JP2015186480A - 化学療法、放射線療法、酸化ストレス、および加齢を防御するための食事組成物ならびに方法 - Google Patents

化学療法、放射線療法、酸化ストレス、および加齢を防御するための食事組成物ならびに方法 Download PDF

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Abstract

【課題】化学療法、放射線療法、酸化ストレス、および加齢を防御するための有用な新規食事組成物並びに方法の提示。【解決手段】単糖、二糖、及び多糖の置換物としてのグリセロールを含む食事組成物であって、化学療法又は酸化ストレスに暴露した動物又はヒトへの前記食事組成物の投与が前記化学療法若しくは酸化ストレスの前３−１０連日、前記化学療法若しくは酸化ストレスの後２４時間、又はそれらの組み合せで行われる食事組成物。当該食事組成物が前記化学療法又は酸化ストレスに対して前記動物又はヒトを防御するために用いられる食事組成物。０−０．２重量％のＬ−メチオニン、及び各々少なくとも０．０５重量％の量のＬ−トリプトファン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−スレオニン、並びにＬ−バリンを含み、タンパク質を含まない食事組成物。【選択図】なし

Description

［関連出願］
本出願は、２００７年３月２８日に出願された米国仮出願第６０／９０８，６３６号、および２００７年６月７日に出願された米国仮出願第６０／９４２，５６１号の優先権を主張する２００８年３月２８日に出願された米国特許出願第１２／０５８，６００号の一部継続出願である。本出願は、また、２００８年４月２４日に出願された米国仮出願第６１／０４７，６８０号の優先権を主張する。米国特許出願第１２／０５８，６００ならびに米国仮出願第６０／９０８，６３６号、第６０／９４２，５６１号、および第６１／０４７，６８０号の内容は、これらのすべての参照により本明細書中に組み入れられる。
［財政的支援］
本発明は、一部、米国国立衛生研究所の助成、ＡＧ２０６４２、ＡＧ０２５１３５、ＧＭ０７５３０８、および神経科学計画（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｂｌｕｅｐｒｉｎｔ）の支援を受けてなされたものである。したがって、米国政府は特定の権利を有する。
［技術分野］
本発明は、概して、疾患の治療に関する。より具体的には、本発明は、化学療法、放射線療法、酸化ストレスおよび加齢を防御するための食事組成物ならびに方法を提供する。
現代の化学療法は、癌関連症状の緩和によって癌患者の生活の質を改善することができ、多くの悪性腫瘍の生存も顕著に延長することができる。しかし、不可避の中毒性副作用により薬物投与の用量強度と投与頻度がしばしば制限される。例えば、ドキソルビシンまたはシスプラチンの使用は多くの悪性腫瘍を有効的に治療することができるが、薬物誘発性のそれぞれ心毒性と腎毒性によって薬物の全潜在能力は制限される。したがって、癌標的性を損なわずに正常細胞を選択的に防御し、望ましくない毒性を軽減することによって、化学慮法の有益性が立証され、そして臨床転帰を良くするであろう。
本発明は、化学療法、放射線療法、酸化ストレス、および加齢を防御するために有用な新規食事組成物ならびに方法に関する。
したがって、一つの形態では、本発明は、０−０．２重量％のＬ−メチオニン、およびそれぞれ少なくとも０．０５重量％の量のＬ−トリプトファン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−スレオニン、およびＬ−バリンを含み、タンパク質を含まない食事組成物を特徴とする。本組成物は、さらに、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グリシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−チロシン、Ｌ−アルギニン、およびＬ−ヒスチジンから成る群から選択される１つまたは複数のアミノ酸を含むことができる。
もうひとつの形態では、本発明は、０−０．２重量％のＬ−トリプトファン、および少なくともそれぞれ０．０５重量％の量のＬ−メチオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−バリンを含み、タンパク質を含まない食事組成物を特徴とする。本組成物は、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グリシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−チロシン、Ｌ−アルギニン、およびＬ−ヒスチジンからなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸をさらに含むことができる。
さらにもう一つの形態では、本発明は、それぞれ０−０．２重量％の量のＬ−メチオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−バリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グリシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−チロシン、Ｌ−アルギニン、およびＬ−ヒスチジンを含み、タンパク質を含まない食事組成物を特徴とする。
さらにもう一つの形態では、本発明は、単糖、二糖、および多糖の代替物としてグリセロールを含む食事組成物を特徴とする。
また、本発明の範囲には、化学療法、放射線療法、酸化ストレス、または加齢から動物またはヒトを防御する方法も含まれる。本発明の方法は、本発明の組成物を動物またはヒトに投与し、それによって、化学療法、放射線療法、酸化ストレス、または加齢から動物またはヒトを防御することを含む。本発明の方法は、さらに、動物またはヒトを化学療法、放射線療法、または酸化ストレスに暴露することを含むことができる。幾つかの実施態様では、本組成物は、暴露過程前に連日３−１０日間、暴露過程後２４時間、またはそれらの併用によって動物またはヒトに投与される。幾つかの実施態様では、本組成物は、加齢から動物またはヒトを防御するため、３回目の食事毎または３−１０日毎に投与される。
加えて、本発明は、８１３−９５７キロカロリー以下の総エネルギーを供給し、もし炭水化物が食材に存在する場合は該炭水化物の割合は該総エネルギーの半分以下であり、３０−３６グラム以下のタンパク質を含有する該食材を供給しながら、対象者に栄養を供給し得る該食材を含む低カロリー食事またはノンカロリー食事を特徴とする。幾つかの実施態様では、食材は総エネルギー７００キロカロリー以下を供給しうる食材である。
さらに、本発明は、１日に動物またはヒト体重当たり１１キロカロリー以下のエネルギー、および１日に該動物またはヒト体重当たり０．４グラム以下のタンパク質を供給し、食事中に炭水化物が存在する場合は、該炭水化物の割合は該総エネルギーの半分以下である該食事を供給しながら、栄養を供給しうる該食事を動物またはヒトに投与することによって、化学療法、放射線療法、酸化ストレス、または加齢から動物またはヒトを防御する方法を供給する。幾つかの実施態様では、食事は１日当たり総エネルギー７００キロカロリー以下を供給することができる。本方法は、さらに、動物またはヒトを化学療法、放射線療法、または酸化ストレスに暴露することを含むことができる。幾つかの実施態様では、食事を暴露過程前の３−１０日間、暴露過程を２４時間、またはそれらの併用によって動物またはヒトに投与する。幾つかの実施態様では、加齢から動物またはヒトを防御するために、食事を３食毎または３−１０日毎に投与する。
本発明は、さらに、化学療法から動物またはヒトを防御する方法を供給する。本方法は、１サイクルの化学療法の４８−１４０時間前、化学療法後４−５６時間、またはそれらの併用によって担癌動物または癌患者を絶食させ、該動物またはヒトを化学療法に暴露することを含む。幾つかの実施態様では、１サイクルの化学療法前後１８０時間以下の間、該動物またはヒトを絶食させる。
本発明における上述した特徴および本発明の他の特徴ならびに入手法とそれらの使用法は以下の記述と同時に付随する図面を参照することによってより明白となり、最上の理解が得られるであろう。本図面は、本発明の典型的な実施態様のみを描写するものであり、その範囲に限定されるものではない。
グラフ（Ａ）生存率％、（Ｂ）メチオニン食体重％、（Ｃ）メチオニン摂餌量、（Ｄ）治療後体重％、および（Ｅ）日付関数としての治療後の摂餌量。マウスはドキソルビシン治療前に低メチオニンアミノ酸混合物（ＬＭＡ１）で処理した。 グラフ（Ａ）生存率％、（Ｂ）治療後体重％、および（Ｃ）日付関数としてのトリプトファン食体重％。マウスはドキソルビシン治療前に低トリプトファンアミノ酸混合物（ＬＴＡ１）で処理した。 グラフ（Ａ）日付関数としての摂餌、（Ｂ）血液グルコース濃度、（Ｃ）時間関数としての生存率％、および（Ｄ）日付関数としての体重％。マウスはパラコート処理前にグリセロール食を与えた。 ストレス耐性と寿命の調節におけるＳｃｈ９，Ｔｏｒ１，およびＲａｓ２間の遺伝子相互作用。（Ａ−Ｄ）３日目の野生株（ＤＢＹ７４６）およびＴｏｒ１，Ｓｃｈ９またはＲａｓ２欠損細胞に熱ショック（５５℃：Ａ，１０５分；Ｂ，７５分；Ｃ，１５０分；およびＤ，１２０分）または酸化ストレス（１００ｍＭ過酸化水素６０分；または２５０μＭメナジオン３０分）を暴露させた。（Ｅ）１００万個細胞当たりｃａｎＲ変異株で測定した突然変異頻度の時間経過。４回の実験の平均を示す。エラーバーはＳＥＭを表す。（Ｆ）最少完全培地中（ＳＤＣ）の野生株（ＤＢＹ７４６）、ｔｏｒ１Δ、およびＳＣＨ９または構造的活性型Ｒａｓ２（ｒａｓ２Ｖａｌ１９）のいずれかを過剰発現する突然変異株の経時的生存率。（Ｇ）野生株（ＤＢＹ７４６）およびＴｏｒ１，Ｓｃｈ９，Ｒａｓ２またはこれらを同時に欠損する突然変異株の経時的生存率をグラフに示す。データは少なくとも４回の実験の平均を表す。エラーバーはＳＥＭを示す。非線形曲線適合により計算された平均寿命については表２を参照のこと。（Ｈ）酵母の長寿命調節経路。Ｓｃｈ９，Ｔｏｒ，およびＲａｓによって制御される栄養センサー経路はプロテインキナーゼＲｉｍ１５に収斂する。一方、ストレス応答性転写因子Ｍｓｎ２、Ｍｓｎ４，およびＧｉｓ１はストレス応答性遺伝子をトランス活性化し、寿命延長につながる細胞防御を増強する。ＣＲの前長寿命効果は部分的にＳｃｈ９，Ｔｏｒ，およびＲａｓによって介在され、多くはまだ確認されていないさらなる機序も必要とするかもしれない。 長寿命変異株の遺伝子発現特性。（Ａ）野生型細胞に比較して２．５日目におけるｔｏｒ１Δ，ｓｃｈ９Δ，およびｒａｓ２Δ変異株の２倍超上方制御または下方制御された遺伝子の数のベン図。マイクロアレイ解析を三重で実施した。データは上方／下方制御遺伝子を表す。（Ｂ）ｓｃｈ９Δバックグラウンドを持つ長寿命の変異株において最も上方制御された遺伝子の欠損変異体の寿命。各株につき独立して３回から４回の実験を実施した。データはペアを組み合わせてプールした実験の平均およびＳＥＭを表す。 （Ａ）グリセロール代謝の模式図。図示の目的のために、３種すべての長寿命変異体の中で野生株と比較して２０％超上方制御された遺伝子を赤く表示し、下方制御された遺伝子を緑色に表示した。（Ｂ）２．５日目の野生株（ＤＢＹ７４６）と比較したｓｃｈ９Δ，ｔｏｒ１Δ，およびｒａｓ２Δ変異株のグリセロール生合成遺伝の発現レベルを倍数変化で表す。（Ｃ）３日目の野生株（ＤＢＹ７４６）およびｓｃｈ９Δ細胞におけるＧＰＤ１ｍＲＮＡレベルのリアルタイム定量ＰＣＲ解析。データは、平均とＳＥＭ、ｎ＝４を表す。＊ｐ＜０．０５，ｔ検定、両側、ｓｃｈ９Δ ｖｓ．ＷＴ。 Ｓｃｈ９欠損変異株はエタノールを代謝し、グリセロールを蓄積する。（Ａ）１日目と３日目に野生株（ＤＢＹ７４６）とＳｃｈ９欠損細胞の細胞内グリセロール量を測定した。データは、解析した５培養の平均とＳＥＭを表す。（Ｂ）野生型およびｓｃｈ９Δ培養液中のグリセロール濃度。データは解析した５−７培養の平均およびＳＥＭを表す。＊＊ｐ＜０．０１、独立ｔ検定、両側、ｓｃｈ９Δ ｖｓ．ＷＴ。（Ｃ−Ｄ）野生型（Ｃ）およびｓｃｈ９Δ（Ｄ）培養液中のグリセルールおよびエタノール濃度。データは解析した３−５培養の平均とＳＥＭを表す。（Ｅ）１日目の野生型とｓｃｈ９Δ変異株の中性脂肪のナイルレッド染色。ナイルレッド染色は右側に、位相顕微鏡は左側に示す。バー、１０μｍ。 グリセロール生合成遺伝子の欠損は、Ｓｃｈ９の欠損に関連して寿命の伸長とストレス耐性を逆転させた。（Ａ）培養液中のグリセロール濃度。データは解析した４培養の平均とＳＥＭを表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、独立ｔ検定、両側、ｓｃｈ９Δ ｖｓ．ｒｈｒ２Δ ｓｃｈ９Δ。（Ｂ）野生型（ＤＢＹ７４６）、ｓｃｈ９Δ、ｒｈｒ２ΔおよびＲｈｒ２を欠損するＳｃｈ９欠損変異株の寿命。グリセロール（最終濃度１％）を培養１日目のｒｈｒ２Δ ｓｃｈ９Δ培養に添加した。データは解析した４−５培養の平均とＳＥＭを表す。（Ｃ）３日目の細胞を熱ショック（５５℃、１０５分）または過酸化水素（１５０ｍＭ，６０分）で暴露した。提示した細胞株は、野生型（ＤＢＹ７４６），ｒｈｒ２Δ、ｓｃｈ９Δ、ｒｈｒ２Δ ｓｃｈ９Δである。（Ｄ）野生型（ＢＹ４７４１）、ｓｃｈ９Δ、およびＧｐｄ１，Ｇｐｄ２，またはＲｈｒ２を欠損し、Ｓｃｈ９を欠損する変異株の寿命。データは３実験の平均とＳＥＭを表す。（Ｅ）グリセロール生合成遺伝子を欠損する培養３日目の変異株の熱ショック（５５℃）および酸化ストレス（５００ｍＭの過酸化水素、６０分）耐性。 グリセロールのストレス耐性と寿命に対する効果。（Ａ）細菌の熱感受性ルシフェラーゼを発現する３日目の野生型（ＤＢＹ７４６）とｓｃｈ９Δ変異株に熱ストレス（４２℃、６０分）を加えた。データは平均とＳＥＭ，ｎ＝３。＊ｐ＜０．０５、独立ｔ検定、両側を表す。（Ｂ）グリセロール（図に示された濃度）で３０分前処理した野生型細胞における熱ストレス（４２℃、６０分）後のルシフェラーゼ活性の回復。データは平均とＳＥＭ、ｎ＝３を表す。（Ｃ）ＳＤＣ中で増殖する３日目の野生型細胞を水で３回洗浄し、グリセロール存在下または非存在下で２４時間高濃度のＮａＣｌ（２Ｍ）に暴露した。その後細胞を３回洗浄して、塩を除き、連続的に希釈し、ＹＰＤプレートに播種した。（Ｄ）３日目の野生型とｓｃｈ９Δ変異株を高濃度（２および４Ｍ）のＮａＣｌに２４時間暴露した。（Ｅ）図のようにグリセロールを補充したＳＤＣ中で増殖する野生型細胞の経時的生存率。データは平均とＳＥＭ，ｎ＝３を表す。（Ｆ）ｉｎ ｓｉｔｕ生存アッセイ。ＳＤＣ野生型培養１日目に希釈し、ＳＣ−Ｔｒｐプレート上（炭素源なし）または炭素源としてグルコース（２％グルコース）、エタノール（０．８％ＥｔＯＨ）またはグリセロール（３％グリセロール）を補充したプレート上に播種した。２日毎にトリプトファン（または追加のグルコースとともに）をプレートに添加した。トリプトファン添加２日後にコロニー形成をモニターした。データは平均とＳＥＭ、ｎ＝３を表す。（Ｇ）正常（ＳＣ＋２％グルコース）、カロリー制限（ＳＣ＋１％グルコース）、またはグルコース／グリセロール（ＳＣ＋１％＋１％）培地中で増殖した野生型（ＤＢＹ７４６）およびｍｓｎ２Δ ｍｓｎ４Δ ｇｉｓ１Δ変異株の経時的生存率。データは解析した４培養の平均とＳＥＭを表す。（Ｈ）ＳＤＣ培地中で増殖した３日目の野生型細胞を水で３回洗浄し、グリセロール（０．１％または１％）添加または非添加水（ＣＲ／極度の飢餓）中でインキュベートした。プロットは同様な結果が得られた３回の反復実験の代表的な実験（重複の平均）を示す。（Ｉ）ＳＤＣ中で増殖する酵母を図に示した時点で試料採取（１ｍｌ）した。［１，２，３−３Ｈ］グリセロール（ＡＲＣ Ｉｎｃ．）を一定量加え、撹拌下、３０℃で２４時間インキュベートした。その後、細胞を水で３回洗浄した。細胞［３Ｈ］量をシンチレーション測定（Ｗａｌｌａｃ １４１０，ファルマシア社）し、細胞数（ＣＦＵによる生存率）で標準化した。データは解析した４培養の平均とＳＥＭを表す。 糖質をグリセロールで置換した食事はパラコート毒性からマウスを防御した。１群５匹からなる２群はそれぞれ対照食またはグリセロール食を６日間自由に与えられた。（Ａ）体重１００ｇ当たりの摂餌量はグリセロール食摂餌群がやや多かった。（Ｂ）パラコート注入前に血糖値を測定した（摂餌開始６日後。＊ｐ＝０．０５、独立ｔ検定、両側）。（Ｃ）５０ｍｇ／ｋｇパラコート（ＰＢＳ中７．５ｍｇ／ｍｌ）腹腔内注入後の生存曲線。（Ｄ）パラコート処理後のマウス体重。 症例１の血球数臨床検査値。（Ａ）好中球；（Ｂ）リンパ球；（Ｃ）白血球ＷＢＣ；（Ｄ）赤血球、ＲＢＣ；（Ｅ）血小板；（Ｆ）ヘモグロビン、Ｈｇｂ；（Ｇ）ヘマトクリット、Ｈｃｔ；（Ｈ）体重。 症例１、化学療法後の自己申告による副作用。 症例２、化学療法後の自己申告による副作用。 症例３、血球数臨床検査値。（Ａ）好中球；（Ｂ）リンパ球；（Ｃ）白血球、ＷＢＣ；（Ｄ）赤血球、ＲＢＣ；（Ｅ）血小板；（Ｆ）ヘモグロビン、Ｈｇｂ；（Ｇ）ヘマトクリット、Ｈｃｔ；（Ｈ）。前立腺特異抗原（ＰＳＡ）濃度。 症例３、化学療法後の自己申告による副作用。 症例４、血球数臨床検査値。（Ａ）好中球；（Ｂ）リンパ球；（Ｃ）白血球、ＷＢＣ；（Ｄ）赤血球、ＲＢＣ；（Ｅ）血小板；（Ｆ）ヘモグロビン、Ｈｇｂ；（Ｇ）ヘマトクリット、Ｈｃｔ。 症例４、化学療法後の自己申告による副作用。 症例５、血球数臨床検査値。（Ａ）好中球；（Ｂ）リンパ球；（Ｃ）白血球、ＷＢＣ；（Ｄ）赤血球、ＲＢＣ；（Ｅ）血小板；（Ｆ）ヘモグロビン、Ｈｇｂ；（Ｇ）ヘマトクリット、Ｈｃｔ；（Ｈ）前立腺特異抗原（ＰＳＡ）濃度。 症例６、血球数臨床検査値。（Ａ）好中球；（Ｂ）リンパ球；（Ｃ）白血球、ＷＢＣ；（Ｄ）赤血球、ＲＢＣ；（Ｅ）血小板；（Ｆ）ヘモグロビン、Ｈｇｂ；（Ｇ）ヘマトクリット、Ｈｃｔ。 症例９、血球数臨床検査値。（Ａ）好中球；（Ｂ）リンパ球；（Ｃ）白血球、ＷＢＣ；（Ｄ）赤血球、ＲＢＣ；（Ｅ）血小板；（Ｆ）ヘモグロビン、Ｈｇｂ；（Ｇ）ヘマトクリット、Ｈｃｔ。 症例１０、化学療法後の自己申告による副作用。 絶食または非絶食での化学療法後の自己申告による副作用。（Ａ）データは本実験のすべての患者によって報告されたすべてのサイクル後のＣＴＣ評価の平均を表す；（Ｂ）データは絶食および非絶食サイクルの整合によるＣＴＣ評価の平均を表す。 ７２時間絶食の体重、グルコース濃度、およびＧＨ／ＩＧＦ−Ｉ軸に対する効果。３０週齢のＣＤ−１マウスを７２時間絶食させ、屠殺した。深麻酔下に心穿刺により血液を採取し、直ちに血糖を測定した。血漿のＧＨ濃度およびＩＧＦ−Ｉ濃度（Ｃｏｈｅｎ）を解析した。ＧＨは拍動性のホルモンであり、ゆえに、有意な結果を得るためには大きなサンプルサイズを要する。マンホイットニーのＵ検定により計算したＩＧＦＢＰ−１以外は全てのＰ値はスチューデントのｔ検定により計算した。 絶食／カロリー制限に応答するストレス耐性の保存された調節経路。酵母では、Ｓｃｈ９，Ｔｏｒ，およびＲａｓによって制御される栄養感知シグナル伝達経路はプロテインキナーゼＲｉｍ１５に収斂する。続いて、ストレス応答性転写因子Ｍｓｎ２，Ｍｓｎ４，およびＧｉｓ１がストレス応答性遺伝子をトランス活性化し、細胞防御を増強して寿命が延長する。マウスとヒトでは、短期間の絶食により循環ＩＧＦ−Ｉ濃度が有意に低下する。部分的に保存されるＩＧＦ−Ｉシグナル伝達経路はＡｋｔによってＦｏｘＯ転写因子ファミリーが負に調節される。ＲａｓとＴｏｒはＩＧＦ−Ｉの下流領域にも機能するが、ストレス耐性と加齢の調節における役割は十分に解明されていない。５型アデニルシクラーゼ（ＡＣ）を欠損するマウスはストレス耐性であり、アデニルシクラーゼ欠損酵母と似ている。特に、ＩＧＦ−Ｉ，Ａｋｔ，Ｒａｓ，ＴｏｒおよびＰＫＡの過剰な活性化をもたらす発癌遺伝子の突然変異はヒト癌の中で最も一般的である［２０］。 ＩＧＦ−Ｉ減少によるＣＰ処理に対するｉｎ ｖｉｔｒｏＤＳＲ。初代ラットグリア細胞とラットグリオーマ細胞株（Ｃ６，９ＬおよびＡ１０−８５）を試験した。（Ａ）細胞を１％血清加ＤＭＥＭ／Ｆ１２中でプレインキュベートし、抗ＩＧＦ−ＩＲモノクローナル抗体α−ＩＲ３（１μｇ／ｍｌ）で２４時間中和した。ＣＰ処理（１５ｍｇ／ｍｌ；ｎ＝１２）後、細胞毒性（ＬＤＨ法）を調べた。（Ｂ）細胞を１％（ＳＴＳ）または１０％ＦＢＳのいずれかを添加した培地中で２４時間プレインキュベートした。ＣＰ処理（１５ｍｇ／ｍｌ；ｎ＝１２）後、細胞毒性（ＬＤＨ法）を調べた。（Ｃ）細胞をｒｈＩＧＦ−Ｉ（１００ｎｇ／ｍｌ）添加または非添加１％血清加培地中で４８時間プレインキュベートした。ＣＰ処理（１２ｍｇ／ｍｌ；ｎ＝２１）後、細胞毒性（ＬＤＨ法）を調べた。スチューデントｔ検定による＊＊＊Ｐ＜０．０００１。 Ｒ＋およびＲ−細胞をコンフルエントになるまで増殖させ、１０％ＦＢＳ補充ＤＭＥＭ／Ｆ１２中で（Ａ）２４時間または（Ｂ）４８時間ＤＸＲ（０−５００μＭ）処理した。生存率は、非処理に比べた相対的なＭＴＴ還元度により決定した；平均±ＳＤ、スチューデントのｔ検定による＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１，＊＊＊Ｐ＜０．００１；同一ＤＸＲ濃度におけるＲ＋細胞 ｖｓ．Ｒ−細胞。（Ｃ）コメット解析。ＩＧＦ−ＩＲを過剰発現する細胞またはＩＧＦ−ＩＲを欠損する細胞（Ｒ＋およびＲ−）を５０μＭのＤＸＲで１時間処理した。ＤＸＲ処理Ｒ＋細胞に有意なＤＮＡ障害が観察されたが、Ｒ−細胞はＤＸＲ誘発ＤＮＡ障害を防御した。スチューデントのｔ検定による＊＊Ｐ＜０．０１，＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；Ｒ＋対照 ｖｓ．Ｒ＋ＤＸＲ；Ｒ−対照 ｖｓ．Ｒ−ＤＸＲ；Ｒ＋ＤＸＲ ｖｓ．Ｒ−ＤＸＲ。２つの独立した実験から同様の結果が得られた。代表的な実験を示す。 Ｓ．セレビシエにおけるＤＸＲに対するＳｃｈ９／Ｒａｓ２欠損のによるＤＳＲの効果。（Ａ）野生型（ＤＢＹ７４６）、ｓｃｈ９Δ，ｓｃｈ９Δｒａｓ２Δ，ＲＡＳ２ｖａｌ１９，およびｓｃｈ９ΔＲＡＳ２ｖａｌ１９株をＯＤ６００＝０．１で播種し、グルコース培地中で別々に増殖させ、播種開始２４時間後にＤＸＲ（２００μＭ）で処理した。生存率を適切な選択培地上でのコロニー形成ユニット（ＣＦＵ）として測定した。３つの独立した実験からのデータを平均±ＳＥとして示す。スチューデントのｔ検定による＊Ｐ＜０．０５，ｓｃｈ９Δｒａｓ２Δ ｖｓ．ｓｃｈ９ΔＲＡＳ２ｖａｌ１９。（Ｂ）突然変異頻度の時間経過、１０６個細胞当たりのＣａｎｒ突然変異体として測定。示す株は、野生型（ＷＴ）、Ｓｃｈ９および／またはＲａｓ２を欠損する細胞、ならびに構造的に活性なＲａｓ２ｖａｌ１９を過剰発現する細胞。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝３−５実験）を表す。細胞を１日目にＤＸＲ（２００μＭ）で処理した。野生型無処理細胞の突然変異頻度を対象として報告した。スチューデントのｔ検定による＊Ｐ＜０．０５，ｓｃｈ９Δｒａｓ２Δ ｖｓ．ｓｃｈ９ΔＲＡＳ２ｖａｌ１９。 種々の高用量化学療法剤で処理したＬＩＤマウスにおけるストレス耐性試験。ＬＩＤおよび対照マウスは（Ａ）１００ｍｇ／ｋｇエトポシド（Ｅｔｏ，Ｐ＝０．０６４）の単回注入、（Ｂ）５００ｍｇ／ｋｇＣＰ（Ｐ＝０．００１）単回注入、（Ｃ）４００ｍｇ／ｋｇ５−フルオロウラシル（５−ＦＵ，Ｐ＝０．１４８）単回注入、（Ｄ）ドキソルビシン（ＤＸＲ）２回注入、を受けた。最初の２０ｍｇ／ｋｇは０日目に、２回目の２８ｍｇ／ｋｇは２２日目（Ｐ＝０．０２２）に注入された。生存率％で評価された毒性を示す。Ｐｅｔｏのログランク検定によるＰ値。 メラノーマ担癌ＬＩＤマウスにおける２サイクルの高用量ＤＸＲに対する分別的ストレス耐性（ＤＳＲ）。（Ａ）実験手順のスケジュール。（Ｂ）２サイクルの高用量ＤＸＲで処理したＢ１６Ｆｌｕｃメラノーマ担癌ＬＩＤマウスおよび対照マウスの生物発光画像。５匹のマウスを無作為に選択し、実験の間中腫瘍の進行または退縮のモニターを続けた。（Ｃ）２サイクルの高用量ＤＸＲ（Ｐ＜０．０５）で処理したＢ１６Ｆｌｕｃメラノーマ担癌ＬＩＤマウスと対照マウス間の生存率比較。（Ｄ）（Ｃ）のデータは、全ての死亡が転移およびＤＸＲ毒性の両方に起因することを表す。ゆえに、本データはＤＸＲ毒性関連の死亡のみを表すために解析された。（Ｅ）ＬＩＤマウスおよび対照マウスの体重。（Ｆ）対照マウスおよびＬＩＤマウスにおけるＤＸＲ誘発心筋症。心不全は、急性ＤＸＲ毒性の主要な結果である［７６］。ＤＸＲ処理対照マウスからの心臓の組織標本スライドは、筋原線維の欠損と免疫細胞の浸潤を示したが、一方、ＤＸＲ依存性の心筋症はＬＩＤマウスには観察されなかった。ヘマトキシリン エオジン染色。代表的なスライドを示す。バー、１００μｍ。 短期間絶食（ＳＴＳ）と低ＩＧＦ−Ｉに対する応答における分別的なストレス耐性（ＤＳＲ）のモデル。正常細胞は、絶食または増殖シグナルの欠如に対し、細胞周期停止の実行およびエネルギー維持へのシフトによって対応する。癌細胞の特徴の一つは、外部の調節シグナル（ＩＧＦ−ＩＲ，Ｒａｓ，およびＡｋｔを含む）にかかわらず増殖する、または増殖モードを維持する能力であることから、癌細胞は、絶食および低ＩＧＦ−Ｉに対する応答において防御維持モードに入ることができず、または一部のみ入ることが予想される。 絶食による分別的なストレス耐性。正常細胞では、Ａｋｔ，Ｒａｓおよび他の癌原遺伝子を含むＩＧＦ−Ｉの下流エフェクターおよび他の増殖因子経路が絶食に起因する増殖因子の減少に応答して下方制御される。この下方制御は増殖を阻止／減少し、化学療法に対する防御を促進する。対照的に、発癌突然変異は、増殖シグナルから独立性により、腫瘍細胞のＳＴＳに対する応答を低下させる。それゆえ、癌細胞は、絶食状態に対する応答ができず、または一部の応答のみに留まり、酸化ストレスおよび高用量化学療法に対して防御する代わりに、増殖促進を続ける。 絶食哺乳類細胞における分別的ストレス耐性。初代ラットグリア細胞、ラットグリオーマ細胞株（Ｃ６，Ａ１０−８５，およびＲＧ２）、ヒトグリオーマ細胞株（ＬＮ２２９）およびヒト神経芽細胞腫細胞株（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ）を試験した（＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１）。 短期間絶食（ＳＴＳ）はマウスを化学毒性から防御する。３種の異なる遺伝的背景（Ａ：Ａ／Ｊ Ｂ：ＣＤ−１ Ｃ：ヌード）のマウスを４８−６０時間絶食させ、高用量エトポシド（１００−１１０ｍｇ／ｋｇ）でチャレンジした（＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００５）。 短期間絶食（ＳＴＳ）はマウスを化学毒性から防御する。（Ｅ）８週齢のＣＤ−１雌性マウスを１２ｍｇ／ｋｇのシスプラチン投与前４８時間と投与後２４時間絶食させた（ｐ＜０．０５）。（Ｆ）１５週齢のＡ／Ｊ雌性マウスを４８時間絶食させ、１６ｍｇ／ｋｇのドキソルビシンでチャレンジした（ｐ＜０．０５）。 神経芽細胞腫を有する絶食マウスにおける分別的ストレス耐性。（Ａ）ＮＸＳ２（神経芽細胞腫）担癌マウスを高用量のエトポシド（８０ｍｇ／ｋｇ）による化学療法前に４８時間絶食（ＳＴＳ）させた。 神経芽細胞腫を有する絶食マウスにおける分別的ストレス耐性。（Ｂ）実験手順。 神経芽細胞腫を有する絶食マウスにおける分別的ストレス耐性。（Ｃ）ＳＴＳはＮＸＳ２細胞をドキソルビシンとシスプラチンに対する感受性を増強するかもしれない。 Ｂ１６メラノーマ細胞を有する絶食マウスにおける分別的ストレス応答性。ＳＴＳはＤＸＲに対するＢ１６メラノーマ細胞の感受性を増強する。：化学療法４８時間前の絶食によりマウスはより高い腫瘍奏効を示し、この応答はバイオルミネッセンス技術の使用によりさらに定量化された。
