JP2016021984A - 架橋ゼラチンスポンジ及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、細胞培養に適した形状・大きさの空孔が複数設けられ、各空孔が互いに連通されている架橋ゼラチンスポンジ及びその製造方法を提供することを課題とする。
【解決手段】ゼラチン基材に複数の空洞部が設けられた架橋ゼラチンスポンジであって、前記ゼラチン基材が、ゼラチンが分子架橋されてなり、前記空洞部が略球状であり、前記空洞部の径が２０μｍ以上１０００μｍ以下であり、前記空洞部が互いに連通されている架橋ゼラチンスポンジを用いることにより、前記課題を解決できる。
【選択図】図２１

Description

本発明は、架橋ゼラチンスポンジ及びその製造方法に関する。

病気や事故などの原因で、生体組織・臓器などが損傷、あるいは失われる場合がある。
そのような生体組織・臓器は多岐にわたり、例えば、皮膚、骨や軟骨、靭帯、筋肉、気管、食道、鼻、耳、血管、膵臓、肝臓等がある。

前記生体組織・臓器を修復、治療するために、従来、人工臓器や生体臓器の移植が行われてきた。
しかし、人工臓器では、（１）もとの臓器の機能をすべて代替すること困難を極めるという問題、（２）磨耗・緩み・破損が生じやすいという問題がある。
また、生体臓器移植の場合では、（１）ドナーの不足という問題、（２）免疫応答に基づく拒絶反応という問題、（３）免疫抑制に伴う感染症等の医学的リスク置いう問題がある。

そこで、現在、生体組織工学による生体組織・臓器の再生が注目されている。
生体組織工学では、例えば、（１）まず、生体より採取した細胞（生体細胞）を生体外で増殖させる、（２）次に、細胞の足場となる足場材料に、増殖させた生体細胞を播種する、（３）次に、生体外で培養して、生体組織を形成させる、（４）最後に、形成した生体組織を、生体内に移植するという工程により、生体組織・臓器の再生を行う。
また、上記工程において、（３）生体細胞を播種した足場材料を、生体内に埋め込む、（４）生体内で生体組織の再生を誘導する工程としてもよい。
生体組織工学による生体組織・臓器の再生手法では、ドナーを必要とせず、生体組織を形成でき、損傷等を修復、治療できるので、理想的とされている。

上記手法において、足場材料は非常に重要な役割を果たす。足場材料が、生体組織の形成を誘導、促進し、生体組織の形態を保持するためである。
一般に、足場材料として、多孔質材料が用いられる。この多孔質材料には、生体に影響を及ぼさない性質としての生体適合性や、新しい生体組織が形成するとともに分解・吸収される生体吸収性等が要求される。

多孔質材料としてゼラチンスポンジがある。ゼラチンスポンジの骨形成用移植体への応用に関する報告がある（特許文献１）。活性成分を含むゼラチンスポンジ、その調製及び使用の報告もある（特許文献２）。極めて柔軟であり、再生医療用基材として好適に用いることができるゼラチンスポンジの報告もある（特許文献３）。

ゼラチンは、コラーゲンと同様、細胞との親和性にすぐれている。そのため、ゼラチンの多孔質体であるゼラチンスポンジが、生体組織再生のための足場材料として検討されている。

ゼラチンは、体内に最も多く含まれるタンパク質であるコラーゲンを熱処理、抽出することによって得られる。
また、ゼラチン分子は荷電することから、反対の電荷をもつ分子と複合体を形成させることも可能である。

ゼラチンスポンジは、通常、ゼラチンの水溶液を凍結乾燥することによって得られる。 しかしながら、凍結乾燥によって得られるゼラチンスポンジは、空孔サイズが不均一であり、連通されていない孤立した空孔が形成された。このようなゼラチンスポンジを足場材として用いた場合には、細胞をスポンジ全体に行き渡らせ、スポンジ全体に均一分布するように培養することが困難であった。

国際公開第９６／１０４２６号 特表２０１１−５１３３８８号公報 特願２００４−２４２６３号公報

本発明は、均一に細胞培養可能な架橋ゼラチンスポンジ及びその製造方法を提供することを課題とする。

上記事情を鑑みて、試行錯誤することにより、本発明者は、（１）あらかじめ作製した氷の微粒子を造孔剤としてゼラチン溶液と混合し、凍結乾燥を行うことにより、細胞培養に適した形状・大きさの空孔を、互いに連通させて、複数設けることができること、（２）球状の空孔のサイズは氷微粒子のサイズによって制御可能であること、（３）連通した空孔のサイズはゼラチン溶液／氷微粒子混合物の凍結温度で制御可能なこと、（２）前記空孔構造は、培養細胞をスポンジ全体に均一に行き渡らせることが可能なことを見出して、本発明を完成した。
本発明は、以下の構成を有する。

（１） ゼラチン基材に複数の空洞部が設けられた架橋ゼラチンスポンジであって、前記ゼラチン基材が、ゼラチンが分子架橋されてなり、前記空洞部が略球状であり、前記空洞部の径が２０μｍ以上１０００μｍ以下であり、前記空洞部が互いに連通されていることを特徴とする架橋ゼラチンスポンジ。

（２） 前記空洞部が互いに隣接して連通されていることを特徴とする（１）に記載の架橋ゼラチンスポンジ。
（３） 前記空洞部が互いに連結孔で連通されていることを特徴とする（１）又は（２）に記載の架橋ゼラチンスポンジ。
（４） 前記連結孔の径が２０μｍ以上１０００μｍ以下であることを特徴とする（３）に記載の架橋ゼラチンスポンジ。

（５） 前記ゼラチン基材の形状が、シート状、板状、球状、柱状又は管状の群から選択されるいずれか一の形状であることを特徴とする（１）に記載の架橋ゼラチンスポンジ。
（６） 前記ゼラチンが、ブタ、ウシ、ニワトリ、魚骨、魚皮の群から選択されるいずれか一の素材に由来するゼラチンであることを特徴とする（１）に記載の架橋ゼラチンスポンジ。

（７） 氷微粒子を作製する工程と、ゼラチン溶液を作製する工程と、鋳型を作製する工程と、氷微粒子とゼラチン溶液とからなる混合物を鋳型に流し込み、ゼラチンスポンジを作製する工程と、ゼラチンスポンジを架橋して、架橋ゼラチンスポンジを作製する工程と、を有することを特徴とする架橋ゼラチンスポンジの製造方法。

（８） 氷微粒子を作製する工程が、純水を容器に満たした液体窒素中に噴霧して、氷粒子を作製する工程と、低温チャンバー（ −１５℃）に容器ごと移す工程と、容器内の液体窒素が蒸発するまで、容器を静置する工程と、大きな目開きの篩と小さな目開きの篩を用いて所定の径の氷を篩い分ける工程と、低温チャンバー内の温度を−５℃に変更する工程と、２時間静置する工程と、を有することを特徴とする（７）に記載の架橋ゼラチンスポンジの製造方法。

