JP2016036322A - Chimeric protein binding to angiogenic factor - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、抗血管新生作用を有するキメラタンパク質に関する。本発明はさらに、上記キメラタンパク質をコードするＤＮＡ、ベクター、ウイルス、細胞、上記キメラタンパク質の製造方法、並びに薬学的組成物に関する。 The present invention relates to a chimeric protein having an anti-angiogenic action. The present invention further relates to a DNA, vector, virus, cell encoding the chimeric protein, a method for producing the chimeric protein, and a pharmaceutical composition.
血管新生は、新しい血管を形成するというプロセスであり、多くの正常な生理学的状態および異常な病理学的状態において非常に重要な役割を果たす。正常な生理学的条件下における血管新生は、例えば、創傷治癒、胎児および胚の発達、ならびに、黄体、子宮内膜および胎盤の形成においてみられる。 Angiogenesis is the process of forming new blood vessels and plays a very important role in many normal physiological and abnormal pathological conditions. Angiogenesis under normal physiological conditions is found, for example, in wound healing, fetal and embryonic development, and the formation of the corpus luteum, endometrium and placenta.
適切にコントロールされない血管新生が様々な疾患の発症ならびに進行の原因となっている。例えば、腫瘍の成長には新しく形成された血管により供給された酸素と栄養分が必要であるため、血管新生が関与する。また、関節リウマチ、網膜症、血管腫、乾癬などでも血管新生が認められる。コントロールされない血管新生が存在する多様な病理学的疾患状態が血管新生関連疾患として分類されている。 Angiogenesis that is not properly controlled is responsible for the onset and progression of various diseases. For example, angiogenesis is involved because tumor growth requires oxygen and nutrients supplied by newly formed blood vessels. Angiogenesis is also observed in rheumatoid arthritis, retinopathy, hemangioma, psoriasis and the like. A variety of pathological disease states in which uncontrolled angiogenesis exists are classified as angiogenesis-related diseases.
血管は血管内皮細胞から形成される管腔から形成され、血管新生においては血管内皮細胞の活性化が起こる。血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の結合によるＦＬＴ１（ＶＥＧＦＲ１）及びＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ２）の活性化は、血管内皮細胞の成長、移動及び生存にとって極めて重要であり、血管新生及び脈管形成に必須のプロセスである。ＶＥＧＦシグナルを阻害して血管新生を阻害する薬剤は、異常な血管新生を伴う疾患に対して効果を発揮する。例えば、アバスチン（登録商標）（ベバシズマブ）は、ＶＥＧＦに結合するモノクローナル抗体であり、様々ながんの処置において用いられている。ＶＥＧＦに結合するアプタマーであるマクジェン（登録商標）、可溶性ＶＥＧＦＲ−Ｆｃキメラタンパク質であるアイリーア（登録商標）は加齢性黄斑変性の処置において用いられている。 Blood vessels are formed from lumens formed from vascular endothelial cells, and activation of vascular endothelial cells occurs during angiogenesis. Activation of FLT1 (VEGFR1) and KDR (VEGFR2) by binding vascular endothelial growth factor (VEGF) is critical for vascular endothelial cell growth, migration and survival and is an essential process for angiogenesis and angiogenesis is there. A drug that inhibits VEGF signal to inhibit angiogenesis exerts an effect on diseases accompanied by abnormal angiogenesis. For example, Avastin® (bevacizumab) is a monoclonal antibody that binds to VEGF and is used in the treatment of various cancers. Macgen (registered trademark), an aptamer that binds to VEGF, and Airia (registered trademark), a soluble VEGFR-Fc chimeric protein, have been used in the treatment of age-related macular degeneration.
一方でトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−βファミリーのリガンドの一つである骨形成因子（ＢＭＰ）−９は血管新生に関与していることが報告されている（非特許文献１）。ＢＭＰ−９のＩ型細胞表面受容体はＡＬＫ１であり、ＡＣＶＲＬ１及びＡＣＶＲＬＫ１としてもまた知られている。ＡＬＫ１は、ＢＭＰ−９及びＢＭＰ−１０に対する親和性も備えている（非特許文献２）。 On the other hand, it has been reported that bone morphogenetic factor (BMP) -9, which is one of transforming growth factor (TGF) -β family ligands, is involved in angiogenesis (Non-patent Document 1). The type I cell surface receptor for BMP-9 is ALK1, also known as ACVRL1 and ACVRLK1. ALK1 also has an affinity for BMP-9 and BMP-10 (Non-patent Document 2).
ＡＬＫ１は血管内皮細胞選択的に発現していることが知られている。マウスにおいて、ＡＬＫ１遺伝子の機能喪失変異は発達途中の血管系における様々な異常を引き起こす（非特許文献３）（非特許文献４）。 ALK1 is known to be expressed selectively in vascular endothelial cells. In mice, loss-of-function mutations in the ALK1 gene cause various abnormalities in the developing vascular system (Non-patent Document 3) (Non-patent Document 4).
ヒトでは、ＡＬＫ１遺伝子における機能喪失変異は遺伝性出血性毛細管拡張症（オースラー・ウェーバー・レンデュ症候群、ＨＨＴ） に関連している。ＨＨＴ患者の典型的な症状には、繰り返される鼻血、胃腸出血、皮膚および粘膜皮膚の毛細血管拡張症、ならびに、肺、脳または肝臓の血管系における動静脈奇形が含まれる（非特許文献５）。 In humans, loss-of-function mutations in the ALK1 gene are associated with hereditary hemorrhagic telangiectasia (Austler-Weber-Rendu syndrome, HHT). Typical symptoms in HHT patients include repeated nasal bleeding, gastrointestinal bleeding, cutaneous and mucocutaneous telangiectasia, and arteriovenous malformations in the pulmonary, brain or liver vasculature (Non-Patent Document 5). .
ＢＭＰ−９およびＢＭＰ−１０がＡＬＫ１を血管内皮細胞において活性化することで、血管内皮細胞の増殖および遊走を促すことが示されている。ＢＭＰ−９は血管内皮細胞に作用することで、ＶＥＧＦＲ２やＴｉｅ２の発現を誘導する。ＢＭＰ−９の腫瘍細胞における強制発現は腫瘍中の血管密度を増加させることが示されている。（非特許文献６）。 BMP-9 and BMP-10 have been shown to activate ALK1 in vascular endothelial cells to promote vascular endothelial cell proliferation and migration. BMP-9 acts on vascular endothelial cells to induce the expression of VEGFR2 and Tie2. Forced expression of BMP-9 in tumor cells has been shown to increase vascular density in tumors. (Non-patent document 6).
ＢＭＰ−９が腫瘍血管の増加に関与していることから、これと結合しシグナルを抑制するＡＬＫ１Ｆｃキメラタンパク質が開発されている（非特特許文献７）、実際にＡＬＫ１Ｆｃを用いた基礎実験では、ＡＬＫ１Ｆｃはマウス自然膵がん発がんモデルにおいて腫瘍縮小効果を示した（非特許文献８）。また、角膜の血管新生をＡＬＫ１Ｆｃが阻害することが示された（非特許文献９）。 Since BMP-9 is involved in the increase of tumor blood vessels, an ALK1Fc chimeric protein that binds to it and suppresses the signal has been developed (Non-patent Document 7). In basic experiments using ALK1Fc, ALK1Fc was actually used. Showed a tumor reduction effect in a mouse spontaneous pancreatic cancer carcinogenesis model (Non-patent Document 8). It was also shown that ALK1Fc inhibits corneal neovascularization (Non-patent Document 9).
当初、血管内皮細胞を標的とした治療方法では、腫瘍細胞自体を標的とした治療方法と比較して薬剤耐性の獲得により治療抵抗性が生じる可能性は低いと考えられていた。しかし、アバスチン（登録商標）をはじめとした抗血管新生治療の臨床試験の結果、実際に治療抵抗性が確認された例が出現し、ＶＥＧＦＲキナーゼ阻害剤においても同様な治療抵抗性が懸念されている。 Initially, it was considered that a therapeutic method targeting vascular endothelial cells was less likely to cause treatment resistance by acquiring drug resistance than a therapeutic method targeting tumor cells themselves. However, as a result of clinical trials of anti-angiogenic treatment including Avastin (registered trademark), an example in which treatment resistance was actually confirmed appeared, and there is a concern about the same treatment resistance in VEGFR kinase inhibitors. Yes.
血管新生に関与する因子としては、ＶＥＧＦ以外にも種々知られており、前述したＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０以外にも、例えばＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、ＳＤＦ−１、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、ＥＧＦ、ＥＧ−ＶＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＨＧＦ、ＩＬ−１β、ＩＬ−８、ＭＭＰ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰｌＧＦ、Ｐｒｏｌａｃｔｉｎなどが挙げられる。ＶＥＧＦを標的とする薬剤に対する耐性腫瘍の出現するメカニズムの一つとして、ＶＥＧＦ阻害による血管量の低下に伴う低酸素状態が、血管新生因子であるＦＧＦ−２を誘導することが報告されている（非特許文献１０）。また、他の耐性獲得メカニズムとして、腫瘍から放出されるＧ−ＣＳＦが骨髄からＣＤ１１ｂ陽性細胞の動員を促し、この細胞が腫瘍に集積して腫瘍環境中で同様に血管新生因子であるＥＧ−ＶＥＧＦを放出するということも報告されている（非特許文献１０）。 Various factors other than VEGF are known as factors involved in angiogenesis. In addition to BMP-9 and BMP-10 described above, for example, FGF-1, FGF-2, FGF-4, FGF-7, SDF -1, Ang1, Ang2, EGF, EG-VEGF, G-CSF, HGF, IL-1β, IL-8, MMP, PDGF-AA, PDGF-BB, PDGF-AB, PlGF, Prolactin and the like. As one of the mechanisms for the emergence of resistant tumors to drugs targeting VEGF, it has been reported that hypoxia associated with a decrease in vascular volume due to VEGF inhibition induces FGF-2, an angiogenic factor ( Non-patent document 10). As another resistance acquisition mechanism, G-CSF released from the tumor promotes the recruitment of CD11b positive cells from the bone marrow, and these cells accumulate in the tumor and are similarly angiogenic factors EG-VEGF in the tumor environment. Has also been reported (Non-patent Document 10).
ＶＥＧＦを標的とする抗血管新生治療方法には、ＶＥＧＦに依存しない血管新生を促すバイパス経路の出現により耐性が出現しうるため、バイパス経路を押えて、より広範な治療選択域を示す新たな抗血管新生治療方法が求められている。 In anti-angiogenic treatment methods targeting VEGF, resistance can emerge due to the emergence of bypass pathways that promote angiogenesis independent of VEGF. There is a need for an angiogenesis treatment method.
ＶＥＧＦを標的とした抗血管新生治療方法では効果が現れない、または同治療方法を継続することで耐性を獲得した癌及び異常な血管新生を伴う疾患に対する治療薬を開発することが望まれている。本発明は、抗血管新生を有するキメラタンパク質を提供することを課題とする。本発明はさらに上記キメラタンパク質をコードするＤＮＡ、ベクター、ウイルス、細胞、上記キメラタンパク質の製造方法、並びに薬学的組成物を提供することを課題とする。 It is desired to develop a therapeutic agent for a cancer that has not been effective in an anti-angiogenic treatment method targeting VEGF, or has acquired resistance by continuing the treatment method, and a disease associated with abnormal angiogenesis. . An object of the present invention is to provide a chimeric protein having anti-angiogenesis. Another object of the present invention is to provide a DNA, vector, virus, cell, method for producing the chimeric protein, and pharmaceutical composition encoding the chimeric protein.
