JP2017129545A - フローセル、粒子分析装置および粒子分析方法 - Google Patents

Abstract

【課題】チャンバ内の汚染および気泡が血球計数の精度に影響を及ぼすことを防止または抑制できるフローセルおよびそれを使用した粒子分析装置ならびに粒子分析方法を提供する。
【解決手段】フローセル２００は、第一の層２１０と、第二の層２２０と、第三の層２３０と、を有する。第一の層２１０は、第一の流路２１１および第一の電極２１６を有する。第二の層２２０は、第二の流路２２１および第二の電極２２４を有する。第三の層２３０は、第一の層２１０と第二の層２２０との間に形成され、第一の流路２１１と第二の流路２２１とを連通する第一の連通孔２３１を有する。第一の電極２１６は、第一の連通孔２３１に関して第一の流路２１１にサンプルが供給される側と反対側の第一の流路２１１に設置される。第二の電極２２４は、第一の連通孔２３１に関して第二の流路２２１から流体が排出される側と反対側の第二の流路２２１に設置される。
【選択図】図２

Description

本発明は、フローセル、粒子分析装置および粒子分析方法に関する。

医療現場において、医療従事者が被検者（患者）の血液検査を迅速に実施できる小型の血液検査装置が望まれている。血液検査装置が小型化されて可搬性が高まることにより、一般の病院、診療所などの医療機関において、多くの患者の血液検査を迅速に実施できることが期待される。とくに、血液検査のうち、血液中に含まれる赤血球、白血球、血小板などの血球を計数する検査は、医療機関において頻繁に実施されている検査であるため、小型の血球計数装置の開発が重要になってきている。

このような血球計数装置のうち、たとえば電気抵抗式の血球計数装置では、血球計数センサ部のチャンバに患者の血液サンプルを導入し、血球が検知孔（アパーチャ）を通過する際の電気抵抗の変化に基づいて、血球を計数する。ところが、従来の血球計数装置では、血液サンプルがチャンバ内を汚染したり、検知孔付近に貯留した気泡が上記電気抵抗を変化させたりするため血球計数の精度に影響を及ぼすおそれがある。

これに関連して、チャンバ内の汚染および気泡が血球計数の精度に影響を及ぼすことを回避するため、血球計数センサ部をディスポーザブル（使い捨て）とする技術が開発されている（たとえば、下記特許文献１）。しかし、このような血球計数装置は、血球計数センサ部を構成する部品が高価であるため、実用化が困難であるという問題がある。

特開２００２−２７７３８０号公報

本発明は、上述した問題を解決するためになされたものである。したがって、本発明の目的は、チャンバ内の汚染および気泡が血球計数の精度に影響を及ぼすことを防止または抑制できるフローセル、粒子分析装置および粒子分析方法を提供することである。

本発明の上記目的は、下記によって達成される。

フローセルは、第一の層と、第二の層と、第三の層と、を有する。第一の層は、第一の流路および第一の電極を有する。第二の層は、第二の流路および第二の電極を有する。第三の層は、第一の層と第二の層との間に形成され、第一の流路と第二の流路とを連通する第一の連通孔を有する。第一の電極は、第一の連通孔に関して第一の流路にサンプルが供給される側と反対側の第一の流路に設置される。第二の電極は、第一の連通孔に関して第二の流路から流体が排出される側と反対側の第二の流路に設置される。

また、粒子分析装置は、フローセルと、サンプル供給部と、分析部と、を有する。流体注入部は、第一の流路に被計数粒子を含む流体を注入する。分析部は、第一の電極および第二の電極に接続され、第一の電極と第二の電極との間の抵抗値に基づいて被計数粒子を分析する。

また、粒子分析方法は、第一の層の第一の流路の一端からシース液を供給し、他端から排出するステップ（ａ）と、第二の層の第二の流路の一端からシース液を供給し、他端から排出するステップ（ｂ）と、シース液が排出される側において第一の流路を閉鎖し、シース液が供給される側において第二の流路を閉鎖し、第一の流路にシース液を供給し、第一の連通孔を通じて、第二の流路から排出するステップ（ｃ）と、シース液が供給される側において第一の流路に流体を注入し、第一の連通孔を通過する当該流体に含まれる粒子を計数するステップ（ｄ）と、を有する。第一の連通孔は、第一の層と第二の層との間の第三の層に形成され、第一の流路と第二の流路とを連通する。

本発明によれば、フローセルにおいてサンプルがシース液に包まれた状態で流れ、検知孔を通過する。また、電極付近をサンプルが流れないので、サンプルによって電極が汚染されない。また、粒子の計測時に電極付近をサンプルおよびシース液が流れないので、電極に付着した気泡が流れによって剥離されず、血球パルスの基線を変動させることを防止できる。したがって、フローセルの流路内の汚染および気泡が血球計数の精度に影響を及ぼすことを防止または抑制できる。

本発明の第一の実施形態に係る粒子分析装置の概略構成を示すブロック図。 図１に示すフローセルの構成を示す分解斜視図。 本発明の第一の実施形態に係る粒子分析方法の一例を示すフローチャート。 図３に示すフローチャートの各ステップに対応する動作を示す模式図。 図４Ａに後続する模式図。 図４Ｂに後続する模式図。 図４Ｃに後続する模式図。 図４Ｄに後続する模式図。 図４Ｅに後続する模式図。 図４Ｆに後続する模式図。 図２のＡ方向から見た場合のサンプル注入部付近におけるサンプル流およびシース流について例示する模式図。 図２のＡ方向から見た場合の検知孔付近のサンプル流およびシース流を示す模式図。 図５のＷ方向から見た場合の検知孔付近のサンプル流およびシース流を示す模式図。 本発明の第一の実施形態の一変形例を示す模式図。 本発明の第二の実施形態に係るフローセルの動作を例示する模式図。 図８Ａに後続する模式図。 図８Ｂに後続する模式図。 本発明の第三の実施形態に係るフローセルの動作を例示する模式図。 図９Ａに後続する模式図。 図９Ｂに後続する模式図。

以下、添付した図面を参照して本発明のフローセル、粒子分析装置および粒子分析方法の実施形態を説明する。なお、図中、同一の部材には同一の符号を用いた。また、図面の寸法比率は、説明の都合上誇張されており、実際の比率とは異なる場合がある。

