JP2015109806A

JP2015109806A - Method for detecting new ret fused body

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Publication number: JP2015109806A
Application number: JP2012065436A
Authority: JP
Inventors: 鈴木　淳; Atsushi Suzuki; 淳鈴木; 和久角山; Kazuhisa Tsunoyama; 真浅海; Makoto Asaumi
Original assignee: Astellas Pharma Inc
Current assignee: Astellas Pharma Inc
Priority date: 2012-03-22
Filing date: 2012-03-22
Publication date: 2015-06-18
Also published as: WO2013141266A1

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To clarify a polynucleotide that is a new causative gene for cancer to thereby provide a method for detecting the polynucleotide or a polypeptide encoded thereby and a kit and a primer set for the detection method.SOLUTION: Based on a finding that a fused gene consisting of a part of PIBF1 gene and a part of RET gene, the fused gene existing in some cancer patients, is a causative gene for cancer, a method for detecting a polynucleotide that is the gene and a polypeptide encoded thereby has been constructed. According to this detection method, a fused gene consisting of a part of PIBF1 gene and a part of RET gene or a fused protein encoded thereby is detected. The primer set or detection kit contains a sense primer that is designed on the basis of the part encoding PIBF1 gene and an antisense primer that is designed on the basis of the part encoding RET gene.

Description

本発明は、ＲＥＴキナーゼ領域を含む新規の融合遺伝子または各融合遺伝子によってコードされる融合タンパク質の検出方法に関する。 The present invention relates to a novel fusion gene containing a RET kinase region or a method for detecting a fusion protein encoded by each fusion gene.

レアレンジドデュアリングトランスフォーメーション（ｒｅａｒｒａｎｇｅｄｄｕｒｉｎｇｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ；ＲＥＴ）遺伝子は染色体１０番長腕のセントロメア付近に存在し、２１個のエキソンからなる。コードする蛋白質は受容体型チロシンキナーゼであり、中央部に細胞膜貫通領域を有し、そのカルボキシル末端側にチロシンキナーゼ領域、アミノ末端側に細胞外領域を有する。カルボキシル末端のスプライシングの違いにより１０７２アミノ酸（ＲＥＴ９）、１１０６アミノ酸（ＲＥＴ４３）、１１１４アミノ酸（ＲＥＴ５１）の３種類の蛋白質が存在することが知られている（非特許文献１）。ＲＥＴはリガンド／ＧＦＲ複合体を介して二量体を形成することで自己のチロシンをリン酸化し活性化する（非特許文献１）。
甲状腺乳頭癌において、ＲＥＴ遺伝子が染色体内逆位もしくは染色体間転座により他の遺伝子（Ｈ４、ＥＬＥ１など）と融合し、癌化能を持った融合型チロシンキナーゼＲＥＴ／ＰＴＣが発現していることが報告されている（非特許文献２）。これらの融合はＲＥＴのチロシンキナーゼ領域のアミノ末端側で生じており、ＲＥＴは細胞外領域及び細胞膜貫通領域を失い、融合パートナーとの融合蛋白質を形成している。融合パートナー分子の多くは複合体形成ドメインを有していることから、融合体自身も複合体を形成していると考えられており、この複合体形成がＲＥＴのチロシンキナーゼ活性の恒常的な自己リン酸化を引き起こし、細胞内シグナルが異常に活性化され癌化及び細胞増殖を惹き起こしていると考えられている（非特許文献２）。実際に、ＲＥＴ／ＰＴＣ融合遺伝子をマウス正常細胞ＮＩＨ３Ｔ３細胞に導入すると癌細胞様に形質転換すること、さらにはＲＥＴキナーゼ抑制化合物がＲＥＴ／ＰＴＣ融合遺伝子を発現した甲状腺癌細胞株の細胞増殖を抑制できることから、ＲＥＴ／ＰＴＣ融合体が甲状腺癌の治療標的分子となる可能性が示唆されている（非特許文献３−５）。これまでに１０種類以上のＲＥＴ／ＰＴＣ融合遺伝子が甲状腺癌において存在する事が報告されている。また、非小細胞肺癌患者において、ＫＩＦ５Ｂ遺伝子とＲＥＴ遺伝子が融合した遺伝子が発現しているとの報告がある（特許文献１）。
プロゲステロンイムノモジュレーターバインディングファクター１（ＰｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅＩｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｂｉｎｄｉｎｇｆａｃｔｏｒ１）遺伝子は染色体１３番長腕に存在し１８個のエクソンからなる。ＰＩＢＦ１は妊娠初期トロホブラスト細胞の浸潤に関わることが知られている（非特許文献６）。
これまでにＰＩＢＦ１とＲＥＴが融合しているという報告はなされていない。 The rearranged during transformation (RET) gene is present in the vicinity of the centromere of the 10th long arm of chromosome and consists of 21 exons. The encoded protein is a receptor tyrosine kinase, which has a transmembrane region at the center, a tyrosine kinase region on the carboxyl terminal side, and an extracellular region on the amino terminal side. It is known that there are three types of proteins of 1072 amino acids (RET9), 1106 amino acids (RET43), and 1114 amino acids (RET51) due to differences in splicing at the carboxyl terminal (Non-patent Document 1). RET phosphorylates and activates its own tyrosine by forming a dimer via a ligand / GFR complex (Non-patent Document 1).
In papillary thyroid cancer, the RET gene is fused with other genes (H4, ELE1, etc.) by intrachromosomal inversion or interchromosomal translocation, and the fusion tyrosine kinase RET / PTC having canceration ability is expressed. Has been reported (Non-Patent Document 2). These fusions occur at the amino terminal side of the tyrosine kinase region of RET, and RET loses the extracellular region and the transmembrane region, and forms a fusion protein with the fusion partner. Since many fusion partner molecules have a complex-forming domain, it is considered that the fusion itself also forms a complex, and this complex formation is a constant self of RET tyrosine kinase activity. It is considered that phosphorylation is caused and intracellular signals are abnormally activated to cause canceration and cell proliferation (Non-patent Document 2). In fact, when a RET / PTC fusion gene is introduced into a mouse normal cell NIH3T3 cell, it is transformed into a cancer cell-like, and further, a RET kinase inhibitor compound suppresses cell growth of a thyroid cancer cell line expressing the RET / PTC fusion gene. From this, it has been suggested that the RET / PTC fusion may be a therapeutic target molecule for thyroid cancer (Non-patent Documents 3-5). To date, it has been reported that more than 10 types of RET / PTC fusion genes exist in thyroid cancer. In addition, there is a report that a gene in which a KIF5B gene and a RET gene are fused is expressed in a non-small cell lung cancer patient (Patent Document 1).
The progesterone immunomodulator binding factor 1 gene is present in the long arm of chromosome 13 and consists of 18 exons. PIBF1 is known to be involved in infiltration of trophoblast cells in early pregnancy (Non-patent Document 6).
So far, there has been no report that PIBF1 and RET are fused.