本発明者らは、上記課題を達成するために鋭意研究を進めたところ、ＶＥＧＦ、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０のいずれとも結合するキメラタンパク質が、腫瘍中の血管新生を抑制し、腫瘍増殖を抑制することを見出した。本発明のキメラタンパク質は、ＶＥＧＦ及びＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０に関連した疾患、例えば癌、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、関節リウマチ、乾癬、急性及び慢性炎症、アテローム性動脈硬化症並びにリンパ増殖性疾患等の疾患を治療するのに有用であると考えられる。 The inventors of the present invention have made extensive studies to achieve the above-mentioned problems. As a result, a chimeric protein that binds to any of VEGF, BMP-9, and BMP-10 suppresses angiogenesis in the tumor and suppresses tumor growth. I found it to suppress. The chimeric protein of the present invention can be used to treat VEGF and BMP-9, diseases related to BMP-10 such as cancer, age-related macular degeneration, diabetic retinopathy, rheumatoid arthritis, psoriasis, acute and chronic inflammation, atherosclerosis It is considered useful for treating diseases such as symptom and lymphoproliferative disease.
すなわち本発明は次の（１）〜（２５）に関するものである。
（１） ＢＭＰ−９のＩ型細胞表面受容体の細胞外ドメイン及びＶＥＧＦの細胞膜上受容体の細胞外ドメインを有し、ＢＭＰ−９及びＶＥＧＦに結合するキメラタンパク質。
（２） ＢＭＰ−９のＩ型細胞表面受容体の細胞外ドメインがＡＬＫ１細胞外ドメインである、（１）に記載のキメラタンパク質。
（３） ＶＥＧＦの細胞膜上受容体の細胞外ドメインがＦＬＴ１細胞外ドメインである、（１）又は（２）に記載のキメラタンパク質。
（４） ＦＬＴ１細胞外ドメイン中のＩｇ２ドメインを有する、（１）から（３）の何れかに記載のキメラタンパク質。
（５） ＡＬＫ１細胞外ドメイン及びＦＬＴ１細胞外ドメイン中のＩｇ２ドメインを有する、（１）から（４）の何れかに記載のキメラタンパク質。
（６） さらに二量体化ドメインを有する、（１）から（５）の何れかに記載のキメラタンパク質。
（７） 二量体化ドメインが免疫グロブリンドメインである、（６）に記載のキメラタンパク質。
（８） 免疫グロブリンドメインが、ＩｇＧのＦｃドメイン、ＩｇＧの重鎖、又はＩｇＧの軽鎖である、（７）に記載のキメラタンパク質。
（９） 免疫グロブリンドメインが、ＩｇＧのＦｃドメインである、（７）に記載のキメラタンパク質。
（１０） ＢＭＰ−９のＩ型細胞表面受容体の細胞外ドメインのカルボキシ（Ｃ）末端にＶＥＧＦの細胞膜上受容体の細胞外ドメインのアミノ（Ｎ）末端が結合し、ＶＥＧＦの細胞膜上受容体の細胞外ドメインのＣ末端に免疫グロブリンドメインのＮ末端が結合している、（１）から（９）の何れかに記載のキメラタンパク質。
（１１） ＶＥＧＦの細胞膜上受容体の細胞外ドメインのＣ末端にＢＭＰ−９のＩ型細胞表面受容体の細胞外ドメインのＮ末端が結合し、ＢＭＰ−９のＩ型細胞表面受容体の細胞外ドメインのＣ末端に免疫グロブリンドメインのＮ末端が結合している、（１）から（９）の何れかに記載のキメラタンパク質。
（１２） 以下の（ａ）〜（ｃ）の何れかである、（１）から（１１）の何れかに記載のキメラタンパク質。
（ａ）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるキメラタンパク質；
（ｂ）配列番号４で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ＢＭＰ−９及びＶＥＧＦに結合するキメラタンパク質；又は
（ｃ）配列番号４で表されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加しているアミノ酸配列からなり、ＢＭＰ−９及びＶＥＧＦに結合するキメラタンパク質；
（１３） アセチル修飾またはポリエチレングリコール修飾を受けている、（１）から（１２）の何れかに記載のキメラタンパク質。
（１４） 二量体化している、（１）から（１３）の何れかに記載のキメラタンパク質。
（１５） 以下の（ａ）〜（ｃ）の何れかのキメラタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ａ）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるキメラタンパク質；
（ｂ）配列番号４で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ＢＭＰ−９及びＶＥＧＦに結合するキメラタンパク質；又は
（ｃ）配列番号４で表されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加しているアミノ酸配列からなり、ＢＭＰ−９及びＶＥＧＦに結合するキメラタンパク質；
（１６） 以下の（ｄ）又は（ｅ）の何れかのＤＮＡ。
（ｄ）配列番号８で表される塩基配列からなるＤＮＡ；又は
（ｅ）配列番号８で表される塩基配列において１又は数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加している塩基配列からなり、ＢＭＰ−９及びＶＥＧＦに結合するキメラタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ。
（１７） （１５）又は（１６）に記載のＤＮＡを含むベクター。
（１８） （１７）に記載のベクターを有するウイルス。
（１９） （１７）に記載のベクター又は（１８）に記載のウイルスを有する細胞。
（２０） 細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞及び哺乳動物細胞から成る群から選択される細胞である、（１９）に記載の細胞。
（２１） （１９）又は（２０）に記載の細胞を培養する工程を含む、（１）から（１４）の何れかに記載のキメラタンパク質を製造する方法。
（２２） （１）から（１４）の何れかに記載のキメラタンパク質、（１５）又は（１６）に記載のＤＮＡ、（１７）に記載のベクター、（１８）に記載のウイルス、あるいは（１９）又は（２０）に記載の細胞を含む、薬学的組成物。
（２３） ＶＥＧＦ阻害剤である、（２２）に記載の薬学的組成物。
（２４） 抗血管新生剤である、（２２）に記載の薬学的組成物。
（２５） 抗腫瘍剤である、（２２）に記載の薬学的組成物。
That is, the present invention relates to the following (1) to (25).
(1) A chimeric protein having an extracellular domain of a BMP-9 type I cell surface receptor and an extracellular domain of a receptor on the cell membrane of VEGF, which binds to BMP-9 and VEGF.
(2) The chimeric protein according to (1), wherein the extracellular domain of BMP-9 type I cell surface receptor is the ALK1 extracellular domain.
(3) The chimeric protein according to (1) or (2), wherein the extracellular domain of a receptor on the plasma membrane of VEGF is the FLT1 extracellular domain.
(4) The chimeric protein according to any one of (1) to (3), which has an Ig2 domain in the FLT1 extracellular domain.
(5) The chimeric protein according to any one of (1) to (4), which has an Ig2 domain in the ALK1 extracellular domain and the FLT1 extracellular domain.
(6) The chimeric protein according to any one of (1) to (5), further having a dimerization domain.
(7) The chimeric protein according to (6), wherein the dimerization domain is an immunoglobulin domain.
(8) The chimeric protein according to (7), wherein the immunoglobulin domain is an IgG Fc domain, an IgG heavy chain, or an IgG light chain.
(9) The chimeric protein according to (7), wherein the immunoglobulin domain is an Fc domain of IgG.
(10) The amino (N) terminus of the extracellular domain of the VEGF on-cell receptor binds to the carboxy (C) terminus of the extracellular domain of BMP-9 type I cell surface receptor, and the VEGF on-cell receptor The chimeric protein according to any one of (1) to (9), wherein the N-terminus of the immunoglobulin domain is bound to the C-terminus of the extracellular domain of.
(11) The N-terminal of the extracellular domain of the BMP-9 type I cell surface receptor binds to the C-terminal of the extracellular domain of the receptor on the cell membrane of VEGF, and the cell of the type I cell surface receptor of BMP-9 The chimeric protein according to any one of (1) to (9), wherein the N-terminus of the immunoglobulin domain is bound to the C-terminus of the outer domain.
(12) The chimeric protein according to any one of (1) to (11), which is any of the following (a) to (c):
(A) a chimeric protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4;
(B) a chimeric protein comprising an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 and binding to BMP-9 and VEGF; or (c) the amino acid represented by SEQ ID NO: 4 A chimeric protein consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted and / or added in the sequence and binding to BMP-9 and VEGF;
(13) The chimeric protein according to any one of (1) to (12), which is subjected to acetyl modification or polyethylene glycol modification.
(14) The chimeric protein according to any one of (1) to (13), which is dimerized.
(15) A DNA encoding any of the following chimeric proteins (a) to (c):
(A) a chimeric protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4;
(B) a chimeric protein comprising an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 and binding to BMP-9 and VEGF; or (c) the amino acid represented by SEQ ID NO: 4 A chimeric protein consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted and / or added in the sequence and binding to BMP-9 and VEGF;
(16) DNA of any of the following (d) or (e).
(D) DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 8; or (e) a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted and / or added in the base sequence represented by SEQ ID NO: 8. A DNA comprising a base sequence encoding a chimeric protein that binds to BMP-9 and VEGF.
(17) A vector comprising the DNA according to (15) or (16).
(18) A virus having the vector according to (17).
(19) A cell having the vector according to (17) or the virus according to (18).
(20) The cell according to (19), which is a cell selected from the group consisting of bacterial cells, yeast cells, insect cells and mammalian cells.
(21) A method for producing the chimeric protein according to any one of (1) to (14), comprising a step of culturing the cell according to (19) or (20).
(22) The chimeric protein according to any one of (1) to (14), the DNA according to (15) or (16), the vector according to (17), the virus according to (18), or (19 Or a pharmaceutical composition comprising the cell according to (20).
(23) The pharmaceutical composition according to (22), which is a VEGF inhibitor.
(24) The pharmaceutical composition according to (22), which is an anti-angiogenic agent.
(25) The pharmaceutical composition according to (22), which is an antitumor agent.
さらに本発明によれば、以下の発明が提供される。
（２６） ＶＥＧＦ阻害に使用するための、（１）から（１４）の何れかに記載のキメラタンパク質、（１５）又は（１６）に記載のＤＮＡ、（１７）に記載のベクター、（１８）に記載のウイルス、あるいは（１９）又は（２０）に記載の細胞。
（２７） 血管新生の抑制に使用するための、（１）から（１４）の何れかに記載のキメラタンパク質、（１５）又は（１６）に記載のＤＮＡ、（１７）に記載のベクター、（１８）に記載のウイルス、あるいは（１９）又は（２０）に記載の細胞。
（２８） 腫瘍の予防及び／又は治療に使用するための、（１）から（１４）の何れかに記載のキメラタンパク質、（１５）又は（１６）に記載のＤＮＡ、（１７）に記載のベクター、（１８）に記載のウイルス、あるいは（１９）又は（２０）に記載の細胞。
（２９） ＶＥＧＦ阻害剤の製造のための、（１）から（１４）の何れかに記載のキメラタンパク質、（１５）又は（１６）に記載のＤＮＡ、（１７）に記載のベクター、（１８）に記載のウイルス、あるいは（１９）又は（２０）に記載の細胞の使用。
（３０） 抗血管新生剤の製造のための、（１）から（１４）の何れかに記載のキメラタンパク質、（１５）又は（１６）に記載のＤＮＡ、（１７）に記載のベクター、（１８）に記載のウイルス、あるいは（１９）又は（２０）に記載の細胞の使用。
（３１） 抗腫瘍剤の製造のための、（１）から（１４）の何れかに記載のキメラタンパク質、（１５）又は（１６）に記載のＤＮＡ、（１７）に記載のベクター、（１８）に記載のウイルス、あるいは（１９）又は（２０）に記載の細胞の使用。
（３２） （１）から（１４）の何れかに記載のキメラタンパク質、（１５）又は（１６）に記載のＤＮＡ、（１７）に記載のベクター、（１８）に記載のウイルス、あるいは（１９）又は（２０）に記載の細胞を、ＶＥＧＦ阻害を必要とする対象者に投与することを含む、ＶＥＧＦの阻害方法。
（３３） （１）から（１４）の何れかに記載のキメラタンパク質、（１５）又は（１６）に記載のＤＮＡ、（１７）に記載のベクター、（１８）に記載のウイルス、あるいは（１９）又は（２０）に記載の細胞を、血管新生の抑制を必要とする対象者に投与することを含む、血管新生の抑制方法。
（３４） （１）から（１４）の何れかに記載のキメラタンパク質、（１５）又は（１６）に記載のＤＮＡ、（１７）に記載のベクター、（１８）に記載のウイルス、あるいは（１９）又は（２０）に記載の細胞を、対象者に投与することを含む、腫瘍を抑制する方法。
Furthermore, according to the present invention, the following inventions are provided.