（９） 前記氷微粒子を、径が０．１μｍ以上２０００μｍ以下の略球状にして作製することを特徴とする（８）に記載の架橋ゼラチンスポンジの製造方法。
（１０） ゼラチン溶液を作製する工程が、ゼラチンに酢酸に加えて、ゼラチン溶液を調製する工程と、４５℃で２時間撹拌する工程と、室温で４時間撹拌する工程と、を有することを特徴とする（７）に記載の架橋ゼラチンスポンジの製造方法。

（１１） 前記ゼラチン溶液に、生体吸収性高分子、細胞成長因子、細胞分化制御因子又は低分子化合物の群から選択されるいずれか一又は二以上の材料を添加することを特徴とする（１０）に記載の架橋ゼラチンスポンジの製造方法。
（１２） 前記生体吸収性高分子がコラーゲン又はヒアルロン酸であり、前記細胞成長因子が上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）であり、前記細胞分化制御因子が骨形成因子（ＢＭＰ）であり、前記低分子化合物がデキサメタゾンであることを特徴とする（１０）に記載の架橋ゼラチンスポンジの製造方法。
（１３） 前記ゼラチン溶液のゼラチン濃度を０．００１（ｗ／ｖ）％以上３０（ｗ／ｖ）％以下とすることを特徴とする（１０）に記載の架橋ゼラチンスポンジの製造方法。

（１４） 鋳型を作製する工程が、温チャンバー（−５℃）内で、フィルム被覆銅板の上にシリコーンゴム枠を配置して、鋳型を作製する工程と、鋳型を３０分間静置する工程と、を有することを特徴とする（７）に記載の架橋ゼラチンスポンジの製造方法。

（１５） ゼラチンスポンジを作製する工程が、ゼラチン溶液をガラス瓶に移し、２０分間撹拌する工程と、ゼラチン溶液に氷微粒子加え、４分間ゆっくりかき混ぜて、ゼラチン溶液／氷微粒子の混合物を作製する工程と、鋳型のシリコーンゴム枠部分の内側に、混合物を流延する工程と、 混合物の表面をスパーテルでならしてから、−５℃で冷却したガラス板をかぶせる工程と、−８０℃のディープフリーザーに、混合物を鋳型ごと移し、１２時間静置して、凍結物を作製する工程と、凍結物からガラス板とフィルム被覆銅板を取り外す工程と、５Ｐａ以下の減圧下で４８時間凍結乾燥を行う工程と、を有することを特徴とする請求項７に記載の架橋ゼラチンスポンジの製造方法。

（１６） 前記ゼラチン溶液と前記氷微粒子の混合比を、ゼラチン溶液１ｍＬに対して氷微粒子は０．０１ｇ以上１０ｇ以下とすることを特徴とする（１５）に記載の架橋ゼラチンスポンジの製造方法。
（１７） 前記５Ｐａ以下の減圧下で４８時間凍結乾燥を行う工程での凍結温度が−０．１℃以下−１９６℃以上であることを特徴とする（１５）に記載の架橋ゼラチンスポンジの製造方法。

（１８） 架橋ゼラチンスポンジを作製する工程が、凍結乾燥させた凍結物を架橋反応させる工程と、洗浄する工程と、 凍結乾燥を行う工程と、を有することを特徴とする（７）に記載の架橋ゼラチンスポンジの製造方法。
（１９） 前記架橋反応が、カルボジイミド、アルデヒド類或いはエポキシ類を用いた化学架橋法又は紫外線、ガンマ線或いは熱による物理的架橋法のいずれかであることを特徴とする（１８）に記載の架橋ゼラチンスポンジの製造方法。

本発明の架橋ゼラチンスポンジは、ゼラチン基材に複数の空洞部が設けられた架橋ゼラチンスポンジであって、前記ゼラチン基材が、ゼラチンが分子架橋されてなり、前記空洞部が略球状であり、前記空洞部の径が２０μｍ以上１０００μｍ以下であり、前記空洞部が互いに連通されている構成なので、スポンジ全体で均一に細胞を培養できる。

本発明の架橋ゼラチンスポンジの製造方法は、氷微粒子を作製する工程と、ゼラチン溶液を作製する工程と、鋳型を作製する工程と、氷微粒子とゼラチン溶液とからなる混合物を鋳型に流し込み、ゼラチンスポンジを作製する工程と、ゼラチンスポンジを架橋して、架橋ゼラチンスポンジを作製する工程と、を有する構成なので、スポンジ全体で均一に細胞を培養可能な架橋ゼラチンスポンジを容易に製造できる。

図１は、本発明の実施形態である架橋ゼラチンスポンジの一例を示す図であって、斜視図（ａ）、Ａ部拡大図（ｂ）、Ｂ部拡大図（ｃ）である。 分子架橋の一例を示す概略図である。 本発明の実施形態である架橋ゼラチンスポンジの製造方法の一例を示すフローチャート図である。 氷微粒子作製工程のフローチャート図である。 氷微粒子作製工程図である。 ゼラチン溶液作製工程Ｓ２のフローチャート図である。 鋳型作製工程Ｓ３のフローチャート図である。 ゼラチンスポンジ作製工程Ｓ４のフローチャート図である。 ゼラチンスポンジ作製工程図である。 架橋ゼラチンスポンジ作製工程Ｓ５のフローチャート図である。 架橋反応工程Ｓ５１のフローチャート図である。 架橋ゼラチンスポンジ作製工程Ｓ５の一例を示す工程図である。 カルボジイミドを用いたゼラチン分子の架橋反応の一例を示す図である。 グルタルアルデヒドを用いたゼラチン分子の架橋反応の一例を示す図である。 １，４−ブタンジオールジグリシジルエーテルを用いたゼラチン分子の架橋反応の一例を示す図である。 洗浄工程Ｓ５２のフローチャート図である。 架橋ゼラチンスポンジ作製工程Ｓ５の一例を示す工程図である。 得られた架橋ゼラチンスポンジの走査電子顕微鏡写真である。 得られた架橋ゼラチンスポンジの走査電子顕微鏡写真である。 得られた架橋ゼラチンスポンジの走査電子顕微鏡写真である。 実施例１−２と、実施例３−１の架橋ゼラチンスポンジの走査電子顕微鏡写真である。 比較例のゼラチンスポンジの走査電子顕微鏡写真である。

（本発明の第１の実施形態）
（架橋ゼラチンスポンジ）
まず、本発明の第１の実施形態である架橋ゼラチンスポンジについて説明する。
図１は、本発明の実施形態である架橋ゼラチンスポンジの一例を示す図であって、斜視図（ａ）、Ａ部拡大図（ｂ）、Ｂ部拡大図（ｃ）である。
図１（ａ）に示すように、本発明の実施形態である架橋ゼラチンスポンジ１１は、略シート状である。しかし、この形状に限られるものではなく、前記ゼラチン基材の形状が、シート状、板状、球状、柱状又は管状の群から選択されるいずれか一の形状としてもよい。

