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JP2016106558A - Aspergillus mutant and transformant - Google Patents

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JP2016106558A
JP2016106558A JP2014246021A JP2014246021A JP2016106558A JP 2016106558 A JP2016106558 A JP 2016106558A JP 2014246021 A JP2014246021 A JP 2014246021A JP 2014246021 A JP2014246021 A JP 2014246021A JP 2016106558 A JP2016106558 A JP 2016106558A
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智 新川
智 新川
茂信 光澤
茂信 光澤
麻衣子 田中
麻衣子 田中
友裕 今井
友裕 今井
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本田技研工業株式会社
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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide an aspergillus mutant which can dramatically improve the production amount of a heterologous enzyme by the transformation through the induction of a saccharifying enzyme gene, and to provide a transformant in which the saccharifying enzyme gene is induced into the aspergillus mutant.SOLUTION: The invention provides an aspergillus mutant in which a full-length or a part of prtR gene encoding the transcription factor of Aspergillus oryzae HO2 strain (Accession number: NITE BP-01750) is deficient.SELECTED DRAWING: Figure 1

Description

本発明は、固体培養に好適であり、かつ遺伝子組換えの宿主として好適な麹菌変異株及び、該麹菌変異株から得られた形質転換体に関する。 The present invention is suitable for solid culture, and preferred Aspergillus mutant and a recombinant host, a transformant body obtained from 該麹 subtilis mutant strain.

従来、稲わら、コーンストーバ等のリグノセルロース系バイオマスを基質として、該基質を糖化酵素により糖化し、得られた糖を微生物(アルコール発酵菌)により発酵させてエタノール等のアルコールを製造する方法が知られている。 Conventionally, rice straw, as a substrate lignocellulosic biomass such as corn stover, said substrate saccharification by saccharifying enzymes, methods resulting sugar by fermenting microorganism (alcohol fermentation bacteria) to produce an alcohol such as ethanol is known It is.

また、前記リグノセルロース系バイオマスを糖化酵素により糖化する際に、アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)等の麹菌に糖化酵素遺伝子が導入された形質転換体を用いることが知られている。 Further, the lignocellulosic biomass in saccharification by saccharifying enzyme, it is known to use Aspergillus oryzae (Aspergillus oryzae) transformant saccharifying enzyme gene is introduced into koji molds and the like. 前記形質転換体は、例えば、前記リグノセルロース系バイオマスを用いて固体培養されることにより糖化酵素を生産し、該糖化酵素により該リグノセルロース系バイオマスが糖化される。 The transformant, for example, using the lignocellulosic biomass to produce saccharification enzymes by being solid culture, the lignocellulosic biomass is saccharified by sugar enzyme.

ところが、前記アスペルギルス・オリゼはプロテアーゼ遺伝子を有しており、プロテアーゼを生産するので、前記形質転換体により生産される異種酵素が該プロテアーゼにより分解されてしまうという問題がある。 However, the Aspergillus oryzae has a protease gene, since the production of protease, the heterologous enzyme produced by the transformant is a problem that is decomposed by the protease.

前記問題を解決するために、前記アスペルギルス・オリゼのプロテアーゼ遺伝子を欠損させることにより異種酵素の生産量を向上させることが知られている(例えば、非特許文献1参照)。 In order to solve the above problems, to improve the production of heterologous enzymes by defective protease gene of Aspergillus oryzae it is known (e.g., see Non-Patent Document 1).

しかしながら、前記プロテアーゼ遺伝子を欠損させたアスペルギルス・オリゼでは異種酵素の生産量を十分に向上させることができず、さらに改良が望まれる。 However, the protease gene in Aspergillus oryzae was deficient not possible to sufficiently improve the production of heterologous enzymes, improvements are desired further.

本発明は、かかる事情に鑑み、糖化酵素遺伝子を導入して形質転換することにより異種酵素の生産量を飛躍的に向上させることができる麹菌変異株及び、該麹菌変異株に糖化酵素遺伝子が導入された形質転換体を提供することを目的とする。 The present invention, such a situation in view of the saccharification enzyme gene is introduced Aspergillus mutant strain and can dramatically improve the production of heterologous enzymes by transforming saccharification enzyme gene introduced into 該麹 subtilis mutant strain and to provide a transformants.

かかる目的を達成するために、本発明の麹菌変異株は、アスペルギルス・オリゼHO2株(受託番号:NITE BP−01750)の転写因子をコードする遺伝子prtRの全長又は一部が欠損していることを特徴とする。 To achieve the above object, Aspergillus oryzae mutant strain of the present invention, Aspergillus oryzae HO2 strain (Accession Number: NITE BP-01750) that the entire length of the gene prtR that encodes a transcription factor or a part is missing and features.

本発明の麹菌変異株によれば、前記遺伝子prtRの全長又は一部が欠損していることにより、プロテアーゼ遺伝子の発現を正に制御する転写因子を発現することができず、複数のプロテアーゼ遺伝子の発現が抑制される。 According to Aspergillus mutant strain of the present invention, by the total length or a part of the gene prtR is missing, it is impossible to express the transcription factor that positively regulates the expression of the protease gene, a plurality of protease genes expression is suppressed. この結果、本発明の麹菌変異株に糖化酵素遺伝子を導入して形質転換体としたときに、該形質転換体が生産する糖化酵素(異種酵素)のプロテアーゼによる分解が低減し、該糖化酵素の生産量を飛躍的に向上させることができる。 As a result, the present invention A. oryzae mutants by introducing a saccharifying enzyme gene when the transformants were reduced degradation by proteases saccharification enzyme (heterologous enzyme) that the transformant is produced, the sugar enzyme the production can be dramatically improved.

本発明の麹菌変異株は、前記形質転換体とするために、アスペルギルス・オリゼHO3株(受託番号:NITE BP−01954)であることが適している。 Aspergillus oryzae mutant strain of the present invention, in order to the transformant, Aspergillus oryzae HO3 strain (Accession Number: NITE BP-01954) it has suitable is.