(26) The chimeric protein according to any one of (1) to (14), the DNA according to (15) or (16), the vector according to (17), (18) for use in VEGF inhibition Or the cell according to (19) or (20).
(27) The chimeric protein according to any one of (1) to (14), the DNA according to (15) or (16), the vector according to (17), which is used for suppressing angiogenesis, The virus according to 18), or the cell according to (19) or (20).
(28) The chimeric protein according to any one of (1) to (14), the DNA according to (15) or (16), or the DNA according to (17) for use in prevention and / or treatment of a tumor A vector, the virus according to (18), or the cell according to (19) or (20).
(29) For the production of a VEGF inhibitor, the chimeric protein according to any one of (1) to (14), the DNA according to (15) or (16), the vector according to (17), (18 ) Or the cell according to (19) or (20).
(30) The chimeric protein according to any one of (1) to (14), the DNA according to (15) or (16), the vector according to (17) for the production of an anti-angiogenic agent, Use of the virus according to 18) or the cell according to (19) or (20).
(31) The chimeric protein according to any one of (1) to (14), the DNA according to (15) or (16), the vector according to (17), (18) for the production of an antitumor agent ) Or the cell according to (19) or (20).
(32) The chimeric protein according to any one of (1) to (14), the DNA according to (15) or (16), the vector according to (17), the virus according to (18), or (19 ) Or the method of inhibiting VEGF, comprising administering the cell according to (20) to a subject in need of VEGF inhibition.
(33) The chimeric protein according to any one of (1) to (14), the DNA according to (15) or (16), the vector according to (17), the virus according to (18), or (19 ) Or the cell according to (20), comprising administering to a subject in need of inhibition of angiogenesis.
(34) The chimeric protein according to any one of (1) to (14), the DNA according to (15) or (16), the vector according to (17), the virus according to (18), or (19 ) Or a method for suppressing a tumor, comprising administering the cell according to (20) to a subject.
本発明のキメラタンパク質は、ＢＭＰ−９及びＶＥＧＦに結合する新たなキメラタンパク質であり、ＢＭＰ−９シグナルのみならずＶＥＧＦシグナルも抑制する。本発明のキメラタンパク質は、疾患における血管新生を効果的に抑制し、新規な抗血管新生阻害薬、抗腫瘍剤、抗乾癬剤として期待できる。 The chimeric protein of the present invention is a new chimeric protein that binds to BMP-9 and VEGF, and suppresses not only BMP-9 signal but also VEGF signal. The chimeric protein of the present invention effectively suppresses angiogenesis in diseases and can be expected as a novel anti-angiogenesis inhibitor, antitumor agent, and anti-psoriatic agent.
（１）キメラタンパク質
本発明のキメラタンパク質は、ＢＭＰ−９のＩ型細胞表面受容体の細胞外ドメイン及びＶＥＧＦ（ＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＢ）の細胞膜上受容体の細胞外ドメインを有し、ＢＭＰ−９及びＶＥＧＦ（ＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＢ）に結合することを特徴とする。
(1) Chimeric protein The chimeric protein of the present invention has an extracellular domain of a BMP-9 type I cell surface receptor and an extracellular domain of a receptor on the plasma membrane of VEGF (VEGFA and VEGFB), and BMP-9 and It is characterized by binding to VEGF (VEGFA and VEGFB).
ＢＭＰ−９のＩ型細胞表面受容体の細胞外ドメインとしては、ＡＬＫ１細胞外ドメイン、ＡＬＫ２細胞外ドメイン、ＡＬＫ３細胞外ドメインなどが挙げられ、特にＡＬＫ１細胞外ドメインが好ましい。 Examples of the extracellular domain of BMP-9 type I cell surface receptor include ALK1 extracellular domain, ALK2 extracellular domain, ALK3 extracellular domain and the like, and ALK1 extracellular domain is particularly preferable.
ＡＬＫ１細胞外ドメインとしては、配列番号１で表されるアミノ酸配列、及び配列番号１で表されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加にしているアミノ酸配列であって、ヒトＢＭＰ−９との結合能を有するアミノ酸配列を挙げることができる。なお、ＡＬＫ１細胞外ドメインはヒト以外の生物由来のＡＬＫ１細胞外ドメインであってもヒトＢＭＰ−９との結合能を有するものであれば本発明において利用可能である。本発明においてはＢＭＰ−９に対して親和性を示すＩｇ２ドメインを有するアミノ酸配列が好ましい。 The ALK1 extracellular domain includes an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted and / or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. An amino acid sequence having the ability to bind to human BMP-9 can be mentioned. The ALK1 extracellular domain can be used in the present invention as long as it has an ability to bind to human BMP-9 even if it is an ALK1 extracellular domain derived from a non-human organism. In the present invention, an amino acid sequence having an Ig2 domain showing affinity for BMP-9 is preferred.
ＶＥＧＦＡの細胞膜上受容体の細胞外ドメインとしては、ＦＬＴ１細胞外ドメイン、ＦＬＫ１細胞外ドメイン、ＮＲＰ１細胞外ドメイン、ＮＲＰ２細胞外ドメインなどが挙げられ、特にＦＬＴ１細胞外ドメインが好ましい。ＶＥＧＦＢの細胞膜上受容体の細胞外ドメインとしては、ＦＬＴ１細胞外ドメイン、ＮＲＰ１細胞外ドメイン、などが挙げられ、特にＦＬＴ１細胞外ドメインが好ましい。 Examples of the extracellular domain of the receptor on the cell membrane of VEGFA include the FLT1 extracellular domain, the FLK1 extracellular domain, the NRP1 extracellular domain, the NRP2 extracellular domain, and the FLT1 extracellular domain is particularly preferable. Examples of the extracellular domain of the receptor on the cell membrane of VEGFB include the FLT1 extracellular domain, the NRP1 extracellular domain, and the like, and the FLT1 extracellular domain is particularly preferable.
ＦＬＴ１細胞外ドメインのアミノ酸配列としては、配列番号２で表されるアミノ酸配列、及び配列番号２で表されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加しているアミノ酸配列であって、ヒトＶＥＧＦとの結合能を有するアミノ酸配列を挙げることができる、なお、ＦＬＴ１細胞外ドメインは、ヒト以外の生物由来ＦＬＴ１細胞外ドメインであってもヒトＶＥＧＦとの結合能を有するものであれば本発明において利用可能である。本発明においてはＶＥＧＦに対して親和性を示すＩｇ２ドメインを有するアミノ酸配列が好ましい。 The amino acid sequence of the FLT1 extracellular domain includes the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 with one or several amino acid deletions, substitutions, and / or additions An amino acid sequence that has a binding ability to human VEGF can be mentioned, and the FLT1 extracellular domain has a binding ability to human VEGF even if it is a FLT1 extracellular domain derived from a non-human organism. Anything can be used in the present invention. In the present invention, an amino acid sequence having an Ig2 domain showing affinity for VEGF is preferable.
本発明においてはさらに二量体化ドメインを有するキメラタンパク質がより好ましい。二量体化ドメインにより本発明のキメラタンパク質は二量体化し、血中滞留性の向上が期待できる。 In the present invention, a chimeric protein further having a dimerization domain is more preferred. The chimeric protein of the present invention is dimerized by the dimerization domain, and improvement in blood retention can be expected.
本発明において二量体化ドメインは本発明のキメラタンパク質を二量体化させるものであれば特に限定されない。例えば、免疫グロブリンドメインを使用することができ、具体的には、ＩｇＧのＦｃドメイン（例えば、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメイン、ヒトＩｇＧ２のＦｃドメイン、ヒトＩｇＧ３のＦｃドメイン、ヒトＩｇＧ４のＦｃドメインなど）が挙げられる。また、ＩｇＧの重鎖、又はＩｇＧの軽鎖でもよい。また、ヒト以外の生物由来の免疫グロブリンドメインでもよい。さらに、これらのアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加しているアミノ酸配列からなるものでもよい。本発明においてはキメラタンパク質の血中滞留性を向上させる免疫グロブリンドメインを使用することが好ましい。 In the present invention, the dimerization domain is not particularly limited as long as it dimerizes the chimeric protein of the present invention. For example, immunoglobulin domains can be used, specifically IgG Fc domains (eg, human IgG1 Fc domain, human IgG2 Fc domain, human IgG3 Fc domain, human IgG4 Fc domain, etc.). Can be mentioned. Further, it may be an IgG heavy chain or an IgG light chain. Further, it may be an immunoglobulin domain derived from a non-human organism. Further, these amino acid sequences may be composed of amino acid sequences in which one or several amino acids are deleted, substituted and / or added. In the present invention, it is preferable to use an immunoglobulin domain that improves the retention of the chimeric protein in blood.
本発明において使用できる二量体化ドメインの一例としては、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインであって、配列番号３で表されるアミノ酸配列で示されるものである。 An example of a dimerization domain that can be used in the present invention is the Fc domain of human IgG1, which is represented by the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3.
本発明のキメラタンパク質において、ＢＭＰ−９のＩ型細胞表面受容体の細胞外ドメイン（例えば、ＡＬＫ１細胞外ドメイン）とＶＥＧＦの細胞膜上受容体の細胞外ドメイン（例えば、ＦＬＴ１細胞外ドメイン）の配列順序は特に限定されない。即ち、ＢＭＰ−９のＩ型細胞表面受容体の細胞外ドメインのＣ末端にＶＥＧＦの細胞膜上受容体の細胞外ドメインのＮ末端が結合していてもよいし、ＶＥＧＦの細胞膜上受容体の細胞外ドメインのＣ末端にＢＭＰ−９のＩ型細胞表面受容体の細胞外ドメインのＮ末端が結合していてもよい。また、各ドメインがアミノ酸やペプチド、親水性ポリマーなど、何らかのリンカーを介して結合していてもよい。 In the chimeric protein of the present invention, the sequence of the extracellular domain (eg, ALK1 extracellular domain) of type I cell surface receptor of BMP-9 and the extracellular domain (eg, FLT1 extracellular domain) of the receptor on the plasma membrane of VEGF The order is not particularly limited. That is, the N-terminus of the extracellular domain of the VEGF on-cell membrane receptor may be bound to the C-terminus of the extracellular domain of the type I cell surface receptor of BMP-9, or the cell of the VEGF on-cell membrane receptor The N-terminus of the extracellular domain of the BMP-9 type I cell surface receptor may be bound to the C-terminus of the outer domain. In addition, each domain may be bound via some kind of linker such as an amino acid, a peptide, or a hydrophilic polymer.
ＢＭＰ−９のＩ型細胞表面受容体の細胞外ドメインとしてＡＬＫ１細胞外ドメインを含み、ＶＥＧＦの細胞膜上受容体の細胞外ドメインとしてＦＬＴ１細胞外ドメインを含み、さらに免疫グロブリンドメインを含むキメラタンパク質の場合の例としては、ＡＬＫ１細胞外ドメインのＣ末端にＦＬＴ１細胞外ドメインのＮ末端が結合し、ＦＬＴ１細胞外ドメインのＣ末端に免疫グロブリンドメインのＮ末端が結合しているキメラタンパク質、及びＦＬＴ１細胞外ドメインのＣ末端にＡＬＫ１細胞外ドメインのＮ末端が結合し、ＡＬＫ１細胞外ドメインのＣ末端に免疫グロブリンドメインのＮ末端が結合しているキメラタンパク質を挙げることができる。また、各ドメインがアミノ酸やペプチド、親水性ポリマーなど、何らかのリンカーを介して結合していてもよい。 In the case of a chimeric protein containing the ALK1 extracellular domain as the extracellular domain of the BMP-9 type I cell surface receptor, the FLT1 extracellular domain as the extracellular domain of the VEGF on-cell receptor, and further containing the immunoglobulin domain As an example, a chimeric protein in which the N-terminus of the FLT1 extracellular domain is bound to the C-terminus of the ALK1 extracellular domain, and the N-terminus of the immunoglobulin domain is bound to the C-terminus of the FLT1 extracellular domain, and the FLT1 extracellular Mention may be made of chimeric proteins in which the N-terminus of the ALK1 extracellular domain is bound to the C-terminus of the domain, and the N-terminus of the immunoglobulin domain is bound to the C-terminus of the ALK1 extracellular domain. In addition, each domain may be bound via some kind of linker such as an amino acid, a peptide, or a hydrophilic polymer.
