JP2016034925A - Novel diatom protein and use thereof - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、珪藻類の被殻表面に発現する新規タンパク質、及びその利用に関する。 The present invention relates to a novel protein expressed on the surface of a diatom shell and its use.
微細藻類は、他の植物に比べてバイオ燃料の生産効率が高いことから、燃料生産に用いることが期待されている。微細藻類からの燃料生産プロセスは、藻類の培養、回収、脱水、油脂抽出、燃料への変換に大きく分けられる。その中でも回収工程が、全工程において最もエネルギー消費が大きい工程であることが試算されている（非特許文献１、２、及び３）。
Microalgae are expected to be used for fuel production because they have higher biofuel production efficiency than other plants. The process for producing fuel from microalgae can be broadly divided into algae culture, recovery, dehydration, fat extraction, and conversion to fuel. Among these, it has been estimated that the recovery process is the process that consumes the most energy in all processes (
現在採用されている回収方法として、遠心分離、フィルターろ過、及び凝集沈殿（凝集浮上を含む）等がある（非特許文献４）。 Currently employed collection methods include centrifugation, filter filtration, and coagulation sedimentation (including coagulation flotation) (Non-patent Document 4).
ほとんどの微細藻類は遠心分離によって回収することができ、その方法は当業者には公知である（非特許文献５）。遠心分離は最も回収率の高い方法である反面、回収に高いエネルギーを必要とすることが問題とされている。 Most microalgae can be recovered by centrifugation, and the method is known to those skilled in the art (Non-Patent Document 5). Centrifugation is the method with the highest recovery rate, but requires high energy for recovery.
フィルターろ過には主に2種類の方法がある。培養液中にフィルター付きホースを挿入し、ホースの先から吸引することで培養液の濃度を高めるバキューム方式と、圧力を加えて培養液をフィルターに流すことで水分のみが分離され、藻体をフィルターに接着させるプレッシャー方式である（非特許文献５及び６）。フィルター濾過法では、目詰まりによるフィルターの交換、培養液を移動させるためのポンプの使用等により運用コストが高くなることが問題とされている。 There are two main methods of filter filtration. Insert a hose with a filter into the culture medium and suck it from the tip of the hose to increase the concentration of the culture medium. By applying pressure and flowing the culture medium through the filter, only water is separated, This is a pressure method for adhering to a filter (Non-Patent Documents 5 and 6). In the filter filtration method, there is a problem that the operation cost becomes high due to replacement of a filter due to clogging, use of a pump for moving a culture solution, and the like.
より低エネルギーで藻体と培地の分離を行える方法として、凝集沈殿法が挙げられる。凝集沈殿法の例として、塩基性の凝集剤を培地に加えることで、藻体表面の負電荷を中和させ、互いに結合して凝集を起こさせる化学的凝集誘導法がある（非特許文献７及び８）。この方法は、淡水性培地を用いた例では高い効率を示すが、塩濃度が高く、多価電解質の豊富な海洋環境中では、藻体の凝集が困難な場合があるという問題点が指摘されている。 As a method for separating the algal cells and the medium with lower energy, a coagulation precipitation method can be mentioned. As an example of the coagulation precipitation method, there is a chemical coagulation induction method in which a basic coagulant is added to a medium to neutralize the negative charge on the surface of algal bodies and bind to each other to cause aggregation (Non-patent Document 7) And 8). Although this method shows high efficiency in an example using a fresh aqueous medium, it has been pointed out that agglomeration of algal bodies may be difficult in a marine environment with a high salt concentration and rich in polyelectrolytes. ing.
その他の化学的凝集誘導法として、水混和溶媒セットを添加する方法（特許文献１）、ポリ塩化アルミニウムとポリジメチルジアリルアンモニウムクロライドの混合物を添加する方法（特許文献２）、カチオン性高分子凝集剤を添加する方法（特許文献３）、ポリグルタミン酸を主体とする生分解性凝集剤を添加する方法（特許文献４）等が挙げられる。いずれの化学凝集法も、凝集剤自体を製造するエネルギー投資やコストは避けられず、環境に負荷を与える要因となる。 As other chemical aggregation induction methods, a method of adding a water-miscible solvent set (Patent Document 1), a method of adding a mixture of polyaluminum chloride and polydimethyldiallylammonium chloride (Patent Document 2), a cationic polymer flocculant And a method of adding a biodegradable flocculant mainly composed of polyglutamic acid (Patent Document 4). In any of the chemical agglomeration methods, energy investment and cost for producing the aggregating agent itself are unavoidable, which causes a burden on the environment.
一方、バクテリアの添加等、生物学的因子により凝集誘導を起こす研究も報告されている（非特許文献９、１０、及び１１、並びに特許文献５）。例として海洋性の藻類であるNannochloropsis oceanica IMET1の培養液にバクテリアであるBacillus megaterium strain PPB7の培養液を藻体：バクテリア比が5:1となるよう添加することで、藻体が急速に凝集し、培地と藻体を容易に分離できることが知られている（非特許文献１２）。この凝集法では、多量のバクテリアを使用することから、藻体とバクテリアの二種類の生物を大量に培養する必要があるため、二重の培養コストが費やされるという欠点がある。また、バクテリアの培養には二酸化炭素以外の炭素源が必要である。したがって、バクテリアを用いるこの方法は、海洋微細藻類の凝集方法としては有望な方法だが、Carbon Capture and Storage (CCS) の観点において、CO2排出削減効果に貢献できないことから、理想的な方法ではないと考えられる。
On the other hand, studies that induce aggregation by biological factors such as addition of bacteria have also been reported (
本発明者らは、珪藻類の被殻表面にペプチドを発現させることができれば、このペプチドの性質に基いて珪藻類を凝集させることができると考えた。本発明者らは、これを達成するために、Fistulifera solaris JPCC DA0580株のような油脂高蓄積性を示す珪藻類の被殻表面に局在するタンパク質の同定を試みた。 The present inventors considered that if a peptide can be expressed on the diatom shell, the diatom can be aggregated based on the property of the peptide. In order to achieve this, the present inventors tried to identify a protein localized on the putamen surface of a diatom exhibiting a high accumulation of fats and oils such as Fistulifera solaris JPCC DA0580 strain.
本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討した結果、珪藻類の被殻表面に発現する新規タンパク質を見出した。また、この新規タンパク質と他のペプチドを融合させたポリペプチドを被殻表面に発現させることができること、及び融合ポリペプチドに対する抗体を用いて珪藻類を凝集させることができることを見出し、本発明を完成させた。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have found a novel protein that is expressed on the diatom shell. In addition, the inventors have found that a polypeptide in which this novel protein and another peptide are fused can be expressed on the putamen surface, and that diatoms can be aggregated by using an antibody against the fusion polypeptide, thereby completing the present invention. I let you.
すなわち、本発明は以下の特徴を包含する。 That is, the present invention includes the following features.
１．次の（i）〜（iii）からなる群より選択される、ポリペプチド：
（i）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、及び配列番号１２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ii）（i）に記載のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、（iii）（i）に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチド。
２．上記１に記載のポリペプチドに融合パートナーを連結してなる、融合タンパク質。
３．融合パートナーが、標識タンパク質、酵素、抗体、金属イオン結合ペプチド、バイオミネラリゼーションペプチド、及び凝集タンパク質からなる群より選択される、上記２に記載の融合タンパク質。
４．珪藻類の被殻表面に発現する、上記２又は３に記載の融合タンパク質。
５．上記１に記載のポリペプチド又は上記２〜４のいずれかに記載の融合タンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
６．次の（i）〜（iv）からなる群より選択される、ポリヌクレオチド：
（i）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、及び配列番号１１からなる群より選択される塩基配列を含むポリヌクレオチド、（ii）（i）に記載の塩基配列と90%以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチド、（iii）（i）に記載の塩基配列において、１若しくは複数個の塩基が欠失、置換、又は付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド、並びに（iv）（i）に記載の塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
７．上記５又は６に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
８．上記５若しくは６に記載のポリヌクレオチド又は上記７に記載のベクターで珪藻類を形質転換させる工程を含む、形質転換珪藻類を製造する方法。
９．珪藻類が、Fistulifera属に属する藻類である、上記８に記載の方法。
１０．Fistulifera属に属する藻類がFistulifera soralisに属する、上記９に記載の方法。
１１．Fistulifera soralis属に属する藻類が、JPCC DA0580株（受託番号 FERM BP-11201）である、上記１０に記載の方法。
１２．上記５若しくは６に記載のポリヌクレオチド又は上記７に記載のベクターで形質転換された、珪藻類。
１３．Fistulifera属に属する、上記１２に記載の珪藻類。
１４．Fistulifera soralisに属する、上記１３に記載の珪藻類。
１５．JPCC DA0580株（受託番号 FERM BP-11201）である、上記１４に記載の珪藻類。
１６．珪藻類の被殻表面に発現している上記１に記載のポリペプチド又は上記２〜４のいずれかに記載の融合タンパク質の性質に基いて、該珪藻類を凝集させる工程を含む、珪藻類の凝集方法。
１７．上記１６に記載の方法によって凝集させた珪藻類を回収する工程を含む、珪藻類の回収方法。
１８．上記１７に記載の方法によって回収した珪藻類から、珪藻類が産生する物質を抽出する工程を含む、珪藻類による物質の産生方法。
１９．珪藻類が産生する物質が油脂である、上記１８に記載の方法。
1. A polypeptide selected from the group consisting of the following (i) to (iii):
(I) a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, and SEQ ID NO: 12, (ii) described in (i) A polypeptide comprising an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence, (iii) an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, or added in the amino acid sequence described in (i) A polypeptide comprising.