（第一の実施形態）
図１は、本発明の第一の実施形態に係る粒子分析装置１００の概略構成を示すブロック図である。粒子分析装置１００は、サンプルに含まれる粒子を分析する装置である。以下では、血液サンプルに含まれる血球数を計測する場合（血球計数）を例示して説明する。

＜粒子分析装置１００の構成＞
図１に示すように、粒子分析装置１００は、フローセル２００、サンプル供給部３００、シース液供給部４００、廃液回収部５００、分析部６００、表示部７００、電源部８００および制御部９００を有する。

フローセル２００は、血液サンプルに含まれる各々の血球の大きさに関する情報を抵抗値として分析部６００へ出力する。より具体的には、フローセル２００は一対の電極を有し、当該一対の電極間の抵抗値は、フローセル２００に供給された血液サンプルに含まれる各々の血球の大きさに応じて変化する。フローセル２００の構成の詳細については後述する。

サンプル供給部３００は、血液サンプルをフローセル２００に供給する。サンプル供給部３００は、サンプル容器３１０、配管３２１，３２２、サンプル供給弁３３０およびサンプルポンプ３４０を有する。サンプル容器３１０は、血液サンプルを保持するための容器であり、サンプル供給弁３３０を介して、配管３２１によってフローセル２００に接続されている。また、サンプル容器３１０は、サンプル供給弁３３０を介して、配管３２２によって廃液回収部５００にも接続されている。配管３２２は、たとえばサンプル容器３１０の不要になった血液サンプルを直接的に廃液回収部５００へ排出する場合などに使用される。血液サンプルは、患者から採取した血液を希釈液で計数に適した倍率に希釈した液体、および溶血した血液である。

サンプル供給弁３３０は、たとえばピンチバルブであり、サンプル容器３１０とフローセル２００との間に設置され、制御部９００の指示に従って弁を開閉する。サンプル供給弁３３０が開いているとき、サンプル容器３１０からフローセル２００および廃液回収部５００へ血液サンプルが供給される。一方、サンプル供給弁３３０が閉じているとき、サンプル容器３１０からフローセル２００および廃液回収部５００への血液サンプルの供給が遮断される。したがって、制御部９００は、サンプル容器３１０からフローセル２００および廃液回収部５００へ血液サンプルを供給するタイミングを調整することができる。

サンプルポンプ３４０（例えば、シリンジポンプ）は、配管３２１の血液サンプルに対して圧力を加える。サンプルポンプ３４０は、シース液供給部４００および配管３２１に接続されている。サンプルポンプ３４０は、制御部９００の指示に従って、シース液供給部４００からシース液を導入するとともに、配管３２１に対してシース液を排出し、配管３２１の血液サンプルに対して所定の圧力を加える。したがって、制御部９００は、サンプル容器３１０からフローセル２００へ血液サンプルを供給する量を調整することができる。なお、シース液供給部４００からサンプルポンプ３４０にシース液を導入する代わりに、別途、希釈液をサンプルポンプ３４０に供給する構成としてもよい。

シース液供給部４００は、シース液をフローセル２００に供給する。シース液供給部４００は、シース液容器４１０、配管４２１、第一供給弁４３１および第二供給弁４３２を有する。

シース液容器４１０は、シース液（たとえば生理的食塩水など）を保持する。第一供給弁４３１は、シース液容器４１０のシース液の供給先をサンプルポンプ３４０およびフローセル２００のいずれかに切り替える。第二供給弁４３２は、シース液の供給先を配管４２２および配管４２３のいずれかに切り替える。後述するように、配管４２２および配管４２３は、フローセル２００のシース液注入部に接続されている。第一供給弁４３１および第二供給弁４３２は、たとえば３方向電磁弁であり、制御部９００によって制御される。

廃液回収部５００は、フローセル２００からの廃液を回収する。廃液回収部５００は、廃液回収容器５１０、吸引ポンプ５２０、第一回収弁５３１および第二回収弁５３２を有する。

廃液回収容器５１０は、フローセル２００からの廃液を貯留するための容器である。吸引ポンプ５２０は、廃液回収容器５１０の内容物を吸引する。吸引ポンプ５２０は、廃液回収容器５１０の内容物を吸引することにより、廃液回収容器５１０内を大気圧に対して陰圧にする。廃液回収容器５１０内を大気圧に対して陰圧にすることにより、大気圧のシース液供給部４００のシース液がフローセル２００へ引き込まれて供給される。このような陰圧駆動の粒子分析装置では、陽圧駆動に比べて部品の数を削減できるので、コストを抑制できる。

第一回収弁５３１は、サンプル供給部３００の配管３２２から供給される血液サンプルおよびフローセル２００からの廃液のいずれかを選択し、廃液回収容器５１０に排出する。また、第二回収弁５３２は、配管５２１および配管５２２のいずれかを選択し、フローセル２００からの廃液を第一回収弁５３１に排出する。後述するように、配管５２１および配管５２２は、フローセル２００の排出部に接続されている。第一回収弁５３１および第二回収弁５３２は、たとえば３方向電磁弁であり、制御部９００によって制御される。

分析部６００は、血液サンプルに含まれる血球を計数する。分析部６００は、定電流源および電圧計を備え、電気抵抗法に基づいて血液サンプルに含まれる特定の血球を計数する。分析部６００は、フローセル２００の上記一対の電極間に定電流を流し、血球が検知孔を通過したときの抵抗値の変化に応じた電圧パルス（以下、「血球パルス」とも書く）を取得する。血球パルスの波高値は、血球の体積に比例することが知られている。分析部６００は、特定の血球に対応する所定の波高値の血球パルス数を計測し、血液サンプルに含まれる特定の血球の数を算出する。上記特定の血球は、たとえば赤血球、血小板および白血球である。

また、分析部６００は、赤血球、白血球、血小板以外の測定項目、たとえばヘモグロビン濃度（ＨＧＢ）、ヘマトクリット値（ＨＣＴ）、平均赤血球容積（ＭＣＶ）、平均赤血球ヘモグロビン量（ＭＣＨ）、リンパ球パーセント（ＬＹ％）、単球パーセント（ＭＯ％）、顆粒球パーセント（ＧＲ％）、リンパ球（ＬＹ）、単球（ＭＯ）、顆粒球（ＧＲ）についても計測可能に構成されている。

