JP2016008270A - ナノ粒子及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】温度応答性のブロック共重合体を使用して多様なナノ粒子を形成する。
【解決手段】温度応答性のブロック共重合体と当該ブロック重合体の一つのブロックと同じ構造を有する温度応答性の共重合体の水溶液を昇温することで、コア部位に共重合体を取り込んだブロック重合体のナノ粒子が形成される。使用するブロック共重合体及び共重合体の構造やそれらを構成するユニットの繰り返し数、末端の官能基等の組み合わせを適宜選択することで、多様な特徴を有するナノ粒子を形成することができる。
【選択図】図１

Description

本発明はナノ粒子に関し、特に共重合体とブロック共重合体との混合と昇温によって自己組織化的に形成されるナノ粒子に関する。

いろいろなタイプの「スマートな」重合体ナノ粒子が広範な分野に適用されてきた（非特許文献１、２）。これらのナノ粒子は通常それぞれ実験室で作成され、それゆえ、これらの諸性質（モノマー、サイズ、構造、電荷、組成等）は独自なものであり、これにより開発の遅延が起こることが懸念される。特性が可変なナノ粒子を設計することは大きな課題であり、全世界に大きな貢献をもたらすであろう。

ナノ粒子の作成のために、リビングラジカル重合（controlled living radical polymerization、ＣＬＲＰ）及びクリック反応（click chemistry）の開発による多機能性ブロック共重合体が報告されている（非特許文献３〜６）。しかしながら、ブロック共重合体の刺激応答性の数には依然として制限があり、また重合後に刺激応答性を変更するのは通常困難である。この問題を解決するため、ナノ粒子を単純なブロック共重合体の混合物から自己組織化的に構築することが提案された（非特許文献７〜９）。自己組織化のきっかけとして、取り扱いを単純化するために（可逆性、特別な機器が不要、また化学薬品の添加不要）温度が使用された。温度応答性高分子は最もよく研究されている高分子のひとつであり、またたんぱく質複合体、薬物送達システム（ＤＤＳ）、細胞工学及びデバイスなどの広い範囲に応用されている（非特許文献１０〜１５）。溶液の温度を上昇させることにより、これらの温度応答性高分子はその物理化学的性質を可逆的に変化させることができる。この変化が起こる温度は下限臨界溶液温度（Lower Critical Solution Temperature、ＬＣＳＴ）として知られる。本願発明者は先に、２または３種類の温度応答性ブロック共重合体を使用してミセルのシェル（多機能シェル）を作成することを提案した。これらのブロック共重合体は共通のＬＣＳＴを有していて、ＬＣＳＴ以上ではナノ粒子の混合シェルを形成した。このシェルの性質はブロック共重合体の混合比によって正確に調節された（非特許文献９）。

しかしながら、一般的な両親媒性ブロック共重合体では、集合体を調製する為に、有機溶媒の添加や透析が必要となる。また集合体の高い分散安定性のため、回収に時間がかかる。本願発明者らは、先に温度応答性高分子を用い、有機溶媒を用いずに水中での昇温にて、多機能性シェルを作成することに成功した(非特許文献９)。またブロック共重合体は二段階の温度応答性を有する為、迅速な回収が可能となった。しかしながら、非特許文献９に示された方法では、集合体のコア部に対しての制御が不十分であった。従って、本発明の課題は、ブロック共重合体及び共重合体の混合物を用いることにより、集合体のコア部の機能性を制御することである。