2. A fusion protein comprising the polypeptide according to 1 above and a fusion partner linked thereto.
3. 3. The fusion protein according to 2 above, wherein the fusion partner is selected from the group consisting of a labeled protein, an enzyme, an antibody, a metal ion-binding peptide, a biomineralization peptide, and an aggregate protein.
4). 4. The fusion protein according to 2 or 3 above, which is expressed on the diatom shell.
5. 5. A polynucleotide encoding the polypeptide according to 1 or the fusion protein according to any one of 2 to 4 above.
6). A polynucleotide selected from the group consisting of the following (i) to (iv):
(I) a polynucleotide comprising a base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, and SEQ ID NO: 11, (ii) described in (i) A polynucleotide comprising a nucleotide sequence having 90% or more identity with the nucleotide sequence, the nucleotide sequence according to (iii) (i), wherein one or more nucleotides are deleted, substituted, or added; And (iv) a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to a complementary strand of the base sequence described in (i).
7). An expression vector comprising the polynucleotide according to 5 or 6 above.
8). A method for producing transformed diatoms, comprising the step of transforming diatoms with the polynucleotide according to 5 or 6 above or the vector according to 7 above.
9. 9. The method according to 8 above, wherein the diatom is an algae belonging to the genus Fistulifera.
10. 10. The method according to 9 above, wherein the algae belonging to the genus Fistulifera belong to Fistulifera soralis.
11. 11. The method according to 10 above, wherein the algae belonging to the genus Fistulifera soralis is JPCC DA0580 strain (Accession No. FERM BP-11201).
12 A diatom transformed with the polynucleotide according to 5 or 6 above or the vector according to 7 above.
13. The diatom as described in 12 above, belonging to the genus Fistulifera.
14 14. The diatom as described in 13 above, belonging to Fistulifera soralis.
15. The diatom according to the above 14, which is JPCC DA0580 strain (Accession No. FERM BP-11201).
16. A method of agglutinating a diatom, comprising the step of aggregating the diatom based on the property of the polypeptide according to 1 or the fusion protein according to any one of 2 to 4 expressed on the surface of a diatom shell. Aggregation method.
17. A method for recovering diatoms, comprising the step of recovering diatoms aggregated by the method described in 16 above.
18. 18. A method for producing a substance using diatoms, comprising a step of extracting a substance produced by diatoms from diatoms collected by the method according to 17 above.
19. 19. The method according to 18 above, wherein the substance produced by diatoms is fats and oils.
本発明者により見出された被殻表面発現タンパク質と融合させることにより、任意のペプチドを被殻表面に発現させることができる。また、発現させた融合タンパク質の性質に基いて、珪藻類を凝集させ、珪藻類の回収に要するエネルギーコストを抑え、珪藻類を効率的に回収することができる。 Any peptide can be expressed on the surface of the putamen by fusing with the putamen surface expression protein found by the present inventors. Moreover, based on the property of the expressed fusion protein, diatoms can be aggregated, energy cost required for recovery of diatoms can be suppressed, and diatoms can be recovered efficiently.
＜ポリペプチド＞
一態様において、本発明は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、及び配列番号１２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに関する。配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、及び配列番号１２はそれぞれ、本発明者らによって新規に見出された、Fistulifera solarisの被殻表面発現タンパク質候補であるFrustulin 1、2、3、4、5、及び6のアミノ酸配列である。ここで、Frustulinとは、珪藻類の被殻に発現するタンパク質であり、3つの特徴（二つのシグナル配列、Acidic cysteine-rich領域、及びProline-rich領域）を有することが知られている。
<Polypeptide>
In one aspect, the invention relates to a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, and SEQ ID NO: 12. SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, and SEQ ID NO: 12 are candidate putamen surface expressed proteins of Fistulifera solaris newly discovered by the present inventors.
本明細書で、「珪藻」又は「珪藻類」とは、珪藻綱（Bacillariophyceae）に属する微細藻類を意味する。珪藻類として、円心目（Centrales）に属する藻類及び羽状目（Pennales）に属する藻類が挙げられる。円心目（Centrales）に属する藻類として、シクロテラ属（Cyclotella）、ミニディスクス属（Minidiscus）、タラシオシラ属（Thalassiosira）及びキートケロス属（Chaetoceros）に属する藻類等が挙げられ、羽状目（Pennales）に属する藻類として、ディメレグラムマ属（Dimeregramma）、シリンドロテカ属（Cylindrotheca）、ナビキュラ属（Navicula）、及びフィストゥリフェラ属（Fistulifera）に属する藻類等が挙げられる。本発明の珪藻はいずれの珪藻であってもよい。 In the present specification, “diatom” or “diatom” means a microalga belonging to the diatom class (Bacillariophyceae). Diatoms include algae belonging to Centrales and algae belonging to Pennales. Algae belonging to the genus Cyclotella, Minidiscus, Thalassiosira and Chaetoceros are included as algae belonging to the Centrales, and the Penales Examples of the algae belonging to the genus Dimeregramma, Cylindrotheca, Navicula, and Fistulifera include algae. The diatom of the present invention may be any diatom.
本明細書で、「被殻（frustule）」とは、主としてケイ酸で構成される、珪藻類の細胞壁を意味する。被殻は、図４で示す様に二つの部分、すなわち上殻（epitheca）（401）と下殻（hypotheca）（402）からなることが知られている。 As used herein, “frustule” refers to a cell wall of diatoms composed mainly of silicic acid. As shown in FIG. 4, it is known that the putamen consists of two parts, that is, the upper shell (401) and the lower shell (402).
Frustulin 1、2、3、4、5、及び6の塩基配列（それぞれ配列番号１、３、５、７、９、及び１１）は、それぞれアクセッション番号AB854058、AB854059、AB854057、AB854056、AB854061、及びAB854060として、公共のデータベースであるDDBJに登録されている。Frustulin 1〜6の塩基配列、アミノ酸配列、及びアクセッション番号の対応表を以下に示す。
本発明のポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、及び配列番号１２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに限定されず、珪藻類の被殻表面に発現する限り、そのオルソログ及び変異体等であって良い。したがって、本発明で用いるポリペプチドは、例えば、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、及び配列番号１２からなる群より選択されるアミノ酸配列と、70%以上の同一性、好ましくは80%以上の同一性、より好ましくは90%以上の同一性、最も好ましくは95%以上、例えば98%以上又は99%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであってよい。本明細書で使用する同一性の値は、複数のアミノ酸配列間の同一性を演算するソフトウェア（例えば、FASTA、DANASYS、及びBLAST）を用いてデフォルトの設定で算出した値を示す。また、本発明で用いるポリペプチドは、珪藻類の被殻表面に発現する限り、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、及び配列番号１２からなる群より選択されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドであってよい。ここで、「１若しくは複数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、1から20個、好ましくは1から10個、より好ましくは1から7個、さらに好ましくは1から5個、特に好ましくは1から3個、あるいは1個又は2個である。 The polypeptide of the present invention is not limited to a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, and SEQ ID NO: 12, Orthologues and mutants thereof may be used as long as they are expressed on the surface of the shell. Therefore, the polypeptide used in the present invention is, for example, 70% or more of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, and SEQ ID NO: 12. A polypeptide comprising an amino acid sequence having the identity of, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, most preferably 95% or more, such as 98% or more or 99% or more. It may be. The identity value used in the present specification indicates a value calculated with a default setting using software (for example, FASTA, DANASYS, and BLAST) that calculates identity between a plurality of amino acid sequences. The polypeptide used in the present invention is selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, and SEQ ID NO: 12 as long as it is expressed on the diatom shell. A polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, or added. Here, the range of “one or more” is not particularly limited, but for example, 1 to 20, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 7, more preferably 1 to 5, and particularly preferably Is 1 to 3, or 1 or 2.
