JP2015149949A - Evaluation method for immunosuppressive agent and evaluation kit for immunosuppressive agent - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、免疫抑制剤の評価方法、及び免疫抑制剤評価キットに関するものである。 The present invention relates to an immunosuppressant evaluation method and an immunosuppressant evaluation kit.
インシュリン依存状態の１型糖尿病患者には、生活の質を改善させるべく膵ランゲルハンス島（以下、膵島ともいう。）移植療法が行われている。膵島移植を受けた患者数は２００５年まで増加したが、この年を境に漸減した(非特許文献１参照。)。
該文献１にて、１）移植膵島の生着率の低さ、２）免疫抑制剤の副作用、３）免疫抑制剤の膵島への影響、が問題点としてあげられた。１）に対するよい策がない現時点において、２）、 ３）への対応が現実的である。細胞治療が盛んな北米では、新しい免疫抑制剤の組み合わせにもとり組んできているものの、移植細胞機能の長期維持はなされていないばかりか、副作用は相変わらず高率に出現し、時には致死的となる場合があった。
Insulin-dependent type 1 diabetes patients undergo pancreatic islets (hereinafter also referred to as islets) transplantation therapy to improve quality of life. The number of patients who received islet transplantation increased until 2005, but gradually decreased from this year (see Non-Patent Document 1).
In Reference 1, 1) low engraftment rate of transplanted islets, 2) side effects of immunosuppressive agents, and 3) effects of immunosuppressive agents on islets were raised as problems. At present, there is no good measure for 1), and it is realistic to respond to 2) and 3). In North America, where cell therapy is thriving, new immunosuppressive drug combinations are being worked on, but not only long-term maintenance of transplanted cell function has been achieved, but side effects still appear at a high rate and sometimes become lethal was there.
免疫抑制剤は膵島移植療法の目的に反し、骨髄抑制、口腔内潰瘍、下痢、浮腫、蛋白尿、感染など、様々な副作用を引き起こす事があり、患者の生活の質を落とすばかりか、時には命をも脅かす。また免疫抑制剤自身が、インシュリンｍＲＮＡの転写を阻害し、膵島の機能低下を引き起こす事が判明してきている （非特許文献２参照。）。
これまで膵島移植における免疫抑制剤の使用法は、エドモントンプロトコール (非特許文献３参照。) をもとに改善、改良を加えたもので、免疫抑制剤の影響の評価は、事後的に臨床判断のもと検証せざるを得なかった。
また、基礎研究等における免疫抑制剤の評価方法としては、単離した膵島を従来の２次元培養法により培養し、免疫抑制剤を添加して評価する方法や、単離した膵島を移植した免疫不全マウスに免疫抑制剤を投与する方法が挙げられる（非特許文献２、４〜５参照。）。
Immunosuppressants, contrary to the purpose of islet transplantation, can cause a variety of side effects such as bone marrow suppression, oral ulcers, diarrhea, edema, proteinuria, and infection, not only reducing the patient's quality of life, but sometimes life. Threaten. In addition, it has been found that immunosuppressive agents themselves inhibit insulin mRNA transcription and cause pancreatic islet function deterioration (see Non-Patent Document 2).
So far, the use of immunosuppressive agents in islet transplantation has been improved and improved based on the Edmonton Protocol (see Non-Patent Document 3). I had to verify it.
In addition, as a method for evaluating immunosuppressants in basic research, etc., isolated islets are cultured by a conventional two-dimensional culture method, and immunosuppressants are added for evaluation, or immunity transplanted with isolated islets. The method of administering an immunosuppressive agent to a deficient mouse is mentioned (refer nonpatent literature 2, 4-5).
しかしながら、上記非特許文献に記載の免疫抑制剤の評価方法では、ヒト体内の膵島で生じる現象を捕捉するという点では未だ改良の余地があった。 However, the method for evaluating an immunosuppressant described in the above non-patent document still has room for improvement in terms of capturing a phenomenon that occurs in a pancreatic islet in a human body.
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、免疫抑制剤の膵島への影響を客観的に評価でき、副作用の低減に寄与できる免疫抑制剤の評価方法、及び免疫抑制剤評価キットを提供する。 The present invention has been made in view of the above circumstances, and provides an immunosuppressive agent evaluation method and an immunosuppressant evaluation kit that can objectively evaluate the influence of an immunosuppressive agent on pancreatic islets and contribute to the reduction of side effects. To do.
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、生体類似三次元培養システムを構築することにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏの評価系であっても、高い正診率が得られる免疫抑制剤の評価方法を見出し、本発明を完成させた。 As a result of diligent research to solve the above problems, the present inventors have established an organism-similar three-dimensional culture system, and thus an immunosuppressive agent that can obtain a high correct diagnosis rate even in an in vitro evaluation system. The evaluation method was found and the present invention was completed.
すなわち、本発明は、以下の免疫抑制剤の評価方法、及び免疫抑制剤評価キットを提供するものである。 That is, the present invention provides the following immunosuppressive agent evaluation method and immunosuppressive agent evaluation kit.
（１）生体組織由来の膵島を、分子内に疎水性部分と親水性部分とを有し、低温でゾル状態、高温でゲル状態となる熱可逆的なゾル−ゲル転移を示す温度感応性ハイドロゲルを含有する培地で培養する工程Ａと、
免疫抑制剤を培地に添加する工程Ｂと、
免疫抑制剤に接触した膵島の状態を評価する工程Ｃと、
を有することを特徴とする免疫抑制剤の評価方法。
（２）前記工程Ｃは、免疫抑制剤に接触したインシュリン遺伝子のプロモーターのメチル化の割合を指標に膵島の状態を評価する工程Ｃ１を有する前記（１）に記載の免疫抑制剤の評価方法。
（３）前記工程Ｃ１は、更に免疫抑制剤に接触した内因性及び／又は外因性Ｐｄｘ１遺伝子のメチル化の割合を指標に膵島の状態を評価する工程を含む前記（２）に記載の免疫抑制剤の評価方法。
（４）前記生体組織由来の膵島は、Ｐｄｘ１遺伝子のプロモーターと、その下流に蛍光タンパク質をコードする遺伝子を有する導入遺伝子断片が導入されてなるトランスジェニック非ヒト動物由来の膵島である前記（１）から（３）のいずれかに記載の免疫抑制剤の評価方法。
（５）前記工程Ｃは、免疫抑制剤に接触した外因性Ｐｄｘ１遺伝子のプロモーターの転写活性を蛍光タンパク質の発する蛍光の強度を指標に膵島の状態を評価する工程Ｃ２を有する前記（４）に記載の免疫抑制剤の評価方法。
（６）前記トランスジェニック非ヒト動物の宿主動物がブタである前記（４）又は（５）に記載の免疫抑制剤の評価方法。
(1) A temperature-sensitive hydrous pancreatic islet having a hydrophobic portion and a hydrophilic portion in a molecule and exhibiting a thermoreversible sol-gel transition that becomes a sol state at a low temperature and a gel state at a high temperature. Culturing in a medium containing a gel, and
Adding an immunosuppressive agent to the medium, B;
Step C for assessing the state of the islets in contact with the immunosuppressant;
The evaluation method of the immunosuppressive agent characterized by having.
(2) The method for evaluating an immunosuppressive agent according to (1), wherein the step C comprises a step C1 of evaluating the state of the pancreatic islet using the ratio of the methylation of the promoter of the insulin gene in contact with the immunosuppressive agent as an index.
(3) The immunosuppression according to (2), wherein the step C1 further comprises a step of evaluating the state of the islets using the ratio of methylation of the endogenous and / or exogenous Pdx1 gene in contact with the immunosuppressive agent as an index. Evaluation method of the agent.
(4) The islet derived from a living tissue is a pancreatic islet derived from a transgenic non-human animal into which a transgene fragment having a promoter encoding a Pdx1 gene and a gene encoding a fluorescent protein downstream thereof is introduced (1) The evaluation method of the immunosuppressive agent in any one of (3).
(5) The step C includes the step C2 of evaluating the state of the pancreatic islets using the transcriptional activity of the promoter of the exogenous Pdx1 gene in contact with the immunosuppressant as an indicator of the intensity of fluorescence emitted by the fluorescent protein. Evaluation method of immunosuppressive agent.
(6) The method for evaluating an immunosuppressant according to (4) or (5), wherein the host animal of the transgenic non-human animal is a pig.