ＷＯ２０１２/０１４７９５WO2012 / 014795

「トレンド・イン・ジェネティクス（TRENDS in Genetics），（（英国），２００６年，２２巻，ｐ．６２７−６３６）」"TRENDS in Genetics, ((UK), 2006, Vol. 22, pp. 627-636)" 「ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・エンドクリノロジー（European journal of endoclinology），（（英国），２００６年，１５５巻，ｐ．６４５−６５３）“European journal of endoclinology, ((UK), 2006, 155, pp. 645-653). 「キャンサー・リサーチ（CANCER RESEARCH），（（米国），２００２年，６２巻，ｐ．７２８４−７２９０）」"CANCER RESEARCH, ((USA), 2002, 62, p. 7284-7290)" 「ジャーナル・オブ・クリニカル・エンドクリノロジー・アンド・メタボリズム（The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism），（（米国），２００６年，９１巻，ｐ．４０７０−４０７６）」"The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, ((USA), 2006, Vol. 91, p. 4070-4076)" 「ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY），（（米国），２００７年，２８２巻，ｐ．２９２３０−２９３４０）」“THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, ((USA), 2007, Vol.282, p. 29230-29340)” 「ジャーナル・オブ・リプロダクティブイムノロジ―（Journal of Reproductive Immunology）（（アイルランド）, ２０１１年、９０巻、ｐ．５０−５７）」“Journal of Reproductive Immunology (Ireland), 2011, 90, p. 50-57”

癌の新たな原因遺伝子であるポリヌクレオチドを解明し、これにより、当該ポリヌクレオチド又はそれがコードするポリペプチドの検出方法、およびそのためのキット又はプライマーセットを提供することを課題とする。 It is an object of the present invention to elucidate a polynucleotide that is a new causative gene of cancer, thereby providing a method for detecting the polynucleotide or a polypeptide encoded by the polynucleotide, and a kit or primer set therefor.

