JP2015180607A - Antibody which can treat disease associated with hematopoietic stem cell transplantation such as graft-versus-host disease, and functional fragment thereof and pharmaceutical composition comprising the same - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）などの造血幹細胞移植に伴う疾患を治療することのできる抗体およびその機能断片並びにこれらを含んでなる医薬組成物に関する。 The present invention relates to an antibody, a functional fragment thereof, and a pharmaceutical composition comprising these, which can treat diseases associated with hematopoietic stem cell transplantation such as graft-versus-host disease (GVHD).
造血幹細胞移植や輸血の際に、しばしば、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）が発症することが知られている。ＧＶＨＤは、主にドナーとレシピエントのＨＬＡ型の不一致である場合に、ドナー由来の白血球がレシピエントの組織を攻撃することにより発症する疾患であると考えられている。ＧＶＨＤは、治療により治癒することもあるが、重症例ではほぼ全例が死亡することが知られている。 It is known that graft-versus-host disease (GVHD) often develops during hematopoietic stem cell transplantation and blood transfusion. GVHD is considered to be a disease that develops when donor-derived leukocytes attack the recipient's tissues, mainly when the donor and recipient have mismatched HLA types. GVHD can be cured by treatment, but it is known that almost all cases die in severe cases.
治療法としては、免疫抑制剤（抗胸腺細胞グロブリンなど）やステロイドの投与などの対処療法が試みられているが、多くのＧＶＨＤでは症状が長期に持続するため、根本的な治療とはなっていない。また、治療効果が表われたとしても、免疫抑制剤やステロイドの投与の副作用等の結果、長期生存者のＱＯＬは低い傾向にある。 As treatment, coping therapy such as administration of immunosuppressants (such as anti-thymocyte globulin) and steroids has been tried, but since many GVHD symptoms persist for a long time, it is not a fundamental treatment. Absent. Even if a therapeutic effect appears, the QOL of long-term survivors tends to be low as a result of the side effects of administration of immunosuppressants and steroids.
ところで、造血幹細胞移植では、本来、レシピエントの造血幹細胞をドナーのものに置き換えるべきところ、レシピエント側の白血球が残存してしまうことによる微小残存病変が発症することがある。微小残存病変の治療のゴールは、レシピエント側の白血球を減少させることであり、治療効果を確認することを目的としてレシピエント側の白血球の数量をモニターするためのＨＬＡアリル特異的抗体が開発されている（非特許文献１）。しかし、このような抗体で細胞傷害性を有するものは知られていなかった。 By the way, in hematopoietic stem cell transplantation, the recipient's hematopoietic stem cells should be replaced with those of the donor, but minute residual lesions may develop due to the remaining leukocytes on the recipient side. The goal of treatment of minimal residual disease is to reduce leukocytes on the recipient side, and HLA allele-specific antibodies have been developed to monitor the quantity of leukocytes on the recipient side in order to confirm the therapeutic effect. (Non-Patent Document 1). However, such an antibody having cytotoxicity has not been known.
本発明は、移植片対宿主病などの造血幹細胞移植に伴う疾患を治療することのできる抗体およびその機能断片並びにこれらを含んでなる医薬組成物を提供することを目的とする。 An object of this invention is to provide the antibody which can treat the disease accompanying hematopoietic stem cell transplantation, such as graft-versus-host disease, its functional fragment, and a pharmaceutical composition containing these.
本発明者らは、抗ＨＬＡ抗体がＨＬＡの特定のアリルを発現する細胞に対して細胞傷害性を示すこと、そして、このような抗ＨＬＡ抗体がＧＶＨＤの治療に有効であることを見出した。本発明は、このような知見に基づいてなされた発明である。 The present inventors have found that anti-HLA antibodies are cytotoxic to cells that express specific alleles of HLA and that such anti-HLA antibodies are effective in the treatment of GVHD. The present invention has been made based on such findings.
すなわち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）ＨＬＡの特定のアリルを発現する細胞に対して細胞傷害性を示すアリル特異的抗ＨＬＡ抗体またはその機能断片を含んでなる、医薬組成物。
（２）造血幹細胞移植におけるドナー側の白血球に対して特異的に細胞障害性を示し、レシピエント側の細胞に対しては細胞障害性を示さない、上記（１）に記載の医薬組成物。
（３）造血幹細胞移植におけるレシピエント側の白血球に対して特異的に細胞障害性を示し、ドナー側の白血球に対しては細胞障害性を示さない、上記（１）に記載の医薬組成物。
（４）ＨＬＡの特定のアリルが、クラスＩまたはクラスＩＩのＨＬＡアリルである、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の医薬組成物。
（５）ＨＬＡの特定のアリルが、クラスＩのＨＬＡアリルから選択される１以上のアリルである、上記（４）に記載の医薬組成物。
（６）ＨＬＡの特定のアリルが、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２３：０１またはＨＬＡ−Ａ＊２４：０２のアリルである、上記（５）に記載の医薬組成物。
（７）抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体である、上記（１）〜（６）のいずれかに記載の医薬組成物。
（８）機能断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、ＦｖまたはｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２である、上記（１）〜（７）のいずれかに記載の医薬組成物。
（９）細胞障害作用を増強させたアリル特異的抗ＨＬＡ抗体またはその機能断片を含んでなる、上記（１）〜（８）のいずれかに記載の医薬組成物。
（１０）同種移植拒絶に伴う疾患の処置のための、上記（１）〜（８）のいずれかに記載の医薬組成物。
（１１）移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の処置のための、上記（１０）に記載の医薬組成物。
（１２）微小残存病変の処置のための、上記（１０）に記載の医薬組成物。
（１３）アリル特異的抗ＨＬＡ抗体またはその機能断片が、１〜２５ｍｇ／（ｋｇ体重・日）の投与量で投与されることを特徴とする、上記（１）〜（１２）のいずれかに記載の医薬組成物。
（１４）ＨＬＡの特定のアリルを発現する細胞に対して細胞傷害性を示す、アリル特異的抗ＨＬＡ抗体またはその機能断片。
（１５）ＨＬＡの特定のアリルが、クラスＩまたはクラスＩＩのＨＬＡアリルである、上記（１４）に記載のアリル特異的抗ＨＬＡ抗体またはその機能断片。
（１６）ＨＬＡの特定のアリルが、クラスＩのＨＬＡアリルから選択される１以上のアリルである、上記（１５）に記載のアリル特異的抗ＨＬＡ抗体またはその機能断片。
（１７）ＨＬＡの特定のアリルが、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２３：０１またはＨＬＡ−Ａ＊２４：０２のアリルである、上記（１６）に記載のアリル特異的抗ＨＬＡ抗体またはその機能断片。
（１８）抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体である、上記（１４）〜（１７）のいずれかに記載のアリル特異的抗ＨＬＡ抗体またはその機能断片。
（１９）断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、ＦｖまたはｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２である、上記（１４）〜（１８）のいずれかに記載の断片。
（２０）細胞障害作用を増強させた、上記（１４）〜（１９）のいずれかに記載のアリル特異的抗ＨＬＡ抗体またはその機能断片。
（２１）上記（１４）〜（２０）のいずれかに記載のアリル特異的抗ＨＬＡ抗体またはその機能断片を含んでなる、ＨＬＡアリル特異的な細胞傷害剤。
（２２）特定アリルのＨＬＡを有するヒトＰＢＭＣを移植した、ＧＶＨＤ動物モデル。
That is, according to the present invention, the following inventions are provided.
(1) A pharmaceutical composition comprising an allyl-specific anti-HLA antibody or a functional fragment thereof showing cytotoxicity to cells expressing a specific allele of HLA.
(2) The pharmaceutical composition according to the above (1), which specifically shows cytotoxicity against the leukocytes on the donor side in hematopoietic stem cell transplantation and does not show cytotoxicity against the cells on the recipient side.
(3) The pharmaceutical composition according to (1) above, which specifically shows cytotoxicity against leukocytes on the recipient side in hematopoietic stem cell transplantation and does not show cytotoxicity against leukocytes on the donor side.
(4) The pharmaceutical composition according to any one of (1) to (3) above, wherein the specific allele of HLA is a class I or class II HLA allyl.
(5) The pharmaceutical composition according to (4) above, wherein the specific allyl of HLA is one or more allyl selected from class I HLA allyl.
(6) The above-mentioned (5), wherein the specific allyl of HLA is an allyl of HLA-A * 02: 01, HLA-A * 03: 01, HLA-A * 23: 01 or HLA-A * 24: 02 A pharmaceutical composition according to 1.
(7) The pharmaceutical composition according to any one of (1) to (6) above, wherein the antibody is a human antibody, a humanized antibody or a chimeric antibody.
(8) The pharmaceutical composition according to any one of (1) to (7) above, wherein the functional fragment is Fab, Fab ′, Fab′-SH, Fv or scFv, F (ab ′) 2 .
(9) The pharmaceutical composition according to any one of the above (1) to (8), comprising an allyl-specific anti-HLA antibody having enhanced cytotoxic activity or a functional fragment thereof.
(10) The pharmaceutical composition according to any one of (1) to (8) above, for the treatment of a disease associated with allograft rejection.
(11) The pharmaceutical composition according to (10) above for the treatment of graft-versus-host disease (GVHD).
(12) The pharmaceutical composition according to (10) above, for the treatment of minimal residual lesions.
(13) Any one of (1) to (12) above, wherein the allyl-specific anti-HLA antibody or a functional fragment thereof is administered at a dose of 1 to 25 mg / (kg body weight / day). The pharmaceutical composition as described.
(14) An allele-specific anti-HLA antibody or a functional fragment thereof that exhibits cytotoxicity to cells expressing a specific allele of HLA.
(15) The allele-specific anti-HLA antibody or the functional fragment thereof according to (14), wherein the specific allele of HLA is a class I or class II HLA allyl.
(16) The allele-specific anti-HLA antibody or the functional fragment thereof according to (15) above, wherein the specific allele of HLA is one or more alleles selected from class I HLA alleles.
(17) The above-mentioned (16), wherein the specific allyl of HLA is an allyl of HLA-A * 02: 01, HLA-A * 03: 01, HLA-A * 23: 01 or HLA-A * 24: 02 Or an allele-specific anti-HLA antibody or a functional fragment thereof.
(18) The allele-specific anti-HLA antibody or the functional fragment thereof according to any one of (14) to (17), wherein the antibody is a human antibody, a humanized antibody or a chimeric antibody.
(19) The fragment according to any one of (14) to (18) above, wherein the fragment is Fab, Fab ′, Fab′-SH, Fv or scFv, F (ab ′) 2 .
(20) The allele-specific anti-HLA antibody or a functional fragment thereof according to any one of (14) to (19), which has enhanced cytotoxic effect.
(21) An HLA allele-specific cytotoxic agent comprising the allele-specific anti-HLA antibody or the functional fragment thereof according to any one of (14) to (20).
(22) A GVHD animal model transplanted with human PBMC having a specific allyl HLA.
本発明の抗体若しくはその機能断片は、ＨＬＡの特定のアリルを発現する細胞に対して特異的に細胞傷害性を示し、特定のアリルのＨＬＡを発現する細胞を特異的に傷害する細胞傷害剤として用いられる。従って、本発明の抗体やその機能断片は、微小残存病変やＧＶＨＤなどの造血幹細胞移植に伴う疾患の処置にも有利に用いられる。 The antibody of the present invention or a functional fragment thereof shows cytotoxicity specifically to cells expressing a specific allele of HLA, and is used as a cytotoxic agent that specifically damages cells expressing a specific allele of HLA. Used. Therefore, the antibody of the present invention and functional fragments thereof can be advantageously used for treatment of diseases associated with hematopoietic stem cell transplantation such as minimal residual lesions and GVHD.