本発明の形質転換体は、アスペルギルス・オリゼHO2株(受託番号:NITE BP−01750)の転写因子をコードする遺伝子prtRの全長又は一部が欠損している麹菌変異株に、糖化酵素遺伝子が導入されていることを特徴とする。 The transformant of the present invention, Aspergillus oryzae HO2 strain (Accession Number: NITE BP-01750) in Aspergillus oryzae mutant full length or a part of a gene prtR that encodes a transcription factor which is deficient in, saccharifying enzyme gene introduced characterized in that it is.

本発明の形質転換体によれば、前記遺伝子prtRの全長又は一部が欠損していることにより、複数のプロテアーゼ遺伝子の発現が抑制される。 According to the transformant of the present invention, by the total length or a part of the gene prtR is missing, the expression of several protease genes is suppressed. そこで、本発明の形質転換体によれば、導入された糖化酵素遺伝子により生産される糖化酵素(異種酵素)のプロテアーゼによる分解が低減し、該糖化酵素の生産量を飛躍的に向上させることができる。 Therefore, according to the transformant of the present invention, reduces the degradation by proteases of the saccharifying enzyme (heterologous enzyme) produced by the introduced saccharifying enzyme gene, you can dramatically improve the production of sugar enzyme it can.

本発明の形質転換体において、前記糖化酵素遺伝子は、セロビオハイドロラーゼ遺伝子、β−グルコシダーゼ遺伝子、エンドキシラナーゼ遺伝子、アラビノフラノシダーゼ遺伝子、グルクロニダーゼ遺伝子、エンドグルカナーゼ遺伝子からなる群から選択される少なくとも1種の遺伝子であることが好ましい。 In the transformant of the present invention, the saccharification enzyme gene, cellobiohydrolase gene, beta-glucosidase gene, endoxylanase gene, arabinofuranosidase gene, -glucuronidase gene, at least one selected from the group consisting of endoglucanase gene it is preferably a species of gene.

前記糖化酵素遺伝子は、より具体的には、アクレモニウム・セルロリティカス由来のセロビオハイドロラーゼ遺伝子、アクレモニウム・セルロリティカス由来のβ−グルコシダーゼ遺伝子、サーモアスカス属菌由来のエンドキシラナーゼ遺伝子、アクレモニウム・セルロリティカス由来のアラビノフラノシダーゼ遺伝子、アクレモニウム・セルロリティカス由来のグルクロニダーゼ遺伝子からなる群から選択される少なくとも1種の遺伝子であることが好ましい。 The saccharification enzyme gene, more specifically, cellobiohydrolase gene derived from Acremonium cellulolyticus, beta-glucosidase gene from Acremonium cellulolyticus, endoxylanase gene from Thermo Asuka scan genus, Acremonium cellulolyticus derived arabinofuranosidase gene, is preferably at least one gene selected from the group consisting of glucuronidase gene from Acremonium cellulolyticus.

また、本発明の形質転換体において、前記糖化酵素遺伝子は、染色体中に導入されていることが好ましい。 Also, in the transformant of the present invention, the saccharification enzyme gene, it is preferably introduced into the chromosome.

本発明の麹菌変異株の形質転換体と、アスペルギルス・オリゼHO2株の形質転換体との糖化酵素生産量を示すグラフ。 Graph showing the transformant of Aspergillus oryzae mutant strain of the present invention, the saccharification enzyme production of the transformants of Aspergillus oryzae HO2 strain.

次に、添付の図面を参照しながら本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。 Next, it will be described in more detail embodiments of the present invention with reference to the accompanying drawings.

本実施形態の麹菌変異株は、アスペルギルス・オリゼHO2株の転写因子をコードする遺伝子prtRの全長又は一部が欠損しているものである。 Aspergillus oryzae mutant strain of the present embodiment is a full length or a part of a gene prtR that encodes a transcription factor of Aspergillus oryzae HO2 strain is deficient.

アスペルギルス・オリゼHO2株は、アスペルギルス・オリゼAOK27L株(株式会社秋田今野商店より入手可能)のpyrG遺伝子の全長又は一部が欠損したウリジン要求性変異株であるアスペルギルス・オリゼHO1株に対し、さらにligD遺伝子を欠損させた変異株である。 Aspergillus oryzae HO2 strain against Aspergillus oryzae HO1 strain full length or a part of the pyrG gene is uridine auxotrophic mutant strain deficient in Aspergillus oryzae AOK27L strain (Inc. available from Akita Konno Shoten), further ligD a mutant strain that was deficient in the gene.

アスペルギルス・オリゼHO1株、アスペルギルス・オリゼHO2株は、本出願人により、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター(千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8 122号室)に寄託されている(寄託日:平成25年11月12日)。 Aspergillus oryzae HO1 strain, Aspergillus oryzae HO2 share, by the applicant, are deposited with the National Institute of Technology and Evaluation, Patent Microorganisms Depositary Center (Kisarazu, Chiba Kazusa legs bowed in 2-5-8 No. 122 room) It is (deposit date: 2013 November 12, 2008). 受託番号は、アスペルギルス・オリゼHO1株がNITE BP−01749であり、アスペルギルス・オリゼHO2株がNITE BP−01750である。 Accession number, Aspergillus oryzae HO1 share is NITE BP-01749, Aspergillus oryzae HO2 share is NITE BP-01750.

アスペルギルス・オリゼHO2株のprtR遺伝子の全長又は一部を欠損する方法は、プロトプラスト−PEG法、自然変異法等の微生物の遺伝子組み換えにおいて用いられる公知の技術の中から適宜選択して用いることができる。 How lacking the full length or a part of the prtR gene of Aspergillus oryzae HO2 strain, protoplasts -PEG method can be suitably selected from known techniques used in recombinant microorganisms, such as natural mutagenesis .

本出願人は、アスペルギルス・オリゼHO2株のprtR遺伝子の全長又は一部が欠損している麹菌変異株を、アスペルギルス・オリゼHO3株と命名し、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター(千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8 122号室)に寄託した(寄託日:平成26年10月24日、受託番号:NITE BP−01954)。 The applicant has the Aspergillus mutant full length or a part of the prtR gene of Aspergillus oryzae HO2 strain is deficient, and designated Aspergillus oryzae HO3 strain, National Institute of Technology and Evaluation Patent Microorganisms Depositary ( was deposited in Kisarazu, Chiba Kazusa legs bowed in 2-5-8 No. 122 room) (date of deposit: 2014 October 24, accession number: NITE BP-01954).