本発明は、少なくとも部分的に、減少レベルのメチオニン、トリプトファン、すべてのアミノ酸、またはタンパク質を含む食事組成物、単糖、二糖、および多糖の代替物としてのグリセロールを含む食事組成物、ならびに減少レベルのエネルギー、炭水化物、またはタンパク質の低カロリーまたはノンカロリー食事、および絶食が、化学療法、放射線療法、酸化ストレス、または加齢から対象を防御するために使用できるという予想外の発見に基づいている。
より具体的には、本発明の一の食事組成物は、０−０．２重量％（例えば、０．０２％、０．０５％、０．１％、または０．１５％）のＬ−メチオニンおよび少なくとも０．０５重量％（例えば、０．１％、０．５％、１％、または２％）のそれぞれＬ−トリプトファン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−スレオニン、およびＬ−バリンを含有するが、タンパク質は含有しない。幾つかの実施態様では、本組成物は、また、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グリシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−チロシン、Ｌ−アルギニン、およびＬ−ヒスチジンから成る群から選択される１つまたは複数のアミノ酸を、例えば、それぞれを少なくとも０．０５重量％（例えば、０．１％、０．５％、または２％）含有する。幾つかの実施態様では、本組成物は、正常量のそれぞれＬ−トリプトファン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−バリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グリシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−チロシン、Ｌ−アルギニン、およびＬ−ヒスチジンを含有する。
本発明の２番目の食事組成物は、０−０．２重量％（例えば、０．０２％、０．０５％、０．１％、または０．１５％）のＬ−トリプトファンおよび少なくとも０．０５重量％（例えば、０．１％，０．５％，１％，または２％）のＬ−メチオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−バリンを含有するが、タンパク質は含有しない。幾つかの実施態様では、本組成物は、また、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グリシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−チロシン、Ｌ−アルギニン、およびＬ−ヒスチジンから成る群から選択される１つまたは複数のアミノ酸を、例えば、それぞれ少なくとも０．０５重量％量（例えば、０．１％、０．５％、１％、または２％）含有する。幾つかの実施態様では、本組成物は、正常量のそれぞれＬ−メチオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−バリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ―システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グリシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−チロシン、Ｌ−アルギニン、およびＬ−ヒスチジンを含有する。
本発明の３番目の食事組成物は、Ｌ−メチオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−バリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グリシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−チロシン、Ｌ−アルギニン、およびＬ−ヒスチジンを、それぞれ０−０．２重量％量（例えば、０．０２％、０．０５％、０．１％、または０．１５％）を含有するが、タンパク質は含有しない。
本発明の第４番目の食事組成物は、単糖（例えばグルコース）、二糖、および多糖の代替物としてグリセロールを含有する。
本発明の食事組成物は、化学療法、放射線療法、酸化ストレス、または加齢から動物またはヒトを防御するために使用することができる。より具体的には、動物またはヒトは本発明の食事組成物を摂食することができる。動物またはヒトが化学療法、放射線療法、または酸化ストレスに暴露される場合、動物またはヒトの正常細胞は防御されるが、癌細胞等の異常細胞は防御されない。例えば、動物またはヒトが化学療法、放射線療法、または酸化ストレスに暴露される前に連日３−１０日間本組成物を動物またはヒトに投与することができる。本組成物は、また、暴露後２４時間動物またはヒトに投与することができる。好ましくは、本組成物は、動物またはヒトを化学療法、放射線療法、または酸化ストレスの暴露する前に連日３−１０日間、および暴露後２４時間の両方を動物またはヒトに投与することができる。動物またはヒトを加齢から防御するために、組成物は３回目の食事毎または３−１０日毎に投与することができる。
化学療法の実施例として、エトポシド、ドキソルビシン、シスプラチン、５−ＦＵ、ゲムシタビン、シクロホスファミド、ドセタキセル、シクロホスファミド、カルボプラチン、ＧＭＺ、およびパクリタキセルが挙げられるが、これらに限定されるものではない。これらの薬物は個別にまたは併用で使用することができる。
本発明は、また、低カロリー食事またはノンカロリー食事を供給する。該食事は８１３−９５７キロカロリー以下（例えば、７００、５００、３００、１００キロカロリー以下、または０キロカロリー）の総エネルギーと、３０−３６ｇ以下（例えば、２０、１０、または５ｇ以下、または０ｇ）のタンパク質を供給しながら、対象者に栄養を供給することが可能な食材を含有する。もし、炭水化物が本食材中に存在する場合は、炭水化物の割合は総エネルギーの半分以下である。
本発明の食事は、化学療法、放射線療法、酸化ストレス、または加齢を防御するために、動物またはヒトに（例えば、１日１回、または３回に分けて）投与することができる。例えば、本食事を動物またはヒトに化学療法、放射線療法、または酸化ストレスに暴露する前に連日３−１０日間動物またはヒトに投与することができる。本食事は、該暴露後、２４時間動物またはヒトに投与することもができる。好ましくは、本食事を、動物またはヒトに化学療法、放射線療法、または酸化ストレスに暴露する前に連日３−１０日間、および該暴露後２４時間の両方を動物またはヒトに投与することができる。加齢から動物またはヒトを防御するためには、３回目の食事毎にまたは３−１０日毎に投与することができる。
本発明は、さらに、動物またはヒト体重ｋｇ当たり１日１１キロカロリー以下（例えば、８、５、または２キロカロリー以下、または０キロカロリー）のエネルギーと、動物またはヒトの体重当たり１日０．４ｇ以下（例えば、０．３、０．２または０．１ｇ、または０ｇ）のタンパク質を供給しながら、栄養を供給することができる食事を動物またはヒトに投与することによって、化学療法、放射線療法、酸化ストレス、または加齢から動物またはヒトを防御する方法を供給する。もし、炭水化物が食事中に存在する場合、炭水化物の割合は該エネルギーの半分以下である。幾つかの実施態様では、本食事は、１日当たり７００キロカロリー未満（例えば、６００、４００、または２００キロカロリーまたは０キロカロリー）の総エネルギーを供給することができる。該動物またはヒトが化学療法、放射線療法、または酸化ストレスに暴露される場合、該動物またはヒトの正常細胞は防御されるが、癌細胞等の異常な細胞は防御されない。例えば、本食事は該動物またはヒトが化学療法、放射線療法、または酸化ストレスに暴露する前に３―１０連日該動物またはヒトに投与することができる。本食事は、該暴露後２４時間該動物またはヒトに投与することもできる。好ましくは、本食事は、該動物またはヒトを化学療法、放射線療法、または酸化ストレスに暴露する前３−１０連日および該暴露後２４時間の両方を該動物またはヒトに投与することができる。加齢から動物またはヒトを防御するために、本食事を３回目の食事毎または３−１０日毎に投与することができる。
さらに、本発明は、化学療法の前後に担癌動物または癌患者を絶食させることによって、化学療法から動物またはヒトを防御する方法を供給する。例えば、担癌動物または癌患者を１サイクルの化学療法前４８−１４０時間または化学療法後４−５６時間絶食させることができる。好ましくは、担癌動物または癌患者を１サイクルの化学療法前４８−１４０時間および化学療法後４−５６時間絶食させる。動物またはヒトが化学療法に暴露される場合、該動物またはヒトの正常細胞は防御されるが、癌細胞は防御されない。幾つかの実施態様では、該動物またはヒトを１サイクルの化学療法の前後１８０時間以下絶食させられる。
化学療法前４８−６０時間、化学療法後±２４時間の絶食はマウスを防御し、癌細胞の化学療法に対する感受性を増強することが動物で観察された。さらに、以下に示すように、癌患者においては、絶食または極めて低カロリーの食事は化学療法から患者を防御したが、癌細胞は防御しなかった。極めて低カロリーの該食事／絶食は、また、癌細胞の化学療法に対する感受性を増強すると思われた。絶食は種々の癌細胞の種々のタイプの化学療法に対する感受性を増強したことも動物実験で観察された。加えて、動物実験では、絶食によりＩＧＦ−Ｉの７５％の低下がもたらされ、ＩＧＦ−Ｉの７５−９０％の低下は動物を防御し、化学療法に対する癌細胞の感受性を増強するのに十分であった。さらに、ヒト臨床試験では５日の絶食および／または低カロリー／低タンパク質／低糖質のいずれかにより７５％以上のＩＧＦ−Ｉの低下がもたらされたことが観察された（Ｔｈｉｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗ １５（ｌ）：８０−１０１）。ゆえに、極めて低カロリー／低糖質だけでなく極めて低タンパク質の食事が化学療法から動物およびヒトを防御し、多くの種類の癌細胞の化学療法に対する感受性を増強するであろう。
以下の実施例は本発明の範囲を説明することを意図するが、本発明の範囲はこれに限定されるものではない。かかる実施例は使用することが可能な典型的な実施例であるが、当業者に公知の他の手順も代わりに使用することが可能である。事実、通常の当業者は、本発明の教示に基づき、必要以上の実験無しに、容易にさらなる実施態様を想像し、実行することができる。
癌を治療するための戦略は、主に腫瘍細胞に対する毒性を増強することに集中してきた。本発明者は、腫瘍を殺すことに集中する古典的な腫瘍中心の薬物開発から離れ、正常細胞の防御を増強することに集中してきた。最近、本発明者は短期間絶食（ＳＴＳ；４０−６０時間）により化学療法に対する宿主抵抗性が増強する一方、同時に化学療法誘発アポトーシスに対する腫瘍の感受性が増強することを報告した（分別的ストレス耐性、ＤＳＲ）（１）。ＳＴＳの根拠は、増殖因子抑制とカロリー制限（ＣＲ）が種々の生物の寿命を延ばし、ストレス耐性を増強するという加齢の分野におけるＤｒ．Ｌｏｎｇｏの仕事に由来する。しかし、ＳＴＳは宿主を分別的に防御するための強力な方法ではあるが、臨床設定における応用は制限してきた。ゆえに、本発明者は、化学療法に対する宿主抵抗性を増強することもできる代替的な薬剤介入を調べた。研究を通じて、本発明者は、化学療法剤に対する宿主の防御の増強を提供する３つの有望な薬剤を決定した。化学療法に対する耐性増強に有効であった本薬剤は１）メチオニン制限アミノ酸混合物（ＬＡＭ１）、２）トリプトファン制限アミノ酸混合物（ＬＴＡ１）、および３）グリセロール（Ｇ１）であった。ＬＭＡ１は、本食事が他のメチオニン源を欠乏する場合のみ有効であり、ＬＴＡ１は本食事が他のトリプトファン源を欠乏する場合のみ有効である。最後に、Ｇ１はグルコース制限食との併用時に有効である。興味深いことに、ＬＭＡ１とＬＴＡ１は等カロリーで、摂食も同等であるにもかかわらず、ＬＭＡ１／ＬＴＡ１処理により動物は体重低下特性を示した。これは、ＬＭＡ１／ＬＴＡ１が該動物を「増殖／再生」から「維持」へとエネルギーをシフトさせ、ゆえに、化学療法毒性に対する耐性を増強していることを示唆する。
ＬＭＡ１混合物
メチオニン制限は、実験用げっ歯類の寿命を延ばし、ストレス耐性を高めることが示されている（２，３）。ゆえに、タンパク質欠乏食における低メチオニンアミノ酸混合物（ＬＭＡ１）の実験用げっ歯類における化学療法毒性からの防御に対する効果を調べた。化学療法前の５日間、８匹のマウスにＬＭＡ１混合物をタンパク質フリー食と併用で投与した（ハーラン社，ＴＤ．０７７８９）。ＬＭＡ１混合物中のメチオニンレベルは対照食のレベルの２０％であった（ＴＤ．０７７８８）。５日のＬＭＡ１食の後、マウスに高用量のドキソルビシン（ＤＸＲ，広く使用される化学療法剤）を静脈内注射した。毒性の程度を調べるため、毎日マウスの体重減少と異常な行動をモニターした。体重と摂餌を毎日記録した。ＬＭＡ１処理マウスは対照群に比較してより迅速に体重減少から回復した（図１）。さらに、ＬＭＡ１処理マウスは、高用量化学療法後、対照マウスに比べ有意に高い生存率を示した（それぞれ６３％ ｖｓ．１３％）（図１）。
ＬＴＡ１混合物
メチオニン制限と同様に、低濃度のトリプトファン食も寿命の延長と癌を含む若干の加齢関連疾患の減少を示している（４−７）。長寿とストレス耐性の間に強い関連性があるという事実に基づいて、本発明者らは、他のトリプトファン源欠乏下において低トリプトファンアミノ酸混合物でのマウスの処理も寿命延長に加えてストレス耐性の増強も提供することができると考えた。化学療法前１０日間、８匹のマウスにタンパク質欠乏食（ハーラン社，ＴＤ．０７７９０）と併用でＬＴＡ１混合物の処理を行った。ＬＴＡ１混合物中のトリプトファンレベルは対照食のレベルの２０％であった（ＴＤ．０７７８８）。毒性をＬＭＡ１混合物実験で実施された場合と同様に調べた。ＬＴＡ１混合物は化学療法後の体重管理を改善し、対照に比べ体重減少のより迅速な回復をもたらした（図２）。また、ＬＴＡ１混合物処理マウスは、対象と比べて４倍高い生存率であった（５０％ ｖｓ．１２．５％）（図２）。
Ｇ１混合物
カロリー制限は、酵母から哺乳類までの範囲のモデル生物においてストレス耐性を増強し、寿命を延長する（Ｌｏｎｇｏ，２００３）（８，９）。絶食が複数の化学療法に対する防御効果を示し、炭素源のグリセロール置換が酵母の寿命の延長とストレス耐性に好ましい効果を示すという我々の最近の結果を考慮して、マウスにおけるグリセロール摂餌のトキシンに対する防御効果を調べた。１群５匹のマウスから成る２群のそれぞれに２種類の等カロリー食、対照食（４０％デンプン／砂糖／マルトースデキストリンを補充したＴｅｋｌａｄ ８６０４固形飼料）またはグリセロール含有Ｇ１食（４０％グリセロール補充）を６日間自由に摂餌させた。グリセロール食のマウスは対照食のマウスよりやや多く摂餌したが、６日目には両群とも血糖値の１８％の減少を示した（図３）。その後、両群のマウスに５０ｍｇ／ｋｇのパラコートを腹腔内に１回投与し、正常食（８６０４固形飼料）に戻した。パラコートは肝細胞と肺細胞のＳ期停止をもたらし（１０）、死に至ることが知られている（１１）。対照群のマウスは３日目までにすべて死亡したが、グリセロール食マウスの５匹中３匹はパラコート毒性を完全に防御し（図３Ｃ，ｐ＜０．０５）、パラコート処理５日後に正常な体重に回復した（図３Ｄ）。これらの結果は、炭素源をグリセロールで置換した食事はインビボの酸化ストレス耐性を増強し、より高等な真核生物のカロリー制限を模倣する可能性を有していることを示す。
材料と方法
ＬＭＡ１およびＬＴＡ１
ＬＭＡ１およびＬＴＡ１は純粋な合成アミノ酸混合物に基づいており（１）、ハーランテクラッド社で我々のために１／２インチのペレット状に注文生産された。対照（ＴＤ．０７７８８）、ＬＭＡ１（ＴＤ．０７７９０）、およびＬＴＡ１（ＴＤ．０７７８９）を含むすべての群は等カロリー食（３．９Ｋｃａｌ／ｇ）を摂餌した。
ＬＭＡ１混合物：体重２５−３０ｇのＣＤ−１マウスに化学療法前５日間正常（０．８６％）または低（０．１７％）レベルのメチオニンを含有する純粋合成アミノ酸混合物を予め摂餌させた。
ＬＴＡ１混合物：体重２５−３０ｇのＣＤ−１マウスに化学療法前５日間正常（０．８６％）または低（０．１７％）レベルのトリプトファンを含有する純粋合成アミノ酸混合物を予め摂餌させた。
Figure 2015186480
マウスにおけるドキソルビシン実験
マウスをＬＭＡ１またはＬＴＡ１で処理した後、２４−２６ｍｇ／ｋｇのドキソルビシン（ベッドフォード ラボラトリーズ社）を３０ゲージのインスリン用注射器（ベクトン ディッキンソン社）で静脈内注射した。ドキソルビシンは精製水中に溶解し、生理食塩水で最終濃度５ｍｇ／ｍｌに希釈した。全てのドキソルビシン注射の後、生理食塩水／ヘパリンで洗浄して、血管内皮細胞の損傷を最少にした。毒性と有効性を調べるため、マウスの体重減少と一般的行動を常時モニターした。体重は実験期間中毎日１回記録した。瀕死状態と判断したマウスは二酸化炭素麻酔により屠殺し、剖検を実施した。心毒性は、急性のドキソルビシン毒性による死亡の主要な原因であるので、組織レベルで障害の程度を調べるため組織標本スライドを作成した。
マウスにおけるグリセロール食
体重１８−２４ｇのＡ／Ｊマウスに４０％グリセロール食（Ｗ／Ｗ）を６日間与えた。本食は６０重量％のペレット（ハーランテクラッド社，Ｄｉｅｔ８６０４）と４０重量％のグリセロール（バイオサーブ社，米国ニュージャージー州）から成っていた。簡潔には、ペレットをフードプロセッサーで細かく粉砕し、ＵＳＰグレードのグリセロールと混合した。ペレット粉末と混合する時には、グリセロールの密度（１．２６ｇ／ｍｌ）を考慮した。食物は４日間乾燥した。グリセロールは吸湿性であることから、大気中の湿気を吸い取り、乾燥過程の最初の３日間でペレット重量を３％増加させ、その後安定な重量を維持した。血糖値は６日目に測定した。無菌の３１ゲージ針を用いて尾静脈を最少に穿刺し、短時間出血させた。血糖値は、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｘｔｒａ血糖モニタリングシステム（アボット ラボラトリーズ社）により測定した。グリセロールは主に肝と腎で代謝されるので、これらの臓器を剖検時に組織学的検査用に採取した。
マウスにおけるパラコート試験
６日間のグリセロール食の後、マウスにパラコート（シグマ社）を注入した。パラコートはリン酸緩衝食塩水中に溶解して７．５ｍｇ／ｍｌに調製し、３１ゲージ注射器（ベクトン ディッキンソン社）を用いて５０ｍｇ／ｋｇを腹腔内に注入した。パラコート投与後、速やかに動物を正常食（ハーランテクラッド社，Ｄｉｅｔ ８６０４）に戻した。マウスは４日間２時間毎にモニターし、体重を実験期間中毎日１回記録した。体重測定は、グリセロール食期およびパラコート後期の２期に分けて解析した。マウスがストレスの徴候または痛みを示し、また、高度に訓練され、経験を積んだ研究者が回復の可能性が無いと判断した時には、マウスを屠殺した。肺は主要な標的臓器であるので、屠殺したマウスを剖検し、組織学的検査用に肺を採取した。簡潔には、肺のスライスを４％ホルムアルデヒド中で固定し、パラフィン包埋し、４μｍ厚に薄切し、Ｈ＆Ｅ染色した。
文献
１．Ｒａｆｆａｇｈｅｌｌｏ Ｌ，Ｌｅｅ Ｃ，Ｓａｆｄｉｅ ＦＭ，Ｗｅｉ Ｍ，Ｍａｄｉａ Ｆ，Ｂｉａｎｃｈｉ Ｇ，＆ Ｌｏｎｇｏ ＶＤ（２００８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．
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１０．Ｍａｔｓｕｂａｒａ Ｍ，Ｙａｍａｇａｍｉ Ｋ，Ｋｉｔａｚａｗａ Ｙ，Ｋａｗａｍｏｔｏ Ｋ，＆ Ｔａｎａｋａ Ｔ（１９９６）Ａｒｃｈ Ｔｏｘｉｃｏｌ ７０，５１４−５１８．
１１．Ｍｉｇｌｉａｃｃｉｏ Ｅ，Ｇｉｏｒｇｉｏ Ｍ，Ｍｅｌｅ Ｓ，Ｐｅｌｉｃｃｉ Ｇ，Ｒｅｂｏｌｄｉ Ｐ，Ｐａｎｄｏｌｆｉ ＰＰ，Ｌａｎｆｒａｎｃｏｎｅ Ｌ，＆ Ｐｅｌｉｃｃｉ ＰＧ（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ ４０２，３０９−３１３．
１２．Ｒｏｇｅｒｓ ＱＲ ＆ Ｈａｒｐｅｒ ＡＥ（１９６５）Ｊ Ｎｕｔｒ ８７，２６７−２７３．
ＳＣＨ９調節炭素源置換はカロリー制限と同様な寿命延長効果がある
要約
酵母からマウスまでの範囲の生物において証明された寿命延長に対するカロリー制限（ＣＲ）の効果は、Ｔｏｒ，Ａｋｔ，およびＲａｓを含む経路の下方制御が関わるかもしれない。ここで、我々は、酵母Ｓｃｈ９（ＡｋｔおよびＳ６Ｋの両哺乳類キナーゼのホモローグ）が、ＴＣＡサイクルと呼吸から解糖とグリセロール生合成への代謝スイッチに関連する遺伝子の共通セットを制御するネットワークの中心成分であることを示唆する遺伝的なデータおよび遺伝子発現データを提供する。経時的な生存期間中、ＳＣＨ９欠損変異株は細胞外のエタノールを欠乏させ、蓄積脂肪を減少させるが、グリセロールを合成し、遊離した。長寿命のｓｃｈ９Δ、ｔｏｒ１Δ、およびｒａｓ２Δ変異株で最も上方制御されたもののうち、グリセロール生合成遺伝子ＧＰＤ１、ＧＰＤ２またはＲＨＲ２の欠損は、ｓｃｈ９Δ変異株における経時的寿命延長とストレス耐性を逆転させるのに十分であった。炭素源としてのグリセロールをグルコースまたはエタノールで置換すると、カロリー制限または絶食によりもたらされる寿命延長と同様な延長がもたらされた。マウス食をグルコース中心の炭水化物からグリセロールに置換することにより、グルコース濃度が減少し、酸化ストレスに対する耐性が増強された。これらの結果は、“炭素源置換”（ＣＳＳ）が、加齢を遅らせ、細胞を障害から防ぐための新しい戦略を提供することを示唆する。
序論
Ａｋｔ／ＰＫＢ，Ｔｏｒ，およびＲａｓ経路の活性を減少させる突然変異は、幾つかのモデル生物の寿命を延長し、長寿命を調節する潜在的な機序が多くの真核生物において保存されていることを示唆する（Ｋｅｎｙｏｎ，２００１；Ｌｏｎｇｏ ａｎｄ Ｆｉｎｃｈ，２００３）。Ａｋｔ／ＰＫＢは高度に保存されたセリン−スレオニンキナーゼであり、線虫Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓのＤａｆ−２長寿命経路で機能することが示されている（Ｐａｒａｄｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。類似する長寿命調節経路もショウジョウバエとマウスで同定されている（Ｋｅｎｙｏｎ，２００１）。酵母では、哺乳類キナーゼＡｋｔ／ＰＫＢおよびＳ６Ｋとの高度な配列同一性を共有するＳｃｈ９は、栄養感知経路の一部であり、その下方制御は経時的寿命（ＣＬＳ，非分裂酵母集団の生存時間）を３倍にまで延長する（Ｆａｂｒｉｚｉｏ ｅｔ ａｌ．，２００１）。Ｒａｓ Ｇタンパク質も進化上保存され、グルコース／増殖因子に応答して細胞分裂に関係する。ＲＡＳ２の欠損は酵母のＣＬＳを２倍にする（Ｆａｂｒｉｚｉｏ ｅｔ ａｌ．，２００３）。哺乳類では、Ｒａｓの寿命制御における役割は確定的に証明されてはいないが、Ａｋｔとともに、ＲａｓはＩＧＦ−Ｉシグナル伝達の主要なメディエーターの一つであり、加齢を促進することが示されている（Ｈｏｌｚｅｎｂｅｒｇｅｒ，２００４；Ｌｏｎｇｏ，２００４）。細胞増殖と細胞周期進行を調節するもう一つの保存されている栄養応答性経路は、線虫Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓとショウジョウバエの寿命調節と関連するとされてきたラパマイシン標的プロテインキナーゼＴＯＲを含む。ＬＥＴ−３６３／ＣｅＴＯＲのノックダウンは、成中寿命の第１日目にスタートして、線虫の寿命を２倍以上にした（Ｖａｌｌａｉ ｅｔ ａｌ．，２００３）。同様に、哺乳類ｍＴＯＲ相互作用タンパク質ｒａｐｔｏｒの線虫相同分子種であるＤａｆ−１５の活性低下は、寿命延長を促進する（Ｊｉａ ｅｔ ａｌ．，２００４）。ハエでは、ドミナント ネガティブｄＴＯＲまたはＴＯＲ阻害ｄＴｓｃ１／２タンパク質の過剰発現も寿命延長につながる（Ｋａｐａｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００４）。さらに、ＣｅＴＯＲのノックダウンは食事制限（ＤＲ）の対象である線虫の寿命をさらに延長はせず、ＴＯＲ阻害は栄養豊富な食物の有害な効果からハエを防御するので、少なくとも一部分はＴＯＲによって介在されるＤＲの有益な効果が示唆される（Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｋａｐａｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００４）。
２種のＴＯＲ相同分子種ＴＯＲ１とＴＯＲ２が酵母で確認されている。Ｔｏｒ１とＴｏｒ２のいずれもラパマイシン感受性様式における増殖関連シグナル伝達を介在する一方、Ｔｏｒ２は加えてアクチン細胞骨格の細胞周期依存的な構築の制御においてラパマイシン非感受性の機能を有する（Ｌｏｅｗｉｔｈ ｅｔ ａｌ，２００２）。ＴＯＲ経路活性の低下は酵母の複製寿命（ＲＬＳ）の延長をもたらし、個々の母細胞によって作製される娘細胞の数（Ｋｅｎｎｅｄｙ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｍｏｒｔｉｍｅｒ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ，１９５９）は、Ｓｃｈ９不活性化の時に得られる数に匹敵する（Ｋａｅｂｅｒｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００５ａ；Ｋａｅｂｅｒｌｅｉｎ ａｎｄ Ｋｅｎｎｅｄｙ，２００５）。さらに、ハイスループット法で個々の酵母の欠損変異株のＣＬＳを測定した結果、Ｔｏｒ経路に関連する遺伝子欠損を保有する幾つかの長寿命株を同定した（Ｐｏｗｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２００６）。Ｔｏｒ１活性とＣＬＳの間の逆相関を指示するさらなる事実が最近提供されている（Ｂｏｎａｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，２００７）。
Ｔｏｒ１とＳｃｈ９の両酵母の加齢調節機能は、カロリー制限（ＣＲ）依存性ＲＬＳ延長を介在する。いずれかの経路の下方制御は、培地のグルコース含有量を低下する効果に良く似ており、ｓｃｈ９Δまたはｔｏｒ１Δ変異株がカロリー制限された時にはＲＬＳの更なる延長は観察されない （Ｋｅａｂｅｒｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００５ｂ）。発酵性の増殖中に生産されるエタノールは、酵母細胞が迅速な増殖から遅い出芽へと転換し、実質的に増殖を止めるダイオーキシックシフト期およびポスト ダイオーキシックシフト期の間の炭素源として使用される（Ｇｒａｙ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｌｉｌｌｉｅ ａｎｄ Ｐｒｉｎｇｌｅ，１９８０）。酵母のグルコース／エタノール培地中での増殖から水への転換は、非分裂細胞の極度のＣＲ／絶食状態に似る。ＣＲのこの極度の態様は野生型の酵母の経時的な生存率を二倍にする（Ｆａｂｒｉｚｉｏ ａｎｄ Ｌｏｎｇｏ，２００３）。ＲＬＳとは対照的に、ＣＲ誘発性のＣＬＳの増加はＳｃｈ９によって部分的にのみ介在される（Ｆａｂｒｉｚｉｏ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｗｅｉ ｅｔ ａｌ．，２００８）。