架橋ゼラチンスポンジ１１には、複数の空洞部２１ｃが設けられている。これにより、多くの細胞を空洞部２１ｃ内で増殖させることができる。

図１（ｂ）に示すように、架橋ゼラチンスポンジ１１は、空洞部２１ｃが略球状であり、空洞部２１ｃの径が２０μｍ以上１０００μｍ以下とされている。この範囲とすることにより、細胞を空洞部２１ｃ内に侵入させて、安定保持でき、細胞の空間分布を均一にできる。空洞部２１ｃの径が２０μｍ未満の場合には細胞を侵入させることができない。逆に、１０００μｍ超の場合には、細胞の空間分布が不均一になる。

空洞部２１ｃは互いに連通されている。連通は、空洞部が互いに隣接して形成される連通部分２１ｆと、連結孔２１ｅとがある。これにより、細胞を空洞部から別の空洞部に行き渡らせることができる。

連結孔２１ｅの径も２０μｍ以上１０００μｍ以下であることが好ましい。この範囲とすることにより、細胞を連結孔２１ｅ内に侵入させて、安定保持でき、細胞の空間分布を均一にできる。連結孔２１ｅの径が２０μｍ未満の場合には細胞を侵入させることができない。逆に、１０００μｍ超の場合には、細胞の空間分布が不均一になる。

図１（ｃ）に示すように、ゼラチン基材２１は、ゼラチン３１が分子架橋３２されてなる。ネットワーク構造が形成されている。分子架橋により、ゼラチン基材２１は非水溶性とされている。

また、ゼラチン３１は、ブタ、ウシ、ニワトリ、魚骨、魚皮の群から選択されるいずれか一の素材に由来するゼラチンであることが好ましい。これにより、細胞培養に適したゼラチン基材とすることができる。

図２は、分子架橋の一例を示す概略図である。
図２（ａ）は、カルボジイミドを用いた化学架橋からなるアミド結合である。図２（ｂ）は、アルデヒド類を用いた化学架橋からなるシッフ塩基結合である。図２（ｃ）は、エポキシ類を用いた化学架橋からなるエポキシアミン結合である。

（架橋ゼラチンスポンジの製造方法）
まず、本発明の第１の実施形態である架橋ゼラチンスポンジの製造方法について説明する。
図３は、本発明の実施形態である架橋ゼラチンスポンジの製造方法の一例を示すフローチャート図である。
図３に示すように、本発明の実施形態である架橋ゼラチンスポンジの製造方法は、氷微粒子作製工程Ｓ１と、ゼラチン溶液作製工程Ｓ２と、鋳型作製工程Ｓ３と、ゼラチンスポンジを作製する工程Ｓ４と、架橋ゼラチンスポンジ作製工程Ｓ５と、を有する。
なお、氷微粒子作製工程Ｓ１と、ゼラチン溶液作製工程Ｓ２と、鋳型作製工程Ｓ３は、準備工程Ｓ０に属し、順番は考慮せず、いずれの工程を先に行ってもよいが、すべての工程を行うことを要する。

（氷微粒子作製工程Ｓ１）
図４は、氷微粒子作製工程のフローチャート図である。図５は、氷微粒子作製工程図である。
図４に示すように、氷微粒子を作製する工程Ｓ１は、氷粒子作製工程Ｓ１１と、容器移動工程Ｓ１２と、容器静置工程Ｓ１３と、氷篩い分け工程Ｓ１４と、温度変更工程Ｓ１５と、静置工程Ｓ１６と、を有する。

図５（ａ）に示すように、氷粒子作製工程Ｓ１１では、スプレイヘッド７１から容器に満たした液体窒素７２中に純水を噴霧して、氷粒子７３を作製する。
容器移動工程Ｓ１２では、低温チャンバー（ −１５℃）に容器ごと移す。
図５（ｂ）に示すように、容器静置工程Ｓ１３では、容器内の液体窒素が蒸発するまで、容器を静置する。

図５（ｃ）に示すように、氷篩い分け工程Ｓ１４では、大きな目開きの篩８１と小さな目開きの篩８２を用いて所定の径の氷を篩い分ける。
まず、大きな目開きの篩８１により、氷粒子７３を、第１濾過残留氷粒子７４と、第１濾過氷粒子７５に分ける。
次に、小さな目開きの篩８２により、第１濾過氷粒子７５を、第２濾過残留氷粒子７６と、第２濾過氷粒子７７に分ける。
これにより、第２濾過残留氷粒子７６の径を０．１μｍ〜２０００μｍとする。氷微粒子の径が空洞部の径となる。つまり、球状の空洞部の径は氷微粒子の径によって制御される。空洞部の径は小さすぎると細胞を侵入させることができない。大きすぎると細胞の空間分布が不均一になる。

図５（ｄ）に示すように、温度変更工程Ｓ１５では、低温チャンバー内の温度を−５℃に変更する。
図５（ｅ）に示すように、静置工程Ｓ１６では、２時間静置する。
最終的に、氷微粒子４５を、径が０．１μｍ以上２０００μｍ以下の略球状にして作製する。

（ゼラチン溶液作製工程Ｓ２）
図６は、ゼラチン溶液作製工程Ｓ２のフローチャート図である。
図６に示すように、ゼラチン溶液作製工程Ｓ２は、ゼラチン溶液調製工程Ｓ２２と、第１撹拌工程と、第２撹拌工程Ｓ２３と、を有する。

ゼラチン溶液調製工程Ｓ２２では、ゼラチンに酢酸に加えて、ゼラチン溶液を調製する。
例えば、前記酢酸が、１５（ｖ／ｖ）％以上３０（ｖ／ｖ）％以下の酢酸とする。ゼラチン溶液と氷微粒子の混合工程で凍結させないようにできる。
なお、ゼラチン溶液と氷微粒子の混合工程で凍結しなければ、濃度は限定されない。水と混和する溶媒であればほかの溶媒を使用することも可能である。

前記ゼラチン溶液に、生体吸収性高分子、細胞成長因子、細胞分化制御因子又は低分子化合物の群から選択されるいずれか一又は二以上の材料を添加してもよい。
前記生体吸収性高分子としてコラーゲン又はヒアルロン酸、前記細胞成長因子として上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、前記細胞分化制御因子として骨形成因子（ＢＭＰ）、前記低分子化合物としてデキサメタゾンを挙げられる。