また、本実施形態の形質転換体は、アスペルギルス・オリゼHO3株の染色体に、糖化酵素遺伝子が導入されている。 The transformant of the present embodiment, the chromosome of Aspergillus oryzae HO3 strain saccharifying enzyme gene has been introduced.

前記糖化酵素遺伝子は、例えば、セロビオハイドロラーゼ遺伝子、β−グルコシダーゼ遺伝子、エンドキシラナーゼ遺伝子、アラビノフラノシダーゼ遺伝子、グルクロニダーゼ遺伝子、エンドグルカナーゼ遺伝子からなる群から選択される少なくとも1種の遺伝子である。 The saccharification enzyme gene, for example, at least one gene selected cellobiohydrolase gene, beta-glucosidase gene, endoxylanase gene, arabinofuranosidase gene, glucuronidase gene, from the group consisting of endoglucanase gene.

また、前記糖化酵素遺伝子は、より具体的には、アクレモニウム・セルロリティカス由来のセロビオハイドロラーゼ遺伝子、アクレモニウム・セルロリティカス由来のβ−グルコシダーゼ遺伝子、サーモアスカス属菌由来のエンドキシラナーゼ遺伝子、アクレモニウム・セルロリティカス由来のアラビノフラノシダーゼ遺伝子、アクレモニウム・セルロリティカス由来のグルクロニダーゼ遺伝子からなる群から選択される少なくとも1種の遺伝子である。 Further, the saccharifying enzyme gene, more specifically, cellobiohydrolase gene derived from Acremonium cellulolyticus, Acremonium cellulolyticus derived β- glucosidase gene, it endoxylanase derived from Thermomyces Asuka scan genus gene, at least one gene that arabinofuranosidase gene from Acremonium cellulolyticus, is selected from the group consisting of glucuronidase gene from Acremonium cellulolyticus.

前記形質転換体は、前記糖化酵素遺伝子を発現させるための発現カセットを組み込んだ発現ベクターをアスペルギルス・オリゼHO3株の染色体に導入することにより得ることができる。 The transformant, the expression vector incorporating the expression cassette for expressing the saccharifying enzyme gene can be obtained by introducing into chromosome of Aspergillus oryzae HO3 strain. ここで、前記発現カセットとは、構造遺伝子を発現させるために必要なDNAの組合せであり、構造遺伝子と宿主細胞内で機能するプロモーター及びターミネーターを含む。 Herein, the expression cassette is a combination of DNA required to express the structural gene, including the promoter and terminator which function in the structural gene and the host cell. 前記発現カセットには、さらに、5´−非翻訳領域、3´−非翻訳領域のいずれか1つ以上が含まれていてもよい。 The expression cassette further, 5'-untranslated region may include any one or more of the 3'-untranslated region.

また、前記発現カセットを組み込む発現ベクターとしては、アスペルギルス・オリゼを初めとする麹菌に対する形質転換に使用可能な公知のベクターの中から適宜選択して、必要に応じて適宜改変したものを用いることができる。 As the expression vector into the expression cassette, appropriately selected from known vectors that can be used to transform for koji mold including the Aspergillus oryzae, it is used those appropriately modified as required it can.

発現ベクターをアスペルギルス・オリゼHO3株の染色体に導入する形質転換方法は、特に限定されるものではなく、アスペルギルス・オリゼを初めとする麹菌に対する遺伝子導入を行う際に使用される各種方法により行うことができる。 Transformation method for introducing an expression vector into a chromosome of Aspergillus oryzae HO3 strain is not limited in particular, it is carried out by various methods used in carrying out the gene introduction for the koji mold including the Aspergillus oryzae it can. 前記形質転換方法としては、例えば、プロトプラスト−PEG法、PEG−カルシウム法(Mol.Gen.Genet., vol.218, p.99-104(1989))、エレクトロポレーション法、アグロバクテリウム法等をあげることができる。 Examples transformation method, for example, protoplast -PEG method, PEG-calcium method (Mol.Gen.Genet., Vol.218, p.99-104 (1989)), electroporation method, Agrobacterium method, etc. it can be mentioned.

本実施形態の形質転換体によれば、prtR遺伝子の全長又は一部が欠損していることにより、複数のプロテアーゼ遺伝子の発現が抑制される。 According to the transformant of the present embodiment, by the full-length or a part of the prtR gene is missing, the expression of several protease genes is suppressed. そこで、本実施形態の形質転換体によれば、導入された糖化酵素遺伝子により生産される糖化酵素(異種酵素)のプロテアーゼによる分解が低減し、該糖化酵素の生産量を飛躍的に向上させることができる。 Therefore, according to the transformant of the present embodiment, degradation by proteases saccharification enzyme produced (heterologous enzyme) is reduced by the introduced saccharifying enzyme gene, to dramatically improve the production of sugar enzyme can.

次に、本発明の実施例及び比較例を示す。 Next, Examples and Comparative Examples of the present invention.

〔実施例1〕 Example 1
本実施例では、アスペルギルス・オリゼHO2株から、次のようにしてprtR遺伝子が欠損している麹菌変異株であるアスペルギルス・オリゼHO3株を構築した。 In this example, was constructed from Aspergillus oryzae HO2 strain Aspergillus oryzae HO3 strain is Aspergillus oryzae mutant prtR gene as follows it is missing.

まず、アスペルギルス・オリゼHO2株のゲノムDNA遺伝子を鋳型に、プライマー1、2にてprtR遺伝子の上流配列、プライマー3、4にて下流配列、プライマー5、6にてマーカーリサイクリング用配列、アスペルギルス・アワモリHA1株(受託番号:NITE BP−01751)のゲノムDNA遺伝子を鋳型に、プライマー7、8にてpyrG遺伝子発現カセットを、それぞれDNAポリメラーゼ(東洋紡績株式会社製、商品名:KOD FX neo)にてPCR増幅し、精製キット(QIAGEN社製、商品名:QIAquick PCR purification kit)にて精製して、計4つの遺伝子断片を取得した。 First, a genomic DNA gene of Aspergillus oryzae HO2 strain as a template, the upstream sequence of prtR gene at the primer 1 and 2, the downstream sequence in the primer 3 and 4, SEQ markers recycling at primers 5,6, Aspergillus awamori HA1 strain (accession number: NITE BP-01751) in the genomic DNA gene a template, the pyrG gene expression cassette by primer 7 and 8, respectively, DNA polymerase (Toyobo Co., Ltd., trade name: KOD FX neo) to PCR amplification Te, and purification kit (QIAGEN Inc., trade name: QIAquick PCR purification kit) was purified by acquired a total of four gene fragments.