異なる生物における栄養感知経路と寿命調節との間の連鎖を示す広範な一連の成果にもかかわらず、加齢の過程を遅らせる原因となる重要な機序はいまだに分かりにくい。異なるモデル生物に見られてきた寿命延長と異なるストレスチャレンジに耐える能力との間の直接的な相関性は、細胞防御の活性化が重要な生存戦略を意味することを示す（Ｌｏｎｇｏ ａｎｄ Ｆａｂｒｉｚｉｏ，２００２）。我々の以前の研究は、スーパーオキサイドが加齢と加齢依存性の死亡に重要な役割を果たしていることを示唆するが、スーパーオキサイドに対する防御は、ＳＣＨ９とＲＡＳ２における突然変異の寿命に対する潜在的な効果の一部を説明するのみである（Ｆａｂｒｉｚｉｏ ｅｔ ａｌ．，２００３）。カロリー制限とＳｃｈ９，Ｔｏｒ，およびＲａｓ２の経路との間の関係、および寿命に対するＣＲ依存性効果の機序との間の関係は良く理解されていない。ここで、我々は、Ｓｃｈ９は言うに及ばずＴｏｒとＲａｓによって制御される遺伝子のセットの発現変化がグリセロール生産への代謝スイッチにつながり、それは細胞防御と寿命延長の増強をもたらすという証拠を提供する。炭素源としてグルコースまたはエタノールをグリセロールで置換することは、細胞防御と寿命延長の促進におけるカロリー制限と同様に効果的である。糖類をグリセロールで置換した食事は、また、酸化ストレスからマウスを防御したことから、炭素源置換（ＣＳＳ）は、高等真核生物におけるカロリー制限または絶食の防御効果の一部の引き金を引く可能性があることを示唆する。
結果
ＳＣＨ９とＲＡＳ２およびＴＯＲ１との間の遺伝的相互作用
遺伝的アプローチを使用して、我々は、ストレスと寿命に対する細胞防御の調節におけるＳｃｈ９，Ｔｏｒ１，およびＲａｓ２の間の関係を調べた。Ｔｏｒ１活性の欠損に起因する寿命とストレス耐性に対する効果は、Ｓｃｈ９またはＲａｓ２欠損株に見られる活性ほど強固ではない。我々は、ｓｃｈ９Δノックアウト株とｔｏｒ１Δ ｓｃｈ９Δ二重ノックアウト株との間の平均寿命またはストレス耐性の何らかの有意差を見出さなかった（図４Ａおよび４Ｇ）。対照的に、ＳＣＨ９プロモーター域にトランソポゾン挿入を有する変異株におけるＴＯＲ１の欠損は、ＳＣＨ９発現のみを減少させる（Ｆａｂｒｉｚｉｏ ｅｔ ａｌ．，２００１）が、この欠損は、熱およびスーパーオキサイド産生剤メナジオンに対する耐性の更なる増強をもたらしたが、過酸化水素に対する耐性の増強はもたらされなかった（図４Ｂ）。このことは、ＴＯＲ１がＳｃｈ９経路の更なる不活化に寄与することを示唆する。この結果は、Ｓｃｈ９がラパマイシン感受性Ｔｏｒ複合体Ｉ（ＴＯＲＣ１）の直接標的であることを示す最近の研究と一致する（Ｕｒｂａｎ ｅｔ ａｌ．，２００７）。事実、ＴＯＲＣ１成分をコードするＴＣＯ８９の欠損、またはラパマイシン処理のいずれかによってＴＯＲＣ１の活性を減少させると、熱および過酸化水素に対する細胞耐性が増強される。Ｓｃｈ９活性は、突然変異頻度の加齢依存性の増加と関連するので（Ｆａｂｒｉｚｉｏ ｅｔ ａｌ．，２００５）、我々は経時的変化の間のゲノム不安定性調節におけるＳｃｈ９とＴｏｒ１との間の相互作用を調べた。ｔｏｒ１Δ変異株は１日目と７日目の間のゲノム不安定性（ＣＡＮ１遺伝子の加齢依存性突然変異頻度で測定した）に対する感受性が野生株よりやや低い一方、ｔｏｒ１Δｓｃｈ９Δ二重変異株における突然変異頻度の変化はｓｃｈ９Δ変異株の該変化に比べ有意ではなかった（図４Ｅ）。ＴＯＲ１の過剰発現は、ｓｃｈ９Δのストレス耐性形質をやや減少させたのみであった。しかし、ｔｏｒ１Δのストレス耐性と寿命延長はＳＣＨ９の過剰発現によって消滅した（図５Ｆ）。まとめると、これらのデータは寿命調節におけるＴｏｒとＳｃｈ９との間の共有のシグナル伝達経路と一致し、Ｓｃｈ９シグナル伝達におけるＴｏｒ１の上流の役割を示唆する（図４Ｈ）。
ＴｏｒとＲａｓ／ｃＡＭＰ−ＰＫＡシグナル伝達のいずれもストレス応答性（ＳＴＲＥ）遺伝子を調節することが知られている（Ｚｕｒｉｔａ−Ｍａｒｔｉｎｅｚ ａｎｄ Ｃａｒｄｅｎａｓ，２００５）。構造的に活性なＲａｓ２（ｒａｓ２ｖａｌ１９）を異所性に発現することによってＲａｓ活性を増強させると、ｔｏｒ１Δ変異株の寿命延長とストレス耐性が逆転された（図４Ｆ）。反対に、ＲＡＳ２の欠損は、ストレス耐性に関してｔｏｒ１Δに対する相加効果をもたらすが、寿命については相加効果をもたらさなかった（図４Ｃおよび４Ｇ）ことから、Ｔｏｒ１とＲａｓ２による寿命調節の重複が示唆された。
我々は、以前にＴｏｒ１，Ｓｃｈ９，およびＲａｓ２によって調節される寿命の調節が、プロテインキナーゼＲｉｍ１５に収斂することを示した（Ｗｅｉ ｅｔ ａｌ．，２００８）。Ｒｉｍ１５は、細胞防御に関与する遺伝子を活性化するストレス応答性転写因子（ＴＦｓ）Ｍｓｎ２／４およびＧｉｓ１を正に調節する。興味深いことに、Ｒａｓ２欠損に関連するストレス耐性と寿命延長の増強は、ＳＴＲＥ結合ＴＦｓＭｓｎ２／４とＰＤＳ結合Ｇｉｓ１の両方を必要とする一方、ｓｃｈ９Δ介在性の長寿命調節は、主に後者に依存する（Ｆａｂｒｉｚｉｏ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｗｅｉ ｅｔ ａｌ．，２００８）。これらの結果は、共通の下流エフェクターがＳｃｈ９とＲａｓ２によって異なって調節されることを示す。事実、ｒａｓ２Δｓｃｈ９Δ二重ノックアウト細胞は、それぞれ単独の欠損変異株に比べてより高いストレス耐性を示した（図４Ｄ）。該二重ノックアウト細胞は、また、野生型細胞に比べ平均寿命における５倍の増加を示した（図５Ｇ）。しかし、ｓｃｈ９Δｒａｓ２Δｔｏｒ１Δ三重欠損変異株は、寿命とストレス耐性につき何らの更なる増強も示さなかった（図４Ｄおよび４Ｇ）。これらの結果は、Ｔｏｒ／Ｓｃｈ９とＲａｓによって制御されるシグナル伝達系に平行して、しかし一部は連結して構成される寿命調節ネットワークを表す（図４Ｈ）。
長寿命変異株の遺伝子発現特性
Ｔｏｒ／Ｓｃｈ９経路とＲａｓ経路の下流にある寿命延長のメディエーターを調べるため、我々は、３つの主要な長寿命変異株：ｓｃｈ９Δ，ｔｏｒ１Δおよびｒａｓ２ΔのすべてにつきＤＮＡマイクロアレイ解析を実施した。２．５日培養の長寿命変異株と野生型細胞から全ＲＮＡを抽出した。この日数は、未だ分裂しているより若い日数（１−２日目）の細胞の小さなフラクションから生ずる可能性があるノイズならびにより遅い日数（４−５日目）において正常に生ずる全般的な代謝低下とその結果としての遺伝子発現の低下のいずれも避けるために選択された（Ｆａｂｒｉｚｉｏ ａｎｄ Ｌｏｎｇｏ，２００３）。全ＲＮＡから得られたｃＲＮＡをＳ．セレビシエに存在する５８４５遺伝子の内５８４１遺伝子の検出を許容する遺伝子チップとハイブリダイズした。各遺伝子型の３つの独立集団を解析した。計８００遺伝子は、野生型細胞に対して２倍を超える発現の変化を示した。これらの中で、６３遺伝子は、３つの変異株のすべてにおいて２倍を超えて上方制御され、２５遺伝子は一貫して下方制御されていた（図５Ａ）。最も上方制御された７種のｍＲＮＡレベルおよびｔｏｒ１Δおよびｓｃｈ９Δ変異株のいずれにおいても最も下方制御された遺伝子の１種を定量的ＲＴ−ＰＣＲおよび／またはノーザンブロットにより確認した。長寿命変異株の対比較に基づき、長寿命変異株では上方および下方制御遺伝子は有意に重複しており、このことから、Ｒａｓ，Ｔｏｒ，およびＳｃｈ９を中心とする寿命調節ネットワークが下方制御遺伝子の共通のセットを制御していることが示唆された（表１）。これら３つの長寿命変異株に共通する特徴を調べるため、我々は、ウィルコキソンランクテストによるマイクロアレイデータの遺伝子オントロジー（ＧＯ）解析を行った。データは、３つの長寿命変異株すべてに共通の変化を示しているが、ＧＯカテゴリー解析は、ｒａｓ２Δ変異株および他の２変異株との間の発現パターンの相違を示した。この結果は、我々のＳｃｈ９およびＲａｓ２によって制御される２つのパラレルシグナル伝達経路の遺伝的解析と一致し、同一の寿命調節経路におけるＳｃｈ９とＴｏｒの役割と合致する（表１および図４Ｈ）（Ｗｅｉ，２００８）。
Figure 2015186480
長寿命変異株の発現特性の遺伝子オントロジー解析（ＧＯ）。有意な上方または下方制御カテゴリーを示す（ｐ＜０．０１）。多試験エラーを修正するためｑ値も算定した。
寿命延長に関連する代謝変化
長寿命変異株と野生型細胞との間の遺伝子発現特性の比較により、ＴＣＡサイクル、酸化的リン酸化、ミトコンドリアリボソームタンパク質、およびミトコンドリア標的タンパク質の機能を含むミトコンドリアタンパク質をコードする遺伝子の一貫した下方制御が示された。解糖系／発酵系遺伝子発現は代わりに上方制御されたが、糖新生遺伝子は上方制御されなかった。興味深いことに、高グルコース濃度で阻害されることが知られる（Ｏｚｃａｎ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，１９９９）高親和性グルコース輸送体または仮想のグルコース輸送体をコードする幾つかの遺伝子は、上方制御されており、長寿命変異株がグルコース取り込みが最大化される絶食様モードに入っている可能性が示された。変異株および野生型細胞では１−２日目には細胞外グルコースが枯渇していることを考慮すると、２．５日目に発酵用に使用可能な主要な基質は、おそらく後期指数増殖期にある酵母によって正常に蓄積されているグリコーゲンであろう（Ｗｅｒｎｅｒ−Ｗａｓｈｂｕｒｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９９３）。
静止期生存率、胞子形成、減数分裂およびストレス応答に関わる遺伝子（ＦＭＰ４５，ＧＲＥ１，ＩＭＥ１，ＲＰＩ１，ＳＰＳ１００，およびＴＡＨ１）は３つの長寿命変異株すべてにおいて最も上方制御された遺伝子の中にあった。長寿命変異株における寿命延長およびストレス耐性へのこれらの寄与を調べるため、われわれは、最も上方制御された遺伝子の一つと組み合わせて、ＳＣＨ９，ＲＡＳ２，またはＴＯＲ１の欠損を保有する二重変異株のセットを創出した。ＦＭＰ４５またはＹＤＬ２１８Ｗのいずれかの欠損はｓｃｈ９Δ変異株の平均寿命をやや減じた（図５Ｂ）一方、ｒａｓ２Δ変異株には効果はなかった。ＩＭＥ１またはＲＰＩ１の欠損は、Ｓｃｈ９の欠損に起因するストレス耐性または寿命延長のいずれにも影響しなかった（図５Ｂ）。最も下方制御された遺伝子ＹＬＲ０１２Ｃ欠損は、該細胞の寿命またはストレス耐性に有意に影響しなかった。
エルゴステロール生合成において機能するタンパク質をコードする幾つかの遺伝子は長寿命変異株では上方制御されていた。エルゴステロールは酵母では優勢なステロールであり、構造的にコレステロールと密接に関連する。細胞膜の構造成分であることに加え、エルゴステロールはリン脂質合成、脂質ラフト形成、シグナル伝達、および好気的なエネルギー代謝に影響する（Ｐａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。ＨＭＧ１またはＥＲＧ２８のいずれかの欠損はｓｃｈ９Δ変異株の熱および酸化ストレス耐性のいずれにも有意な減少の原因となる。しかし、われわれのマイクロアレイ解析で最も上方制御されたエルゴステロール生合成遺伝子ＥＲＧ５の欠損は、ｓｃｈ９Δ変異株と関連する寿命延長または低ストレス耐性を逆転させなかった。特に３つの長寿命変異株すべてで上方制御されたエルゴステロール生合成遺伝子は、スクワレンからエルゴステロールへの変換に関わる遺伝子であり、分子状酸素を要求し、しばしばＮＡＤＰＨからＮＡＤＰ＋への酸化に関わる。この上方制御は、これらの長寿命変異株のポスト・ダイオーキシック期生存期間中の低酸素環境を反映し、そして、細胞の酸化還元状態と生存との関連を示唆しているのかもしれない。まとめると、これらの結果は、長寿命変異株中で最も上方制御された遺伝子の中で、多くの単一遺伝子の欠損は寿命には殆ど効果がないことを示している。
長寿命変異株におけるグリセロール生合成遺伝子の高発現
ＴＣＡサイクル遺伝子および呼吸遺伝子の低発現と解糖系／発酵系遺伝子の高発現に加えて、我々は、解糖流量と限定された呼吸能の増強がある場合に、オーバーフローした代謝の副産物であるグリセロールの代謝に関与する遺伝子が上方制御されることも観察した（図６Ａおよび６Ｂ）。グルセロール代謝に関与する遺伝子（２１遺伝子）の有意な上方制御がｓｃｈ９Δおよびｒａｓ２Δ変異株に観察された（それぞれｐ値０．００５８および０．０１４２，ウィルコキソンランクテスト、片側）。酵母では、グリセロールは解糖中間物であるトリアシルグリセロールまたはジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）のいずれかから生産される（図６Ａ）。トリアシルグリセロールの加水分解を担うリパーゼをコードする遺伝子は、やや上方制御される一方、ＤＨＡＰからのグリセロール生産に要求される鍵酵素をコードしているＧＰＤ１およびＧＰＤ２は、長寿命変異株の全てにおいてより高い発現レベルを示し（図６Ｂおよび６Ｃ）、これらの変異株によって利用されるグルコースの一部はグリセロール生合成に向けられることが示唆された。
事実、３日目に野生型細胞と比較してｓｃｈ９Δ変異株では高レベルの細胞内グリセロールが観察された（図７Ａ）。野生型細胞では、細胞外グリセロールレベルは２日目にはピークに達したが、３日目までには大部分が枯渇していた。しかし、ｓｃｈ９Δ培養では、９日目までの培養液中ではるかに高いレベルのグリセロールが測定された（図７Ｂ）。対照的に、指数増殖中（たいがいはポスト ダイオーキシック期であるが）に生産されたエタノールは、ｓｃｈ９Δ変異株では初期には枯渇していたが、野生型細胞では枯渇せず（図７Ｃおよび７Ｄ）（Ｆａｂｒｉｚｉｏ ｅｔ ａｌ．，２００５）、野生型細胞におけるエタノールの生合成と遊離からｓｃｈ９Δ変異株におけるグリセロールの生合成と遊離への代謝スイッチが示唆された。グリセロール蓄積は、他の炭素源の枯渇によっても同時に起こり得た。脂肪体のナイルレッド染色により、ｓｃｈ９Δ変異株ではトリアシルグリセロールおよび他の中性脂肪のレベルが野生型細胞に比べすべての日数で一貫して低いことが示された（図７Ｅ）。このことは、脂質をグリセロールに変換する脂肪分解性酵素のｍＲＮＡレベルが、わずかではあるが一貫して増加していたことと一致する。細胞外グリセロールの蓄積は、また、ｔｏｒ１Δおよびｒａｓ２Δ変異株でも生じたが、ｓｃｈ９Δ変異株で観察されたものに比べてより低かった。
グリセロール生合成遺伝子はｓｃｈ９Δにおける寿命延長に必要である
グリセロール生合成の寿命制御における役割をさらに調べるため、我々は、ｓｃｈ９Δの背景における酵母ＤＬ−グリセロール−３−ホスファターゼＲｈｒ２を欠損する株を作製した。このｒｈｒ２Δｓｃｈ９Δ二重変異株は、グリセロールを細胞外に蓄積することができなかった（図８Ａ）。ＲＨＲ２の欠損は、ＤＢＹ７４６遺伝的背景におけるＳＣＨ９の欠損と関連する寿命延長ならびにＤＢＹ７４６遺伝的背景におけるＳＣＨ９の欠損に関連する熱および酸化ストレス耐性を破壊した（図８Ｂおよび８Ｃ）。酵母ＫＯコレクション（ＢＹ４７４１の遺伝的背景）を用いて、我々は、グリセロール生合成鍵遺伝子欠損株においてＳＣＨ９を欠損させた。ＮＡＤ依存性グリセロール−３−リン酸脱水素酵素遺伝子のＧＰＤ１またはＧＰＤ２のいずれかの欠損は野生型ＢＹ４７４１細胞における有意な寿命の変化をもたらさなかった。しかし、ＧＰＤ１またはＧＰＤ２のいずれかの欠損は、Ｓｃｈ９欠損と関連する寿命延長の逆転につながった（図８Ｄ）。同様に、ＲＨＲ２の欠損はｓｃｈ９Δ変異株の寿命延長を破壊した（図８Ｄ）。対照的に、ＤＬ−グリセロール−３−ホスファターゼの重複性イソザイムのＨｏｒ２欠損は、ｓｃｈ９Δ変異株の寿命には影響しなかった。これら２つのイソザイムの相違は、Ｒｈｒ２は細胞における優勢なイソザイムであるという事実で説明できよう（Ｎｏｒｂｅｃｋ ｅｔ ａｌ．， １９９６）。Ｒｈｒ２の主要な役割と一致して、Ｒｈｒ２のインヒビターをコードするＹＩＧ１のｍＲＮＡレベル（Ｇｒａｎａｔｈ ｅｔ ａｌ．，２００５）は長寿命変異株すべてにおいて下方制御されていた（図６Ｂ）。特に、一部のｒｈｒ２Δ培養は再増殖／ギャスピングｇａｓｐｉｎｇを示したが、ＢＹ４７４１の遺伝的背景にあるｒｈｒ２Δ変異株の寿命は、野生型細胞と同様であった（Ｆａｂｒｉｚｉｏ ｅｔ ａｌ．，２００４）。
Ｒｈｒ２およびＨｏｒ２のいずれも欠損する細胞は、スーパーオキシドアニオン生成剤パラコートに高感受性であることが示されており、浸透ストレスを超えた細胞防御におけるグリセロール生合成の役割が示唆される（Ｐａｈｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００１）。我々は、ｓｃｈ９Δ変異株のストレス耐性におけるグリセロール生合成遺伝子の役割を試験した。熱およびペルオキシド誘発酸化ストレスに対する高感受性はＲＨＲ２ヌル株に観察されたが、ＢＹ４７４１を背景とするｇｐｄ１Δ，ｇｐｄ２Δ，またはｈｏｒ２Δ変異株では観察されなかった（図８Ｅ）。さらに、Ｒｈｒ２インヒビターＹｉｇ１を欠損する細胞は、野生型細胞を少し上回るストレス耐性であった（図８Ｅ）。ｓｃｈ９Δ変異株のストレス耐性形質は、ＧＰＤ１，ＧＰＤ２，またはＲＨＲ２の欠損によって部分的に逆転した（図８Ｅ）。グリセロール生合成経路における一つの酵素の欠損が他の酵素の活性化によって代償され得るようなストレスに対するグリセロール介在性の応答の重複性があるように思われる。ＳＣＨ９の欠損は、おそらくＨｏｒ２レベルの上方制御によるｒｈｒ２Δの熱および過酸化水素に対するストレス耐性を大いに増強した。グリセロールホスファターゼ（Ｒｈｒ２およびＨｏｒ２）はグリセロール生産の律速酵素ではない（Ｐａｈｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００１）ので、Ｇｐｄ１およびＧｐｄ２の上方制御は、ＳＣＨ９欠損細胞におけるｒｈｒ２Δストレス感受性形質の救援に寄与する可能性もある。同様な重複はＧｐｄ１およびＧｐｄ２間にも存在する。どちらかの単一欠損変異株では、有るか無しかの効果であるが、ｇｐｄ１／２Δ二重ノックアウト株は熱および過酸化水素処理に高感受性である。ｓｃｈ９Δｇｐｄ１Δｇｐｄ２Δ三重変異株は液体培養において厳しい増殖欠損と低い飽和密度を示し、上位研究のためのこの変異株の使用中止を余儀なくされた。まとめると、これらの結果は、ＳＣＨ９欠損変異株における細胞防御と寿命延長の促進にグリセロール生合成が重要性であることを強調する。
グリセロール依存性寿命延長の機序
グリセロールは、部分的にその化学シャペロンとしての機能の故に、ストレスを防御できる（Ｍｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｄｅｏｃａｒｉｓ，２００６；Ｗｏｊｄａ，２００３）。グリセロールの熱誘導タンパク質ミスフォールディングに対する防御の役割を調べるため、我々は野生型細胞とｓｃｈ９Δ細胞における熱感受性の細菌ルシフェラーゼ（Ｐａｒｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９４）の活性喪失と回復を調べた。野生型細胞を熱ストレス（５５℃、１時間）に暴露させた結果、〜８０％のルシフェラーゼ活性の低下があったが、ｓｃｈ９Δ変異株では２０−４０％の活性喪失のみが観察された（図９Ａ）。この結果は、ｓｃｈ９Δ変異株のストレス耐性形質の増強と一致する（図４）。しかし、野生型細胞を低濃度のグリセロールで前処理したが、ルシフェラーゼ活性の熱誘導による喪失と回復に対する効果はなく（図９Ｂ）、ｓｃｈ９Δの熱耐性形質は細胞外グリセロールに依存しないことが示された。ＢＹ４７４１の遺伝的背景において同様な結果が得られた。
グリセロールの細胞内蓄積は浸透ストレスに対する防御にも寄与する（Ａｌｂｅｒｔｙｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｗｏｊｄａ ｅｔ ａｌ．，２００３）。培地に０．１％のグリセロールを添加した結果、野生型酵母の浸透ストレス耐性がわずかに増強された（図９Ｃ）。高濃度のＮａＣｌに暴露された場合、ｓｃｈ９Δ変異株とｒａｓ２Δ変異株は、ｔｏｒ１Δ変異株に比べ高浸透圧に対する耐性の増強を示し、同様に野生型細胞よりも優れた防御であったことから（図９Ｄ）、高浸透圧に対する耐性の増強は、すべての長寿命変異株に共有される一般的なストレス応答の一部である可能性が示唆された。これらのデータは、高浸透圧増殖条件が酵母におけるＲＬＳとＣＬＳを延長するという報告とも一致する（Ｋａｅｂｅｒｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｍｕｒａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．，２００８）。しかし、寿命に関して、長寿命ｓｃｈ９Δ変異株でグリセロール濃度が高い培養３日目（図７Ｂ）に野生型酵母に細胞外グリセロールを添加したが（０．１％および１％）、何らの有益な効果も示されなかった（図９Ｅ）。
グリセロールはカロリー制限の加齢効果に影響せずに炭素源を供給する
エタノールは炭素源としてプロエイジングシグナル伝達を誘発し、細胞死を促進する。蒸発させる、または酵母を使い古された培地から水に切り替えることのいずれかによってエタノールを除去するという極度のカロリー制限／絶食条件を提供することによって、酵母の経時的寿命が延長される（Ｆａｂｒｉｚｉｏ ｅｔ ａｌ．，２００５）。このエタノール利用とグリセロール生合成の代謝的切り換えは、プロエイジング炭素源（グルコースとエタノール）の有害な効果を除去し、ｓｃｈ９Δ変異株の培養におけるカロリー制限に似た環境を作成する（図７Ｄ）。酵母の生存における異なる炭素源の役割を解明するため、我々は、プレート上で細胞の生存をモニターするインサイツアッセイを使用した。この方法は、われわれが、ａ）他のすべての栄養の存在下で異なる炭素源の効果を調べること、ｂ）カロリー制限のＲＬＳ研究に使用される実験条件と同様な、全実験にわたり細胞が暴露される炭素源の量を正確に制御することを可能にした。
１日齢のトリプトファン栄養要求性細胞をトリプトファン欠損ＳＣプレート（ＳＣ−Ｔｒｐ）に播種した。２日毎に、同じ日に作成した一連のプレートの一つにトリプトファンを加えて増殖させ、生存をモニターした。我々は、コロニー形成をモニターして細胞の生存率を決定した。２％グルコース添加ＳＣプレートに播種した約２００個の野生型ＤＢＹ７４６細胞の生存曲線は、標準液体培地例の該曲線と良く似ている（図９Ｆ）。ＳＣ−Ｔｒｐプレートから炭素源を除去すると、平均寿命の７０％増加がもたらされたが、この増加は低濃度のエタノールの存在により部分的に逆転され（図９Ｆ）、我々の以前の知見と一致した（Ｆａｂｒｉｚｉｏ ｅｔ ａｌ．，２００５）。グルコースの高レベルグリセロール（３％）による置換はグルコースまたはエタノールで見られたようなプロエイジングの引き金を引くことはなかった（図９Ｆ）。従って、長寿命ｓｃｈ９Δ変異株におけるグリセロール生合成への代謝スイッチは遺伝的に誘発される「炭素源置換」を表し、カロリー制限の場合と同様に効果的であり得るといえよう。
グリセロール培地にスイッチ後の寿命延長はＣＲ転写因子に依存する
カロリー制限により誘発される酵母の細胞防御と寿命延長は、プロテインキナーゼＲｉｍ１５およびその下流のストレス応答性転写因子Ｍｓｎ２／４とＧｉｓ１に依存し、これらのすべてはＳｃｈ９，Ｔｏｒ，およびＲａｓにより負に調節されている（Ｗｅｉ ｅｔ ａｌ．，２００８）。酵母をグルコース（２％）またはグルコース／グリセロール（各１％）のいずれかを含有する等カロリー培地で増殖させると、グルコース／グリセロール培地中で培養した酵母において平均寿命の１．５倍の増加が観察された（図９Ｇ）。このグルコース／グリセロール食の長寿命効果はカロリー制限の場合と同様、大部分がストレス応答性転写因子に依存していた（図９Ｇ）。
グリセロールはｓｃｈ９Δ変異株によって取り込まれる
ｓｃｈ９Δ変異株における代謝スイッチは、グルコース／エタノールまたは他の炭素源からプロエイジング／死シグナル伝達を除去するだけでなく、長期間生存のための炭素源も生産する。我々は、野生型細胞をエタノール含有培地から０．１％グリセロールを含有する水に切り換えた。極度のカロリー制限によるものに加えて寿命のわずかな延長が観察され（図９Ｈ）、グリセロールが飢餓条件下で栄養補給またはさらなる防御を提供する可能性が示唆された。事実、我々は、大部分の細胞外グルコースが欠乏した後にポスト・ダイオーキシック期に入ったＳ．セレビシエが外部の［１，２，３−３Ｈ］グリセロールを活発に取り込むことを示す（図９Ｉ）。グリセロールのかかる利用は、また、野生型細胞においてグリセロールの異化に関与する遺伝子が極度のカロリー制限／絶食（水）条件下で上方制御されることを示す我々のマイクロアレイ解析により支持される。
食事性の炭素源としてのグリセロールの置換はマウスにおけるストレス耐性を増強する
カロリー制限は、酵母から哺乳類の範囲のモデル生物においてストレス耐性を増強し、寿命を延長する（Ｌｏｎｇｏ，２００３； Ｋｅｎｎｅｄｙ ｅｔ ａｌ．，２００７； Ｍａｓｏｒｏ，２００５）。グリセロールを炭素源として置換すると酵母の寿命とストレス耐性に有益な効果が見られるという観点から、我々はマウスにおけるＣＳＣの効果を調べた。１群５匹、２群のマウスにそれぞれ対照食（４０％デンプン／ショ糖／マルトースデキストリン添加固形飼料Ｔｅｋｌａｄ ８６０４）またはグリセロール食（４０％グリセロール添加）の等カロリー食のいずれかを６日間自由に与えた。グリセロール食のマウスは、対照食のマウスよりわずかに多く摂餌したが、６日目までには両群のマウスは１８％の血糖低下を示した（図１０Ａおよび１０Ｂ）。両群のマウスはその後５０ｍｇ／ｋｇのパラコートを腹腔内に１回投与され、正常食（８６０４固形飼料）に戻された。パラコートは肝細胞と肺細胞のＳ期停止をもたらし（Ｍａｔｓｕｂａｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９６）、死亡に至ることが知られている（Ｍｉｇｌｉａｃｃｉｏ ｅｔ ａｌ．，１９９９）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎａｔｕｒｅ．ｃｏｍ／ｎａｔｕｒｅ／ｊｏｕｒｎａｌ／ｖ４０２／ｎ６７５９／ｆｕｌｌ／４０２３０９ａ０．ｈｔｍｌ−ａ１。対照群のすべてのマウスは３日までに死亡したが、グリセロール食のマウス５匹の内３匹はパラコート毒性を完全に防御し（図１０Ｃ，ｐ＜０．０５）、パラコート処理５日後には正常な体重に回復した（図１０Ｄ）。これらの結果は、炭素源をグリセロールで置換した食事は、インビボの酸化ストレス耐性を増強し、高等真核生物におけるカロリー制限に似た可能性を有することを示している。
考察
酵母、虫、ハエ等のモデル生物は、共通の進化起源を有する寿命調節経路の発見のための道具である。これらの内、インスリン／ＩＧＦ−Ｉ様経路は、酵母とマウスのように系統発生学的に遠い生物の長寿命を制御している。Ａｋｔ，Ｔｏｒ，およびＲａｓは哺乳類のＩＧＦ−Ｉシグナル伝達経路で機能し、異なるモデル生物で寿命調節に関連している（Ｋｅｎｎｅｄｙ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｌｏｎｇｏ ａｎｄ Ｆｉｎｃｈ，２００３）。本研究では、我々は、長寿命調節経路が呼吸から解糖およびグリセロール生合成へのシフトを制御していることを示す。プロエイジングの炭素源とグリセロール蓄積の除去につながるこの代謝切り換えは、炭素源を除去することなしにカロリー制限に似るｓｃｈ９Δ培養の環境を作る。