（７）分子内に疎水性部分と親水性部分とを有し、低温でゾル状態、高温でゲル状態となる熱可逆的なゾル−ゲル転移を示す温度感応性ハイドロゲルを備えたことを特徴とする免疫抑制剤評価キット。
（８）更に、免疫抑制剤に接触した遺伝子のプロモーターのメチル化の割合を測定するメチル化測定キットを備えた前記（７）に記載の免疫抑制剤評価キット。
（９）更に、Ｐｄｘ１遺伝子のプロモーターと、その下流に蛍光タンパク質をコードする遺伝子を有する導入遺伝子断片が導入されてなるトランスジェニック非ヒト動物由来の膵島を備えた前記（７）又は（８）に記載の免疫抑制剤評価キット。
（１０）前記トランスジェニック非ヒト動物の宿主動物がブタである前記（９）に記載の免疫抑制剤の選別方法。
(7) A temperature-sensitive hydrogel having a hydrophobic portion and a hydrophilic portion in the molecule and exhibiting a thermoreversible sol-gel transition that is in a sol state at a low temperature and in a gel state at a high temperature. An immunosuppressant evaluation kit.
(8) The immunosuppressive agent evaluation kit according to (7), further comprising a methylation measurement kit for measuring a methylation rate of a promoter of a gene in contact with the immunosuppressive agent.
(9) The above (7) or (8) further comprising a pancreatic islet derived from a transgenic non-human animal into which a Pdx1 gene promoter and a transgene fragment having a gene encoding a fluorescent protein are introduced downstream thereof. The immunosuppressive agent evaluation kit as described.
(10) The method for selecting an immunosuppressive agent according to (9), wherein the transgenic non-human animal host animal is a pig.
本発明によれば、免疫抑制剤の膵島への影響を客観的に評価でき、副作用の低減に寄与できる。 According to the present invention, it is possible to objectively evaluate the influence of an immunosuppressive agent on pancreatic islets and contribute to the reduction of side effects.
＜免疫抑制剤の評価方法＞
本実施形態の免疫抑制剤の評価方法は、分子内に疎水性部分と親水性部分とを有し、低温でゾル状態、高温でゲル状態となる熱可逆的なゾル−ゲル転移を示す温度感応性ハイドロゲルを含有する培地で培養する工程Ａと、免疫抑制剤を培地に添加する工程Ｂと、免疫抑制剤に接触した膵島の状態を評価する工程Ｃと、を有する。
本実施形態の評価方法は、免疫抑制剤を患者に投与する前に、生じる副作用を予見し、副作用の少ない免疫抑制剤を選別するための方法又は最適投与用量を決定するための方法である。以下、各工程について具体的に説明する。
<Method for evaluating immunosuppressant>
The immunosuppressive agent evaluation method of the present embodiment has a temperature-sensitive sol-gel transition that has a hydrophobic portion and a hydrophilic portion in the molecule, and exhibits a thermoreversible sol-gel transition that takes a sol state at a low temperature and a gel state at a high temperature. A step A of culturing in a medium containing a functional hydrogel, a step B of adding an immunosuppressive agent to the medium, and a step C of evaluating the state of the islets in contact with the immunosuppressive agent.
The evaluation method of the present embodiment is a method for predicting side effects that occur before administering an immunosuppressive agent to a patient, and for selecting an immunosuppressive agent with few side effects, or a method for determining an optimal dose. Hereinafter, each step will be specifically described.
工程Ａは、生体組織由来の膵島を、分子内に疎水性部分と親水性部分とを有し、低温でゾル状態、高温でゲル状態となる熱可逆的なゾル−ゲル転移を示す温度感応性ハイドロゲルを含有する培地で培養する工程である。工程Ａにおいて用いられる生体組織由来の膵島としては、移植に用いられるヒト由来の膵島；移植を受ける患者のｉＰＳ細胞を分化してなる膵島が好ましい。簡便に入手可能で、ヒトの臓器サイズに近い観点からブタ由来の膵島がより好ましい。
更に、簡便にかつ客観的に免疫抑制剤の膵島への影響を評価する観点から、前記生体組織由来の膵島は、Ｐｄｘ１遺伝子のプロモーターと蛍光タンパク質をコードする遺伝子を有する導入遺伝子断片が導入されてなるトランスジェニック非ヒト動物由来の膵島であることが好ましい。簡便に入手可能で、ヒトの臓器サイズに近い観点から、係るトランスジェニック非ヒト動物の宿主動物は、ブタであることが好ましい。ブタ膵島は糖尿病患者に対し、ニュージーランドでＰｈａｓｅＩ ｔｒｉａｌ、ロシアでＰｈａｓｅＩ／ＩＩａ ｔｒｉａｌとして臨床試験に使われている。ブタの膵島で再現性のある検討は、ヒトへの臨床情報を収集するには好都合である。
Step A is a temperature-sensitive pancreatic islet having a hydrophobic part and a hydrophilic part in the molecule and exhibiting a thermoreversible sol-gel transition that takes a sol state at a low temperature and a gel state at a high temperature. It is a step of culturing in a medium containing hydrogel. As the islet derived from a living tissue used in the step A, a human-derived islet used for transplantation; an islet obtained by differentiating iPS cells of a patient receiving the transplant is preferable. A pancreatic islet is more preferable from the viewpoint of being easily available and close to the size of a human organ.
Furthermore, from the viewpoint of simply and objectively evaluating the effect of an immunosuppressive agent on the islets, the above-mentioned islets derived from living tissues are introduced with a transgene fragment having a Pdx1 gene promoter and a gene encoding a fluorescent protein. It is preferable that the islet is derived from a transgenic non-human animal. The host animal of such a transgenic non-human animal is preferably a pig from the viewpoint that it can be easily obtained and is close to the size of a human organ. Porcine islets are used in clinical trials for diabetic patients as Phase I trial in New Zealand and Phase I / IIa trial in Russia. A reproducible study on porcine islets is convenient for collecting clinical information for humans.
Ｐｄｘ１（Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ａｎｄ ｄｕｏｄｅｎａｌ ｈｏｍｅｏｂｏｘ１）遺伝子は、膵臓の発生期に発現する転写因子ＰＤＸ１をコードする遺伝子である。転写因子ＰＤＸ１は、ヒトインシュリンプロモーターの転写因子結合部位に結合し、インシュリンの発現を制御する。
従って、Ｐｄｘ１遺伝子のプロモーターと、その下流にレポーターとしての蛍光タンパク質をコードする遺伝子を有する導入遺伝子断片を導入されてなるトランスジェニック非ヒト動物は、蛍光を発する膵島を有する。そして、膵島が蛍光を発していることは、Ｐｄｘ１遺伝子のプロモーターが正常に機能していることを意味し、転写因子ＰＤＸ１を介してインシュリンが正常に発現していることを意味する。
The Pdx1 (Pancreatic and dual homebox1) gene is a gene encoding the transcription factor PDX1 expressed in the pancreatic developmental stage. The transcription factor PDX1 binds to the transcription factor binding site of the human insulin promoter and controls the expression of insulin.
Therefore, a transgenic non-human animal into which a transgene fragment having a Pdx1 gene promoter and a gene encoding a fluorescent protein as a reporter downstream thereof has a fluorescent islet. The fact that the pancreatic islet is fluorescent means that the promoter of the Pdx1 gene is functioning normally, and that insulin is normally expressed via the transcription factor PDX1.
Ｐｄｘ１遺伝子のプロモーターとその下流に蛍光タンパク質をコードする遺伝子を有する導入遺伝子断片が導入されてなるトランスジェニックブタ（以下、Ｐｄｘ１−蛍光タンパク質Ｔｇブタともいう。）の作製方法としては、特に限定されず、従来公知の方法が挙げられる。導入遺伝子断片が異なる以外は、例えば、特開２００８−１５４５２０号公報に記載の方法にて、トランスジェニックブタを作製できる。
上述したように、Ｐｄｘ１遺伝子は、膵臓の発生期に発現する遺伝子であるため、Ｐｄｘ１−蛍光タンパク質Ｔｇブタは、膵臓(主として膵島)特異的に蛍光タンパク質を発現している。
The method for producing a transgenic pig (hereinafter also referred to as Pdx1-fluorescent protein Tg pig) into which a Pdx1 gene promoter and a transgene fragment having a gene encoding a fluorescent protein are introduced downstream is not particularly limited. And a conventionally known method. Except for different transgene fragments, for example, transgenic pigs can be produced by the method described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2008-154520.
As described above, since the Pdx1 gene is a gene expressed during the pancreatic development stage, the Pdx1-fluorescent protein Tg pig expresses the fluorescent protein specifically in the pancreas (mainly islets).