次に、プラスミドpRI910(タカラバイオ株式会社製)を制限酵素SmaI(タカラバイオ株式会社製)にて30℃で処理し、前記精製キットにて精製してプラスミドを線状化したもの(以下、「第1の線状化プラスミド」と略記する)を取得した。 Then treated at 30 ° C. at plasmid pRI910 limit (Takara Bio Inc.) enzyme SmaI (manufactured by Takara Bio Inc.), which were linearized plasmid was purified by the purification kit (hereinafter, " It was obtained abbreviated) and the first linearized plasmid ".

次に、前記上流配列、pyrG遺伝子発現カセット、線状化プラスミド配列の3つの遺伝子断片をクローニングキット(タカラバイオ株式会社製、商品名:In-Fusion(登録商標) HD Cloning kit)にて処理し、E. Next, the upstream sequences, pyrG gene expression cassette, three gene fragments Cloning kit linearized plasmid sequences: treated with (Takara Bio Co., Ltd., trade name an In-Fusion (TM) HD Cloning kit) , E. coliHST08株(タカラバイオ株式会社より入手)に形質転換し、プラスミドpRI910のSmaIサイト部分に、前記上流配列とpyrG遺伝子発現カセットとを導入したプラスミドpRI−AoΔprtR1::pyrGを取得した。 Transformed into coliHST08 strain (obtained from Takara Bio Inc.), a SmaI site portion of the plasmid PRI910, to obtain a plasmid pRI-AoΔprtR1 :: pyrG introduced and the upstream sequences and the pyrG gene expression cassette.

次に、プラスミドpRI−AoΔprtR1::pyrGを制限酵素NotI(タカラバイオ株式会社製)にて37℃で処理し、前記精製キットにて精製して、プラスミドpRI−AoΔprtR1::pyrGを線状化したもの(以下、「第2の線状化プラスミド」と略記する)を取得した。 Next, the plasmid pRI-AoΔprtR1 :: pyrG with restriction enzymes NotI (manufactured by Takara Bio Inc.) was treated with 37 ° C., is purified by the purification kit, the plasmid pRI-AoΔprtR1 :: pyrG was linearized things (hereinafter, abbreviated as "second linearized plasmid") were obtained.

次に、前記マーカーリサイクリング用配列、前記下流配列、第2の線状化プラスミド配列の3つの遺伝子断片を、前記クローニングキットにて処理してE. Then, the marker recycling for sequence, the downstream sequence, the three gene fragments second linearized plasmid sequences, and processed by the cloning kit E. coliHST08株に形質転換し、プラスミドpRI−AoΔprtR1::pyrGのpyrG遺伝子発現カセットの下流に前記マーカーリサイクリング用配列、前記下流配列を導入したプラスミドpRI−AoΔprtR::pyrGRを取得した。 Transformed into coliHST08 strain, the markers recycling for sequences downstream of the pyrG gene expression cassette of plasmid pRI-AoΔprtR1 :: pyrG, to obtain a plasmid pRI-AoΔprtR :: pyrGR introduced the downstream sequence.

次に、プラスミドpRI−AoΔprtR::pyrGRを鋳型に、プライマー9、10を用い、前記DNAポリメラーゼにてPCR増幅し、前記精製キットにて精製して麹菌形質転換用の遺伝子断片を取得した。 Next, the plasmid pRI-AoΔprtR :: pyrGR a template, with primers 9 and 10, the PCR amplified by DNA polymerase were obtained gene fragments for Aspergillus transformation was purified by the purification kit.

次に、PEG−カルシウム法により定法に従って、前記麹菌形質転換用の遺伝子断片を用い、アスペルギルス・オリゼHO2株を形質転換した。 Then, in accordance with a conventional method by PEG- calcium method, using the gene fragment for the koji mold transformant, and the Aspergillus oryzae HO2 strain was transformed.

次に、前記形質転換したアスペルギルス・オリゼHO2株から、CD培地にて生育できる株を選択し、prtR遺伝子欠損株を取得した。 Then, from the transformed Aspergillus oryzae HO2 strain and selecting a strain which can grow in CD medium to get the prtR gene-deficient strain.

次に、得られたprtR遺伝子欠損株の胞子懸濁液を、CD培地に終濃度1mg/1mLの5−フルオロオロチン酸一水和物(和光純薬工業株式会社製)と終濃度20mMのウリジン(シグマアルドリッチ社製)とを加えたプレート培地に、1×10 個/プレートになるように植菌し、生育できる株を選択して、prtR遺伝子とpyrG遺伝子との2遺伝子欠損株であり、ウリジン要求性を備える麹菌変異株としてアスペルギルス・オリゼHO3株を取得した。 Next, the spore suspension of the resulting prtR gene-deficient strain, CD medium at a final concentration of 1 mg / 1 mL 5-fluoroorotic acid monohydrate and (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) at a final concentration of 20mM uridine a plate medium supplemented with the (manufactured by sigma-Aldrich), was inoculated so as to be 1 × 10 6 cells / plate, and selecting a strain that can grow, is 2 gene-deficient strain of the prtR gene and pyrG genes It was obtained Aspergillus oryzae HO3 strain as Aspergillus mutant strain with a uridine auxotrophy.

プライマー1〜10の塩基配列を表1に示す。 The nucleotide sequences of the primers 1 to 10 shown in Table 1.

〔比較例1〕 Comparative Example 1
本比較例では、アスペルギルス・オリゼHO2株から、次のようにしてpepE遺伝子が欠損している麹菌変異株を構築した。 In this comparative example, from Aspergillus oryzae HO2 strain, pepE gene was constructed Aspergillus oryzae mutant strain deficient in the following manner.