遺伝的データとゲノムデータは、我々の以前の仕事に一致する、Ｓｃｈ９とＲａｓによって制御される２つの平行する長寿命シグナル伝達経路を示した（Ｆａｂｒｉｚｉｏ ｅｔ ａｌ．，２００１）。両経路の低下した活性の有益な効果は相加的であり（図４Ｄおよび４Ｇ）、ｓｃｈ９Δｒａｓ２Δ二重変異株は、最も長寿命な遺伝的変異株の一つである（Ｐａｒｔｒｉｄｇｅ ａｎｄ Ｇｅｍｓ，２００２）。遺伝的データと一致して、２．５日齢のｒａｓ２Δ変異株の遺伝子発現特性は、分別的に発現する遺伝子の約６７％が他の二つの変異株では有意に変化しないことを示す（図５Ａ）。我々のＴｏｒ経路と他の２つの寿命調節経路との間の相互作用についての遺伝的解析により、ストレス耐性、長寿命、および加齢に依存するゲノム不安定性の調節におけるＴｏｒ１経路とＳｃｈ９経路の間の強い重複が示された。他の研究者が提供してきたもの（Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００４）、およびＴＯＲＣ１によるＳｃｈ９の直接リン酸化の証明（Ｕｒｂａｎ ｅｔ ａｌ．，２００７）と一致して、ＴＯＲＣ１はＳｃｈ９の上流でこれらの読み出しの調節に機能することも示唆する。我々のマイクロアレイ解析は、ＴｏｒとＲａｓによって制御される一連の遺伝子間の類似点だけでなく相違点も示している。一方、ＴＯＲ１欠損は、ｒａｓ２Δ変異株の熱ショック耐性をさらに増強し、他方では、さらなる寿命延長は見られなかった。さらに、構造的な活発なＲａｓ２の過剰発現は、ＴＯＲ１の欠損に関連してＣＬＳ延長を破壊し、２つの経路とおそらくＴＯＲＣ１上流の役割との重複が示唆された。
ｒａｓ２Δ変異株に見られた高度の異なる発現特性にもかかわらず、３つの長寿命変異株のすべてにおいて重要な代謝経路に関わる遺伝子の発現パターンに有意な同一性がある。ゲノム規模の関連性（転写因子結合モチーフ濃縮試験）と遺伝的解析により、Ｔｏｒ／Ｓｃｈ９およびＲａｓシグナル伝達による長寿命の調節は、プロテインキナーゼＲｉｍ１５とその下流のストレス応答性転写因子Ｍｓｎ２／４およびＧｉｓ１に依存することが示された（Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｗｅｉ ｅｔ ａｌ，２００８）。最も顕著な結果は、３つの長寿命変異株すべてで解糖／発酵に関与する遺伝子が一貫して上方制御される一方、ミトコンドリアに関与する遺伝子は３つの長寿命変異株のすべてで下方制御されたことであり、解糖ならびにＴＣＡサイクルと酸化的リン酸化を含むミトコンドリア機能の減少を支持する細胞状態が示唆された。我々の結果の一部は、ｔｏｒ１Δ変異株では呼吸が上方制御されていることを示す最近の結果（Ｂｏｎａｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ，２００７）と矛盾すると思われる。この矛盾は、観察の時点が異なることによって説明が可能であろう。Ｂｏｎａｗｉｔｚと共同研究者らは、野生型酵母に関連して指数増殖期または培養１日目のｔｏｒ１Δにおいてより高い呼吸率を測定した。２日目までにはこの違いはもはや観察されなかった（Ｂｏｎａｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，２００７）。複製寿命における呼吸の役割はいまだ明らかではない。一方では、増加した呼吸はＣＲ（０．５％グルコース）の有益な効果を介在することが示されており（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， ２００２）、もう一方で、低グルコース含有培地（０．０５％グルコース）上での増殖は、呼吸欠損酵母の複製寿命を延長することができる（Ｋａｅｂｅｒｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００５ａ）。さらに、Ｊａｚｗｉｎｓｋｉのグループによる研究では呼吸が複製寿命に直接影響はしないことが示された（Ｋｉｒｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。この寿命に関する呼吸の異なる効果には、寿命研究に使用された実験系も寄与している可能性がある。複製寿命の解析は、細胞がグルコースと他の栄養に常時暴露されている実質的で豊富なＹＰＤ培地で大部分が実施されている。増殖に必要なエネルギーは主に発酵から得られる。対照的に、我々の経時的長寿命研究は、発酵が最小化される非分裂期における集団の生存率をモニターすることによって実施されている（Ｆａｂｒｉｚｉｏ ａｎｄ Ｌｏｎｇｏ，２００３）。
長寿命変異株の遺伝子発現特性は、鍵遺伝子の発現誘導にはグリセロール生合成を必要とすること示した。ｓｃｈ９Δ培養において高レベルの細胞外および細胞内グリセロールが検出され、トリクリセリドの異化がグリセロール産生に寄与すると思われた（図７）。このグリセロール産生へのシフトは、長寿命変異株の生理機能における基礎的な代謝変化を表す。興味深いことに、Ｓｉｒ２ならびにもう一つのＣＲに依存し、および依存しない寿命調節関連の遺伝子を欠損する変異株（Ｋａｅｂｅｒｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００５ａ；Ｋａｅｂｅｒｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０００）は、プロエイジング炭素源エタノールも枯渇している（Ｆａｂｒｉｚｉｏ ｅｔ ａｌ，２００５）。ｓｃｈ９Δ変異株の様なｓｉｒ２Δ変異株の発現特性解析は、グリセロール生合成遺伝子の上方制御を示し、Ｓｉｒ２依存性の寿命調節におけるグリセロール生合成の役割が示唆された（Ｆａｂｒｉｚｉｏ ｅｔ ａｌ．，２００５）。
ｓｃｈ９Δ変異株におけるグリセロール生合成に必要な遺伝子を欠損させることによってなされる遺伝的解析は、グリセロールの生産が寿命の調節とストレス耐性に必要であることを示している（図８）。グリセロール生合成の増加は、幾つかの明瞭な機序による寿命調節に寄与する可能性がある。第一に、Ｓｃｈ９を欠損する細胞は、グルコースとエタノールを利用し、非プロエイジング炭素源であるグリセロールを蓄積し、蓄積されたグリセロールは効率的に“自ら課した”ＣＳＳをもたらし、増殖培地中のグルコースを低下させ、またはエタノールを除去することによって得られるＣＲは、酵母のＣＬＳを延長する（Ｆａｂｒｉｚｉｏ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｗｅｉ ｅｔ ａｌ．，２００８）。反対に、低濃度のエタノールを添加することにより、ＣＲまたはＳＣＨ９欠損により誘発された寿命延長は逆転させられる（Ｆａｂｒｉｚｉｏ ｅｔ ａｌ．，２００５）。ここに、我々は、Ｓｃｈ９を欠損する細胞はプロエイジング炭素源を枯渇し、グリセロール生合成を活性化することを示す。グルコースおよびエタノールのようには加齢を促進しない“ファントム炭素源”として活動することに加え、グリセロールはマイナーではあるが更に絶食状態下にある細胞の生存を増強する原因となったことから、グリセロールは栄養的な支援を与えることが示唆され、このことは非分裂細胞によるグリセロールの取り込みから確認された（図９Ｈおよび９Ｉ）。二番目に、グリセロールが浸透ストレス耐性を増強し、新規合成または熱不活化タンパク質を安定化し／復元する分子シャペロンとして機能することから、グリセロールの生産と蓄積は、細胞の防御に寄与する可能性がある。三番目に、グリセロールの生産は、ＮＡＤ：ＮＡＤＨ比率の維持に寄与することから、本生産は細胞の酸化還元平衡調節によって加齢に影響する可能性がある（Ａｎｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｂａｋｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｒｉｇｏｕｌｅｔ ｅｔ ａｌ．，２００４）。Ｅａｓｌｏｎらは、最近、マレイン酸−アスパラギン酸ＮＡＤＨシャトル構成成分の過剰発現が酵母の複製寿命を延長すること示している（Ｅａｓｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００８）。しかし、後者の２つの機序は長寿の増強に有意に寄与する可能性は低い。何故なら、培養物への外部グリセロールの添加は熱誘導タンパク質不活化（図９Ｂ）または野生型細胞の経時的生存率（図９Ｅ）に対する効果が少ないか、何らの効果もないのである。加えて、我々は、野生型細胞に細菌ＮＡＤＨオキシダーゼ（ＮＯＸ）または代替性オキシダーゼ（ＡＯＸ）を過剰発現させたが、酵母における両方のＮＡＤＨ酸化の増加（Ｖｅｍｕｒｉ ｅｔ ａｌ．，２００７）は該細胞の寿命を有意に変えなかった。
我々のマウスにおける結果は、食事におけるグルコースを中心とする炭水化物の一部のグリセロール置換は、血糖濃度の低下と致死量のパラコート投与に対するマウスの耐性の増加に十分であることを示す。ゆえに、酵母において観察される自己生産ＣＳＳは、食事中のグルコースの他の炭素源による置換が哺乳動物へ応用可能であることを示唆する。加齢経路の保存と広範な種の寿命延長におけるカロリー制限の役割の観点から、高等真核生物においてグリセロールが抗加齢の役割を果たす可能性をさらに調べることが重要であろう。
実験手順
酵母株と増殖条件
ＤＮＡマイクロアレイ解析に使用されたすべての株は、前述の一段階遺伝子置換によるＤＢＹ７４６に由来する（ＭＡＴα，ｌｅｕ２−３，１１２，ｈｉｓ３Δ，ｔｒｐ１−２８９，ｕｒａ３−５２，ＧＡＬ＋）（Ｂｒａｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。二重欠損変異株をＤＢＹ７４６およびＢＹ４７４１に作製した（ＭＡＴα，ｈｉｓ３Δ１，ｌｅｕ２Δ０，ｍｅｔ１５Δ０，ｕｒａ３Δ０）。ＳＣＨ９，またはｒａｓ２ｖａｌ１９を過剰発現する株はＤＢＹ７４６をプラスミドｐＨＡ−ＳＣＨ９（テキサス大学医学部Ｍｏｒａｎｏ博士から寄贈）またはｐＭＷ１０１（ｐＭＦ１００のＣｌａ Ｉ−ｒａｓ２ｖａｌ１９−Ｈｉｎｄ ＩＩＩフラグメントを保有するプラスミドＲＳ４１６）でそれぞれ形質転換して作製した。熱感受性細菌ルシフェラーゼを発現する株（Ｐａｒｓｅｌｌ，１９９４）は酵母をプラスミドｐＧＰＤ−ｌｕｘＡＢ（Ａｄｄｇｅｎｅ．ｃｏｍ）を保有する形質転換酵母により作製した。酵母の経時的寿命は、前述の如く測定した（Ｆａｂｒｉｚｉｏ ａｎｄ Ｌｏｎｇｏ，２００３）。簡潔には、酵母を２％グルコース含有ＳＤＣで増殖させ、前述の如くアミノ酸、アデニン、およびウラシルを添加した（Ｆａｂｒｉｚｉｏ ａｎｄ Ｌｏｎｇｏ，２００３）。酵母の生存率は４８時間毎にコロニー形成ユニット（ＣＦＵ）をモニターして測定した。３日目のＣＦＵ数は、最初の生存率（１００％）と考えられ、日齢依存性の致死率を決定するために使用した。プレート上の生存率アッセイ用に、トリプトファン栄養要求性株の１日目のＳＤＣ培養液を希釈し、炭素源のない、またはグルコース（２％）またはグリセロール（３％）を添加したＳＣ−Ｔｒｐプレート（約２００細胞／プレート）に播種した。実験期間中プレートを３０℃でインキュベートした。２日毎に２ｍｇ／ｍｌのトリプトファン０．５ｍｌをプレートに加えた。グルコースを含有しないプレートにはトリプトファンに加えて１ｍｌの５％グルコースを加えた。３０℃でのインキュベーション２−３日後にコロニー形成をモニターした。
ＤＮＡマイクロアレイ解析とデータ処理
２．５日目の野生型酵母および変異株の培養液（ｎ＝３）を回収し、酸フェノール法により全ＲＮＡを抽出した。該ｃＲＮＡをＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｙｅａｓｔ ２．０ ａｒｒａｙにハイブリダイズして、遺伝子発現測定値を得た。Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ Ａｆｆｙ Ｐａｃｋａｇｅをマイクロアレイデータ（Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）の処理に採用した。“不変集合”アプローチをプローブレベルでの正規化に使用し、“モデルベース”法を用いて要約し、各プローブセットについての発現を得た（Ｌｉ ａｎｄ Ｈｏｎｇ，２００１）。遺伝子レベルでピアソン相関係数０．９６を超える高い一致が同一株からのレプリケート間で得られた。
ＧＯ解析
遺伝子オントロジーＧＯ（ウェブサイトｇｅｎｏｍｅ−ｆｔｐ．ｓｔａｎｆｏｒｄ，ｅｄｕ／ｐｕｂ／ｇｏ／ｏｎｔｏｌｏｇｙ／を参照）データは各ノードが特異的なアノテーションを持つ遺伝子の集合に対応した有向非巡回グラフ（ＤＡＧ）として構築された。我々の解析では、良くアノテートされ、統計解析に十分な数の遺伝子（３０遺伝子以上）を含むＧＯカテゴリーのみが含まれており、末端の有益なＧＯ（ＴＩＧＯ）カテゴリーとして定義された：４４の細胞成分、５３の分子機能、および１０９の生物学的過程。ＴＩＧＯカテゴリーが有意に上方または下方制御されているかどうかを調べるため、ウィルコキソンランクテストを実施した。最終的に、“ｑ値”パッケージを用いて複数の試験誤差を訂正するために各試験のｑ値を計算した（Ｓｔｏｒｎｅｙ ａｎｄ Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ，２００３）。
ストレス耐性アッセイ
熱ショック耐性は、３日目のポストオーキシック培養から取り出した細胞の段階希釈液をＹＰＤプレート上に播種し、５５℃（熱ショック）および３０℃（対照）で６０−１５０分インキュベートして測定した。熱ショック後、プレートを３０℃に戻し、２−３日インキュベートした。酸化ストレスアッセイについては、３日目の細胞をｐＨ６のリン酸カリウム緩衝液でＯＤ６００＝１に希釈し、１００−２００ｍＭの過酸化水素で６０分処理した。もう一つの方法として、細胞をｐＨ７．４のリン酸カリウム緩衝液中２５０μＭのメナジオンで３０分処理した。対照細胞または処理細胞を段階希釈して、ＹＰＤプレート上に播種し、３０℃で２−３日インキュベートした。浸透ストレス耐性については、３日目の細胞を水で２回洗浄し、塩緩衝液（２または４ＭのＮａＣｌ）中に再懸濁した。３０℃、２４時間振とうしながらインキュベート後、細胞を水で洗浄して塩を除去し、段階的に希釈してから、ＹＰＤプレート上に播種した。プレートを３０℃で２−３日インキュベートした。
ナイルレッド染色
細胞（１ｍｌＳＤＣ培養）をＰＢＳで１回洗浄し、１ｍｌＰＢＳ中に再懸濁した。１０μｌのナイルレッド（アセトン中０．１ｍｇ／ｍｌ）を細胞懸濁液に加え、室温、暗闇で５分インキュベートした。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、ライカ蛍光顕微鏡でイメージングした。
グリセロール測定
細胞内グリセロール量用に、細胞を水で３回洗浄した。１ｍｌ培養物からの細胞ペレットを０．５ｍｌのトリス緩衝液（０．１Ｍ，ｐＨ７．４）に再懸濁し、細胞片を除去するためにその後５分煮沸し、次いで３０秒スピンした。細胞抽出液または細胞を取り除いた培地からの上澄みをそれぞれ細胞内または細胞外グリセロール濃度の測定に用いた。グリセロール濃度は、ＵＶベースのグリセロールアッセイキット（ベーリンガー・マンハイム社／Ｒ−バイオファーム社）を用いて測定した。該アッセイを９６穴プレートフォーマットに導入するために、該製造業者が推奨するプロトコルを修飾した。各サンプルは二つの組でアッセイし、データをストックグリセロールの段階希釈により作成した標準曲線に適合させた。
ルシフェラーゼアッセイ
ルシフェラーゼの熱不活性化を前述のように測定した（Ｐａｒｓｅｌｌ， １９９４）。簡潔には、熱感受性細菌ルシフェラーゼを発現する酵母を熱ショック（４２℃、６０分）にかけた。熱ショック終了１０分前にシクロヘキシミド（最終２０μＭ）を培養液に加えた。この培養液をサンプル採取し、ルシフェラーゼ基質デカノール（シグマ社）と混合し、シグナルをルミノメーター（Ｌｕｍｉｎｏｓｋａｎ Ａｓｃｅｎｔ，サーモサイエンティフィック社）中で迅速に測定した。
マウスにおけるパラコート毒性
体重１８−２４ｇの６週齢Ａ／Ｊマウスに２種の食事、対照食（４０％デンプン／ショ糖／マルトースデキストリンを添加したＴｅｋｌａｄ ８６０４固型試料）またはグリセロール食（４０％グリセロールを添加したＴｅｋｌａｄ ８６０４固型試料）を６日与えた。Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｘｔｒａ 試験紙（アボットラボラトリーズ社）を用いて血糖レベルを測定した。パラコート（リン酸緩衝食塩水中７．５ｍｇ／ｍｌ）を腹腔内に１回注入した（５０ｍｇ／ｋｇ）。パラコート投与後速やかにマウスを正常食（Ｄｉｅｔ ８６０４， ハーランテクラッド社）で維持した。４日間、２時間毎にマウスをモニターし、実験期間中１日１回体重を記録した。ストレスまたは痛みの徴候を示した場合および回復のチャンスがないと判断した場合にはマウスを屠殺した。
文献
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Ｅａｓｌｏｎ， Ｅ．， Ｔｓａｎｇ， Ｆ．， Ｓｋｉｎｎｅｒ， Ｃ， Ｗａｎｇ， Ｃ， ａｎｄ Ｌｉｎ， Ｓ．Ｊ． （２００８）． Ｔｈｅ ｍａｌａｔｅ−ａｓｐａｒｔａｔｅ ＮＡＤＨ ｓｈｕｔｔｌｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ａｒｅ ｎｏｖｅｌ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｌｏｎｇｅｖｉｔｙ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｃａｌｏｒｉｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｌｉｆｅ ｓｐａｎ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｉｎ ｙｅａｓｔ． Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ２２， ９３１−９４４．
Ｆａｂｒｉｚｉｏ， Ｐ．， Ｂａｔｔｉｓｔｅｌｌａ， Ｌ．， Ｖａｒｄａｖａｓ， Ｒ．， Ｇａｔｔａｚｚｏ， Ｃ， Ｌｉｏｕ， Ｌ．Ｌ．， Ｄｉａｓｐｒｏ， Ａ．， Ｄｏｓｓｅｎ， Ｊ．Ｗ．， Ｇｒａｌｌａ， Ｅ． Ｂ．， ａｎｄ Ｌｏｎｇｏ， Ｖ．Ｄ． （２００４）． Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｉｓ ａ ｍｅｄｉａｔｏｒ ｏｆ ａｎ ａｌｔｒｕｉｓｔｉｃ ａｇｉｎｇ ｐｒｏｇｒａｍ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ． Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １６６， １０５５−１０６７．
Ｆａｂｒｉｚｉｏ， Ｐ．， Ｇａｔｔａｚｚｏ， Ｃ， Ｂａｔｔｉｓｔｅｌｌａ， Ｌ．， Ｗｅｉ， Ｍ．， Ｃｈｅｎｇ， Ｃ， ＭｃＧｒｅｗ， Ｋ．， ａｎｄ Ｌｏｎｇｏ， Ｖ．Ｄ． （２００５）． Ｓｉｒ２ ｂｌｏｃｋｓ ｅｘｔｒｅｍｅ ｌｉｆｅ−ｓｐａｎ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ． Ｃｅｌｌ １２３， ６５５−６６７．
Ｆａｂｒｉｚｉｏ， Ｐ．， Ｌｉｏｕ， Ｌ．Ｌ．， Ｍｏｙ， Ｖ．Ｎ．， Ｄｉａｓｐｒｏ， Ａ．， Ｖａｌｅｎｔｉｎｅ， Ｊ．Ｓ．， Ｇｒａｌｌａ， Ｅ．Ｂ．， ａｎｄ Ｌｏｎｇｏ， Ｖ．Ｄ． （２００３）． ＳＯＤ２ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｏｆ Ｓｃｈ９ ｔｏ ｅｘｔｅｎｄ ｌｏｎｇｅｖｉｔｙ ｉｎ ｙｅａｓｔ． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６３， ３５−４６．
Ｆａｂｒｉｚｉｏ， Ｐ．， ａｎｄ Ｌｏｎｇｏ， Ｖ．Ｄ． （２００３）． Ｔｈｅ ｃｈｒｏｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｌｉｆｅ ｓｐａｎ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ． Ａｇｉｎｇ Ｃｅｌｌ ２， ７３−８１．
Ｆａｂｒｉｚｉｏ， Ｐ．， Ｐｏｚｚａ， Ｆ．， Ｐｌｅｔｃｈｅｒ， Ｓ． Ｄ．，Ｇｅｎｄｒｏｎ， Ｃ．Ｍ．， ａｎｄ Ｌｏｎｇｏ， Ｖ．Ｄ． （２００１）． Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｏｎｇｅｖｉｔｙ ａｎｄ ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｂｙ Ｓｃｈ９ ｉｎ ｙｅａｓｔ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２， ２８８−２９０．
Ｇｒａｎａｔｈ， Ｋ．， Ｍｏｄｉｇ， Ｔ．， Ｆｏｒｓｍａｒｋ， Ａ．， Ａｄｌｅｒ， Ｌ．， ａｎｄ Ｌｉｄｅｎ， Ｇ． （２００５）． Ｔｈｅ ＹＩＧ１ （ＹＰＬ２０１ｃ） ｅｎｃｏｄｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ． Ｙｅａｓｔ ２２， １２５７−１２６８．
Ｇｒａｙ， Ｊ． Ｖ．， Ｐｅｔｓｋｏ， Ｇ．Ａ．， Ｊｏｈｎｓｔｏｎ， Ｇ．Ｃ．， Ｒｉｎｇｅ， Ｄ．， Ｓｉｎｇｅｒ， Ｒ．Ａ．， ａｎｄ Ｗｅｒｎｅｒ−Ｗａｓｈｂｕｒｎｅ， Ｍ． （２００４）， “Ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙ”： ｑｕｉｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｒｅｖ ６８， １８７−２０６．
Ｈａｎｓｅｎ， Ｍ．， Ｔａｕｂｅｒｔ， Ｓ．， Ｃｒａｗｆｏｒｄ， Ｄ．， Ｌｉｂｉｎａ， Ｎ．， Ｌｅｅ， Ｓ．Ｊ．， ａｎｄ Ｋｅｎｙｏｎ， Ｃ． （２００７）． Ｌｉｆｅｓｐａｎ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｂｙ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｔｈａｔ ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ． Ａｇｉｎｇ Ｃｅｌｌ ６， ９５−１１０．
Ｈｏｌｚｅｎｂｅｒｇｅｒ， Ｍ． （２００４）． Ｔｈｅ ＧＨ／ＩＧＦ−Ｉ ａｘｉｓ ａｎｄ ｌｏｎｇｅｖｉｔｙ． Ｅｕｒ Ｊ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ １５１ Ｓｕｐｐｌ １， Ｓ２３−２７．
Ｊｉａ， Ｋ．， Ｃｈｅｎ， Ｄ．， ａｎｄ Ｒｉｄｄｌｅ， Ｄ．Ｌ． （２００４）． Ｔｈｅ ＴＯＲ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎｔｅｒａｃｔｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｉｎｓｕｌｉｎ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ｔｏ ｒｅｇｕｌａｔｅ Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ ｌａｒｖａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ ｌｉｆｅ ｓｐａｎ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３１， ３８９７−３９０６．
Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ， Ｐ．， Ｒｕｐｅｓ， Ｌ， Ｓｈａｒｏｍ， Ｊ．Ｒ．， Ｓｃｈｎｅｐｅｒ， Ｌ．， Ｂｒｏａｃｈ， Ｊ．Ｒ．， ａｎｄ Ｔｙｅｒｓ， Ｍ． （２００４）． Ａ ｄｙｎａｍｉｃ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｎｅｔｗｏｒｋ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｅｓ ｇｒｏｗｔｈ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔｏ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｃｅｌｌ ｓｉｚｅ． Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １８， ２４９１−２５０５．
Ｋａｅｂｅｒｌｅｉｎ， Ｍ．， Ａｎｄａｌｉｓ， Ａ．Ａ．， Ｆｉｎｋ， Ｇ．Ｒ．， ａｎｄ Ｇｕａｒｅｎｔｅ， Ｌ． （２００２）． Ｈｉｇｈ ｏｓｍｏｌａｒｉｔｙ ｅｘｔｅｎｄｓ ｌｉｆｅ ｓｐａｎ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｂｙ ａ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｃａｌｏｒｉｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２２， ８０５６−８０６６．
Ｋａｅｂｅｒｌｅｉｎ， Ｍ．， Ｈｕ， Ｄ．， Ｋｅｒｒ， Ｅ．Ｏ．， Ｔｓｕｃｈｉｙａ， Ｍ．， Ｗｅｓｔｍａｎ， Ｅ．Ａ．， Ｄａｎｇ， Ｎ．， Ｆｉｅｌｄｓ， Ｓ．， ａｎｄ Ｋｅｎｎｅｄｙ， Ｂ． Ｋ． （２００５ａ）． Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｌｉｆｅ ｓｐａｎ ｄｕｅ ｔｏ ｃａｌｏｒｉｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｉｎ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｙｅａｓｔ． ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ １， ｅ６９．
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Ｋａｅｂｅｒｌｅｉｎ， Ｍ．， ＭｃＶｅｙ， Ｍ．， ａｎｄ Ｇｕａｒｅｎｔｅ， Ｌ． （１９９９）． Ｔｈｅ ＳＩＲ２／３／４ ｃｏｍｐｌｅｘ ａｎｄ ＳＩＲ２ ａｌｏｎｅ ｐｒｏｍｏｔｅ ｌｏｎｇｅｖｉｔｙ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｂｙ ｔｗｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ． Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １３， ２５７０−２５８０．