蛍光タンパク質としては特に限定されず、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、ＡｃＧＦＰ、ＴａｇＧＦＰ、Ａｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＥｍＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＧＦＰ２、ＨｙＰｅｒ等の緑色蛍光タンパク質（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ, ＧＦＰ）；ＥＢＦＰ等の青色蛍光タンパク質（Ｂｌｕｅ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｎ, ＢＦＰ ）； ＥＣＦＰ、ＴａｇＣＦＰ、ＡｍＣｙａｎ、ＭｉｄｏｒｉｉｓｈｉＣｙａｎ等のシアン蛍光タンパク質（Ｃｙａｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ, ＣＦＰ）；ＴｕｒｂｏＲＦＰ、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＴａｇＲＦＰ、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＡｓＲｅｄ２、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ等赤色蛍光タンパク質（Ｒｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ, ＲＦＰ）；ＴａｇＹＦＰ、ＥＹＦＰ、Ｖｅｎｕｓ、ＰｈｉＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ−ｍ、ＴｕｒｂｏＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ｍＢａｎａｎａ等の黄色蛍光タンパク質（Ｙｅｌｌｏｗ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ, ＹＦＰ）、ＫｕｓａｂｉｒａＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ等の橙色蛍光タンパク質、ＴｕｒｂｏＦＰ６０２、ｍＲＦＰ１、ＪＲｅｄ、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＨｃＲｅｄ、ＫｅｉｍａＲｅｄ ｍＲａｓｂｅｒｒｙ、ｍＰｌｕｍ等の赤外光の蛍光を発する蛍光タンパク質が挙げられる。観察に適した明るさが得られ、かつ簡便に入手できる点から、Ｖｅｎｕｓ、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙが好ましい。 The fluorescent protein is not particularly limited, and is a green fluorescent protein (Green Fluorescent Protein, GFP) such as TurboGFP, AcGFP, TagGFP, Azami-Green, ZsGreen, EmGFP, EGFP, GFP2, HyPer; Blue Fluor protein such as EBFP Protene, BFP); ECFP, TagCFP, AmCyan, MidorishiCyan et al. Cyan Fluorescent Protein (Cyan Fluorescent Protein, CFP); TurboRFP, DsRed-Express, DsRed-M, Red ent Protein, RFP); Yellow fluorescent proteins such as TagYFP, EYFP, Venus, PhiYFP, PhiYFP-m, TurboYFP, ZsYellow, mBana, etc., Yellow Fluoroprotein Protein, YFP; , A fluorescent protein that emits infrared fluorescence, such as KillerRed, mCherry, HcRed, KeimaRed mRasbury, mPlum. Venus, DsRed-Monomer, and mStrawberry are preferable from the viewpoint that brightness suitable for observation can be obtained and they can be easily obtained.
また、膵臓の発する蛍光を指標に、フローサイトメトリーやセルソーターを用いて、精製することができる。
膵臓から膵島を精製する方法としては、密度勾配遠心法等、従来公知の方法が挙げられる。
ＳＤＩ法、ＡＴＰ法、ＭＴＴ ａｓｓａｙ法等の従来の試験方法では、混在してくる他の細胞が原因で、不均一な染色から結果を判定しなければならず、過小評価となる問題点を含んでいた。本実施形態において、蛍光信号により膵島のみを評価対象として用いることにより、係る問題点を解決することができる。
Moreover, it can refine | purify using flow cytometry or a cell sorter by using the fluorescence which pancreas emits as a parameter | index.
Examples of methods for purifying islets from the pancreas include conventionally known methods such as density gradient centrifugation.
In conventional test methods such as the SDI method, ATP method, and MTT assay method, the result must be judged from non-uniform staining due to other mixed cells, and there is a problem of underestimation. It was out. In the present embodiment, such a problem can be solved by using only the islet as an evaluation target by the fluorescence signal.
工程Ａに用いられる培地は、分子内に疎水性部分と親水性部分とを有し、低温で流動性のあるゾル状態、高温でゲル状態となる熱可逆的なゾル−ゲル転移を示す温度感応性ハイドロゲルを含有する。温度感応性ハイドロゲルのゾル−ゲル転移温度は、膵島の熱的損傷を防ぐ温度範囲が好ましく、４℃〜４０℃がより好ましい。係るゾル−ゲル転移温度を示す温度感応性ハイドロゲルとしては、その水溶液が曇点を有する高分子と親水性高分子を結合してなる共重合体が挙げられる。
曇点とは、濃度１重量％程度の透明な高分子の水溶液を例えば、１℃／分程度の速度で、徐々に加熱した時、はじめて白濁を生じる温度を言う。本実施形態においては、温度感応性ハイドロゲルのゾル−ゲル転移温度を４℃〜４０℃とするためには、この曇点が５４℃〜４０℃であることが好ましい。すなわち、その水溶液が曇点を有する高分子は、曇点より低い温度では水に溶解するが、曇点より高い温度では非水溶性となり水から析出する。
The medium used in Step A has a hydrophobic part and a hydrophilic part in the molecule, and exhibits a thermosensitive reversible sol-gel transition that is fluid at low temperatures and gels at high temperatures. Contains a functional hydrogel. The sol-gel transition temperature of the temperature-sensitive hydrogel is preferably in a temperature range that prevents thermal damage to the islets, and more preferably 4 ° C to 40 ° C. Examples of the temperature-sensitive hydrogel exhibiting such a sol-gel transition temperature include a copolymer obtained by binding a polymer having a cloud point to a hydrophilic polymer.
The cloud point refers to a temperature at which white turbidity occurs only when a transparent polymer aqueous solution having a concentration of about 1% by weight is gradually heated, for example, at a rate of about 1 ° C./min. In this embodiment, in order to set the sol-gel transition temperature of the temperature-sensitive hydrogel to 4 ° C. to 40 ° C., the cloud point is preferably 54 ° C. to 40 ° C. That is, the polymer whose aqueous solution has a cloud point dissolves in water at a temperature lower than the cloud point, but becomes water-insoluble at a temperature higher than the cloud point and precipitates from water.
その水溶液が曇点を有する高分子としては、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、ポリ−Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド、ポリ−Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、ポリ−Ｎ−アクリロイルピペリジン、ポリ−Ｎ−アクリロイルピロリジン、ポリ−Ｎ，Ｎ−エチルメチルアクリルアミドなどのポリＮ置換アクリルアミド誘導体、ポリ−Ｎ−イソプロピルメタアクリルアミド、ポリ−Ｎ−シクロプロピルメタアクリルアミドなどのポリＮ置換メタアクリルアミド誘導体、ポリプロピレンオキサイドなどのポリアルキレンオキサイド、ポリビニルメチルエ−テル、ポリビニルアルコ−ル部分酢化物などが挙げられる。 Examples of the polymer whose aqueous solution has a cloud point include poly-N-isopropylacrylamide, poly-Nn-propylacrylamide, poly-N-cyclopropylacrylamide, poly-N, N-diethylacrylamide, and poly-N-acryloyl. PolyN-substituted acrylamide derivatives such as piperidine, poly-N-acryloylpyrrolidine, poly-N, N-ethylmethylacrylamide, poly-N-isopropylmethacrylamide, poly-N-cyclopropylmethacrylamide, etc. And polyalkylene oxides such as polypropylene oxide, polyvinyl methyl ether, polyvinyl alcohol partially acetylated products, and the like.
その水溶液が曇点を有する高分子は単独でも、他の単量体と共重合させて得たものでも良い。共重合する単量体としては、親水性単量体、疎水性単量体のいずれも用いることができる。一般的にポリＮ置換（メタ）アクリルアミド誘導体の曇点は親水性単量体と共重合すると上昇し、疎水性単量体と共重合すると下降する。従って、これらを選択することによっても、所望の曇点を有する高分子を得ることができる。 The polymer in which the aqueous solution has a cloud point may be used alone or may be obtained by copolymerization with other monomers. As the monomer to be copolymerized, either a hydrophilic monomer or a hydrophobic monomer can be used. In general, the cloud point of a poly-N-substituted (meth) acrylamide derivative increases when copolymerized with a hydrophilic monomer and decreases when copolymerized with a hydrophobic monomer. Therefore, a polymer having a desired cloud point can also be obtained by selecting them.
親水性単量体としては、Ｎ−ビニルピロリドン、ビニルピリジン、アクリルアミド、メタアクリルアミド、Ｎ−メチルアクリルアミド、ヒドロキシエチルメタアクリレ−ト、ヒドロキシエチルアクリレ−ト、ヒドロキシメチルメタアクリレ−ト、ヒドロキシメチルアクリレ−ト、酸性基を有するアクリル酸、メタアクリル酸およびそれらの塩、ビニルスルホン酸、スチレンスルホン酸など、並びに塩基性基を有するＮ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレ−ト、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチルメタクリレ−ト、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドおよびそれらの塩などが挙げられる。 Examples of hydrophilic monomers include N-vinyl pyrrolidone, vinyl pyridine, acrylamide, methacrylamide, N-methyl acrylamide, hydroxyethyl methacrylate, hydroxyethyl acrylate, hydroxymethyl methacrylate, hydroxy Methyl acrylate, acrylic acid having an acidic group, methacrylic acid and salts thereof, vinyl sulfonic acid, styrene sulfonic acid and the like, and N, N-dimethylaminoethyl methacrylate having a basic group, N, Examples thereof include N-diethylaminoethyl methacrylate, N, N-dimethylaminopropyl acrylamide and salts thereof.