本発明の一側面によれば温度応答性の共重合体と、複数のブロックから構成されるとともに、前記複数のブロック中の一つのブロックは前記共重合体と同じ構造を有する温度応答性のブロック共重合体とを含むナノ粒子が与えられる。
ここで、前記一つのブロックを構成する複数のユニットと前記共重合体を構成する複数のユニットとは同じであるが前記一つのブロック内での前記複数のユニットの各々の繰り返し数と前記共重合体内での前記複数のユニットの各々の繰り返し数とが同じであるか異なっていてよい。
また、前記ナノ粒子は前記ブロック共重合体の昇温されたことによって疎水化された部分と昇温されたことによって疎水化された前記共重合体とを含むコア部位と、それ以外のシェル部位とから構成されてよい。
また、前記コア部位中に含まれる前記疎水化された前記共重合体の重量は前記ナノ粒子を構成する前記ブロック共重合体の重量以下であってよい。
また、前記ブロック共重合体は２−（２−メトキシエトキシ）エチルメタクリレート（ＭＥＯ_２ＭＡと略記する）、オリゴ（エチレングリコール）メタクリレート（ＯＥＧＭＡと略記する）、６−アセチルチオヘキシルアクリレート（ＡＴＡと略記する）及び２−（ジイソプロピルアミノ）エチルメタクリレート（ＤＰと略記する）の４種類のモノマーが重合したものであって、Ｐ（ＭＥＯ_２ＭＡ−ｃｏ−ＯＥＧＭＡ）なる構造を有する第１のブロック及びＰ（ＭＥＯ_２ＭＡ−ｃｏ−ＯＥＧＭＡ−ｃｏ−ＡＴＡ−ｃｏ−ＤＰ）なる構造を有する第２のブロックとを有するブロック共重合体Ｐ（ＭＥＯ_２ＭＡ−ｃｏ−ＯＥＧＭＡ）−ｂ−Ｐ（ＭＥＯ_２ＭＡ−ｃｏ−ＯＥＧＭＡ−ｃｏ−ＡＴＡ−ｃｏ−ＤＰ）であり、前記共重合体はＭＥＯ_２ＭＡ、ＯＥＧＭＡ、ＡＴＡ及びＤＰの４種類のモノマーが重合したものであって、前記第２のブロックと同じＰ（ＭＥＯ_２ＭＡ−ｃｏ−ＯＥＧＭＡ−ｃｏ−ＡＴＡ−ｃｏ−ＤＰ）なる構造を有する共重合体であり、前記モノマーが前記ユニットに対応するものであってよい。
また、前記ブロック共重合体の前記第１のブロック中のモノマーＭＥＯ_２ＭＡ及びＯＥＧＭＡの繰り返し数はそれぞれ４８及び２０であり、前記ブロック共重合体の前記第２のブロック中のモノマーＭＥＯ_２ＭＡ、ＯＥＧＭＡ、ＡＴＡ及びＤＰの繰り返し数はそれぞれ２５、４、３及び４であって前記ブロック共重合体はＰ（ＭＥＯ_２ＭＡ_４８−ｃｏ−ＯＥＧＭＡ_２０）−ｂ−Ｐ（ＭＥＯ_２ＭＡ_２５−ｃｏ−ＯＥＧＭＡ_４−ｃｏ−ＡＴＡ_３−ｃｏ−ＤＰ_４）と表され、前記共重合体中のモノマーＭＥＯ_２ＭＡ、ＯＥＧＭＡ、ＡＴＡ及びＤＰの繰り返し数はそれぞれ１７、２、３及び２であるか、またはそれぞれ３３、５、４及び５であって、前記共重合体はＰ（ＭＥＯ_２ＭＡ_１７−ｃｏ−ＯＥＧＭＡ_２−ｃｏ−ＡＴＡ_３−ｃｏ−ＤＰ_２）またはＰ（ＭＥＯ_２ＭＡ_３３−ｃｏ−ＯＥＧＭＡ_５−ｃｏ−ＡＴＡ_４−ｃｏ−ＤＰ_５）と表されるものであってよい。
また、前記ブロック共重合体の末端に官能基を有してよい。
また、前記官能基に他の物質を結合させてよい。
また、前記他の物質はタンパク質、核酸、酵素、低分子、無機粒子及び量子ドットからなる群から選択されてよい。
また、前記他の物質はナノ粒子表面に配列してよい。
また、水中で前記共重合体及び前記ブロック共重合体中の前記第２のブロックの下限臨界溶液温度よりも低温にすることによって前記共重合体と前記ブロック共重合体とに分解してよい。
また、前記下限臨界溶液温度以上に昇温することによって再度形成されてよい。
また、前記コア部位がゲル化しており、その内部に他の物質を内包させてよい。
また、前記他の物質は医薬、酵素、タンパク質、核酸、無機粒子からなる群から選択されてよい。
本発明の他の側面によれば、温度応答性の共重合体と、複数のブロックから構成されるとともに、前記複数のブロック中の一つのブロックは前記共重合体と同じ構造を有する温度応答性のブロック共重合体とを含む水溶液を前記共重合体及び前記ブロック共重合体の前記一つのブロックの下限臨界溶液温度以上に昇温するナノ粒子の製造方法。
ここで、上に示す方法により製造された第１のナノ粒子と、上に示す請求項１５の方法により製造され、前記第１のナノ粒子とは前記共重合体と前記ブロック共重合体との重量比が異なる第２のナノ粒子とを含む水溶液の温度を前記下限臨界溶液温度よりも低下させて、前記第１及び第２のナノ粒子を前記共重合体と前記ブロック共重合体とに分解し、前記分解後に前記水溶液の温度を前記下限臨界溶液温度以上に昇温させて前記重量比が前記第１及び第２のナノ粒子の何れとも異なる第３のナノ粒子を製造してよい。
また、前記水溶液は更に緩衝溶液を含んでよい。
また、前記ブロック共重合体の末端が官能基を有してよい。

本発明はブロック共重合体と共重合体とを混合して昇温することによってナノ粒子を作製することにより、ナノ粒子の粒径、コア部(ナノ粒子はコア部とシェル部から成る)の機能性の制御、ナノ粒子の表面の性質をコントロールすることができる。また、温度応答性高分子を用いているため、一度形成したナノ粒子を温度を下げることで溶解させ、温度を上げることで再びナノ粒子を構築させることができる。さらに、ここで使用するブロック共重合体は温度応答性であるＬＣＳＴを２つ有している（つまり、ブロック共重合体を構成する複数種類のブロックのＬＣＳＴは互いに異なっている）ので、集合体を迅速に回収することもできる。本願発明者等が先に非特許文献９で提案した多機能シェルと組み合わせれば、多様なニーズに対応してナノ粒子を調製することが可能となる。また、本発明のナノ粒子はそのコア部にナノ粒子の重量とほぼ同じ重量の疎水性の材料を取り込むことができるため、各種の物質のための効率の良いキャリアとしての応用も可能となる。