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Ｋａｐａｈｉ， Ｐ．， Ｚｉｄ， Ｂ．Ｍ．， Ｈａｒｐｅｒ， Ｔ．， Ｋｏｓｌｏｖｅｒ， Ｄ．， Ｓａｐｉｎ， Ｖ．， ａｎｄ Ｂｅｎｚｅｒ， Ｓ． （２００４）． Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｆｅｓｐａｎ ｉｎ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｂｙ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ＴＯＲ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ． Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ １４， ８８５−８９０．
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Ｌｉｎ， Ｓ．Ｊ．， Ｋａｅｂｅｒｌｅｉｎ， Ｍ．， Ａｎｄａｌｉｓ， Ａ．Ａ．， Ｓｔｕｒｔｚ， Ｌ．Ａ．， Ｄｅｆｏｓｓｅｚ， Ｐ．Ａ．， Ｃｕｌｏｔｔａ， Ｖ． Ｃ， Ｆｉｎｋ， Ｇ．Ｒ．， ａｎｄ Ｇｕａｒｅｎｔｅ， Ｌ． （２００２）． Ｃａｌｏｒｉｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｘｔｅｎｄｓ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｌｉｆｅｓｐａｎ ｂｙ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ． Ｎａｔｕｒｅ ４１８， ３４４−３４８．
Ｌｏｅｗｉｔｈ， Ｒ．， Ｊａｃｉｎｔｏ， Ｅ．， Ｗｕｌｌｓｃｈｌｅｇｅｒ， Ｓ．， Ｌｏｒｂｅｒｇ， Ａ．， Ｃｒｅｓｐｏ， Ｊ．Ｌ．， Ｂｏｎｅｎｆａｎｔ， Ｄ．， Ｏｐｐｌｉｇｅｒ， Ｗ．， Ｊｅｎｏｅ， Ｐ．， ａｎｄ Ｈａｌｌ， Ｍ．Ｎ． （２００２）． Ｔｗｏ ＴＯＲ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ， ｏｎｌｙ ｏｎｅ ｏｆ ｗｈｉｃｈ ｉｓ ｒａｐａｍｙｃｉｎ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ， ｈａｖｅ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｒｏｌｅｓ ｉｎ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ｃｏｎｔｒｏｌ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ １０， ４５７−４６８．
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Ｌｏｎｇｏ， Ｖ．Ｄ．， ａｎｄ Ｆｉｎｃｈ， Ｃ．Ｅ． （２００３）． Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｍｅｄｉｃｉｎｅ： ｆｒｏｍ ｄｗａｒｆ ｍｏｄｅｌ ｓｙｓｔｅｍｓ ｔｏ ｈｅａｌｔｈｙ ｃｅｎｔｅｎａｒｉａｎｓ？ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９９， １３４２−１３４６．
Ｍａｓｏｒｏ， Ｅ．Ｊ． （２００５）． Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｃａｌｏｒｉｃ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ａｎｄ ａｇｅｉｎｇ． Ｍｅｃｈ Ａｇｅｉｎｇ Ｄｅｖ １２６， ９１３−９２２．
Ｍａｔｓｕｂａｒａ， Ｍ．， Ｙａｍａｇａｍｉ， Ｋ．， Ｋｉｔａｚａｗａ， Ｙ．， Ｋａｗａｍｏｔｏ， Ｋ．， ａｎｄ Ｔａｎａｋａ， Ｔ． （１９９６）． Ｐａｒａｑｕａｔ ｃａｕｓｅｓ Ｓ−ｐｈａｓｅ ａｒｒｅｓｔ ｏｆ ｒａｔ ｌｉｖｅｒ ａｎｄ ｌｕｎｇ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｖｏ． Ａｒｃｈ Ｔｏｘｉｃｏｌ ７０， ５１４−５１８．
Ｍｅｎｇ， Ｆ．， Ｐａｒｋ， Ｙ．， ａｎｄ Ｚｈｏｕ， Ｈ． （２００１）． Ｒｏｌｅ ｏｆ ｐｒｏｌｉｎｅ， ｇｌｙｃｅｒｏｌ， ａｎｄ ｈｅｐａｒｉｎ ａｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｌｄｉｎｇ ａｉｄｓ ｄｕｒｉｎｇ ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ ｏｆ ｒａｂｂｉｔ ｍｕｓｃｌｅ ｃｒｅａｔｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ． Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ３３， ７０１−７０９．
Ｍｉｇｌｉａｃｃｉｏ， Ｅ．， Ｇｉｏｒｇｉｏ， Ｍ．， Ｍｅｌｅ， Ｓ．， Ｐｅｌｉｃｃｉ， Ｇ．， Ｒｅｂｏｌｄｉ， Ｐ．， Ｐａｎｄｏｌｆｉ， Ｐ．Ｐ．， Ｌａｎｆｒａｎｃｏｎｅ， Ｌ．， ａｎｄ Ｐｅｌｉｃｃｉ， Ｐ． Ｇ． （１９９９）． Ｔｈｅ ｐ６６ｓｈｃ ａｄａｐｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｎｄ ｌｉｆｅ ｓｐａｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｓ． Ｎａｔｕｒｅ ４０２， ３０９−３１３．
Ｍｏｒｔｉｍｅｒ， Ｒ．Ｋ．， ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｔｏｎ， Ｊ．Ｒ． （１９５９）． Ｌｉｆｅ ｓｐａｎ ｏｆ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｙｅａｓｔ ｃｅｌｌｓ． Ｎａｔｕｒｅ １８３， １７５１−１７５２．
Ｍｕｒａｋａｍｉ， Ｃ．Ｊ．， Ｂｕｒｔｎｅｒ， Ｃ． Ｒ．， Ｋｅｎｎｅｄｙ， Ｂ．Ｋ．， ａｎｄ Ｋａｅｂｅｒｌｅｉｎ， Ｍ． （２００８）． Ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｙｅａｓｔ ｃｈｒｏｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｌｉｆｅ ｓｐａｎ． Ｊ Ｇｅｒｏｎｔｏｌ Ａ Ｂｉｏｌ Ｓｃｉ Ｍｅｄ Ｓｃｉ ６３， １１３−１２１．
Ｎｏｒｂｅｃｋ， Ｊ．， Ｐａｈｌｍａｎ， Ａ．Ｋ．， Ａｋｈｔａｒ， Ｎ．， Ｂｌｏｍｂｅｒｇ， Ａ．， ａｎｄ Ａｄｌｅｒ， Ｌ． （１９９６）． Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｗｏ ｉｓｏｅｎｚｙｍｅｓ ｏｆ ＤＬ−ｇｌｙｃｅｒｏｌ− ３−ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｆｒｏｍ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ＧＰＰｌ ａｎｄ ＧＰＰ２ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｏｓｍｏｔｉｃ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｐｐ２ｐ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ｏｓｍｏｓｅｎｓｉｎｇ ｍｉｔｏｇｅｎ− ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７１， １３８７５−１３８８１．
Ｏｚｃａｎ， Ｓ．， ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｔｏｎ， Ｍ． （１９９９）． Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｙｅａｓｔ ｈｅｘｏｓｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｒｅｖ ６３， ５５４−５６９．
Ｐａｈｌｍａｎ， Ａ．Ｋ．， Ｇｒａｎａｔｈ， Ｋ．， Ａｎｓｅｌｌ， Ｒ．， Ｈｏｈｍａｎｎ， Ｓ．， ａｎｄ Ａｄｌｅｒ， Ｌ． （２００１）． Ｔｈｅ ｙｅａｓｔ ｇｌｙｃｅｒｏｌ ３−ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｓ Ｇｐｐｌｐ ａｎｄ Ｇｐｐ２ｐ ａｒｅ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｏｓｍｏｔｉｃ， ａｎａｅｒｏｂｉｃ， ａｎｄ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６， ３５５５−３５６３．
Ｐａｒａｄｉｓ， Ｓ．， Ａｉｌｉｏｎ， Ｍ．， Ｔｏｋｅｒ， Ａ．， Ｔｈｏｍａｓ， Ｊ．Ｈ．， ａｎｄ Ｒｕｖｋｕｎ， Ｇ． （１９９９）． Ａ ＰＤＫ１ ｈｏｍｏｌｏｇ ｉｓ ｎｅｃｅｓｓａｒｙ ａｎｄ ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｏ ｔｒａｎｓｄｕｃｅ ＡＧＥ−１ ＰＩ３ ｋｉｎａｓｅ ｓｉｇｎａｌｓ ｔｈａｔ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｄｉａｐａｕｓｅ ｉｎ Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ． Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １３， １４３８−１４５２．
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Ｐａｒｓｅｌｌ， Ｄ．Ａ．， Ｋｏｗａｌ， Ａ．Ｓ．， Ｓｉｎｇｅｒ， Ｍ．Ａ．， ａｎｄ Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ， Ｓ． （１９９４）． Ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｉｓａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｈｅａｔ−ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｈｓｐ１０４． Ｎａｔｕｒｅ ３７２， ４７５−４７８．
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Ｐｏｗｅｒｓ， Ｒ． Ｗ．， ３ｒｄ， Ｋａｅｂｅｒｌｅｉｎ， Ｍ．， Ｃａｌｄｗｅｌｌ， Ｓ．Ｄ．， Ｋｅｎｎｅｄｙ， Ｂ．Ｋ．， ａｎｄ Ｆｉｅｌｄｓ， Ｓ． （２００６）． Ｅ ｘｔｅｎｓｉｏｎ ｏｆ ｃｈｒｏｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｌｉｆｅ ｓｐａｎ ｉｎ ｙｅａｓｔ ｂｙ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ＴＯＲ ｐａｔｈｗａｙ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ． Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ２０， １７４−１８４．
Ｒｉｇｏｕｌｅｔ， Ｍ．， Ａｇｕｉｌａｎｉｕ， Ｈ．， Ａｖｅｒｅｔ， Ｎ．， Ｂｕｎｏｕｓｔ， Ｏ．， Ｃａｍｏｕｇｒａｎｄ， Ｎ．， Ｇｒａｎｄｉｅｒ−Ｖａｚｅｉｌｌｅ， Ｘ．， Ｌａｒｓｓｏｎ， Ｃ， Ｐａｈｌｍａｎ， Ｉ．Ｌ．， Ｍａｎｏｎ， Ｓ．， ａｎｄ Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ， Ｌ． （２００４）． Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ＮＡＤＨ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ ｔｈｅ ｙｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２５６− ２５７， ７３−８１．
Ｓｍｉｔｈ， Ｄ．Ｌ．， Ｊｒ．， ＭｃＣｌｕｒｅ， Ｊ．Ｍ．， Ｍａｔｅｃｉｃ， Ｍ．， ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ， Ｊ．Ｓ． （２００７）． Ｃａｌｏｒｉｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｘｔｅｎｄｓ ｔｈｅ ｃｈｒｏｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｌｉｆｅｓｐａｎ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｉｒｔｕｉｎｓ． Ａｇｉｎｇ Ｃｅｌｌ ６， ６４９−６６２．
Ｓｔｏｒｅｙ， Ｊ．Ｄ．， ａｎｄ Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ， Ｒ． （２００３）． Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｆｏｒ ｇｅｎｏｍｅｗｉｄｅ ｓｔｕｄｉｅｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １００， ９４４０−９４４５．
Ｕｒｂａｎ， Ｊ．， Ｓｏｕｌａｒｄ， Ａ．， Ｈｕｂｅｒ， Ａ．， Ｌｉｐｐｍａｎ， Ｓ．， Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ， Ｄ．， Ｄｅｌｏｃｈｅ， Ｏ．， Ｗａｎｋｅ， Ｖ．， Ａｎｒａｔｈｅｒ， Ｄ．， Ａｍｍｅｒｅｒ， Ｇ．， Ｒｉｅｚｍａｎ， Ｈ．， ｅｔ ａｌ． （２００７）． Ｓｃｈ９ ｉｓ ａ ｍａｊｏｒ ｔａｒｇｅｔ ｏｆ ＴＯＲＣ１ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ２６， ６６３−６７４．
Ｖｅｌｌａｉ， Ｔ．， Ｔａｋａｃｓ−Ｖｅｌｌａｉ， Ｋ．， Ｚｈａｎｇ， Ｙ．， Ｋｏｖａｃｓ， Ａ．Ｌ．， Ｏｒｏｓｚ， Ｌ．， ａｎｄ Ｍｕｌｌｅｒ， Ｆ． （２００３）． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ： ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ＴＯＲ ｋｉｎａｓｅ ｏｎ ｌｉｆｅｓｐａｎ ｉｎ Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ． Ｎａｔｕｒｅ ４２６， ６２０．
Ｖｅｍｕｒｉ， Ｇ．Ｎ．， Ｅｉｔｅｍａｎ， Ｍ．Ａ．， ＭｃＥｗｅｎ， Ｊ．Ｅ．， Ｏｌｓｓｏｎ， Ｌ．， ａｎｄ Ｎｉｅｌｓｅｎ， Ｊ． （２００７）． Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ＮＡＤＨ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｒｅｄｕｃｅｓ ｏｖｅｒｆｌｏｗ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０４， ２４０２−２４０７．
Ｗｅｉ， Ｍ．， Ｆａｂｒｉｚｉｏ， Ｐ．， Ｈｕ， Ｊ．， Ｇｅ， Ｈ．， Ｃｈｅｎｇ， Ｃ， Ｌｉ， Ｌ．， ａｎｄ Ｌｏｎｇｏ， Ｖ．Ｄ． （２００８）． Ｌｉｆｅ ｓｐａｎ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｂｙ ｃａｌｏｒｉｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｄｅｐｅｎｄｓ ｏｎ Ｒｉｍ１５ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｏｆ Ｒａｓ／ＰＫＡ， Ｔｏｒ， ａｎｄ Ｓｃｈ９． ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ ４， ｅｌ３．
Ｗｅｒｎｅｒ− Ｗａｓｈｂｕｒｎｅ， Ｍ．， Ｂｒａｕｎ， Ｅ．， Ｊｏｈｎｓｔｏｎ， Ｇ．Ｃ．， ａｎｄ Ｓｉｎｇｅｒ， Ｒ．Ａ． （１９９３）． Ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ ｐｈａｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｙｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ ５７， ３８３−４０１．
Ｗｏｊｄａ， Ｉ．， Ａｌｏｎｓｏ−Ｍｏｎｇｅ， Ｒ．， Ｂｅｂｅｌｍａｎ， Ｊ．Ｐ．， Ｍａｇｅｒ， Ｗ．Ｈ．， ａｎｄ Ｓｉｄｅｒｉｕｓ， Ｍ． （２００３）． Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｈｉｇｈ ｏｓｍｏｔｉｃ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｅｌｅｖａｔｅｄ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｉｓ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｂｙ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｇｌｙｃｅｒｏｌ ａｎｄ ｉｎｖｏｌｖｅｓ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＭＡＰ ｋｉｎａｓｅ ｐａｔｈｗａｙｓ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４９， １１９３−１２０４．
Ｚｕｒｉｔａ−Ｍａｒｔｉｎｅｚ， Ｓ．Ａ．， ａｎｄ Ｃａｒｄｅｎａｓ， Ｍ．Ｅ． （２００５）． Ｔｏｒ ａｎｄ ｃｙｃｌｉｃ ＡＭＰ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ａ： ｔｗｏ ｐａｒａｌｌｅｌ ｐａｔｈｗａｙｓ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ． Ｅｕｋａｒｙｏｔ Ｃｅｌｌ ４， ６３−７１．
要約
絶食は、Ｅ．ｃｏｌｉからマウスまでの範囲の生物をして酸化障害を含む種々の障害に対する顕著な耐性を与えるモードに切り換えることが良く知られている。以前の研究は、４８時間絶食が、防御系の負の調節における癌遺伝子の役割と一致して、化学療法（分別的ストレス耐性）に対してマウスを防御する効果があるが、癌細胞に対しては無いことを実証した。患者は一般的に癌専門医により化学療法前は通常に食事することを推奨される。それは、一つにはかなりの部分の患者が以前の化学療法サイクルにより体重を減少させ、または、弱っているという理由で、絶食が化学療法を受ける患者に有害である可能性があると多くの人に考えられているからである。ここで、われわれは、化学療法治療の前（４８−１４０時間）および後（２４−５６時間）に自発的に絶食した種々の悪性腫瘍を診断された患者の１０症例を記述する。絶食とともに平均４サイクルの化学療法を受けたこの１０例の誰も空腹以外に絶食そのものに起因する重大な副作用を報告しなかった。絶食または非絶食で化学療法を受けた５例の患者における通常の毒性基準（ＣＴＣ）に基づく自己申告による副作用は、絶食が疲労、脱力、および胃腸の副作用を防ぐ可能性を示している。癌の進行をモニターすることができたすべての患者において、絶食が化学療法依存性の腫瘍マーカーまたは腫瘤サイズの減少を阻止しなかった。治療係数の増強における絶食の役割を決定するには対照臨床試験が要求されるが、ここに提供されたこの１０症例は、化学療法との組み合わせにおける絶食が安全であり、高度に有益である可能性を示している。
序論
化学療法は、広範な悪性腫瘍を診断された患者の生存を延長することができるが、その正常な細胞および組織に対する毒性は用量強度、頻度、および有効性を制限する。例えば、ドキソルビシンまたはシスプラチンの使用は多くの悪性腫瘍を有効に治療することができるが、薬物誘発性のそれぞれ心毒性および腎毒性がこれら薬剤の最大能力を制限する。ゆえに、悪性細胞に対する毒性を損なわずに正常細胞を選択的に防御することによって不要な毒性を軽減することは、癌治療を増強するための望ましい戦略である。
最近、細胞培養において、および神経芽細胞担癌マウスにおいて、癌細胞ではなく、正常細胞を分別的に高用量化学療法から防御する可能性のある絶食に基づく治療介入が報告された（Ｒａｆｆａｇｈｅｌｌｏ ２００８ ＰＮＡＳ）。神経芽細胞腫異種移植マウスモデルにおいて、高用量エトポシド治療前４８時間に水のみをマウスに消費させた。絶食は高用量エトポシドで治療したマウスの防御に極めて有効であり、自由に摂餌したマウスは高用量エトポシドにより５０％死亡したが、該絶食は神経芽細胞腫の転移依存性の死亡を大幅に遅延させた （Ｒａｆｆａｇｈｅｌｌｏ ２００８ ＰＮＡＳ）。
ここに我々は、種々のタイプの癌を診断された１０症例を提示する。これらの症例は、化学療法前後に自発的に絶食した。正常細胞と癌細胞の分別的防御における絶食の有効性を決定するには適切に制御された臨床試験が必要であるが、患者の自己申告による健康アウトカムと血液データ読み出しに基づいてここに提示された結果は、絶食が安全であり、癌細胞死を阻害せずに化学療法に起因する複数の副作用を軽減した可能性を示唆する。
結果
化学療法を受けている１０例の癌患者がこの症例シリーズで提示される。その内女性は７例、男性は３例で、年齢中央値は６１歳（４４−７８歳の範囲）である。４例は乳癌、２例は前立腺癌、４例は卵巣癌、子宮癌、非小細胞肺癌、または食道腺癌であった。これらすべての患者は、彼らを治療する癌専門医の監視のもとで化学療法前計４８−１４０時間および化学療法後２４−４０時間自発的に絶食した。全ての患者は絶食に良好に耐えた。空腹、および血圧の低下は長い絶食期間後に患者が訴えた共通の症状であった。
症例１：
５１歳女性、ステージＩＩＡの乳癌で、ドセタキセル（ＤＴＸ）とシクロホスファミド（ＣＰ）によるアジュバント化学療法が推奨されていた。彼女は最初に化学療法サイクルの前に絶食した。絶食療法は、化学療法前１２０時間と化学療法後６０時間（計１８０時間）の完全なカロリー欠乏から成り、その間、彼女は水とビタミンのみを摂取した。患者はこの長い絶食を主要な不都合もなく完了し、７ポンド低下したが、絶食を止めて数日以内に回復させた（図１１Ｈ）。最初の化学療法薬投与後３日間患者は軽度の疲労、口渇としゃっくりを経験したが、それにもかかわらず彼女は毎日の活動を保持することができた（１日に１２時間の就労）。対照的に、その後の化学療法サイクル（２または３回目）において、彼女は非絶食で化学療法を受け、中等度のひどい吐き気、嘔吐、腹部仙痛、下痢および疲労を訴えた（図１２）。これらの重い副作用により彼女は通常の仕事のスケジュールを止めざるを得なかった。４回目および最後のサイクルの間、異なる療法ではあったが、彼女は再び絶食を選択した。この療法は化学療法前１２０時間、化学療法後２４時間の絶食から成っていた。注目すべきことに、予測された以前の治療による蓄積されたダメージにもかかわらず彼女の自己申告による副作用はより少なかった。患者の毒性に関する自己申告と一致して、血液分析の結果は、絶食が血液細胞を防御する有益な効果を持つ可能性を支持している。４日目の化学療法サイクルとその後の計１４０時間の絶食の後、好中球、ｗｂｃ，および血小板数は、８０日前の化学療法開始以来最高のレベルに到達した（図１１Ａ，ＣおよびＥ）。特に、予想されたナディアおける数は入手不能であった。全体的に見て、血球数と自己申告調査は、絶食が安全であり、この患者に対しては化学療法の毒性的副作用に対する防御を絶食が与えた可能性が示唆された。
症例２：
６８歳の白人男性で、２００８年２月に食道癌と診断された。診断時までにはステージＩＶと一致する左の副腎への転移がＣＴ−ＰＥＴスキャンで発見された。最初の化学療法剤は５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）とシスプラチン（ＣＤＤＰ）であった。化学療法レジメンと同時に彼は最初の２サイクルの化学療法の間、局所照射も受けた。この期間中、患者は極度の脱力、顕著な疲労、下痢、嘔吐および末梢神経障害を含むひどい副作用を経験した（図１３）。さらに、患者は、大部分は放射線治療に起因すると思われる極度の口内炎に続き激しい嚥下障害を訴え、それゆえ経皮的内視鏡下胃瘻造設術（ＰＥＧ）を実施し、７日後、除去された。３回目のサイクルの間に、５−ＦＵ投与は重度の悪心と治療抵抗性の嘔吐により中断を余儀なくされた（図１３）。化学療法と放射線の積極的なアプローチにもかかわらず、彼の病気は進行した。右副腎、右肺下葉、左仙骨および烏口突起への新規な転移の発生が２００８年８月に実施されたＣＴ−ＰＥＴにより発見された。これらの進行により、ドセタキセルと５−ＦＵ（５−ＦＵは９６時間投与された）の併用でカルボプラチン（ＣＢＤＣＡ）を含む彼の化学療法レジメン（４サイクル目）の増強が促進された。患者は、化学療法前７２時間と化学療法後５１時間の絶食を４回目のサイクルの間取り入れた。化学療法後５１時間の絶食の根拠は５−ＦＵの持続投与に対する防御のためである。患者は約７ポンド減ったが、その内４ポンドは正常食への復帰後最初の２〜３日間に回復した。このサイクルの間３種類の化学療法剤が併用で使用されたが、自己申告による副作用は中等度の疲労が含まれるのみであった。５回目のサイクルの前に彼は再び絶食を選択した。以前に受けたような９６時間の５−ＦＵの注入を受ける代わりに、同用量の５−ＦＵを４８時間以内に投与し、絶食療法も薬物投与前４８時間と薬物投与後５６時間に修正した。興味深いことに、自己申告による副作用が非常に低かっただけでなく、ＣＴ−ＰＥＴにおいて主要な食道の腫瘤、副腎、および右肺下葉の結節の縮小が表示され、臨床的な奏効の増強もあった。６、７、８回目のサイクルの間、患者は化学療法治療（上記参照）の前後に絶食し、軽度の副作用のみが報告された。この癌は非常に悪性な癌であり、化学療法が良好に耐容されたにもかかわらず、患者の病は進行し、２００９年２月に死亡した。
症例３：