まず、アスペルギルス・オリゼHO2株のゲノムDNA遺伝子を鋳型に、プライマー11、12にてpepE遺伝子の上流配列、プライマー13、14にて下流配列、プライマー15、16にてマーカーリサイクリング用配列、アスペルギルス・アワモリHA1株(受託番号:NITE BP−01751)のゲノムDNA遺伝子を鋳型に、プライマー7、8にてpyrG遺伝子発現カセットを、それぞれDNAポリメラーゼ(東洋紡績株式会社製、商品名:KOD -plus- neo)にてPCR増幅し、精製キット(QIAGEN社製、商品名:QIAquick PCR purification kit)にて精製して、計4つの遺伝子断片を取得した。 First, a genomic DNA gene of Aspergillus oryzae HO2 strain as a template, the upstream sequence of pepE gene in primers 11 and 12, the downstream sequence in the primer 13 and 14, SEQ markers recycling at primers 15 and 16, Aspergillus awamori HA1 strain (accession number: NITE BP-01751) genomic DNA gene of a template, the pyrG gene expression cassette by primer 7 and 8, respectively, DNA polymerase (Toyobo Co., Ltd., trade name: KOD -plus- neo ) was PCR amplified by, purification kit (QIAGEN Inc., trade name: was purified by QIAquick PCR purification kit), was obtained a total of four gene fragments.

次に、前記4つの遺伝子断片を用いた以外は、実施例1と全く同一にして、アスペルギルス・オリゼHO2株を形質転換した。 Next, except for using the four gene fragments, in the same manner as in Example 1, and the Aspergillus oryzae HO2 strain was transformed.

次に、前記形質転換したアスペルギルス・オリゼHO2株から、CD培地にて生育できる株を選択し、pepE遺伝子欠損株を取得した。 Then, from the transformed Aspergillus oryzae HO2 strain and selecting a strain which can grow in CD medium to get the pepE gene-deficient strain.

次に、得られたpepE遺伝子欠損株の胞子懸濁液を用いた以外は、実施例1と全く同一にして、pepE遺伝子とpyrG遺伝子との2遺伝子欠損株であり、ウリジン要求性を備える麹菌変異株を取得した。 Next, except for using a spore suspension of the resulting pepE gene-deficient strain, and in exactly the same manner as in Example 1, a 2 gene-deficient strain of the pepE gene and pyrG genes, Aspergillus oryzae comprising the uridine auxotrophy a mutant strain was obtained.

プライマー11〜16の塩基配列を表2に示す。 The nucleotide sequences of the primers 11 to 16 shown in Table 2.

〔比較例2〕 Comparative Example 2
本比較例では、アスペルギルス・オリゼHO2株から、次のようにしてpepA遺伝子が欠損している麹菌変異株を構築した。 In this comparative example, from Aspergillus oryzae HO2 strain, pepA gene was constructed Aspergillus oryzae mutant strain deficient in the following manner.

まず、アスペルギルス・オリゼHO2株のゲノムDNA遺伝子を鋳型に、プライマー17、18にてpepA遺伝子の上流配列、プライマー19、20にて下流配列、プライマー21、22にてマーカーリサイクリング用配列、アスペルギルス・アワモリHA1株(受託番号:NITE BP−01751)のゲノムDNA遺伝子を鋳型に、プライマー7、8にてpyrG遺伝子発現カセットを、それぞれDNAポリメラーゼ(東洋紡績株式会社製、商品名:KOD -plus- neo)にてPCR増幅し、精製キット(QIAGEN社製、商品名:QIAquick PCR purification kit)にて精製して、計4つの遺伝子断片を取得した。 First, a genomic DNA gene of Aspergillus oryzae HO2 strain as a template, the upstream sequences of the pepA gene in primer 17, the downstream sequence in the primer 19, the sequence markers recycling at primers 21 and 22, Aspergillus awamori HA1 strain (accession number: NITE BP-01751) genomic DNA gene of a template, the pyrG gene expression cassette by primer 7 and 8, respectively, DNA polymerase (Toyobo Co., Ltd., trade name: KOD -plus- neo ) was PCR amplified by, purification kit (QIAGEN Inc., trade name: was purified by QIAquick PCR purification kit), was obtained a total of four gene fragments.

次に、前記4つの遺伝子断片を用いた以外は、実施例1と全く同一にして、アスペルギルス・オリゼHO2株を形質転換した。 Next, except for using the four gene fragments, in the same manner as in Example 1, and the Aspergillus oryzae HO2 strain was transformed.

次に、前記形質転換したアスペルギルス・オリゼHO2株から、CD培地にて生育できる株を選択し、pepA遺伝子欠損株を取得した。 Then, from the transformed Aspergillus oryzae HO2 strain and selecting a strain which can grow in CD medium to get the pepA gene defective strain.

次に、得られたpepA遺伝子欠損株の胞子懸濁液を用いた以外は、実施例1と全く同一にして、pepA遺伝子とpyrG遺伝子との2遺伝子欠損株であり、ウリジン要求性を備える麹菌変異株を取得した。 Next, except for using a spore suspension of the resulting pepA gene-deficient strain, and in exactly the same manner as in Example 1, a 2 gene-deficient strain of the pepA gene and pyrG genes, Aspergillus oryzae comprising the uridine auxotrophy a mutant strain was obtained.

プライマー17〜22の塩基配列を表3に示す。 The nucleotide sequences of the primers 17 to 22 shown in Table 3.

〔比較例3〕 Comparative Example 3
本比較例では、アスペルギルス・オリゼHO2株から、次のようにしてtppA遺伝子が欠損している麹菌変異株を構築した。 In this comparative example, from Aspergillus oryzae HO2 strain, TPPA gene was constructed Aspergillus oryzae mutant strain deficient in the following manner.