また、本発明で用いるポリペプチドは、珪藻類の被殻表面に発現する限り、上記ポリペプチドの断片であってもよい。かかる断片は、上記のアミノ酸配列に基いて任意のペプチド断片を作製し、そのペプチド断片の発現部位を確認することにより、当業者であれば容易に作製することができる。 The polypeptide used in the present invention may be a fragment of the above polypeptide as long as it is expressed on the diatom shell. Such a fragment can be easily prepared by those skilled in the art by preparing an arbitrary peptide fragment based on the above amino acid sequence and confirming the expression site of the peptide fragment.
＜融合タンパク質＞
一態様において、本発明は、上記ポリペプチドに融合パートナーを連結してなる、融合タンパク質に関する。該融合タンパク質は、好ましくは、珪藻類の被殻表面に発現する。
<Fusion protein>
In one aspect, the present invention relates to a fusion protein comprising a fusion partner linked to the above polypeptide. The fusion protein is preferably expressed on the diatom shell.
本明細書で使用する「融合パートナー」は、上記ポリペプチドと異なるポリペプチドであれば、いかなるものであってもよく、珪藻類に元来存在する内因性のポリペプチドであるか否かを問わない。融合パートナーは、上記ポリペプチドに対して1個連結させてもよいし、1個以上、例えば2〜10個、特に2〜5個、例えば2個、3個、4個、又は5個連結させても良い。融合パートナーは上記ポリペプチドのN末端及びC末端のいずれに連結してもよいし、場合によりリンカー（例えば1〜50アミノ酸）を介して連結してもよい。当業者であれば、必要に応じて適宜リンカーを選択することができる。 As used herein, the “fusion partner” may be any polypeptide as long as it is different from the above-mentioned polypeptide, regardless of whether it is an endogenous polypeptide originally present in diatoms. Absent. One fusion partner may be linked to the polypeptide, or one or more, such as 2-10, in particular 2-5, such as 2, 3, 4, or 5. May be. The fusion partner may be linked to either the N-terminus or C-terminus of the polypeptide, or optionally via a linker (eg, 1-50 amino acids). A person skilled in the art can appropriately select a linker as necessary.
融合パートナーとして、限定するものではないが、標識タンパク質、酵素、抗体、金属イオン結合ペプチド、バイオミネラリゼーションペプチド、及び凝集タンパク質等が挙げられる。 Fusion partners include, but are not limited to, labeled proteins, enzymes, antibodies, metal ion binding peptides, biomineralization peptides, aggregated proteins, and the like.
本明細書で使用する「標識タンパク質」は、上記ポリペプチドを標識する役割を果たせるタンパク質であれば、特に限定しない。そのようなタンパク質として、例えば蛍光タンパク質及び発光タンパク質等が挙げられる。具体的な蛍光タンパク質として、例えば、GFP、CFP、RFP、DsRed、YFP、PE、PerCP、及びAPC等が挙げられ、具体的な発光タンパク質として、例えば、イクオリン等が挙げられる。 The “label protein” used in the present specification is not particularly limited as long as it is a protein capable of playing a role of labeling the polypeptide. Examples of such proteins include fluorescent proteins and photoproteins. Specific fluorescent proteins include, for example, GFP, CFP, RFP, DsRed, YFP, PE, PerCP, and APC, and specific photoproteins include, for example, aequorin.
酵素又は抗体の種類は特に限定しない。酵素又は抗体を被殻表面に発現させた場合は、珪藻類を固定化担体として利用し、イムノアッセイ、バイオアッセイ、バイオセンサ等に用いることができる。 The kind of enzyme or antibody is not particularly limited. When an enzyme or antibody is expressed on the surface of the shell, diatoms can be used as an immobilization carrier and used for immunoassays, bioassays, biosensors, and the like.
本明細書で使用する「金属イオン結合ペプチド」は、金属イオンを結合できるペプチドであれば特に限定するものではなく、例えばポリヒスチジンタグペプチド等のキレート作用を有するペプチド等が挙げられる。金属イオン結合ペプチドを被殻表面に発現させた場合は、珪藻類を海洋等の環境からの資源回収や環境浄化（バイオレメディエーション）に用いることができる。 The “metal ion-binding peptide” used in the present specification is not particularly limited as long as it is a peptide capable of binding a metal ion, and examples thereof include a peptide having a chelating action such as a polyhistidine tag peptide. When the metal ion-binding peptide is expressed on the surface of the shell, diatoms can be used for resource recovery from the environment such as the ocean and environmental purification (bioremediation).
本明細書で使用する「バイオミネラリゼーションペプチド」は、鉱物を作り出すペプチドを意味し、例えば、金粒子合成ペプチド（例えば、J. Am. Chem. Soc., 2002, 124, pp. 13660-13661に記載のAHHAHHAAD（配列番号17））、銀粒子合成ペプチド（例えば、Nat. Mater., 2002, 1, pp.169-172に記載のNPSSLFRYLPSD（配列番号18））、パラジウム粒子合成ペプチド（例えば、Chem. Mater, 2007, 19, pp.2056-2064に記載のGHHHHHH（配列番号19））等が挙げられる。バイオミネラリゼーションペプチドによって生成される鉱物としては金、銀、パラジウムのナノ粒子等が挙げられる。バイオミネラリゼーションペプチドを被殻表面に発現させた場合は、珪藻類を触媒の担体として用いることができる。 As used herein, “biomineralization peptide” means a peptide that produces minerals, such as gold particle synthetic peptides (eg, J. Am. Chem. Soc., 2002, 124, pp. 13660-13661). AHHAHHAAD (SEQ ID NO: 17)), silver particle synthetic peptide (for example, NPSLFRYLPSD (SEQ ID NO: 18) described in Nat. Mater., 2002, 1, pp.169-172), palladium particle synthetic peptide (for example, Chem. Mater, 2007, 19, pp. 2056-2064, and the like. Examples of the mineral generated by the biomineralization peptide include gold, silver, and palladium nanoparticles. When the biomineralization peptide is expressed on the surface of the shell, diatoms can be used as a catalyst carrier.
本明細書で使用する「凝集タンパク質」は、その性質に基いて凝集を誘起することができるタンパク質であれば特に限定しない。そのようなタンパク質として、例えば自己凝集タンパク質、抗体定常領域に対する抗体定常領域認識タンパク質、抗体定常領域認識タンパク質に対する抗体定常領域、ビオチンキャリアタンパク質に対するアビジン若しくはストレプトアビジン、アビジン若しくはストレプトアビジンに対するビオチンキャリアタンパク質、並びに抗原タンパク質に対する抗体、及び抗体に対する抗原タンパク質等が挙げられる。以下で具体的に説明する。 The “aggregated protein” used herein is not particularly limited as long as it is a protein capable of inducing aggregation based on its properties. Such proteins include, for example, self-aggregating proteins, antibody constant region recognition proteins for antibody constant regions, antibody constant regions for antibody constant region recognition proteins, avidin or streptavidin for biotin carrier proteins, biotin carrier proteins for avidin or streptavidin, and Examples thereof include an antibody against an antigen protein and an antigen protein against the antibody. This will be specifically described below.
自己凝集タンパク質には、エラスチン様タンパク質等が挙げられる。エラスチン様タンパク質は、（VPGVG）nで表されるタンパク質であり、温度上昇によりコンフォメーションチェンジが起こると、疎水性相互作用により自己凝集する。したがって、このタンパク質を凝集タンパク質として利用する場合は、培養温度を調節することで、細胞凝集を誘起することができる。 Self-aggregating proteins include elastin-like proteins. An elastin-like protein is a protein represented by (VPGVG) n , and self-aggregates by hydrophobic interaction when a conformational change occurs due to an increase in temperature. Therefore, when this protein is used as an aggregated protein, cell aggregation can be induced by adjusting the culture temperature.
抗体定常領域認識タンパク質には、Protein A、Protein G、及びProtein L等が挙げられる。抗体定常領域又は抗体定常領域認識タンパク質を凝集タンパク質として利用する場合は、例えば、抗体定常領域を発現する株と、抗体定常領域認識タンパク質を発現する株を別個に作成し、混合することで細胞凝集を誘起することができる。 Examples of antibody constant region recognition proteins include Protein A, Protein G, and Protein L. When using an antibody constant region or antibody constant region recognition protein as an aggregation protein, for example, a strain that expresses an antibody constant region and a strain that expresses an antibody constant region recognition protein are prepared separately and mixed to produce cell aggregation. Can be induced.