この患者は７４歳白人男性で、２０００年７月に両側性の前立腺癌、グリーソンスコア７、ＰＳＡレベル５．８ｎｇ／ｍｌと診断された。２０００年９月に前立腺摘除術を実施し、ＰＳＡが１．４ｎｇ／ｍｌに上昇した２００３年１月までＰＳＡレベルが検出不能となった。ビカルタミドおよびフィナステリドと一緒に酢酸ロイプロリドを疾患制御のために処方した。しかし、これらの薬剤の投与はテストステロン欠乏に関連する重度の副作用により２００４年４月に休薬を余儀なくされた。その結果、疾患制御のため、トリプトレリン、パモ酸、ニルタミド、サリドマイド、シクロホスファミドおよびケトコナゾールを含む異なる薬剤が投与された。しかし、２００７年１月には患者のＰＳＡレベルが９に達し、２００７年３月には新規な転移が骨スキャンにより表示され、ステージＤ２と一致する疾患が確認された。２００７年６月にドセタキセル治療が週１回の頻度で開始されたが、患者のＰＳＡレベルは４０．６ｎｇ／ｍｌに達した（図１４Ｈ）。同年８月にアバスチンが薬物療法に加味された。これらのサイクルの間患者は、金属味、めまい、もの忘れ、短期記憶障害および末梢神経障害を含む化学療法による顕著な副作用を経験した（図１５）。それにもかかわらず、臨床的奏効は陽性であり、ＰＳＡ値は正常化された（図１４Ｈ）。２００７年１２月には骨スキャンは全体的な改善を示した。２００８年に化学療法治療を止めた後、彼のＰＳＡは急速に上昇した。もう１度ドセタキセルが処方された。２００８年１月から同年５月まで患者は２１日毎にドセタキセルを受けた。これらの治療サイクルの間、彼は以前２００７年に経験したと同様の副作用を経験したが、疲労と脱力が重症化した（図１５）。２００８年６月には、化学療法は中止され、患者は、非生殖線のアンドロゲン生合成に重要な一連の反応を触媒するミクロゾーム酵素ＣＹＰ１７を選択的に阻害することができる薬物アビラテロンのフェーズＩＩＩ臨床試験に登録された。この臨床試験中、患者のＰＳＡレベルは２０．９ｎｇ／ｍｌまで上昇した（図１４Ｈ）。その結果、化学療法を再開したが、今回は絶食と分別的ストレス耐性に関する動物モデルの研究に基づき（Ｒａｆｆａｇｈｅｌｌｏ ２００８ ＰＮＡＳ）、患者は化学療法前の絶食を選択した。彼の絶食スケジュールは薬物投与前６０時間、薬物投与後２４時間であった。更新された絶食／化学療法によりＰＳＡレベルは速やかに低下し、特に、患者は無視できる副作用を報告した（図１５）。最後の３サイクルの間、絶食以外に患者はテストステロン（１％クリーム）を化学療法前に５日間適用された。テストステロンとともにＰＳＡレベルは劇的に上昇した。それにもかかわらず、絶食を併用した３サイクルの化学療法によりＰＳＡは３４．２から６．４３ｎｇ／ｍｌに低下した（図１４Ｈ）。
症例４：
６１歳白人女性で、２００８年６月に未分化非小細胞癌と診断された。左肺下葉に限局した腫瘤は、生検結果と相関してＰＥＴスキャンにより代謝亢進状態にあることが明らかになった（２００８年６月）。同スキャンにおいて、広範な転移性疾患が複数の縦隔および左門部周囲のリンパ節に示された。骨、肝、脾、および膵臓への転移も観察された。ドセタキセル７５ｍｇ／ｍ２およびカルボプラチン５４０ｍｇ／ｍ２による初期治療が計画された。彼女は通常食を取っていたが、最初の５サイクルの間各治療後に平均４ポンドを失った。これは化学療法による毒性である可能性が最も高い。患者はもとの体重に戻るのに約３週間を要したと報告した。経験した副作用の内、彼女は重度の筋痙縮、下肢神経障害、顕著な疲労、口と舌の痛み、できやすいあざ、腸不快感、下痢便秘交代症を訴えた（図１７）。同一薬物と用量から成る６回目のサイクルの間、患者は化学療法前４８時間、化学療法後２４時間絶食した。この間患者は約６ポンド失ったが、１０日以内に回復した。２日以内に回復した軽度の疲労と便秘以外には、彼女が以前の５サイクル中に経験したいずれの副作用も訴えなかった。さらに、彼女は６回目と最後のサイクル後、彼女のエネルギーが急速に回復し、該薬物投与後３日のみで３マイル歩くことができたと報告した。２００９年２月に実施された最後のレントゲン検査により、ベースラインＰＥＴスキャンと比べた場合、肺病変（主要な腫瘤）および脾臓、膵臓、および脊椎等の陽性病巣を有する他の臓器の改善が示された。
症例５：
６６歳白人男性で、１９９８年７月に前立腺癌、グリーソンスコア８と診断された。同年に実施された陽性前立腺シンチ試験により、右腸骨リンパ節に放射性トレーサーの取り込み増加が示された。これらの所見は、ステージＤ１疾患と一致する。１９９８年に最初は、患者は酢酸ロイプロリドとビカルタミドを受けた。１９９９年９月にはこれらの薬物を止め、フィナステリド治療が開始された。２０００年１２月には、ＣＴスキャンにより限局性の疾患の進行が疑われた。ＰＳＡベースライン１．１で彼は酢酸ロイプロリドによる２回目のサイクルを開始したが、今回は高線量（ＨＤＲ）小線源療法と強度変調放射線療法（ＩＭＲＴ）の追加による外照射も右閉鎖神経リンパ節に受けた。この後、２００２年迄週１００ｍｇのナンドロロンによる治療が続けられた。翌年には、ビカルタミド、トリプトレリンパモ酸塩等の異なる薬剤が処方され、ナンドロロンが疾患制御のために使用された。しかし、彼のＰＳＡレベルは治療が中断される毎に急速に上昇した。２００８年４月、コンビデックススキャンにより３×５ｃｍの骨盤の腫瘤と左水腎症が示された。それゆえ、腎摘除とステントの左尿管への装着が行われた。同年６月、ＰＳＡレベルの上昇と新規ＣＴスキャンによる左腸骨域の更なる腫瘤の確認により、ドセタキセル（２１日スケジュールの１回目サイクル、６０ｍｇ／ｍ２、および２−８回目サイクル、７５ｍｇ／ｍ２）による治療が促された。動物実験に基づき、患者は化学療法前６０−６６時間の絶食と化学療法後８−２４時間の絶食を決定した（表Ａ）。絶食中、患者は意識朦朧と有意な血圧低下を経験したが、自己申告による副作用は、絶食−ドセタキセルの７回の連続サイクル後に発生した足の軽度な振動感覚以外は殆ど存在しなかった。しかし、彼はしびれ、知覚異常、または痛みを報告しなかった。これらの結果は、大部分の患者がこの薬剤のまさに２−４サイクル後に一種の神経障害を発症するとの考えを強くする。一方、血球数は１回目のサイクル以外は治療を通して定常値を示し（図１８Ａ）、血球数も絶食依存性の防御の利益得ている可能性が示唆される。最後に、ＰＳＡレベルは化学療法サイクルの間、一貫して低下し、絶食は前立腺癌細胞を殺すことを阻害はしないことが示唆された（図１８Ｈ）。
症例６：
４４歳白人女性で、２００７年７月に１０×１２ｃｍの右卵巣腫瘤が発見された。患者は複数（３０＋）のバイオプシーをしたが、すべて癌は陰性であり、卵巣嚢の関与は示されなかった。これらのことに基づいて、最終診断はステージＩＡ卵巣癌肉腫となった。最初に実施された治療は、イホスファミドとシスプラチンによる６サイクルコースで、患者はこのコースを２００７年７月から１１月まで受けた。２００８年１月に実施された彼女の最初のＣＴスキャンは卵巣外の疾患を示さなかった。７ヶ月後、ＭＲＩにより複数の新規結節が肺に示された。この発見はＣＴスキャンで確認され、２０を超える新規結節が同一領域で視覚化された。また、この試験では幾つかの異常（低密度画像ＭＴＳ）が脾領域に、および脊椎に退行性変化が見られた。これらの結果に基づき、タキソール、カルボプラチン、およびアバスチンを含む新規治療レジメンが選出された。２００８年８月に注入が開始され、３週毎に実施された。同時に、患者は高用量ビタミンＣ（５０ｍｇ／ｄａｙ）を補充した。２００８年９月、ＣＴスキャンを用いた再評価により、サイズと複数のびまん性、両側性の肺結節数の低下が示された。しかし、１１月にはＣＴスキャンにより主要な結節の一つが．５から．８ｃｍに増大し、疾患の進行が確認された。１日目にゲムシタビン、８日目にゲムシタビンとドセタキセルから成る新規療法が処方された。しかし、総量（９００ｍｇ／ｍ２）のゲムシタビンの最初の投与後、患者は持続性の好中球減少（図１９Ａ）と血小板減少（図１９Ｄ）を経験し、追加治療が断念させられた。２回目のサイクルの間、患者は減量したゲムシタビン（７２０ｍｇ／ｍ２）を受けたが、再び持続性の好中球減少と血小板減少を発症し、最初のスケジュールの完了は困難となった。その結果、患者は化学療法前６２時間と化学療法後２４時間の絶食を始めることを決定した。彼女は副作用の全体的な減少と血球数の改善を報告した。我々は、ナディアが僅かで、あまりはっきりせず、好中球数、リンパ球数、および白血球数のピークが著しく高いことに注目した（それぞれ図１９Ａ，Ｂ，およびＣ）。さらに、ゲムシタビン単独は急速かつ急激な血小板数の低下をきたし、回復に１１−１２日を要した。しかし、最初の絶食／ゲムシタビン併用治療後は血小板数が減少せず、むしろ増加した（図１９Ｄ）。血小板ナディアは以前の化学療法単独に比較してより低レベルに達したが、今回は化学療法剤３剤を１剤の代わりに投与しており、相加効果がこれらの深いナディアの説明になり得る。それにもかかわらず、血小板数のリバウンドが化学療法単独に比べ絶食／化学療法治療中でははるかに明確であった（図１９Ａ，ＢおよびＣ）。この複数の絶食／化学療法サイクル後の血小板の顕著な回復およびより急速な回復は、この戦略が巨核芽球に対して防御効果を有し、血小板、好中球およびリンパ球をより速やかに再増殖させる可能性を示唆する。
症例７：
ここに、我々は、ステージＩＩＡ乳癌（ＨＥＲ２＋）と診断された５３歳白人女性を紹介する。２００８年に乳腺腫瘍摘出手術後、患者は３週毎の化学療法を４サイクル受けた。その療法はドセタキセル（７５ｍｇ／ｍ２）とシクロホスファミド（６００ｍｇ／ｍ２）の併用であった。４サイクルを通して患者は化学療法投与前６４時間、および化学療法投与後２４時間絶食した。報告された副作用は軽度の脱力と軽度の短期記憶障害であり、他の副作用は報告されなかった。
症例８：
この患者は４８歳白人女性で、乳癌と診断され、アジュバント化学療法を推奨された。彼女の化学療法レジメンは、ドキソルビシン（１１０ｍｇ）とシクロホスファミド（１１００ｍｇ）の併用を３週毎を４サイクル、その後、パクリタキセルとハーセプチンを週１回、１２週間から成っていた。最初の化学療法治療（ＡＣ）前に患者は４８時間絶食し、なんらの副作用も言及されなかった。２回目のサイクルの間、患者は化学療法前６０時間の絶食を組み込み、薬物投与後５時間まで継続した。興味深いことに、絶食後には彼女は何らの苦痛も表現しなかった。彼女は化学療法による脱毛を経験したが、他には疲労、脱力、悪心、嘔吐、および下痢等の通常報告される化学療法による副作用に苦しめられることはなかった。
症例９：
この患者は７８歳の老婦人で、ＨＥＲ２陽性乳癌と診断された。診断により乳腺腫瘍摘出手術を実施し、彼女の乳房から３個の腫瘤を摘出した。術後患者は感染症を発症し、ドレナージ設置のため２回目の手術実施を強いられた。種々の試みがなされたが、全乳房切除は避けられなかった。６サイクルのカルボプラチン（４００ｍｇＡＵＣ６）とドセタキセル（７５ｍｇ／ｍ２）、その後６カ月のトラスツズマブによる補完的アジュバント化学療法が癌専門医によって指示された。化学療法治療を通して患者は薬物投与前後に絶食した。患者によって採用される絶食療法は異なった（表Ａ参照）が、軽度の疲労と脱毛のみが報告された。さらに、好中球、リンパ球、白血球および血小板レベルを含む全白血球数は正常範囲内であった（図２０）。このことから、絶食は化学療法毒性から血液細胞を防御し得ることが示唆される。
症例１０：
この患者は７４歳老婦人で、２００８年にステージＩＶの子宮体部漿液性腺癌と診断された。その結果、手術とアジュバント化学療法が指示された。手術法は、腹式子宮全摘術プラス両側卵管卵巣摘除術から成っていた（ＴＡＨ−ＢＳＯ）。加えて、骨盤リンパ節、大動脈周囲リンパ節および上大静脈リンパ節を切除した。最後に、右尿管の顕著な肥大により、右腎摘除も実施した。それに加え、カルボプラチン（４８０ｍｇ）およびパクリタキセル（２８０ｍｇ）の６サイクルを３週毎に適用した。最初の治療前に患者は通常の食事を摂った。彼女は疲労、脱力、脱毛、頭痛を経験し、また、胃腸不快感も訴えた（図２１）。対照的に、２回目のサイクル前と残りの治療の間、患者は薬物投与前後に絶食した（表Ａ参照）。化学療法薬は中毒性副作用の蓄積が良く知られているが、患者は以前に経験した大部分の副作用が一貫して軽減したと報告した。このことは他の患者が経験したことおよび我々の前臨床データと一致する。
我々は、モニターした１０例の患者すべてにつき、通常の毒性基準尺度に基づく副作用の重症度に関する自己申告評価を得た。我々は１０例全ての患者の自己申告による副作用の評価を示す（図２２Ａ）。化学療法のすべてのサイクルと組み合わせて絶食した５例の患者は大部分の副作用につき極めて低い重症度を報告した。軽度の脱力と脱毛のみが複数の患者から報告された。絶食または自由食の両方とともに化学療法を受けた５例の患者については、自己申告による多くの副作用の重症度の一般的かつ大きな軽減が絶食との組み合わせに存在した。悪心、嘔吐、下痢、腹部仙痛、および口内炎は、絶食した１０例の全ての患者の報告からは実質的になかったが、これらの症状の内少なくとも１つは自由に摂食した５例の内４例の患者により報告された。
絶食または非絶食で少なくとも１サイクルの化学療法を受けた５例の患者につき、患者が絶食または非絶食した化学療法の最も近接する２サイクルのみを考慮することによって我々は自己申告された副作用の重症度を決定した（図２２Ｂ）。疲労および脱力等の症状は有意に軽減されていた（それぞれｐ＜０．００１およびｐ＜０．００１９３）が、悪心と嘔吐は絶食と組み合わせた場合まったく経験されなかった（図２２Ｂ）。特に、ＣＴＣベースの調査に含まれる副作用はなくその平均重症度は絶食によって上昇した（図２２ＡおよびＢ）。
化学療法の毒性副作用の多くは蓄積性であるので、我々は絶食および非絶食と関連付けた化学療法の副作用のすべての調査データを比較した。勇気づけられることに、絶食サイクルの大部分が治療の後半部分に実施されたにもかかわらず、より良い自己申告による健康結果が全ての患者によって報告された。少数の異質な癌患者群からの調査結果は、癌患者において絶食が安全かつ良く忍容され、また、複数の化学療法依存性の副作用を改善する可能性も示唆する。バイアスが患者による副作用の評価に影響するが、化学療法後に減少する複数の血球タイプ数を改善する傾向は、絶食が実際に異なる化学療法薬に対して防御する可能性を示唆する。特に、絶食は、酵母からマウスまでの範囲の生物を種々の毒とストレスから防御することが知られており、ゆえに、ヒトにおける複数の化学療法薬に対する防御効果は驚くにはあたらない。
飲水に加え化学療法の前後に絶食した患者の一部は、本出願に記載されたカロリーレベルまたはタンパク質レベルを超えない極めて低カロリーの範囲の食事を消費したが、本防御効果を経験し続けた。
考察
癌治療の間の一般的に推奨される食事は、栄養不足を防ぎまたは逆転させること、やせた体重を維持すること、および栄養関連の副作用（食欲の減退、悪心、味覚変化または腸の変化）を最少化するという全体的なゴールに基づいている（Ｄｏｙｌｅ， Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｄｕｒｉｎｇ ａｎｄ Ａｆｔｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ， ２００６）。標準的な化学療法後の食事に反して、本シリーズの大部分の患者は、絶食が実行可能で、疲労、脱力、悪心、嘔吐および腹部仙痛等の副作用を軽減することによる利益を報告した。絶食中にめまい、空腹、または頭痛を含む軽微な愁訴があったが、仕事中に正常な活動を妨げないようなレベルであった。
体重減少は癌患者の主要な関心である。これは、癌自体、化学療法または胃腸障害後の食欲減退によるかもしれない。特にこの症例では、絶食中の体重減少は大部分の患者で速やかに回復し、事実これらの治療完了後患者らは元の体重に到達した。絶食とともにおよび非絶食で化学療法を受けた患者にとって、化学毒性の副作用は絶食サイクル中減弱されると思われた。この介入によって軽減されると思われる症状は主に胃腸および全身性であった。
非悪性細胞では、絶食等の環境的に困難な条件は、生物が増殖／再増殖を抑制することを刺激し、そのエネルギーを維持／修復に転換させ、およびその生存のチャンスを最大化する（Ｌｏｎｇｏ， Ｃｅｌｌ ｒｅｖｉｅｗ， ２００５）。ゆえに、ＩＧＦ−Ｉ等の増殖因子は減少し、絶食応答における異常タンパク質応答（ＵＰＲ）の増加等のストレス耐性機序は増加する。癌の６つの特徴において記載の通り、正常細胞はこれらの変化に応答し、悪性細胞は増殖シグナルの自給自足により非応答性であろう（Ｈａｎａｈａｎ， Ｈａｌｌｍａｒｋｓ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ， ２０００）。ゆえに、絶食は癌細胞に対する薬物活性を減じることなく、化学療法毒性から正常細胞を選択的に防御するであろう。
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ＩＧＦ−Ｉは正常細胞および悪性細胞において化学療法に対する分別的耐性を調節する
要約
骨髄抑制、胃腸障害、および疲労を含む化学療法毒性副作用は癌治療の用量と期間を制限する。幾つかの化学療法防御物質は薬物依存性および組織特異的な防御を供給しているが、これらの化合物が正常細胞と癌細胞の分別的な防御において広い役割を有することができるかどうかは知られていない。最近、我々は短期絶食（ＳＴＳ）が癌細胞ではなく正常細胞およびマウスを化学療法から選択的に防御する（分別的ストレス耐性、ＤＳＲ）ことを報告した。ここに、我々はＳＴＳ依存性防御の機序を調べた。マウスでは、７２時間絶食はＩＧＦ−Ｉを７０％まで低下させ、ＩＧＦ−Ｉ阻害物質ＩＧＦＢＰ−１のレベルを１１倍増加させた。ＩＧＦ−Ｉ／ＩＧＦ−Ｉシグナル伝達の低下は、グリオーマ細胞ではなく、初代グリア細胞をシクロホスファミドから防御し、マウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）をドキソルビシン依存性のＤＮＡ障害から防御した。循環ＩＧＦ−Ｉレベルが７０−８０％低下しているＬＩＤマウスは、試験した化学療法薬４薬の内３薬を防御し、ドキソルビシン処理したメラノーマ担癌ＬＩＤマウスの６０％が長期生存を伸ばしたのに対し、すべての対照マウスは癌転移または化学療法毒性のいずれかで死亡した。これらの結果はＩＧＦ−Ｉが癌細胞ではなく、正常細胞における防御の潜在的な阻害物質であることを示唆する。
序論
殆どの化学療法剤は、正常細胞に用量を制限する毒性につながる著明な障害をもたらして、患者に対する短期および長期副作用のいずれも有する。薬物開発は、癌特異抗原を標的とする抗体［１］または狭い治療指数を有する薬剤［２，３］等の一連の選択的抗腫瘍剤によりこれらの副作用を減らしてきたが、毒性は癌治療を制限し続けている。ゆえに、不要な毒性副作用を減じる介入は多くの化学療法薬の有効性を増強することができよう。アミホスチン、グルタチオン、メスナ、およびデクスラゾキサン等の化学防御化合物が研究され、特定の組織の薬物依存性防御を供給することを示してきたが、これらの化合物の使用は無病生存期間または全生存期間を増加することを示してはいない［４，５］。最近、我々は短期絶食（ＳＴＳ）が広範囲の正常細胞に防御を提供するが、悪性細胞には提供しないか、またははるかに少なく、生存率の改善につながっていることを報告した［６］。
正常な条件下では、生物の有限なエネルギー源は増殖と維持の間で精巧に平衡が保たれている［７］。しかし、絶食条件等の困難な環境下では、エネルギーを成長から維持へ転換することによって、増殖を犠牲にして防御と生存を増強する［８］。種々のモデル動物における加齢研究は、カロリー制限と増殖促進ＧＨ／ＩＧＦ−Ｉ軸の欠乏が多くの生理学的特徴を共有し、寿命とストレス耐性を増加させることができることを示している［９］。
増殖ホルモン（ＧＨ）はその増殖効果の主要なメディエーターであるＩＧＦ−Ｉの産生を直接調節する［１０］。絶食中、新しい環境に対する生理学的適応の結果としてＧＨ／ＩＧＦ−Ｉ軸における幾つかの変化が起きる。ヒトでは、短期絶食（３６−７２時間）に応答してＧＨ分泌が増加するにもかかわらずＩＧＦ−Ｉレベルは劇的に減少する［１１−１４］。マウスでは短期絶食（２４−７２時間）によりＧＨとＩＧＦ−Ｉのいずれも減少する［１５，１６］。ＩＧＦ−Ｉシグナル伝達が欠乏する長寿命生物は複数のタイプのストレスに耐性であることも示されている［１７−１９］。我々の仮説は、絶食に応答するＩＧＦ−Ｉの低下は増殖促進経路を多くの細胞で抑制するというものであり、エネルギーの維持への投資を支持する。
正常細胞と癌細胞は多くの様式で異なるが、すべての癌細胞を正常細胞から差別する特徴はほとんどない。癌の特質のレビューで記載したように、正常細胞が癌化するのに必要とされる多くの条件の内増殖シグナルにおける自給自足および増殖抑制シグナルに対する非感受性は特に重要である［２０］。増殖シグナルにおける自給自足は、条件に関係なく増殖経路を構造的に活性化する原因となる癌遺伝子における機能獲得型の突然変異によってしばしば可能となる（例えばＩＧＦ−ＩＲまたは下流のＲａｓ，Ａｋｔ，ｍＴｏｒ，など）。特に、ＲＡＳ／ＲＡＦ／ＭＡＰＫおよびＰＴＥＮ／ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路は、ＣＲと絶食［２１］、おそらくＩＧＦ−Ｉシグナル伝達の減少により下方制御され得る。一方、増殖抑制シグナルに対する非感受性は、腫瘍抑制遺伝子（例えば、Ｒｂ，ｐ５３，ＰＴＥＮなど）の機能喪失突然変異によるものであり、癌細胞が抗増殖シグナルを無視することを可能にする［２０，２２］。Ｓ．セレビシエについての我々の研究では、我々は、Ｒａｓ，ＡｋｔおよびＳ６Ｋの相同体はカロリー制限依存性ストレス耐性の主要なメディエーターであることを示した。我々は、ＩＧＦ−Ｉ／Ｒａｓシグナル伝達が酸化障害に対してラット神経を増感し［２３］、ＲＡＳ癌遺伝とＡＫＴ癌遺伝子の相同体が酵母を種々のストレス暴露と化学療法薬に対し増感させることも報告した［６，２４］（図２４）。増殖と維持の調節シグナルに対する正常細胞と癌細胞の異なる応答は、我々の分別的ストレス耐性戦略の基礎である。
患者にとって治療期間中の長期かつ極端な食事制限の実施は不可能または不本意であるという理由により、絶食の臨床適用は制限されてきたであろうことから、我々は絶食のＤＳＲに対する有益な効果を介在する可能性のある経路を調べた（図２４）。
結果
短期絶食は増殖促進ＧＨ／ＩＧＦ−Ｉ軸の成分を調節する
分別的ストレス耐性（ＤＳＲ）に対する絶食の有益な効果におけるＧＨ，ＩＧＦ−Ｉの役割を調べるため、ＳＴＳ実施マウスにおけるＧＨ／ＩＧＦ−Ｉおよびにその結合タンパク質ＩＧＦＢＰ−１と−３の循環レベルを測定することからスタートした。ＣＤ−１マウスを７２時間絶食させ、血液を採取してグルコースレベルと血漿ＧＨ、ＩＧＦ−Ｉ、およびＩＧＦＢＰ−１と−３のレベルを測定した。ＳＴＳ７２時間後、マウスは約２０％の体重を減らし、糖レベルは４１％まで減少し、ＧＨレベルはわずかに増加し、ＩＧＦ−Ｉレベルは７０％減少した（図２３Ａ−Ｄ）。ＩＧＦ−Ｉ受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）を活性化し得るＩＧＦ−Ｉのバイオアベイラビリティは、ＩＧＦ結合タンパク質によって調節されている。絶食マウスでは、通常ＩＧＦ−Ｉのシグナル伝達を減らすＩＧＦＢＰ−１のレベルが１１．４倍増加していた（図２３Ｅ）。これらの結果は、ヒトおよびラットでは絶食に応答してＩＧＦＢＰ−Ｉが増加することを示す報告［１６，２５，２６］と一致し、マウスにおけるその過剰発現はＩＧＦ−Ｉの捕捉によって効果的に増殖を遅らせること示す報告とも一致する。他方、７２時間絶食は、短期絶食ヒトおよびラットの報告［１６，２７］と一致してＩＧＦＢＰ−３レベルを４２％まで減らした（図２３Ｆ）。ＩＧＦＢＰ−３の減少についての機序の説明は明白ではないが、ＩＧＦＢＰ−３のＩＧＦ−Ｉ非依存性効果［２８］、またはＩＧＦ−Ｉへの親和性の増加による可能性がある［２７］。
以前に我々は、低グルコース（正常な１００ｍｇ／ｄｌに対して５０ｍｇ／ｄｌ）および低血清（１％ウシ胎児血清；結果的にＩＧＦ−Ｉを含む幾つかの増殖因子が減少）でプレインキュベートした初代グリア細胞がアルキル化化学療法剤であるシクロホスファミドに対する防御を増強したが、グリオーマ細胞ではかかる増強は見られなかったことを示した［６］。絶食マウスのグルコースレベルはＩＧＦ−Ｉレベルの劇的な減少とともに同様なレベルに低下した（図２３ＢおよびＤ）。ゆえに、主要な増殖促進因子ＩＧＦ−Ｉの低下はＤＳＲに対する絶食の効果の一部を介在する可能性がある（図２３ＤおよびＥ；図２４）。
低下したＩＧＦ−Ｉシグナル伝達は高用量シクロホスファミドからグリオーマ細胞ではなく初代グリア細胞を防御する
ＩＧＦ−Ｉ様シグナル伝達は、単純な酵母から虫、ハエ、およびマウスまでの範囲の生物において寿命とストレス耐性の調節に関わっている［９，２９−３１］。インビトロでの化学療法薬に対するＤＳＲにおけるＩＧＦ−Ｉシグナル伝達の役割を調べるため、我々は、正常細胞およびそれに相当する癌細胞株をアルキル化細胞障害性薬剤であるシクロホスファミド（ＣＰ）で処理する前にＩＧＦ−Ｉ受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）阻止抗体、異なる血清濃度、または過剰なＩＧＦ−Ｉのいずれかとともにインキュベートした。初代混合ラットグリア（アストロサイト＋５−１０％ミクログリア）および３種のラットグリオーマ細胞株（Ｃ６，Ａ１０−８５および９Ｌ）を試験した。全ての細胞は増殖率の違いを最少にするためにコンフルエントになるまで増殖させた。最初に、拮抗するＩＧＦ−ＩＲ抗体（αＩＲ３）とのプレインキュベーションによりＣＰ毒性に対して初代グリアが防御されたが、３種のグリオーマ細胞株は防御されなかった（図２５Ａ）。血清レベルにおける通常の１０％から１％への減少、結果としてＩＧＦ−Ｉを含む増殖因子の減少は、１５ｍｇ／ｍｌＣＰの初代グリアに対する毒性を軽減したが、Ｃ６グリオーマ細胞は軽減しなかった（図２５Ｂ）。我々は、また、ＩＧＦ−Ｉを培養液に添加することによって高用量ＣＰ毒性に対するＩＧＦ−Ｉ上昇の効果を試験した。１００ｎｇ／ｍｌＩＧＦ−Ｉ（成人ヒト血清の低い正常範囲）［３２］でのプレインキュベーションにより初代混合グリアに対するＣＰ毒性の３倍の増強がもたらされたが、Ｃ６グリオーマ細胞に対してはＣＰ毒性を増強しなかった（図２５Ｃ）。同様な結果がＩＧＦ−Ｉと酸化ストレス剤パラコートで併用処理した初代ニューロンおよびニューロン様褐色細胞腫細胞（ＰＣ１２）について得られた。これらの結果は、我々の絶食およびＤＳＲについての以前の研究［６］と一致し、ＩＧＦ−Ｉシグナル伝達の下方制御が化学療法毒性から正常細胞を防御し得るが、癌細胞では防御しないという仮説を支持する。
マウス胚線維芽細胞におけるＩＧＦ−ＩＲ欠損またはストレス耐性における過剰発現の効果
分別的なストレス耐性に関与する機序の検討を開始するため、我々はｉｇｆ１ｒ欠損（Ｒ−細胞）またはＩＧＦ−ＩＲ過剰発現（Ｒ＋細胞）を有するマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）をＤＸＲで処理した［３３］。全ての細胞は増殖の差を最少化するためコンフルエントになるまで増殖させ、ＤＸＲで２４時間または４８時間処理した。ＤＸＲ処理２４時間後、Ｒ−細胞はＲ＋細胞に比較してより高い生存率を示した。この効果は２５μＭで最も顕著であり、８０％を超すＲ−細胞が生存したが、Ｒ＋細胞は３０％のみの生存であった（図２６Ａ，Ｐ＜０．０００５）。細胞を４８時間処理した場合同様な結果が観察され、Ｒ−およびＲ＋細胞の２５μＭでの生存率はそれぞれ５０％ ｖｓ．１２％であった（図２６Ｂ，Ｐ＜０．０２）。
ＩＧＦ−Ｉが如何にして化学療法毒性を防御するかを調べるため、我々はコメット解析を用いてＤＮＡ障害を測定した。ＤＸＲ誘発ＤＮＡ障害はＲ−細胞と比較してＲ＋細胞で有意に高く、コメット解析で評価した場合３倍を超える差があった（図２６ＣおよびＤ、Ｐ＜０．００１）。特に、Ｒ−細胞はＳＶ４０ラージＴ抗原による形質転換に耐性を示した。このことは線維芽細胞が培養中にしばしば自発的に形質転換することを考慮すると注目に値する［３４］。これらの結果は、低下したＩＧＦ−Ｉシグナル伝達が酸化依存性のＤＮＡ障害を軽減することによって正常細胞を防御するという我々の仮説を支持する［３５］。