本発明の抗体若しくはその機能断片は、ＨＬＡの特定のアリルから産出されるＨＬＡをアリル特異的に認識し、該ＨＬＡを発現する細胞に対して細胞傷害性を示すアリル特異的抗ＨＬＡ抗体またはその機能断片であり、好ましくは、該ＨＬＡを発現する細胞に対してのみ細胞傷害性を示すアリル特異的抗ＨＬＡ抗体またはその機能断片である。本発明の抗体若しくはその機能断片は、特にクラスＩまたはクラスＩＩのＨＬＡ、好ましくはクラスＩのＨＬＡをアリル特異的に認識し、該ＨＬＡを発現する細胞に対して特異的に細胞傷害性を示す。 The antibody of the present invention or a functional fragment thereof is an allele-specific anti-HLA antibody that recognizes allele-specifically HLA produced from a specific allele of HLA and exhibits cytotoxicity to cells expressing the HLA or A functional fragment, preferably an allele-specific anti-HLA antibody or a functional fragment thereof showing cytotoxicity only to cells expressing the HLA. The antibody or functional fragment thereof of the present invention specifically recognizes class I or class II HLA, preferably class I HLA allele-specifically, and exhibits cytotoxicity specifically to cells expressing the HLA. .
ＨＬＡクラスＩ分子には３つの遺伝子座ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃが存在し、それぞれには抗原型が数多く存在する。本発明の抗体若しくはその機能断片は、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃ、好ましくはＨＬＡ−ＡまたはＨＬＡ−Ｂ、より好ましくはＨＬＡ−Ａの抗原型のアリルを発現する細胞に対して特異的に細胞傷害性を示す。 There are three loci, HLA-A, HLA-B, and HLA-C, in HLA class I molecules, each with many antigenic types. The antibody of the present invention or a functional fragment thereof is used for cells expressing HLA-A, HLA-B and HLA-C, preferably HLA-A or HLA-B, more preferably HLA-A antigenic allele. Specific cytotoxicity.
ＨＬＡクラスＩ分子のＨＬＡ−Ａの抗原型としては、例えば、ＨＬＡ−Ａ１〜ＨＬＡ−Ａ８０が知られている（http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/）。この中で日本人によく見られる抗原型は、例えば、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ９（ＨＬＡ−Ａ２４としても知られる）、ＨＬＡ−Ａ１１、ＨＬＡ−Ａ２６およびＨＬＡ−Ａ３３である。これらの抗原型のそれぞれには更にアリルが存在する。例えば、ＨＬＡ−Ａ２には、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１〜ＨＬＡ−Ａ＊０２：１２６のアリルが存在し、日本人では、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０３、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０６、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０７、ＨＬＡ−Ａ＊０２：１０およびＨＬＡ−Ａ＊０２：１８などのアリルがよく見られる。なお、本明細書では、ＨＬＡ−Ａ９は、慣例に従い、抗原型を示す場合にはＨＬＡ−Ａ９と表現するが、特定のアリルを示す場合には、ＨＬＡ−Ａ２４にアリル番号を付して、例えば、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２と表現する。 For example, HLA-A1 to HLA-A80 are known as HLA-A antigen types of HLA class I molecules (http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/). Among these, antigenic types often seen in Japanese are, for example, HLA-A2, HLA-A9 (also known as HLA-A24), HLA-A11, HLA-A26 and HLA-A33. Each of these serotypes also has an allyl. For example, HLA-A2 has alleles from HLA-A * 02: 01 to HLA-A * 02: 126. In Japanese, HLA-A * 02: 01, HLA-A * 02: 03, HLA -Alleles such as A * 02: 06, HLA-A * 02: 07, HLA-A * 02: 10 and HLA-A * 02: 18 are common. In addition, in this specification, HLA-A9 is expressed as HLA-A9 in the case of showing an antigen type according to the convention, but when showing a specific allyl, an allyl number is attached to HLA-A24, For example, it is expressed as HLA-A * 24: 02.
ＨＬＡクラスＩ分子のＨＬＡ−Ｂの抗原型としては、例えば、ＨＬＡ−Ｂ１〜ＨＬＡ−Ｂ８２（http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/）が知られている。この中で日本人によく見られる抗原型は、例えば、ＨＬＡ−Ｂ５、ＨＬＡ−Ｂ１３、ＨＬＡ−Ｂ１６、ＨＬＡ−Ｂ２２、ＨＬＡ−Ｂ３５、ＨＬＡ−Ｂ３９、ＨＬＡ−Ｂ４６、ＨＬＡ−Ｂ４８、ＨＬＡ−Ｂ６０、ＨＬＡ−Ｂ６１（ＨＬＡ−Ｂ４０としても知られる。）、ＨＬＡ−Ｂ６２、ＨＬＡ−Ｂ７１およびＨＬＡ−Ｂ７５である。ＨＬＡ−Ａ同様に、これらの抗原型のそれぞれには更にアリルが存在する。なお、本明細書では、ＨＬＡ−Ｂ６１は、抗原型を示す場合にはＨＬＡ−Ｂ６１と表現するが、特定のアリルを示す場合には、ＨＬＡ−Ｂ４０にアリル番号を付して、例えば、ＨＬＡ−Ｂ＊４０：０２と表現する。 For example, HLA-B1 to HLA-B82 (http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/) are known as HLA-B antigen types of HLA class I molecules. Among these, the antigen types often seen in Japanese are, for example, HLA-B5, HLA-B13, HLA-B16, HLA-B22, HLA-B35, HLA-B39, HLA-B46, HLA-B48, HLA-B60. HLA-B61 (also known as HLA-B40), HLA-B62, HLA-B71 and HLA-B75. Like HLA-A, each of these serotypes also has an allyl. In this specification, HLA-B61 is expressed as HLA-B61 when showing an antigen type, but when showing a specific allele, an allyl number is given to HLA-B40, for example, HLA-B61. -Expressed as B * 40: 02.
本発明の抗体またはその機能断片は、特に限定されないが、例えば、ＨＬＡ−Ａ２のアリル、ＨＬＡ−Ａ３のアリル、ＨＬＡ−Ａ９のアリル、ＨＬＡ−Ａ２３のアリル、ＨＬＡ−Ｂ３５のアリル、またはＨＬＡ−Ｂ６１のアリルを発現する細胞に対して特異的に細胞障害性を示す。より具体的な態様では、本発明の抗体またはその機能断片は、例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２、ＨＬＡ−Ｂ＊３５：０１、またはＨＬＡ−Ｂ＊４０：０２を発現する細胞に対して特異的に細胞障害性を示す。 The antibody of the present invention or a functional fragment thereof is not particularly limited. For example, allyl of HLA-A2, allyl of HLA-A3, allyl of HLA-A9, allyl of HLA-A23, allyl of HLA-B35, or HLA- It is specifically cytotoxic to cells expressing the allele of B61. In a more specific aspect, the antibody of the present invention or a functional fragment thereof is, for example, HLA-A * 02: 01, HLA-A * 03: 01, HLA-A * 23: 01, HLA-A * 24: 02 , Specifically cytotoxic to cells expressing HLA-B * 35: 01 or HLA-B * 40: 02.
ＨＬＡクラスＩＩ分子としては、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱおよびＨＬＡ−ＤＰの３つが知られる。この３つの遺伝子座それぞれにも、抗原型が数多く存在し、それぞれの抗原型に対してアリルが存在する。本発明の抗体若しくはその機能断片は、好ましくは、ＨＬＡ−ＤＲのβ１鎖の抗原のアリルをアリル特異的に認識し、該ＨＬＡを発現する細胞に対して特異的に細胞傷害性を示す。 Three types of HLA class II molecules are known: HLA-DR, HLA-DQ, and HLA-DP. Each of these three loci has many antigen types, and alleles exist for each antigen type. The antibody of the present invention or a functional fragment thereof preferably recognizes allyl of the β1 chain antigen of HLA-DR in an allyl-specific manner and exhibits cytotoxicity specifically to cells expressing the HLA.
このように、本発明の抗体またはその機能断片は、特定のＨＬＡアリルを有する細胞（すなわち、ＨＬＡクラスＩであれば赤血球を除く有核細胞、ＨＬＡクラスＩＩであればマクロファージ、樹状細胞、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞などの抗原提示細胞）に対してＨＬＡアリル特異的な細胞障害性を示す。従って、本発明によれば、本発明の抗体またはその機能断片を含んでなるＨＬＡアリル特異的な細胞傷害剤が提供される。 Thus, the antibody of the present invention or a functional fragment thereof is a cell having a specific HLA allele (ie, nucleated cells excluding erythrocytes if HLA class I, macrophages, dendritic cells, activity if HLA class II) HLA allyl-specific cytotoxicity against antigen-presenting cells such as T cells and B cells). Therefore, according to the present invention, there is provided an HLA allele-specific cytotoxic agent comprising the antibody of the present invention or a functional fragment thereof.
本明細書では、「ＨＬＡアリル特異的に認識する」とは、ＨＬＡの特定のアリルを認識し、それ以外のアリルは認識しないことを意味する。本明細書では、「アリル特異的に認識する」には、複数のＨＬＡのアリルを認識することが含まれ、本発明のアリル特異的な抗ＨＬＡ抗体は、２つ以上のＨＬＡのアリルを認識し得るものであってもよい。本明細書では、ＨＬＡをアリル特異的に認識する抗体は、アリル特異的抗ＨＬＡ抗体（または「ＡＳＨｍＡｂ」）と呼ぶ。 In the present specification, “recognize specifically for an HLA allele” means that a specific allele of HLA is recognized and other alleles are not recognized. As used herein, “recognizing allele-specifically” includes recognizing a plurality of alleles of HLA, and the allele-specific anti-HLA antibody of the present invention recognizes alleles of two or more HLA. It may be possible. Herein, an antibody that recognizes HLA in an allele-specific manner is called an allele-specific anti-HLA antibody (or “ASHmAb”).
本明細書では、「ＨＬＡアリル特異的な細胞障害性を示す」または「ＨＬＡの特定のアリルを発現する細胞に対して細胞傷害性を示す」とは、ＨＬＡの特定のアリルを発現する細胞に対して細胞障害性を示し、ＨＬＡの特定のアリルを発現しない細胞に対しては細胞障害性を示さないことを意味する。本明細書では、「アリル特異的な細胞障害性を示す」または「ＨＬＡの特定のアリルを発現する細胞に対して細胞傷害性を示す」には、アリル特異的抗ＨＬＡ抗体が複数のＨＬＡのアリルを認識し得る場合が含まれ、そのような場合には、それぞれのＨＬＡのアリルを発現する細胞に対して細胞障害性を示すことがある。本明細書では、「ＨＬＡの特定のアリルを発現する細胞に対してのみ細胞傷害性を示す」とは、該特定のアリルを発現する細胞以外に対しては細胞傷害性を示さないことを意味する。 In the present specification, “showing HLA allyl-specific cytotoxicity” or “showing cytotoxicity against cells expressing a specific allele of HLA” refers to cells expressing a specific allele of HLA. On the other hand, it means cytotoxicity to cells that do not express a specific allele of HLA, and does not show cytotoxicity. As used herein, “showing allyl-specific cytotoxicity” or “showing cytotoxicity against cells expressing a specific allele of HLA” includes an allele-specific anti-HLA antibody comprising a plurality of HLA antibodies. A case where alleles can be recognized is included, and in such a case, cytotoxicity may be exhibited with respect to cells expressing the allele of each HLA. In the present specification, “showing cytotoxicity only to cells expressing a specific allele of HLA” means not showing cytotoxicity to cells other than those expressing the specific allele. To do.
本明細書では、「機能断片」とは、アリル特異的な細胞障害性を示す本発明の抗体の断片をいう。本明細書では、「断片」としては、特に限定されないが、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、またはＦ（ａｂ’）２が挙げられ、これらの断片は当業者に周知の方法により作製することができる。 As used herein, “functional fragment” refers to a fragment of the antibody of the present invention that exhibits allyl-specific cytotoxicity. As used herein, “fragment” is not particularly limited, and includes, for example, Fab, Fab ′, Fab′-SH, Fv, scFv, or F (ab ′) 2. It can be produced by a known method.