リンカーがアミノ酸やペプチドの場合は、キメラタンパク質のベクターを構築する際に、各ドメインのＤＮＡ配列とリンカーのＤＮＡ配列を用いてベクターを構築すればよい。リンカーのペプチドとしては、例えば、ＣＧＧ−、ＣＡＡ−、ＣＬＬ−、ＣＶＶ−、ＣＬＡ−、ＣＧ−、ＣＧＧＧ−、ＣＧＧＧＧ−、ＣＧＧＧＧＧ−、（ＧＧＧＧＳ）3、（ＧＧＧＧＳ）6、ＶＣｉｔ、ＡＦ(（Ｇはグリシン、Ａはアラニン、Ｌはロイシン、Ｖはバリン、Ｓはセリン、Ｃｉｔはシトルリン、Ｆはフェニルアラニンをそれぞれ示す。）などを挙げることができる。また、リンカーの親水性ポリマーとしては、例えば、ヒドロキシ基、カルボキシル基、カルボキシレート基、ヒドロキシエチル基、ポリオキシエチル基、ヒドロキシプロピル基、ポリオキシプロピル基、アミノ基、アミノエチル基、アミノプロピル基、アンモニウム基、アミド基、カルボキシメチル基、スルホン酸基、リン酸基などの親水性基を有するものを挙げることができ、具体的には、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、デンプン誘導体、カルボキシメチルセルロースおよびそのナトリウム塩、セルロースアセテート、アルギン酸ナトリウム、酢酸ビニル−マレイン酸コポリマー類、スチレン−マレイン酸コポリマー類、ポリアクリル酸類およびそれらの塩、ポリメタクリル酸類およびそれらの塩、ヒドロキシエチルメタクリレートのホモポリマーおよびコポリマー、ヒドロキシエチルアクリレートのホモポリマーおよびコポリマー、ヒドロキシピロピルメタクリレートのホモポリマーおよびコポリマー、ヒドロキシプロピルアクリレートのホモポリマーおよびコポリマー、ヒドロキシブチルメタクリレートのホモポリマーおよびコポリマー、ヒドロキシブチルアクリレートのホモポリマーおよびコポリマー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）類、ヒドロキシプロピレンポリマー類、ポリビニルアルコール類、加水分解度が６０モル％以上、好ましくは８０モル％以上である加水分解ポリビニルアセテート、ポリビニルホルマール、ポリビニルブチラール、ポリビニルピロリドン、アクリルアミドのホモポリマーおよびコポリマー、メタクリルアミドのホモポリマーおよびポリマー、Ｎ−メチロールアクリルアミドのホモポリマーおよびコポリマー、アルコール可溶性ナイロン、２，２−ビス−（４−ヒドロキシフェニル）−プロパンとエピクロロヒドリンとのポリエーテルなどを挙げることができるが、ＰＥＧが好ましい。ＰＥＧの分子量は特に限定されず、例えば、ＰＥＧ２００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ５００、ＰＥＧ２０００、ＰＥＧ５０００、ＰＥＧ１００００、ＰＥＧ２００００、ＰＥＧ３００００、ＰＥＧ３５０００などを用いることができる。 When the linker is an amino acid or a peptide, the vector may be constructed using the DNA sequence of each domain and the DNA sequence of the linker when constructing a chimeric protein vector. Examples of the linker peptide include CGG-, CAA-, CLL-, CVV-, CLA-, CG-, CGGG-, CGGGGG-, CGGGGGG-, (GGGGGS) 3 , (GGGGS) 6 , VCit, AF (( G represents glycine, A represents alanine, L represents leucine, V represents valine, S represents serine, Cit represents citrulline, and F represents phenylalanine.) Examples of the hydrophilic polymer of the linker include: Hydroxy group, carboxyl group, carboxylate group, hydroxyethyl group, polyoxyethyl group, hydroxypropyl group, polyoxypropyl group, amino group, aminoethyl group, aminopropyl group, ammonium group, amide group, carboxymethyl group, List those having hydrophilic groups such as sulfonic acid groups and phosphoric acid groups Specifically, gum arabic, casein, gelatin, starch derivatives, carboxymethylcellulose and its sodium salt, cellulose acetate, sodium alginate, vinyl acetate-maleic acid copolymers, styrene-maleic acid copolymers, polyacrylic acids And salts thereof, polymethacrylic acids and salts thereof, homopolymers and copolymers of hydroxyethyl methacrylate, homopolymers and copolymers of hydroxyethyl acrylate, homopolymers and copolymers of hydroxypyrrole methacrylate, homopolymers and copolymers of hydroxypropyl acrylate, Homopolymers and copolymers of hydroxybutyl methacrylate, homopolymers of hydroxybutyl acrylate and Polymer, polyethylene glycol (PEG), hydroxypropylene polymers, polyvinyl alcohol, hydrolyzed polyvinyl acetate, polyvinyl formal, polyvinyl butyral, polyvinyl pyrrolidone, acrylamide having a hydrolysis degree of 60 mol% or more, preferably 80 mol% or more Homopolymers and copolymers of methacrylamide, homopolymers and polymers of methacrylamide, homopolymers and copolymers of N-methylolacrylamide, alcohol soluble nylon, poly of 2,2-bis- (4-hydroxyphenyl) -propane and epichlorohydrin Although ether can be exemplified, PEG is preferable, and the molecular weight of PEG is not particularly limited, and examples thereof include PEG200, PEG400, PEG500, PEG2000, EG5000, PEG10000, PEG20000, PEG30000, or the like can be used PEG35000.
本発明のキメラタンパク質の具体例としては、以下の（ａ）〜（ｃ）の何れかのキメラタンパク質を挙げることができる。
（ａ）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるキメラタンパク質；
（ｂ）配列番号４で表されるアミノ酸配列と９０％以上（好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ＢＭＰ−９及びＶＥＧＦに結合するキメラタンパク質；又は
（ｃ）配列番号４で表されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加しているアミノ酸配列からなり、ＢＭＰ−９及びＶＥＧＦに結合するキメラタンパク質；
Specific examples of the chimeric protein of the present invention include any of the following chimeric proteins (a) to (c).
(A) a chimeric protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4;
(B) consisting of an amino acid sequence having a sequence identity of 90% or more (preferably 95% or more, more preferably 97% or more, particularly preferably 99% or more) with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, A chimeric protein that binds to 9 and VEGF; or (c) an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, and / or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, and BMP-9 and A chimeric protein that binds to VEGF;
アミノ酸配列の同一性は、例えばＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３））又はＦＡＳＴＡ（ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０））等を用いて決定することができる。このＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮとよばれるプログラムが開発されているので（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）、このプログラムをデフォルト設定で用いて配列同一性を計算することができる。 The identity of amino acid sequences can be determined using, for example, BLAST (Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873 (1993)) or FASTA (Methods Enzymol., 183, 63 (1990)). Based on this BLAST, programs called BLASTP and BLASTN have been developed (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), and this program is used with default settings to calculate sequence identity. Can do.
アミノ酸残基の置換は、あるアミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換される保存的置換でもよい。類似の側鎖を有するアミノ酸のファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸（グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β位分岐側鎖を有するアミノ酸（スレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖を有するアミノ酸（チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）、ヒドロキシル基含有側鎖を有するアミノ酸（セリン、スレオニン、チロシン）、および硫黄含有側鎖を有するアミノ酸（システイン、メチオニン）を挙げることができる。 The amino acid residue substitution may be a conservative substitution in which an amino acid residue is substituted with an amino acid residue having a similar side chain. The family of amino acids with similar side chains includes amino acids with basic side chains (lysine, arginine, histidine), amino acids with acidic side chains (aspartic acid, glutamic acid), amino acids with uncharged polar side chains ( Glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine), amino acids with non-polar side chains (alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan), amino acids with β-branched side chains (threonine) , Valine, isoleucine), amino acids with aromatic side chains (tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine), amino acids with hydroxyl group-containing side chains (serine, threonine, tyrosine), and amino acids with sulfur-containing side chains (Cysteine, methionine) can be mentioned.
本明細書において「アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加している」における数個とは、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個を意味する。 In the present specification, the term “several amino acids in which one or several amino acids are deleted, substituted and / or added” in the amino acid sequence is preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, even more preferably. Means 1-3.
本発明のキメラタンパク質は、アセチル修飾またはポリエチレングリコール修飾を受けているものでもよい。真核生物のタンパク質のN末端にあるαアミノ酸はアセチル化される場合があり、生細胞内で、タンパク質の翻訳後修飾としてアセチル化が行われる場合がある。また、ポリエチレングリコールをタンパク質に結合すると、タンパク質分解が抑制されることにより薬効の持続期間を延長したり、副作用を軽減することが可能になる。タンパク質のアセチル修飾またはポリエチレングリコール修飾は当業者に公知の手法により行うことができる。 The chimeric protein of the present invention may be subjected to acetyl modification or polyethylene glycol modification. An α-amino acid at the N-terminus of a eukaryotic protein may be acetylated and may be acetylated in a living cell as a post-translational modification of the protein. Further, when polyethylene glycol is bound to a protein, it is possible to prolong the duration of medicinal effect and reduce side effects by suppressing proteolysis. Protein acetyl modification or polyethylene glycol modification can be performed by techniques known to those skilled in the art.
本発明のキメラタンパク質は、二量体化したキメラタンパク質でもよい。本発明の二量体化キメラタンパク質としては、二量体化ドメインにより二量体化したもの、ペプチドリンカーによって二量体化された本発明のキメラタンパク質、化学結合により二量体化された本発明のキメラタンパク質を含む。 The chimeric protein of the present invention may be a dimerized chimeric protein. The dimerized chimeric protein of the present invention includes those dimerized by a dimerization domain, the chimeric protein of the present invention dimerized by a peptide linker, and a dimerized by chemical bonding. Including the chimeric protein of the invention.
（２）ＤＮＡ
本発明は、ＢＭＰ−９及びＶＥＧＦ（好ましくは、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０及びＶＥＧＦ）に結合するキメラタンパク質をコードするＤＮＡに関する。本発明のＤＮＡはｃＤＮＡであることが好ましい。具体的には、ＢＭＰ−９のＩ型細胞表面受容体の細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡ配列及びＶＥＧＦ受容体細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡ配列を有するをコードするｃＤＮＡ配列が本発明に含まれる。さらにＡＬＫ１細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡ配列とＦＬＴ１細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡ配列を有するｃＤＮＡ配列が好ましい。上記ｃＤＮＡ配列におけるＡＬＫ１細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡ配列とＦＬＴ１細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡ配列の配列順序は特に限定されない。本発明のＤＮＡは、免疫グロブリンドメインをコードするＤＮＡをさらに有することが好ましい。
(2) DNA
The present invention relates to DNA encoding a chimeric protein that binds to BMP-9 and VEGF (preferably BMP-9, BMP-10 and VEGF). The DNA of the present invention is preferably cDNA. Specifically, a cDNA sequence encoding a BMP-9 type I cell surface receptor extracellular domain and a cDNA sequence encoding a VEGF receptor extracellular domain are included in the present invention. Furthermore, a cDNA sequence having a cDNA sequence encoding the ALK1 extracellular domain and a cDNA sequence encoding the FLT1 extracellular domain is preferred. The sequence order of the cDNA sequence encoding the ALK1 extracellular domain and the cDNA sequence encoding the FLT1 extracellular domain in the cDNA sequence is not particularly limited. The DNA of the present invention preferably further has DNA encoding an immunoglobulin domain.