前記ゼラチン溶液のゼラチン濃度を０．００１（ｗ／ｖ）％以上３０（ｗ／ｖ）％以下とすることが好ましく、０．５（ｗ／ｖ）％から１０（ｗ／ｖ）％とすることがより好ましい。スポンジの形状を保ち、気孔率を高く維持できる。ゼラチン濃度を０．００１（ｗ／ｖ）％未満とすると、スポンジの形状を保つのは困難となる。逆に、ゼラチン濃度を３０（ｗ／ｖ）％超とすると、気孔率が低下する。

第１撹拌工程Ｓ２２では、４５℃で２時間撹拌する。
第２撹拌工程Ｓ２３では、室温で４時間撹拌する。

（鋳型作製工程Ｓ３）
図７は、鋳型作製工程Ｓ３のフローチャート図である。
図７に示すように、鋳型作製工程Ｓ３は、鋳型作製工程Ｓ３１と、鋳型静置工程Ｓ３２と、を有する。

鋳型作製工程Ｓ３１では、低温チャンバー（−５℃）内で、フィルム被覆銅板の上にシリコーンゴム枠を配置して、鋳型を作製する。
鋳型静置工程Ｓ３２では、鋳型を３０分間静置する。

（ゼラチンスポンジ作製工程Ｓ４）
図８は、ゼラチンスポンジ作製工程Ｓ４のフローチャート図である。図９は、ゼラチンスポンジ作製工程図である。
図８に示すように、ゼラチンスポンジ作製工程Ｓ４は、ゼラチン溶液撹拌工程Ｓ４１と、混合物作製工程Ｓ４２と、混合物流延工程Ｓ４３と、ガラス板かぶせ工程Ｓ４４と、凍結物作製工程Ｓ４５と、取り外し工程Ｓ４６と、凍結乾燥工程Ｓ４７と、を有する。

ゼラチン溶液撹拌工程Ｓ４１では、ゼラチン溶液をガラス瓶に移し、２０分間撹拌する。
混合物作製工程Ｓ４２では、ゼラチン溶液４４に氷微粒子４５を加え、４分間ゆっくりかき混ぜて、ゼラチン溶液／氷微粒子の混合物４６を作製する。
前記ゼラチン溶液と前記氷微粒子の混合比を、ゼラチン溶液１ｍＬに対して氷微粒子は０．０１ｇ以上１０ｇ以下とすることが好ましく、０．０１ｇ〜５ｇとすることがより好ましい。これにより、スポンジの力学強度を高くでき、気孔率も高くできる。氷微粒子の割合が高くなるほど気孔率は高くなるが、スポンジの力学強度は低下する。

図９（ａ）に示すように、混合物流延工程Ｓ４３では、鋳型（フィルム４２被覆銅板４１上のシリコーンゴム枠４３部分）の内側に、混合物４６を流延する。
図９（ｂ）に示すように、ガラス板かぶせ工程Ｓ４４では、混合物４６の表面をスパーテルでならしてから、−５℃で冷却したガラス板４７をかぶせる。
図９（ｃ）に示すように、凍結物作製工程Ｓ４５では、−８０℃のディープフリーザーに、混合物４６を鋳型ごと移し、１２時間静置して、凍結物５１を作製する。
図９（ｄ）に示すように、取り外し工程Ｓ４６では、−８０℃のディープフリーザーから取り出し、凍結物５１からガラス板４７とフィルム４２被覆銅板４１を取り外す。
凍結物５１は、凍結ゼラチン５４に氷微粒子４５が埋め込まれている。

図９（ｅ）に示すように、凍結乾燥工程Ｓ４７では、室温、５Ｐａ以下の減圧下で４８時間凍結乾燥を行う。これにより、凍結乾燥物６１とする。
凍結乾燥物６１は、乾燥ゼラチン５５に空洞部６１ｃが形成されている。
凍結乾燥工程Ｓ４７での凍結温度が−０．１℃以下−１９６℃以上であることが好ましく、−５℃から−８０℃とすることがより好ましい。これにより、連通孔の径を所望の範囲とすることができる。温度が低くなるほど氷晶の成長速度は増加し、連通孔のサイズは小さくなる。
ゼラチンに他の種類の生体吸収性高分子や細胞成長因子、細胞分化制御因子等を添加する場合は、これらの添加物が変性しない温度範囲で凍結乾燥を行うことが好ましい。

（架橋ゼラチンスポンジ作製工程Ｓ５）
図１０は、架橋ゼラチンスポンジ作製工程Ｓ５のフローチャート図である。
図１０に示すように、架橋ゼラチンスポンジ作製工程Ｓ５は、架橋反応工程Ｓ５１と、洗浄工程Ｓ５２と、 凍結乾燥工程Ｓ５３と、を有する。
この工程では、ゼラチンスポンジを架橋して、架橋ゼラチンスポンジを作製する。

架橋反応工程Ｓ５１では、凍結乾燥物６１を架橋反応させる。
図１１は、架橋反応工程Ｓ５１のフローチャート図である。図１２は、架橋ゼラチンスポンジ作製工程Ｓ５の一例を示す工程図である。３段階の架橋反応工程図を示している。
図１１に示すように、架橋反応工程Ｓ５１は、エタノール水溶液調製工程Ｓ５１１と、ＭＥＳ溶液作製工程Ｓ５１２と、架橋反応溶液調製工程Ｓ５１３と、浸漬保持工程Ｓ５１４と、エタノール水溶液調製工程Ｓ５１５と、を有する。

エタノール水溶液調製工程Ｓ５１１では、エタノール濃度の低いエタノール水溶液を調製する。
ＭＥＳ溶液作製工程Ｓ５１２では、エタノール水溶液にＭＥＳを撹拌しながら加えて、ＭＥＳ溶液を作製する。
架橋反応溶液調製工程Ｓ５１３では、ＭＥＳ溶液に、ＥＤＣとＮＨＳを加えて、１０分間撹拌して、架橋反応溶液を調製する。
浸漬保持工程Ｓ５１４では、凍結乾燥させた凍結物を架橋反応溶液に浸漬し、室温で８時間保持する。 これにより、図１２に示す架橋反応第１段階が終了する。
乾燥ゼラチン５５は、第１段階の部分架橋された乾燥ゼラチン５６となる。

架橋反応が、カルボジイミド、アルデヒド類或いはエポキシ類を用いた化学架橋法又は紫外線、ガンマ線或いは熱による物理的架橋法のいずれかを挙げることができる。

図１３は、カルボジイミドを用いたゼラチン分子の架橋反応の一例を示す図である。
図１４は、グルタルアルデヒドを用いたゼラチン分子の架橋反応の一例を示す図である。
図１５は、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテルを用いたゼラチン分子の架橋反応の一例を示す図である。