本明細書では、「キメラ抗体」とは、抗原特異性を有する元の抗体由来の軽鎖可変領域および重鎖可変領域を、他の生物種の軽鎖定常領域および重鎖定常領域と結合させた抗体を意味する。 As used herein, “chimeric antibody” refers to a light chain variable region and a heavy chain variable region derived from an original antibody having antigen specificity combined with a light chain constant region and a heavy chain constant region of another species. Antibody.
本明細書では、「ヒト化抗体」とは、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）がヒト以外の抗体由来であり、ＣＤＲ以外の全部または一部がヒト由来である抗体を意味する。ＣＤＲがグラフトされる抗体は、好ましくは、元の抗体のフレームワーク領域との相同性により選択することができる。また、ヒト化抗体を作製する際には、抗体のフレームワークをサポートするアミノ酸を改変して抗体の抗原への特異性や親和性を改善してもよい。このようなヒト化抗体の作製法は、当業者に周知である。 As used herein, “humanized antibody” means an antibody in which the complementarity determining region (CDR) of an antibody is derived from an antibody other than human and all or part of the antibody other than CDR is derived from human. The antibody to which the CDR is grafted can preferably be selected by homology with the framework region of the original antibody. In preparing a humanized antibody, amino acids that support the antibody framework may be modified to improve the specificity and affinity of the antibody for the antigen. Methods for producing such humanized antibodies are well known to those skilled in the art.
本明細書では、「ヒト抗体」は、ヒト免疫グロブリン遺伝子から産生されるヒト抗体である。ヒト抗体は、特に限定されないが、例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子を導入したヒト抗体産生動物、例えば、マウス、ウシ若しくはブタ等の非ヒト動物を用いた方法、ＥＢウイルスを感染させて増殖させたヒトＢリンパ球を用いた方法、または、ファージディスプレイヒト抗体ライブラリを用いたファージディスプレイ法などの当業者に周知の方法を用いて作製できる。 As used herein, a “human antibody” is a human antibody produced from a human immunoglobulin gene. The human antibody is not particularly limited. For example, a method using a human antibody-producing animal into which a human immunoglobulin gene has been introduced, for example, a method using a non-human animal such as a mouse, a cow or a pig, or a human grown by infection with an EB virus It can be prepared using a method well known to those skilled in the art, such as a method using B lymphocytes or a phage display method using a phage display human antibody library.
本発明の抗体は、好ましくは、モノクローナル抗体である。 The antibody of the present invention is preferably a monoclonal antibody.
本発明の抗体またはその機能断片はまた、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体としてヒトに投与することで、医薬としての有効性や安全性を高めることができる。 The antibody of the present invention or a functional fragment thereof can also be administered to humans as a chimeric antibody, a humanized antibody or a human antibody, thereby enhancing the efficacy and safety as a medicine.
本発明の抗体またはその機能断片は、細胞障害作用を有する化合物が共有結合または非共有結合にて連結していてもよい。細胞障害作用を有する化合物は、本発明の抗体またはその機能断片に連結させることにより、特定のＨＬＡアリルを発現する細胞に効率的かつ選択的に送達され得、抗体またはその機能断片の細胞障害作用を増強させることができる。本発明の抗体またはその機能断片は、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体として、あるいは、ＩｇＭとしてヒトに投与することによっても、抗体が有する細胞障害作用を増強させることができる。 In the antibody of the present invention or a functional fragment thereof, a compound having a cytotoxic effect may be linked by a covalent bond or a non-covalent bond. A compound having a cytotoxic effect can be efficiently and selectively delivered to a cell expressing a specific HLA allyl by linking to the antibody of the present invention or a functional fragment thereof. Can be strengthened. The cytotoxic effect of the antibody can be enhanced by administering the antibody of the present invention or a functional fragment thereof as a chimeric antibody, humanized antibody or human antibody, or by administering it to a human as IgM.
本発明によれば、特定のＨＬＡのアリルを発現する細胞に対して特異的に細胞傷害性を示す抗ＨＬＡ抗体は、以下のように作製する。 According to the present invention, an anti-HLA antibody specifically cytotoxic to a cell expressing a specific HLA allele is prepared as follows.
まず、抗体を作製したいアリルとは異なるＨＬＡのアリルを発現する非ヒトトランスジェニック動物（例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、サル、ニワトリ、マウス、ラットなどの齧歯類や哺乳類）を作製する。 First, a non-human transgenic animal that expresses an allele of HLA different from the allele for which an antibody is to be produced (eg, rodents and mammals such as cows, pigs, sheep, monkeys, chickens, mice, rats, etc.) is produced.
トランスジェニック動物に発現させるＨＬＡアリルは、特に限られないが、抗体を作製したいアリルと同じ動物種のＨＬＡであることが好ましく、また、同じ動物種の同じクラスのＨＬＡであることがより好ましい。すなわち、ＨＬＡクラスＩのＡＳＨｍＡｂを得る場合には、得たいアリルとは異なるクラスＩのアリルを発現するトランスジェニック動物（例えば、マウス）、例えば、既に作製済みのＨＬＡ−Ｂ５１：０１を発現するトランスジェニック動物（例えば、マウス）を作製することができる（非特許文献１）。このＨＬＡ−Ｂ５１：０１トランスジェニック動物（例えば、マウス）からは、ＨＬＡ−ＡおよびＢに属する抗原型のアリル（ＨＬＡ−Ｂ５１：０１を除く）を発現する細胞に対して特異的に細胞傷害性を示す抗体が得られる。同様に、ＨＬＡクラスＩＩのＡＳＨｍＡｂを得る場合には、得たいアリルとは異なるクラスＩＩのアリルを発現するトランスジェニック動物（例えば、マウス）を作製することができる。 The HLA allele to be expressed in the transgenic animal is not particularly limited, but is preferably HLA of the same animal species as the allele for which an antibody is to be produced, and more preferably HLA of the same class of the same animal species. That is, when obtaining an HLA class I ASH mAb, a transgenic animal (for example, a mouse) expressing a class I allele different from the allele to be obtained, for example, a transgene expressing an already produced HLA-B51: 01. A transgenic animal (for example, a mouse) can be prepared (Non-patent Document 1). This HLA-B51: 01 transgenic animal (for example, mouse) is specifically cytotoxic to cells expressing antigenic alleles (excluding HLA-B51: 01) belonging to HLA-A and B. Is obtained. Similarly, when obtaining an HLA class II ASH mAb, a transgenic animal (eg, a mouse) expressing a class II allele different from the allele to be obtained can be produced.
得られたトランスジェニック動物は、常法により、抗体を作製したいアリルのＨＬＡをアジュバントと共に注射して免疫する（初回免疫）ことができる。免疫に用いるＨＬＡは、テトラマーを形成させることによりその免疫原性を高める等の工夫を行ってもよい。また、初回免疫の後は、１回以上の追加免疫を行ってもよい。免疫後は、マウスの脾臓および／またはリンパ節からＢ細胞を取得して、常法によりハイブリドーマ細胞を得ることができる。抗ＨＬＡ抗体は、ハイブリドーマ細胞の培養液から回収することができる。 The obtained transgenic animal can be immunized (primary immunization) by injecting allyl HLA for which an antibody is to be prepared with an adjuvant together with an adjuvant. The HLA used for immunization may be devised to increase its immunogenicity by forming a tetramer. In addition, after the initial immunization, one or more additional immunizations may be performed. After immunization, B cells can be obtained from the spleen and / or lymph nodes of mice, and hybridoma cells can be obtained by conventional methods. Anti-HLA antibodies can be recovered from the culture medium of hybridoma cells.
アリル特異的な細胞傷害性を示す抗体を得るために、得られた抗体は、細胞傷害性試験に供することができる。具体的には、得られた抗体を補体と共に、抗体を作製したいアリルのＨＬＡを発現する細胞、および、該アリルのＨＬＡを発現しない細胞の培地にそれぞれ添加して、例えば、１０％ＣＯ２、３７℃で２４時間インキュベートすることができる。その結果、抗体を作製したいアリルのＨＬＡを発現する細胞のみに対して細胞障害性を示したモノクローナル抗体は、ＨＬＡのアリル特異的に細胞障害性を示す抗体である。細胞障害性試験には、例えば、単離した健常者の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を用いることができる。細胞障害性は、特に限定されないが、プロピジウムイオダイド（ＰＩ）染色およびクロミウム５１放出試験などにより評価することができる。 In order to obtain an antibody exhibiting allyl-specific cytotoxicity, the obtained antibody can be subjected to a cytotoxicity test. Specifically, the obtained antibody is added together with complement to the culture medium of cells expressing allyl HLA for which antibodies are to be produced and cells not expressing the allyl HLA, for example, 10% CO 2 Incubate for 24 hours at 37 ° C. As a result, a monoclonal antibody that exhibits cytotoxicity only to cells expressing allyl HLA for which antibodies are to be produced is an antibody that exhibits cytotoxicity specifically to alleles of HLA. For example, isolated peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of healthy individuals can be used for the cytotoxicity test. The cytotoxicity is not particularly limited, but can be evaluated by propidium iodide (PI) staining, a chromium 51 release test, and the like.
アリル特異的な細胞傷害性を示すヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を導入したヒト抗体産生動物、例えば、マウス、ウシ若しくはブタ等の非ヒト動物を用いた方法、ＥＢウイルスを感染させて増殖させたヒトＢリンパ球を用いた方法、または、ファージディスプレイヒト抗体ライブラリを用いたファージディスプレイ法などの当業者に周知の方法を用いて作製することができる。アリル特異的に細胞傷害性を示す抗体を効率良く得る観点では、ヒト免疫グロブリン遺伝子を導入したヒト抗体産生動物は、さらに抗体を作製したいアリルとは別のアリルのＨＬＡを発現するように遺伝子改変がなされていることが好ましい。 A human antibody exhibiting allyl-specific cytotoxicity is a method using a human antibody-producing animal into which a human immunoglobulin gene has been introduced, for example, a non-human animal such as a mouse, cow or pig, or an EB virus infected to proliferate. The method can be prepared using a method well known to those skilled in the art, such as a method using human B lymphocytes or a phage display method using a phage display human antibody library. From the viewpoint of efficiently obtaining antibodies that show cytotoxicity specifically for alleles, human antibody-producing animals into which human immunoglobulin genes have been introduced are genetically modified to express alleles of HLA that are different from the alleles for which antibodies are to be produced. It is preferable that
本発明の抗体またはその機能断片は、微小残存病変やＧＶＨＤなどの造血幹細胞移植に伴う疾患の処置に有利に用いられる。 The antibody of the present invention or a functional fragment thereof is advantageously used for the treatment of diseases associated with hematopoietic stem cell transplantation such as minimal residual lesions and GVHD.
造血幹細胞移植の際には、特にＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−ＤＲの３つのＨＬＡをアリルのレベルで完全に合致させることが理想的であるとされる。しかしながら、実際の移植では、ドナーとレシピエントとのＨＬＡのアリルが完全には合致しない場合がある。ＨＬＡのアリルが完全に合致しない細胞は、非自己と見なされてＣＤ８陽性Ｔ細胞により傷害を受けることがある。造血幹細胞移植の場合には、ＨＬＡのアリルが完全に合致しないレシピエントの細胞が非自己とみなされて、ドナー由来のＣＤ８陽性Ｔ細胞により傷害を受ける（移植片対宿主病（ＧＶＨＤ））。このＧＶＨＤは、輸血の際にも見られることがあり、ドナーとレシピエントのＨＬＡのアリルが完全に合致しないことにより生ずる疾患であると考えられている。 In the case of hematopoietic stem cell transplantation, it is ideal that three HLAs of HLA-A, HLA-B and HLA-DR are perfectly matched at the allyl level. However, in actual transplantation, the HLA alleles of the donor and recipient may not match perfectly. Cells in which the alleles of HLA are not perfectly matched can be considered non-self and can be damaged by CD8 + T cells. In the case of hematopoietic stem cell transplantation, recipient cells that do not completely match the HLA allele are considered non-self and are injured by donor-derived CD8-positive T cells (graft versus host disease (GVHD)). This GVHD may also be seen during blood transfusions and is thought to be a disease caused by a mismatch between the donor and recipient HLA alleles.