ビオチンキャリアタンパク質とは、生体内に元来存在し、小分子であるビオチンを固定化できるタンパク質である。ビオチンキャリアタンパク質、又はアビジン若しくはストレプトアビジン（若しくはその単量体）を凝集タンパク質として利用する場合は、例えば、ビオチンキャリアタンパク質を発現する株と、アビジン又はストレプトアビジンを発現する株を別個に作成し、混合することで細胞凝集を誘起することができる。 The biotin carrier protein is a protein that originally exists in a living body and can immobilize biotin, which is a small molecule. When using biotin carrier protein, or avidin or streptavidin (or its monomer) as an aggregation protein, for example, a strain that expresses biotin carrier protein and a strain that expresses avidin or streptavidin are prepared separately, By mixing, cell aggregation can be induced.
抗原タンパク質又は抗体を凝集タンパク質として利用する場合は、例えば、抗原タンパク質を発現する株に対して抗体を添加することで、細胞凝集を誘起することができる。 When an antigen protein or an antibody is used as an aggregate protein, for example, cell aggregation can be induced by adding an antibody to a strain that expresses the antigen protein.
＜ポリヌクレオチド＞
一態様において、本発明は上記「ポリペプチド」の章に記載のポリペプチド又は上記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドに関する。
<Polynucleotide>
In one aspect, the present invention relates to a polynucleotide encoding the polypeptide described in the “Polypeptides” section or the fusion protein.
また、本発明は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、及び配列番号１１からなる群より選択される塩基配列を含むポリヌクレオチドに関する。また、本発明のポリヌクレオチドは、上記塩基配列を含むポリヌクレオチドに限定されず、珪藻類の被殻表面に発現するポリペプチドをコードする限り、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、及び配列番号１１からなる群より選択される塩基配列と70%以上の同一性、好ましくは80%以上の同一性、より好ましくは90%以上の同一性、最も好ましくは95%以上、例えば98%以上又は99%以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドであってよい。 The present invention also relates to a polynucleotide comprising a base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, and SEQ ID NO: 11. Further, the polynucleotide of the present invention is not limited to the polynucleotide containing the above base sequence, and as long as it encodes a polypeptide expressed on the diatom shell, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, 70% or more identity, preferably 80% or more identity, more preferably 90% or more identity, most preferably, a base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 11 It may be a polynucleotide comprising a base sequence having 95% or more, such as 98% or more or 99% or more identity.
同様に、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、及び配列番号１１からなる群より選択される塩基酸配列において、１若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド、又は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、及び配列番号１１からなる群より選択される塩基酸配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであってよい。 Similarly, the polynucleotide of the present invention has one or a plurality of base acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, and SEQ ID NO: 11. Or a polynucleotide comprising a nucleotide sequence deleted, substituted, or added, or selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, and SEQ ID NO: 11. It may be a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to the complementary strand of the basic acid sequence.
ここでいう「ストリンジェントな条件」とはいわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を意味し、例えばGreen and Sambrook, Molecular Cloning, 4th Ed (2012), Cold Spring Harbor Laboratory Press を参照して適宜決定することができる。具体的には、サザンハイブリダイゼーションの際の温度や溶液に含まれる塩濃度、及びサザンハイブリダイゼーションの洗浄工程の際の温度や溶液に含まれる塩濃度によりストリンジェントな条件を設定することができる。より詳細には、ストリンジェントな条件としては、例えば、ナトリウム濃度が25〜500mM、好ましくは25〜300mMであり、温度が42〜68℃、好ましくは42〜65℃である。より具体的には、5×SSC (83mM NaCl、83mMクエン酸ナトリウム)、温度42℃である。 As used herein, “stringent conditions” refers to conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed. For example, Green and Sambrook, Molecular Cloning, 4th Ed (2012), Cold Spring Harbor It can be determined appropriately with reference to Laboratory Press. Specifically, stringent conditions can be set according to the temperature at the time of Southern hybridization and the salt concentration contained in the solution, and the temperature at the time of the washing step of Southern hybridization and the salt concentration contained in the solution. More specifically, as stringent conditions, for example, the sodium concentration is 25 to 500 mM, preferably 25 to 300 mM, and the temperature is 42 to 68 ° C, preferably 42 to 65 ° C. More specifically, 5 × SSC (83 mM NaCl, 83 mM sodium citrate), temperature 42 ° C.
＜発現ベクター＞
一態様において、本発明は、発現ベクターに関する。本発明のベクターは、好ましくは、上記「ポリペプチド」の章に記載のポリペプチド又は融合タンパク質をコードするDNAを発現可能な状態で含む。ここで、「発現可能な状態で含む」とは、ベクターが宿主細胞に導入された際に、ベクターに含まれるDNAによりコードされるポリペプチドが、宿主細胞において発現されることを意味する。
<Expression vector>
In one aspect, the invention relates to an expression vector. The vector of the present invention preferably contains a DNA encoding the polypeptide or fusion protein described in the “Polypeptide” section above in a state capable of being expressed. Here, “including in an expressible state” means that when the vector is introduced into the host cell, the polypeptide encoded by the DNA contained in the vector is expressed in the host cell.
本発明に使用されるベクターとしては、例えばプラスミドベクター等が挙げられる。プラスミドベクターとしては、例えばpSP-NPT/H4及びpSP-ShBle/H4等が挙げられる。 Examples of the vector used in the present invention include a plasmid vector. Examples of plasmid vectors include pSP-NPT / H4 and pSP-ShBle / H4.
ベクターは、発現されるDNAの他に、例えばプロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、及びターミネーター等の調節性配列、並びに必要に応じて選択マーカー等を含んでよい。プロモーターは恒常的なものであってもよいし、誘導性のものであってもよい。調節性の配列を使用すれば、上記ポリペプチド又は融合タンパク質の発現時期を調整することができる。例えば、誘導性のプロモーターの下流に凝集タンパク質をコードするDNAを含む発現ベクターを珪藻類に形質転換すれば、プロモーターを活性化することで、任意の時期に珪藻類の凝集を促進することができる。 In addition to the DNA to be expressed, the vector may contain regulatory sequences such as a promoter, an enhancer, a ribosome binding site, and a terminator, and a selection marker, if necessary. The promoter may be constitutive or inducible. If a regulatory sequence is used, the expression time of the said polypeptide or fusion protein can be adjusted. For example, if an expression vector containing DNA encoding an aggregated protein downstream of an inducible promoter is transformed into diatoms, diatom aggregation can be promoted at any time by activating the promoter. .
＜形質転換珪藻の製造方法＞
一態様において、本発明は、上記ポリヌクレオチド又はベクターで珪藻類を形質転換させる工程を含む、形質転換珪藻類を製造する方法に関する。また、本発明は、上記ポリヌクレオチド又はベクターで形質転換された珪藻類に関する。
<Method for producing transformed diatom>
In one aspect, the present invention relates to a method for producing transformed diatoms, comprising the step of transforming diatoms with the polynucleotide or vector. The present invention also relates to a diatom transformed with the above polynucleotide or vector.
本発明において、遺伝子を導入する生物は、前述した珪藻類であれば特に限定しないが、好ましくはFistulifera属に属する珪藻類である。Fistulifera属に属する珪藻類等として、特にWO 2010/116611に開示されているFistulifera sp. JPCC DA0580株（Navicula sp. JPCC DA0580株から改名、本明細書ではFistulifera solaris JPCC DA0580株とも称する）を例示することができる。なお、Fistulifera solaris JPCC DA0580株は、WO 2010/116611に記載されているように、FERM BP-11201（FERM P-21788より移管）として独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター (IPOD, NITE) (〒292-0818千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8) に国際寄託されている。 In the present invention, the organism into which the gene is introduced is not particularly limited as long as it is a diatom described above, but is preferably a diatom belonging to the genus Fistulifera. Examples of diatoms belonging to the genus Fistulifera include the Fistulifera sp. JPCC DA0580 strain disclosed in WO 2010/116611 (renamed from Navicula sp. JPCC DA0580 strain, also referred to herein as Fistulifera solaris JPCC DA0580 strain) be able to. The Fistulifera solaris JPCC DA0580 strain, as described in WO 2010/116611, is FERM BP-11201 (transferred from FERM P-21788). ) (Deposited internationally at 2-5-8 Kazusa Kamashi, Kisarazu City, Chiba Prefecture 292-0818, Japan)
ポリヌクレオチドの導入方法としては、珪藻類へポリヌクレオチドを導入できる方法であればいずれも用いる事ができ、例えばパーティクルガン法、カルシウムイオン法、プロトプラスト法、及びエレクトロポレーション法等を挙げることができる。これらの方法は植物分野において遺伝子導入方法として周知の技術である。例えば、Muto M, Fukuda Y, Nemoto M, Yoshino T, Matsunaga T, Tanaka T, Marine Biotechnology, (2013), 15(1): 48-55に記載の方法を利用することができる。 As a method for introducing a polynucleotide, any method that can introduce a polynucleotide into diatoms can be used, and examples thereof include a particle gun method, a calcium ion method, a protoplast method, and an electroporation method. . These methods are well-known techniques for gene introduction in the field of plants. For example, the method described in Muto M, Fukuda Y, Nemoto M, Yoshino T, Matsunaga T, Tanaka T, Marine Biotechnology, (2013), 15 (1): 48-55 can be used.