表示部７００は、ディスプレイを備え、分析部６００により算出された血球の数を当該ディスプレイに表示する。

電源部８００は、サンプル供給部３００、シース液供給部４００、廃液回収部５００、分析部６００、表示部７００および制御部９００に電源を供給する。

制御部９００は、サンプル供給部３００、シース液供給部４００、廃液回収部５００、分析部６００、表示部７００および電源部８００を制御する。制御部９００は、演算処理部および記憶部を有する。演算制御部は、記憶部に記憶されている制御プログラムを実行する。制御プログラムは、粒子分析装置１００に粒子分析方法を実行させるように構成されている。粒子分析方法については後述する。

＜フローセル２００の構成＞
図２は、図１に示すフローセル２００の構成を示す分解斜視図である。フローセル２００は、第一の層２１０、第二の層２２０および第三の層２３０を有する。図２において、Ａ方向から見える面を上面、Ａ方向と反対方向から見える面を下面と定義する。フローセル２００は、たとえば３枚の板状の樹脂に各々流路となる凹部、孔などのパターンを形成し、積層して貼り合せることにより作製されうる。パターン形成には、エッチング加工、レーザー加工など公知の技術を使用できる。このように、フローセル２００は、簡単な積層構造を有するので、小型、軽量、かつ安価に作製されうる。なお、フローセル２００は、ガラスやセラミックスにより作製されてもよい。

第一の層２１０は、第一の流路２１１、サンプル注入部２１２、シース液注入部２１３，２１４、排出部２１５および第一の電極２１６を有する。

第一の流路２１１は、サンプル注入部２１２およびシース液注入部２１３，２１４から排出部２１５へ流体を導く微細な流路である。第一の流路２１１は、第一の層２１０の下面側に形成された凹部および第三の層２３０の上面が合せられることにより断面が矩形状に構成されている。第一の流路２１１の内寸ｗ１は、たとえば１ｍｍ角以下であることが好ましい。第一の層２１０の凹部は、第一の層２１０を下面側から平面視したときにＹ字型を呈するように形成される。第一の流路２１１の両端部には、それぞれシース液注入部２１３，２１４および排出部２１５が配されている。また、シース液注入部２１３，２１４の各々から流入したシース液が合流する位置には、サンプル注入部２１２が配されている。

サンプル注入部２１２は、サンプル供給部３００から供給された血液サンプルを第一の流路２１１に注入する。サンプル注入部２１２は、第一の層２１０の下面側に形成され、ノズルを備える。配管３２１から供給された血液サンプルは上記ノズルから吐出され、第一の流路２１１に注入される。

第一の電極２１６は、上記一対の電極の一方の電極であり、分析部６００に接続されている。第一の電極２１６は、第一の流路２１１の排出部２１５側、すなわち後述の検知孔（第一の連通孔）２３１に関して第一の流路２１１に血液が流入する側と反対側の第一の流路２１１に設置される。第一の電極２１６は、第一の流路２１１における検知孔２３１寄りに設置されることが好ましい。また、第一の電極２１６は、第一の層２１０の上面に露出したリード部を備え、当該リード部は配線を介して分析部６００に接続される。

配管４２２は、２本に分岐し、各々シース液注入部２１３，２１４に着脱可能に接続されている。また、配管５２１は、排出部２１５に着脱可能に接続される。

第二の層２２０は、第二の流路２２１、シース液注入部２２２、排出部２２３、第二の電極２２４、シース液輸送孔２２５，２２６および廃液輸送孔２２７を有する。

第二の流路２２１は、シース液注入部２２２から排出部２２３へ流体を導く微細な流路である。第二の流路２２１は、第二の層２２０の上面側に形成された凹部および第三の層２３０の下面が合せられることより断面が矩形状に構成される。また前記断面は、半丸形状または丸形状でもよい。第二の流路２２１の内寸ｗ２は、たとえば１ｍｍ角以下であることが好ましい。第二の流路２２１は、第一の流路２１１と並列に形成されうる。第二の流路２２１が第一の流路２１１と並列に形成されることにより、フローセル２００を小型化できる。

第二の電極２２４は、上記一対の電極の他方の電極であり、分析部６００に接続されている。第二の電極２２４は、第二の流路２２１のシース液注入部２２２側、すなわち後述の検知孔２３１に関して第二の流路２２１から流体が流出する側と反対側の第二の流路２２１に設置される。第二の電極２２４は、第二の流路２２１における検知孔２３１寄りに設置されることが好ましい。また、第二の電極２２４は、第二の層２２０の下面に露出したリード部を備え、当該リード部は配線を介して分析部６００に接続される。

シース液輸送孔２２５，２２６は、シース液を第二の層２２０から第一の層２１０へ輸送する配管４２２を通すための貫通孔である。また、廃液輸送孔２２７は、廃液を第一の層２１０から第二の層２２０へ輸送する配管５２１を通すための貫通孔である。

配管４２３は、シース液注入部２２２に着脱可能に接続されている。また、配管５２２は、排出部２２３に着脱可能に接続される。

このように、配管４２２、４２３、５２１および５２２はフローセル２００に対して着脱可能に接続されているので、フローセル２００は粒子分析装置１００本体に対して容易に取り付けおよび取り外しが可能である。後述するように、フローセル２００は、１回切りの使い捨て（ディスポーザブルタイプ）ではなく、何度も繰り返し使用できる。しかしながら、フローセル２００を清浄な状態に維持し、計測精度を一定の高いレベルに維持する観点から、フローセル２００は所定回数使用した後に交換されることが好ましい。フローセル２００は、粒子分析装置１００本体に対して容易に取り付けおよび取り外しが可能であるので、定期的に交換されうる。

また、第一の電極２１６および第二の電極２２４は、とくに限定されないが、第一・第二電極２１６，２２４を同じ金属にすることで電位差の発生を抑制できので、電極材料は白金電極同士が好ましい。しかし、たとえばチタン−白金電極、安価なカーボン−カーボン電極であってもよい。このような電極材料を使用することにより、電極材料のコストを削減できる。