ＧＶＨＤの治療は、現在、免疫抑制剤やステロイドの投与により、免疫機能を一時的に抑制することにより行われている。確かに、免疫機能の抑制は、ＧＶＨＤにより生じる炎症を鎮めることに役立っているが、上記のＨＬＡアリルの適合性を改善するものではなく、十分な治療効果を有するものではない。また、ＧＶＨＤに関して他の有効な治療手段は知られていない。 The treatment of GVHD is currently performed by temporarily suppressing immune function by administration of an immunosuppressant or steroid. Certainly, suppression of immune function has helped to mitigate inflammation caused by GVHD, but does not improve the compatibility of the above HLA allele and does not have a sufficient therapeutic effect. Also, no other effective treatment means is known for GVHD.
しかしながら、本発明者らは、本発明の抗体がＧＶＨＤの治療に有効であることを見出した。すなわち、本発明者らは、ドナーのみが有するＨＬＡクラスＩのアリルを発現する細胞に対して特異的に細胞障害性を示す抗体を作製し、得られた抗体をＧＶＨＤモデル動物に対して投与することにより、ＧＶＨＤモデル動物のＧＶＨＤを有効に治療することに成功した。 However, the present inventors have found that the antibodies of the present invention are effective for the treatment of GVHD. That is, the present inventors produce an antibody specifically cytotoxic to a cell expressing an HLA class I allele possessed only by a donor, and administer the obtained antibody to a GVHD model animal. Thus, GVHD was successfully treated in GVHD model animals.
本発明の抗体またはその機能断片は、微小残存病変の処置に用いることもできる。微小残存病変は、レシピエント由来の白血球がレシピエントの体内に残存してしまうことによる疾患であり、レシピエント由来の白血球の数を低減させることが治療上有効であるとされている。本発明によれば、レシピエントのみに細胞障害性を示す抗体またはその機能断片を得ることができるが、ＨＬＡは白血球で特に高く発現するため、本発明の抗体またはその機能断片は白血球を優先的に傷害し得る。そのため、本発明の抗体またはその機能断片を用いれば、体内に残存したレシピエント由来の白血球を殺傷して微小残存病変を処置することができる。 The antibody or functional fragment thereof of the present invention can also be used for the treatment of minimal residual lesions. A minute residual lesion is a disease caused by remaining leukocytes derived from the recipient in the body of the recipient, and it is considered that it is therapeutically effective to reduce the number of leukocytes derived from the recipient. According to the present invention, it is possible to obtain an antibody or functional fragment thereof that is cytotoxic only to the recipient. However, since HLA is particularly highly expressed in leukocytes, the antibody of the present invention or functional fragment thereof preferentially leukocytes. Can be injured. Therefore, if the antibody of the present invention or a functional fragment thereof is used, a leukocyte derived from a recipient remaining in the body can be killed to treat a minute residual lesion.
このように、本発明の抗体またはその機能断片は、ＧＶＨＤや微小残存病変などの同種移植拒絶に伴う疾患の処置に有効である。従って、本発明によれば、本発明の抗体またはその機能断片を含んでなる医薬組成物、特にＧＶＨＤや微小残存病変などの同種移植拒絶に伴う疾患の処置のための医薬組成物が提供される。 Thus, the antibody of the present invention or a functional fragment thereof is effective for treatment of diseases associated with allograft rejection such as GVHD and minimal residual lesions. Therefore, according to the present invention, there is provided a pharmaceutical composition comprising the antibody of the present invention or a functional fragment thereof, particularly a pharmaceutical composition for the treatment of diseases associated with allograft rejection such as GVHD and minimal residual disease. .
本発明の医薬組成物の好ましい態様によれば、造血幹細胞移植におけるドナーのみが有するＨＬＡクラスＩまたはＩＩのアリルを発現する細胞（好ましくは、白血球）に対して特異的に細胞障害性を示す抗体およびその機能断片を含んでなる医薬組成物が提供される。この医薬組成物は、ドナー側の細胞（好ましくは、白血球）に対しては細胞傷害性を示すが、レシピエント側の細胞に対しては細胞障害性を示さず、例えば、ＧＶＨＤの処置に用いることができる。 According to a preferred embodiment of the pharmaceutical composition of the present invention, an antibody specifically cytotoxic to cells expressing HLA class I or II alleles (preferably leukocytes) possessed only by donors in hematopoietic stem cell transplantation And a pharmaceutical composition comprising the functional fragment thereof. This pharmaceutical composition shows cytotoxicity to donor-side cells (preferably leukocytes), but does not show cytotoxicity to recipient-side cells. For example, it is used for the treatment of GVHD. be able to.
また、本発明の医薬組成物の好ましい態様によれば、造血幹細胞移植におけるレシピエントの細胞（好ましくは、白血球）のみが有するＨＬＡクラスＩまたはＩＩのアリルを発現する細胞に対して特異的に細胞傷害性を示す抗体およびその機能断片を含んでなる医薬組成物が提供される。この医薬組成物は、レシピエント側の細胞、好ましくは、白血球に対しては細胞傷害性を示すが、ドナー側の白血球に対しては細胞障害性を示さず、例えば、微小残存病変の処置に用いることができる。 In addition, according to a preferred embodiment of the pharmaceutical composition of the present invention, the cell specifically expresses an HLA class I or II allele that is possessed only by a recipient cell (preferably a leukocyte) in hematopoietic stem cell transplantation. A pharmaceutical composition comprising an antibody exhibiting toxicity and a functional fragment thereof is provided. This pharmaceutical composition is cytotoxic to recipient cells, preferably leukocytes, but not to leukocytes on the donor side, eg for the treatment of minimal residual disease. Can be used.
このように、本発明の医薬組成物は、ＨＬＡの特定のアリルを発現する細胞に対して細胞傷害性を示すアリル特異的抗ＨＬＡ抗体またはその機能断片を含んでなり、例えば、ＧＶＨＤや微小残存病変などの同種移植拒絶に伴う疾患の処置に用いることができる。 Thus, the pharmaceutical composition of the present invention comprises an allele-specific anti-HLA antibody or a functional fragment thereof that exhibits cytotoxicity to cells expressing a specific allele of HLA, such as GVHD or microresidue. It can be used to treat diseases associated with allograft rejection such as lesions.
本発明の医薬組成物は、特に限定されないが、好ましくは、非経口投与、例えば、静脈内、腹腔内、皮下または筋肉内投与することができ、より好ましくは、静脈内投与することができる。 The pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited, but preferably can be administered parenterally, for example, intravenously, intraperitoneally, subcutaneously or intramuscularly, more preferably intravenously.
経口投与および非経口投与のための剤形およびその製造方法は当業者に周知であり、本発明による抗体またはその機能断片を、薬学的に許容される坦体等と混合等することにより、常法に従って製造することができる。 Dosage forms for oral administration and parenteral administration and methods for producing the same are well known to those skilled in the art, and the antibody or functional fragment thereof according to the present invention is usually mixed with a pharmaceutically acceptable carrier or the like. Can be manufactured according to the law.
また、本発明の医薬組成物は、例えば、免疫抑制剤などの他の薬剤をさらに含んでいてもよい。 Moreover, the pharmaceutical composition of this invention may further contain other chemical | medical agents, such as an immunosuppressive agent, for example.
非経口投与のための剤型は、注射用製剤（例えば、点滴注射剤、静脈注射剤、筋肉注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤）が挙げられる。 Examples of the dosage form for parenteral administration include injectable preparations (eg, intravenous injection, intravenous injection, intramuscular injection, subcutaneous injection, intradermal injection).
例えば、注射用製剤は、通常、本発明による抗体またはその機能断片を注射用蒸留水に溶解して調製するが、必要に応じて溶解補助剤、緩衝剤、ｐＨ調整剤、等張化剤、無痛化剤、保存剤、安定化剤等を添加することができる。 For example, a preparation for injection is usually prepared by dissolving the antibody according to the present invention or a functional fragment thereof in distilled water for injection. If necessary, a solubilizing agent, a buffer, a pH adjuster, an isotonic agent, Soothing agents, preservatives, stabilizers and the like can be added.
本発明の医薬組成物は、治療上有効量の本発明の抗体またはその機能断片を含んでなる。本明細書では、「治療上有効量」とは、かかる量を投与されていない対象と比較して、疾患若しくは障害の治療、治癒、防止若しくは、寛解の改善、または、疾患若しくは障害の進行速度の低減をもたらす量を意味する。 The pharmaceutical composition of the present invention comprises a therapeutically effective amount of the antibody of the present invention or a functional fragment thereof. As used herein, a “therapeutically effective amount” refers to the treatment, cure, prevention or amelioration of a disease or disorder or the rate of progression of a disease or disorder as compared to a subject who has not been administered such an amount. Means an amount that results in a reduction in
本発明の抗体またはその機能断片の治療上有効量は、治療対象の年齢、体重、治療する疾患若しくは障害の重症度、投与経路、および／または、これらに限定されない種々の要因によって定まり、主治医の裁量により決定され得る。例えば、本発明の抗体またはその機能断片を静脈注射により注射する場合には、例えば、１日当り１．０ｍｇ／ｋｇ体重〜２５．０ｍｇ／ｋｇ体重、２．０ｍｇ／ｋｇ体重〜１０．０ｍｇ／ｋｇ体重、２．５ｍｇ／ｋｇ体重〜５ｍｇ／ｋｇ体重、または２．５ｍｇ／ｋｇ体重〜３．７５ｍｇ／ｋｇ体重である。この量は、単位用量として投与することもできるし、いくつかのサブ用量で数回に分けて与えてもよい。投与日数も、主治医の裁量により決定され得るが、本発明の抗体またはその機能断片は、例えば３日間〜１０日間、例えば５日間投与することができる。 The therapeutically effective amount of the antibody or functional fragment thereof of the present invention is determined by the age of the subject to be treated, the body weight, the severity of the disease or disorder to be treated, the route of administration, and / or various factors that are not limited thereto. It can be determined at the discretion. For example, when the antibody of the present invention or a functional fragment thereof is injected by intravenous injection, for example, 1.0 mg / kg body weight to 25.0 mg / kg body weight, 2.0 mg / kg body weight to 10.0 mg / kg per day. Body weight, 2.5 mg / kg body weight to 5 mg / kg body weight, or 2.5 mg / kg body weight to 3.75 mg / kg body weight. This amount can be administered as a unit dose or may be given in several sub-doses in several divided doses. The number of administration days can also be determined at the discretion of the attending physician, but the antibody of the present invention or a functional fragment thereof can be administered for 3 days to 10 days, for example, 5 days.
本発明によれば、治療上の有効量の本発明の抗体またはその機能断片をヒトを含むほ乳類に投与することを含んでなる、同種移植拒絶に伴う疾患（例えば、ＧＶＨＤまたは微小残存病変）を処置する方法が提供される。 According to the present invention, a disease associated with allograft rejection (eg, GVHD or minimal residual disease) comprising administering to a mammal, including a human, a therapeutically effective amount of an antibody of the present invention or a functional fragment thereof. A method of treating is provided.
本発明のある態様では、ＧＶＨＤを処置する方法であって、
（i）ドナーのＨＬＡアリルとレシピエントのＨＬＡアリルに基づいて、ドナーに特有のアリル（すなわち、ドナーの白血球は発現するが、レシピエントの細胞は発現しないアリル）を特定する工程と、
（ii）ドナーに特有のＨＬＡの特定のアリルを発現する細胞に対して細胞障害性を示すが、レシピエントの細胞に対しては細胞障害性を示さない抗ＨＬＡ抗体の治療上有効量を、レシピエントに投与する工程と
を含んでなる方法が提供される。
In one aspect of the invention, a method of treating GVHD comprising:
(I) identifying a donor-specific allele (ie, an allele that expresses donor leukocytes but not recipient cells) based on the donor's HLA allele and the recipient's HLA allele;
(Ii) a therapeutically effective amount of an anti-HLA antibody that is cytotoxic to cells expressing a specific allele of HLA specific to the donor, but not to recipient cells, Administering to the recipient.