＜珪藻類による物質の産生方法＞
一態様において、本発明は珪藻類、特に本明細書に記載の形質転換珪藻類の被殻表面に発現しているポリペプチド又は融合タンパク質の性質に基いて、形質転換珪藻類を凝集させる工程を含む、珪藻類の凝集方法に関する。
<Method of producing substances by diatoms>
In one aspect, the present invention comprises a step of aggregating transformed diatoms based on the properties of diatoms, particularly polypeptides or fusion proteins expressed on the putamen surface of the transformed diatoms described herein. Including a diatom agglomeration method.
本明細書で使用する「ポリペプチド又は融合タンパク質の性質に基いて」珪藻類を凝集させるとは、該ポリペプチドの性質を利用して珪藻類を凝集させることを意味し、その手段は特に限定しない。利用し得る性質は、限定するものではないが、ペプチド又は融合タンパク質の恒常的な自己凝集性、又は温度及びpH等の培養条件の変更若しくは凝集因子の添加によって誘導される誘導的凝集性が挙げられる。自己凝集性を利用する場合は、適切な調節因子、例えば誘導性のプロモーターを選択することによって、また、誘導的凝集性を利用する場合は、培養条件の変更又は凝集因子の添加によって、珪藻類の凝集時期を調節することができる。 As used herein, “aggregating diatoms” based on the property of the polypeptide or fusion protein means that the properties of the polypeptide are used to aggregate diatoms, and means for that are particularly limited. do not do. The properties that can be used include, but are not limited to, the constant self-aggregation of peptides or fusion proteins, or induced aggregation induced by changes in culture conditions such as temperature and pH, or addition of aggregation factors. It is done. When utilizing self-aggregation properties, diatoms can be selected by selecting appropriate regulatory factors, such as inducible promoters, and when inducible aggregation properties are utilized, by changing the culture conditions or adding aggregation factors. The aggregation time can be adjusted.
凝集因子の例として、上記ポリペプチド若しくは上記融合タンパク質を発現させた場合の、該ポリペプチド若しくは融合タンパク質に対する抗体が挙げられる。具体的には、例えば、FrustulinとGFPの融合タンパク質を発現させた場合の、抗Frustulin抗体又は抗GFP抗体である。また、本明細書に記載の凝集タンパク質を用いて、珪藻類を凝集させることもできる。 Examples of the aggregation factor include an antibody against the polypeptide or fusion protein when the polypeptide or the fusion protein is expressed. Specifically, for example, an anti-Frustulin antibody or an anti-GFP antibody when a fusion protein of Frustulin and GFP is expressed. Moreover, diatoms can also be aggregated using the aggregated protein described in the present specification.
一態様において、本発明は、本明細書に記載の方法によって凝集させた珪藻類を回収する工程を含む、珪藻類の回収方法に関する。回収は、本明細書に記載の方法によって凝集させた細胞を含む培養液等から、デカンテーション又はアスピレーション等により単に培養液等を除くことにより行ってもよいし、凝集が不十分な場合には、さらに遠心分離、フィルターろ過、凝集沈殿等の分離操作を行った後に、培養液等を除くことにより行ってもよい。 In one aspect, the present invention relates to a method for recovering diatoms, comprising the step of recovering diatoms agglomerated by the methods described herein. The collection may be performed by simply removing the culture solution or the like by decantation or aspiration from the culture solution containing the cells aggregated by the method described in this specification, or when the aggregation is insufficient Further, the separation may be performed by removing the culture solution or the like after further separation operations such as centrifugation, filter filtration, and coagulation sedimentation.
一態様において、本発明は、回収した珪藻類から、珪藻類が産生する物質を抽出する工程を含む、珪藻類による物質の産生方法に関する。珪藻類が産生する物質の抽出は、当業者にとって公知の方法、例えば、ホモジナイザー等による物理的処理、超音波処理、熱処理、及び有機溶媒による抽出等の化学的処理のいずれかを用いて、又はこれらの一以上を組み合わせて行うことができる。 In one aspect, the present invention relates to a method for producing a substance using diatoms, the method comprising extracting a substance produced by diatoms from the recovered diatoms. The extraction of substances produced by diatoms can be performed using any of methods known to those skilled in the art, for example, physical treatment using a homogenizer or the like, ultrasonic treatment, heat treatment, and chemical treatment such as extraction using an organic solvent, or One or more of these can be combined.
一態様において、本発明は、（a）珪藻類、特に本明細書に記載の形質転換珪藻類を培養する工程、（b）該珪藻類の被殻表面に発現しているポリペプチド又は融合タンパク質の性質に基いて、該珪藻類を凝集させる工程、（c）凝集させた珪藻類を回収する工程、及び（d）回収した珪藻類から、珪藻類が産生する物質を抽出する工程を含む、珪藻類による物質の産生方法に関する。 In one aspect, the present invention provides (a) culturing diatoms, particularly transformed diatoms described herein, (b) a polypeptide or fusion protein expressed on the putamen surface of the diatoms A step of aggregating the diatoms based on the properties of (c) a step of recovering the aggregated diatoms, and (d) a step of extracting a substance produced by the diatoms from the recovered diatoms, The present invention relates to a method for producing substances by diatoms.
珪藻類が産生する物質は、特に限定するものではないが、例えば、スクワレン及びトリグリセリド等の油脂、フコキサンチン及びエイコサペンタエン酸等の生理活性物質が挙げられ、好ましくは油脂である。油脂を生産する場合には、Fistulifera属に属するオイル蓄積能を有する珪藻類、特にオイル高蓄積能を有するFistulifera solaris JPCC DA0580株を用いることが好ましい。 Although the substance which diatoms produce is not specifically limited, For example, fats and oils, such as squalene and a triglyceride, physiologically active substances, such as fucoxanthin and eicosapentaenoic acid, are mentioned, Preferably it is fats and oils. In the case of producing fats and oils, it is preferable to use diatoms having an oil accumulation ability belonging to the genus Fistulifera, particularly Fistulifera solaris JPCC DA0580 strain having a high oil accumulation ability.
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further in detail, the technical scope of this invention is not limited to a following example.
＜実施例１：珪藻類における被殻表面タンパク質の単離＞
（１）珪藻類の培養
Fistulifera solaris JPCC DA0580株はhalf strength of Guillard's f solution (f/2培地)（75 mg NaNO3, 6 mg Na2HPO4・2H2O, 0.5 μg vitamin B12, 0.5 μg biotin, 100 μg thiamine HCl, 10 mg Na2SiO3・9H2O, 4.4 mg Na2EDTA, 3.16 mg FeCl3・6H2O, 12 μg CoSO4・5H2O, 21 μg ZnSO4・7H2O, 0.18 mg MnCl2・4H2O, 70 μg CuSO4・5H2O, and 7 μg Na2MoO4・2H2O）を1 Lの人工海水(富田製薬)に溶解した培地を用いて、500 mLの扁平フラスコを用いて、25 ℃、140 μmol/m2/sの連続光照射下で培養した。
<Example 1: Isolation of putamen surface protein in diatoms>
(1) Culture of diatoms
Fistulifera solaris JPCC DA0580 strain is half strength of Guillard's f solution (f / 2 medium) (75 mg NaNO 3 , 6 mg Na 2 HPO 4・ 2H 2 O, 0.5 μg vitamin B12, 0.5 μg biotin, 100 μg thiamine HCl, 10 mg Na 2 SiO 3・ 9H 2 O, 4.4 mg Na 2 EDTA, 3.16 mg FeCl 3・ 6H 2 O, 12 μg CoSO 4・ 5H 2 O, 21 μg ZnSO 4・ 7H 2 O, 0.18 mg MnCl 2・ 4H 2 O, 70 μg CuSO 4 · 5H 2 O, and 7 μg Na 2 MoO 4 · 2H 2 O) in 1 L artificial seawater (Tonda Pharmaceutical), using a 500 mL flat flask, The cells were cultured at 25 ° C. under continuous light irradiation of 140 μmol / m 2 / s.