ＡＬＫ１細胞外ドメインをコードするＤＮＡ配列としては、配列番号５で表されるＤＮＡ配列、及び配列番号５で表されるＤＮＡ配列において１又は数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加しているＤＮＡ配列であって、ＢＭＰ−９との結合能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列を挙げることができる。なお、ＡＬＫ１細胞外ドメインのＤＮＡ配列はヒト以外の由来のものであってもＢＭＰ−９との結合能を有するポリペプチドを発現させるものであれば本発明において利用可能である。 As the DNA sequence encoding the ALK1 extracellular domain, one or several bases are deleted, substituted and / or added in the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 5 and the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 5. And a DNA sequence encoding a protein capable of binding to BMP-9. The DNA sequence of the ALK1 extracellular domain can be used in the present invention as long as it expresses a polypeptide capable of binding to BMP-9 even if it is derived from a source other than human.
ＦＬＴ１細胞外ドメインのＤＮＡ配列としては、配列番号６で表されるＤＮＡ配列、及び配列番号６で表されるＤＮＡ配列において１又は数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加しているＤＮＡ配列であって、ヒトＶＥＧＦとの結合能を有するタンパク質をコードするＤＮＡを挙げることができる。なお、ＦＬＴ１細胞外ドメインのＤＮＡ配列はヒト以外の由来のものであってもＶＥＧＦとの結合能を有するポリペプチドを発現させるものであれば本発明において利用可能である。 As the DNA sequence of the FLT1 extracellular domain, a DNA sequence represented by SEQ ID NO: 6 and DNA in which one or several bases are deleted, substituted and / or added in the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 6 A DNA that codes for a protein that is a sequence and has a binding ability to human VEGF can be mentioned. It should be noted that the DNA sequence of the FLT1 extracellular domain can be used in the present invention as long as it expresses a polypeptide capable of binding to VEGF even if it is derived from a source other than human.
本明細書において「ＤＮＡ配列において１又は数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加している」又は「塩基配列において１又は数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加している」における数個とは、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個を意味する。 In the present specification, “one or several bases are deleted, substituted and / or added in the DNA sequence” or “one or several bases are deleted, substituted and / or added in the base sequence” “Several” in the formula means preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and still more preferably 1 to 3.
本発明において二量体化ドメインをコードするＤＮＡは、例えば配列番号７で表されるＤＮＡ配列からなるヒトＩｇＧ１のＦｃドメインである。 In the present invention, the DNA encoding the dimerization domain is, for example, the Fc domain of human IgG1 consisting of the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 7.
本発明のＤＮＡの具体例としては、以下の（ａ）〜（ｃ）の何れかのキメラタンパク質をコードするＤＮＡを挙げることができる。
（ａ）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるキメラタンパク質；
（ｂ）配列番号４で表されるアミノ酸配列と９０％以上（好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ＢＭＰ−９及びＶＥＧＦに結合するキメラタンパク質；又は
（ｃ）配列番号４で表されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加しているアミノ酸配列からなり、ＢＭＰ−９及びＶＥＧＦに結合するキメラタンパク質；
Specific examples of the DNA of the present invention include DNA encoding any of the following chimeric proteins (a) to (c).
(A) a chimeric protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4;
(B) consisting of an amino acid sequence having a sequence identity of 90% or more (preferably 95% or more, more preferably 97% or more, particularly preferably 99% or more) with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, A chimeric protein that binds to 9 and VEGF; or (c) an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, and / or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, and BMP-9 and A chimeric protein that binds to VEGF;
本発明のＤＮＡの更なる具体例としては、以下の（ｄ）又は（ｅ）の何れかのＤＮＡを挙げることができる。
（ｄ）配列番号８で表される塩基配列からなるＤＮＡ；又は
（ｅ）配列番号８で表される塩基配列において１又は数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加している塩基配列からなり、ＢＭＰ−９及びＶＥＧＦに結合するキメラタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ。
As a further specific example of the DNA of the present invention, any of the following DNAs (d) and (e) can be mentioned.
(D) DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 8; or (e) a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted and / or added in the base sequence represented by SEQ ID NO: 8. A DNA comprising a base sequence encoding a chimeric protein that binds to BMP-9 and VEGF.
（３）ベクター、ウイルス、細胞、及びキメラタンパク質の製造方法
本発明はさらに、本発明のキメラタンパク質をコードするＤＮＡ（好ましくはｃＤＮＡ）を含むベクターに関する。本発明のベクターとしては、任意のプラスミドにＢＭＰ−９Ｉ型受容体細胞外ドメインをコードするＤＮＡ（好ましくはｃＤＮＡ）、及びＶＥＧＦ受容体細胞外ドメインをコードするＤＮＡ（好ましくはｃＤＮＡ）を組み込むことにより得られるベクターが挙げられる。さらに本発明のベクターとしては、任意のプラスミドにＢＭＰ−９Ｉ型受容体細胞外ドメインをコードするＤＮＡ（好ましくはｃＤＮＡ）、ＶＥＧＦ受容体細胞外ドメインコードするＤＮＡ（好ましくはｃＤＮＡ）、及び二量体化ドメインをコードするＤＮＡ（好ましくはｃＤＮＡ）を組み込んだものを挙げることができる。プラスミドは例えばｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ、ｐｃＲＩＩ−Ｔｏｐｏ、ｐＥＮＴＲ２０１などが挙げられる。
(3) Method for Producing Vector, Virus, Cell, and Chimeric Protein The present invention further relates to a vector comprising DNA (preferably cDNA) encoding the chimeric protein of the present invention. As the vector of the present invention, a DNA encoding BMP-9I receptor extracellular domain (preferably cDNA) and a DNA encoding VEGF receptor extracellular domain (preferably cDNA) are incorporated into any plasmid. Examples of the resulting vector include. Furthermore, the vector of the present invention includes a DNA encoding BMP-9I receptor extracellular domain (preferably cDNA), a DNA encoding VEGF receptor extracellular domain (preferably cDNA), and a dimer in any plasmid. And those incorporating a DNA encoding a coding domain (preferably cDNA). Examples of the plasmid include pBlueScript, pcRII-Topo, and pENTR201.
本発明のベクターはクローニングした、または、購入したＢＭＰ−９Ｉ型受容体細胞外ドメイン、ＶＥＧＦ受容体細胞外ドメイン及び二量体化ドメインそれぞれのＤＮＡ（好ましくはｃＤＮＡ）を用いて作製することができる。任意のプラスミドに各ドメインのｃＤＮＡを組み込む順序に制限はない。本発明のベクターの作成手順に制限はないが、例えば、二量体化ドメインを含む本発明のキメラタンパク質のベクターを作成する場合、クローニングしたＢＭＰ−９Ｉ型受容体細胞外ドメイン及びＶＥＧＦ受容体細胞外ドメインの各ＤＮＡをマルチクローニングサイトでタンデム発現できるようにサブクローニングし、該サブクローニングされたＢＭＰ−９Ｉ型受容体細胞外ドメイン及びＶＥＧＦ受容体細胞外ドメインの各ｃＤＮＡを二量体化ドメインのｃＤＮＡ配列を有するベクターに組み込むことで得られる。二量体化ドメインのＤＮＡ配列を有するベクターは市販のベクター、例えばＩｎｖｉｖｏｇｅｎ社から販売されているｐＦＵＳＥ−Ｆｃシリーズなどを利用してもよい。 The vector of the present invention can be prepared using cloned or purchased DNAs (preferably cDNA) of the BMP-9I receptor extracellular domain, VEGF receptor extracellular domain, and dimerization domain. . There is no restriction on the order of incorporating the cDNA of each domain into any plasmid. There are no limitations on the procedure for producing the vector of the present invention. For example, when creating a vector of the chimeric protein of the present invention containing a dimerization domain, the cloned BMP-9I type receptor extracellular domain and VEGF receptor cell Each DNA of the outer domain is subcloned so that it can be expressed in tandem at the multicloning site, and each cDNA of the subcloned BMP-9I receptor extracellular domain and VEGF receptor extracellular domain is cDNA sequence of the dimerization domain It is obtained by incorporating into a vector having As the vector having the DNA sequence of the dimerization domain, a commercially available vector such as pFUSE-Fc series sold by Invivogen may be used.
本発明のベクターは、本発明のキメラタンパク質をコードするＤＮＡを有する発現ベクターでもよい。本発明の発現ベクターは、上記した本発明のベクターから、本発明のキメラタンパク質をコードするＤＮＡを切り出し、任意のプロモーター領域を有するベクターに組み込むことで得ることができる。プロモーター領域を有するベクターとしては、例えばｐｃＤＮＡ、ｐＧＬ、ｐＣＳＩＩ−ＥＦ−ＲｆＡが挙げられる。 The vector of the present invention may be an expression vector having a DNA encoding the chimeric protein of the present invention. The expression vector of the present invention can be obtained by cutting out the DNA encoding the chimeric protein of the present invention from the above-described vector of the present invention and incorporating it into a vector having any promoter region. Examples of the vector having a promoter region include pcDNA, pGL, and pCSII-EF-RfA.
本発明は、本発明のベクターを有するウイルスに関する。本発明のウイルスとしては、本発明のベクター（好ましくは発現ベクター）により形質転換されたウイルスを挙げることができる。具体的には、本発明の発現ベクターを、後記する本発明のキメラタンパク質産生細胞の宿主細胞の形質転換に適したウイルスに組み込むことによって、本発明のウイルスを得ることができる。用いられるウイルスは特に限定されないが、例えばアデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス属のウイルスが挙げられる。 The present invention relates to a virus having the vector of the present invention. Examples of the virus of the present invention include a virus transformed with the vector of the present invention (preferably an expression vector). Specifically, the virus of the present invention can be obtained by incorporating the expression vector of the present invention into a virus suitable for transformation of the host cell of the chimeric protein-producing cell of the present invention described later. The virus to be used is not particularly limited, and examples thereof include adenovirus, retrovirus, and lentivirus viruses.
本発明はさらに、本発明のベクター又は本発明のウイルスを有する細胞に関する。本発明の細胞は、宿主細胞を、本発明のベクター又は本発明のウイルスにより形質転換することにより得ることができる。好ましくは、本発明の細胞は、本発明のキメラタンパク質を産生する細胞である。本発明の細胞の宿主細胞は、本発明のキメラタンパク質の発現に適した細胞であれば制限はなく、例えば、大腸菌、酵母、昆虫細胞、又は哺乳動物細胞が挙げられる。哺乳動物細胞としてはＭＤＡ−ＭＢ−２３１Ｄ、ＣＯＳ若しくはＣＨＯなどが挙げられる。本発明の細胞は、各宿主細胞に適した公知の培養方法により継代される。 The present invention further relates to a cell having the vector of the present invention or the virus of the present invention. The cell of the present invention can be obtained by transforming a host cell with the vector of the present invention or the virus of the present invention. Preferably, the cell of the present invention is a cell that produces the chimeric protein of the present invention. The host cell of the cell of the present invention is not limited as long as it is a cell suitable for expression of the chimeric protein of the present invention, and examples thereof include Escherichia coli, yeast, insect cells, and mammalian cells. Mammalian cells include MDA-MB-231D, COS, and CHO. The cells of the present invention are passaged by a known culture method suitable for each host cell.
本発明の細胞は、電子穿孔、リポフェクション、又はリン酸カルシウム媒介トランスフェクション等により細胞へ本発明のベクターを導入することで得ることができる。また、本発明の細胞は、本発明のウイルスを感染させることにより得ることができる。 The cell of the present invention can be obtained by introducing the vector of the present invention into the cell by electroporation, lipofection, calcium phosphate-mediated transfection, or the like. The cell of the present invention can be obtained by infecting the virus of the present invention.