まず、アスペルギルス・オリゼHO2株のゲノムDNA遺伝子を鋳型に、プライマー23、24にてtppA遺伝子の上流配列、プライマー25、26にて下流配列、プライマー27、28にてマーカーリサイクリング用配列、アスペルギルス・アワモリHA1株(受託番号:NITE BP−01751)のゲノムDNA遺伝子を鋳型に、プライマー7、8にてpyrG遺伝子発現カセットを、それぞれDNAポリメラーゼ(東洋紡績株式会社製、商品名:KOD -plus- neo)にてPCR増幅し、精製キット(QIAGEN社製、商品名:QIAquick PCR purification kit)にて精製して、計4つの遺伝子断片を取得した。 First, a genomic DNA gene of Aspergillus oryzae HO2 strain as a template, the upstream sequence of tppA gene in primers 23 and 24, the downstream sequence in the primer 25, the sequence markers recycling at primers 27 and 28, Aspergillus awamori HA1 strain (accession number: NITE BP-01751) genomic DNA gene of a template, the pyrG gene expression cassette by primer 7 and 8, respectively, DNA polymerase (Toyobo Co., Ltd., trade name: KOD -plus- neo ) was PCR amplified by, purification kit (QIAGEN Inc., trade name: was purified by QIAquick PCR purification kit), was obtained a total of four gene fragments.

次に、前記4つの遺伝子断片を用いた以外は、実施例1と全く同一にして、アスペルギルス・オリゼHO2株を形質転換した。 Next, except for using the four gene fragments, in the same manner as in Example 1, and the Aspergillus oryzae HO2 strain was transformed.

次に、前記形質転換したアスペルギルス・オリゼHO2株から、CD培地にて生育できる株を選択し、tppA遺伝子欠損株を取得した。 Then, from the transformed Aspergillus oryzae HO2 strain and selecting a strain which can grow in CD medium to get the tppA gene-deficient strain.

次に、得られたtppA遺伝子欠損株の胞子懸濁液を用いた以外は、実施例1と全く同一にして、tppA遺伝子とpyrG遺伝子との2遺伝子欠損株であり、ウリジン要求性を備える麹菌変異株を取得した。 Next, except for using a spore suspension of the resulting tppA gene-deficient strain, and in exactly the same manner as in Example 1, a 2 gene-deficient strain of tppA gene and pyrG genes, Aspergillus oryzae comprising the uridine auxotrophy a mutant strain was obtained.

プライマー23〜28の塩基配列を表4に示す。 The nucleotide sequences of the primers 23-28 shown in Table 4.

〔比較例4〕 Comparative Example 4
本比較例では、アスペルギルス・オリゼHO2株から、次のようにしてcpI遺伝子が欠損している麹菌変異株を構築した。 In this comparative example, from Aspergillus oryzae HO2 strain, CPI gene was constructed Aspergillus oryzae mutant strain deficient in the following manner.

まず、アスペルギルス・オリゼHO2株のゲノムDNA遺伝子を鋳型に、プライマー29、30にてcpI遺伝子の上流配列、プライマー31、32にて下流配列、プライマー33、34にてマーカーリサイクリング用配列、アスペルギルス・アワモリHA1株(受託番号:NITE BP−01751)のゲノムDNA遺伝子を鋳型に、プライマー7、8にてpyrG遺伝子発現カセットを、それぞれDNAポリメラーゼ(東洋紡績株式会社製、商品名:KOD -plus- neo)にてPCR増幅し、精製キット(QIAGEN社製、商品名:QIAquick PCR purification kit)にて精製して、計4つの遺伝子断片を取得した。 First, a genomic DNA gene of Aspergillus oryzae HO2 strain as a template, the upstream sequence of cpI gene in primers 29 and 30, the downstream sequence in the primer 31, the sequence markers recycling at primers 33 and 34, Aspergillus awamori HA1 strain (accession number: NITE BP-01751) genomic DNA gene of a template, the pyrG gene expression cassette by primer 7 and 8, respectively, DNA polymerase (Toyobo Co., Ltd., trade name: KOD -plus- neo ) was PCR amplified by, purification kit (QIAGEN Inc., trade name: was purified by QIAquick PCR purification kit), was obtained a total of four gene fragments.

次に、前記4つの遺伝子断片を用いた以外は、実施例1と全く同一にして、アスペルギルス・オリゼHO2株を形質転換した。 Next, except for using the four gene fragments, in the same manner as in Example 1, and the Aspergillus oryzae HO2 strain was transformed.

次に、前記形質転換したアスペルギルス・オリゼHO2株から、CD培地にて生育できる株を選択し、cpI遺伝子欠損株を取得した。 Then, from the transformed Aspergillus oryzae HO2 strain and selecting a strain which can grow in CD medium to get the cpI gene-deficient strain.

次に、得られたcpI遺伝子欠損株の胞子懸濁液を用いた以外は、実施例1と全く同一にして、cpI遺伝子とpyrG遺伝子との2遺伝子欠損株であり、ウリジン要求性を備える麹菌変異株を取得した。 Next, except for using a spore suspension of the resulting cpI gene-deficient strain, and in exactly the same manner as in Example 1, a 2 gene-deficient strain of cpI gene and pyrG genes, Aspergillus oryzae comprising the uridine auxotrophy a mutant strain was obtained.

プライマー29〜34の塩基配列を表5に示す。 The nucleotide sequence of the primer 29 to 34 shown in Table 5.

〔形質転換体の構築〕 [Construction of the transformants]
次に、セロビオハイドロラーゼ(cbh1)遺伝子を導入する場合を例として、形質転換体の構築方法について説明する。 Next, an example in which to introduce cellobiohydrolase (cbh1) gene, which describes how to build a transformant.

まず、アスペルギルス・オリゼHO2株のゲノムDNA遺伝子を鋳型に、プライマー35、36にてpyrG遺伝子の上流配列、プライマー37、38にて下流配列、プライマー39、40にてteflプロモーター遺伝子、プライマー41、42にてagdAターミネーター遺伝子、アクレモニウム・セルロリィティカスH1株(受託番号:NITE BP−11508)のゲノムDNAを鋳型に、プライマー43、44にてセロビオハイドロラーゼ(cbh1)遺伝子、アスペルギルス・アワモリHA1株(受託番号:NITE BP−01751)のゲノムDNA遺伝子を鋳型に、プライマー45、46にてpyrG遺伝子発現カセットを、それぞれDNAポリメラーゼ(東洋紡績株式会社製、商品名:KOD -plus- neo)にてPCR増幅し、精 First, a genomic DNA gene of Aspergillus oryzae HO2 strain as a template, TEFL promoter gene upstream sequence of the pyrG gene at the primer 35 and 36, the downstream sequence in the primer 37, in primer 39, 40, primer 41 agdA terminator gene by, Acremonium cellulolyticus Ryi Tikka scan an H1 strain (accession number: NITE BP-11508) genomic DNA as a template, the cellobiohydrolase (cbh1) in the primer 43, 44 genes, Aspergillus awamori HA1 strain (accession number: NITE BP-01751) genomic DNA gene of a template, the pyrG gene expression cassette in the primer 45 and 46, respectively, DNA polymerase (Toyobo Co., Ltd., trade name: KOD -plus- neo) to PCR amplification Te, and seminal 製キット(QIAGEN社製、商品名:QIAquick PCR purification kit)にて精製して、計6つの遺伝子断片を取得した。 Manufacturing kit (QIAGEN Inc., trade name: QIAquick PCR purification kit) was purified by, to obtain a total of six of the gene fragment.