本発明は、肺癌患者から得た検体からＰＩＢＦ１遺伝子の一部と、キナーゼであるＲＥＴ遺伝子の一部とが融合した新規の融合遺伝子を単離同定し（実施例１）、これらの融合遺伝子が肺癌患者検体に存在すること（実施例２及び３）、またこれらの融合遺伝子を発現させるためレトロウイルスを作成し（実施例４）、感染細胞が腫瘍形成能を有し、癌の原因遺伝子であることを見出した（実施例５及び６）。本発明者は、これらの知見から、これらの融合遺伝子の検出法を構築し（実施例２及び３）、そのためのキットおよびプライマーセットを提供し、これらの融合遺伝子またはそれにコードされる融合タンパク質を検出することにより、ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ阻害剤治療の対象となる癌患者を選別することを可能とした。 The present invention isolates and identifies a novel fusion gene in which a part of the PIBF1 gene and a part of the RET gene that is a kinase are fused from a specimen obtained from a lung cancer patient (Example 1). Exist in lung cancer patient specimens (Examples 2 and 3), and create retroviruses to express these fusion genes (Example 4). Infected cells have tumorigenicity and are cancer causative genes. It was found (Examples 5 and 6). Based on these findings, the present inventor constructed a detection method for these fusion genes (Examples 2 and 3), provided a kit and a primer set therefor, and used these fusion genes or fusion proteins encoded thereby. By detecting, it was possible to select cancer patients to be treated with PIBF1-RET inhibitor treatment.