疎水性単量体としては、エチルアクリレ−ト、メチルメタクリレ−ト、ｎ−ブチルメタクリレ−ト、グリシジルメタクリレ−ト等のアクリレ−ト誘導体およびメタクリレ−ト誘導体，Ｎ−ｎ−ブチルメタアクリルアミドなどのＮ置換アルキルメタアクリルアミド誘導体、塩化ビニル、アクリロニトリル、スチレン、酢酸ビニルなどが挙げられる。 Hydrophobic monomers include ethyl acrylate, methyl methacrylate, n-butyl methacrylate, glycidyl methacrylate and other acrylate derivatives and methacrylate derivatives, Nn-butyl methacrylamide N-substituted alkylmethacrylamide derivatives such as vinyl chloride, acrylonitrile, styrene, vinyl acetate and the like.
親水性高分子としては、例えば、ポリエチレングリコール、メチルセルロ−ス、デキストラン、ポリエチレンオキサイド、ポリビニルアルコ−ル、ポリＮ−ビニルピロリドン、ポリビニルピリジン、ポリアクリルアミド、ポリメタアクリルアミド、ポリＮ−メチルアクリルアミド、ポリヒドロキシメチルアクリレ−ト、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリビニルスルホン酸、ポリスチレンスルホン酸およびそれらの塩、ポリＮ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレ−ト、ポリＮ，Ｎ−ジエチルアミノエチルメタクリレ−ト、ポリＮ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドおよびそれらの塩などが挙げられる。 Examples of the hydrophilic polymer include polyethylene glycol, methyl cellulose, dextran, polyethylene oxide, polyvinyl alcohol, poly N-vinyl pyrrolidone, polyvinyl pyridine, polyacrylamide, polymethacrylamide, poly N-methylacrylamide, and polyhydroxy. Methyl acrylate, polyacrylic acid, polymethacrylic acid, polyvinyl sulfonic acid, polystyrene sulfonic acid and their salts, poly N, N-dimethylaminoethyl methacrylate, poly N, N-diethylaminoethyl methacrylate , Poly N, N-dimethylaminopropylacrylamide and salts thereof.
上記の中から、本実施形態に用いられる温度感応性ハイドロゲルは、温度感応性高分子であるポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドと親水性高分子ポリエチレングリコールの共重合体が好ましい。 Among the above, the temperature-sensitive hydrogel used in the present embodiment is preferably a copolymer of poly-N-isopropylacrylamide, which is a temperature-sensitive polymer, and a hydrophilic polymer, polyethylene glycol.
本実施形態に用いられる温度感応性ハイドロゲルの高分子は、転移温度の低温側では流動性のある水溶液、高温側では流動性を失ってハイドロゲルとなる昇温時ゲル化タイプの熱可逆ゾル−ゲル転移を示す。
すなわち、共重合体中の曇点を有する高分子部分の曇点より低い温度では、該曇点を有する高分子部分、親水性高分子部分ともに水溶性であるので、該共重合体は完全に水に溶解する。しかし、この水溶液の温度を該曇点より高い温度に昇温すると、該曇点を有する
高分子部分が非水溶性となって凝集し分子間会合が起こる。一方、親水性高分子部分は該曇点より高い温度においても水溶性を保つので、該曇点を有する高分子部分間の凝集が巨視的な相分離に至ることを防止し、安定なハイドロゲルが形成される。
The temperature-sensitive hydrogel polymer used in the present embodiment is an aqueous solution having fluidity at the low temperature side of the transition temperature, and a gelling type thermoreversible sol at elevated temperature that loses fluidity at the high temperature side and becomes a hydrogel. -Showing gel transition.
That is, at a temperature lower than the cloud point of the polymer part having a cloud point in the copolymer, the polymer part having the cloud point and the hydrophilic polymer part are both water-soluble, so that the copolymer is completely Dissolve in water. However, when the temperature of the aqueous solution is raised to a temperature higher than the cloud point, the polymer portion having the cloud point becomes water-insoluble and aggregates to cause intermolecular association. On the other hand, since the hydrophilic polymer part remains water-soluble even at a temperature higher than the cloud point, the aggregation between the polymer parts having the cloud point is prevented from leading to macroscopic phase separation, and a stable hydrogel is obtained. Is formed.
本実施形態に用いられるハイドロゲル形成性の高分子における、その水溶液が曇点を有する高分子（Ａ）と親水性高分子（Ｂ）を結合してなる共重合体中の（Ａ）の含有量は、１０〜９０重量％の範囲であることが好ましく、３０〜７０重量％の範囲であることがより好ましい。
曇点を有する高分子（Ａ）の含有量が１０重量％以上の場合、該曇点を有する高分子部分間の凝集力が弱すぎず、該曇点より高い温度でもハイドロゲルとなりやすくなる。高分子（Ａ）の含有量が９０重量％以下の場合、曇点を有する高分子部分間の凝集力が強すぎず、系全体が巨視的な相分離を起こすことなく、安定なハイドロゲルが得られやすくなる。
In the hydrogel-forming polymer used in this embodiment, the aqueous solution contains (A) in a copolymer formed by binding a polymer (A) having a cloud point and a hydrophilic polymer (B). The amount is preferably in the range of 10 to 90% by weight, more preferably in the range of 30 to 70% by weight.
When the content of the polymer (A) having a cloud point is 10% by weight or more, the cohesive force between the polymer parts having the cloud point is not too weak, and a hydrogel is easily formed even at a temperature higher than the cloud point. When the content of the polymer (A) is 90% by weight or less, the cohesive force between the polymer parts having cloud points is not too strong, and the entire system does not cause macroscopic phase separation, and a stable hydrogel can be obtained. It becomes easy to obtain.
工程Ａにおいて、温度感応性ハイドロゲルをゾル−ゲル転移温度より低い温度で、培地と混合し、更に膵島を混入し、ゾル−ゲル転移温度より高い温度でこれら混合物をゲル状態とする。
工程Ａにおいて用いられる培地としては、細胞培養に用いられる従来公知のものが挙げられる。
In step A, the temperature-sensitive hydrogel is mixed with the medium at a temperature lower than the sol-gel transition temperature, and islets are further mixed, and these mixtures are brought into a gel state at a temperature higher than the sol-gel transition temperature.
Examples of the medium used in Step A include conventionally known media used for cell culture.
本実施形態に用いられる温度感応性ハイドロゲルは、膵島を低温ゾル状態で包埋できるため、包埋時の熱的損傷を回避できる。
更に前記温度感応性ハイドロゲルは、分子内に疎水性部分を有するため、温度の上昇と共に疎水性部分間の結合力が強くなり、三次元網目構造を形成する。また、親水性部分は水溶性を保っているため、温度感応性ハイドロゲルが凝集することなく、含水ゲルの状態が保たれる。従って、工程Ａにおいて、生体類似三次元培養システムにより、膵島を生体内に近い状態で３次元培養することができる。
また、マトリゲル等の生体からの培養基材は、含まれる未知の増殖因子により、免疫抑制剤の純粋な評価に影響を及ぼす可能性、あるいは牛海綿状脳症などの病変形成が懸念される。本実施形態に用いられる温度感応性ハイドロゲルは、生体からの培養基材を含まない高分子化合物であるため、係る懸念は皆無で、目的とした細胞のみを純粋に評価でき、薬剤選択後には薬剤の様々な濃度の設定ができる利点を有する。
The temperature-sensitive hydrogel used in the present embodiment can embed the islets in a low-temperature sol state, and thus can avoid thermal damage during embedding.
Furthermore, since the temperature-sensitive hydrogel has a hydrophobic portion in the molecule, the bonding force between the hydrophobic portions becomes stronger as the temperature rises, forming a three-dimensional network structure. Moreover, since the hydrophilic part maintains water solubility, the state of a water-containing gel is maintained, without a temperature-sensitive hydrogel aggregating. Therefore, in step A, the islet can be three-dimensionally cultured in a state close to the living body by the living body-like three-dimensional culture system.
Moreover, there is a concern that a culture substrate from a living body such as Matrigel may affect the pure evaluation of an immunosuppressive agent due to an unknown growth factor contained therein or a lesion formation such as bovine spongiform encephalopathy. Since the temperature-sensitive hydrogel used in this embodiment is a polymer compound that does not contain a culture substrate from a living body, there is no such concern, only the intended cells can be evaluated purely, and after drug selection This has the advantage that various concentrations of the drug can be set.