第三の層２３０は、第一の層２１０と第二の層２２０との間に形成され、検知孔２３１、シース液輸送孔２３２，２３３および廃液輸送孔２３４を有する。検知孔２３１は、第一の流路２１１と第二の流路２２１とをそれぞれの中途において連通する連通孔である。検知孔２３１の大きさは、１〜１００μｍ程度であることが好ましいが、この範囲の大きさに限定されない。シース液輸送孔２３２，２３３は、配管４２２を貫通させるための貫通孔である。また、廃液輸送孔２３４は、配管５２１を貫通させるための貫通孔である。

＜粒子分析方法＞
図３は本実施形態の粒子分析方法の一例を示すフローチャートであり、図４Ａ〜図４Ｇは図３に示すフローチャートの各ステップに対応する動作を示す模式図である。図４Ａ〜図４Ｇにおいて、図２のＸＹ平面に沿ったフローセル２００の断面が示されている。

図３および図４Ａに示すように、まず、第一の流路２１１の一端からシース液を供給し、他端から排出する（ステップＳ１０１）。制御部９００は、サンプル供給部３００、シース液供給部４００および廃液回収部５００を制御して、第一の流路２１１にシース液を供給し、廃液を回収する。

より具体的には、供給側では、サンプル供給弁３３０が閉じられて血液サンプルの供給が遮断される。また、第一供給弁４３１および第二供給弁４３２が制御されて、シース液容器４１０からシース液注入部２１３，２１４を経て第一の流路２１１にシース液を供給する経路が確立される。

一方、回収側では、第一回収弁５３１および第二回収弁５３２が制御されて第一の流路２１１から排出部２１５を経て廃液回収容器５１０にシース液を排出する経路が確立される。続いて、吸引ポンプ５２０が作動し、廃液回収容器５１０の内容物（空気）が吸引される。廃液回収容器５１０の内容物が吸引されると、廃液回収容器５１０内が大気圧に対して陰圧になるため、シース液容器４１０のシース液がシース液注入部２１３，２１４に流れ込み、第一の流路２１１を流れ、排出部２１５を経て廃液回収容器５１０に貯留する。第一の流路２１１は微細な構造を有するので容量が小さく、少量のシース液によって速やかに満たされる。したがって、従来のチャンバと比べてシース液を給水する時間を短縮できる。

また、血液サンプルの血球を計数する前に第一の流路２１１にシース液が通されることにより、第一の流路２１１に血液などの汚れや気泡が付着していたとしても除去できる。

次に、図４Ｂに示すように、第二の流路２２１の一端からシース液を供給し、他端から排出する（ステップＳ１０２）。制御部９００は、サンプル供給部３００、シース液供給部４００および廃液回収部５００を制御して、第二の流路２２１にシース液を供給し、廃液を回収する。

より具体的には、供給側では、サンプル供給弁３３０が閉じられて血液サンプルの供給が遮断される。また、第一供給弁４３１および第二供給弁４３２が制御されて、シース液容器４１０からシース液注入部２２２を経て第二の流路２２１にシース液を供給する経路が確立される。

一方、回収側では、第一回収弁５３１および第二回収弁５３２が制御されて、第二の流路２２１から排出部２２３を経て廃液回収容器５１０にシース液を排出する経路が確立される。続いて、吸引ポンプ５２０が作動し、廃液回収容器５１０の内容物（空気／シース液）が吸引される。廃液回収容器５１０の内容物が吸引されると、廃液回収容器５１０内が大気圧に対して陰圧になるため、シース液容器４１０のシース液がシース液注入部２２２に流れ込み、第二の流路２２１を流れ、排出部２２３を経て廃液回収容器５１０に貯留する。なお、このとき第一の流路２１１を満したシース液は第二回収弁５３２により廃液回収容器５１０への排出が遮断されるため、第一の流路２１１に保持される。第二の流路２２１は微細な構造を有するので容量が小さく、少量のシース液によって速やかに満たされる。したがって、従来のチャンバと比べてシース液を給水する時間を短縮できる。

また、血液サンプルの血球を計数する前に第二の流路２２１にシース液が通されることにより、第二の流路２２１に血液などの汚れや気泡が付着していたとしても除去できる。

次に、検知孔２３１を通じて第一の流路２１１から第二の流路２２１にシース液を流す（ステップＳ１０３）。図４Ｃに示すように、制御部９００は、サンプル供給部３００、シース液供給部４００および廃液回収部５００を制御して、第一の流路２１１にシース液を供給する。第一の流路２１１に供給されたシース液は、検知孔２３１を通じて第一の流路２１１から第二の流路２２１に流れる。そして、廃液回収部５００にて廃液が回収される。

より具体的には、供給側では、サンプル供給弁３３０が閉じられ、血液サンプルの供給が遮断される。そして、第一供給弁４３１および第二供給弁４３２が制御され、シース液容器４１０からシース液注入部２１３，２１４を経て第一の流路２１１にシース液を供給する経路が確立される。シース液容器４１０から第二の流路２２１にシース液を供給する経路は、第二供給弁４３２によって遮断される。すなわち、シース液が供給される側において第二の流路２２１は閉鎖されている。

一方、回収側では、第一回収弁５３１および第二回収弁５３２が制御されて、シース液が検知孔２３１を通じて第二の流路２２１に流れる。また、第二の流路２２１から排出部２２３を経て、廃液回収容器５１０に廃液が排出される経路が確立される。続いて、吸引ポンプ５２０が作動すると、廃液回収容器５１０の内容物（空気／シース液）が吸引され、シース液容器４１０のシース液がシース液注入部２１３，２１４に流れ込み、第一の流路２１１を流れる。そして、シース液は、検知孔２３１を通じて第二の流路２２１に流れ込み、廃液回収容器５１０に貯留する。したがって、血液サンプルの血球を測定する前に、検知孔２３１を通じて第一の流路２１１から第二の流路２２１にシース液が通されることにより、検知孔２３１に血液などの汚れが付着していたとしても除去できる。

次に、血液サンプルの血球を計数する（ステップＳ１０４）。制御部９００は、サンプル供給部３００、シース液供給部４００、廃液回収部５００および分析部６００を制御し、サンプル供給部３００によってフローセル２００に供給された血液サンプルの血球を計数する。

図４Ｄに示すように、シース液容器４１０から第一の流路２１１にシース液が供給され、検知孔２３１を通じて第二の流路２２１に流れる経路が確立された状態で血液サンプルを第一の流路２１１に注入する。