（２）被殻表面タンパク質の検索
Fistulifera solaris JPCC DA0580株のゲノム配列を解析した。次に、Fistulifera solaris JPCC DA0580株のドラフトゲノム配列から、AUGUSTUSプログラムを利用してタンパク質をコードする領域を予測した。予測されたタンパク質群のアミノ酸配列から、他の珪藻で見出されている被殻表面タンパク質であるFrustulinと相同性を持つタンパク質を検索した。すなわち、Query配列としてCylindrotheca fusiformis由来alpha 2 Frustulin (EMBL登録番号：CAA67702.1)、及びalpha 3 Frustulin (EMBL登録番号：CAA67703.1) を利用し、BlastPによる検索を行った。その際、E-value cut off valueを1e-15とした。その結果、他の珪藻で見出されたFrustulinの3つの特徴（二つのシグナル配列、Acidic cysteine-rich領域、及びProline-rich領域）を備えるタンパク質として、6つの候補タンパク質が選択された。それらを、Furstulin 1（cDNA配列：配列番号1、及びアミノ酸配列：配列番号2）、Furstulin 2（cDNA配列：配列番号3、及びアミノ酸配列：配列番号4）、Furstulin 3（cDNA配列：配列番号5、及びアミノ酸配列：配列番号6）、Furstulin 4（cDNA配列：配列番号7、及びアミノ酸配列：配列番号8）、Furstulin 5（cDNA配列：配列番号9、及びアミノ酸配列：配列番号10）、及びFurstulin 6（cDNA配列：配列番号11及びアミノ酸配列：配列番号12）として同定した。
(2) Search for putamen surface proteins
The genome sequence of Fistulifera solaris JPCC DA0580 strain was analyzed. Next, the region encoding the protein was predicted from the draft genome sequence of Fistulifera solaris JPCC DA0580 using the AUGUSTUS program. From the predicted amino acid sequences of proteins, we searched for proteins with homology to Frustulin, a putamen surface protein found in other diatoms. In other words, Cylindrotheca fusiformis-derived
＜実施例２：Frustulin 1-GFP融合遺伝子発現ベクターの構築＞
500 μg/mL G418を添加したf/2培地中でFistulifera solaris JPCC DA0580株を4日間培養し、3000 g、10分間、24 ℃の条件で遠心回収を行った。回収した細胞ペレットを液体窒素中で乳鉢、乳棒を用いて粉砕し、ConcertTM Plant RNA Reagent (Life technologies)によりTotal RNAの抽出を行った。得られた抽出物をRNeasy Mini Kit (QIAGEN)により精製した。その後、DNase I (TaKaRa)により37 ℃、30分間の条件でサンプル中のDNAの分解を行った。吸光度及びAgilent RNA 6000 Nano Assay kit(Agilent technologies)を用いてキャピラリー電気泳動によりTotal RNAを評価した。得られたTotal RNA 1 μgをテンプレートとし、PrimeScript II 1st strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa)によりcDNA合成を行った。得られたcDNAを鋳型とし、実施例１で同定したFrustulin 1をコードする遺伝子を、特異的プライマーペア (forward primer: 5’-ATG ACA GTC CTT CAG CTT TTA CTC AAG GTC-3’（配列番号１３）及びreverse primer: 5’-GTA TTT GTT CCA GTA CGA TGT GTT GCT GC-3’（配列番号１４）)を用いてPCR増幅した。一方、発現ベクターpSP-NPT/H4（pSP73 (Promega Corporation, Madison,WI, USA）をもとに、Muto M, Fukuda Y, Nemoto M, Yoshino T, Matsunaga T, Tanaka T, Marine Biotechnology, (2013), 15(1): 48-55に記載の方法で構築）に新たにJPCC DA0580株由来のglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) 遺伝子プロモーター（500-bp）、緑色蛍光タンパク質GFP遺伝子配列（720-bp）、及びPhaeodacylum tricornutum由来のfucoxanthin chlorophyll a/c-binding protein A (fcpA)遺伝子ターミネーター配列（227-bp）を導入した。その新たに導入したプロモーター及びGFP遺伝子配列間に設計されたEcoRV配列にFrustulin 1遺伝子を導入し、Frustulin 1-GFP融合遺伝子発現ベクターpSP-Frustulin 1-GFP/GAPDHを構築した（図１）。
<Example 2: Construction of Frustulin 1-GFP fusion gene expression vector>
The Fistulifera solaris JPCC DA0580 strain was cultured in f / 2 medium supplemented with 500 μg / mL G418 for 4 days and centrifuged at 3000 g for 10 minutes at 24 ° C. The collected cell pellet was pulverized in liquid nitrogen using a mortar and pestle, and total RNA was extracted with Concert ™ Plant RNA Reagent (Life technologies). The obtained extract was purified by RNeasy Mini Kit (QIAGEN). Thereafter, DNA in the sample was decomposed with DNase I (TaKaRa) at 37 ° C. for 30 minutes. Absorbance and total RNA were evaluated by capillary electrophoresis using Agilent RNA 6000 Nano Assay kit (Agilent technologies). Using 1 μg of the total RNA obtained as a template, cDNA synthesis was performed by PrimeScript II 1st strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa). Using the obtained cDNA as a template, a gene encoding Frustulin 1 identified in Example 1 was transferred to a specific primer pair (forward primer: 5'-ATG ACA GTC CTT CAG CTT TTA CTC AAG GTC-3 '(SEQ ID NO: 13 ) And reverse primer: 5′-GTA TTT GTT CCA GTA CGA TGT GTT GCT GC-3 ′ (SEQ ID NO: 14)). On the other hand, based on the expression vector pSP-NPT / H4 (pSP73 (Promega Corporation, Madison, WI, USA), Muto M, Fukuda Y, Nemoto M, Yoshino T, Matsunaga T, Tanaka T, Marine Biotechnology, (2013) , 15 (1): Constructed by the method described in 48-55) and newly glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) gene promoter (500-bp) derived from JPCC DA0580 strain, green fluorescent protein GFP gene sequence (720- bp), and fucoxanthin chlorophyll a / c-binding protein A (fcpA) gene terminator sequence (227-bp) derived from Phaeodacylum tricornutum. The Frustulin 1 gene was introduced into the EcoRV sequence designed between the newly introduced promoter and the GFP gene sequence to construct a Frustulin 1-GFP fusion gene expression vector pSP-Frustulin 1-GFP / GAPDH (FIG. 1).
＜実施例３：JPCC DA0580株への遺伝子導入方法＞
60 mg/mLの濃度で50 %グリセロール中に懸濁した0.6 μmのタングステン粒子（高純度化学研究所）50 μLに対し、実施例２で得られた発現ベクターpSP-Frustulin 1-GFP/GAPDH（1 μg/μL、5 μL）及び2.5 M CaCl2 50 μL、0.1 Mスペルミジン20 μLを添加し、粒子上にベクターを固定化した。また、対数増殖期初期（細胞濃度：1〜2 × 107 cells/mL）のJPCC DA0580株5 × 107 cellsを1 %寒天f/2培地（直径3.6 cmシャーレ）上に塗布した。シャーレをBiolistic PDS-1000/He Particle Delivery System (BIO-RAD)内にセットし、打ち出し圧力を1550 psiに調整し、パーティクルガンにより発現ベクターを導入した。導入後、寒天培地上の藻体を1 mLのf/2培地で懸濁し、1 %寒天f/2培地（直径9 cm）に塗布し、140 μmol/m2/sの光照射、25 ℃条件下で24時間培養した。1 mLのf/2培地で寒天培地上の細胞を懸濁し、1 × 107 cells (200 μL)を500 μg/mLのG418を含む1 %寒天培地（直径9 cmシャーレ）に播種し、3週間培養を行い、190個の抗生物質耐性コロニーの獲得を行った。
<Example 3: Gene transfer method to JPCC DA0580>
The expression vector pSP-Frustulin 1-GFP / GAPDH obtained in Example 2 was applied to 50 μL of 0.6 μm tungsten particles (High Purity Chemical Laboratory) suspended in 50% glycerol at a concentration of 60 mg / mL. 1 μg / μL, 5 μL) and 2.5
＜実施例４：蛍光顕微鏡観察による融合タンパク質の局在評価＞
実施例３で得られた抗生物質耐性クローンを500 μg/mLのG418が添加されたf/2液体培地中で培養し、生育の見られたクローンを形質転換体とした。得られた形質転換体クローンを、以下の様に、蛍光顕微鏡で観察し、Frustulin 1の局在を確認した。
<Example 4: Localization evaluation of fusion protein by fluorescence microscope observation>
The antibiotic-resistant clone obtained in Example 3 was cultured in an f / 2 liquid medium supplemented with 500 μg / mL G418, and a clone in which growth was observed was used as a transformant. The obtained transformant clone was observed with a fluorescence microscope as follows, and the localization of Frustulin 1 was confirmed.