すなわち、本発明は、以下の［１］〜［７］に関する。
［１］被験者から得た試料中の、下記（１）〜（３）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又は該ポリペプチドの存在を検出する工程を含むことを特徴とする、プロゲステロンイムノモジュレーターバインディングファクター１（ＰｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅＩｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｂｉｎｄｉｎｇｆａｃｔｏｒ１）遺伝子とリアレンジドデュアリングトランスフォーメーション（ｒｅａｒｒａｎｇｅｄｄｕｒｉｎｇｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ；ＲＥＴ）遺伝子との融合遺伝子又は該融合遺伝子によってコードされる融合蛋白質の検出方法：
（１）配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１若しくは配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１若しくは配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（２）配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１若しくは配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３で表されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、あるいは、
（３）配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１若しくは配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
［２］前記ポリペプチドが、下記（１）〜（３）に記載のポリペプチドである［１］に記載の検出方法：
（１）配列番号２若しくは配列番号４で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２若しくは配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（２）配列番号２若しくは配列番号４で表されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、あるいは、
（３）配列番号２若しくは配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
［３］下記（１）〜（３）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、ＰＩＢＦ１遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合遺伝子の検出用キット：
（１）配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１若しくは配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１若しくは配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（２）配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１若しくは配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３で表されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、あるいは、
（３）配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１若しくは配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
［４］前記ポリペプチドが、下記（１）〜（３）に記載のポリペプチドである［３］に記載の検出用キット：
（１）配列番号２若しくは配列番号４で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２若しくは配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（２）ポリペプチド配列番号２若しくは配列番号４で表されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、あるいは、
（３）配列番号２若しくは配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
［５］ＰＩＢＦ１遺伝子をコードする部分から設計されるセンスプライマー及びＲＥＴ遺伝子をコードする部分から設計されるアンチセンスプライマーを含む、ＰＩＢＦ１遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、「１」又は［２］に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット。
［６］配列番号１の塩基番号１から１８３３間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号１の塩基番号１８３４から２９１６間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。
［７］配列番号３の塩基番号１から２０４９間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号３の塩基番号２０５０から３１３２間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。 That is, the present invention relates to the following [1] to [7].
[1] A progesterone immunomodulator comprising a step of detecting the presence of the polynucleotide encoding the polypeptide of the following (1) to (3) or the polypeptide in a sample obtained from a subject. A detection method for a fusion gene of a binding factor 1 (Progesterone Immunomodulator binding factor 1) gene and a rearranged during transformation (RET) gene or a fusion protein encoded by the fusion gene:
(1) A polypeptide comprising the amino acid sequence represented by amino acid numbers 78 to 911 of SEQ ID NO: 2 or amino acid numbers 78 to 983 of SEQ ID NO: 4 and having tumorigenicity, or amino acid numbers 78 to 911 or an amino acid sequence represented by amino acid numbers 78 to 983 of SEQ ID NO: 4, comprising an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids are deleted, substituted, and / or inserted, and having a tumorigenic ability ,
(2) a polymorphism comprising an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence represented by amino acid numbers 78 to 911 of SEQ ID NO: 2 or amino acid numbers 78 to 983 of SEQ ID NO: 4 and having tumorigenic potential Peptide, or
(3) A polypeptide comprising an amino acid sequence represented by amino acid numbers 78 to 911 of SEQ ID NO: 2 or amino acid numbers 78 to 983 of SEQ ID NO: 4.
[2] The detection method according to [1], wherein the polypeptide is a polypeptide according to the following (1) to (3):
(1) A polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 and having tumorigenicity, or 1 to 10 amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 A polypeptide comprising an amino acid sequence in which an amino acid is deleted, substituted, and / or inserted, and having tumorigenic potential,
(2) a polypeptide comprising an amino acid sequence having an identity of 90% or more with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 and having tumorigenicity, or
(3) A polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4.
[3] A fusion gene of a PIBF1 gene and a RET gene, comprising a sense primer and an antisense primer designed to specifically amplify a polynucleotide encoding the polypeptide described in (1) to (3) below Detection kit:
(1) A polypeptide comprising the amino acid sequence represented by amino acid numbers 78 to 911 of SEQ ID NO: 2 or amino acid numbers 78 to 983 of SEQ ID NO: 4 and having tumorigenicity, or amino acid numbers 78 to 911 or an amino acid sequence represented by amino acid numbers 78 to 983 of SEQ ID NO: 4, comprising an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids are deleted, substituted, and / or inserted, and having a tumorigenic ability ,
(2) a polymorphism comprising an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence represented by amino acid numbers 78 to 911 of SEQ ID NO: 2 or amino acid numbers 78 to 983 of SEQ ID NO: 4 and having tumorigenic potential Peptide, or
(3) A polypeptide comprising an amino acid sequence represented by amino acid numbers 78 to 911 of SEQ ID NO: 2 or amino acid numbers 78 to 983 of SEQ ID NO: 4.
[4] The detection kit according to [3], wherein the polypeptide is a polypeptide according to the following (1) to (3):
(1) A polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 and having tumorigenicity, or 1 to 10 amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 A polypeptide comprising an amino acid sequence in which an amino acid is deleted, substituted, and / or inserted, and having tumorigenic potential,
(2) a polypeptide comprising an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence represented by polypeptide SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 and having tumorigenicity, or
(3) A polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4.
[5] A primer set for detecting a fusion gene of a PIBF1 gene and a RET gene, including a sense primer designed from a portion encoding the PIBF1 gene and an antisense primer designed from a portion encoding the RET gene. An antisense primer comprising a nucleic acid molecule that hybridizes under stringent conditions to the polynucleotide encoding the polypeptide according to “1” or [2], and hybridizes under stringent conditions to the complementary strand of the polynucleotide. A primer set including a sense primer composed of a nucleic acid molecule that soybeans.
[6] A sense primer consisting of an arbitrary continuous at least 16 base oligonucleotide between base numbers 1 to 1833 of SEQ ID NO: 1 and an arbitrary continuous at least 16 base oligonucleotide between base numbers 1834 to 2916 of SEQ ID NO: 1 A primer set of antisense primers consisting of oligonucleotides that are complementary to.
[7] A sense primer composed of an arbitrary continuous at least 16 base oligonucleotide between base numbers 1 to 2049 of SEQ ID NO: 3 and an arbitrary continuous at least 16 base oligonucleotide between base numbers 2050 to 3132 of SEQ ID NO: 3 A primer set of antisense primers consisting of oligonucleotides that are complementary to.