本発明の共重合体とブロック共重合体の集合による混合ナノ粒子の作製及びそのようにして作製された混合ナノ粒子の特徴を概念的に説明する図。 本発明の実施例で使用するブロック共重合体および共重合体の構造式を示す図。 温度制御された溶液により作製される混合ナノ粒子のためのＰ（ＭＥＯ_２ＭＡ−ｃｏ−ＯＥＧＭＡ−ｃｏ−ＡＴＡ−ｃｏ−ＤＰ）（４Ｃ）及びＰ（ＭＥＯ_２ＭＡ−ｃｏ−ＯＥＧＭＡ）−ｂ−Ｐ（ＭＥＯ_２ＭＡ−ｃｏ−ＯＥＧＭＡ−ｃｏ−ＡＴＡ−ｃｏ−ＤＰ）（２Ｃｂ４Ｃ）の構造を示す図。 （Ａ）４０℃のｐＨ７．４ＰＢＳに２Ｃｂ４Ｃ及び４Ｃ（短）を０．５ｗｔ％混合した溶液中の混合ナノ粒子の粒径／ＰＤＩと４Ｃ（短）の重量％との関係を示す図。（Ｂ）４０℃のｐＨ７．４ＰＢＳに２Ｃｂ４Ｃ及び４Ｃ（長）を０．５ｗｔ％混合した溶液中の混合ナノ粒子の粒径／ＰＤＩと４Ｃ（長）の重量％との関係を示す図。温度を１５℃から４０℃まで昇温した（１０分毎に５℃昇温）。 溶液の温度を制御することによる混合ナノ粒子の再構築を説明する図。二種類の互いに異なるサイズのナノ粒子（サイズ／ＰＤＩ／４Ｃ（長）量：７４±３０ｎｍ／０．１６／５０ｗｔ％及び３３±８ｎｍ／０．０８／０ｗｔ％）を４０℃で混合した。４Ｃ（長）の総量は１０ｗｔ％であった。 （Ａ）ｐＨ７．４ＰＢＳに２Ｃｂ４Ｃ及び４Ｃ（長）を０．５ｗｔ％混合した溶液について温度に対する透過率変化を示す図。（Ｂ）２Ｃｂ４ＣとＰ（ＭＥＯ_２ＭＡ_１９−ｃｏ−ＯＥＧＭＡ_２）とからなる混合ナノ粒子の４５℃におけるサイズ分布ヒストグラム（総濃度０．５ｗｔ％、混合比１：１）。（Ｃ）２Ｃｂ４Ｃと各種の組成、鎖長及びＬＣＳＴの共重合体との混合によるナノ粒子形成の可否を示す図表（○：作成できた、×：作成できなかった）。ここで、2Ｃｂ4Ｃと共重合体との混合はｐＨ７．４のＰＢＳで行い、混合比は１：１であった。 ブロック共重合体２Ｃｂ４Ｃからなるナノ粒子のＡＦＭ像。

本発明では、高分子ナノ粒子を構成する要素を二つに分けた。具体的には図１に示すように、共重合体（poly(A)）及びブロック共重合体（poly(A)-b-poly(B)）である。すなわち、共重合体（poly(A)）はブロック共重合体（poly(A)-b-poly(B)）を形成する複数のブロックのうちの一部のブロックと同じものを使用する（より正確には当該ブロックを構成する各ユニットの繰り返し数を除いては同じものを使用する。ユニット数に関しては一致しなくてもナノ粒子が形成される）。例えば図２にその構造を示すようなブロック共重合体および共重合体は、同温度（例えば３５℃付近）にて集合を開始するように設計され、混合ナノ粒子を調製することができる。この温度は、組成により容易に制御することができる。また、混合ナノ粒子の溶液の温度をこれらの重合体が集合を開始する温度よりも下げることで、混合ナノ粒子を構成していた共重合体とブロック共重合体との集合が解けて、溶解する。その後、新たにブロック共重合体を添加することで、粒径の異なる集合体、つまり混合ナノ粒子を図５に示すように再構築することができる。

ブロック共重合体の末端に例えばカルボキシル基を設けておけば、集合化の際には、その表面にこれらのカルボキシル基が配列する。カルボキシル基とアミン基の反応を利用すれば、分子や抗体等様々な材料とブロック共重合体を結合し、それらを混合ナノ粒子の表面に配置することができる。また、末端のカルボキシル基は、重合の際にＲＡＦＴ剤を選択する事で、ノニオン性のものや、クリック反応用に変換することも可能である。

ブロック共重合体および共重合体の混合により、本発明の混合ナノ粒子の粒径や機能性等を精密にデザインすることが可能である。混合ナノ粒子の各種のパラメータは例えば以下のようにして制御することができる。このように比較的簡単に各種パラメータの調節が可能であるため、本発明を利用して、いくつかのブロック共重合体と共重合体を組み合わせた薬品セットを広範なナノ粒子作製用の標準キットとして提供することもできる。

１．ブロック共重合体および共重合体の温度応答性について
本発明のナノ粒子の原料となる何れも温度応答性のブロック共重合体および共重合体はリビングラジカル重合により合成されるので、それらの鎖長、組成を正確に制御することができる。これにより、それぞれの高分子の構造や、温度応答性を自由に設計することが可能となる。

２．粒径の制御について
共重合体の混合により数ｎｍオーダーでの粒径の調整が可能であるが、もっと大きいオーダー（数十ｎｍ）については、ブロック共重合体の鎖長を調整することで実現される。これにより、本発明の混合ナノ粒子の粒径は数十ｎｍ〜数百ｎｍの範囲で設計が可能となる。

３．ブロック共重合体及び共重合体の構造／組成について
ｐＨ応答性や生分解性を共重合体へ組み込むことに成功したが、その他の刺激応答性（例えば、光応答性、分子応答性）を組み込むことで、非常に多様な複合ナノ粒子を作製できるようになる。これにより、これらのブロック共重合体及び共重合体を例えば上述したナノ粒子作成用のキットの選択肢として展開することが可能となる。