エタノール水溶液調製工程Ｓ５１５では、エタノール濃度をより高くしたエタノール水溶液を調製する。 エタノール濃度は、その前段階で作ったものよりもわずかだけ濃くしてエタノール溶液を調製する。そして、ＭＥＳ溶液作製工程Ｓ５１２と、架橋反応溶液調製工程Ｓ５１３と、浸漬保持工程Ｓ５１４と、エタノール水溶液調製工程Ｓ５１５までを繰り返す。これにより、図１２に示す架橋反応第２段階が終了する。
第２段階の部分架橋された乾燥ゼラチン５７となる。

同様の操作を繰り返し、図１２に示す架橋反応第３段階が終了する。３段階の架橋反応の例では、このとき、エタノール濃度が所定の濃度となっているので、終了する。
わずかずつ架橋反応させることにより、ゼラチン分子をより均一に架橋することができる。
第３段階の部分架橋された乾燥ゼラチン５８となる。

洗浄工程Ｓ５２では、洗浄する。
図１６は、洗浄工程Ｓ５２のフローチャート図である。図１７は、架橋ゼラチンスポンジ作製工程Ｓ５の一例を示す工程図である。
洗浄工程Ｓ５２では、ゼラチンスポンジを室温で３０分間超純水に浸漬して洗浄する浸漬洗浄工程Ｓ５２１を行う。
これを繰り返し、所定の清浄回数となったときに終了する。例えば、１０回繰り返す。

凍結乾燥工程Ｓ５３では、凍結乾燥を行う。
以上により、本発明の実施形態である架橋ゼラチンスポンジ１１を製造できる。

本発明の実施形態である架橋ゼラチンスポンジ１１は、ゼラチン基材に複数の空洞部が設けられた架橋ゼラチンスポンジであって、前記ゼラチン基材が、ゼラチンが分子架橋されてなり、前記空洞部が略球状であり、前記空洞部の径が２０μｍ以上１０００μｍ以下であり、前記空洞部が互いに連通されている構成なので、スポンジ全体で均一に細胞を培養できる。ゼラチンは互いに分子架橋されているので、前記ゼラチン基材は非水溶性とされている。前記空洞部の径を２０μｍ〜１０００μｍとすることにより、細胞を空洞部内に侵入させて、安定保持でき、細胞の空間分布を均一にできる。

本発明の実施形態である架橋ゼラチンスポンジ１１は、前記空洞部が互いに隣接して連通されている構成なので、スポンジ全体で均一に細胞を培養できる。

本発明の実施形態である架橋ゼラチンスポンジ１１は、前記空洞部が互いに連結孔で連通されている構成なので、スポンジ全体で均一に細胞を培養できる。

本発明の実施形態である架橋ゼラチンスポンジ１１は、前記連結孔の径が２０μｍ以上１０００μｍ以下である構成なので、細胞を空洞部内に侵入させて、安定保持でき、細胞の空間分布を均一にできる。

本発明の実施形態である架橋ゼラチンスポンジ１１は、前記ゼラチン基材の形状が、シート状、板状、球状、柱状又は管状の群から選択されるいずれか一の形状である構成なので、再生したい組織の形状に応じて任意の形状とすることが可能であり、その形状のスポンジ全体で均一に細胞を培養できる。板状は膜厚の厚いブロック状を含む。

本発明の実施形態である架橋ゼラチンスポンジ１１は、前記ゼラチンが、ブタ、ウシ、ニワトリ、魚骨、魚皮の群から選択されるいずれか一の素材に由来するゼラチンである構成なので、細胞培養に適したゼラチン基材とすることができる。

本発明の実施形態である架橋ゼラチンスポンジ１１の製造方法は、氷微粒子を作製する工程と、ゼラチン溶液を作製する工程と、鋳型を作製する工程と、氷微粒子とゼラチン溶液とからなる混合物を鋳型に流し込み、ゼラチンスポンジを作製する工程と、ゼラチンスポンジを架橋して、架橋ゼラチンスポンジを作製する工程と、を有する構成なので、スポンジ全体で均一に細胞を培養可能な架橋ゼラチンスポンジを容易に製造できる。

本発明の実施形態である架橋ゼラチンスポンジ１１の製造方法は、氷微粒子を作製する工程が、純水を容器に満たした液体窒素中に噴霧して、氷粒子を作製する工程と、低温チャンバー（ −１５℃）に容器ごと移す工程と、容器内の液体窒素が蒸発するまで、容器を静置する工程と、大きな目開きの篩と小さな目開きの篩を用いて所定の径の氷を篩い分ける工程と、低温チャンバー内の温度を−５℃に変更する工程と、２時間静置する工程と、を有する構成なので、所望の氷微粒子を容易に製造できる。

本発明の実施形態である架橋ゼラチンスポンジ１１の製造方法は、前記氷微粒子を、径が０．１μｍ以上２０００μｍ以下の略球状にして作製する構成なので、これを造孔剤として利用して、ゼラチン基材に径が０．１μｍ以上２０００μｍ以下の空洞部を容易に形成できる。

本発明の実施形態である架橋ゼラチンスポンジ１１の製造方法は、ゼラチン溶液を作製する工程が、ゼラチンに酢酸に加えて、ゼラチン溶液を調製する工程と、４５℃で２時間撹拌する工程と、室温で４時間撹拌する工程と、を有する構成なので、均質なゼラチン基材を容易に製造できる。

本発明の実施形態である架橋ゼラチンスポンジ１１の製造方法は、前記ゼラチン溶液に、生体吸収性高分子、細胞成長因子、細胞分化制御因子又は低分子化合物の群から選択されるいずれか一又は二以上の材料を添加する構成なので、特殊な成分を添加させた架橋ゼラチンスポンジを容易に製造できる。

本発明の実施形態である架橋ゼラチンスポンジ１１の製造方法は、前記生体吸収性高分子がコラーゲン又はヒアルロン酸であり、前記細胞成長因子が上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）であり、前記細胞分化制御因子が骨形成因子（ＢＭＰ）であり、前記低分子化合物がデキサメタゾンである構成なので、特殊な成分を添加させた架橋ゼラチンスポンジを容易に製造できる。

本発明の実施形態である架橋ゼラチンスポンジ１１の製造方法は、前記ゼラチン溶液のゼラチン濃度を０．００１（ｗ／ｖ）％以上３０（ｗ／ｖ）％以下とする構成なので、気孔率を高く維持したまま、スポンジの形状を保つことができる。

本発明の実施形態である架橋ゼラチンスポンジ１１の製造方法は、鋳型を作製する工程が、温チャンバー（−５℃）内で、フィルム被覆銅板の上にシリコーンゴム枠を配置して、鋳型を作製する工程と、鋳型を３０分間静置する工程と、を有する構成なので、所望の形状の架橋ゼラチンスポンジを容易に製造できる。