本発明は、上記した本発明の細胞を培養することによって、本発明のキメラタンパク質を製造する方法にも関する。本発明のキメラタンパク質の製造方法は、上記した本発明のキメラタンパク質産生細胞を用いて行われる。 The present invention also relates to a method for producing the chimeric protein of the present invention by culturing the above-described cells of the present invention. The method for producing a chimeric protein of the present invention is performed using the above-described chimeric protein-producing cell of the present invention.
任意の本発明のキメラタンパク質産生細胞により産生された本発明のキメラタンパク質は、活性を保持することのできる任意の方法によって精製される。例えば、これらに限定されないが、可溶性タンパク質又は封入体として細胞からキメラタンパク質を回収してもよく、細胞から８Ｍのグアニジン塩酸塩及び透析によって定量的に抽出してもよい。キメラタンパク質をさらに精製するために、これらに限定されないが、従来のイオン交換クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、様々な糖クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、逆相クロマトグラフィ又はゲル濾過を含む任意数の精製法を使用してもよい。 The chimeric protein of the present invention produced by any chimeric protein producing cell of the present invention is purified by any method capable of retaining activity. For example, but not limited to, the chimeric protein may be recovered from the cell as a soluble protein or inclusion body and may be quantitatively extracted from the cell by 8M guanidine hydrochloride and dialysis. Use any number of purification methods to further purify the chimeric protein, including but not limited to conventional ion exchange chromatography, affinity chromatography, various sugar chromatography, hydrophobic interaction chromatography, reverse phase chromatography or gel filtration May be.
（４）薬学的組成物
本発明はさらに、上記した本発明のキメラタンパク質、ＤＮＡ、ベクター、ウイルス又は細胞を含む、薬学的組成物に関する。本発明の薬学的組成物は、ＶＥＧＦ阻害剤、抗血管新生剤、又は抗腫瘍剤として使用することができる。
(4) Pharmaceutical Composition The present invention further relates to a pharmaceutical composition comprising the chimeric protein, DNA, vector, virus or cell of the present invention described above. The pharmaceutical composition of the present invention can be used as a VEGF inhibitor, anti-angiogenic agent, or anti-tumor agent.
本発明の薬学的組成物は、少なくとも本発明のキメラタンパク質、ＤＮＡ、ベクター、ウイルス又は細胞を含み、必要に応じて担体、その他成分を含む。本発明のキメラタンパク質は標的化分子（例えば抗体、ホルモン、成長因子等）と連結させたり、又はリポソーム、マイクロカプセルに組み込んでもよい。担体としては、滅菌水、生理食塩水、リン酸バッファー又はデキストロース溶液等が挙げられるがこれらに制限されない。担体は固体（例えばワックス） 又は半固体（例えばゲル状）でもよい。その他成分は薬学的に許容された任意の成分であって、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、潤沢剤、被覆剤、矯味剤、可溶化剤等である。 The pharmaceutical composition of the present invention contains at least the chimeric protein, DNA, vector, virus or cell of the present invention, and optionally contains a carrier and other components. The chimeric protein of the present invention may be linked to a targeting molecule (eg, antibody, hormone, growth factor, etc.), or incorporated into a liposome or microcapsule. Examples of the carrier include, but are not limited to, sterilized water, physiological saline, phosphate buffer, or dextrose solution. The carrier may be solid (eg, wax) or semi-solid (eg, gel). The other components are any pharmaceutically acceptable components such as excipients, binders, disintegrants, lubricants, coating agents, flavoring agents, solubilizers, and the like.
本発明の薬学的組成物の投与経路には限定がなく、全身又は局所から適宜選択される。本発明の薬学的組成物の投与経路は静脈内、髄腔内、動脈内、鼻内、経口、皮下、腹腔内、又は局所の注射若しくは外科的移植を含む。本発明の薬学的組成物の剤型は特に制限がなく、錠剤、顆粒剤、散剤、液剤、注射剤、座剤等、任意の剤型から選ばれる。 There is no limitation on the route of administration of the pharmaceutical composition of the present invention, and it is appropriately selected from systemic or local. The route of administration of the pharmaceutical composition of the present invention includes intravenous, intrathecal, intraarterial, intranasal, oral, subcutaneous, intraperitoneal, or local injection or surgical implantation. The dosage form of the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited, and is selected from arbitrary dosage forms such as tablets, granules, powders, solutions, injections, suppositories and the like.
本発明の薬学的組成物の投与量は、性別や体重、年齢、人種、症状等に応じて当業者により適宜決定される。有効成分であるキメラタンパク質、ＤＮＡ、ベクター、ウイルス又は細胞の投与量は、例えば、０.００１μｇ／ｋｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇから適宜調整される。 The dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is appropriately determined by those skilled in the art according to sex, body weight, age, race, symptoms and the like. The dose of the chimera protein, DNA, vector, virus or cell as the active ingredient is appropriately adjusted, for example, from 0.001 μg / kg to 1000 mg / kg.
本発明は、遺伝子療法を含む。遺伝子療法としては、例えば、本発明のＤＮＡ、発現ベクター、ウイルス又はキメラタンパク質産生細胞を生体に移植することによって生体内で本発明のキメラタンパク質を産生させるようにすることを含む。 The present invention includes gene therapy. Gene therapy includes, for example, producing the chimeric protein of the present invention in vivo by transplanting the DNA, expression vector, virus or chimeric protein-producing cell of the present invention into the living body.
遺伝子療法において本発明のＤＮＡ配列を用いる場合、例えば、ｎａｋｅｄ ＤＮＡの直接注射、脂質若しくは細胞表面受容体と親和性のあるタンパク質などでコーティングされた、リポソーム、微粒子、若しくはマイクロカプセル、又は核移行性ペプチド等に連結して投与することが挙げられる。 When the DNA sequence of the present invention is used in gene therapy, for example, direct injection of naked DNA, liposomes, microparticles or microcapsules coated with a protein having affinity for lipid or cell surface receptor, or nuclear transferability Administration by linking to a peptide or the like can be mentioned.
遺伝子療法において本発明のＤＮＡを含む発現ベクターを用いる場合、ベクターとしては欠損、弱毒化レトロウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター及びアデノ関連ウイルスなどが挙げられるがこれに限られない。 When an expression vector containing the DNA of the present invention is used in gene therapy, examples of the vector include, but are not limited to, deletion, attenuated retrovirus vector, retrovirus vector, adenovirus vector, and adeno-associated virus.
遺伝子療法のために本発明のＤＮＡを導入することができる細胞は、上皮細胞、血管内皮細胞、角化細胞、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞； Ｔ―リンパ球、Ｂ−リンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球等の血液細胞； 様々な幹細胞又は前駆細胞、特に例えば骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝臓から得られる造血幹細胞又は前駆細胞等が挙げられるが、これらに限定されない。 The cells into which the DNA of the present invention can be introduced for gene therapy are epithelial cells, vascular endothelial cells, keratinocytes, fibroblasts, muscle cells, hepatocytes; T-lymphocytes, B-lymphocytes, single cells Blood cells such as spheres, macrophages, neutrophils, eosinophils, megakaryocytes, granulocytes; various stem cells or progenitor cells, especially hematopoietic stem cells or progenitor cells obtained from bone marrow, umbilical cord blood, peripheral blood, fetal liver, etc. However, it is not limited to these.
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
実施例１：本発明のｃＤＮＡ配列の調製及び本発明のベクターの調製
ＡＬＫ１細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡ配列（配列番号５）及びＶＥＧＦＡの受容体であるＦＬＴ１細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡ配列（配列番号６）はヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）ｃＤＮＡをもとにクローニングした。ＡＬＫ１細胞外ドメインは配列番号９及び配列番号１０に示すプライマーにて、ＦＬＴ１細胞外ドメインは配列番号１１及び配列番号１２に示すプライマーにてＰＣＲ法によって増幅し、クローニングした。クローニングした各ｃＤＮＡ配列をｐＣＲＩＩ−Ｔｏｐｏベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に組み込んだ。次いでｐＥＮＴＲ２０１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のマルチクローニングサイト（ｍｃｓ）に配列番号５および配列番号６で表されるｃＤＮＡ配列を組み込んだ（図１参照）。次いで本発明のｃＤＮＡ配列をｍｃｓでタンデム発現できるようにサブクローニングするため、ｐＥＮＴＲ２０１ベクターから切り出した配列番号５および配列番号６で表されるｃＤＮＡ配列をｐＦＵＳＥ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社）のｈＩｇＧ１−ＦｃのｃＤＮＡ配列（配列番号７）のＮ末側に組み込み、本発明のキメラタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号８）及び本発明のベクター（ｐＥＮＴＲ２０１ ＡＬＫ１ＦＬＴ１（Ｉｇ２）−Ｆｃ）を得た（図１参照）。
Example 1: Preparation of cDNA sequence of the present invention and preparation of vector of the present invention cDNA sequence encoding ALK1 extracellular domain (SEQ ID NO: 5) and cDNA sequence encoding FLT1 extracellular domain which is a receptor for VEGFA No. 6) was cloned based on human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) cDNA. The ALK1 extracellular domain was amplified by the PCR method with primers shown in SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10, and the FLT1 extracellular domain was amplified by the primer shown in SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12 and cloned. Each cloned cDNA sequence was incorporated into a pCRII-Topo vector (Invitrogen). Subsequently, the cDNA sequences represented by SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 were incorporated into the multicloning site (mcs) of the pENTR201 vector (Invitrogen) (see FIG. 1). Subsequently, in order to subclone the cDNA sequence of the present invention so that it can be expressed in tandem with mcs, the cDNA sequence represented by SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 excised from the pENTR201 vector was used as the hIgG1-Fc of pFUSE-hIgG1-Fc (Invivogen). The cDNA sequence (SEQ ID NO: 8) encoding the chimeric protein of the present invention and the vector (pENTR201 ALK1FLT1 (Ig2) -Fc) encoding the chimeric protein of the present invention were obtained (FIG. 1). reference).
比較例１：比較用キメラタンパク質のベクターの調製
配列番号１３で表されるＦＬＴ１細胞外ドメイン及び細胞外移行シグナルドメインを含むｃＤＮＡ配列を配列番号１４及び配列番号１２に示すプライマーにてＰＣＲ法によって増幅した。次いで増幅されたｃＤＮＡ配列と実施例１で増幅された配列番号５で表されるｃＤＮＡ配列をそれぞれｐＦＵＳＥ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社）のｈＩｇＧ１−ＦｃのｃＤＮＡ配列（配列番号３）の５’末側に組み込み、比較用キメラタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列及び比較用ベクター（ｐＥＮＴＲ２０１ ＡＬＫ１−Ｆｃ及びｐＥＮＴＲ２０１ ＦＬＴ１（Ｉｇ１−３）−Ｆｃ）を得た。
Comparative Example 1: Preparation of a vector of a chimeric protein for comparison A cDNA sequence containing the FLT1 extracellular domain and the extracellular signal domain represented by SEQ ID NO: 13 was amplified by PCR using the primers shown in SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 12. did. Subsequently, the amplified cDNA sequence and the cDNA sequence represented by SEQ ID NO: 5 amplified in Example 1 were respectively converted into the 5 ′ end of the cDNA sequence (SEQ ID NO: 3) of pFUSE-hIgG1-Fc (Invivogen) hIgG1-Fc. A cDNA sequence encoding a comparative chimeric protein and a comparative vector (pENTR201 ALK1-Fc and pENTR201 FLT1 (Ig1-3) -Fc) were obtained.
実施例２：本発明の発現ベクター調製
実施例１で得られた本発明のベクターからクローニングした本発明のｃＤＮＡ配列をｐＣＳＩＩ−ＥＦ−Ｒｆａ（理化学研究所より分与）へＬＲ反応を用いて組み込み、本発明の発現ベクターを得た（図１参照）。
Example 2: Preparation of expression vector of the present invention The cDNA sequence of the present invention cloned from the vector of the present invention obtained in Example 1 was incorporated into pCSII-EF-Rfa (distributed by RIKEN) using LR reaction. The expression vector of the present invention was obtained (see FIG. 1).