４．ブロック共重合体の末端について
本発明で使用するブロック共重合体はＲＡＦＴ（reversible addition-fragmentation chain transfer）重合により合成できるので、末端はＲＡＦＴ剤に起因する。現在、複数のＲＡＦＴ剤が購入可能であり、その末端はノニオン性、カチオン性、アニオン性、クリック反応基と様々である。これら市販のＲＡＦＴ剤を用いるか、またはＲＡＦＴ剤を合成するかにより、様々な種類の末端を持つブロック共重合体を合成し、上述したキットに含まれる材料の選択肢として提供することができる。

５．ブロック共重合体の末端の反応性について
上記の様に、様々な末端をブロック共重合体に配置することができるため、本発明の混合ナノ粒子を各種の分子やタンパク質、核酸等と結合させることができる。また、これらの結合した材料は、混合ナノ粒子の表面に配列する。

６．混合集合体のコア部位の多様性について
本発明の混合ナノ粒子のコア部位はゲル化させることもできるため、その内部に薬物、酵素、タンパク質、核酸、無機粒子等を内包させることができる。このゲル化は、例えば共重合しているＡＴＡを脱保護し、露出したチオール(−ＳＨ)同士の架橋を利用して行う。また、ゲル化のための架橋密度や架橋量の調節により、内包量等を制御することができる。混合する材料の応答温度さえ近似していれば、異なる構造を有するブロック共重合体および共重合体でも、同一の粒子に組み込むことが可能となる。

以下では、本発明を実施例に基づいてより詳細に説明する。

本願では図３に示される共重合体及びブロック共重合体からなるナノ粒子の混合コアに着目した。ここで、コア部とは昇温により疎水化した部位のことである。このブロック共重合体は同じ重量の疎水性の共重合体（つまり、同じく昇温によって疎水化した共重合体）をコア部に取り込むことが可能であることが見出された。また、混合ナノ粒子の平均粒径はその混合比により５ｎｍの範囲内に正確に制御できた（混合比範囲：１０〜５０ｗｔ％；ここで［混合比］＝［共重合体重量］／（［共重合体重量］＋［ブロック共重合体重量］）。このナノ粒子の構造は溶液の温度を制御することによって再構築することが可能であって、当該微細構造は混合された共重合体の分子量及びＬＣＳＴに強く影響されることも見出された。この理解を用いて、混合される共重合体及びブロック共重合体を選択することによってこのナノ粒子を正確かつ簡単に設計することができる。ナノ粒子を設計後、共重合体をＬＣＳＴ未満の温度で水媒体に溶解させ、ＬＣＳＴよりも高い温度にすることで、目的のナノ粒子が構築される。調節できる特性は、粒径、刺激応答性の数や種類、表面特性、架橋構造の形成制御、及び様々な材料のカプセル化に及ぶ。

図３は共重合体（４Ｃ及び２Ｃｂ４Ｃ）のそれぞれの構造を示す。モノマーとして２−（２−メトキシエトキシ）エチルメタクリレート（2-(2-methoxyethoxy)ethyl methacrylate、ＭＥＯ_２ＭＡ）／オリゴ（エチレングリコール）メタクリレート（oligo(ethylene glycol) methacrylate、ＯＥＧＭＡ）、６−アセチルチオヘキシルアクリレート（6-acetylthiohexyl acrylate、ＡＴＡ）及び２−（ジイソプロピルアミノ）エチルメタクリレート（2-(Diisopropylamino)ethyl methacrylate、ＤＰ）を選択して、温度、生分解性及びｐＨへの応答性をそれぞれ制御した（ここで先頭の２つのモノマー、ＭＥＯ_２ＭＡとＯＥＧＭＡ、の間の区切子が「／」になっているのは、ＭＥＯ_２ＭＡとＯＥＧＭＡの２つによって温度応答性の制御を行っていて、これら２つの組み合わせの意味が他とは異なることを表すためである）。Ｐ（ＭＥＯ_２ＭＡ−ｃｏ−ＯＥＧＭＡ）及びＰ（ＭＥＯ_２ＭＡ−ｃｏ−ＯＥＧＭＡ−ｃｏ−ＡＴＡ−ｃｏ−ＤＰ）のＬＣＳＴをそれぞれ６０℃及び３５℃に調節した。これらのＬＣＳＴ間の関係との二元共重合体Ｐ（ＭＥＯ_２ＭＡ−ｃｏ−Ｘ）の中のＸの量（具体的にはＸのｍｏｌ％。別の形で表現すればＸのユニット数）との組合せを使用することによって、複雑な組成（例えば、四元共重合体）の場合であってもＬＣＳＴを予測することが可能であった。４Ｃ及び２Ｃｂ４Ｃの特性の設計のため、各種の溶液（ｍｉｌｌｉＱ、ｐＨ７．４のＰＢＳ及びｐＨ５．５の緩衝溶液）中で、Ｐ（ＭＥＯ２ＭＡ−ｃｏ−Ｘ）（ここでＸ＝ＯＥＧＭＡ，ＡＴＡ及びＤＰ）のＬＣＳＴを測定した。