本発明の実施形態である架橋ゼラチンスポンジ１１の製造方法は、ゼラチンスポンジを作製する工程が、ゼラチン溶液をガラス瓶に移し、２０分間撹拌する工程と、ゼラチン溶液に氷微粒子加え、４分間ゆっくりかき混ぜて、ゼラチン溶液／氷微粒子の混合物を作製する工程と、鋳型のシリコーンゴム枠部分の内側に、混合物を流延する工程と、 混合物の表面をスパーテルでならしてから、−５℃で冷却したガラス板をかぶせる工程と、−８０℃のディープフリーザーに、混合物を鋳型ごと移し、１２時間静置して、凍結物を作製する工程と、凍結物からガラス板とフィルム被覆銅板を取り外す工程と、５Ｐａ以下の減圧下で４８時間凍結乾燥を行う工程と、を有する構成なので、均質なゼラチンスポンジを容易に製造できる。

本発明の実施形態である架橋ゼラチンスポンジ１１の製造方法は、前記ゼラチン溶液と前記氷微粒子の混合比を、ゼラチン溶液１ｍＬに対して氷微粒子は０．０１ｇ以上１０ｇ以下とする構成なので、スポンジの力学強度を高くでき、気孔率も高くできる。

本発明の実施形態である架橋ゼラチンスポンジ１１の製造方法は、前記５Ｐａ以下の減圧下で４８時間凍結乾燥を行う工程での凍結温度が−０．１℃以下−１９６℃以上である構成なので、連通孔の径を所望の範囲とすることができる。

本発明の実施形態である架橋ゼラチンスポンジ１１の製造方法は、架橋ゼラチンスポンジを作製する工程が、凍結乾燥させた凍結物を架橋反応させる工程と、洗浄する工程と、凍結乾燥を行う工程と、を有する構成なので、均質な架橋ゼラチンスポンジを容易に製造できる。

本発明の実施形態である架橋ゼラチンスポンジ１１の製造方法は、前記架橋反応が、カルボジイミド、アルデヒド類或いはエポキシ類を用いた化学架橋法又は紫外線、ガンマ線或いは熱による物理的架橋法のいずれかである構成なので、高度にネットワーク化された架橋ゼラチンスポンジを容易に製造できる。

本発明の実施形態である架橋ゼラチンスポンジ及びその製造方法は、上記実施形態に限定されるものではなく、本発明の技術的思想の範囲内で、種々変更して実施することができる。本実施形態の具体例を以下の実施例で示す。しかし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

（実施例１−１）
（氷微粒子の作製）
以下のようにして、ゼラチン濃度２（ｗ／v）％の架橋ゼラチンスポンジを作製した。
まず、純水３００ｍＬを容器に満たした液体窒素１０Ｌ中に噴霧した。
次に、−１５℃に保った低温チャンバーに容器ごと移した。
次に、そのまま低温チャンバー内で２〜２．５時間静置した。これにより、液体窒素を蒸発させた。

次に、低温チャンバー内で５００μｍの目開きをもつ篩と４２５μｍの目開きをもつ篩を用いて大きさ４２５μｍ〜５００μｍの氷を篩い分けた。
次に、低温チャンバー内の温度を−５℃に変更し、２時間静置した。
以上の工程により、氷微粒子を作製した。

（ゼラチン溶液の作製）
まず、０．２ｇのブタ由来ゼラチンに３０（ｖ／ｗ）％酢酸に加えて、１０ｍＬの混合溶液を調製した。
次に、混合溶液を４５℃で２時間撹拌した。
次に、室温で４時間撹拌した。
以上の工程により、ゼラチン溶液を作製した。

（鋳型の準備）
まず、低温チャンバー（−５℃）内で、ポリフルオロアルコキシエチレン（ＰＦＡ）フィルムで被覆した銅板の上にシリコーンゴム枠（内寸は縦３６．５×横６６．５×厚み５ｍｍ）を配置して、鋳型を作製した。
次に、低温チャンバー（−５℃）内で、前記鋳型を３０分間静置した。
以上により、鋳型を準備した。

（ゼラチンスポンジの作製）
まず、低温チャンバー（−５℃）内で、ゼラチン溶液４．２ｍＬをガラス瓶に移し、２０分間撹拌した。
次に、低温チャンバー（−５℃）内で、ゼラチン溶液／氷微粒子３０／７０（ｖ／ｗ）となるよう、ゼラチン溶液に氷微粒子９．８ｇ加え、スパーテルで４分間ゆっくりかき混ぜて、ゼラチン溶液／氷微粒子の混合物を作製した。

次に、鋳型のシリコーンゴム枠部分の内側に、前記ゼラチン溶液／氷微粒子の混合物を流延した。
次に、余分なゼラチン溶液／氷微粒子混合物を取り除いた。
次に、混合物の表面をスパーテルでならした。
次に、その上から−５℃で冷却したガラス板をかぶせた。

次に、ゼラチンスポンジ鋳型ごと−８０℃のディープフリーザーに移し、１２時間静置した。
次に、凍結物からガラス板とＰＦＡフィルム被覆銅板を取り外した。
次に、室温、５Ｐａ以下の減圧下で４８時間凍結乾燥を行った。
以上の工程により、ゼラチンスポンジを作製した。

（架橋ゼラチンスポンジの作製）
次に、ゼラチンスポンジの架橋反応を３段階の工程に分けて行った。

（第１段階の架橋反応）
まず、エタノール／水（９５／５、ｖ／ｖ）３０ｍＬに０．０３ｇの２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ、終濃度０．１ｗｔ％）を撹拌しながら加えて、ＭＥＳ溶液を作製した。
次に、このＭＥＳ溶液に、０．２８８ｇの１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ、終濃度５０ｍＭ）と０．０６９ｇのＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ、終濃度２０ｍＭ）を加えて、１０分間撹拌して、架橋反応溶液を調製した。

次に、この架橋反応溶液に前記のゼラチンスポンジを室温で８時間浸漬した。
これにより、第１段階の架橋反応を行った。

（第２段階の架橋反応）
まず、エタノール／水（９０／１０、ｖ／ｖ）３０ｍＬに０．０３ｇのＭＥＳを撹拌しながら加えて、第１段階で用いたＭＥＳ溶液とは濃度の異なるＭＥＳ溶液を作製した。
次に、このＭＥＳ溶液に０．２８８ｇのＥＤＣと０．０６９ｇのＮＨＳを加えて、１０分間撹拌して、架橋反応溶液を調製した。
次に、この架橋反応溶液に第１段階の架橋反応後のゼラチンスポンジを室温で８時間浸漬した。
これにより、第２段階の架橋反応を行った。

（第３段階の架橋反応）
まず、エタノール／水（８５／１５、ｖ／ｖ）３０ｍＬに０．０３ｇのＭＥＳを撹拌しながら加えて、第１段階及び第２段階で用いたＭＥＳ溶液とは濃度の異なるＭＥＳ溶液を作製した。
次に、このＭＥＳ溶液に０．２８８ｇのＥＤＣと０．０６９ｇのＮＨＳを加え１０分間撹拌して、架橋反応溶液を調製した。
次に、この架橋反応溶液に第２段階の架橋反応後のゼラチンスポンジを室温で８時間浸漬した。
これにより、第３段階の架橋反応を行った。