比較例２：比較用キメラタンパク質の発現ベクターの調製
比較例１で得られた比較用キメラタンパク質のベクターを用いて実施例２と同様にして比較用発現ベクターを得た。
Comparative Example 2: Preparation of Expression Vector for Comparative Chimeric Protein A comparative expression vector was obtained in the same manner as in Example 2 using the comparative chimeric protein vector obtained in Comparative Example 1.
実施例３：本発明のウイルスの調製
実施例２で得られた本発明の発現ベクターと、パッケージング用プラスミドのｐＣＡＧ−ＨＩＶ（理化学研究所より分与）及びｐＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇ−ＲＳＶ−Ｒｅｖ（理化学研究所より分与）をＨＥＫ２９３ＦＴ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてトランスフェクトして、３７℃２日間培養した後に培地を回収した。得られた培地を３０００ｒｐｍ、１０分間遠心を行うことで、レンチウイルスを含む培養上清を分離した。
Example 3: Preparation of the virus of the present invention The expression vector of the present invention obtained in Example 2, and the packaging plasmids pCAG-HIV (distributed from RIKEN) and pCMV-VSV-G-RSV-Rev (Distributed from RIKEN) was transfected into HEK293FT cells (Invitrogen) using lipofectamine 2000 (registered trademark) (Invitrogen) and cultured at 37 ° C. for 2 days, and the medium was collected. The culture medium containing the lentivirus was separated by centrifuging the obtained medium at 3000 rpm for 10 minutes.
比較例３：比較用ウイルスの調製
比較例２で得られた本発明の発現ベクターを用いて実施例３と同様にして、比較用レンチウイルスを含む培養上清を得た。
Comparative Example 3: Preparation of Comparative Virus A culture supernatant containing a comparative lentivirus was obtained in the same manner as in Example 3 using the expression vector of the present invention obtained in Comparative Example 2.
実施例４：本発明のキメラタンパク質の作製
１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）３×１０6個を直径１０ｃｍ ｄｉｓｈに撒きこみ、一晩培養したのちにＦｕｇｅｎｅＨＤ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ社）を用いて実施例２で得られた本発明の発現ベクターを２０μｇトランスフェクトし、本発明のキメラタンパク質産生細胞を得た。得られた本発明のキメラタンパク質産生細胞を４時間、３７℃で培養した後に培地を除去し、ＦＢＳを含まないＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地に置き換えて、２４時間インキュベーター内で培養し、培養上清を回収した。回収した上清は０．２２μｍのポアサイズのフィルターを用いてろ過し、本発明のキメラタンパク質を含む培養上清液を得た。本発明のキメラタンパク質の濃度はヒトＩｇＧＦｃＥＬＩＳＡキット（Ｂｅｔｈｙｌ社）を用いて測定した結果、５００ｎｇ／ｍＬであった。
Example 4 Production of Chimeric Protein of the Present Invention Using 10% FBS-containing DMEM medium, 3 × 10 6 HEK293T cells (Invitrogen) were seeded in a 10 cm diameter dish and cultured overnight, then FugeneHD (registered trademark). (Roche) was used to transfect 20 μg of the expression vector of the present invention obtained in Example 2 to obtain a chimeric protein-producing cell of the present invention. The obtained chimeric protein-producing cells of the present invention were cultured for 4 hours at 37 ° C., then the medium was removed, replaced with OPTI-MEM medium containing no FBS, and cultured in an incubator for 24 hours, and the culture supernatant was recovered. did. The collected supernatant was filtered using a 0.22 μm pore size filter to obtain a culture supernatant containing the chimeric protein of the present invention. The concentration of the chimeric protein of the present invention was 500 ng / mL as a result of measurement using a human IgG Fc ELISA kit (Bethyl).
比較例４：比較用キメラタンパク質の作製
比較例２で得られた比較用発現ベクター（配列番号１３のｃＤＮＡ配列を含む）を用いて実施例４と同様にして、ＦＬＴ１（Ｉｇ１−３）−Ｆｃ産生細胞を得、培養上清を回収した。回収した上清は０．２２μｍのポアサイズのフィルターを用いてろ過し、ＦＬＴ１（Ｉｇ１−３）−Ｆｃ）含む培養上清液を得た。ＦＬＴ１（Ｉｇ１−３）−Ｆｃの濃度はヒトＩｇＧＦｃＥＬＩＳＡキット（Ｂｅｔｈｙｌ社）を用いて測定した結果、６００ｎｇ／ｍＬであった。
Comparative Example 4: Preparation of Comparative Chimeric Protein In the same manner as in Example 4 using the comparative expression vector (including the cDNA sequence of SEQ ID NO: 13) obtained in Comparative Example 2, FLT1 (Ig1-3) -Fc Production cells were obtained and the culture supernatant was collected. The collected supernatant was filtered using a 0.22 μm pore size filter to obtain a culture supernatant containing FLT1 (Ig1-3) -Fc). The concentration of FLT1 (Ig1-3) -Fc was 600 ng / mL as a result of measurement using a human IgG Fc ELISA kit (Bethyl).
実施例５：本発明のキメラタンパク質のＢＭＰ−９結合能の確認
ＡＬＫ１のリガンドであるＢＭＰ−９によって発現が誘導されるＩｄ−１遺伝子の誘導阻害作用を見ることにより本発明のキメラタンパク質のＢＭＰ−９結合能を確認した。１２ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ上にＥＧＭ ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（Ｌｏｎｚａ社）を用いてＨＵＶＥＣを１×１０5個撒き、一晩培養して培地を除去した後に、ＦＢＳを含まないＯＰＴＩ−ＭＥＭ中にコントロールとしてＨＥＫ２９３Ｔの培養液上清、実施例４で得られた本発明のキメラタンパク質を含んだ培養上清、ｃｏｎｔｒｏｌＦｃ（Ｒ＆Ｄシステムズ社）、又は、ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＡＬＫ１Ｆｃ（Ｒ＆Ｄシステムズ社；以下「ｒｅＡＬＫ１Ｆｃ」）、及び終濃度１０ｎｇ／ｍＬとなるようヒトＢＭＰ−９を添加して、細胞に処理した。処理から４時間後に、ＲＮｅａｓｙ（キアゲン社）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡの回収を行った。回収したＲＮＡは濃度を測定後、各処理群で同量のＲＮＡを使用してＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いてｃＤＮＡの合成を行った。定量的ＰＣＲには、得られたｃＤＮＡを水で２５倍に希釈し、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステム社）を用いて、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステム（アプライドバイオシステム社）によってＩｄ−１及びＧＡＰＤＨの発現量を測定した。Ｉｄ−１の発現量はＧＡＰＤＨの発現量を用いて補正を行った。
Example 5: Confirmation of the BMP-9 binding ability of the chimeric protein of the present invention BMP of the chimeric protein of the present invention was observed by observing the inhibitory action of the Id-1 gene whose expression is induced by BMP-9, which is a ligand of ALK1. -9 binding ability was confirmed. 1 × 10 5 HUVECs were spread on a 12-well plate using EGM BulletKit (Lonza), and after overnight culture, the medium was removed, and then the HEK293T culture supernatant as a control in OPTI-MEM without FBS The culture supernatant containing the chimeric protein of the present invention obtained in Example 4, controlFc (R & D Systems), or recombinant ALK1Fc (R & D Systems; hereinafter referred to as “reALK1Fc”), and a final concentration of 10 ng / mL Human BMP-9 was added to treat the cells. Four hours after the treatment, total RNA was collected using RNeasy (Qiagen). After measuring the concentration of the recovered RNA, cDNA was synthesized using PrimeScript RT reagent Kit (Takara Bio Inc.) using the same amount of RNA in each treatment group. For quantitative PCR, the obtained cDNA was diluted 25-fold with water, and SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) was used with a StepOnePlus real-time PCR system (Applied Biosystems) to identify Id-1 and GAPDH. The expression level of was measured. The expression level of Id-1 was corrected using the expression level of GAPDH.
精製を行っていない培養上清中に含まれる本発明のキメラタンパク質がＢＭＰ−９に結合することを確認した（図２参照）。結合能はｒｅＡＬＫ１Ｆｃと同程度であった。 It was confirmed that the chimeric protein of the present invention contained in the culture supernatant not purified was bound to BMP-9 (see FIG. 2). The binding ability was similar to that of reALK1Fc.
実施例６：キメラタンパク質のＶＥＧＦＡ結合能の確認
Ｆｌｔ１のリガンドであるＶＥＧＦＡによって誘導されるＥＧＲ３遺伝子の誘導阻害作用を見ることにより本発明のキメラタンパク質のＶＥＧＦＡ結合能を確認した。１２ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ上にＥＧＭ ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（Ｌｏｎｚａ社）を用いてＨＵＶＥＣを１×１０5個撒き、一晩培養して培地を除去した後に、ＦＢＳを含まないＯＰＴＩ−ＭＥＭ中にコントロールとしてＨＥＫ２９３Ｔの培養液上清、実施例４で得られた本発明のキメラタンパク質を含んだ培養上清、又は、ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＦＬＴ１Ｆｃ（Ｒ＆Ｄシステムズ社：ＦＬＴ１細胞外ドメイン及び細胞外移行シグナルドメインを含む；以下「ｒｅＦＬＴ１Ｆｃ」）、又は、比較例４で得られたＦＬＴ１（Ｉｇ１−３）Ｆｃ、及び終濃度１００ｎｇ／ｍＬとなるように調整したＶＥＧＦＡを培養液中に添加した。１時間培養後、ＲＮｅａｓｙ（キアゲン社）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡの回収を行った。回収したＲＮＡは濃度を測定後、各処理群で同量のＲＮＡを使用してＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いてｃＤＮＡの合成を行った。定量的ＰＣＲには、得られたｃＤＮＡを水で２５倍に希釈し、ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステム社）を用いて、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステム（アプライドバイオシステム社）によってＥＧＲ３及びＧＡＰＤＨの発現量を測定した。ＥＧＲ３の発現量はＧＡＰＤＨの発現量を用いて補正を行った。
Example 6: Confirmation of VEGFA binding ability of chimeric protein The ability of the chimeric protein of the present invention to bind to VEGFA was confirmed by observing the inhibitory action of the EGR3 gene induced by VEGFA, a ligand of Flt1. 1 × 10 5 HUVECs were spread on a 12-well plate using EGM BulletKit (Lonza), and after overnight culture, the medium was removed, and then the HEK293T culture supernatant as a control in OPTI-MEM without FBS A culture supernatant containing the chimeric protein of the present invention obtained in Example 4, or recombinant FLT1Fc (R & D Systems: FLT1 extracellular domain and extracellular signal domain; hereinafter referred to as “reFLT1Fc”), or FLT1 (Ig1-3) Fc obtained in Comparative Example 4 and VEGFA adjusted to a final concentration of 100 ng / mL were added to the culture solution. After culturing for 1 hour, total RNA was recovered using RNeasy (Qiagen). After measuring the concentration of the recovered RNA, cDNA was synthesized using PrimeScript RT reagent Kit (Takara Bio Inc.) using the same amount of RNA in each treatment group. For quantitative PCR, the obtained cDNA was diluted 25-fold with water, and EGR3 was applied by StepOnePlus real-time PCR system (Applied Biosystems) using SYBR (registered trademark) Green PCR Master Mix (Applied Biosystems). And the expression level of GAPDH was measured. The expression level of EGR3 was corrected using the expression level of GAPDH.
精製を行っていない培養上清中に含まれる本発明のキメラタンパク質がＶＥＧＦＡへの結合することを確認した（図３参照）。なお、本発明のキメラタンパク質はｒｅＦＬＴ１Ｆｃに比較してＶＥＧＦＡシグナル阻害活性が緩やかであった。 It was confirmed that the chimeric protein of the present invention contained in the culture supernatant not purified was bound to VEGFA (see FIG. 3). It should be noted that the chimeric protein of the present invention had a slower VEGFA signal inhibitory activity than reFLT1Fc.