チオール（ＳＨ）基同士による架橋(−Ｓ−Ｓ−)は、細胞中では還元性の環境のために壊すことが可能であるので（非特許文献１６）、薬物キャリアとして使用されている。しかしながら、チオール基はラジカル・スカベンジャーとして機能するので、チオール基を有するモノマーをラジカル重合で直接重合することは困難である。そこで、チオール基を保護するとともに重合後は簡単に脱保護できることから（非特許文献１７）、ＡＴＡモノマーが選択された。実際、Ｐ（ＭＥＯ_２ＭＡ−ｃｏ−ＡＴＡ）中のＡＴＡの脱保護の効率は、還元剤の濃度及び反応時間により、３６．７％から６７．７％まで制御できる。生体材料中のｐＨ応答性重合体としてＤＰ（ｐＫ_ａ＝６．３）が適用されている。プロトンスポンジ効果（非特許文献１８）により、重合体のＤＰユニットのカチオン電荷からエンドソーム脱出（endosome escape）が引き起こされる。これらの生体適合性、生分解性及びエンドソーム脱出は、薬物のキャリアに必要とされる能力のひとつである。本発明によれば、共通のＬＣＳＴを有するブロック共重合体および共重合体を混合するだけでコアの機能性を簡単に設計することができる。

本発明で使用する共重合体の例として、四元共重合体Ｐ（ＭＥＯ_２ＭＡ−ｃｏ−ＯＥＧＭＡ−ｃｏ−ＡＴＡ−ｃｏ−ＤＰ）（４Ｃ）とブロック共重合体Ｐ（ＭＥＯ_２ＭＡ−ｃｏ−ＯＥＧＭＡ）−ｂ−Ｐ（ＭＥＯ_２ＭＡ−ｃｏ−ＯＥＧＭＡ−ｃｏ−ＡＴＡ−ｃｏ−ＤＰ）（２Ｃｂ４Ｃ）とを準備した。このブロック共重合体は同一の４Ｃブロックを共通の温度応答性ブロック（ＬＣＳＴ：ｐＨ７．４のＰＢＳ中で３５℃）（図３）として有している。２Ｃｂ４Ｃの方は、重合体鎖の端にカルボキシル基を有していて、これらのカルボキシル基は、自己組織化後はナノ粒子上に位置する。その位置は、溶液特性に強く影響し（非特許文献１９）、またカルボキシル基は、低分子、酵素、たんぱく質、核酸及び無機材料との反応サイトのために使用される。重要なことに、カルボキシル基はＲＡＦＴ剤に由来し、様々な官能基（非イオン性、スクシンイミド、アジド基等）を有するＲＡＦＴ剤が購入あるいは合成可能である。もちろん、反応点としてジチオエステルの末端基も使用することができる（非特許文献２０、２１）。

図４はＰＢＳ中における４０℃での２Ｃｂ４Ｃ並びに４Ｃ（短）あるいは４Ｃ（長）からなる混合ナノ粒子の粒径及びＰＤＩ（多分散度指数(polydispersity index)）を示す。２Ｃｂ４Ｃのナノ粒子の粒径は３３±８ｎｍであった（ＰＤＩ：０．０７９）（ＡＦＭから、２Ｃｂ４Ｃのナノ粒子は球状であることも確認された（図７）。一方、図４（Ａ）に示すように、４Ｃ（短）共重合体の混合量を増やしていくにつれて、混合ナノ粒子の粒径はＰＤＩが０．１未満と狭い分布のままで少し大きくなった。混合ナノ粒子（４Ｃ（短）の量が５０ｗｔ％）において、ブロック共重合体は、同程度の質量の共重合体を内包することができたことは注目すべきことであった。これは、２Ｃｂ４Ｃは、その４Ｃコア中に３４０％（［コア中に取り込まれた共重合体４Ｃの重量］／［コア中のブロック共重合体の４Ｃの部分の重量］×１００）もの重量の４Ｃ（短）を取り込むことができることを意味している。温度を２０℃から４０℃へ直接上げたときには、粒径と共重合体の内包量との関係は温度をゆっくり上げた場合と同様であった。この驚くほど高いカプセル化率及び安定性は表面上のカルボキシル基も関係していると考えられる。このカルボキシル基はＲＡＦＴ剤に由来し、その官能基は分子、ペプチド、抗体、タンパク質、核酸及び無機粒子のような材料との反応サイトとしても使用される。

混合ナノ粒子の粒径は４Ｃ（短）の混合比により５ｎｍの範囲に正確に制御された。混合量が７０ｗｔ％を上回ると、凝集または沈殿が観測された。また、ＦＲＥＴ（fluorescence resonance energy transfer、蛍光共鳴エネルギー移動）現象（非特許文献２２、２３）を用いることで、ナノ粒子の混合コアは共重合体（ピレン単位（pyrene unit）を有する）及びブロック共重合体（クマリン３４３単位を有する）からなることが示された。混合ナノ粒子が形成された後、高強度のＦＲＥＴが観察された。図４（Ｂ）は２Ｃｂ４Ｃと４Ｃ（長）との間の混合ナノ粒子の粒径を示す。粒径は、同量の４Ｃ（短）の場合と比べて僅かに大きくなった。興味深いことに、５０ｗｔ％の混合量でＰＤＩが０．１より大きくなり、粒径が大きく増加した。これらの結果は、分子量の小さな共重合体はブロック共重合体のコア中への混合に有利であることを示唆している。