次に、最後の架橋反応後のゼラチンスポンジを室温で３０分間超純水に浸漬した（以下、これを１回の洗浄とする。）。
前記洗浄を全部で１０回繰り返した。
１０回の洗浄後、５Ｐａ以下の減圧下で４８時間凍結乾燥を行った。
以上の工程により、ゼラチン濃度２（ｗ／ｖ）％の架橋ゼラチンスポンジ（実施例１−１）を得た。

（実施例１−２）
ブタ由来ゼラチンの量を０．４ｇとした他は実施例１−１と同様にして、ゼラチン濃度４（ｗ／ｖ）％の架橋ゼラチンスポンジ（実施例１−２）
を作製した。

（実施例１−３）
ブタ由来ゼラチンの量を０．６ｇとした他は実施例１−１と同様にして、ゼラチン濃度６（ｗ／ｖ）％の架橋ゼラチンスポンジ（実施例１−３）
を作製した。

（実施例１−４）
ブタ由来ゼラチンの量を０．８ｇとした他は実施例１−１と同様にして、ゼラチン濃度８（ｗ／ｖ）％の架橋ゼラチンスポンジ（実施例１−４）
を作製した。

（電子顕微鏡観察）
得られた架橋ゼラチンスポンジのＳＥＭ観察を行った。
図１８は、得られた架橋ゼラチンスポンジの走査電子顕微鏡写真である。
２、４、６、８（ｗ／ｖ）％の濃度で作製した各ゼラチンスポンジはいずれも、複数の球状の空孔と、それらを互いに連通する空隙からなる多孔質構造を有していた。
球状の空孔の大きさは、氷微粒子のサイズを反映していた。

（実施例２−１）
ゼラチン溶液と氷微粒子の混合比を、ゼラチン溶液／氷微粒子２０／８０（ｖ／ｗ）となるように変えた他は実施例１−２と同様にして、架橋ゼラチンスポンジ（実施例２−１）
を作製した。

（実施例２−２）
ゼラチン溶液と氷微粒子の混合比を、ゼラチン溶液／氷微粒子２５／７５（ｖ／ｗ）となるように変えた他は実施例１−２と同様にして、架橋ゼラチンスポンジ（実施例２−２）
を作製した。

（実施例２−３）
ゼラチン溶液と氷微粒子の混合比を、ゼラチン溶液／氷微粒子４０／６０（ｖ／ｗ）となるように変えた他は実施例１−２と同様にして、架橋ゼラチンスポンジ（実施例２−３）
を作製した。

（実施例２−４）
ゼラチン溶液と氷微粒子の混合比を、ゼラチン溶液／氷微粒子５０／５０（ｖ／ｗ）となるように変えた他は実施例１−２と同様にして、架橋ゼラチンスポンジ（実施例２−４）
を作製した。
表１は、ゼラチン溶液と氷微粒子の混合比の条件をまとめたものである。

低温でのゼラチン溶液と氷微粒子の均一な混合。
球状の空孔が均一に分布したゼラチンスポンジを作製するためには、ゼラチン溶液と氷微粒子を均一に混合する必要がある。氷微粒子が融解しない温度で混合工程を行う必要があるが、一般にゼラチンは低温にすればするほどゲル化しやすくなるため、均一に混合することは困難である。そこで、酢酸を含有したゼラチン水溶液を用いることにより、ゼラチンのゲル化を防ぐことができ、ゾル状態のゼラチンと氷微粒子を均一に混合することができた。

（電子顕微鏡観察）
得られた架橋ゼラチンスポンジのＳＥＭ観察を行った。
図１９は、得られた架橋ゼラチンスポンジの走査電子顕微鏡写真である。
ゼラチン溶液と氷微粒子の混合比（ゼラチン溶液の体積／氷微粒子の重量）２０／８０、２５／７５、４０／６０、および５０／５０で作製した各ゼラチンスポンジは、氷微粒子のサイズを反映した球状の空孔構造と、球状の空孔を連通する空隙からなる多孔質構造を有していた。

（実施例３−１）
凍結温度を−８０℃に変え、１５（ｖ／ｗ）％酢酸溶液を用いた他は実施例１−２と同様にして、架橋ゼラチンスポンジ（実施例３−１）を作製した。

（実施例３−２）
凍結温度を−３０℃に変え、１５（ｖ／ｗ）％酢酸溶液を用いた他は実施例１−２と同様にして、架橋ゼラチンスポンジ（実施例３−２）を作製した。

（実施例３−３）
凍結温度を−２０℃に変え、１５（ｖ／ｗ）％酢酸溶液を用いた他は実施例１−２と同様にして、架橋ゼラチンスポンジ（実施例３−３）を作製した。

（電子顕微鏡観察）
得られた架橋ゼラチンスポンジのＳＥＭ観察を行った。
図２０は、得られた架橋ゼラチンスポンジの走査電子顕微鏡写真である。
−８０〜−２０℃の凍結温度で作製した各ゼラチンスポンジは、氷微粒子のサイズを反映した球状の空孔構造と、球状の空孔を連通する空隙からなる多孔質構造を有していた。

（電子顕微鏡観察：溶媒依存性）
実施例１−２と、実施例３−１について、新たな試料を作製して、顕微鏡観察することにより、溶媒依存性の効果の検討を行った。
図２１は、実施例１−２と、実施例３−１の架橋ゼラチンスポンジの走査電子顕微鏡写真である。
ゼラチン溶液の溶媒を変えて作製した各ゼラチンスポンジは、氷微粒子のサイズを反映した球状の空孔構造と、球状の空孔を連通する空隙からなる多孔質構造を有した。
表２に、各実施例の作製条件をまとめた。

（比較例１）
氷微粒子を用いなかった他は実施例１−１と同様にして、ゼラチン濃度４（ｗ／ｖ）％の架橋ゼラチンスポンジ（比較例１）を作製した。
得られた架橋ゼラチンスポンジのＳＥＭ観察を行った。
図２２は、比較例のゼラチンスポンジの走査電子顕微鏡写真である。
Ｌｅａｆ−ｌｉｋｅ構造とよばれる空孔壁が一方向に重なった空孔構造が形成されていた。各空洞部は孤立して形成され、連通されておらず、細胞を均一分散させることはできなかった。

本発明の架橋ゼラチンスポンジ及びその製造方法は、細胞培養に適した形状・大きさの空孔が複数設けられ、各空孔が互いに連通されているので、細胞培養の足場材料として効率よく利用でき、細胞培養を容易にかつ均一に行うことができ、生体組織産業、再生医療部材産業等において利用可能性がある。