Ｓ．セレビシエにおけるＩＧＦ−ＩＲ下流エレメント相同体の役割
ＩＧＦ−ＩＲの下方制御が化学毒性とそのＤＮＡ障害への効果を防御する機序を理解するため、我々はＳ．セレビシエ単純モデル系に取り掛かった。酵母を使用する理論的根拠は、我々の以前の研究で示した酸化ストレス、ＤＮＡアルキル化、および熱ストレスに対する細胞防衛の調節における哺乳類のＲａｓとＡｋｔまたはＳ６Ｋの相同体のＲａｓ２およびＳｃｈ９、およびＩＧＦ−ＩＲの下流にあるＳＣＨ９およびＲＡＳ２相同体の中心的シグナル伝達の役割に基づいている［６，２４，３６］。我々は、ＤＸＲ耐性に対するＲＡＳ２およびＳＣＨ９欠損の効果を試験した。ＤＳＲをさらに調べるため、我々はヒト発癌性のＲａｓ突然変異のモデルとなる構造的に活性なＲＡＳ２（ＲＡＳ２ｖａｌ１９）を発現する遺伝子で形質転換した細胞も調べた。ＳＣＨ９（ｓｃｈ９Δ）またはＳＣＨ９およびＲＡＳ２（ｓｃｈ９Δｒａｓ２Δ）の欠損は、その野生型（ＷＴ）株と比較してＤＸＲに対する有意な防御を供給した（図２７Ａ）。しかし、我々の哺乳類研究に類似して、癌遺伝子様ＲＡＳ２ｖａｌ１９の発現はＲＡＳ２およびＳＣＨ９欠損によって供給される防御を逆転させた。ＤＸＲ処理４８時間後、ＷＴおよびＲＡＳ２ｖａｌ１９発現細胞の５０％は生存したが、ｓｃｈ９Δの７０％およびｓｃｈ９Δｒａｓ２Δの９０％超が生存した（図２７Ａ）。この効果は、ＤＸＲ処理７２時間後はさらに明白であり、ｓｃｈ９Δｒａｓ２Δおよびｓｃｈ９Δは高度に防御された（それぞれ８８％および７０％の生存）が、この防御はＲＡＳ２ｖａｌ１９の発現により逆転された（ｓｃｈ９ΔＲＡＳ２ｖａｌ１９；２７％生存）。分別的なＤＸＲ耐性の分子機序を調べるため、我々は、ＤＮＡ突然変異頻度をモニターし、Ｃａｎｒコロニー／１０６細胞として測定した［３７］。ＤＸＲ処理は全ての株で突然変異頻度を増加させた。生存解析に一致して、ｓｃｈ９Δおよびｓｃｈ９Δｒａｓ２Δは最も低い突然変異頻度を示したが、ＲＡＳ２ｖａｌ１９発現は突然変異頻度を増加させた（図２７Ｂ）。ｓｃｈ９ΔにおけるＲＡＳ２ｖａｌ１９発現（ｓｃｈ９ΔＲＡＳ２ｖａｌ１９）は、Ｓｃｈ９欠損によって供給される防御を完全に逆転させ、突然変異頻度の３倍の増加をもたらした（図２７）。これらのデータは、低下したＲａｓ２およびＳｃｈ９シグナル伝達の有益な効果が少なくとも部分的には細胞におけるＤＮＡ障害に対する防御の増強によること、および癌遺伝子の発現によって逆転されることを示唆する。
オクトレオチドがＮＸＳ２神経芽細胞腫細胞を増感させるが、高用量エトポシドに対してマウスを防御しない
ＩＧＦ−Ｉの低下が哺乳類培養細胞において分別的な化学療法防御を供給することから、我々はＧＨ／ＩＧＦ−Ｉ軸の薬理学的な操作がインビボにおいてＤＳＲを誘導し得るかどうかを調べた。ソマトスタチン類似体オクトレオチドは臨床において主に先端巨大症患者におけるＧＨ分泌およびＩＧＦ−Ｉ産生を減らすために使用される。また、オクトレオチドは絶食に応答してソマトスタチンが上昇することから選択された［３８］。以前の報告で、我々は短期絶食（ＳＴＳ）が、トポイソメラーゼＩＩを阻害し、広範に使用される化学療法薬である高用量エトポシドに対してＤＳＲを供給することを示した［６］。ここで、我々はこのエトポシドに対する防御がオクトレオチドによるＧＨ／ＩＧＦ−Ｉ軸阻害によって獲得、または増強され得るかどうかを試験した。興味深いことに、オクトレオチドおよび他のソマトスタチン類似体は２つの異なる効果：ソマトスタチン受容体によって介在される腫瘍に対する直接作用［４０，４１］および増殖ホルモン遊離の阻害およびＩＧＦ−Ｉの低下による間接的な効果［４０−４２］によって、多数の癌に治療効果を有することが知られている［３９］。我々は、とりわけ悪性度が高く、神経芽細胞腫（ＮＢ）のモデルである腫瘍株（ＮＸＳ２）を選択した［４３］。ＮＸＳ２細胞の静脈内注入によって肝、腎、副腎、および卵巣を含む複数の臓器に一貫した転移形成が生じた［４３］。高用量のエトポシド（８０ｍｇ／ｋｇ）の単回注入によって、治療しなければ４０日以内に転移して死亡していたであろう担癌マウスの寿命が延長された。我々の以前の研究では、ＳＴＳは急性の化学毒性関連の死亡を顕著に減少させたが、癌細胞に対する部分的な防御も供給した［６］。我々の今回の結果は、オクトレオチドが化学療法から動物を防御するには十分ではないが、ＳＴＳとの併用によりＮＸＳ２のエトポシドに対する感受性が高められていることを示している。しかし、通常はヒトのＧＨ産生を減じるために使用されるオクトレオチドはマウスではＩＧＦ−Ｉレベル低下作用はマイナーであり、ゆえにオクトレオチドによる宿主防御の欠乏はＩＧＦ−Ｉレベルについてのマイナーな効果によって説明可能であろう。恒常的な機序がソマトスタチンの効果に拮抗し、オクトレオチド治療に対する急速な耐性につながり、ゆえにＩＧＦ−Ｉレベルの有意な減少に失敗した可能性がある。
オクトレオチドが直接または間接にＮＸＳ２細胞に対する増感効果を示すかどうかを調べるため、我々はＮＸＳ２細胞をオクトレオチドとエトポシドでインビトロ処理した。オクトレオチドはエトポシドの細胞培養におけるＮＸＳ２細胞に対する毒性を変化させず、マウスにおけるオクトレオチドの増感効果は間接的であることが示唆された。同時にこのことは、オクトレオチド単独では絶食様の宿主防御を供給しないが、癌細胞を増感させることによってＳＴＳにより供給される癌細胞に対する部分的な防御を逆転させる可能性があることを暗示する。オクトレオチドが化学療法に対する他の腫瘍の感受性を増感させる可能性を調べるさらなる研究が必要である。
ＬＩＤマウスにおける高用量化学療法に対するストレス耐性の増強
ＩＧＦ−ＩＲまたはその下流のエレメントが遺伝的に破壊されたマウスは、酸化ストレスに対しより耐性であることが知られている［１７，４４］。ＩＧＦ−Ｉシグナル伝達の減少が化学療法に対して防御するかどうかを決定するため、我々は、アルブミン駆動Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ組み換え系［４５］を用いて、絶食７２時間後のマウスに似た循環ＩＧＦ−Ｉ［４６］の７０−８０％減少を出生後に来たす条件付き肝ｉｇｆ１遺伝子欠損（ＬＩＤ）トランスジェニックマウスモデルを試験した（図２３Ｄ）。このＬＩＤマウスは化学療法耐性におけるＩＧＦ−Ｉと絶食の機序の関連性を調べるためのモデルを供給する［４７］。最初に、エトポシドとＳＴＳ／オクトレオチドについての我々の有望な結果に基づき、我々は高用量エトポシドでＬＩＤマウスを検証した。驚いたことに、１００ｍｇ／ｋｇのエトポシド単回投与に対してＬＩＤマウスは対照マウス（マウスはｌｏｘＰ−隣接ｉｇｆ１遺伝子はホモ接合性であるが、ｃｒｅリコンビナーゼを欠損する）に比べ防御されず［４５］、生存率はＬＩＤマウスと対照マウスそれぞれ５０％ ｖｓ．８８％であった（図２８Ａ、ｎ＝１０／ＬＩＤ，ｎ＝９／対照、Ｐ＝０．０６４）。その後、我々のインビトロ結果に基づきＬＩＤマウスでＣＰを試験した。５００ｍｇ／ｋｇのＣＰで処理したＬＩＤマウスは有意により高い耐性を示し、ＬＩＤマウスと対照マウスの生存率はそれぞれ７０％ ｖｓ．３０％であった（図２８Ｂ，ｎ＝２０／群，Ｐ＝０．００１）。さらに、ＬＩＤマウスがそれらの平均体重を１０％のみ失ったのに対し、対照マウスは２０％失った。生存ＬＩＤマウスは何らの毒性サインも示さなかった。低下したＩＧＦ−Ｉによる防御の範囲を決定するため、我々は化学療法薬の異なるクラスを表す２つの追加薬５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）とドキソルビシン（ＤＸＲ）を試験した。シクロホスファミドはＤＮＡアルキル化剤［４８］、５−ＦＵは代謝拮抗剤［４９］、ＤＸＲは挿入剤およびトポイソメラーゼＩＩ阻害剤［５０，５１］、およびエトポシドはトポイソメラーゼＩＩ阻害剤［５２］である。高用量の５−ＦＵで処理後、ＬＩＤおよび対照における生存率は改善され、それぞれ５５％ ｖｓ．１０％であったが、その差は有意ではなかった（図２８Ｃ，ｎ＝１１／ＬＩＤ，ｎ＝１０／対照、Ｐ＝０．１４８）。同様であるが、より明白な効果がＤＸＲにつき得られた。高用量の単回注入後げっ歯類の尾静脈に不可逆性の障害を引き起こし得るエトポシドおよび他の薬物と異なり、ＤＸＲは２−３サイクル注入ができる。ゆえに、化学療法の複数のサイクルの効果を試験するため、我々は２サイクルの高用量ＤＸＲでＬＩＤマウスを検証した。最初のＤＸＲ注入（２０ｍｇ／ｋｇ）は何らの毒性関連死ももたらさなかったが、全てのマウスで著しい体重減少につながった（図２８Ｄ）。ＤＸＲ注入後５日間に体重減少はＬＩＤマウスでより明白であったが、体重を減少し続け、毒性のサインを示した対照とは異なり、ＬＩＤマウスはその後３週後の間にはそれらの体重を回復させた。２番目のＤＸＲ注入（２８ｍｇ／ｋｇ）は対照マウスにかなりの量のＤＸＲ関連死（２５％生存）をもたらしたが、ＬＩＤマウスは１００％の生存であった（図２８Ｄ，ｎ＝５／ＬＩＤ， ｎ＝４／対照，Ｐ＝０．０２２）。
メラノーマ担癌ＬＩＤマウスにおける高用量ドキソルビシンに対する分別的なストレス耐性
次に、我々は、主に肺に転移する悪性度の高いメラノーマ細胞株（Ｂ１６Ｆｌｕｃ）を移植したＬＩＤマウスをモニターすることによってインビボＤＳＲ試験を実施した［５３］。Ｂ１６ＦｌｕｃはＢ１６マウスメラノーマ細胞株の発光性の誘導細胞である。ゆえに、腫瘍の進行と縮小を可視化でき、生物発光画像技術（ＢＬＩ）を用いてインビボで定量することができる［５３］。ＬＩＤマウスとその対照マウスにＢ１６Ｆｌｕｃ（２ｘ１０５細胞／マウス）メラノーマ細胞を静脈内に注入し、高用量のＤＸＲで２サイクル治療した（図７Ａ，ｎ＝４／ＬＩＤ−Ｂ１６，ｎ＝５／ＬＩＤ−Ｂ１６−ＤＸＲ，ｎ＝８／対照−Ｂ１６，ｎ＝７／対照−Ｂ１６−ＤＸＲ）。ＩＧＦ−Ｉは形質転換、抗アポトーシス、腫瘍増殖、および転移において主な役割を果たす［５４］が、ＬＩＤマウスとその対照マウスのいずれも癌移植後早くも２５日目には転移に屈し始めた。２サイクルの高用量ＤＸＲはすべてのマウスで転移を遅延させ生存時間を延長した（図２９ＢおよびＣ）。ＤＸＲ治療した対照マウスのかなりの数が心筋症のサインがあって毒性で死亡（４３％）したが、ＬＩＤマウスはＤＸＲ毒性では一匹も死ななかった（図２９ＤおよびＦ）。加えて、ＬＩＤマウスは体重維持で軽度の有意性を示した（図２９Ｅ）。癌移植９０日後には化学療法を受けたすべての対照マウスは癌転移またはドキソルビシン毒性で死亡していたが、２サイクルの高用量ＤＸＲ治療を受けたＬＩＤマウスの６０％は癌がなく、明らかな毒性副作用もなかった（図２９Ｂ，Ｐ＜０．０５）。すべてのＬＩＤマウスの死亡は癌転移によるものであった。ＤＸＲで治療されたＢ１６Ｆｌｕｃ注入対照およびＬＩＤマウスにおける癌の進行と死亡は同様であり、循環ＩＧＦ−Ｉの低下は高用量化学療法から癌細胞ではなく宿主を防御することが示唆された。
考察
以前の報告において、我々は、短期絶食（ＳＴＳ）に基づくＤＳＲ法が高用量化学療法に対して癌細胞ではなく、宿主を防御することを記述した。この記述の基礎には、細胞が種々の侵襲に対して細胞を防御するために残存するエネルギー源を使う目的で絶食に応答して侵入する非分裂または低分裂「維持モード」の存在があると思われる（図３０）。ここに我々は、哺乳類のＤＳＲ調節におけるＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＲの役割を調べ、循環ＩＧＦ−Ｉの大きな低下は化学療法に対して癌細胞ではなく宿主を防御することができることを見出した。低レベルのＩＧＦ−Ｉは、ＩＧＦ−ＩＲの下流の２つの主要な経路の成分であるＲａｓおよびＡｋｔを含む細胞内の分裂促進シグナル伝達経路を縮小させることができる。この細胞分裂刺激の低下は正常細胞に細胞周期を停止させ［５５，５６］、Ａｋｔ，Ｒａｓ／ＥＲＫ，ＦＯＸＯ，ＳｉｒＴ１，およびＥＲストレス応答［６，１８，２３，３５］を含むタンパク質によって制御される機序によってエネルギーを修復へ転換させる、それによって高度な防御“維持モード”［６，５６］に進入させると我々は信ずる。一方、癌細胞は増殖シグナルにおいて自給自足であり、生理学的な抗増殖シグナルに低応答または応答しない［６，２０，３５］。これは、完全なコンフルエント下で処理された我々のＲ＋およびＲ−細胞に観察されたＤＸＲに対する分別的な防御を説明できるであろう。加えて、我々の酵母実験は、ＲＡＳおよび／またはＡＫＴ／Ｓ６Ｋの相同体の欠損がＤＸＲに対する防御を促進するが、発癌性のＲＡＳ２ｖａｌ１９の発現が細胞分裂と独立して防御を逆転させることを示している。これらの結果は、ＲａｓからＰＴＥＮ／ＡＫＴ からＰＫＡ経路の範囲の経路を活性化する発癌性の突然変異が癌細胞におけるＩＧＦ−Ｉシグナル伝達下方制御の防御効果を逆転させるのに十分である可能性があり、ゆえに宿主および種々の癌の分別的防御を許容するという可能性を高める。特に、ＩＧＦ−ＩＲは正常細胞においてＲａｓ、Ａｋｔなどを活性化することができる多くの受容体の内に単なる一つであり、それゆえ、分別的なストレス耐性を供給するために下方制御することができる受容体の内のただ一つであると説明することができよう。
前臨床試験は、ＩＧＦ−ＩＲ標的戦略が、多発性骨髄腫、前立腺癌、乳癌、結腸癌に加えて他の癌の治療に有効であり得ることを示している［４２，５７］。かかる薬剤に見られる抗腫瘍効果は、ＩＧＦ−ＩＲ不活化に起因するアポトーシスに依存すると考えられる［５７］。しかし、ＩＧＦ−ＩＲ遮断は正常細胞においてアポトーシスを開始させることもでき、血液細胞の増殖／回復に介入することによって高用量化学療法に対して防御しない可能性があることに注目しなければならない。我々のＬＩＤマウスで観察されたように、低下したＩＧＦ−ＩはＩＧＦ−ＩＲ遮断とは異なり、癌細胞死をもたらすことはないが、化学毒性に対する正常細胞の耐性を選択的に増強することができ、かつ、癌細胞の化学療法に対する感受性を高める可能性がある。これは、ＬＩＤ−ＴＲＡＭＰモデルにおける前立腺癌の正常な進展に関する我々の最近の観察と一致する［４６］。エトポシド処理ＬＩＤマウスに起因する我々の結果に基づき、循環ＩＧＦ−Ｉを減らす戦略が特定の化学療法薬の毒性を増強する可能性もある。それゆえ、各薬物とＩＧＦ−Ｉ低下／遮断療法の間の適合性は、候補として考慮される前に前臨床試験で注意深く試験されるべきである。
要約すれば、我々のマウスにおける研究は、循環ＩＧＦ−Ｉの大きな低下は癌細胞ではなく、宿主に耐性の増強を供給することができ、ゆえに、絶食を必要とすることなく癌治療を増強するための方法の基礎を供給する。しかし、絶食とＩＧＦ−Ｉ低下の組み合わせはさらに明確な効果を供給し得る。循環ＩＧＦ−Ｉの低下が種々の癌に利用される可能性があることに注目することは重要である。
方法
細胞株
初代混合グリア細胞は、前述のように１−３日齢のスプラーグドーリーラット新生児（チャールスリバー社）の大脳皮質から取得した［５８］。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で１０−１４日間培養した細胞をアッセイに使用した。Ｃ６，Ａ１０−８５、および９Ｌラットグリオーマ細胞株はＣｈｅｎ博士（南カリフォルニア大学）のご厚意により提供され、Ｒ＋およびＲ−細胞はＢａｓｅｒｇａ博士（トーマスジェファーソン大学）のご厚意により提供され、１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、５％炭酸ガス、３７℃で維持された。Ｒ＋およびＲ−細胞はそれぞれヒトＩＧＦ−ＩＲを過剰発現するまたはＩＧＦ−ＩＲを欠損するマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）であり、前述のように作製された［３３］。Ｒ−細胞はｉｇｆ１ｒ遺伝子を標的破壊されたマウス胚に由来３Ｔ３様細胞である［３３］。Ｒ＋細胞株は、Ｒ−細胞から得られ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下にヒトｉｇｆ１ｒ ｃＤＮＡを発現する［３３］。胎生１８日のスプラーグドーリーラット大脳皮質からの初代ニューロンを０．５ｍＭのＬ−グルタミン、２５μＭのＬ−グルタミン酸および２％Ｂ−２７を添加した神経培養用基礎培地（インビトロジェン社）中に分離し、ホウ酸塩緩衝液（０．１５Ｍ，ｐＨ８．４）に溶解した１０μｇ／ｍｌポリ−Ｄ−リジンでプレコートした９６穴プレートに６４０細胞／ｍｍ２で播種した。ニューロンはＢ−２７および０．５ｍＭのＬ−グルタミンを添加した神経培養用基礎培地中、５％炭酸ガス、３７℃で４日間維持した。ＰＣ１２ラット褐色細胞腫細胞株（ＡＴＣＣ）を１５％ウマ血清および２．５％ウシ胎児血清を添加したＦ１２Ｋ培地中、５％炭酸ガス、３７℃で維持した。
インビトロＩＧＦ−Ｉ調節
すべての細胞は処理前にコンフルエントまで増殖させた。ＩＧＦ−ＩＲ活性化の阻害は１％ＦＢＳ加ＤＭＥＭ／Ｆ１２中２４時間の抗ＩＧＦ−ＩＲモノクローナル抗体（αＩＲ３，１μｇ／ｍｌ；カルビオケム社）で達成した。血清制限は、細胞を１０％または１％ＦＢＳのいずれかを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２中２４時間のインキュベートにより実施した。ＩＧＦ−Ｉ処理は、細胞を１％ＦＢＳおよびｒｈＩＧＦ−Ｉ（１００ｎｇ／ｍｌ、ＰｒｏＳｐｅｃ−Ｔａｎｙ ＴｅｃｈｎｏＧｅｎｅ，レホヴォト、イスラエル）加ＤＭＥＭ／Ｆ１２中で４８時間のインキュベートにより実施し、中年ヒトのＩＧＦ−Ｉレベル範囲内であることが示された［３２］。
インビトロ薬物処理
初代グリアおよびＣ６，Ａ１０−８５，および９Ｌラットグリオーマ細胞を２ｘ１０４細胞／穴で播種し、９６穴プレートで４８時間インキュベートして増殖の差が最小化する処理前にコンフルエントに達した。種々のＩＧＦ−Ｉ調節前処理後、シクロホスファミド（ＣＰ，シグマ社）で処理した。グリア細胞はチトクロムＰ４５０を発現することが報告されており、ゆえに、プロドラッグＣＰを代謝することができる［５９，６０］。ＣＰは１％ＦＢＳ加ＤＭＥＭ／Ｆ１２中で４０ｍｇ／ｍｌに調製し、ろ過滅菌した。原液は４℃で２週間以内貯蔵した。細胞は１％ＦＢＳ加ＤＭＥＭ／Ｆ１２中で種々の濃度のシクロホスファミド（０−１５ｍｇ／ｍｌ）で１０時間インキュベートした。Ｒ＋およびＲ−細胞は２ｘ１０４細胞／穴に播種し、９６穴プレート中でインキュベートし、また、ドキソルビシン（ＤＸＲ）処理前にコンフルエント（２日間）に増殖した。ＤＸＲは無菌生理食塩水中で５ｍｇ／ｍｌに調製した。細胞をＤＸＲで２４時間およびＭＴＴ還元による生存解析前４８時間処理した。オクトレオチド存在または非存在下で（１０および５０μＭ）、異なる濃度のエトポシド（１−３μＭ）で７２時間処理したＮＸＳ２神経芽細胞腫細胞をスクレイピングにより回収し、完全培地で洗浄し、トリパンブルー（０．０４％；シグマ社；セントルイス市、ミズーリ州）で３７℃１分インキュベートした。その後、細胞をビルケル計算盤（Ｔｅｃｎｏｖｅｔｒｏ、モンザ ミラノ、イタリア）中に設置し、位相差顕微鏡（オリンパス光学工業株式会社、東京、日本）にてカウントした。顕微視野（各処理につき４視野カウントした）あたりのトリパンブルー陽性細胞（すなわち死細胞）、トリパンブルー陰性細胞（すなわち生細胞）、および全細胞をカウントした。死（または生）細胞の割合は、死（または生）細胞数を視野当たりの全細胞数で割って算出した。酸化ストレスに対するＩＧＦ−Ｉの効果を決定するため、初代ラットニューロンおよびＰＣ１２細胞をＩＧＦ−Ｉおよびパラコートで処理した。皮質ニューロンは２１ｍＭグルコースおよび１％ウマ血清を添加したイーグルの最少必須培地（インビトロジェン社）で２４時間処理した。ＰＣ１２細胞はポリ−Ｄ−リシン被覆９６穴プレート上に５ｘ１０４細胞／穴で播種し、１％ＨＳ加Ｆ１２Ｋで２４時間増殖させた。両タイプの細胞のいずれもその後適切な培地で１００μＭのパラコート単独、またはその３０分後ＩＧＦ−Ｉ（１００ｎｇ／ｍｌ）またはＩＧＦ−Ｉ（１００ｎｇ／ｍｌ）単独で処理した。生存はＭＴＴ還元アッセイにより決定し、対照に対する処理のパーセントで表した。
インビトロ生存アッセイ
細胞毒性は、ＣｙｔｏＴｏｘ ９６ Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ キット（プロメガ株式会社）を用いて遊離した乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）またはメチルチアゾリルジフェニル−テトラゾリウム ブロミド（ＭＴＴ）還元能のいずれかで測定した。ＭＴＴはミトコンドリア（代謝的に活性名細胞）の中でミトコンドリア還元酵素により還元されて、不溶な紫ホルマザン結晶が生成し、この結晶は界面活性剤の添加により溶解した［１］。簡潔には、ＭＴＴをＰＢＳ中に５ｍｇ／ｍｌに調製し、１％ＦＢＳ加ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中に希釈して最終濃度０．５ｍｇ／ｍｌとし、アッセイ用とした。実験処理後、培地を１００μｌのＭＴＴで置換し、細胞を３７℃で３−４時間インキュベートした。ホルマザン結晶を１００μｌ溶解緩衝液（（ｗ／ｖ）１５％ＳＤＳ，（ｖ／ｖ）５０％ジメチルホルムアミド、ｐＨ４．７）で３７℃一晩（１６時間）溶解した。生存は処理細胞の対照細胞に対するＭＴＴ還元レベルの割合で表した。マイクロプレートリーダーＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ２５０（モレキュラーデバイス社）およびＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ３．０ソフトウェア（モレキュラーデバイス社）を用いて５７０ｎｍで吸収を読み取った。
コメット解析手順
細胞を培地（１０％ＦＢＳ加ＤＭＥＭ／Ｆ１２）で１０５／ｍｌに希釈し、５０μＭのＤＸＲで３７℃、１時間処理した。その後、細胞を冷ＰＢＳで１回洗浄し、製造業者の推奨する手順に従ってコメット解析（トレビジェン社、ガイザーズバーグ、メリーランド州）にかけた。コメット画像はＮｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＴＥ３００蛍光顕微鏡により獲得し、Ｃｏｍｅｔ Ｓｃｏｒｅソフトウェア（ＴｒｉＴｅｋ Ｃｏｒｐ．，ｖｅｒ１．５）で解析した。各遺伝子型／処理群毎に１００−３００細胞をスコア化した。
血漿ｍＧＨ，ｍＩＧＦ−Ｉ、およびＩＧＦＢＰ−１および−３の測定
前述のように、Ｒ＆Ｄシステム（ミネアポリス、ミネソタ州）からの組み換えマウスＩＧＦ―Ｉタンパク質およびモノクローナル抗体を用いて学内のＥＬＩＳＡ法によって血漿ｍＩＧＦ−Ｉ、およびｍＩＧＦＢＰ−１および−３のアッセイを実施した［６１］。ｍＧＨレベルはラット／マウスＧＨ ＥＬＩＳＡキット（アルプコダイアグノスティックス社）により測定した。
血糖測定
７２時間絶食後、２％吸入イソフルレンによりマウスを麻酔し、左室心穿刺により血液を採取した。血糖はＰｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｘｔｒａ血糖モニタリングシステム（アボットラボラトリーズ社、米国）を用いて測定した。
マウスにおけるＳＴＳ／オクトレオチド処理
マウスＮＸ３ＩＴ２８細胞株は前述の通りＧＤ２−陰性Ｃ１３００マウス神経芽細胞腫細胞株（Ａ／Ｊ背景）をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスからのマウス後根神経節細胞とハイブリダイズして作製した［６２］。ＮＸＳ２亜系統は、その後、ＧＤ２を高発現するＮＸ３ＩＴ２８細胞の選択によって創製した［４３］。体重１５−１８ｇの雌性Ａ／ＪマウスはＨａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈａｒｌａｎ Ｉｔａｌｙ，Ｓ．Ｐｉｅｔｒｏ ａｌ Ｎａｔｉｓｏｎｅ，イタリア）より購入し、特定のウイルスおよび抗原フリー条件下無菌ケージ内で飼育した。すべての手順はｌｉｃｅｎｓｉｎｇ ａｎｄ ｅｔｈｉｃａｌ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，ジェノア、イタリア、およびイタリア保健省によってレビューおよび承認された。Ａ／Ｊマウスは１ｍｇ／ｋｇ／日量のオクトレオチド（ＯＣＴ， ＰｒｏＳｐｅｃ−Ｔａｎｙ ＴｅｃｈｎｏＧｅｎｅ，レホボト、イスラエル）を４日間１００μｌの液量で尾静脈より緩徐に投与して４日間前処理した。オクトレオチド処理４日後、マウスに前述の通りＮＸＳ２細胞（２００，０００細胞／マウス）を静脈内に注入した［４３］。腫瘍細胞を注入後、一部の動物を４８時間絶食させ、その後、８０ｍｇ／ｋｇのエトポシド（Ｔｅｖａ Ｐｈａｒｍａ Ｂ．Ｖ．，Ｍｉｊｄｒｅｃｈｔ，オランダ）を静脈内に単回投与した。化学療法後ＯＣＴをさらに４日間連日投与した。非食事介入対照群とＯＣＴ処理群も調べた。
オクトレオチド前処理：１ｍｇ／ｋｇ／日、１−４日目、４日間
ＮＸＳ２：４日目に２００，０００／マウス
ＳＴＳ：４日目から６日目（腫瘍細胞注入後）
エトポシド：７日目に８０ｍｇ／ｋｇ
オクトレオチド後処理：８−１１日目
毒性と有効性を決定するため、体重減少と一般行動につき定期的にマウスをモニターした。動物は、腹部膨張、脱水、または下半身不随等で健康障害のサインを示した場合、キシリジン（２％キシロール， Ｂｉｏ９８ Ｓｒｌ， ミラノ、イタリア）で麻酔後、頸椎脱臼により屠殺した。
ＬＩＤマウスにおける化学療法治療に対するストレス耐性
７５−１００週齢のＬＩＤマウスをヒト発癌モデルのために使用した［６３］。肝がＩＧＦ−Ｉ産生の主要な供給源なので、条件付き肝ｉｇｆ１遺伝子ノックアウトマウスは循環ＩＧＦ−Ｉレベルを８０％まで低下させている［４６］。アルブミンは生後１０日に肝で発現されるが、ｉｇｆ１遺伝子欠損に起因して、ＬＩＤマウスは、ｉｇｆ１遺伝子ノックアウト（ｉｇｆ１−／−）マウスのように早期死亡、増殖遅延、または発育障害を経験しない［４５，６４，６５］。ＬＩＤマウスおよび対照マウスに１００ｍｇ／ｋｇのエトポシドを静脈内に投与した。ＣＰは５００ｍｇ／ｋｇを投与した。ＣＰは生理食塩水に４０ｍｇ／ｍｌで溶解し、腹腔内に注入した。５−フルオロウラシル（５−ＦＵ，シグマ社）は４００ｍｇ／ｋｇを腹腔内に注入した。ドキソルビシン（ＤＸＲ，シグマ社）は生理食塩水中で５ｍｇ／ｍｌに調製し、最初２０ｍｇ／ｋｇ、２２日後に２８ｍｇ／ｋｇで静脈内に注入した。全ての薬物は異なるカテゴリーから選択した。ＣＰはＤＮＡアルキル化剤［４８］、５−ＦＵは代謝拮抗剤［４９］、ＤＸＲは挿入剤およびトポイソメラーゼＩＩ阻害剤［５０，５１］、およびエトポシドはトポイソメラーゼＩＩ阻害剤である［５２］。エトポシド、ＣＰ、５−フルオロウラシル、およびＤＸＲは活性酸素種（ＲＯＳ）を増やし、酸化ストレスをもたらすことを示した［６６−６９］。すべてのマウスは毎日体重減少と疼痛およびストレス症状をモニターした。末期の瀕死にあると決定されたマウスはＣＯ２麻酔下に安楽死させ、剖検を実施した。実験はＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（南カリフォルニア大学、ロサンゼルス、カリフォルニア州）および国立衛生研究所ガイドラインに従って実施した。
ＬＩＤマウスにおけるＤＸＲに対する分別的ストレス耐性