工程（ii）では抗ＨＬＡ抗体のレシピエントへの投与に先立って、ドナーに特有のＨＬＡの特定のアリルを発現する細胞に対して細胞障害性を示すが、レシピエントの細胞に対しては細胞障害性を示さない抗ＨＬＡ抗体を選択し、得る工程を実施してもよい。 In step (ii), prior to administration of the anti-HLA antibody to the recipient, the cell is cytotoxic to cells expressing a specific allele of HLA specific to the donor, but not to recipient cells. A step of selecting and obtaining an anti-HLA antibody that does not exhibit a disorder may be performed.
本発明のＧＶＨＤを処置する方法では、レシピエントに投与する本発明の抗体またはその機能断片は、レシピエントの細胞に対して細胞障害性を示さない限り、他のＨＬＡのアリルを発現する細胞に対して細胞障害性を示すものであっても許容される。ＧＶＨＤの処置では、ドナーに特有のＨＬＡの特定のアリルを発現する細胞に対して細胞障害性を示す抗ＨＬＡ抗体は、レシピエントの細胞に対して細胞障害性を示さない限り、ＨＬＡのアリルに対する特異性の高さは要求されないことは、当業者であれば十分理解できるであろう。 In the method of treating GVHD of the present invention, the antibody of the present invention or a functional fragment thereof administered to the recipient is not toxic to cells expressing other alleles of HLA unless it is cytotoxic to the recipient cell. It is permissible even if it exhibits cytotoxicity. In the treatment of GVHD, an anti-HLA antibody that is cytotoxic to cells expressing a specific allele of HLA specific to the donor will be against the allele of HLA unless it is cytotoxic to the recipient cell. One skilled in the art will appreciate that high specificity is not required.
本発明の別の態様では、微小残存病変を処置する方法であって、
（i）ドナーの白血球に発現するＨＬＡのアリルとレシピエントの白血球に発現するＨＬＡのアリルに基づいて、レシピエントの白血球に特有のアリル（すなわち、レシピエントの白血球は発現するが、ドナーの白血球は発現しないアリル）を特定する工程と、
（ii）レシピエントの白血球に対して細胞障害性を示すが、ドナーの白血球に対しては細胞障害性を示さない抗ＨＬＡ抗体の治療上有効量を、レシピエントに投与する工程と
を含んでなる方法が提供される。
In another aspect of the invention, a method of treating minimal residual disease comprising:
(I) Based on the allele of HLA expressed in donor leukocytes and the allele of HLA expressed in recipient leukocytes, alleles specific to recipient leukocytes (ie, recipient leukocytes are expressed but donor leukocytes are expressed) Identifying an allyl that is not expressed,
(Ii) administering to the recipient a therapeutically effective amount of an anti-HLA antibody that is cytotoxic to the leukocytes of the recipient but not cytotoxic to the leukocytes of the donor. A method is provided.
工程（ii）では抗ＨＬＡ抗体のレシピエントへの投与に先だって、レシピエントの白血球に対して細胞障害性を示すが、ドナーの白血球に対しては細胞障害性を示さない抗ＨＬＡ抗体を選択し、得る工程を実施してもよい。 In step (ii), prior to administration of the anti-HLA antibody to the recipient, an anti-HLA antibody that is cytotoxic to the recipient's leukocytes but not to the donor's leukocytes is selected. The step of obtaining may be carried out.
本発明の微小残存病変を処置する方法では、レシピエントの白血球に対して細胞障害性を示す抗ＨＬＡ抗体は、ドナーの細胞に対して細胞障害性を示さない限り、他のＨＬＡのアリルを発現する細胞に対して細胞障害性を示し得るものであっても許容される。微小残存病変の処置では、レシピエントの白血球に対して細胞障害性を示す抗ＨＬＡ抗体は、ドナーの細胞に対して細胞障害性を示さない限り、ＨＬＡのアリルに対する特異性の高さが要求されないことは、当業者であれば十分理解できるであろう。また、白血球では白血球以外の細胞と比べてＨＬＡの発現が高いことから、ＨＬＡクラスＩに対するＡＳＨｍＡｂであっても、白血球に対して優先的に細胞障害性を示すことも十分に理解できることである。 In the method of treating minimal residual lesions of the present invention, an anti-HLA antibody that is cytotoxic to the leukocytes of the recipient expresses alleles of other HLA unless it is cytotoxic to donor cells. Even those that can show cytotoxicity against the cells to be treated are acceptable. In the treatment of minimal residual disease, anti-HLA antibodies that are cytotoxic to recipient leukocytes are not required to be highly specific for HLA alleles unless they are cytotoxic to donor cells. Those skilled in the art will appreciate this. In addition, since the expression of HLA is higher in leukocytes than in cells other than leukocytes, it can be fully understood that even ASH mAb against HLA class I preferentially shows cytotoxicity against leukocytes.
このようにして、本発明では、ドナーとレシピエントで発現するＨＬＡのアリルの違いを利用して、いずれかでのみ発現するＨＬＡアリルに対して特異的に細胞傷害性を示す抗ＨＬＡ抗体を利用することにより、ドナーまたはレシピエントの細胞のみを殺すことができる。従って、本発明では、この原理を用いて、様々な同種移植拒絶に伴う疾患を処置することができる。 Thus, in the present invention, by utilizing the difference between the alleles of HLA expressed in the donor and the recipient, the anti-HLA antibody specifically cytotoxic to the HLA allyl expressed only in one is used. By doing so, only donor or recipient cells can be killed. Therefore, the present invention can be used to treat various diseases associated with allograft rejection using this principle.
本発明の同種移植拒絶に伴う疾患の処置は、同種移植拒絶に伴う疾患の処置は、治療上有効量の本発明の抗体若しくはその機能断片またはこれらを含んでなる医薬組成物をその処置を必要とする患者に投与することにより行ってもよい。 Treatment of a disease associated with allograft rejection of the present invention requires treatment of a disease associated with allograft rejection using a therapeutically effective amount of the antibody of the present invention or a functional fragment thereof or a pharmaceutical composition comprising them. It may be performed by administering to a patient.
本発明によれば、さらに、ＧＶＨＤモデル動物が提供される。本発明のＧＶＨＤモデル動物としては、特に限定されないが、齧歯類および霊長類などの哺乳類の非ヒト動物、好ましくはマウスを用いることができる。本発明のＧＶＨＤモデル動物は、例えば、免疫不全動物（Blood (2002), Nov 1, 100(9): 3175-82）に、ヒトＰＢＭＣを移植して作製することができる（Transplantation (2009), 87: 1654-1658）。ヒトＰＢＭＣは、好ましくは、当業者に周知のＨＬＡ遺伝子型タイピングの方法を用いてＨＬＡアリルを特定した後に、免疫不全とした動物に移植することができる。 According to the present invention, a GVHD model animal is further provided. The GVHD model animal of the present invention is not particularly limited, and mammalian non-human animals such as rodents and primates, preferably mice can be used. The GVHD model animal of the present invention can be produced, for example, by transplanting human PBMC into an immunodeficient animal (Blood (2002), Nov 1, 100 (9): 3175-82) (Transplantation (2009), 87: 1654-1658). Human PBMC can preferably be transplanted into immunodeficient animals after identifying HLA alleles using methods of HLA genotyping well known to those skilled in the art.
本発明のＧＶＨＤモデル動物は、ヒトＰＭＢＣ移植後、約１０日間〜約１５日間でＧＶＨＤ様の症状を発症し、移植後約２週間〜約３週間で死亡する。従って、本発明のＧＶＨＤモデル動物は、ＧＶＨＤ発症後であって死亡する前に、例えば、作成後約１０日〜約１４日の間に実験に使用することができる。本発明のＧＶＨＤモデル動物は、ＨＬＡアリルに対して特異的に細胞傷害性を示す抗ＨＬＡ抗体を投与してＧＶＨＤの治療効果を確かめることにより、抗体の医薬としての安全性や有効性の試験に用いることができる。 The GVHD model animal of the present invention develops GVHD-like symptoms about 10 to about 15 days after human PMBC transplantation, and dies about 2 to about 3 weeks after transplantation. Therefore, the GVHD model animal of the present invention can be used for experiments after GVHD onset and before death, for example, between about 10 days and about 14 days after production. The GVHD model animal of the present invention can be used to test the safety and efficacy of an antibody as a drug by administering an anti-HLA antibody specifically cytotoxic to HLA allyl and confirming the therapeutic effect of GVHD. Can be used.
実施例１：アリル特異的抗体（ＡＳＨｍＡｂ）の産生ハイブリドーマの取得
本実施例では、まず、アリル特異的抗体を作製した。
Example 1: Production of allyl-specific antibody (ASHmAb) Acquisition of hybridoma In this example, an allyl-specific antibody was first prepared.
アリル特異的抗体の作製は以下の通り行った。すなわち、アリル特異的抗体は、ヒトＨＬＡ−Ｂ５１を有するトランスジェニックマウスに対して、抗原として所望のアリルのＨＬＡをアジュバントと共に免疫し、免疫したマウスからアリル特異的抗体産生Ｂ細胞を取得し、ハイブリドーマを得ることにより、モノクローナル抗体として得た。 The allyl-specific antibody was produced as follows. That is, an allele-specific antibody is obtained by immunizing a transgenic mouse having human HLA-B51 with an HLA of a desired allele as an antigen together with an adjuvant, obtaining allele-specific antibody-producing B cells from the immunized mouse, Was obtained as a monoclonal antibody.
ヒトＨＬＡ−Ｂ５１を有するトランスジェニックマウスとしては、ＨＬＡ−Ｂ５１（Ｂ＊５１０１）トランスジェニックマウス（Karaki, S., Kariyone, A., Kato, N., Kano, K., Iwakura, Y., Takiguchi, M., 1993. HLA-B51 transgenic mice as recipients for production of polymorphic HLA-A, B-specific antibodies. Immunogenetics 37, 139）を用いた。 Examples of transgenic mice having human HLA-B51 include HLA-B51 (B * 5101) transgenic mice (Karaki, S., Kariyone, A., Kato, N., Kano, K., Iwakura, Y., Takiguchi). , M., 1993. HLA-B51 transgenic mice as recipients for production of polymorphic HLA-A, B-specific antibodies. Immunogenetics 37, 139).
抗原としては、ＨＣＭＶｐｐ６５由来のペプチドであるＮＬＶＰＭＶＡＴＶを提示するフィコエリトリン（ＰＥ）−コンジュゲートＨＬＡ−Ａ２テトラマー（株式会社医学生物学研究所製、製品番号：ＴＳ−００１０−１）、ＱＹＤＰＶＡＡＬＦを提示するフィコエリトリン（ＰＥ）−コンジュゲートＨＬＡ−Ａ９テトラマー（株式会社医学生物学研究所製、製品番号：ＴＳ−００２０−１）、ＨＣＭＶｐｐ６５由来のペプチドであるＩＰＳＩＮＶＨＨＹを提示するフィコエリトリン（ＰＥ）−コンジュゲートＨＬＡ−Ｂ３５テトラマー（株式会社医学生物学研究所製、製品番号：ＴＳ−００２７−１）およびＨＥＲＮＧＦＴＶＬを提示するフィコエリトリン（ＰＥ）−コンジュゲートＨＬＡ−Ｂ６１テトラマー（株式会社医学生物学研究所製、製品番号：ＴＳＣＭ−１）を用いた。アジュバントとしては、完全アジュバント（シグマアルドリッチ社製、製品番号：Ｆ５８８１−１０ＭＬ）および不完全アジュバント（シグマアルドリッチ社製、製品番号：Ｆ５５０６−１０ＭＬ）を用いて、これらに対する抗体を新たに取得した。 As antigens, phycoerythrin (PE) -conjugated HLA-A2 tetramer (product number: TS-0010-1), QYDPVAALF presenting NPMVVATV, a peptide derived from HCMVpp65, and phycoerythrin presenting QYDPVAALF (PE) -conjugated HLA-A9 tetramer (manufactured by Medical and Biological Research Institute, product number: TS-0020-1), phycoerythrin (PE) -conjugated HLA-B35 presenting IPSINVHHY, a peptide derived from HCMVpp65 Tetramer (manufactured by Medical and Biological Laboratories Co., Ltd., product number: TS-0027-1) and phycoerythrin (PE) -conjugated HLA-B61 tetramer (Medical and Biological Laboratories Co., Ltd.) presenting HERGNFTVL , Product number: TSCM-1) was used. As adjuvants, complete adjuvant (Sigma Aldrich, product number: F5881-10ML) and incomplete adjuvant (Sigma Aldrich, product number: F5506-10ML) were used, and antibodies against these were newly obtained.