以下の表１に、上で形成した混合ナノ粒子の成分（表１の上からそれぞれ２Ｃ、２Ｃｂ４Ｃ、４Ｃ（長）及び４Ｃ（短））の組成、分子量、分子量分布をまとめたものを示す。

温度応答性重合体であるために、混合ナノ粒子は溶液の温度を制御するだけで簡単に再構築できる。これに対して、通常の自己組織化ナノ粒子の再構築には、有機溶液を使用したり化学薬品を添加したりする必要がある。図５は異なるサイズを有するナノ粒子の混合物を示す（サイズ／ＰＤＩ／４Ｃ（長）量：図４（Ｂ）に示す７４±３０ｎｍ／０．１６／５０ｗｔ％、及び３３±８ｎｍ／０．０８／０ｗｔ％。なお、４Ｃ（長）量が０ｗｔ％の場合は２Ｃｂ４Ｃのみのナノ粒子となって図４（Ａ）と図４（Ｂ）とで同じものとなるので、図４（Ｂ）側では省略した）。混合物全体の４Ｃ（長）の合計量は、１０ｗｔ％である。最初、４０℃で両者を混合した直後は、二つのピークが観測された。ナノ粒子入り溶液の温度を４℃まで下げたところ、ピークは全く観察されなくなった。続いて、溶液の温度を４０℃まで上昇させることにより、狭いＰＤＩを有するナノ粒子（粒径３４±７ｎｍ、ＰＤＩ０．０７）が再構築されることが見出された。この観察されたサイズ及びＰＤＩは図４（Ｂ）に示す１０ｗｔ％の４Ｃ（長）を含む混合ナノ粒子のそれと一致した。

上述したナノ粒子の混合コアは４Ｃ及び同じ組成（つまりＭＥＯ_２ＭＡ、ＯＥＧＭＡ、ＡＴＡ及びＤＰ）の２Ｃｂ４Ｃからなっていた。その結果から、共重合体と別の組成及びＬＣＳＴを有するブロック共重合体とを混合できるか否かという問題が導かれる。非特許文献２４によれば、静電的相互作用によって形成されたポリイオンミセル（polyion complex micelle）は混合されたブロック共重合体の鎖長を認識できる。本願の場合、図４に示すように、鎖長だけではなくＬＣＳＴが、粒子構造にとって重要なファクターとなる。従って、別の鎖長及びＬＣＳＴを有するいくつかの種類の共重合体について、それらが本発明のナノ粒子を形成するのに適合するか否かを調べた。図６（Ａ）は各種の混合比で２Ｃｂ４Ｃと４Ｃ（長）とを混合したものの温度に対する透過率変化を示す。４Ｃ（長）による透過率の減少は、２Ｃｂ４Ｃ量を減少させるにつれて次第に強くなった。５２℃付近のもう一つの透過率の減少は２Ｃブロックの脱水によるものであった。２Ｃｂ４Ｃを混合することによる、共重合体４Ｃの脱水和に起因する透過度の減少が弱くなることは、形成された集合体による光の散乱が弱いことを意味し、ナノ粒子が形成されていることを示唆する。２Ｃｂ４Ｃの繰り返しユニット及びＬＣＳＴはそれぞれ６８／３６（ユニット）及び６０／３５（℃）であった。鎖長が長く（７０ユニット）かつ類似のＬＣＳＴ（３５℃）を有する共重合体は、２Ｃｂ４Ｃと混合したことで凝集及び沈殿を示した（混合比１：１）。興味深いことには、図６（Ｃ）に示すように、鎖長が短く（２１ユニット）かつＬＣＳＴが４２℃と高い共重合体は２Ｃｂ４Ｃと混合ナノ粒子を形成した（３５±７ｎｍ、ＰＤＩ０．０７８）。この共重合体と２Ｃｂ４Ｃ中の４Ｃブロックとの間にはＬＣＳＴに７℃の差がある。温度応答性重合体の脱水は連続的な挙動であり、ＬＣＳＴよりも低温でもナノスケールの脱水を示すことが知られている（非特許文献２５）。弱い相互作用及び短い鎖長によって高度な組織化構造がもたらされるかもしれない。２Ｃｂ４Ｃと４３℃付近のＬＣＳＴ及び長い鎖長（８６ユニット）を有する共重合体との混合物は溶液の温度を上げていくにつれて凝集／沈殿を示した。これらの結果から、ブロック共重合体はそれと混合される共重合体の鎖長及びＬＣＳＴを認識する可能性があることが示唆される（図５）。実際、互いのＬＣＳＴに７度の差があっても混合ナノ粒子を形成できる場合もある。混合ナノ粒子の形成にはＬＣＳＴと共重合体の鎖長が関係している。図６（C）からわかるように、同じＬＣＳＴを有しても、鎖長（共重合体の長さ）が長いと、うまく混合できなかった。その上、疎水性もまた高度なナノ粒子を形成するのに重要な役割を演じていると予想される。同じＬＣＳＴを有する共重合体同士はそれらの構造のために互いに異なる疎水性を有する（非特許文献２６、２７）。

結論として、別々の温度応答性共重合体及びブロック共重合体から構成された混合コアを有するナノ粒子を作製することができた。このブロック共重合体はそのＬＣＳＴ以上に昇温されることによって疎水化した共重合体をコア中に自重と同程度取り込むことができ、また混合ナノ粒子の粒径は混合される共重合体の比率により５ｎｍの範囲に正確に制御される。その組み立てられた構造は溶液の温度を制御することによって再構築することができ、また当該構造は混合される共重合体の鎖長及びＬＣＳＴにより強く影響されるものであった。