より具体的には、サンプル供給弁３３０が開けられ、サンプルポンプ３４０により配管３２１の血液サンプルが加圧され、サンプル注入部２１２のノズルから血液サンプルが第一の流路２１１に注入される。第一の流路２１１に注入された血液サンプルは、シース液注入部２１３，２１４から注入されたシース液に包まれた状態で第一の流路２１１を流れる。本実施形態では、第一の流路２１１は微細な構造を有するので容量が小さいので、血液サンプルの量も従来と比べて低減できる。

一方、第一の流路２１１から排出部２１５を経て廃液回収容器５１０へ至る経路は第二回収弁５３２によって遮断されている。すなわち、血液サンプルおよびシース液が排出される側において第一の流路２１１は閉鎖されている。また、シース液容器４１０から第二の流路２２１にシース液を供給する経路は、第二供給弁４３２によって遮断されている。すなわち、シース液が供給される側において第二の流路２２１は閉鎖されている。したがって、シース液および血液サンプルは、検知孔２３１を通じて第二の流路２２１に流れ込み、排出部２２３を経て廃液回収容器５１０に貯留する。本実施形態では、シース液および血液サンプルの流れは層流となるので、血液サンプルは、シース液に包まれた状態で検知孔２３１に吸い込まれて通過し、第二の流路２２１に流れ込む。

このように、血液サンプルがシース液に包まれた状態で流れることにより、血液サンプルは第一の流路２１１および第二の流路２２１の壁面や検知孔２３１に付着しないため、血液による汚染を防止できる。また、血液サンプルを第一の流路２１１から径の小さい検知孔２３１へ急激に流入させることにより、電気抵抗の変化が大きくなるので、血球パルスの変化も大きくなる。その結果、血球パルスの立ち上がりおよびＳＮ比が改善しうる。また、シース液を用いて検知孔に流入させることで、検知孔の中央を通ることになり、安定した血液パルスを得ることができる。

さらに、検知孔２３１を通過した血液サンプルを、第二の流路２２１の下流へ安定して流すことができるため、検知孔２３１を通過した血液サンプルが検知孔２３１へ舞い戻ることを防止できる。したがって、誤って同じ血球を複数回計数することを防止できる。フローセル２００におけるシース液および血液サンプルの流れの詳細については後述する。制御部９００は第一の電極２１６と第二の電極２２４との間に定電流を流し、分析部６００は、フローセル２００の抵抗値の変化に応じた血球パルスを取得し、血球数を算出する。表示部７００は、分析部６００により算出された上記血球数を表示する。

上述したように、第一の電極２１６は検知孔２３１に関して第一の流路２１１に血液サンプルが流入する側と反対側の第一の流路２１１に設置される。また、第二の電極２２４は、検知孔２３１に関して第二の流路２２１から血液サンプルおよびシース液が流出する側と反対側の第二の流路２２１に設置される。このように第一の電極２１６および第二の電極２２４が配置されているので、電極間電圧を測定する時に第一の電極２１６および第二の電極２２４の付近に血液サンプルおよびシース液の流れが生じない。したがって、電気分解で発生した気泡が第一の電極２１６および第二の電極２２４に付着している場合であっても、付近に流れがないので血球パルスの基線が変動せず、安定した計測が可能である。また、第一の電極２１６および第二の電極２２４の電極面積を大きく取ることができるので、より安定した計測が可能である。

次に、検知孔２３１を通じて第一の流路２１１から第二の流路２２１にシース液を流して洗浄する（ステップＳ１０５）。図４Ｅに示すように、制御部９００は、第一の流路２１１にシース液を供給し、検知孔２３１を通じて第一の流路２１１から第二の流路２２１にシース液を流して洗浄し、廃液を回収する。したがって、第一の流路２１１内、第二の流路２２１内および検知孔２３１に付着した気泡や残留血液（たとえばタンパク）などの汚れを容易に除去できる。その結果、検知孔２３１付近に付着した気泡によって血球パルスの基線が変動することが防止され、安定した血球計測が可能となる。また、電気分解によって発生した電解水も除去されうる。したがって、検知孔２３１は清浄な状態を維持できる。

次に、第一の流路２１１にシース液を流して洗浄する（ステップＳ１０６）。図４Ｆに示すように、制御部９００は、第一の流路２１１にシース液を流して洗浄し、廃液を回収する。したがって、血液サンプルの血球を測定した後に第一の流路２１１にシース液が通されることにより、第一の流路２１１内に付着した気泡や残留血液などの汚れを除去できる。

次に、第二の流路２２１にシース液を流して洗浄する（ステップＳ１０７）。図４Ｇに示すように、制御部９００は、第二の流路２２１にシース液を流して洗浄し、廃液を回収する。したがって、血液サンプルの血球を測定した後に第二の流路２２１にシース液が通されることにより、第二の流路２２１内に付着した気泡や残留血液などの汚れを除去できる。

このように、本実施形態では、第一の流路２１１を有する第一の層２１０と、第二の流路２２１を有する第二の層２２０との間の第三の層に、第一の流路２１１と第二の流路２２１とをそれぞれの中途において連通する検知孔２３１が設けられている。第一の流路２１１に注入された血液サンプルは、シース液に包まれた状態で検知孔２３１まで流れて、略直角に進行方向を変え、検知孔２３１を通過する。そして、検知孔２３１を通過後再び略直角に進行方向を変え、第二の流路２２１を排出部２２３へ向けて流れる（図４Ｄを参照）。以下、フローセル２００における血液サンプルの流れ（以下、「サンプル流」と書く）およびシース液の流れ（以下、「シース流」と書く）について詳細に説明する。

＜フローセル２００におけるサンプル流およびシース流＞
図５は、図２のＡ方向から見た場合のサンプル注入部２１２付近におけるサンプル流およびシース流について例示する模式図である。図５において、Ｌはシース流の流線を表し、Ｐは第一の流路２１１の幅方向（Ｗ方向）におけるシース流の流速分布、すなわちシース流のフローパターンを示す。

また、図６Ａは図２のＡ方向から見た場合の検知孔２３１付近のサンプル流およびシース流を示す模式図であり、図６Ｂは図５のＷ方向から見た場合の検知孔２３１付近のサンプル流およびシース流を示す模式図である。Ｌはサンプル流およびシース流の流線を表し、Ｐはサンプル流およびシース流のフローパターンを表す。

