶媒が蒸発することで気液界面の移動が生じて溶液中のＤＮＡは一次元集合し、移動方向に対して並行に基板表面に固定された。ここで、一次元集合とは、直鎖水溶性高分子のセグメントを繋いで、長いフィラメントを形成させることをいう。長いフィラメントとは、フィラメントの径（例えば０．１〜２μｍ）と比較して、５００倍乃至１０００倍程度以上の長さを有する場合をいう。

次に転写先基板としてカバーガラス（２４ｍｍ×３６ｍｍ、厚さ０．１７ｍｍ）上に、転写面を対向させて転写元基板を静かに置いた。転写先基板としてはカバーガラスの他に雲母、石英ガラス、シリコンウェハ、寒天プレートも使用できる。このとき空気が転写元基板と転写先基板との間に残らないよう、両者が密着するように置いた。およそ３０分間静置した後、転写元基板をカバーガラスから静かにはがして、整列固定された一次元集合ＤＮＡの転写が完了した。顕微鏡を用いて転写前と転写後のサンプルを観察し、表面に固定されているワイヤの形状は同じであった。

上記カバーガラスの対向方向を一次元集合した方向に対して角度を変えて同様の操作を再度行うことで、交差した状態で整列配置した一次元集合ＤＮＡのパターンを得ることができることを蛍光顕微鏡および暗視野光学顕微鏡観察により確認した
図１は、本発明の一実施例を示す微生物アレイの顕微鏡写真で、（Ａ）は明視野光学顕微鏡像、（Ｂ）は蛍光顕微鏡像を示している。図２は、図１の微生物アレイの拡大顕微鏡写真で、（Ａ）は明視野光学顕微鏡像、（Ｂ）は蛍光顕微鏡像を示している。
ＤＮＡ（ナノファイバ）の存在が確認できないが、（Ｂ）は蛍光顕微鏡像では実態が観察できる。このことからＤＮＡナノファイバにそって微生物のコロニーが整列している事が分かる。また、エレクトロスピニング法（非特許文献１、２）を用いて、基板表面に微生物含有ＤＮＡナノファイバを無秩序に固定し作製することもできる。

図３は、本発明の一実施例を示す微生物アレイの２次元パターンの顕微鏡写真である。カバーガラスの対向方向を一次元集合した方向に対して角度を変えて同様の操作を再度行うことで、交差した状態で整列配置した微生物アレイのパターンを得ることができることを顕微鏡より確認した。
図４は、本発明の一実施例を示す微生物アレイの電子顕微鏡写真である。図５は、図４の微生物アレイの拡大電子顕微鏡写真である。

図６は、本発明の一実施例を示す微生物アレイの蛍光顕微鏡写真である。図６の電子顕微鏡写真の微生物の塊において、個々の微生物の境界は確認できないが、蛍光顕微鏡写真において個々の微生物は確認できる。この事からアレイ上の微生物は薄い膜（光は透過する絶縁体の膜（ＤＮＡ））で覆われていることが分かる。

図７は、ＤＮＡナノファイバに内包された微生物の模式図である。したがって本技術により作製される微生物アレイは微生物を内包したＤＮＡナノファイバの平行整列により構成される。さらに水溶性高分子であるＤＮＡは微生物の乾燥を防ぐ効果がある。

直鎖水溶性高分子をファイバ状にして基板表面上に固定できれば、いかなる方法を用いても良い。例えば、エレクトロスピニング法（例えば特開２００６−３１２７９４号参照）を用いれば、微生物を内包した直鎖水溶性高分子ナノファイバを無秩序に基板表面に固定できる。

一方で特許文献３に開示された発明を用いれば、並行整列した状態で一本一本の直鎖水溶性高分子のナノファイバを基板表面に固定できる。また同一基板上への固定は複数回繰り返すことができる。これにより、同一基板上に固定されるナノファイバの密度の制御が可能である。