このように、本実施形態に用いられる温度感応性ハイドロゲルは、低温のゾル状態で細胞を分散させ、培養温度に加熱するだけでゲル化させることができるので、簡単に生体内と類似の三次元環境を作ることができる一方、低温化させ、ゲルからゾルへ転移させることで細胞や組織にダメージを与えることなく回収が可能である。 Thus, the temperature-sensitive hydrogel used in this embodiment can be gelled by simply dispersing cells in a low-temperature sol state and heating to the culture temperature. While the original environment can be created, it can be recovered without causing damage to cells and tissues by lowering the temperature and transferring from gel to sol.
工程Ｂは、免疫抑制剤を培地に添加する工程である。免疫抑制剤を添加するタイミングは、特に限定されないが、膵島含有培地をゲル状態とした後が好ましい。膵島がゲルに包埋された状態を確認後、速やかにいくつかの濃度に分けた免疫抑制剤含有の培養液を添加する。即ち工程Ａと工程Ｂは同日に行われることが好ましい。
培地に添加される免疫抑制剤としては、特に限定されず、副腎皮質ステロイド、アルキル化剤、代謝拮抗剤、アルカロイド系薬剤、カルシニューリン阻害剤、サイクリン依存性カイネース阻害剤、抗胸腺細胞グロブリン、ＣＤ抗原に対するモノクローナル抗体が挙げられる。
具体的には、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ハイドロコルチゾン、トリアムシノロン、ベタメサゾン、デキサメサゾン、シクロフォスファミド、メトトレキサート、アザチオプリン、ミコフェノレート、ミゾリビン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド、マイトマイシンＣ、シクロスポリン、ＦＫ５０６、シロリムス、ラパマイシン、アトガム、チモグロブリン、Ｍｕｒｏｍｏｎａｂ−ＣＤ３、リツキシマブ、バシリキシマブ、ダクリツマブが例示され、ミコフェノレート、アザチオプリン、タクロリムス、シロリムス、ラパマイシン、バシキキシマブ、ダクリツマブ、インフリキシマブ、グスペリムス、抗リンパ球グロブリン、エタネルセプト、ミコフェノール酸モフェチル、ダクリズムマブ等が挙げられる。
工程Ａにおいて、移植に用いられるヒト由来の膵島や移植を受ける患者のｉＰＳ細胞を分化してなる膵島を用いる場合には、上述した免疫抑制剤の中から、患者にとって副作用の少ないものをスクリーニングすることができる。また、実際に膵島移植に至った患者においても、移植に使われるごく一部の膵島を本システムで解析することにより、患者に最も適した免疫抑制剤の選択が可能となる。すなわち、移植開始時は、各施設における免疫抑制剤のレジュメを使用せざるをえないが、本実施形態の免疫抑制剤の評価方法を用いた解析結果が出次第、各患者に最適な免疫抑制剤を選択できるテーラーメード治療となる。
また、工程Ａにおいて、Ｐｄｘ１遺伝子のプロモーターとその下流に蛍光タンパク質をコードする遺伝子を有する導入遺伝子断片が導入されてなるトランスジェニック非ヒト動物由来の膵島を用いる場合には、例えば開発候補品の中から副作用の少ない免疫抑制剤をスクリーニングすることができる。
選択される免疫抑制剤は、単剤でもよく、複数の免疫抑制剤の組み合わせであってもよい。
工程Ａにより、免疫抑制剤の膵島への影響を最小に抑える薬剤を探索、濃度、組み合わせを検証し、膵島移植に使用する最適な免疫抑制剤の選定を行うことができる。
Step B is a step of adding an immunosuppressant to the medium. The timing of adding the immunosuppressive agent is not particularly limited, but is preferably after the pancreatic islet-containing medium is in a gel state. After confirming that the islets are embedded in the gel, a culture solution containing an immunosuppressive agent divided into several concentrations is quickly added. That is, step A and step B are preferably performed on the same day.
The immunosuppressant added to the medium is not particularly limited, but is a corticosteroid, alkylating agent, antimetabolite, alkaloid, calcineurin inhibitor, cyclin-dependent kinase inhibitor, antithymocyte globulin, CD antigen And monoclonal antibodies.
Specifically, prednisolone, methylprednisolone, hydrocortisone, triamcinolone, betamethasone, dexamethasone, cyclophosphamide, methotrexate, azathioprine, mycophenolate, mizoribine, vincristine, vinblastine, etoposide, mitomycin C, cyclosporin, FK 506 , Atogum, thymoglobulin, Muromomonab-CD3, rituximab, basiliximab, daclizumab are exemplified, mycophenolate, azathioprine, tacrolimus, sirolimus, rapamycin, basiliximab, daclizumab, infliximab, gusperimyl, anti-lymphocyte mitochonel fetalmigrel , Daclimusumab and the like.
In step A, when using islets derived from humans used for transplantation or islets obtained by differentiating iPS cells of a patient undergoing transplantation, the above-mentioned immunosuppressive agents are screened for those with few side effects for the patient. be able to. Moreover, even in patients who have actually undergone islet transplantation, it is possible to select an immunosuppressive agent most suitable for the patient by analyzing only a small part of the islets used for transplantation with this system. That is, at the start of transplantation, the immunosuppressant resume at each facility must be used, but as soon as the analysis results using the immunosuppressive agent evaluation method of this embodiment are available, the optimal immunosuppression for each patient It will be tailor-made treatment that allows you to select agents.
Further, in the case of using a pancreatic islet derived from a transgenic non-human animal into which a transgene fragment having a Pdx1 gene promoter and a gene encoding a fluorescent protein is introduced downstream thereof in Step A, for example, among development candidates Therefore, it is possible to screen an immunosuppressive agent with few side effects.
The selected immunosuppressive agent may be a single agent or a combination of a plurality of immunosuppressive agents.
By step A, it is possible to search for a drug that minimizes the influence of the immunosuppressive agent on the islet, verify the concentration and combination, and select an optimal immunosuppressive agent to be used for islet transplantation.
工程Ｃは、免疫抑制剤に接触した膵島の状態を評価する工程である。工程Ｃにおける評価方法としては、免疫抑制剤の有する副作用を評価できる工程であれば特に限定されない。工程Ｃにおける免疫抑制剤に接触した膵島の状態とは、インシュリンｍＲＮＡの転写阻害等、膵島の機能低下の状態が挙げられる。 Step C is a step of evaluating the state of the islets in contact with the immunosuppressant. The evaluation method in step C is not particularly limited as long as it is a step capable of evaluating side effects of the immunosuppressive agent. The state of the islet in contact with the immunosuppressive agent in Step C includes a state of reduced function of the islet, such as transcription inhibition of insulin mRNA.
前記工程Ｃは、免疫抑制剤に接触した内因性及び／又は外因性Ｐｄｘ１遺伝子、及び／又はインシュリン遺伝子のプロモーターのメチル化の割合を指標に膵島の状態を評価する工程Ｃ１を有することが好ましい。
遺伝子の転写制御は、プロモーター領域のメチル化と関連している。エピジェネティックな遺伝子解析は、膵島の短時間の培養のみで、長期の膵島の挙動を捕らえることができるため、短時間培養という時間的限界を補うことができる。
The step C preferably includes a step C1 of evaluating the state of the islets using the ratio of methylation of the endogenous and / or exogenous Pdx1 gene and / or insulin gene promoter in contact with the immunosuppressant as an index.
Transcriptional regulation of genes is associated with promoter region methylation. Epigenetic gene analysis can capture long-term islet behavior only by short-term culture of islets, and thus can compensate for the time limit of short-time culture.
工程Ｃ１において、後述するＰｄｘ１遺伝子のプロモーターとその下流に蛍光タンパク質をコードする遺伝子を有する導入遺伝子断片が導入された膵島を用いずともよい。工程Ｃ１は、移植に用いられるヒト由来の膵島や移植を受ける患者のｉＰＳ細胞を分化してなる膵島の状態を評価するのに適している。
なお、膵島移植は、膵島から分泌されるインシュリンにより、糖尿病患者の血糖値をコントロールする治療法であり、工程Ｃ１において、インシュリン遺伝子のプロモーターのメチル化の割合を指標に、膵島の状態を評価すると、膵島が適切にインシュリンを産生しているか否かを評価できるため、特に好ましい。
また、工程Ｃ１において、Ｐｄｘ１遺伝子のプロモーターとその下流に蛍光タンパク質をコードする遺伝子を有する導入遺伝子断片が導入された膵島を用いる場合には、さらに内因性及び／又は外因性遺伝子のプロモーターのメチル化の割合を指標に、膵島の状態を評価することが好ましい。
また、工程Ｃ１において、移植に用いられるヒト由来の膵島や移植を受ける患者のｉＰＳ細胞を分化してなる膵島を用いる場合には、さらに内因性Ｐｄｘ１遺伝子のプロモーターのメチル化の割合を指標に、膵島の状態を評価することが好ましい。
In step C1, it is not necessary to use an islet in which a promoter of a Pdx1 gene described later and a transgene fragment having a gene encoding a fluorescent protein downstream thereof are introduced. Step C1 is suitable for evaluating the state of islets formed by differentiating human-derived islets used for transplantation and iPS cells of patients undergoing transplantation.