分別的ストレス耐性を調べるため、マウスに高転移性メラノーマ細胞を注入した。７５−１００週齢のＬＩＤマウスおよび対照マウスを使用した。Ｂ１６Ｆｌｕｃメラノーマ細胞はＵＣＬＡのノア クラフト博士からの寛大なる贈呈であった。Ｂ１６Ｆｌｕｃ細胞はＢ１６細胞の類縁体であるが、ＣＭＶプロモーターの駆動によるホタルルシフェラーゼ遺伝子の安定な形質転換により光を生産する［５３］。注入前に、細胞を洗浄し、無菌生理食塩水に懸濁した。各マウスに１００μｌ中の２ｘ１０５細胞を注入し、その後、別の１００μｌ無菌生理食塩水を尾に残存する細胞の洗浄のために注入した。腫瘍接種３日後、最初のＤＸＲ（ベッドフォード研究所）注入は１６ｍｇ／ｋｇの投与量であった。最初のＤＸＲ投与２週後に２回目のＤＸＲを１２ｍｇ／ｋｇ投与した。マウスのストレス症状または疼痛を毎日観察し、体重を記録した。末期の瀕死状態にあるマウスはＣＯ２麻酔下に屠殺し、剖検を実施した。更なる組織学的検査用に心臓を採取した。
生物発光画像法
生物発光画像法（ＢＬＩ）用にＬＩＤマウス群および対照マウス群から５匹のマウスを無作為に選択し、実験期間中追跡した。すべてのＢＬＩ画像の手順は南カリフォルニア大学（ＵＳＣ）Ｓｍａｌｌ Ａｎｉｍａｌ Ｉｍａｇｉｎｇコア施設で実施した。イメージングの前に、吸入イソフルレン（２％）を用いてマウスを麻酔し、６０μｌ、５０ｍｇ／ｋｇのルシフェラーゼ基質ルシフェリン（ゼノジェン・コーポレーション）を注入した。１０分後、マウスを仰臥位にてイメージ化し、ＩＶＩＳ ２００光学的画像システム（ゼノジェン コーポレーション）を用いて２分スキャンした。シグナル強度は検出器によりフォトン計数率／単位体面積／対立体角単位として数量化した（フォトン／ｓ／ｃｍ２／ステリジアン単位）。イメージはＩＶＩＳ ２００およびＬＩＶＩＮＧ ＩＭＡＧＥ ３Ｄ（ゼノジェン コーポレーション）ソフトウェアにより解析した。
組織学的研究
２サイクルの高用量ＤＸＲ後、メラノーマ担癌ＬＩＤマウスおよび対照マウスの組織学的検査用に心臓を採取した。心不全がＤＸＲ投与後の急性毒性の主要な原因として記述されていることから、我々は組織レベルで心臓を調べた［７０］。本臓器を採取し、氷冷ＰＢＳで洗浄し、１０％中性緩衝ホルマリン（ＶＷＲ）に貯蔵した。試料をパラフィン包埋し、５μｍに薄切し、Ｈ＆Ｅ染色した。ＵＳＣ Ｋｅｃｋ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅの病理学教授ダオー博士とともに試料を観察し、解析した。
酵母株
すべての実験はマサチューセッツ工科大学（ケンブリッジ、マサチューセッツ州）のＤ．ボットシュタインにより提供されたＤＢＹ７４６（ＭＡＴα，ｌｅｕ２−３，１１２，ｈｉｓ３Δ１，ｔｒｐ１−２８９，ｕｒａ３−５２，ＧＡＬ＋）株につき実施された。ｓｃｈ９Δ変異株は前述の通りである［７１］。すべての変異株は、一段階遺伝子置換によるＤＢＹ７４６背景に由来する［７２］。
増殖条件
酵母の経時的寿命を使い古されたＳＤＣ培地で４８時間毎にコロニー形成ユニット（ＣＦＵｓ）を測定することによってモニターした。１日目のＣＦＵ数は最初の生存（１００％）と考えられ、加齢依存性の致死率の決定用に使用した［７３］。培養物は１日目に２００μＭのＤＸＲで１回処理した。
突然変異頻度の測定
野生型株および変異株に発生する突然変異のタイプを特徴づけるために、我々は、ＣＡＮ１（ＹＥＬ０６３）遺伝子の突然変異頻度を測定した［７４，７５］。Ｃａｎｒ突然変異は大部分点突然変異および小さな挿入／欠失、複雑な現象および全体の染色体再配置を含む他のＤＮＡ突然変異に起因する［３５］。経時的な加齢培養から細胞を２日毎に選択培地上に播種した。突然変異頻度は前述したように生細胞数に基づき計数した［３６，３７］。
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５１． Ｔｅｗｅｙ ＫＭ， Ｒｏｗｅ ＴＣ， Ｙａｎｇ Ｌ， Ｈａｌｌｉｇａｎ ＢＤ， Ｌｉｕ ＬＦ （１９８４） Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｍａｍｍａｌｉａｎ ＤＮＡ ｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ ＩＩ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２６： ４６６−４６８．
５２． Ｈａｎｄｅ ＫＲ （１９９８） Ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ： ｆｏｕｒ ｄｅｃａｄｅｓ ｏｆ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ ＩＩ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ． Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ３４： １５１４−１５２１．
５３． Ｃｒａｆｔ Ｎ， Ｂｒｕｈｎ ＫＷ， Ｎｇｕｙｅｎ ＢＤ， Ｐｒｉｎｓ Ｒ， Ｌｉａｕ ＬＭ， ｅｔ ａｌ． （２００５） Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｍｅｌａｎｏｍａ ｉｎ ｌｉｖｅ ｍｉｃｅ． Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ １２５： １５９−１６５．
５４． Ｓａｍａｎｉ ＡＡ， Ｙａｋａｒ Ｓ， ＬｅＲｏｉｔｈ Ｄ， Ｂｒｏｄｔ Ｐ （２００７） Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ＩＧＦ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ： ｏｖｅｒｖｉｅｗ ａｎｄ ｒｅｃｅｎｔ ｉｎｓｉｇｈｔｓ． Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｖ ２８： ２０−４７．
５５． Ｋｅｙｏｍａｒｓｉ Ｋ， Ｐａｒｄｅｅ ＡＢ （２００３） Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｒｍａｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ｔｏｘｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃｈｅ ｍｏ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｇｅｎｔｓ． Ｐｒｏｇ Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ Ｒｅｓ ５： ５２７−５３２．
５６． Ｂｌａｇｏｓｋｌｏｎｎｙ ＭＶ， Ｐａｒｄｅｅ ＡＢ （２００１） Ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｉｎｇ ｆｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｒｍａｌ ｃｅｌｌｓ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６１： ４３０１−４３０５．
５７． Ｔａｏ Ｙ， Ｐｉｎｚｉ Ｖ， Ｂｏｕｒｈｉｓ Ｊ， Ｄｅｕｔｓｃｈ Ｅ （２００７） Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｄｉｓｅａｓｅ： ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ １ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐａｔｈｗａｙ− ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ． Ｎａｔ Ｃｌｉｎ Ｐｒａｃｔ Ｏｎｃｏｌ ４： ５９１−６０２．
５８． ＭｃＣａｒｔｈｙ ＫＤ， ｄｅ Ｖｅｌｌｉｓ Ｊ （１９８０） Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｐａｒａｔｅ ａｓｔｒｏｇｌｉａｌ ａｎｄ ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｆｒｏｍ ｒａｔ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｔｉｓｓｕｅ． Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ８５： ８９０−９０２．
５９． Ｇｅｎｇ Ｊ， Ｓｔｒｏｂｅｌ ＨＷ （１９９８） Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ ｇｌｉｏｍａ Ｃ６ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ． Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ ７８４： ２７６−２８３．
６０． Ｋｅｍｐｅｒｍａｎｎ Ｇ， Ｋｎｏｔｈ Ｒ， Ｇｅｂｉｃｋｅ−Ｈａｅｒｔｅｒ ＰＪ， Ｓｔｏｌｚ ＢＪ， ＶｏＩｋ Ｂ （１９９４） Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ ｉｎ ｒａｔ ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ： ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｐｈｅｎｙｔｏｉｎ． Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ ３９： ５７６−５８８．
６１． Ｈｗａｎｇ ＤＬ， Ｌｅｅ ＰＤ， Ｃｏｈｅｎ Ｐ （２００８） Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｏｎｔｏｇｅｎｙ ｏｆ ｍｕｒｉｎｅ ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ （ＩＧＦ）−Ｉ， ＩＧＦ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−３ ａｎｄ ｔｈｅ ＩＧＦ−ｒｅｌａｔｅｄ ａｃｉｄ−ｌａｂｉｌｅ ｓｕｂｕｎｉｔ． Ｇｒｏｗｔｈ Ｈｏｒｍ ＩＧＦ Ｒｅｓ １８： ６５−７４．
６２． Ｇｒｅｅｎｅ ＬＡ， Ｓｈａｉｎ Ｗ， Ｃｈａｌａｚｏｎｉｔｉｓ Ａ， Ｂｒｅａｋｆｉｅｌｄ Ｘ， Ｍｉｎｎａ Ｊ， ｅｔ ａｌ． （１９７５） Ｎｅｕｒｏｎａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄ ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ Ｘ ｓｙｍｐａｔｈｅｔｉｃ ｇａｎｇｌｉｏｎ ｃｅｌｌｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ７２： ４９２３−４９２７．
６３． Ｊｅｍａｌ Ａ， Ｓｉｅｇｅｌ Ｒ， Ｗａｒｄ Ｅ， Ｈａｏ Ｙ， Ｘｕ Ｊ， ｅｔ ａｌ． （２００８） Ｃａｎｃｅｒ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ， ２００８． ＣＡ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ Ｃｌｉｎ ５８： ７１−９６．
６４． Ｌｉｕ ＪＰ， Ｂａｋｅｒ Ｊ， Ｐｅｒｋｉｎｓ ＡＳ， Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ ＥＪ， Ｅｆｓｔｒａｔｉａｄｉｓ Ａ （１９９３） Ｍｉｃｅ ｃａｒｒｙｉｎｇ ｎｕｌｌ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ Ｉ （Ｉｇｆ−１） ａｎｄ ｔｙｐｅ １ ＩＧＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ （Ｉｇｆｌｒ）． Ｃｅｌｌ ７５： ５９−７２．
６５． Ｂａｋｅｒ Ｊ， Ｌｉｕ ＪＰ， Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ ＥＪ， Ｅｆｓｔｒａｔｉａｄｉｓ Ａ （１９９３） Ｒｏｌｅ ｏｆ ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｄ ｐｏｓｔｎａｔａｌ ｇｒｏｗｔｈ． Ｃｅｌｌ ７５： ７３−８２．
６６． Ｔｓａｉ−Ｔｕｒｔｏｎ Ｍ， Ｌｕｏｎｇ ＢＴ， Ｔａｎ Ｙ， Ｌｕｄｅｒｅｒ Ｕ （２００７） Ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ＣＯＶ４３４ ｈｕｍａｎ ｇｒａｎｕｌｏｓａ ｃｅｌｌｓ ｉｎｖｏｌｖｅｓ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ ａｎｄ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ． Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｓｃｉ ９８： ２１６−２３０．
６７． Ｍａｎｄａ Ｋ， Ｂｈａｔｉａ ＡＬ （２００３） Ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｌａｔｏｎｉｎ ａｇａｉｎｓｔ ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ ｉｎ ｍｉｃｅ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ Ｔｏｘｉｃｏｌ １９： ３６７−３７２．
６８． Ｋｕｒｏｓｕ Ｔ， Ｆｕｋｕｄａ Ｔ， Ｍｉｋｉ Ｔ， Ｍｉｕｒａ Ｏ （２００３） ＢＣＬ６ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｉｎ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｒｅａｇｅｎｔｓ ｉｎ Ｂ−ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｃｅｌｌｓ． Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２２： ４４５９−４４６８．
６９． Ｈｗａｎｇ ＪＴ， Ｈａ Ｊ， Ｐａｒｋ ＯＪ （２００５） Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ ａｎｄ ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ ｉｎｄｕｃｅｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃａｌｌｙ ｉｎ ｃｈｅｍｏ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＭＰＫ ａｎｄ ＣＯＸ−２ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ３３２： ４３３−４４０．
７０． Ｒａｊａｇｏｐａｌａｎ Ｓ， Ｐｏｌｉｔｉ ＰＭ１ Ｓｉｎｈａ ＢＫ， Ｍｙｅｒｓ ＣＥ （１９８８） Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｆｒｅｅ ｒａｄｉｃａｌ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｐｅｒｆｕｓｅｄ ｒａｔ ｈｅａｒｔ： ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｃａｒｄｉｏｔｏｘｉｃｉｔｙ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ４８： ４７６６−４７６９．
７１． Ｆａｂｒｉｚｉｏ Ｐ， Ｐｏｚｚａ Ｆ， Ｐｌｅｔｃｈｅｒ ＳＤ， Ｇｅｎｄｒｏｎ ＣＭ， Ｌｏｎｇｏ ＶＤ （２００１） Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｏｎｇｅｖｉｔｙ ａｎｄ ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｂｙ Ｓｃｈ９ ｉｎ ｙｅａｓｔ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２： ２８８−２９０．
７２． Ｂｒａｃｈｍａｎｎ ＣＢ， Ｄａｖｉｅｓ Ａ， Ｃｏｓｔ ＧＪ， Ｃａｐｕｔｏ Ｅ， Ｌｉ Ｊ， ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｄｅｓｉｇｎｅｒ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｓｔｒａｉｎｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｓ２８８Ｃ： ａ ｕｓｅｆｕｌ ｓｅｔ ｏｆ ｓｔｒａｉｎｓ ａｎｄ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｆｏｒ ＰＣＲ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． Ｙｅａｓｔ １４： １１５−１３２．
７３． Ｆａｂｒｉｚｉｏ Ｐ， Ｌｏｎｇｏ ＶＤ （２００３） Ｔｈｅ ｃｈｒｏｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｌｉｆｅ ｓｐａｎ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ． Ａｇｉｎｇ Ｃｅｌｌ ２： ７３−８１．
７４． Ｆａｂｒｉｚｉｏ Ｐ， Ｇａｔｔａｚｚｏ Ｃ， Ｂａｔｔｉｓｔｅｌｌａ Ｌ， Ｗｅｉ Ｍ， Ｃｈｅｎｇ Ｃ， ｅｔ ａｌ． （２００５） Ｓｉｒ２ ｂｌｏｃｋｓ ｅｘｔｒｅｍｅ ｌｉｆｅ−ｓｐａｎ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ． Ｃｅｌｌ １２３： ６５５−６６７．
７５． Ｆａｂｒｉｚｉｏ Ｐ， Ｂａｔｔｉｓｔｅｌｌａ Ｌ， Ｖａｒｄａｖａｓ Ｒ， Ｇａｔｔａｚｚｏ Ｃ， Ｌｉｏｕ ＬＬ， ｅｔ ａｌ． （２００４） Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｉｓ ａ ｍｅｄｉａｔｏｒ ｏｆ ａｎ ａｌｔｒｕｉｓｔｉｃ ａｇｉｎｇ ｐｒｏｇｒａｍ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ． Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １６６： １０５５−１０６７．
７６． Ｖｉｌｌａｎｉ Ｆ， Ｇａｌｉｍｂｅｒｔｉ Ｍ， Ｚｕｎｉｎｏ Ｆ， Ｍｏｎｔｉ Ｅ， Ｒｏｚｚａ Ａ， ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ ｂｙ ｒｅｄｕｃｅｄ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ． Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ２８： ３６５−３６９．
骨髄抑制、胃腸障害、および疲労を含む化学療法の毒性副作用は用量と癌治療期間を制限する。幾つかの化学防御剤が特定組織の防御を供給することが示されてきたが、正常細胞と癌細胞に対する分別的効果は制限されている。最近、我々は、短期絶食（ＳＴＳ）が化学療法に対して癌細胞ではなく、正常細胞を選択的に防御する（分別的ストレス耐性、ＤＳＲ）ことを報告した。ここに我々はＳＴＳ依存性防御の機序を調べた。マウスでは、７２時間絶食はＩＧＦ−Ｉを７０％まで減らし、ＩＧＦ−Ｉ阻害物質ＩＧＦＢＰ１のレベルを１０倍増加させた。ＩＧＦ−Ｉ／ＩＧＦ−Ｉシグナル伝達の低下はシクロホスファミドから初代グリアを防御したが、グリオーマ細胞は防御せず、かつ、ドキソルビシン依存性ＤＮＡ障害に対してマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦｓ）を防御した。循環ＩＧＦ−Ｉレベルが７０−８０％低下しているＬＩＤマウスは試験した４つの化学療法薬の内３つに対して防御を示し、ドキソルビシンで治療したメラノーマ担癌ＬＩＤマウスは低化学毒性で長期生存率を有意に改善（ＬＩＤマウスおよび対照マウスそれぞれ６０％ ｖｓ．０％）していた。これらの結果は、ＩＧＦ−Ｉが癌細胞ではなく正常細胞における潜在的な防御阻止剤であることを示唆する。
複数の化学療法剤に対する分別的防御のための短期絶食に基づく戦略
要約
化学療法の副作用は癌治療の主要な制限因子である。化学防御剤の開発が進められてきたが、これらは薬物および組織特異性により広範には使用されていない。我々の以前の研究により、絶食の役割および種々のトキシンに対する細胞および生物の防御における絶食調節性の遺伝的経路が示された。最近、我々は短期絶食（ＳＴＳ）がエトポシドに対し選択的に正常細胞とマウスを防御するが、神経芽細胞腫細胞に対してはインビトロおよびインビボにおいてそれぞれまったく防御しないか、またはマイナーな防御を供給したことを報告した（分別的ストレス耐性，ＤＳＲ）。我々のＤＳＲ仮説は、ストレス耐性が発癌経路によって阻止されること、また、それゆえ癌細胞ではストレス耐性が活性化され得ないという事実に基づいている。我々は、他の薬剤に対してＳＴＳがマウスを防御するかどうかを調べ、かつ、異なる悪性細胞の化学療法耐性に対するＳＴＳの効果を調べてきた。報告されたＳＴＳ療法は化学療法投与前の４８−６０時間の絶食から成っている。ここに我々は、シスプラチンに対する防御には化学療法前４８時間、化学療法後２４時間の絶食を要することを示す。ルシフェラーゼを発現するメラノーマ細胞および神経芽細胞腫細胞を用いて、我々はインビボ化学療法の効果をモニターした。我々の結果は、ＳＴＳは化学療法毒性から宿主を防御するが、神経芽細胞腫細胞は防御せず、複数のサイクルのドキソルビシン治療に対してメラノーマ細胞を増感させる可能性が示唆されることを確認した。これらの結果は、短期絶食が広範囲の化学療法に対する正常細胞および癌細胞の分別的な防御に効果がある可能性を有し、化学療法の有効性と健康アウトカムを増強する可能性を示している。
材料と方法
細胞培養
初代混合グリア細胞は１−３日齢のスプラーグドーリーラット新生児（チャールスリバー社）の大脳皮質から取得した。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）加ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（インビトロジェン社）で１０−１４日培養した細胞を使用した。Ｃ６，Ａ１０−８５，９ＬおよびＲＧ２ラットグリオーマ細胞株ならびにＬＮ２２９ヒトグリオーマ細胞株はチェン博士（南カリフォルニア大学）のご厚意により提供され、ＳＨ−ＳＹ５Ｙヒト神経芽細胞腫細胞株は１０％ＦＢＳ加ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中、５％ＣＯ２下、３７℃で維持された。
哺乳類細胞のＳＴＳ処理
初代グリア、グリオーマまたは神経芽細胞腫細胞を９６穴マイクロタイタープレートに２０，０００−３０，０００細胞／穴で播種し、２日間インキュベートした。処理前に細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。すべての処理は５％ＣＯ２下、３７℃で実施された。グルコース制限は、細胞を低グルコース（０．５ｇ／Ｌ）または正常グルコース（１．０ｇ／Ｌ）のいずれかを添加したグルコースフリーＤＭＥＭ（インビトロジェン社）、１％血清で２４時間インキュベートして実施した。血清制限は、１０％または１％ＦＢＳのいずれかを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２で細胞を２４時間インキュベートして実施した。
インビトロ薬物処理
シクロホスファミド（ＣＰ，シグマ社）をインビトロ化学療法研究に使用した。ＳＴＳ処理後、細胞を１％ＦＢＳ加ＤＭＥＭ／Ｆ１２中種々の濃度のシクロホスファミド（６−１５ｍｇ／ｍｌ）で１０時間インキュベートした。生存はＭＴＴ／ＬＤＨアッセイにより決定し、対照に対する処理の％比で表した。
マウスにおけるストレス耐性
Ａ／Ｊマウス、ＣＤ−１マウスおよび胸腺欠損ヌード／ｎｕマウスを使用した。体重１５−１８ｇの６週齢雌性Ａ／Ｊマウス（ハーラン社、イタリア）および体重２０−２２ｇの４週齢雌性胸腺欠損（Ｎｕｄｅ−ｎｕ）マウス（ハーラン社）を４８時間絶食させ、その後、それぞれ８０ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇのエトポシド（テバファーマ、オランダ）を静脈内に注入した。体重１８−２０ｇの４週齢雌性ＣＤ−１マウスを６０時間絶食させ、その後、１１０ｍｇ／ｋｇのエトポシドを静脈内に注入した。すべてのマウスに化学療法後食事を提供し、体重減少と一般行動を毎日モニターした。また、異なる化学療法剤シスプラチンの実験をＣＤ−１マウスで、ドキソルビシンをＡ／Ｊマウスで実施した。
マウスにおける分別的ストレス耐性（ＤＳＲ）
体重１５−１８ｇの６−７週齢雌性Ａ／Ｊマウス（ハーラン社、イタリア）を特定のウイルスと抗原がフリーな条件下で無菌封入体の中で飼育した。Ａ／Ｊマウスにマウス神経芽細胞腫ＮＸＳ２細胞株（２００，０００／マウス）を静脈内に注入した。腫瘍細胞注入後、一部の動物群を４８時間絶食させ、その後、８０ｍｇ／ｋｇのエトポシドを１投与量で静脈内に投与した。非絶食の対照群（ＮＸＳ２群）のマウスも調べた。分別的ストレス耐性をさらに調べるため、Ｃ５７ＢＬ／Ｂ６マウスにＢ１６Ｆｌｕｃメラノーマ細胞を注入した。注入前に細胞を洗浄し、無菌生理食塩水に再懸濁した。各マウスは１００μｌ中の２×１０５個の細胞を受け、その後、別の１００μｌの無菌生理食塩水を尾に残存する細胞の洗浄のために受けた。マウスは無作為に選択し、実験中追跡した。生物発光画像法をＵＳＣ小動物イメージングセンターで実施した。シグナル強度を定量した（フォトン／Ｓ／ｃｍ２／ステリジアン単位）。
結果
図３１−３５参照。
結論
短期絶食（ＳＴＳ）はインビトロおよびインビボで化学毒性に対するストレス耐性を誘導することができる。ＳＴＳ誘導ストレス耐性は種々の通常の化学療法に適用可能である。ＳＴＳは哺乳類細胞および担癌マウスにおいて化学療法薬に対する分別的ストレス耐性（ＤＳＲ）を与えた。ＳＴＳは化学療法に対する癌細胞の感受性を増感させる。
本明細書で引用される全ての出版物はこれらのすべての参照により本明細書中に組み入れられたものとする。

Claims (2)

  1. 単糖、二糖、および多糖の置換物としてのグリセロールを含む食事組成物であって、化学療法または酸化ストレスに暴露した動物またはヒトへの前記食事組成物の投与が前記化学療法もしくは酸化ストレスの前３−１０連日、前記化学療法もしくは酸化ストレスの後２４時間、またはそれらの組み合せで行われることを特徴とする食事組成物。
  2. 請求項１に記載の食事組成物において、当該食事組成物が前記化学療法または酸化ストレスに対して前記動物またはヒトを防御するために用いられることを特徴とする食事組成物。
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