初回免疫は、２００μｇの上記ＨＬＡ−Ａ２テトラマー、ＨＬＡ−Ａ９テトラマー、ＨＬＡ−Ｂ３５テトラマーまたはＨＬＡ−Ｂ６１テトラマーを完全アジュバントと共に足蹠内に注射することにより行った。２回目の免疫（追加抗原注射）は、初回免疫から１０日後に抗原を１００μｇずつ皮下注射することにより行い、アジュバントとしては、不完全アジュバントを用いた。 The first immunization was performed by injecting 200 μg of the above HLA-A2 tetramer, HLA-A9 tetramer, HLA-B35 tetramer or HLA-B61 tetramer into the footpad together with complete adjuvant. The second immunization (boost injection) was performed by subcutaneous injection of 100 μg of antigen 10 days after the first immunization, and incomplete adjuvant was used as an adjuvant.
初回免疫から１３日後に、トランスジェニックマウスからリンパ節由来のＢ細胞を得て、ＰＥＧ法によりミエローマ細胞（ＳＰ２／０）と細胞融合させた。具体的には、リンパ節由来のＢ細胞とミエローマ細胞（ＳＰ２／０）をダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（シグマアルドリッチ社製、製品番号：Ｄ５７９６）で洗浄し、ペレットにした後、ＰＥＧ溶液（Stem Cell Technology社製、製品番号：０３８０６）を滴下により加えて細胞を再懸濁した。その後、ＤＭＥＭ（シグマアルドリッチ社製、製品番号：Ｄ５７９６）４ｍＬを滴下により加えた。さらに１０ｍＬのＤＭＥＭを添加した後、細胞懸濁液を１０％ＣＯ２雰囲気下３７℃で５分間インキュベートした。融合した細胞は、ＤＭＥＭで１回洗浄し、ＤＭＥＭに再懸濁した後に、一晩培養した。翌日、細胞は、メチルセルロースベースのヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）培地（Medium D）（Stem Cell Technology社製、製品番号：０３８０４）に懸濁して１０ｃｍディッシュに播種した。１０日後、ハイブリドーマ細胞コロニーをピックアップして、ＤＭＥＭを満たした９６ウェルディッシュに継代した。継代後、ハイブリドーマは、添加物として１０％ウシ胎児血清（ギブコ社製、製品番号：１００９９−１４１）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン−ペニシリン−ストレプトマイシン（ギブコ社製、製品番号：１０３７８）、１０％ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅ（Stem Cell Technology社製、製品番号：０３８０５）を加えたＤＭＥＭを用いて培養した。 Thirteen days after the first immunization, lymph node-derived B cells were obtained from the transgenic mice and fused with myeloma cells (SP2 / 0) by the PEG method. Specifically, lymph node-derived B cells and myeloma cells (SP2 / 0) were washed with Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) (manufactured by Sigma-Aldrich, product number: D5796), pelleted, and then PEG solution ( Stem Cell Technology, product number: 03806) was added dropwise to resuspend the cells. Thereafter, 4 mL of DMEM (manufactured by Sigma-Aldrich, product number: D5796) was added dropwise. After adding an additional 10 mL of DMEM, the cell suspension was incubated for 5 minutes at 37 ° C. in a 10% CO 2 atmosphere. The fused cells were washed once with DMEM, resuspended in DMEM, and then cultured overnight. The next day, the cells were suspended in a methylcellulose-based hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT) medium (Medium D) (Stem Cell Technology, product number: 03804) and seeded in a 10 cm dish. Ten days later, a hybridoma cell colony was picked up and subcultured into a 96-well dish filled with DMEM. After passaging, the hybridoma was supplemented with 10% fetal bovine serum (Gibco, product number: 10099-141), 2 mM L-glutamine-penicillin-streptomycin (Gibco, product number: 10378), 10% Medium. Culturing was performed using DMEM supplemented with E (Stem Cell Technology, product number: 03805).
実施例２：ＡＳＨｍＡｂ産生ハイブリドーマ細胞の選択
本実施例では、実施例１で得られたハイブリドーマ細胞からアリル特異的な抗ＨＬＡ抗体産生ハイブリドーマを選択した。
Example 2: Selection of ASH mAb-producing hybridoma cells In this example, an allele-specific anti-HLA antibody-producing hybridoma was selected from the hybridoma cells obtained in Example 1.
まず、抗ＨＬＡ抗体産生ハイブリドーマを選択するため、Ｍａｘｉｓｏｒｂ ９６ウェルプレート（ヌンク社製、製品番号：１５０２８８）を５０μＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ８．０）に希釈した１ｍｇ／ｍＬのＨＬＡを用いてコーティングした。コーティングは、３７℃で３時間行い、次いで、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、５％乾燥ミルクおよび１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（ギブコ社製、製品番号：１４２００）を用いてプレートをブロッキングした。抗ビオチン、抗ストレプトアビジンおよび抗ＰＥ抗体の検出のため、ビオチン、ストレプトアビジンおよびＰＥの各１ｍｇ／ｍＬの混合物を用いてプレートをコーティングした。ハイブリドーマ細胞の培養上清をこれらのプレートに添加して３７℃で１時間インキュベートし、プレート表面のＨＬＡとハイブリドーマ細胞が産生する抗体を反応させた。ハイブリドーマ細胞が産生するＩｇＧ抗体は、ペルオキシダーゼ−コンジュゲート ｓｈｅｅｐ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ ＨＲＰ抗体（ＧＥヘルスケアー社製、製品番号：ＮＸＡ９３１−１ＭＬ）および２，２’−アジノ−ジ−（３−エチル−ベンズチアゾリン−６−スルホン酸）（シグマアルドリッチ社製、製品番号：４５−０５３−１５００１）を用いてＥＬＩＳＡにより検出した。吸光は、λ＝４９０ｎｍにて測定した。 First, in order to select an anti-HLA antibody-producing hybridoma, a Maxisorb 96-well plate (manufactured by Nunc, product number: 150288) was coated with 1 mg / mL HLA diluted in 50 μM sodium carbonate buffer (pH 8.0). did. The coating was performed at 37 ° C. for 3 hours, and then phosphate buffered saline (PBS) containing 0.05% Tween 20, 5% dry milk and 1% bovine serum albumin (BSA) (Gibco, product number: 14200) was used to block the plate. Plates were coated with a 1 mg / mL mixture of biotin, streptavidin and PE for detection of anti-biotin, anti-streptavidin and anti-PE antibodies. Hybridoma cell culture supernatant was added to these plates and incubated at 37 ° C. for 1 hour to react HLA on the plate surface with the antibody produced by the hybridoma cells. IgG antibodies produced by hybridoma cells are peroxidase-conjugated sheep anti-mouse IgG HRP antibody (manufactured by GE Healthcare, product number: NXA931-1ML) and 2,2′-azino-di- (3-ethyl-benz). Thiazoline-6-sulfonic acid) (manufactured by Sigma-Aldrich, product number: 45-053-15001) was used for detection by ELISA. Absorbance was measured at λ = 490 nm.
その結果、各ＨＬＡアリルのテトラマーで免疫して得られたハイブリドーマクローン数は、表１の通りであった。 As a result, the number of hybridoma clones obtained by immunization with tetramers of each HLA allyl was as shown in Table 1.
表１に示されるように、いずれのＨＬＡアリルに対しても抗ＨＬＡ抗体を産生するハイブリドーマを得ることができた。 As shown in Table 1, hybridomas producing anti-HLA antibodies against any HLA allele could be obtained.
実施例３：ＡＳＨｍＡｂの取得
本実施例では、実施例２で取得した抗ＨＬＡ抗体産生ハイブリドーマ細胞から、ＦｌｏｗＰＲＡスクリーング試験により、アリル特異的抗ＨＬＡ抗体産生ハイブリドーマ細胞を取得した。
Example 3: Acquisition of ASH mAb In this example, allyl-specific anti-HLA antibody-producing hybridoma cells were obtained from the anti-HLA antibody-producing hybridoma cells obtained in Example 2 by the FlowPRA screening test.
ＦｌｏｗＰＲＡスクリーング試験（One Lambda社製、製品番号：Ｇｒｏｕｐ１：ＦＬ１ＨＤ０１、Ｇｒｏｕｐ２：ＦＬ１ＨＤ０２、Ｇｒｏｕｐ３：ＦＬ１ＨＤ０３）は、製造者マニュアルに従って行った。まず、精製ＨＬＡクラスＩ抗原でコーティングした３２種の異なるマイクロビーズ（すべての共通ＨＬＡ抗原をカバーする）のプールを用いて、アリル特異的抗ＨＬＡモノクローナル抗体（ＡＳＨｍＡｂ）をフローサイトメトリーにより検出した。すなわち、９μＬのハイブリドーマ培養上清を０．５μＬのＦｌｏｗＰＲＡクラスＩビーズとインキュベートし、次いで、ビーズを洗浄し、予め滴定したフルオロセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）−コンジュゲート ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（モレキュラープローブズ社製、製品番号：Ａ−２１２３５）により染色した。蛍光強度は、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）フローサイトメーター（ＢＤバイオサイエンシズ社製、製品番号：３４２９７５）を用いて測定した。フローサイトメトリーのデータは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ社製、Version 9.5.2）を用いて解析した。 The FlowPRA screening test (manufactured by One Lambda, product number: Group 1: FL1HD01, Group 2: FL1HD02, Group 3: FL1HD03) was performed according to the manufacturer's manual. First, an allele-specific anti-HLA monoclonal antibody (ASH mAb) was detected by flow cytometry using a pool of 32 different microbeads coated with purified HLA class I antigen (covering all common HLA antigens). That is, 9 μL of hybridoma culture supernatant was incubated with 0.5 μL of FlowPRA class I beads, then the beads were washed and pre-titrated fluorescein isothiocyanate (FITC) -conjugated goat anti-mouse IgG antibody (Molecular Probes) The product was stained by a product number: A-21235). The fluorescence intensity was measured using a FACSCalibur ™ flow cytometer (manufactured by BD Biosciences, product number: 342975). Flow cytometry data was analyzed using FlowJo software (manufactured by TreeStar, Version 9.5.2).
得られたＡＳＨｍＡｂのアイソタイプは、ｍＡｂ Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ ｍｏｕｓｅ ｔｅｓｔ ｋｉｔ（ＨｙＣｕｌｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、製品番号：ＭＭＴ１）を用いて決定した。 The isotype of the obtained ASH mAb was determined using mAb Isotyping mouse test kit (manufactured by HyCult Biotechnology, product number: MMT1).