図５に示すように、第一の流路２１１のサンプル流およびシース流は、第一の流路２１１の幅が下流方向（Ｘ方向）に徐々に狭まっているため、下流に進むほど速度が大きくなる。また、サンプル流およびシース流の流線は、第一の流路２１１の上流に比べて下流の方が密になる。しかし、サンプル流およびシース流は層流であるため、流線同士が交わることはない。

サンプル流は、シース流によって下流に進むにつれて徐々に集束される（「流体力学的焦点合わせ（Ｆｌｏｗ Ｆｏｃｕｓｉｎｇ）」と呼ばれる）。層流において流れの層同士が混ざり合うことはないから、サンプル流はつねにシース流の中央に位置する。したがって、血液サンプル中の血球は検知孔２３１の中心を流れるので、分析部６００は安定した血球パルスを取得できる。

図６Ａに示すように、サンプル流およびシース流は層流であるため、血液サンプルは、シース液に包まれた状態で第一の流路２１１を流れ、検知孔２３１に吸い込まれる。検知孔２３１における吸い込み流を利用することにより、シース液に包み込まれた血球を検知孔２３１に乱れることなく流入させることができる。

一般に、流路内の流れが層流になるか、あるいは乱流になるかは、レイノルズ数Ｒｅ＝ｕ・ｄ／νによって定まることが知られている。ここで、ｕは流速、ｄは流路の内径、νは動粘性係数である。レイノルズ数が約２３２０以下である場合、流れは層流となり、安定する。したがって、第一の流路２１１のような微細な流路内では、サンプル流およびシース流は、層流となると考えられる。

また、図６Ｂに示すように、サンプル流およびシース流は、見かけ上、慣性力よりも粘性力が支配的となっているため、容易に進行方向を略直角に変えることができると考えられる。サンプル流は、第一および第二の流体力学的焦点合わせ領域Ｆ１，Ｆ２において、さらに集束される。

（変形例）
図７は、第一の実施形態の一変形例を示す模式図である。本変形例では、粒子分析装置１０１は、吸引ポンプの代わりに、加圧ポンプ４４０を有する。加圧ポンプ４４０は、シース液容器４１０内を陽圧にし、シース液を第一の流路２１１または第二の流路２２１へ押し出して供給する。たとえば、シース液を第一の流路２１１に流す場合、加圧ポンプ４４０が作動すると、シース液容器４１０の内容物（シース液）が加圧される。廃液回収容器５１０内は大気圧になっているため、シース液容器４１０のシース液は、第一の流路２１１へ押し出されて流れ、排出部２１５から排出されて、廃液回収容器５１０に貯留する。

（実施例）
本実施形態のフローセル２００と同等の構造を有するフローセルを試作した。第一および第二の流路の内寸は１ｍｍ角とした。また、第一の層と第二の層との間の第三の層に、第一の流路と第二の流路とを連通する検知孔（φ０．１）を形成した。このような構成のフローセルを使用して血液サンプルおよびシース液をフローセルに注入し、その流れを観察した。

まず、第一および第二の流路をシース液で満たした。そして、第二回収弁を閉じて第一の流路の下流をせき止めるとともに、第二の流路から廃液回収容器への経路を確立した。

シース液注入部からシース液を注入しつつ、サンプル注入部のノズル（φ０．２５）から血液サンプルを第一の流路に注入した。第一の流路においてサンプル流がシース流に包み込まれて安定した流れとなり、流路が狭まるに従いシース流により流体力学的焦点合わせされることを観察によって確認した。また、サンプル流が、シース流の中心に位置し、シース流によって包まれた状態で進行方向を略直角に変え、上記貫通孔に流れ込むことを観察によって確認した。サンプル流およびシース流は検知孔でさらに集束し、サンプル流を中心とした流れとなるものと考えられる。

以上、説明した本実施形態のフローセル、粒子分析装置および粒子分析方法は、下記の効果を奏する。

本実施形態によれば、フローセル２００において血液サンプルがシース液に包まれた状態で流れ、検知孔２３１を通過する。また、第一の電極２１６および第二の電極２２４付近を血液サンプルが流れないので、血液サンプルによって電極が汚染されない。また、血球の計測時に第一の電極２１６および第二の電極２２４付近を血液サンプルおよびシース液が流れないので、電極に付着した気泡が流れによって剥離されず、血球パルスの基線を変動させることを防止できる。さらに、血液サンプルに含まれる血球の計数が終了したのち、フローセル２００の第一の流路２１１、第二の流路２２１および検知孔２３１内の汚れおよび気泡を容易に洗浄できる。したがって、フローセル２００の第一の流路２１１、第二の流路２２１および検知孔２３１内の汚染および気泡が血球計数の精度に影響を及ぼすことを防止または抑制できる。

（第二の実施形態）
第一の実施形態では、第一の流路と第二の流路との間に検知孔が１つ設けられる場合について説明した。一方、第二の実施形態では、第一の流路と他の複数の流路との間に各々検知孔が設けられる場合について説明する。なお、説明の重複を避けるため、第一の実施形態と同じ構成については説明を省略する。

図８Ａ〜図８Ｃは、第二の実施形態に係るフローセルの動作を例示する模式図である。図８Ａ〜図８Ｃには、第一の流路と第二の流路との間、および第一の流路と第三の流路との間に各々検知孔が設けられている場合について例示されている。

図８Ａに示すように、本実施形態では、フローセル２０１は、第一の流路２１１および第二の流路２２１に加え、第三の流路２２１’を有する。また、第三の流路２２１’には、第三の電極２２４’が配置されている。

第三の流路２２１’は、第二の流路２２１と同じ第二の層２２０に形成されることが好ましい。しかし、第三の流路２２１’が第二の層２２０に形成される場合に限定されるものではない。たとえば、第三の流路２２１’は、第二の層２２０の下側に形成された他の層に配置されてもよい。

また、第二の流路２２１および第三の流路２２１’は、第一の流路２１１に対して略直交方向に形成されることが好ましい。しかし、第二の流路２２１および第三の流路２２１’は、第一の流路２１１に対して略直交方向に形成される場合に限定されるものではない。