次に、プラスミドpMD20(タカラバイオ株式会社製)を制限酵素SmaI(タカラバイオ株式会社製)にて30℃で処理し、前記精製キットにて精製してプラスミドの制限処理物(遺伝子断片)を取得した。 Then treated at 30 ° C. at plasmid pMD20 limit (Takara Bio Co., Ltd.) enzyme SmaI (manufactured by Takara Bio Inc.), obtaining plasmid restriction process product (gene fragment) to give the purification kit did.

前述のようにして得られた各遺伝子断片を、順次クローニングキット(タカラバイオ株式会社製、商品名:In-Fusion(登録商標) HD Cloning kit)にて処理し、E. Each gene fragment obtained as described above, sequentially cloning kit: treated with (Takara Bio Co., Ltd., trade name an In-Fusion (TM) HD Cloning kit), E. coliHST08株(タカラバイオ株式会社製)に形質転換し、プラスミドpPPT1−CBH1を取得した。 Transformed into coliHST08 strain (manufactured by Takara Bio Inc.), to obtain a plasmid pPPT1-CBH1.

次に、得られたプラスミドpPPT1−CBH1を鋳型として、プライマー47、48にて、前記DNAポリメラーゼにてPCR増幅し、前記精製キットにて精製して麹菌形質転換用の遺伝子断片(pyrG−CBH1断片)を取得した。 Next, the plasmid pPPT1-CBH1 obtained as a template, in the primer 47, 48, the DNA polymerase was PCR amplified by a gene fragment (pyrG-CBHl fragments for Aspergillus transformation was purified by the purification kit ) was obtained.

次に、PEG−カルシウム法の定法に従って、前記麹菌形質転換用の遺伝子断片(pyrG−CBH1断片)を用い、アスペルギルス・オリゼHO2株(参考例)と、実施例1及び比較例1〜4で得られたアスペルギルス・オリゼHO2株の遺伝子欠損株とをそれぞれ形質転換し、形質転換体を得た。 Then, in accordance with a conventional method of PEG- calcium method, using the koji mold gene fragments for transformation (pyrG-CBHl fragment), Aspergillus oryzae HO2 strain and (Reference Example) obtained in Example 1 and Comparative Examples 1 to 4 It was a gene-deficient strain of Aspergillus oryzae HO2 strain respectively were transformed to obtain transformants.

次に、得られた形質転換体からCDプレート培地で生育できる株を選択し、参考例、実施例1、比較例1〜4の麹菌変異株にそれぞれ対応する形質転換体を得た。 Next, select the strains which can grow in CD plate medium from the resulting transformant, reference examples, Example 1 to obtain respective Aspergillus oryzae mutant of Comparative Examples 1-4 corresponding transformants. 前記形質転換体は、いずれも染色体にセロビオハイドロラーゼ(cbh1)遺伝子が導入されており、セロビオハイドロラーゼを生産することができる。 The transformants both cellobiohydrolase (cbh1) gene has been introduced into the chromosome, it is possible to produce a cellobiohydrolase. 以下、セロビオハイドロラーゼ(cbh1)遺伝子が導入されて、セロビオハイドロラーゼを生産することができる形質転換体を「CBH1生産株」と記載する。 Hereinafter, cellobiohydrolase (cbh1) gene is introduced, it describes a transformant capable of producing cellobiohydrolase and "CBH1 producing strain".

プライマー35〜48の塩基配列を表6に示す。 The nucleotide sequences of the primers 35 to 48 shown in Table 6.

〔セロビオハイドロラーゼ生産量の測定〕 Measurement of cellobiohydrolase production]
次に、参考例、実施例1、比較例1〜4の麹菌変異株にそれぞれ対応するCBH1生産株によるセロビオハイドロラーゼ生産量の測定方法について説明する。 Next, Reference Examples, Examples 1, method for measuring cellobiohydrolase production by each of Aspergillus oryzae mutants of Comparative Examples 1-4 corresponding CBH1 producing strains will be described.

前記各CBH1生産株によるセロビオハイドロラーゼ生産量を測定するために、まず、前記各CBH1生産株を、CDプレート培地にて1週間培養して胞子を形成させ、0.01%POLYSORBATE20(和光純薬工業社製)を用いて回収し、胞子懸濁液を取得した。 To measure the cellobiohydrolase production by the respective CBH1 producing strain, firstly, the respective CBH1 producing strain and cultured for 1 week at CD plate medium to form spores, 0.01% Polysorbate 20 (Wako Pure were harvested with Chemical Industries Co., Ltd.), it was obtained spore suspension.

次に、100mL三角フラスコにPD液体培地(2質量/容量%デキストリン、1質量/容量%ポリペプトン、0.1質量/容量%カザミノ酸、0.5質量/容量%リン酸2水素カリウム、0.05質量/容量%硫酸マグネシウム、0.1質量/容量%硝酸ナトリウム)30mLを取り、これに前記胞子を最終胞子濃度1×10 /mLとなるように植菌し、30℃で6日間の液体培養を行い、目的酵素であるセロビオハイドロラーゼ(CBH1)が培地中に分泌発現されたCBH1生産株の培養液を得た。 Then, PD liquid medium 100mL Erlenmeyer flask (2 wt / vol% dextrin, 1 wt / vol% polypeptone, 0.1 wt / vol% casamino acid, dipotassium hydrogen 0.5 wt / vol% phosphoric acid, 0. 05 wt / vol% magnesium sulfate, take 0.1 wt / vol% sodium nitrate) 30 mL, which the inoculated spores to a final spore concentration 1 × 10 4 / mL, for 6 days at 30 ° C. perform liquid culture to obtain a culture of CBH1 production strains cellobiohydrolase (CBH1) was expressed and secreted into the culture medium is a target enzyme.