ヘパリン処理済みの血液１０ｍＬを２人の健常者から得た。これらの健常者のＨＬＡの血清学的タイピングは、ＨＬＡ−ＤＮＡ ＭｉｃｒｏＳＳＰ（商標）タイピングキット（One Lambda社製、製品番号：ＳＳＰ１ＡＢ）を用いて製造者マニュアルに従って行った。２人の健常者のうち、１人は、各ＨＬＡアリルのいずれかを発現することが示された健常者であった。サンプルは、リンホセパールＩ（免疫生物研究所社製、製品番号：２３０１０）を用いて遠心分離し、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を分離した。各ＨＬＡアリルを発現するＰＢＭＣは、得られたＡＳＨｍＡｂ、ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ抗体（インビトロジェン社製）、ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＣＤ３抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製、製品番号：５５７８３２）、６−２Ｈ６（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）またはアイソタイプ対照抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製、製品番号：５５７２７３）を用いて染色した。蛍光強度は、ＦＡＣＳ ＡｒｉａＩＩフローサイトメトリー（ＢＤバイオサイエンシズ社製）を用いて測定した。フローサイトメトリーのデータは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて解析した。 10 mL of heparinized blood was obtained from two healthy individuals. HLA serological typing of these healthy subjects was performed according to the manufacturer's manual using an HLA-DNA MicroSSP ™ typing kit (manufactured by One Lambda, product number: SSP1AB). Of the two healthy individuals, one was a healthy person who was shown to express any of each HLA allele. The sample was centrifuged using Lymphosepar I (manufactured by Immunobiological Laboratories, product number: 23010) to separate peripheral blood mononuclear cells (PBMC). PBMCs expressing each HLA allyl were obtained from the ASH mAb, goat anti-mouse IgG antibody (manufactured by Invitrogen), mouse anti-human CD3 antibody (manufactured by BD Pharmingen, product number: 557832), 6-2H6 (BD Pharmingen). Or an isotype control antibody (BD Pharmingen, product number: 557273). The fluorescence intensity was measured using FACS Aria II flow cytometry (manufactured by BD Biosciences). Flow cytometry data was analyzed using FlowJo software.
その結果、得られた各ＨＬＡアリルに対する特異的抗体（ＡＳＨｍＡｂ）ハイブリドーマクローン数は、表２の通りであった。 As a result, the number of specific antibody (ASHmAb) hybridoma clones obtained for each HLA allele was as shown in Table 2.
得られたハイブリドーマ細胞は、常法により一部を凍結保存した。 A part of the obtained hybridoma cells was cryopreserved by a conventional method.
実施例４：細胞障害性ＡＳＨｍＡｂの取得
本発明で使用する細胞傷害作用を持つアリル特異的抗ＨＬＡモノクローナル抗体（以下、「細胞障害性ＡＳＨｍＡｂ」ということがある）を同定するため、実施例３によりえられたハイブリドーマすべてをストックから起こし、実施例１に記載の培地で培養した。２回継代後、細胞が対数増殖期にあると判断された時点で抗体を含む培養上清の一部（１０ｍｌ）をそれぞれ回収した。２４穴プレートの各ウェルには、回収した培養上清３５０μＬと、ＨＬＡが判明している各１×１０６個の健常人末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）（(i)ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性かつＨＬＡ−Ａ＊２４：０２陰性のＰＢＭＣ、(ii)ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陰性かつＨＬＡ−Ａ＊２４：０２陽性のＰＭＢＣ、(iii)ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陰性かつＨＬＡ−Ａ＊２４：０２陰性のＰＭＢＣ）とを加え、さらに補体（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ社製 Ｓｔｅｒｉｌｅ ｂａｂｙ ｒａｂｂｉｔ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）３０％（１５０μｌ）を加えた。３７℃、１０％ＣＯ２の条件で２４時間培養後、プロピジウムイオダイド（ＰＩ）により細胞染色を行い、フローサイトメーターを用いて有核細胞における死細胞の割合を求めた。この結果、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１に対するＡＳＨｍＡｂの中に細胞傷害作用を持つ抗体３種類とＨＬＡ−Ａ＊２４：０２に対するＡＳＨｍＡｂの中に細胞傷害性を持つ抗体３種類（図２）が同定された。ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１に対するＡＳＨｍＡｂを用いた細胞傷害試験の結果は図１Ａに示し、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２に対するＡＳＨｍＡｂを用いた細胞傷害試験の結果は図１Ｂに示す。いずれの抗体も、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１を発現する細胞またはＨＬＡ−Ａ＊２４：０２を発現する細胞のどちらかに対してのみ細胞傷害性を示したことから（図１ＡおよびＢ）、細胞傷害性ＡＳＨｍＡｂであることが明らかとなった。なお、本実施例では、ＰＢＭＣはリンホセパールＩ（免疫生物研究所製、製品番号：２３０１０）を用いて健常人末梢血より分離したものを用いた。
Example 4: Acquisition of cytotoxic ASH mAb In order to identify an allyl-specific anti-HLA monoclonal antibody having cytotoxic activity (hereinafter sometimes referred to as "cytotoxic ASH mAb") used in the present invention, All of the obtained hybridomas were raised from the stock and cultured in the medium described in Example 1. After the second passage, when the cells were determined to be in the logarithmic growth phase, a part (10 ml) of the culture supernatant containing the antibody was collected. In each well of the 24-well plate, 350 μL of the collected culture supernatant and 1 × 10 6 healthy human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) each having known HLA ((i) HLA-A * 02 : 01 positive and HLA-A * 24: 02 negative PBMC, (ii) HLA-A * 02: 01 negative and HLA-A * 24: 02 positive PMBC, (iii) HLA-A * 02: 01 negative and HLA-A * 24: 02 negative PMBC) and 30% (150 μl) of complement (Sterile baby rabbit complement manufactured by Cedarlane) was further added. After culturing at 37 ° C. and 10% CO 2 for 24 hours, cell staining was performed with propidium iodide (PI), and the ratio of dead cells in nucleated cells was determined using a flow cytometer. As a result, three kinds of antibodies having cytotoxic action in ASH mAb against HLA-A * 02: 01 and three kinds of antibodies having cytotoxicity in ASH mAb against HLA-A * 24: 02 were identified (FIG. 2). It was done. The results of the cytotoxicity test using ASH mAb against HLA-A * 02: 01 are shown in FIG. 1A, and the results of the cytotoxicity test using ASH mAb against HLA-A * 24: 02 are shown in FIG. 1B. Both antibodies showed cytotoxicity only against either HLA-A * 02: 01 expressing cells or HLA-A * 24: 02 expressing cells (FIGS. 1A and B). It was found to be a cytotoxic ASH mAb. In this example, PBMCs separated from healthy human peripheral blood using Lymphosepar I (manufactured by Immunobiological Research Institute, product number: 23010) were used.
次に、実施例３に記載のＦｌｏｗＰＲＡスクリーング試験により、得られた３種類のＨＬＡ−Ａ＊０２：０１に対するＡＳＨｍＡｂのうち２種類についてアリル特異性の高さを再検証したところ、１種類は、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１のみと特異的に反応したが（図３右上）、もう１種類はＨＬＡ−Ａ＊０２：０１に加えＨＬＡ−Ａ＊０３：０１とも特異的に反応した（図３右下）。また、実施例３に記載のＦｌｏｗＰＲＡスクリーング試験により、得られた３種類のＨＬＡ−Ａ＊２４：０２に対するＡＳＨｍＡｂについてアリル特異性を検証したところ、２種類は、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２とのみ特異的に反応したが、もう１種類は、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２に加えＨＬＡ−Ａ＊２３：０１とも特異的に反応した（データ示さず）。さらに、いずれの抗体も、上記以外の他のＨＬＡアリルとは反応しなかったことから、高いＨＬＡアリル特異性を有することが示された。従って、この結果からも、これらの抗体は、ＨＬＡの特定のアリルを発現する細胞に対して細胞障害性を示す抗体であることが明らかとなった。 Next, when the FlowPRA screening test described in Example 3 was used to re-examine the high allyl specificity of two types of ASH mAbs against the three types of HLA-A * 02: 01 obtained, one type was , Specifically reacted only with HLA-A * 02: 01 (upper right of FIG. 3), but another type also reacted specifically with HLA-A * 03: 01 in addition to HLA-A * 02: 01 (FIG. 3 lower right). Moreover, when the allele specificity was verified about ASHmAb with respect to three types of obtained HLA-A * 24: 02 by FlowPRA screening test as described in Example 3, two types were HLA-A * 24: 02. However, the other species specifically reacted with HLA-A * 23: 01 in addition to HLA-A * 24: 02 (data not shown). Furthermore, none of the antibodies reacted with other HLA alleles other than those described above, indicating high HLA allyl specificity. Therefore, these results also revealed that these antibodies are cytotoxic to cells expressing a specific allele of HLA.
さらに、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１のみと特異的に反応する細胞障害性ＡＳＨｍＡｂを酸性するハイブリドーマクローンをマウスに移植して、その後抗体を精製した。具体的には、ハイブリドーマクローンを、予めプリスタン５００μＬ（フナコシ社製、製品番号：９８０−６０５４２）を投与したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの腹腔内に１×１０７個接種し、約１０日後に腹水を回収した。回収した腹水をプロテインＧセファロースカラム（ＧＥヘルスケア社製、製品番号：１７−０６１８−０２）に通し、抗体の精製を行った。精製した抗体をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で調べた結果、抗体のＨ鎖およびＬ鎖に由来する２本のバンド以外には、バンドは検出されず、抗体が十分な精製度を有することが確認された。さらに得られた抗体をＭｏｕｓｅ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ Ｔｅｓｔ Ｋｉｔ（ＡｂＤ ｓｅｒｏｔｅｃ社製、製品番号：ＭＭＴ１）を用いて調べたところ、抗体のアイソタイプはＩｇＧ２ａ型であることが判明した。 Furthermore, hybridoma clones that acidify cytotoxic ASH mAb that reacts specifically with only HLA-A * 02: 01 were transplanted into mice, and then the antibodies were purified. Specifically, 1 × 10 7 hybridoma clones were inoculated intraperitoneally into NOD / SCID mice pre-administered with 500 μL of pristane (manufactured by Funakoshi, product number: 980-60542), and ascites was collected about 10 days later did. The collected ascites was passed through a protein G sepharose column (manufactured by GE Healthcare, product number: 17-0618-02) to purify the antibody. As a result of examining the purified antibody by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, no bands other than the two bands derived from the H chain and L chain of the antibody were detected, and the antibody had sufficient purity. confirmed. Further, when the obtained antibody was examined using Mouse Monoclonal Isotyping Test Kit (manufactured by AbD serotec, product number: MMT1), it was found that the antibody isotype was IgG2a type.
実施例５：細胞障害性ＡＳＨｍＡｂの細胞障害作用の評価
本実施例では、実施例４で精製したＨＬＡ−Ａ＊０２：０１のみに特異性を有する細胞障害性ＡＳＨｍＡｂを用いて、まず、細胞染色能力を確認し、その後、細胞障害作用を評価した。
Example 5: Evaluation of cytotoxic effect of cytotoxic ASH mAb In this example, cytotoxic ASH mAb having specificity only in HLA-A * 02: 01 purified in Example 4 was used for cell staining first. The ability was confirmed, and then the cytotoxic effect was evaluated.
まず、実施例４で精製した抗体を用いて、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性の健常人由来のＰＢＭＣの細胞染色を行った。細胞染色では、負の対照としては、Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１ Ｉｓｏｔｙｐｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製、製品番号：５５７２７３）を用い、正の対照としては、Ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＨＬＡ Ａ２（ＦＩＴＣ）（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製、製品番号：５５１２８５）を用いた。実施例４で精製した細胞障害性ＡＳＨｍＡｂは、１μｇ、３μｇおよび５μｇの３段階の用量で用いた。実施例４で得られた細胞障害性ＡＳＨｍＡｂおよび負の対照で使用した抗体は、それぞれＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ Ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（インビトロジェン社製、製品番号：Ａ−１１００１）を２次抗体として蛍光標識し、細胞を染色した。この細胞障害性ＡＳＨｍＡｂはいずれの量においても正の対照と比較して、十分な細胞染色能力を有することが明らかとなった。 First, using the antibody purified in Example 4, cell staining of PBMC derived from HLA-A * 02: 01-positive healthy persons was performed. In the cell staining, Purified Mouse IgG1 Isotype Control (manufactured by BD Pharmingen, product number: 557273) was used as a negative control, and Mouse anti-human HLA A2 (FITC) (manufactured by BD Pharmingen, Product number: 551285) was used. The cytotoxic ASH mAb purified in Example 4 was used at three dose levels of 1 μg, 3 μg and 5 μg. The cytotoxic ASH mAb obtained in Example 4 and the antibody used as the negative control were fluorescently labeled with Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG (manufactured by Invitrogen, product number: A-11001) as a secondary antibody, respectively. Cells were stained. This cytotoxic ASH mAb was found to have sufficient cell staining ability in any amount compared to the positive control.