The islet transplantation is a treatment method for controlling the blood glucose level of a diabetic patient with insulin secreted from the islet. In step C1, the state of the islet is evaluated using the ratio of insulin gene promoter methylation as an index. It is particularly preferable because it is possible to evaluate whether or not the islets appropriately produce insulin.
Further, in the case of using a pancreatic islet into which a transgene fragment having a Pdx1 gene promoter and a gene encoding a fluorescent protein is introduced downstream in the step C1, methylation of the endogenous and / or exogenous gene promoter is further performed. It is preferable to evaluate the state of islets using the ratio of
Further, in step C1, when using islets derived from humans used for transplantation or pancreatic islets obtained by differentiating iPS cells of patients undergoing transplantation, the ratio of endogenous Pdx1 gene promoter methylation is used as an index. It is preferable to evaluate the state of the islets.
工程Ｃ１におけるメチル化測定方法としては、特に限定されず、ＣＯＢＲＡ（ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ）、定量的ＤＮＡメチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ，ｑ−ＭＳＰ）、重亜硫酸シークエンシング（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、パイロシークエンシング（ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）、ＤＮＡメチル化解析（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ａｒｒａｙ）等が挙げられる。 The method for measuring methylation in step C1 is not particularly limited, and COBRA (combined bisulfite restriction analysis), quantitative DNA methylation-specific polymerase chain reaction, sulfuric acid quenching, Examples thereof include bisulfite sequencing, pyrosequencing, next-generation sequencing (NGS), and DNA methylation analysis.
上述したように、工程Ｃ１によれば、短時間の培養のみで長期の膵島の挙動を捕らえることができる。 As described above, according to the step C1, long-term pancreatic islet behavior can be captured only by short-time culture.
また、前記工程Ｃは、免疫抑制剤に接触した外因性Ｐｄｘ１遺伝子のプロモーターの転写活性を蛍光タンパク質の発する蛍光の強度を指標に膵島の状態を評価する工程Ｃ２を有することが好ましい。
上述したように、前記蛍光タンパク質の発する蛍光の強度の低下は、インシュリンｍＲＮＡの転写阻害を反映している。さらに、蛍光強度の測定は、細胞を固定する必要がないため、工程Ｃ２によれば、免疫抑制剤に接触した膵島の状態を生細胞の状態でｒｅａｌ−ｔｉｍｅに測定できる。工程Ｃ２は、迅速性、簡便性、再現性等の観点から優れている。
ｔｒａｃｅｒのない膵島で同様に行う場合、腺房細胞、膵管細胞の混入は避けられず、正確性を欠いてしまう。さらには膵島を確認するためには染色の行程が必要で、毎回、膵島を固定するなど、煩雑であるうえ、生細胞の状態での測定は不可能である。
In addition, the step C preferably includes a step C2 of evaluating the state of the pancreatic islets using the transcriptional activity of the promoter of the exogenous Pdx1 gene in contact with the immunosuppressant as an indicator of the intensity of fluorescence emitted by the fluorescent protein.
As described above, the decrease in the intensity of fluorescence emitted from the fluorescent protein reflects the transcriptional inhibition of insulin mRNA. Furthermore, since the measurement of the fluorescence intensity does not require the cells to be fixed, according to Step C2, the state of the islet in contact with the immunosuppressive agent can be measured in real-time in the state of living cells. The process C2 is excellent from the viewpoints of quickness, simplicity, reproducibility, and the like.
When the same is performed on a pancreatic islet without a tracer, contamination of acinar cells and pancreatic duct cells is unavoidable and lacks accuracy. Furthermore, in order to confirm the islets, a staining process is necessary, and it is troublesome to fix the islets every time, and measurement in the state of living cells is impossible.
＜免疫抑制剤評価キット＞
本実施形態の免疫抑制剤評価キットは、分子内に疎水性部分と親水性部分とを有し、低温でゾル状態、高温でゲル状態となる熱可逆的なゾル−ゲル転移を示す温度感応性ハイドロゲルを備えたものであり、具体的には、上述した＜免疫抑制剤の評価方法＞で、膵島の生体類似三次元培養に用いられる試薬を含むものが挙げられる。
本実施形態の免疫抑制剤評価キットは、培養対象が、移植に用いられるヒト由来の膵島や移植を受ける患者のｉＰＳ細胞を分化してなる膵島の場合には、メチル化測定キットを備えていることが好ましい。また、短時間の培養のみで、長期の膵島の挙動を捕捉するという観点からも、メチル化測定キットを備えていることが好ましい。
<Immunosuppressant evaluation kit>
The immunosuppressive agent evaluation kit of this embodiment has a hydrophobic part and a hydrophilic part in the molecule, and exhibits a thermosensitive reversible sol-gel transition that takes a sol state at a low temperature and a gel state at a high temperature. Specific examples include hydrogels, and specifically, the above-mentioned <Method for evaluating immunosuppressive agent> containing a reagent used for living body-like three-dimensional culture of pancreatic islets.
The immunosuppressive agent evaluation kit of this embodiment includes a methylation measurement kit when the culture subject is a human-derived islet used for transplantation or an islet obtained by differentiating iPS cells of a patient undergoing transplantation. It is preferable. Moreover, it is preferable to provide the methylation measurement kit also from a viewpoint of capturing the behavior of long-term islets only by culturing for a short time.
また、簡便にかつ客観的に免疫抑制剤の膵島への影響を評価する観点から、本実施形態の免疫抑制剤評価キットは、Ｐｄｘ１遺伝子のプロモーターとその下流に蛍光タンパク質をコードする遺伝子を有する導入遺伝子断片が導入されてなるトランスジェニック非ヒト動物由来の膵島を備えたものであることが好ましい。臨床試験での実績があるという観点から、トランスジェニック非ヒト動物の宿主動物は、ブタであることが好ましい。
このように、本実施形態の免疫抑制剤の評価方法に必要な試薬等をキット化することにより、免疫抑制剤の評価をより簡便にかつ客観的に行うことができる。
In addition, from the viewpoint of simply and objectively evaluating the effect of an immunosuppressive agent on pancreatic islets, the immunosuppressive agent evaluation kit of this embodiment is an introduction having a promoter of a Pdx1 gene and a gene encoding a fluorescent protein downstream thereof. A pancreatic islet derived from a transgenic non-human animal into which a gene fragment has been introduced is preferred. From the viewpoint of having a track record in clinical trials, it is preferable that the host animal of the transgenic non-human animal is a pig.
In this way, by preparing a kit necessary for the immunosuppressive agent evaluation method of the present embodiment, the immunosuppressive agent can be evaluated more simply and objectively.
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Next, although an Example is shown and this invention is demonstrated further in detail, this invention is not limited to a following example.
[Ｐｄｘ−１−Ｖｅｎｕｓ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃブタの作製]
ｍｏｕｓｅ ｍＰｄｘ１ ｇｅｎｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ、Ｖｅｎｕｓ ｃＤＮＡ、及びｐｏｌｙ ａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｇａｎａｌを有するｒａｂｂｉｔ β−グロブリン 遺伝子配列を備えた導入遺伝子断片を作製した（配列番号１参照。）。導入遺伝子断片を用いて、特開２００８-１５４５２０号公報に記載の方法にて、Ｐｄｘ−１−Ｖｅｎｕｓ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃブタを作製した。
[Preparation of Pdx-1-Venus transgenic pig]
A transgene fragment having a rabbit β-globulin gene sequence having a mouse mPdx1 gene promoter, a Venus cDNA, and a polyadenylation signal was prepared (see SEQ ID NO: 1). Using the transgene fragment, a Pdx-1-Venus transgenic pig was produced by the method described in JP-A-2008-154520.