細胞培養液2 μLをスライドガラスに載せ、カバーガラスを置き、デジタルカメラ (Olympus DP-70) を搭載した蛍光顕微鏡 (Olympus BX51) を用いて観察した。観察条件としてレーザー強度50、ISO感度1600、フィルターユニットには、GFP観察用にはNIBAを、クロロフィル蛍光用にWIGをそれぞれ使用し、露光時間はGFP、クロロフィルそれぞれ5秒及び0.5秒、光源はファイバ光源システムU-HGLGPS (Olympus) を用いた。また、同株において三次元再構築画像を取得するため、473 nm 及び559 nmのレーザーを搭載した共焦点レーザー走査型顕微鏡FV 1000-D IX81 (Olympus) にて観察を行った。細胞のGFP蛍光及びクロロフィル自家蛍光をそれぞれAlexa Fluor 488及びAlexa Fluor 568を用いた撮像条件で、100倍油浸対物レンズを用いて撮影した。三次元蛍光画像を取得するため、Z軸方向0.2 μm間隔で共焦点画像を撮像した。撮影した画像をVolocity (Perkin Elmer Inc.) を用いて三次元画像に再構築した。
2 μL of the cell culture solution was placed on a slide glass, a cover glass was placed, and observation was performed using a fluorescence microscope (Olympus BX51) equipped with a digital camera (Olympus DP-70). Observation conditions are
その結果、Frustulin 1-GFP融合遺伝子発現株において、細胞の外周を覆うように緑色蛍光が観察された（図２）。同条件で野生株を観察したところ、緑色蛍光は観察されなかったことから、組み換え発現させたFrustulin 1-GFP融合タンパク質が、実際に被殻表面に局在していることが示唆された。共焦点顕微鏡による三次元再構築画像（図３）によると、緑色蛍光は被殻表面全体で観察される一方、上殻 (epitheca) （図４、401）と下殻 (hypotheca) （図４、402）が重なっている部位であるplural bandsに特に局在している様子が観察された（図３及び図４）。 As a result, green fluorescence was observed so as to cover the outer periphery of the cells in the Frustulin 1-GFP fusion gene expression strain (FIG. 2). When wild strains were observed under the same conditions, green fluorescence was not observed, suggesting that the recombinantly expressed Frustulin 1-GFP fusion protein was actually localized on the putamen surface. According to the three-dimensional reconstructed image (Fig. 3) by the confocal microscope, green fluorescence is observed on the entire surface of the putamen, while the epitheca (Figs. 4, 401) and hypotheca (Fig. 4, 402) was observed to be particularly localized in the plural bands, which are overlapping portions (FIGS. 3 and 4).
続いて、Frustulin 1-GFP融合タンパク質と、Silaffin様タンパク質の発現効率を比較した。ここで、Silaffin様タンパク質は、Fistulifera solaris JPCC DA0580で見出された珪殻タンパク質G7408（Accession ID: AB854049）であり、その一部（47アミノ酸）を除いたもの（cDNA配列：配列番号15、及びアミノ酸配列：配列番号16）を発現させた（詳細は、Nemoto et al. Identification of a frustule-associated protein of the marine pennate diatom Fistulifera sp. strain JPCC DA0580, Marine Genomics, in pressを参照されたい）。なお、発現ベクターの作製及び遺伝子の導入は、実施例2〜3でFrustulin 1-GFP融合遺伝子について記載したのと同様に行った。 Subsequently, the expression efficiency of the Frustulin 1-GFP fusion protein and the Silaffin-like protein were compared. Here, the Silaffin-like protein is a silica shell protein G7408 (Accession ID: AB854049) found in Fistulifera solaris JPCC DA0580, and a part thereof (47 amino acids) is removed (cDNA sequence: SEQ ID NO: 15, and Amino acid sequence: SEQ ID NO: 16) was expressed (for details, see Nemoto et al. Identification of a frustule-associated protein of the marine pennate diatom Fistulifera sp. Strain JPCC DA0580, Marine Genomics, in press). In addition, preparation of an expression vector and gene introduction were performed in the same manner as described for the Frustulin 1-GFP fusion gene in Examples 2-3.
Frustulin 1-GFP融合タンパク質を発現させた場合、観察したほぼ全ての形質転換体細胞において、同様の緑色蛍光分布が観察された。Frustulin 1-GFP融合タンパク質の発現効率（形質転換体の99%程度が緑色蛍光を示す）は、他の被殻表面タンパク質であるSilaffin様タンパク質の発現効率（形質転換体の15%程度が緑色蛍光を示す）よりも顕著に高かった（図５）。 When the Frustulin 1-GFP fusion protein was expressed, the same green fluorescence distribution was observed in almost all the transformed cells observed. The expression efficiency of Frustulin 1-GFP fusion protein (about 99% of transformants show green fluorescence) is the expression efficiency of Silaffin-like protein, another putamen surface protein (about 15% of transformants are green fluorescence) (Fig. 5).
＜実施例５：ウェスタンブロッティングによるGFP融合タンパク質の発現評価＞
GFP融合タンパク質の更なる発現評価のため、抗GFP抗体を用いた発現評価を行った。形質転換体において発現していると予想されるFrustulin 1-GFP融合タンパク質は約63 kDaである。また、ポジティブコントロールとしてGFP（約27 kDa）のみを発現する形質転換体、ネガティブコントロールとして野生株の細胞を用いて、同様の実験を行った。それぞれの細胞5 × 107 cellsを遠心回収 (8,500g, 23 ℃, 5分) し、ペレットに1% SDSを200 μL添加後、Heatblock (SIBATA) を用いて99 ℃で10分間加熱した。再び遠心分離を行い、上清のみを回収後、30 μLを3×SDS sample buffer (188 mM Tris-HCl [pH 6.8], 3% SDS, 15% β-mercaptoethanol, 30% glycerol, 0.01% bromophenol blue) 15 μLと混合し5分間煮沸した後、アクリルアミド濃度12.5% (w/v) の分離ゲルを用いたSDS-PAGEに40 μL供した。続いてゲルとPolyvinyliden Difuloride (PVDF) 膜をA液 (0.3 M Tris, 20% Methanol, 0.02% SDS, pH 9.5) 、B液 (25 mM Tris, 20% Methanol, 0.02% SDS, pH 9.3) 、C液 (25 mM Tris, 0.04 M 6-amino-n-capronic acid, 20% Methanol, 0.02% SDS, pH 9.1) に浸したろ紙に挟み、Trans-Blot SD semi-dry transfer cell (BIO-RAD) を用いて1時間40分通電 (1 mA/cm2) させることでブロッティングを行った。ブロッティング後、PVDF膜を1% BSA含有PBS-T中でovernight反応させ、ブロッキングを行った。PBS-Tを加え、10分間の振盪を3回繰り返し洗浄した後、1 μg/mL アルカリホスファターゼ (AP) 標識抗GFP抗体 (Rockland Immunochemicals Inc.) を添加し、室温にて1時間反応させた。反応後のPVDF膜をPBS-Tで3回洗浄した後、BCIP/NBT Blue (Sigma-Aldrich Co. LLC.) を3 mL添加した。バンドが可視化されたところで溶液を捨て、超純水で3回洗浄した後、乾燥させた。その結果、Frustulin 1-GFP融合タンパク質発現株（図６、Lane S）、及びGFP発現株（図６、Lane PC）において、目的の位置にバンドが得られた（図６）。一方、野生株からは特異的なバンドは得られなかった（図６、Lane WT）。以上の事から、蛍光顕微鏡による観察から緑色蛍光が見られた形質転換体において、目的のFrustulin 1-GFP融合タンパク質が発現していることが確認された。
<Example 5: Expression evaluation of GFP fusion protein by Western blotting>
For further evaluation of the expression of the GFP fusion protein, expression evaluation using an anti-GFP antibody was performed. The Frustulin 1-GFP fusion protein expected to be expressed in the transformant is approximately 63 kDa. The same experiment was performed using a transformant expressing only GFP (about 27 kDa) as a positive control and a wild type cell as a negative control. 5 × 10 7 cells of each cell were collected by centrifugation (8,500 g, 23 ° C., 5 minutes), 200 μL of 1% SDS was added to the pellet, and then heated at 99 ° C. for 10 minutes using Heatblock (SIBATA). Centrifuge again and collect only the supernatant, then 30 μL of 3 × SDS sample buffer (188 mM Tris-HCl [pH 6.8], 3% SDS, 15% β-mercaptoethanol, 30% glycerol, 0.01% bromophenol blue After mixing with 15 μL and boiling for 5 minutes, 40 μL was applied to SDS-PAGE using a separation gel with an acrylamide concentration of 12.5% (w / v). Next, gel and Polyvinyliden Difuloride (PVDF) membrane were mixed with solution A (0.3 M Tris, 20% Methanol, 0.02% SDS, pH 9.5), solution B (25 mM Tris, 20% Methanol, 0.02% SDS, pH 9.3), C Put the sample in a filter paper soaked in liquid (25 mM Tris, 0.04 M 6-amino-n-capronic acid, 20% Methanol, 0.02% SDS, pH 9.1), and place the Trans-Blot SD semi-dry transfer cell (BIO-RAD). Blotting was performed by energizing for 1 hour and 40 minutes (1 mA / cm 2 ). After blotting, the PVDF membrane was allowed to react overnight in PBS-T containing 1% BSA for blocking. PBS-T was added, and 10-minute shaking was repeated 3 times. Then, 1 μg / mL alkaline phosphatase (AP) -labeled anti-GFP antibody (Rockland Immunochemicals Inc.) was added and reacted at room temperature for 1 hour. After the reaction, the PVDF membrane was washed 3 times with PBS-T, and 3 mL of BCIP / NBT Blue (Sigma-Aldrich Co. LLC.) Was added. When the band was visualized, the solution was discarded, washed with ultrapure water three times, and then dried. As a result, a band was obtained at the target position in the Frustulin 1-GFP fusion protein expression strain (FIG. 6, Lane S) and the GFP expression strain (FIG. 6, Lane PC) (FIG. 6). On the other hand, no specific band was obtained from the wild type (FIG. 6, Lane WT). From the above, it was confirmed that the target Frustulin 1-GFP fusion protein was expressed in the transformant in which green fluorescence was observed by observation with a fluorescence microscope.