実施例７：本発明のキメラタンパク質の腫瘍増殖抑制作用
ヒト臍帯静脈内皮細胞ＨＵＶＥＣを用い、ＢＭＰ−９により誘導されるＩｄ−１の阻害及びＶＥＧＦＡによって誘導されるＥＧＲ３の阻害によって確認した。
６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅにＢｘＰＣ３を５×１０5個、１ｍＬの培地量で播種しておき、３７℃一晩培養した後に、実施例３及び比較例３において作成したレンチウイルスを含む培養上清を１ｍＬ処理した。３７℃２４時間培養した後、培養上清を除去して、本発明のキメラタンパク質、ｃｏｎｔｒｏｌ Ｆｃ、ＡＬＫ１Ｆｃ、及びＦＬＴ１（Ｉｇ１−３）Ｆｃ、それぞれを安定的に発現するＢｘＰＣ３を作成した。これをヌードマウス皮下に５×１０6個移植して、一週間おきに腫瘍堆積を短径と長径を測定することで算出した。腫瘍堆積は以下に示す 堆積（ｍｍ3）＝（長径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）×短径（ｍｍ））／２ によって算出した。
Example 7: Tumor Growth Inhibitory Action of Chimeric Protein of the Present Invention Human umbilical vein endothelial cells HUVEC were used to confirm by inhibition of Id-1 induced by BMP-9 and inhibition of EGR3 induced by VEGFA.
After seeding 5 × 10 5 BxPC3 in a 1-well medium amount on a 6-well plate and culturing overnight at 37 ° C., 1 mL of the culture supernatant containing the lentivirus prepared in Example 3 and Comparative Example 3 was treated. . After culturing at 37 ° C. for 24 hours, the culture supernatant was removed to prepare BxPC3 that stably expresses the chimeric protein of the present invention, control Fc, ALK1Fc, and FLT1 (Ig1-3) Fc. This was transplanted subcutaneously into nude mice at 5 × 10 6 , and tumor deposition was calculated by measuring the minor axis and major axis every other week. Tumor deposition was calculated by the following deposition (mm 3 ) = (major axis (mm) × minor axis (mm) × minor axis (mm)) / 2.
本発明のキメラタンパク質、ｃｏｎｔｒｏｌＦｃ、ＡＬＫ１Ｆｃ及びＦＬＴ１（Ｉｇ１−３）Ｆｃ発現ＢｘＰＣ３の腫瘍増殖を観察した結果、本発明のキメラタンパク質を発現ＢｘＰＣ３腫瘍のみが、他のｃｏｎｔｒｏｌＦｃ、ＡＬＫ１Ｆｃ及びＦＬＴ１（Ｉｇ１−３）Ｆｃ発現ＢｘＰＣ３腫瘍と比較して有意に増殖が抑制されることが確認された（図４参照）。 As a result of observing the tumor growth of BxPC3 expressing BxPC3 expressing the chimeric protein, controlFc, ALK1Fc and FLT1 (Ig1-3) Fc of the present invention, only the BxPC3 tumor expressing the chimeric protein of the present invention was found to have other controlFc, ALK1Fc and FLT1 (Ig1-3 ) It was confirmed that the proliferation was significantly suppressed as compared with the Fc-expressing BxPC3 tumor (see FIG. 4).
実施例８：本発明のキメラタンパク質ド発現ＢｘＰＣ３における血管密度の観察
実施例７で得られたそれぞれｃｏｎｔｒｏｌＦｃ、ＡＬＫ１Ｆｃ、ＦＬＴ１（Ｉｇ１−３）Ｆｃ及び本発明のキメラタンパク質発現ＢｘＰＣ３細胞をヌードマウス皮下に５×１０6個移植して４９日後にマウスを犠牲死させて、サンプリングした腫瘍塊より凍結切片を作成し、抗ＰＥＣＡＭ−１抗体（ＭＥＣ１３．３：ＢＤバイオサイエンス社）を用いて、蛍光免疫染色し、観察試料を得た。蛍光顕微鏡を用いて観察試料のネクローシスを起こした領域を除外した２５視野を観察した。図５にはＰＥＣＡＭ−１陽性率の平均値に最も近い視野を選択して表示した。図６には各視野におけるＰＥＣＡＭ−１陽性率及び平均値をプロットした。
Example 8: Observation of blood vessel density in BxPC3 expressing chimeric protein of the present invention Each of controlFc, ALK1Fc, FLT1 (Ig1-3) Fc obtained in Example 7 and BxPC3 cells expressing chimeric protein of the present invention were subcutaneously injected into nude mice. 49 days after transplantation of 5 × 10 6 mice, mice were sacrificed, frozen sections were prepared from the sampled tumor mass, and fluorescence immunization was performed using an anti-PECAM-1 antibody (MEC13.3: BD Bioscience). An observation sample was obtained by staining. Using a fluorescent microscope, 25 visual fields were observed excluding the area where necrosis occurred in the observed sample. In FIG. 5, the visual field closest to the average value of the PECAM-1 positive rate was selected and displayed. In FIG. 6, PECAM-1 positive rates and average values in each visual field are plotted.
ｃｏｎｔｒｏｌＦｃ、ＡＬＫ１Ｆｃ、ＦＬＴ１（Ｉｇ１−３）Ｆｃ及び本発明のキメラタンパク質発現ＢｘＰＣ３の腫瘍切片中のＰＥＣＡＭ−１陽性率は、ｃｏｎｔｒｏｌＦｃ発現腫瘍に対して、ＡＬＫ１Ｆｃ、ＦＬＴ１（Ｉｇ１−３）Ｆｃ及び本発明のキメラタンパク質発現ＢｘＰＣ３腫瘍が低かった。ＡＬＫ１Ｆｃ、ＦＬＴ１（Ｉｇ１−３）Ｆｃ発現腫瘍間では有意な差はなかったが、ＡＬＫ１Ｆｃ、及びＦＬＴ１（Ｉｇ１−３）Ｆｃ発現腫瘍と比較して本発明のキメラタンパク質発現腫瘍中のＰＥＣＡＭ−１陽性率は有意に低下した。このことから本発明のキメラタンパク質が血管量を低下させたことで腫瘍増殖が抑制されたと考えられた。 The control rate of PECAM-1 in tumor sections of controlFc, ALK1Fc, FLT1 (Ig1-3) Fc and chimeric protein-expressing BxPC3 of the present invention was ALK1Fc, FLT1 (Ig1-3) Fc and the present invention. The chimeric protein-expressing BxPC3 tumors were low. There was no significant difference between ALK1Fc and FLT1 (Ig1-3) Fc expressing tumors, but PECAM-1 positive in the chimeric protein expressing tumors of the present invention compared to ALK1Fc and FLT1 (Ig1-3) Fc expressing tumors The rate decreased significantly. From this, it was considered that tumor growth was suppressed by reducing the blood vessel volume with the chimeric protein of the present invention.
本発明により、異常な血管新生を伴う疾患、例えば腫瘍、関節リウマチ、様々な網膜症、血管腫および乾癬やそれらの合併症に有効な治療が可能になる。このように、本発明は医薬分野における利用可能性が極めて高く有用である。 The present invention enables effective treatment for diseases involving abnormal angiogenesis, such as tumors, rheumatoid arthritis, various retinopathy, hemangiomas and psoriasis and their complications. Thus, the present invention has a very high applicability in the pharmaceutical field and is useful.
配列番号１：ＡＬＫ１細胞外ドメインのアミノ酸配列
配列番号２：ＦＬＴ１細胞外ドメイン（Ｉｇ２）のアミノ酸配列
配列番号３：ｈＩｇＧ１Ｆｃのアミノ酸配列
配列番号４：ＡＬＫ１ＦＬＴ１（Ｉｇ２）Ｆｃのアミノ酸配列
配列番号５：ＡＬＫ１細胞外ドメインのｃＤＮＡ配列
配列番号６：ＦＬＴ１細胞外ドメイン（Ｉｇ２）のｃＤＮＡ配列
配列番号７：ｈＩｇＧ１ＦｃのｃＤＮＡ配列
配列番号８：ＡＬＫ１ＦＬＴ１（Ｉｇ２）ＦｃのｃＤＮＡ配列
配列番号９：ＡＬＫ１細胞外ドメインのフォワードプライマー
配列番号１０：ＡＬＫ１細胞外ドメインのリバースプライマー
配列番号１１：ＦＬＴ１細胞外ドメイン（Ｉｇ２）のフォワードプライマー
配列番号１２：ＦＬＴ１細胞外ドメイン（Ｉｇ２）／ＦＬＴ１（Ｉｇ１−３）のリバースプライマー
配列番号１３：ＦＬＴ１（Ｉｇ１−３）のｃＤＮＡ配列
配列番号１４：ＦＬＴ１（Ｉｇ１−３）のフォワードプライマー
SEQ ID NO: 1: ALK1 extracellular domain amino acid sequence SEQ ID NO: 2: FLT1 extracellular domain (Ig2) amino acid sequence SEQ ID NO: 3: hIgG1 Fc amino acid sequence SEQ ID NO: 4: ALK1 FLT1 (Ig2) Fc amino acid sequence SEQ ID NO: 5: ALK1 CDNA sequence of extracellular domain SEQ ID NO: 6: cDNA sequence of FLT1 extracellular domain (Ig2) SEQ ID NO: 7: cDNA sequence of hIgG1Fc SEQ ID NO: 8: cDNA sequence of ALK1FLT1 (Ig2) Fc SEQ ID NO: 9: Forward of ALK1 extracellular domain Primer SEQ ID NO: 10: Reverse primer of ALK1 extracellular domain SEQ ID NO: 11: Forward primer of FLT1 extracellular domain (Ig2) SEQ ID NO: 12: Reverse primer of FLT1 extracellular domain (Ig2) / FLT1 (Ig1-3) Immersion SEQ ID NO 13: FLT1 (Ig1-3) cDNA sequences SEQ ID NO: 14: forward primer FLT1 (Ig1-3)
Claims (25)
（ａ）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるキメラタンパク質；
（ｂ）配列番号４で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ＢＭＰ−９及びＶＥＧＦに結合するキメラタンパク質；又は
（ｃ）配列番号４で表されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加しているアミノ酸配列からなり、ＢＭＰ−９及びＶＥＧＦに結合するキメラタンパク質； The chimeric protein according to any one of claims 1 to 11, which is any of the following (a) to (c).
(A) a chimeric protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4;
(B) a chimeric protein comprising an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 and binding to BMP-9 and VEGF; or (c) the amino acid represented by SEQ ID NO: 4 A chimeric protein consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted and / or added in the sequence and binding to BMP-9 and VEGF;
（ａ）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるキメラタンパク質；
（ｂ）配列番号４で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ＢＭＰ−９及びＶＥＧＦに結合するキメラタンパク質；又は
（ｃ）配列番号４で表されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加しているアミノ酸配列からなり、ＢＭＰ−９及びＶＥＧＦに結合するキメラタンパク質； DNA encoding any of the following chimeric proteins (a) to (c):
(A) a chimeric protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4;
(B) a chimeric protein comprising an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 and binding to BMP-9 and VEGF; or (c) the amino acid represented by SEQ ID NO: 4 A chimeric protein consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted and / or added in the sequence and binding to BMP-9 and VEGF;
（ｄ）配列番号８で表される塩基配列からなるＤＮＡ；又は
（ｅ）配列番号８で表される塩基配列において１又は数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加している塩基配列からなり、ＢＭＰ−９及びＶＥＧＦに結合するキメラタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ。 DNA of either of the following (d) or (e).
(D) DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 8; or (e) a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted and / or added in the base sequence represented by SEQ ID NO: 8. A DNA comprising a base sequence encoding a chimeric protein that binds to BMP-9 and VEGF.
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