以上詳細に説明したように、本発明によれば、広い範囲の調節可能な特性を有する高分子ナノ粒子を簡単に作製することができ、またこれに限定する意図はないが、生体内部への薬剤送達等の生体関係の応用が大いに期待できる。

Cohen Stuart, M. A.; Huck, W. T. S.; Genzer, J.; Mueller, M.; Ober, C.; Stamm, M.; Sukhorukov, G. B.; Szleifer, I.; Tsukruk, V. V.; Urban, M.; Winnik, F.; Zauscher, S.; Luzinov, I.; Minko, S. Nat. Mater. 2010, 9, 101-113. Hoffman, A. S. Adv. Drug Deliver. Rev. 2013, 65, 10-16. Kamigaito, M.; Ando, T.; Sawamoto, M. Chem. Rev. 2001, 101, 3689-3745. Braunecker W. A.; Matyjaszewski, K. Prog. Polym. Sci. 2007, 32, 93-146. Moad, G.; Rizzardo, E.; Thang, S. H. Polymer 2008, 49, 1079-1131. Kolb, H. C.; Finn, M. G.; Sharpless, K. B. Angew. Chem. Int. Ed. 2001, 40, 2004-2021. Palyulin V. V.; Potemkin I. I. Macromolecules 2008, 41, 4459-4463. Kim, S. H.; Tan, J. P. K.; Nederberg, F.; Fukushima, K.; Yang, Y. Y.; Waymouth, R. M.; Hedrick J. L. Macromolecules 2009, 42, 25-29. Kotsuchibashi, Y.; Ebara, M.; Idota, N.; Narain, R.; Aoyagi, T. Polym. Chem. 2012, 3, 1150-1157. Wei, H.; Cheng, S.-X.; Zhang, X.-Z.; Zhuo, R.-X. Prog. Polym. Sci. 2009, 34, 893-910. Weber, C.; Hoogenboom, R.; Schubert, U. S. Prog. Polym. Sci. 2012, 37, 686-714. Stayton, P. S.; Shimoboji, T.; Long, C.; Chilkoti A.; Chen, G.; Harris, J. M.; Hoffman, A. S. Nature 1995, 30, 472-474. Mackenzie, K. J.; Francis, M. B. J. Am. Chem. Soc. 2013, 135, 293-300. Sekine, H.; Shimizu, T.; Sakaguchi, K.; Dobashi, I.; Wada, M.; Yamato, M.; Kobayashi, E.; Umezu, M.; Okano, T. Nat. Commun. 2013, 4, 1399. Okabe, K.; Inada, N.; Gota, C.; Harada, Y.; Funatsu, T.; Uchiyama, S. Nat. Commun. 2012, 3, 705. Miyata, K.; Kakizawa, Y.; Nishiyama, N.; Harada, A.; Yamasaki, Y.; Koyama, H.; Kataoka, K. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 2355-2361. Hrsic, E.; Zografou, I.; Schulte, B.; Pich, A.; Keul, H.; Moeller, M. Polymer, 2013, 54, 495-504. Yu, H.; Zou, Y.; Wang, Y.; Huang, X.; Huang, G.; Sumer, B. D.; Boothman, D. A.; Gao, J. ACS Nano 2011, 5, 9246-9255. Kotsuchibashi, Y.; Narain, R. Polym. Chem. 2014, 5, 3061-3070. Keddie, D. J.; Moad, G.; Rizzardo, E.; Thang, S. H. Macromolecules 2012, 45, 5321-5342. Willcock, H.; O'Reilly, R. K. Polym. Chem. 2010, 1, 149-157. Hong, S. W.; Kim, K. H.; Huh, J.; Ahn, C.-H.; Jo W. H. Chem. Mater. 2005, 17, 6213-6215. Li, C.; Liu, S. Chem. Commun. 2012, 48, 3262-3278. Harada, A.; Kataoka, K. Science 1999, 283, 65-67. Motokawa, R.; Morishita, K. Koizumi, S.; Nakahira, T.; Annaka, M. Macromolecules 2005, 38, 5748-5760. Lutz, J.-F.; Akdemir, Oe.; Hoth, A. J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 13046-13047. Sugihara, S.; Yamashita, K.; Matsuzuka, K.; Ikeda, I.; Maeda, Y. Macromolecules 2012, 45, 794-804.

Claims (18)