以下では、第二の層２２０に、第二の流路２２１および第三の流路２２１’が、第一の流路２１１に対して略直交方向に形成される場合について例示して説明する。

本実施形態では、第三の層２３０は、第一の流路２１１と第二の流路２２１とを連通する検知孔２３１に加えて、第一の流路２１１と第三の流路２２１’とを連通する検知孔２３１’（第二の連通孔）をさらに有する。検知孔２３１’は、検知孔２３１とは、大きさが異なる。たとえば検知孔２３１’は、検知孔２３１よりも大きく形成されうる。

表１に示すように、血球計測において、検知孔の大きさ（径）と測定範囲との関係が知られている。

たとえば、検知孔２３１および検知孔２３１’を、それぞれφ３０μｍおよびφ５０μｍに設定し、白血球（約１０μｍ）、赤血球（６μｍ）および血小板（約２μｍ）を計数する場合について説明する。

表１においてφ３０μｍおよびφ５０μｍの検知孔の測定範囲を参照すると、検知孔２３１および検知孔２３１’は、ともに白血球、赤血球および血小板の計数に使用することが可能である。しかし、より高い測定精度、すなわち血球パルスのＳＮ比を向上させる観点から、検知孔２３１は赤血球および血小板の計数に適し、検知孔２３１’は白血球の計数に適していると考えられる。

このようなフローセル２０１を使用して、赤血球、血小板および白血球を計数する手順は次のとおりである。

まず、図８Ａに示すように、第一の流路２１１、第二の流路２２１および第三の流路２２１’に希釈液（シース液）を供給する。

次に、図８Ｂに示すように、血液サンプルを第一の流路２１１から検知孔２３１を通じて第二の流路２２１に流し、赤血球および血小板を計数する。

次に、図８Ｃに示すように、引き続き血液サンプルを第一の流路２１１から検知孔２３１’を通じて第三の流路２２１’に流し、白血球を計数する。

なお、赤血球の検知孔の径（検知孔２３１）をφ５０μｍとし、血小板の検知孔の径（検知孔２３１’）をφ３０μｍとしてもよい。

このように、大きさの異なる検知孔を複数の流路上に設置することにより、血球計数を精度良く、小型かつ低コストで実現できる。また、図８Ａ〜図８Ｃでは、検知孔が２つの場合を例示したが、検知孔を３つ以上設置することもできる。

たとえば、第一の流路と第二の流路との間にφ３０μｍの第一の検知孔、第一の流路と第三の流路との間にφ５０μｍの第二の検知孔、第一の流路と第四の流路との間にφ１００μｍの第三の検知孔を設置できる。第一の検知孔は、血小板の計数に使用され、第二の検知孔は、赤血球の計数に使用され、第三の検知孔は、白血球の計数に使用されうる。このようにして、血液サンプルに含まれる血小板、赤血球および白血球を、それぞれに対して最適な大きさの検知孔に順次通過させることができる。

また、赤血球および血小板を計数するための血液サンプルＡと、白血球を計数するための血液サンプルＢとに分けて血球を計数することも可能である。血液サンプルＡは、希釈液により、たとえば１００倍に希釈される。一方、血液サンプルＢは、希釈液により、たとえば２００倍に希釈された後、溶血剤により溶血される。

まず、血液サンプルＡをサンプル注入部から第一の流路に供給し、最適な検知孔にて計数したのち、上記血液サンプルＡを排出し、フローセル２００内を洗浄する。

次に、血液サンプルＢをサンプル注入部から第一の流路に供給し、最適な検知孔にて計数したのち、上記血液サンプルＢを排出し、フローセル２００内を洗浄する。

これにより、赤血球および血小板を計数するためのフローセルと、白血球を計数するためのフローセルとを別々に備える必要がなく、同じフローセルで計数できるので、粒子分析装置の小型化を実現可能である。

（第三の実施形態）
第一の実施形態では、第一層と第二の層との間に検知孔が１つ設けられる場合について説明した。一方、第三の実施形態では、３つの層以上の各々の層間に検知孔が設けられる場合について説明する。なお、説明の重複を避けるため、第一の実施形態と同じ構成については説明を省略する。

図９Ａ〜図９Ｃは、第三の実施形態のフローセルの動作を例示する模式図である。図９Ａに示すように、フローセル２０２は、第四の層２４０と、当該第四の層２４０と第二の層２２０との間に形成された第五の層２５０とをさらに有する。

本実施形態では、第一の電極２１６は、検知孔２３１に関して第一の流路２１１から血液サンプルおよびシース液が流入する側と反対側に設置される。第一の電極２１６は、第一の流路２１１における検知孔２３１寄りに設置されることが好ましい。また、第二の電極２２４は、検知孔２３１に関して第二の流路２２１から血液サンプルおよびシース液が流出する側と反対側の第二の流路２２１に設置される。第二の電極２２４は、第二の流路２２１における検知孔２３１寄りに設置されることが好ましい。

第四の層２４０は、第三の流路２４１および第三の電極２４４を有する。第三の流路２４１は、第四の層２４０の上面側に形成された凹部および第五の層２５０の下面が合せられることにより断面が矩形状に構成されている。

また、第五の層２５０は、第二の流路２２１と第三の流路２４１とを連通する検知孔２５１（第二の連通孔）を有する。第三の電極２４４は、検知孔２５１に関して第三の流路２４１から血液サンプルおよびシース液が流出する側と反対側に設置される。第三の電極２４４は、第三の流路２４１における検知孔２５１寄りに設置されることが好ましい。

検知孔２５１は、検知孔２３１と大きさが異なる。たとえば、検知孔２５１は、検知孔２３１よりも大きく形成されうる。たとえば、検知孔２３１および検知孔２５１を、それぞれφ３０μｍおよびφ５０μｍに設定し、検知孔２３１にて血液サンプルの赤血球および血小板を計数し、検知孔２５１にて白血球を計数しうる。

血液サンプルの血球を計数するにあたり、図示しないシース液供給部および廃液回収部を制御して、シース液が流出する側において第一〜第三の流路２１１，２２１，２４１を閉鎖し、第一〜第三の流路２１１，２２１，２４１をシース液で満たす。

図９Ｂに示すように、検知孔２３１にて血球を計測する場合、シース液が流出する側において、第二の流路２２１を開放するとともに第一および第三の流路２１１，２４１を閉鎖し、第一の流路２１１に血液サンプルおよびシース液を注入する。