次に、各培養液中のCBH1濃度を、SDS−PAGE解析により確認した。 Next, the CBH1 concentration in each culture was confirmed by SDS-PAGE analysis. タンパク質濃度の基準とするために、0.25μg、0.5μg及び2μgのBSAを同時に泳動し、酵素サンプル10μL中のCBH1濃度をChemiDoc(登録商標)XRS+システムを用いた画像解析により算出した。 For a reference of protein concentration, 0.25 [mu] g, and at the same time migration of BSA 0.5μg and 2 [mu] g, it was calculated by image analysis using a ChemiDoc (TM) XRS + system CBH1 concentration in the enzyme sample 10 [mu] L.

結果を図1及び表7に示す。 The results are shown in Figure 1 and Table 7.

図1及び表1から、遺伝子欠損の無いアスペルギルス・オリゼHO2株(参考例)の形質転換体のセロビオハイドロラーゼ(CBH1)生産量の相対値を1.0とすると、アスペルギルス・オリゼHO2株の転写因子をコードするprtR遺伝子を欠損させたアスペルギルス・オリゼHO3株(実施例1)の形質転換体のCBH1生産量の相対値は1.11となり、参考例の形質転換体を上回ることがわかる。 From Figure 1 and Table 1, when the genetic defect no Aspergillus oryzae HO2 strain relative values ​​of cellobiohydrolase (CBHl) Production of transformant (Reference Example) and 1.0 of Aspergillus oryzae HO2 strain the relative value of CBH1 production of transformant transcription factor encoding prtR gene Aspergillus oryzae HO3 strain deficient (example 1) is found to exceed the 1.11 transformant of reference example.

また、表1から、アスペルギルス・オリゼHO2株のprtR遺伝子以外の遺伝子を欠損させた遺伝子欠損株(比較例1〜4)のCBH1生産量の相対値は0.97〜1.09であり、いずれも実施例1の形質転換体に及ばないことがわかる。 Further, from Table 1, the relative value of the CBH1 production of Aspergillus oryzae HO2 strain gene-deficient strain was deficient in genes other than prtR gene (Comparative Example 1-4) is from 0.97 to 1.09, any it can be seen that also fall short of transformants of example 1.

従って、実施例1のアスペルギルス・オリゼHO3株の形質転換体によれば、糖化酵素であるCBH1の生産量を飛躍的に向上させることができることが明らかである。 Therefore, according to the transformant of Aspergillus oryzae HO3 strain of Example 1, it is clear that it is possible to dramatically improve the production of a saccharification enzyme CBHl.

符号なし Unsigned

Claims (6)

  1. アスペルギルス・オリゼHO2株(受託番号:NITE BP−01750)の転写因子をコードする遺伝子prtRの全長又は一部が欠損していることを特徴とする麹菌変異株。 Aspergillus oryzae HO2 strain (Accession Number: NITE BP-01750) Aspergillus oryzae mutant full length or a part of a gene prtR that encodes a transcription factor, wherein the lacking of.
  2. 請求項1記載の麹菌変異株において、アスペルギルス・オリゼHO3株(受託番号:NITE BP−01954)であることを特徴とする麹菌変異株。 In Aspergillus oryzae mutant strain according to claim 1, Aspergillus oryzae HO3 strain (Accession Number: NITE BP-01954) Aspergillus oryzae mutant strain, which is a.
  3. アスペルギルス・オリゼHO2株(受託番号:NITE BP−01750)の転写因子をコードする遺伝子prtRの全長又は一部が欠損している麹菌変異株に、糖化酵素遺伝子が導入されていることを特徴とする形質転換体。 Aspergillus oryzae HO2 strain (Accession Number: NITE BP-01750) in Aspergillus oryzae mutant full length or a part of a gene prtR that encodes a transcription factor is deficient in, characterized in that the saccharifying enzyme gene has been introduced transformants.
  4. 請求項3記載の形質転換体において、前記糖化酵素遺伝子は、セロビオハイドロラーゼ遺伝子、β−グルコシダーゼ遺伝子、エンドキシラナーゼ遺伝子、アラビノフラノシダーゼ遺伝子、グルクロニダーゼ遺伝子、エンドグルカナーゼ遺伝子からなる群から選択される少なくとも1種の遺伝子であることを特徴とする形質転換体。 In transformant of claim 3, wherein said saccharifying enzyme gene is selected cellobiohydrolase gene, beta-glucosidase gene, endoxylanase gene, arabinofuranosidase gene, glucuronidase gene, from the group consisting of endoglucanase gene transformant, characterized in that at least one gene.
  5. 請求項4記載の形質転換体において、前記糖化酵素遺伝子は、アクレモニウム・セルロリティカス由来のセロビオハイドロラーゼ遺伝子、アクレモニウム・セルロリティカス由来のβ−グルコシダーゼ遺伝子、サーモアスカス属菌由来のエンドキシラナーゼ遺伝子、アクレモニウム・セルロリティカス由来のアラビノフラノシダーゼ遺伝子、アクレモニウム・セルロリティカス由来のグルクロニダーゼ遺伝子からなる群から選択される少なくとも1種の遺伝子であることを特徴とする形質転換体。 In transformant according to claim 4, wherein the saccharification enzyme gene, cellobiohydrolase gene derived from Acremonium cellulolyticus, beta-glucosidase gene from Acremonium cellulolyticus, derived from Thermomyces Asuka scan genus endoxylanase gene, transformant, characterized in that at least one gene that arabinofuranosidase gene from Acremonium cellulolyticus, is selected from the group consisting of glucuronidase gene from Acremonium cellulolyticus .
  6. 請求項3〜請求項5のいずれか1項記載の形質転換体において、前記糖化酵素遺伝子は、染色体中に導入されていることを特徴とする形質転換体。 In transformant according to any one of claims 3 to 5, wherein the saccharification enzyme gene, a transformant characterized in that it is introduced into the chromosome.
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