＜実施例６：抗体結合試験によるGFP融合タンパク質の被殻表面提示状態の確認＞
実施例４における顕微鏡観察の結果、融合タンパク質が被殻表面に局在していることが確認された。一方で珪藻の被殻表面は多糖類を主成分とする細胞外マトリックスで被われていることが知られている。そのため、融合タンパク質が被殻表面において細胞外マトリックスに埋没している可能性もある。
<Example 6: Confirmation of the state of display of the GFP fusion protein by the antibody binding test>
As a result of microscopic observation in Example 4, it was confirmed that the fusion protein was localized on the putamen surface. On the other hand, it is known that the diatom shell surface is covered with an extracellular matrix mainly composed of polysaccharides. Therefore, there is a possibility that the fusion protein is buried in the extracellular matrix on the surface of the putamen.
被殻表面タンパク質に凝集因子を融合発現し、その凝集因子の相互作用を介して細胞を回収するためには、凝集因子は細胞外マトリックスに埋没せず、露出した状態で提示されていることが望ましい。そこで、GFP融合タンパク質の被殻表面提示状態を確認するため、形質転換体細胞に対する抗体の結合試験を行った。 In order to fuse and express the aggregation factor to the putamen surface protein and collect the cells via the interaction of the aggregation factor, the aggregation factor must be presented in an exposed state without being embedded in the extracellular matrix. desirable. Therefore, in order to confirm the state of display of the GFP fusion protein on the putamen surface, an antibody binding test against transformant cells was performed.
融合タンパク質発現株、及び野生株それぞれ5.0×106細胞を含む培養液をとり、3,000 g, 20 ℃の条件で5分間遠心回収を行った。ペレットを50 μLのアルカリホスファターゼ標識抗GFP抗体（1 μg/mL）で懸濁し、30分間静置した。次いで50 μLのTris buffered saline with Tween20（TBS-T: 洗浄緩衝液）で3回洗浄した。その後、発光試薬としてLumi-Phosを50 μL添加し、5分後の発光強度をプレートリーダー SH-9000 (Corona electric)を用いて測定した。その結果、融合タンパク質発現株は野生株と比較し、顕著な発光強度を示した（図７）。このことから、被殻表面タンパク質に融合したGFPに対して添加した抗体が結合できること、すなわち、融合タンパク質が外部に露出した状態で提示されていることが確認された。 A culture solution containing 5.0 × 10 6 cells of each of the fusion protein expression strain and the wild strain was taken and centrifuged for 5 minutes under the conditions of 3,000 g and 20 ° C. The pellet was suspended in 50 μL of alkaline phosphatase-labeled anti-GFP antibody (1 μg / mL) and allowed to stand for 30 minutes. Subsequently, it was washed 3 times with 50 μL of Tris buffered saline with Tween 20 (TBS-T: washing buffer). Thereafter, 50 μL of Lumi-Phos was added as a luminescent reagent, and the luminescence intensity after 5 minutes was measured using a plate reader SH-9000 (Corona electric). As a result, the fusion protein expression strain showed remarkable luminescence intensity compared to the wild strain (FIG. 7). From this, it was confirmed that the antibody added to GFP fused to the putamen surface protein can be bound, that is, the fusion protein is presented in an exposed state.
＜実施例７：抗GFP抗体によるGFP融合タンパク質提示細胞の凝集誘導＞
被殻表面に提示された融合タンパク質を介して細胞凝集を誘導できるかを確認するため、Frustulin 1-GFP融合遺伝子発現株に対し抗GFP抗体を加え、細胞の凝集状態を観察した。Frustulin 1-GFP融合遺伝子発現株を5.0×106細胞含む培養液をとり、3,000 g, 20 ℃の条件で5分間遠心回収を行った。ペレットに対し、抗GFP抗体（1 μg/mL）を50 μL添加し、30分間静置した。その後、デジタルカメラ (Olympus DP-70) を搭載した顕微鏡 (Olympus BX51) を用いて観察した。その結果、細胞が凝集している様子が観察された（図８、Aは抗体を加えていない細胞、Bは抗体を加えた細胞を示す）。
<Example 7: Induction of aggregation of GFP fusion protein-presenting cells by anti-GFP antibody>
In order to confirm whether cell aggregation can be induced through the fusion protein presented on the putamen surface, an anti-GFP antibody was added to the Frustulin 1-GFP fusion gene expression strain, and the cell aggregation state was observed. A culture solution containing 5.0 × 10 6 cells of the Frustulin 1-GFP fusion gene expression strain was taken and centrifuged at 3,000 g and 20 ° C. for 5 minutes. To the pellet, 50 μL of anti-GFP antibody (1 μg / mL) was added and allowed to stand for 30 minutes. Thereafter, observation was performed using a microscope (Olympus BX51) equipped with a digital camera (Olympus DP-70). As a result, it was observed that the cells were aggregated (FIG. 8, A represents a cell to which no antibody was added, and B represents a cell to which the antibody was added).
本発明者により見出された被殻表面発現タンパク質と融合させることにより、任意のペプチドを被殻表面に発現させることができる。また、発現させた融合タンパク質の性質に基いて、珪藻類を凝集させ、効率的に回収することができる。珪藻類は、スクワレン及びトリグリセリド等の油脂、フコキサンチン及びエイコサペンタエン酸等の生理活性物質の有用物質を産生することが知られているため、本発明による珪藻類回収方法を用いることで、珪藻類による有用物質の産生の効率化に寄与できる。 Any peptide can be expressed on the surface of the putamen by fusing with the putamen surface expression protein found by the present inventors. Moreover, diatoms can be aggregated and efficiently recovered based on the properties of the expressed fusion protein. Diatoms are known to produce useful substances such as oils and fats such as squalene and triglycerides, bioactive substances such as fucoxanthin and eicosapentaenoic acid. Can contribute to the efficient production of useful substances.
Claims (19)
（i）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、及び配列番号１２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（ii）（i）に記載のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（iii）（i）に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチド。 A polypeptide selected from the group consisting of the following (i) to (iii):
(I) a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, and SEQ ID NO: 12,
(Ii) a polypeptide comprising an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence described in (i),
(Iii) A polypeptide comprising an amino acid sequence according to (i) wherein one or more amino acids are deleted, substituted, or added.
（i）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、及び配列番号１１からなる群より選択される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ii）（i）に記載の塩基配列と90%以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（iii）（i）に記載の塩基配列において、１若しくは複数個の塩基が欠失、置換、又は付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド、並びに
（iv）（i）に記載の塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド。 A polynucleotide selected from the group consisting of the following (i) to (iv):
(I) a polynucleotide comprising a base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, and SEQ ID NO: 11,
(Ii) a polynucleotide comprising a base sequence having 90% or more identity with the base sequence described in (i),
(Iii) a polynucleotide comprising a base sequence in which one or more bases have been deleted, substituted or added in the base sequence described in (i), and (iv) complementation of the base sequence described in (i) A polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to a strand.
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