第一の流路２１１に注入された血液サンプルは、シース液に包まれた状態で検知孔２３１まで流れて、略直角に進行方向を上向きに変え、検知孔２３１を通過する。血液サンプルが検知孔２３１を通過する際、第一の電極２１６および第二の電極２２４が使用されて血液サンプルに含まれる赤血球および血小板が計数される。そして、検知孔２３１を通過した血液サンプルは、再び略直角に進行方向を変え、第二の流路２２１を流れて廃液回収部により回収される。

また、図９Ｃに示すように、検知孔２５１にて血球を計測する場合、シース液が流出する側において第三の流路２４１を開放するとともに第一および第二の流路２１１，２２１を閉鎖し、第二の流路２２１に血液サンプルおよびシース液を注入する。

第二の流路２２１に注入された血液サンプルは、シース液に包まれた状態で検知孔２５１まで流れ、検知孔２５１において略直角に進行方向を下向きに変え、検知孔２５１を通過する。血液サンプルが検知孔２５１を通過する際、第一の電極２１６および第三の電極２４４が使用されて血液サンプルに含まれる白血球が計数される。さらに、血液サンプルは、検知孔２５１を通過した後、再び略直角に進行方向を変え、第三の流路２４１を流れて廃液回収部により回収される。

このように、大きさの異なる検知孔を複数層の層間に設置することにより、血球計数を精度良く、小型かつ低コストで実現できる。

以上のとおり、実施形態において、本発明のフローセル、粒子分析装置および粒子分析方法を説明した。しかしながら、本発明は、その技術思想の範囲内において当業者が適宜に追加、変形、および省略できることはいうまでもない。

たとえば、上述の第一〜第三の実施形態では、血液サンプルに含まれる血球の数を計測する場合を例示して説明した。しかしながら、本発明の粒子分析装置は、血液サンプルに含まれる血球の数を計測する場合に限定されず、特定サイズの微粒子、たとえばラテックス粒子の計数に適用可能である。また、フローセル２００内にセンサを設け、ヘモグロビン濃度を測定するようにすることも可能である。

また、本発明の粒子分析装置は、さらにヒータを有し、フローセルを粒子分析装置本体に対して積層構造とすることにより、フローセルのみを加温することができる。フローセルを加温することにより、サンプル流およびシース流の液温が安定し、粒子の計数精度を向上できる。

さらに、第一の層、第二の層および第三の層を一体化した一つの層に第一の流路、第二の流路および検知孔を形成してよい。上述した各層の一体化は、３Ｄプリンターにより作製することが可能である。

１００，１０１ 粒子分析装置、
２００，２０１，２０２ フローセル、
２１０ 第一の層、
２１１ 第一の流路、
２１２ サンプル注入部、
２１３，２１４ シース液注入部、
２１５ 排出部、
２１６ 第一の電極、
２２０ 第二の層、
２２１ 第二の流路、
２２２ シース液注入部、
２２３ 排出部、
２２４ 第二の電極、
２２５，２２６ シース液輸送孔、
２２７ 廃液輸送孔、
２３０ 第三の層、
２３１ 検知孔、
３００ サンプル供給部、
４００ シース供給部、
５００ 廃液回収部、
６００ 分析部、
７００ 表示部、
８００ 電源部、
９００ 制御部。

Claims (9)

1. 第一の流路および第一の電極を有する第一の層と、
   第二の流路および第二の電極を有する第二の層と、
   前記第一の層と第二の層との間に形成され、前記第一の流路と前記第二の流路とを連通する第一の連通孔を有する第三の層と、を有し、
   前記第一の電極は、前記第一の連通孔に関して前記第一の流路にサンプルが供給される側と反対側の前記第一の流路に設置され、
   前記第二の電極は、前記第一の連通孔に関して前記第二の流路から流体が排出される側と反対側の前記第二の流路に設置される、フローセル。
2. 前記第二の流路は、前記第一の流路に並列に形成される、請求項１に記載のフローセル。
3. 前記第二の層は、第三の流路をさらに有し、
   前記第三の層は、前記第一の流路と前記第三の流路とを連通する第二の連通孔をさらに有し、
   前記第二の連通孔は、前記第一の連通孔と大きさが異なる、請求項１に記載のフローセル。
4. 第三の流路を有する第四の層と、
   前記第二の層と第四の層との間に形成され、前記第二の流路と前記第三の流路とを連通する第二の連通孔を有する第五の層と、をさらに有し、
   前記第二の連通孔は、前記第一の連通孔と大きさが異なる、請求項２に記載のフローセル。
5. 請求項１〜４のいずれか１項に記載のフローセルと、
   前記第一の流路に被計数粒子を含むサンプルを供給するサンプル供給部と、
   前記第一の電極および前記第二の電極に接続され、前記第一の電極と前記第二の電極との間の抵抗値に基づいて前記被計数粒子を分析する分析部と、
   を有する、粒子分析装置。
6. 前記第一の流路および前記第二の流路にシース液を供給するシース液供給部と、
   をさらに有する、請求項５に記載の粒子分析装置。
7. 前記サンプル注入部から注入された流体は、前記シース液に包まれつつ前記第一の流路を流れ、前記第一の連通孔における吸い込み流により、前記第一の流路から前記第二の流路へ流れる、請求項６に記載の粒子分析装置。
8. 第一の層の第一の流路の一端からシース液を供給し、他端から排出するステップ（ａ）と、
   第二の層の第二の流路の一端からシース液を供給し、他端から排出するステップ（ｂ）と、
   前記シース液が排出される側において前記第一の流路を閉鎖し、前記シース液が供給される側において前記第二の流路を閉鎖し、前記第一の流路にシース液を供給し、第一の連通孔を通じて、前記第二の流路から排出するステップ（ｃ）と、
   前記シース液が供給される側において前記第一の流路に流体を注入し、前記第一の連通孔を通過する当該流体に含まれる粒子を計数するステップ（ｄ）と、を有し、
   前記第一の連通孔は、前記第一の層と前記第二の層との間の第三の層に形成され、前記第一の流路と前記第二の流路とを連通する、
   粒子分析方法。
9. 前記第一の連通孔を通じて前記第一の流路から前記第二の流路にシース液を流して洗浄するステップ（ｅ）と、
   前記第一の流路にシース液を流して洗浄するステップ（ｆ）と、
   前記第二の流路にシース液を流して洗浄するステップ（ｇ）と、
   をさらに有する請求項８に記載の粒子分析方法。