[Ｐｄｘ−１−Ｖｅｎｕｓ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃブタからの膵島の単離]
上述した方法で作製したｔｒａｎｓｇｅｎｉｃブタから膵島を以下の方法で単離した。ブタの生体内をヘパリン化後、ＥＴ−Ｋｙｏｔｏ液を大動脈からかん流、十二指腸、膵臓を摘出した。十二指腸を切離し、膵臓をトリミング後、膵管よりコラゲナーゼを注入した。
膵臓をＬｉｂｅｒａｓｅ ＤＬ （Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）含有溶液を用いて膨張させ、Ｒｅｃｏｒｄｉ ｃｈａｍｂｅｒを用いて、３７℃で消化した。消化プロセスを目視で確認しながら、適宜ジチゾン染色を行い、膵島に付着する細胞が最も適切に分離された時点で、１０％ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ、２５ｍｍ ＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍＬ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、及び１００ｍｇ／ｍＬ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを含有した冷却したＨａｎｋ’ｓ ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ）を加えて、消化反応を停止させた。膵島は、それぞれ、１．１１０ｇ／ｍＬ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ社製）、１．０８４ｇ／ｍＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）、１．０７７ｇ／ｍＬ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ社製）の密度を有する不連続Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配遠心法により精製された。遠心分離後、ＲＰＭＩと１．０７７の界面から膵島を回収した。回収した膵島は、ハンドピックアップにより精製した。
単離した膵島を１０％非働化ブタ血清（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、及び１００ｕｎｉｔ／ｍＬ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−１００μｇ／ｍＬ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ含有ＣＭＲＬ１０６６培地（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）で３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で１晩培養した。ジチゾン染色の結果から、精製した膵島の純度は９５％以上であった。
[Isolation of islets from Pdx-1-Venus transgenic pigs]
Islets were isolated from the transgenic pigs produced by the method described above by the following method. After heparinization in the living body of the pig, the ET-Kyoto solution was perfused from the aorta, and the duodenum and pancreas were removed. The duodenum was excised, the pancreas was trimmed, and collagenase was injected from the pancreatic duct.
The pancreas was expanded using a solution containing Liberase DL (Roche Diagnostics), and digested at 37 ° C. using a Recordi chamber. While confirming the digestion process visually, appropriate dithizone staining was performed, and when the cells attached to the islets were most appropriately separated, 10% fetal bovine serum, 25 mm HEPES, 100 U / mL penicillin, and 100 mg / mL streptomycin were added. The contained chilled Hank's balanced salt solution (HBSS) was added to stop the digestion reaction. The islets were analyzed by discontinuous Ficoll density gradient centrifugation with densities of 1.110 g / mL (Biochrom), 1.084 g / mL (GE Healthcare), and 1.077 g / mL (Biochrom), respectively. Purified. After centrifugation, the islets were collected from the RPMI / 1.077 interface. The collected islets were purified by hand pickup.
The isolated islets were cultured overnight at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator with 10% inactivated porcine serum (Life Technologies) and 100 unit / mL penicillin-100 μg / mL streptomycin-containing CMRL 1066 medium (Corning). did. From the results of dithizone staining, the purity of the purified islets was 95% or more.
[ＦＫ５０６の調製]
０．０１μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬのＦＫ５０６（分子量８０４；タクロリムス、フジマイシン、プログラフトとしても知られている。；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を０．１％エタノールに溶解した。１００μｇ／ｍＬのＦＫ５０６を１％エタノールに溶解した。
[Preparation of FK506]
0.01 μg / mL to 100 μg / mL FK506 (molecular weight 804; also known as tacrolimus, Fujimycin, prograft; Sigma-Aldrich) was dissolved in 0.1% ethanol. 100 μg / mL FK506 was dissolved in 1% ethanol.
[ＴＧＰ含有培地の調製]
凍結乾燥した温度感応性ハイドロゲル（以下、ＴＧＰともいう。メビオール社製）を４℃２４時間混和しながら、１０％非働化ブタ血清、及び１００ｕｎｉｔ／ｍＬ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−１００μｇ／ｍＬ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ含有ＣＭＲＬ１０６６培地に溶解した。ＴＧＰの終濃度を８重量％に合わせた。
冷却したＴＧＰ含有培地を９６ウェルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）の各ウェルに５０μＬずつ添加した。次いで、単離した膵島１個ずつをＴＧＰ含有培地に埋め込み、プレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ中で３０分インキュベートし、ＴＧＰ含有培地をゲル化させた。
次いで、ＦＫ５０６含有培地５０μＬを各ウェルに加え、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ中で培養した。膵島をＦＫ５０６含有培地で培養した後、細胞の蛍光強度を３日おきに評価した。評価の際、ＦＫ５０６の１濃度当たり、８個の膵島を用いた。未処理群をコントロールとした。
[Preparation of TGP-containing medium]
Lyophilized temperature-sensitive hydrogel (hereinafter also referred to as TGP; manufactured by Meviol) dissolved in CMRL1066 medium containing 10% inactivated porcine serum and 100 unit / mL penicillin-100 μg / mL streptomycin when mixed at 4 ° C. for 24 hours. did. The final concentration of TGP was adjusted to 8% by weight.
50 μL of the cooled TGP-containing medium was added to each well of a 96-well plate (manufactured by Becton Dickinson). Then, each isolated islet was embedded in a TGP-containing medium, and the plate was incubated in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator for 30 minutes to allow the TGP-containing medium to gel.
Next, 50 μL of medium containing FK506 was added to each well and cultured in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator. After the islets were cultured in a medium containing FK506, the fluorescence intensity of the cells was evaluated every 3 days. In the evaluation, 8 islets were used per concentration of FK506. The untreated group was used as a control.
[Ｐｄｘ１−Ｖｅｎｕｓの蛍光強度及び細胞生存率の測定]
ＦＫ５０６含有培地で培養中の膵島Ｐｄｘ１の転写活性を測定した。詳細には、４９０ｎｍの波長におけるＶｅｎｕｓの吸光度をマルチモードプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて測定した。各ウェルの吸光度は、８連で測定した。結果を図１に示す。
また、膵島の生存率を評価するために、膵島をＰｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）で染色し、ＣＣＤカメラ付きの位相差顕微鏡（オリンパス社製）で、Ｖｅｎｕｓの緑色発光及びＰＩ染色像を観察した。結果を図２に示す。
[Measurement of fluorescence intensity and cell viability of Pdx1-Venus]
The transcriptional activity of islet Pdx1 during culture in a medium containing FK506 was measured. Specifically, the absorbance of Venus at a wavelength of 490 nm was measured using a multimode plate reader (Perkin-Elmer). The absorbance of each well was measured in 8 replicates. The results are shown in FIG.
In addition, in order to evaluate the survival rate of islets, the islets were stained with Propium iodide (Molecular Probes), and the Venus green light emission and PI stained images were observed with a phase contrast microscope with a CCD camera (Olympus). did. The results are shown in FIG.
図１に示すように、培養１２日後までどの処理群においてもＰｄｘ１−Ｖｅｎｕｓの蛍光強度は上昇し、以後蛍光強度は減少していた。培養３０日後、４５日後において、ＦＫ５０６処理群は、未処理群と比較して蛍光強度の減少の度合いが高かった。
これらのことから、ＦＫ５０６処理群においては、Ｐｄｘ１遺伝子のプロモーターの転写活性が抑制されていること、即ち、膵臓特異的に働くＰｄｘ１遺伝子のプロモーターに制御されている遺伝子群の発現が抑制されることが確認された。
また、図２に示すように、ＦＫ５０６処理群及び未処理群のどちらにおいてもＰＩ染色の度合いに差がみられなったことことから、細胞死が転写活性に影響を与えていないことが確認された。
As shown in FIG. 1, the fluorescence intensity of Pdx1-Venus increased in all treatment groups until 12 days after culturing, and thereafter the fluorescence intensity decreased. After 30 days and 45 days of culture, the FK506-treated group had a higher degree of decrease in fluorescence intensity than the untreated group.
Therefore, in the FK506 treatment group, the transcriptional activity of the promoter of the Pdx1 gene is suppressed, that is, the expression of the gene group controlled by the promoter of the Pdx1 gene that works specifically in the pancreas is suppressed. Was confirmed.
In addition, as shown in FIG. 2, since there was no difference in the degree of PI staining in both the FK506 treated group and the untreated group, it was confirmed that cell death did not affect transcriptional activity. It was.