１１…架橋ゼラチンスポンジ、２１…ゼラチン基材、２１ｃ…空洞部、２１ｅ…連通孔、２１ｆ…連通部分、３１…ゼラチン、３２…分子架橋、４１…銅板、４２…フィルム、４３…シリコーンゴム枠、４４…溶媒、４５…氷微粒子、４６…混合物、４７…ガラス板、５１…凍結物、５４…凍結ゼラチン、５５…乾燥ゼラチン、５６…第１段階の部分架橋された乾燥ゼラチン、５７…第２段階の部分架橋された乾燥ゼラチン、５８…第３段階の部分架橋された乾燥ゼラチン、６１…凍結乾燥ゼラチンスポンジ、６１ｃ…空洞部、７１…スプレイヘッド、７２…液体窒素、７３…氷粒子、７４…第１濾過残留氷粒子、７５…第１濾過氷粒子、７６…第２濾過残留氷粒子、７７…第２濾過氷粒子、８１…大きな目開きの篩、８２…小さな目開きの篩。

Claims (19)

1. ゼラチン基材に複数の空洞部が設けられた架橋ゼラチンスポンジであって、
   前記ゼラチン基材が、ゼラチンが分子架橋されてなり、
   前記空洞部が略球状であり、
   前記空洞部の径が２０μｍ以上１０００μｍ以下であり、
   前記空洞部が互いに連通されていることを特徴とする架橋ゼラチンスポンジ。
2. 前記空洞部が互いに隣接して連通されていることを特徴とする請求項１に記載の架橋ゼラチンスポンジ。
3. 前記空洞部が互いに連結孔で連通されていることを特徴とする請求項１又は２に記載の架橋ゼラチンスポンジ。
4. 前記連結孔の径が２０μｍ以上１０００μｍ以下であることを特徴とする請求項３に記載の架橋ゼラチンスポンジ。
5. 前記ゼラチン基材の形状が、シート状、板状、球状、柱状又は管状の群から選択されるいずれか一の形状であることを特徴とする請求項１に記載の架橋ゼラチンスポンジ。
6. 前記ゼラチンが、ブタ、ウシ、ニワトリ、魚骨、魚皮の群から選択されるいずれか一の素材に由来するゼラチンであることを特徴とする請求項１に記載の架橋ゼラチンスポンジ。
7. 氷微粒子を作製する工程と、ゼラチン溶液を作製する工程と、鋳型を作製する工程と、氷微粒子とゼラチン溶液とからなる混合物を鋳型に流し込み、ゼラチンスポンジを作製する工程と、ゼラチンスポンジを架橋して、架橋ゼラチンスポンジを作製する工程と、を有することを特徴とする架橋ゼラチンスポンジの製造方法。
8. 氷微粒子を作製する工程が、純水を容器に満たした液体窒素中に噴霧して、氷粒子を作製する工程と、 低温チャンバー（ −１５℃）に容器ごと移す工程と、容器内の液体窒素が蒸発するまで、容器を静置する工程と、大きな目開きの篩と小さな目開きの篩を用いて所定の径の氷を篩い分ける工程と、低温チャンバー内の温度を−５℃に変更する工程と、２時間静置する工程と、を有することを特徴とする請求項７に記載の架橋ゼラチンスポンジの製造方法。
9. 前記氷微粒子を、径が０．１μｍ以上２０００μｍ以下の略球状にして作製することを特徴とする請求項８に記載の架橋ゼラチンスポンジの製造方法。
10. ゼラチン溶液を作製する工程が、ゼラチンに酢酸に加えて、ゼラチン溶液を調製する工程と、４５℃で２時間撹拌する工程と、室温で４時間撹拌する工程と、を有することを特徴とする請求項７に記載の架橋ゼラチンスポンジの製造方法。
11. 前記ゼラチン溶液に、生体吸収性高分子、細胞成長因子、細胞分化制御因子又は低分子化合物の群から選択されるいずれか一又は二以上の材料を添加することを特徴とする請求項１０に記載の架橋ゼラチンスポンジの製造方法。
12. 前記生体吸収性高分子がコラーゲン又はヒアルロン酸であり、前記細胞成長因子が上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）であり、前記細胞分化制御因子が骨形成因子（ＢＭＰ）であり、前記低分子化合物がデキサメタゾンであることを特徴とする請求項１０に記載の架橋ゼラチンスポンジの製造方法。
13. 前記ゼラチン溶液のゼラチン濃度を０．００１（ｗ／ｖ）％以上３０（ｗ／ｖ）％以下とすることを特徴とする請求項１０に記載の架橋ゼラチンスポンジの製造方法。
14. 鋳型を作製する工程が、低温チャンバー（−５℃）内で、フィルム被覆銅板の上にシリコーンゴム枠を配置して、鋳型を作製する工程と、鋳型を３０分間静置する工程と、を有することを特徴とする請求項７に記載の架橋ゼラチンスポンジの製造方法。
15. ゼラチンスポンジを作製する工程が、ゼラチン溶液をガラス瓶に移し、２０分間撹拌する工程と、ゼラチン溶液に氷微粒子加え、４分間ゆっくりかき混ぜて、ゼラチン溶液／氷微粒子の混合物を作製する工程と、鋳型のシリコーンゴム枠部分の内側に、混合物を流延する工程と、 混合物の表面をスパーテルでならしてから、−５℃で冷却したガラス板をかぶせる工程と、−８０℃のディープフリーザーに、混合物を鋳型ごと移し、１２時間静置して、凍結物を作製する工程と、凍結物からガラス板とフィルム被覆銅板を取り外す工程と、５Ｐａ以下の減圧下で４８時間凍結乾燥を行う工程と、を有することを特徴とする請求項７に記載の架橋ゼラチンスポンジの製造方法。
16. 前記ゼラチン溶液と前記氷微粒子の混合比を、ゼラチン溶液１ｍＬに対して氷微粒子は０．０１ｇ以上１０ｇ以下とすることを特徴とする請求項１５に記載の架橋ゼラチンスポンジの製造方法。
17. 前記５Ｐａ以下の減圧下で４８時間凍結乾燥を行う工程での凍結温度が−０．１℃以下−１９６℃以上であることを特徴とする請求項１５に記載の架橋ゼラチンスポンジの製造方法。
18. 架橋ゼラチンスポンジを作製する工程が、凍結乾燥させた凍結物を架橋反応させる工程と、 洗浄する工程と、 凍結乾燥を行う工程と、を有することを特徴とする請求項７に記載の架橋ゼラチンスポンジの製造方法。
19. 前記架橋反応が、カルボジイミド、アルデヒド類或いはエポキシ類を用いた化学架橋法又は紫外線、ガンマ線或いは熱による物理的架橋法のいずれかであることを特徴とする請求項１８に記載の架橋ゼラチンスポンジの製造方法。