次に、ハイブリドーマ培養上清を実施例４で精製した抗体に変更する以外は、実施例４で記載された方法と同様の方法により、得られた抗体の細胞障害性を確認した。具体的には、まず、２４穴プレートの各ウェルに、実施例４で精製した１０μｇ、３０μｇまたは５０μｇの抗体と、ＨＬＡが判明している各１×１０６個の健常人末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）（(i)ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性のＰＢＭＣ、(ii)ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陰性のＰＢＭＣ）とを含む１ｍＬの培地を加え、さらに補体（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ社製 Ｓｔｅｒｉｌｅ ｂａｂｙ ｒａｂｂｉｔ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）３０％を加えた。次に、３７℃、１０％ＣＯ２の条件で２４時間培養後、プロピジウムイオダイド（ＰＩ）により細胞染色を行い、フローサイトメーターを用いて、有核細胞中の死細胞の割合を求めた。この結果、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１に対する細胞障害性ＡＳＨｍＡｂは、１０μｇでも十分に殺細胞作用を有することを確認した（図２）。 Next, the cytotoxicity of the obtained antibody was confirmed by the same method as that described in Example 4 except that the hybridoma culture supernatant was changed to the antibody purified in Example 4. Specifically, first, in each well of a 24-well plate, 10 μg, 30 μg or 50 μg of the antibody purified in Example 4 and 1 × 10 6 healthy human peripheral blood mononuclear cells each known to have HLA 1 mL of medium containing cells (PBMC) ((i) HLA-A * 02: 01-positive PBMC, (ii) HLA-A * 02: 01-negative PBMC) was added, and complement (Sterile manufactured by Cedarlane) was further added. baby rabbit complement) 30% was added. Next, after culturing at 37 ° C. and 10% CO 2 for 24 hours, cell staining was performed with propidium iodide (PI), and the ratio of dead cells in nucleated cells was determined using a flow cytometer. As a result, it was confirmed that the cytotoxic ASH mAb against HLA-A * 02: 01 has a sufficient cell killing effect even at 10 μg (FIG. 2).
実施例６：インビボにおける細胞障害性ＡＳＨｍＡｂの有効性および安全性の検証
本実施例では、まず、ＨＬＡが判明しているヒトＰＢＭＣを免疫不全マウスに移植して、ヒトマウス骨髄キメラマウスを作製し、得られたＧＶＨＤモデルマウスにヒトＰＢＣＭに対する細胞障害性ＡＳＨｍＡｂを投与することにより、生体内における細胞障害性ＡＳＨｍＡｂの有効性および安全性を検証した。
Example 6: Verification of efficacy and safety of cytotoxic ASH mAb in vivo In this example, first, human PBMC with known HLA was transplanted into an immunodeficient mouse to produce a human mouse bone marrow chimeric mouse, By administering cytotoxic ASH mAb against human PBCM to the obtained GVHD model mice, the efficacy and safety of cytotoxic ASH mAb in vivo were verified.
まず、以下の方法により、ヒトマウス骨髄キメラマウスを作製した。すなわち、東京都赤十字センター研究用臍帯血バンクから提供された臍帯血からＰＢＭＣを分離し、フローサイトメーターを用いて、ＨＬＡのタイピングを行った。ＨＬＡタイピングは、ａｎｔｉ ＨＬＡ−Ａ２ ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＦＩＴＣ）（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製、製品番号：５５１２８５）を用いた細胞染色により、ＰＢＭＣをＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性（＋）細胞または陰性（−）細胞の２種類に分けることにより行った。ＨＬＡタイピング後、ＣＤ３４ ｍｉｃｒｏ ｂｅａｄｓ（Ｍｉｌｉｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製、製品番号：１３０−０４６−７０３）を用いてＰＢＭＣ中のＣＤ３４陽性細胞を分離し、２Ｇｙの放射線照射後、１×１０５個を免疫不全マウス（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）に移植することにより、ヒトマウス骨髄キメラマウスを作製した。 First, human mouse bone marrow chimeric mice were prepared by the following method. That is, PBMC was separated from umbilical cord blood provided by the Tokyo Red Cross Center Research Umbilical Cord Blood Bank, and HLA typing was performed using a flow cytometer. HLA typing was performed by cell staining using anti HLA-A2 antibody (FITC) (manufactured by BD Pharmingen, product number: 551285), and PBMCs were HLA-A * 02: 01 positive (+) cells or negative (−) cells. It was performed by dividing into two types. After HLA typing, CD34 positive cells in PBMC were separated using CD34 micro beads (Miltenyi Biotec, product number: 130-046-703), and after irradiation with 2 Gy, 1 × 10 5 cells were immunodeficient. Human mouse bone marrow chimera mice were prepared by transplanting into (NOD / SCID).
移植後８週間が経過した時点で、ヒトマウス骨髄キメラマウス中でヒト由来の細胞が生着していることを確認するため、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１（ＰＥ）、ＣＤ４５（ＡＦ４０５）、ＰＩで細胞染色後、フローサイトメーターを用いて血液検査を行った。負の対照としては、Ｉｎｔａｃｔ ＮＯＤ／ＳＣＩＤ ｍｏｕｓｅのＰＢＭＣを用い、正の対照としては、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性のＰＢＭＣを用いて、ヒトＰＢＭＣの生着を確認した。本実施例では、これらの対照に加えて、さらに正の対照と負の対照の混合物を用いて、ヒトＰＢＭＣの生着を確認する実験も行った。ヒトＰＢＭＣの生着が確認されたマウスには、すぐに実施例４で精製した細胞障害性ＡＳＨｍＡｂ ０．５ｍｇを静脈注射し、投与１日後および投与７日後にヒトＰＢＭＣの生着の確認を行った。ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陰性細胞を移植した群では、細胞障害性ＡＳＨｍＡｂ投与後も細胞の生着には特に変化が見られなかったが、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性細胞を移植した群においては、細胞障害性ＡＳＨｍＡｂの投与２４時間後には生着細胞の大幅な減少が見られた（図４）。なお、抗体投与による外見上の副作用は特になく、抗体投与を受けたマウスは、その後も長期に生存した。また、同量の抗体を同じ条件で腹腔内に投与した場合にも、同様の結果が得られた（図５）。このことから、生体内における細胞障害性ＡＳＨｍＡｂの有効性および安全性が確認された。 In order to confirm that human-derived cells are engrafted in human mouse bone marrow chimeric mice at the time when 8 weeks have passed after transplantation, HLA-A * 02: 01 (PE), CD45 (AF405), PI After cell staining, blood tests were performed using a flow cytometer. Intact NOD / SCID mouse PBMC was used as a negative control, and HLA-A * 02: 01 positive PBMC was used as a positive control to confirm the engraftment of human PBMC. In this example, in addition to these controls, an experiment was also conducted to confirm the engraftment of human PBMC using a mixture of positive and negative controls. Mice with confirmed human PBMC engraftment were immediately injected intravenously with 0.5 mg of the cytotoxic ASH mAb purified in Example 4 and confirmed for human PBMC engraftment 1 day and 7 days after administration. It was. In the group transplanted with HLA-A * 02: 01 negative cells, there was no particular change in cell engraftment even after administration of cytotoxic ASH mAb, but the group transplanted with HLA-A * 02: 01 positive cells In FIG. 4, a significant decrease in engrafted cells was observed 24 hours after administration of the cytotoxic ASH mAb (FIG. 4). There were no apparent side effects due to antibody administration, and the mice that received the antibody survived for a long time. Similar results were obtained when the same amount of antibody was administered intraperitoneally under the same conditions (FIG. 5). This confirmed the efficacy and safety of cytotoxic ASH mAb in vivo.
これらの結果から、ＨＬＡアリル特異的な細胞傷害性を示す抗ＨＬＡ抗体は、ＧＶＨＤの処置に用いることができることが示された。また、本実施例のヒトマウス骨髄キメラマウスはＧＶＨＤモデル動物として利用できることが示された。 From these results, it was shown that an anti-HLA antibody exhibiting HLA allyl-specific cytotoxicity can be used for the treatment of GVHD. Moreover, it was shown that the human mouse bone marrow chimeric mouse of this Example can be used as a GVHD model animal.
実施例７：造血幹細胞移植後のＧＶＨＤの治療実験
本実施例では、実施例６で得られたＧＶＨＤモデルマウスに細胞障害性ＡＳＨｍＡｂを投与して、ＧＶＨＤの症状、例えば、体重減少、皮膚の掻痒（pruritus）、紅斑（erythema）、浮腫（Edema/papulation）、擦創（excoriation）、および、ふけ／乾燥（scaling/dryness）に対する治療効果を確認する。
Example 7 GVHD Treatment Experiment After Hematopoietic Stem Cell Transplantation In this example, cytotoxic ASH mAb was administered to the GVHD model mouse obtained in Example 6 to cause GVHD symptoms such as weight loss, skin pruritus. Therapeutic effects on (pruritus), erythema, edema / papulation, excoriation, and dandruff / dryness are confirmed.
ＧＶＨＤモデルマウスが示すＧＶＨＤの症状の改善は、以下の評点（クリニカルスコア）に基づいて評価する。 The improvement of GVHD symptoms exhibited by GVHD model mice is evaluated based on the following score (clinical score).
体重減少
３点：体重減少が激しい
２点：体重減少が中程度である
１点：体重減少がほとんど見られない
皮膚の掻痒
３点：掻痒が激しい
２点：掻痒が中程度である
１点：掻痒がほとんど見られない
皮膚の紅斑
３点：全体的に赤みがかっている
２点：部分的に赤みがかっている
１点：薄いピンク色である
皮膚の浮腫
３点：浮腫が全体的であり、激しい
２点：浮腫が全体的であり、中程度である
１点：浮腫が部分的である
皮膚の擦創
３点：擦創が激しい
２点：擦創が中程度である（一目して擦創が発見される）
１点：擦創がほとんど見られない（見つけにくい）
ふけ・乾燥
３点： 程度が激しい
２点：中程度である
１点：ほとんど見られない
Weight loss 3 points: weight loss is severe
2 points: moderate weight loss 1 point: almost no weight loss
Skin itching 3 points: severe pruritus 2 points: moderate pruritus 1 point: little pruritus is seen
3 points of erythema on the skin : 2 points that are totally reddish: 1 point that is partially reddish: light pink
Skin edema 3 points: edema is overall, severe 2 points: edema is overall, moderate 1 point: edema is partial
Skin bruise 3 points: intense bruise 2 points: moderate bruise (discovered at a glance)
1 point: scars are hardly seen (hard to find)
Dandruff / Dry 3 points: Severe degree 2 points: Moderate 1 point: Almost unseen
前記ＧＶＨＤモデルマウスに対して、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１に対する細胞障害性ＡＳＨｍＡｂ ０．５μｇを含むＰＢＳ溶液を静脈注射する。その後、上記クリニカルスコアに基づいてＧＶＨＤの症状に対する細胞障害性ＡＳＨｍＡｂの効果を検証する。 The GVHD model mouse is intravenously injected with a PBS solution containing 0.5 μg of cytotoxic ASH mAb against HLA-A * 02: 01. Thereafter, the effect of cytotoxic ASH mAb on GVHD symptoms is verified based on the above clinical score.
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