[Ｐｄｘ１遺伝子のプロモーターのメチル化解析]
各膵島のゲノムＤＮＡの抽出と亜硫酸水素ナトリウム反応は、ＥＺ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−Ｄｉｒｅｃｔ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いて行った。亜硫酸水素ナトリウムで処理されたＤＮＡを、ＢｉｏＴａｑ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼにより増幅させた。増幅に用いたプライマーは、以下の通りである。
インシュリン用プライマー
Ｉｎｓ−Ｂｉｓ−Ｆ：５’−ＴＴＴＧＧＧＡＴＴＡＧＴＴＧＴＧＴＴＴＴＴＡＧＧＴＴＡ−３’
Ｉｎｓ−Ｂｉｓ−Ｒ：５’−ＡＴＴＡＡＴＣＡＣＴＴＴＴＡＣＣＡＡＴＴＴＣＣＴＣＣＴ−３’
Ｐｄｘ１−ｖｅｎｕｓ ｐｒｏｍｏｔｅｒ用プライマー
ｍＰｄｘ１−Ｂｉｓ−Ｆ：５’−ＧＡＡＧＧＡＡＧＡＧＡＧＧＡＧＧＴＡＧＧＧＴＡＴ−３’
ｍＰｄｘ１−Ｂｉｓ−Ｒ：５’−ＡＡＡＣＣＡＡＡＡＴＣＡＡＣＣＣＡＡＣＴＴＴＴ−３’
ＰＣＲは、９５℃１０分；９５℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃１分を４０サイクル；７２℃２分のプログラムで行った。ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ Ｔ−Ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に組み込んだ後、シークエンシングを行い、Ｐｄｘ１遺伝子とインシュリン遺伝子のプロモーター領域のメチル化解析を行った。
[Pdx1 gene promoter methylation analysis]
Extraction of genomic DNA from each islet and sodium bisulfite reaction were performed using EZ DNA Methylation-Direct Kit (manufactured by Zymo Research). DNA treated with sodium bisulfite was amplified with BioTaq HS DNA polymerase. The primers used for amplification are as follows.
Primer for insulin Ins-Bis-F: 5'-TTTGGGATTTAGTTTGGTTTTTTAGGTTA-3 '
Ins-Bis-R: 5′-ATTAATCACTTTTACCAATTTCCTCCT-3 ′
Primer for Pdx1-venus promoter mPdx1-Bis-F: 5′-GAAGGAAGAGAGGAGGTAGGGTAT-3 ′
mPdx1-Bis-R: 5′-AAACCAAAATCAACCCAACTTTT-3 ′
PCR was performed with a program of 95 ° C. for 10 minutes; 95 ° C. for 30 seconds, 60 ° C. for 30 seconds, 72 ° C. for 1 minute for 40 cycles; 72 ° C. for 2 minutes. The PCR product was incorporated into pGEM T-Easy vector (Promega), followed by sequencing, and methylation analysis of the promoter regions of Pdx1 gene and insulin gene.
[Ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓｉ（ＣＯＢＲＡ）ａｓｓａｙ]
ＣＯＢＲＡ ａｓｓａｙによるＤＮＡメチル化解析は、ブタ肝臓で低メチル化状態にあるｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ１(ＩＧＦＢＰ１)、(ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｂｆａｍｉｌｙ １, ｇｒｏｕｐ Ｈ, ｍｅｍｂｅｒ ３(Ｎｒ１ｈ３)遺伝子に注目した従来法に基づいて行った（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ. １９９７ Ｊｕｎ １５;２５（１２）:２５３２−４.参照）。上記特異的プライマーを用いて遺伝子増幅した後、増幅産物をＨｐｙＣＨ４ＩＶ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ社製）で３７℃３時間消化、又はＴａｑＩ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ社製）で６５℃３時間消化した。次いで、消化物を電気泳動により解析した。
ＤＮＡのメチル化の割合は、以下の式を用いて計算された。
見積もられるメチル化の割合（％）＝１００×ＩＣ／（ＩＣ＋ＩＵＣ）
ここで、ＩＣ及びＩＵＣは、それぞれ、消化されたバンド及び消化されなかったバンドの強度を示す。バンド強度は、ＩｍａｇｅＪソフトウエアを用いて決定した(http://rsb.info.nih.gov/ij/参照)。結果を図３に示す。
図３に示すように、ＦＫ５０６処理群においては、インシュリン遺伝子のプロモーター領域のメチル化が促進されていた一方、未処理群においては、インシュリン遺伝子のプロモーター領域のメチル化が促進されていなかったことから、ＦＫ５０６処理群においては、メチル化を介してインシュリン遺伝子のプロモーター領域の転写活性が抑制されていることが確認された。
[Combined Bisulfite Restriction Analysis (COBRA) assay]
DNA methylation analysis by COBRA assay was performed on the basis of insulin-like growth factor binding protein 1 (IGFBP1) and (nuclear receptor subfamily 1, group 3 H1 (See Nucleic Acids Res. 1997 Jun 15; 25 (12): 2532-4.) After gene amplification using the above-mentioned specific primers, the amplified product was subjected to HpyCH4IV (manufactured by New England BioLabs) at 37 ° C. Digested for 3 hours, or digested with TaqI (manufactured by Takara Bio) for 3 hours at 65 ° C. The digest was then analyzed by electrophoresis.
The percentage of DNA methylation was calculated using the following formula:
Estimated percentage of methylation (%) = 100 × I C / (I C + I UC )
Here, I C and I UC indicate the intensity of the digested band and the non-digested band, respectively. Band intensity was determined using ImageJ software (see http://rsb.info.nih.gov/ij/). The results are shown in FIG.
As shown in FIG. 3, methylation of the promoter region of the insulin gene was promoted in the FK506 treated group, whereas methylation of the promoter region of the insulin gene was not promoted in the untreated group. In the FK506 treatment group, it was confirmed that the transcriptional activity of the promoter region of the insulin gene was suppressed through methylation.
以上、本発明によれば、免疫抑制剤の膵島への影響を客観的に評価でき、副作用の低減に寄与できることが明らかである。 As described above, according to the present invention, it is clear that the influence of the immunosuppressive agent on the islets can be objectively evaluated and can contribute to the reduction of side effects.
Claims (10)
免疫抑制剤を培地に添加する工程Ｂと、
免疫抑制剤に接触した膵島の状態を評価する工程Ｃと、
を有することを特徴とする免疫抑制剤の評価方法。 Contains a temperature-sensitive hydrogel that has a hydrophobic part and a hydrophilic part in its molecule and has a thermo-reversible sol-gel transition that becomes a sol state at a low temperature and a gel state at a high temperature. Culturing in a culture medium to be
Adding an immunosuppressive agent to the medium, B;
Step C for assessing the state of the islets in contact with the immunosuppressant;
The evaluation method of the immunosuppressive agent characterized by having.
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Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0489000A (en) * | 1990-05-02 | 1992-03-23 | W R Grace & Co | Cell cultivation kit and cell damage testing method |
| JP2004154136A (en) * | 2002-10-18 | 2004-06-03 | Sankyo Co Ltd | METHOD FOR EVALUATING beta CELL DYSFUNCTION IMPROVING AGENT |
| JP2008154520A (en) * | 2006-12-25 | 2008-07-10 | Meiji Univ | Transgenic non-human animal expressing fluorescent protein |
| JP2012516685A (en) * | 2009-02-03 | 2012-07-26 | コーニンクレッカ ネザーランド アカデミー ヴァン ウェテンシャッペン | Culture medium for epithelial stem cells and organoids containing the stem cells |
| WO2014017513A1 (en) * | 2012-07-24 | 2014-01-30 | 日産化学工業株式会社 | Culture medium composition, and method for culturing cell or tissue using said composition |
-
2014
- 2014-02-17 JP JP2014027655A patent/JP2015149949A/en active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0489000A (en) * | 1990-05-02 | 1992-03-23 | W R Grace & Co | Cell cultivation kit and cell damage testing method |
| JP2004154136A (en) * | 2002-10-18 | 2004-06-03 | Sankyo Co Ltd | METHOD FOR EVALUATING beta CELL DYSFUNCTION IMPROVING AGENT |
| JP2008154520A (en) * | 2006-12-25 | 2008-07-10 | Meiji Univ | Transgenic non-human animal expressing fluorescent protein |
| JP2012516685A (en) * | 2009-02-03 | 2012-07-26 | コーニンクレッカ ネザーランド アカデミー ヴァン ウェテンシャッペン | Culture medium for epithelial stem cells and organoids containing the stem cells |
| WO2014017513A1 (en) * | 2012-07-24 | 2014-01-30 | 日産化学工業株式会社 | Culture medium composition, and method for culturing cell or tissue using said composition |
Non-Patent Citations (7)
| Title |
|---|
| CELL TRANSPLANTATION, 2009, VOL.18, PP.833-845, JPN6018000011, ISSN: 0003841037 * |
| DIABETOLOGIA, 2011, VOL.54, PP.360-367, JPN6018000017, ISSN: 0003841041 * |
| DIABETOLOGIA, 2013, VOL.56, SUPPL.1, S147-S148, 344, JPN6018000021, ISSN: 0003841043 * |
| MOL. ENDOVRINOL., 2012, VOL.26, NO.7, PP.1203-1212, JPN6018000019, ISSN: 0003841042 * |
| PLOS ONE, 2009, VOL.4, NO.9, E6953, JPN6018000016, ISSN: 0003841040 * |
| 日本油化学会誌, 2000, VOL.49, NO.10, PP.1071-1280,1295, JPN6018000013, ISSN: 0003841038 * |
| 高分子化学, 1957, VOL.14, NO.141, PP.41-48, JPN6018000015, ISSN: 0003841039 * |
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