1. 温度応答性の共重合体と、
   複数のブロックから構成されるとともに、前記複数のブロック中の一つのブロックは前記共重合体と同じ構造を有する温度応答性のブロック共重合体と
   を含むナノ粒子。
2. 前記一つのブロックを構成する複数のユニットと前記共重合体を構成する複数のユニットとは同じであるが前記一つのブロック内での前記複数のユニットの各々の繰り返し数と前記共重合体内での前記複数のユニットの各々の繰り返し数とが同じであるか異なっている、請求項１に記載のナノ粒子。
3. 前記ナノ粒子は前記ブロック共重合体の昇温されたことによって疎水化された部分と昇温されたことによって疎水化された前記共重合体とを含むコア部位と、それ以外のシェル部位とから構成される、請求項１または２に記載のナノ粒子。
4. 前記コア部位中に含まれる前記疎水化された前記共重合体の重量は前記ナノ粒子を構成する前記ブロック共重合体の重量以下である、請求項３に記載のナノ粒子。
5. 前記ブロック共重合体は
   ２−（２−メトキシエトキシ）エチルメタクリレート（ＭＥＯ_２ＭＡと略記する）、オリゴ（エチレングリコール）メタクリレート（ＯＥＧＭＡと略記する）、６−アセチルチオヘキシルアクリレート（ＡＴＡと略記する）及び２−（ジイソプロピルアミノ）エチルメタクリレート（ＤＰと略記する）の４種類のモノマーが重合したものであって、
   Ｐ（ＭＥＯ_２ＭＡ−ｃｏ−ＯＥＧＭＡ）なる構造を有する第１のブロック及びＰ（ＭＥＯ_２ＭＡ−ｃｏ−ＯＥＧＭＡ−ｃｏ−ＡＴＡ−ｃｏ−ＤＰ）なる構造を有する第２のブロックとを有する
   ブロック共重合体Ｐ（ＭＥＯ_２ＭＡ−ｃｏ−ＯＥＧＭＡ）−ｂ−Ｐ（ＭＥＯ_２ＭＡ−ｃｏ−ＯＥＧＭＡ−ｃｏ−ＡＴＡ−ｃｏ−ＤＰ）であり、
   前記共重合体はＭＥＯ_２ＭＡ、ＯＥＧＭＡ、ＡＴＡ及びＤＰの４種類のモノマーが重合したものであって、前記第２のブロックと同じＰ（ＭＥＯ_２ＭＡ−ｃｏ−ＯＥＧＭＡ−ｃｏ−ＡＴＡ−ｃｏ−ＤＰ）なる構造を有する
   共重合体であり、
   前記モノマーが前記ユニットに対応する
   請求項１から４の何れかに記載のナノ粒子。
6. 前記ブロック共重合体の前記第１のブロック中のモノマーＭＥＯ_２ＭＡ及びＯＥＧＭＡの繰り返し数はそれぞれ４８及び２０であり、
   前記ブロック共重合体の前記第２のブロック中のモノマーＭＥＯ_２ＭＡ、ＯＥＧＭＡ、ＡＴＡ及びＤＰの繰り返し数はそれぞれ２５、４、３及び４であって
   前記ブロック共重合体はＰ（ＭＥＯ_２ＭＡ_４８−ｃｏ−ＯＥＧＭＡ_２０）−ｂ−Ｐ（ＭＥＯ_２ＭＡ_２５−ｃｏ−ＯＥＧＭＡ_４−ｃｏ−ＡＴＡ_３−ｃｏ−ＤＰ_４）と表され、
   前記共重合体中のモノマーＭＥＯ_２ＭＡ、ＯＥＧＭＡ、ＡＴＡ及びＤＰの繰り返し数はそれぞれ１７、２、３及び２であるか、またはそれぞれ３３、５、４及び５であって、
   前記共重合体はＰ（ＭＥＯ_２ＭＡ_１７−ｃｏ−ＯＥＧＭＡ_２−ｃｏ−ＡＴＡ_３−ｃｏ−ＤＰ_２）またはＰ（ＭＥＯ_２ＭＡ_３３−ｃｏ−ＯＥＧＭＡ_５−ｃｏ−ＡＴＡ_４−ｃｏ−ＤＰ_５）と表される
   請求項１から５の何れかに記載のナノ粒子。
7. 前記ブロック共重合体の末端に官能基を有する、請求項１から６の何れかに記載のナノ粒子。
8. 前記官能基に他の物質を結合させた、請求項７に記載のナノ粒子。
9. 前記他の物質はタンパク質、核酸、酵素、低分子、無機粒子及び量子ドットからなる群から選択される、請求項８に記載のナノ粒子。
10. 前記他の物質はナノ粒子表面に配列している、請求項８または９に記載のナノ粒子。
11. 水中で前記共重合体及び前記ブロック共重合体中の前記第２のブロックの下限臨界溶液温度よりも低温にすることによって前記共重合体と前記ブロック共重合体とに分解する、請求項１から１０の何れかに記載のナノ粒子。
12. 前記下限臨界溶液温度以上に昇温することによって再度形成される、請求項１１に記載のナノ粒子。
13. 前記コア部位がゲル化しており、その内部に他の物質を内包させた、請求項３または４に記載のナノ粒子。
14. 前記他の物質は医薬、酵素、タンパク質、核酸、無機粒子からなる群から選択される、請求項１３に記載のナノ粒子。
15. 温度応答性の共重合体と、
    複数のブロックから構成されるとともに、前記複数のブロック中の一つのブロックは前記共重合体と同じ構造を有する温度応答性のブロック共重合体と
    を含む水溶液を前記共重合体及び前記ブロック共重合体の前記一つのブロックの下限臨界溶液温度以上に昇温する
    ナノ粒子の製造方法。
16. 請求項１５の方法により製造された第１のナノ粒子と、
    請求項１５の方法により製造され、前記第１のナノ粒子とは前記共重合体と前記ブロック共重合体との重量比が異なる第２のナノ粒子と
    を含む水溶液の温度を前記下限臨界溶液温度よりも低下させて、前記第１及び第２のナノ粒子を前記共重合体と前記ブロック共重合体とに分解し、
    前記分解後に前記水溶液の温度を前記下限臨界溶液温度以上に昇温させて前記重量比が前記第１及び第２のナノ粒子の何れとも異なる第３のナノ粒子を製造する、
    ナノ粒子の製造方法。
17. 前記水溶液は更に緩衝溶液を含む、請求項１５または１６に記載のナノ粒子の製造方法。
18. 前記ブロック共重合体の末端が官能基を有する、請求項１５または１６に記載のナノ粒子の製造方法。