本発明の微生物凝集体のアレイ群生成装置および微生物凝集体のアレイ群の生成方法は、以上説明した実施例に限定されるものではなく、各種の変形実施例が可能である。例えば、異なる代謝機能を持った微生物コロニーを同一基板上の特定位置・方向に配置する事で、異種微生物によるマイクロリアクタとセンサ部位を構築する用途に用いても良い。また同一基板上に異なる種類の微生物コロニーアレイをパターニングできれば、異種微生物コロニー間の情報伝達の様子を直接観察する用途に用いても良い。

本発明の微生物アレイは、研究および病院施設での簡便で迅速なスクリーニング用途（微生物を用いるバイオアッセイ全般）に適している。即ち、本発明の微生物アレイにおいて、同種の微生物コロニーは一方向のＤＮＡナノファイバラインに沿って配列するので、ラインの方向や長さを変えパターン化することで、より複雑なナノファイバパターンを作製でき、異なる種類の微生物1菌体あるいはコロニーを個別に認識する用途に適している。

Claims (7)

1. 転写元基板上に並行整列した状態で固定された直鎖水溶性高分子と、
   当該直鎖水溶性高分子のセグメントを繋いで形成されたフィラメントを有すると共に、この直鎖水溶性高分子の内部に形成された微生物を内包する微生物アレイと、
   を備える微生物凝集体のアレイ群生成装置であって、
   前記転写元基板の微生物アレイ固定面を転写先基板と密着させて、前記微生物アレイを前記転写先基板に転写するように構成されたことを特徴とする微生物凝集体のアレイ群生成装置。
2. 前記直鎖水溶性高分子は、ＤＮＡ、ポリペプチド、リボ核酸（ＲＮＡ）、アミロース、アクチンフィラメント、糖鎖、ポリペプチド、ポリアニリン、ポリピロール、ポリチオフェン、カーボンナノチューブ、ポリ−Ｌ−リジンからなる群から選ばれた少なくとも一種類の化合物からなることを特徴とする請求項１に記載の微生物凝集体のアレイ群生成装置。
3. 前記直鎖水溶性高分子がＤＮＡの場合は、当該ＤＮＡがＹＯＹＯ−１、アクリジンオレンジ、ビオチン、ＤＮＡ結合タンパク質、金属コロイド、半導体コロイドからなる群から選ばれた少なくとも一種類の分子で修飾されていることを特徴とする請求項２に記載の微生物凝集体のアレイ群生成装置。
4. 前記直鎖水溶性高分子がＤＮＡ、ポリペプチド、リボ核酸（ＲＮＡ）からなる群から選ばれた少なくとも一種類の直鎖水溶性高分子の場合は、当該ＤＮＡ、ポリペプチド、リボ核酸（ＲＮＡ）の何れかを修飾する分子としては、アミロース、アクチンフィラメント、糖鎖、ポリペプチド、ポリアニリン、ポリピロール、ポリチオフェン、カーボンナノチューブ、ポリ−Ｌ−リジンからなる群から選ばれた少なくとも一種類の分子で修飾されていることを特徴とする請求項２に記載の微生物凝集体のアレイ群生成装置。
5. 転写元基板上に並行整列した状態で固定された直鎖水溶性高分子を準備する工程と、
   当該直鎖水溶性高分子のセグメントを繋いで、フィラメントを形成させると共に、この直鎖水溶性高分子の内部に形成された微生物を内包する微生物アレイを準備する工程と、
   前記転写元基板の微生物アレイ固定面を前記転写先基板と密着させて、当該微生物アレイを前記転写先基板に転写する工程と、
   を含むことを特徴とする微生物アレイの転写方法。
6. 前記転写元基板は複数準備され、前記転写元基板毎に固有の直鎖水溶性高分子の配置と、当該直鎖水溶性高分子に内包された微生物アレイの配置を有し、
   前記転写元基板の一つを選択し、当該選択された転写元基板の微生物アレイ固定面を転写先基板と密着させて、当該微生物アレイを前記転写先基板に転写する工程と、
   を含むことを特徴とする請求項５に記載の微生物アレイの転写方法。
7. 前記転写元基板はポリジメチルシロキサンまたはポリジメチルシランを基材としたシリコーンゴムを用いており、
   前記転写先基板はてガラス、シリコンウェハ、または寒天プレートの一種類であることを特徴とする請求項５又は６に記載の微生物アレイの転写方法。