また、本発明は、
下記（１）〜（３）に記載のポリペプチド（以下、「本発明のポリペプチド」と略すこともある）又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（以下、「本発明のポリヌクレオチド」と略すこともある）：
（１）配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１（好ましくは配列番号２）若しくは配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３（好ましくは配列番号４）に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（２）配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１（好ましくは配列番号２）若しくは配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３（好ましくは配列番号４）に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１（好ましくは配列番号２）、配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３（好ましくは配列番号４）に示されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、あるいは、
（３）配列番号２若しくは配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
に関する。また、本発明は、
下記工程を含むことを特徴とするＲＥＴキナーゼ領域を含む融合遺伝子陽性の癌（特には肺癌又は甲状腺癌）の存在の検出方法；
被験者から得た試料中の、下記（１）乃至（３）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在を検出する工程、
（１）配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１（好ましくは配列番号２）若しくは配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３（好ましくは配列番号４）で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１（好ましくは配列番号２）若しくは配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３（好ましくは配列番号４）で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（２）配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１（好ましくは配列番号２）若しくは配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３（好ましくは配列番号４）で表されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、あるいは、
（３）配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１（好ましくは配列番号２）若しくは配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３（好ましくは配列番号４）で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
に関する。
また、本発明は、
下記工程を含むことを特徴とするＰＩＢＦ１遺伝子とＲＥＴ遺伝子とを含む融合遺伝子陽性の癌（特には肺癌又は甲状腺癌）の診断方法：
被験者から得た試料中の、下記（１）〜（３）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在を検出する工程、
（１）配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１（好ましくは配列番号２）若しくは配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３（好ましくは配列番号４）に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（２）配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１（好ましくは配列番号２）若しくは配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３（好ましくは配列番号４）に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１（好ましくは配列番号２）、配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３（好ましくは配列番号４）に示されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、あるいは、
（３）配列番号２若しくは配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
に関する。 The present invention also provides:
The polypeptide of the following (1) to (3) (hereinafter sometimes abbreviated as “polypeptide of the present invention”) or a polynucleotide encoding the polypeptide (hereinafter abbreviated as “polynucleotide of the present invention”) Sometimes):
(1) The identity with the amino acid sequence shown by amino acid number 78-911 (preferably sequence number 2) of sequence number 2 or amino acid number 78-983 (preferably sequence number 4) of sequence number 4 is 90% or more A polypeptide comprising an amino acid sequence and having tumorigenicity,
(2) It includes the amino acid sequence of amino acid numbers 78 to 911 (preferably SEQ ID NO: 2) of SEQ ID NO: 2 or amino acid numbers 78 to 983 of SEQ ID NO: 4 (preferably SEQ ID NO: 4) and has tumorigenicity 1-10 amino acids in the polypeptide or the amino acid sequence shown in amino acid Nos. 78 to 911 (preferably SEQ ID No. 2) of SEQ ID No. 2 and amino acid Nos. 78 to 983 of SEQ ID No. 4 (preferably SEQ ID No. 4) A polypeptide comprising an amino acid sequence in which an amino acid has been deleted, substituted, and / or inserted, and having tumorigenic potential, or
(3) a polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4,
About. The present invention also provides:
A method for detecting the presence of a fusion gene positive cancer (particularly lung cancer or thyroid cancer) comprising a RET kinase region, characterized by comprising the following steps:
A step of detecting the presence of a polynucleotide encoding the polypeptide according to the following (1) to (3) in a sample obtained from a subject;
(1) comprising an amino acid sequence represented by amino acid numbers 78 to 911 (preferably SEQ ID NO: 2) of SEQ ID NO: 2 or amino acid numbers 78 to 983 (preferably SEQ ID NO: 4) of SEQ ID NO: 4 and having tumorigenicity Or an amino acid sequence represented by amino acid numbers 78 to 911 (preferably SEQ ID NO: 2) of SEQ ID NO: 2 or amino acid numbers 78 to 983 of SEQ ID NO: 4 (preferably SEQ ID NO: 4) A polypeptide comprising an amino acid sequence in which one amino acid has been deleted, substituted, and / or inserted, and having tumorigenic potential,
(2) 90% or more identity with the amino acid sequence represented by amino acid numbers 78 to 911 (preferably SEQ ID NO: 2) of SEQ ID NO: 2 or amino acid numbers 78 to 983 (preferably SEQ ID NO: 4) of SEQ ID NO: 4 A polypeptide having an amino acid sequence which is and having tumorigenicity, or
(3) a polypeptide comprising an amino acid sequence represented by amino acid numbers 78 to 911 (preferably SEQ ID NO: 2) of SEQ ID NO: 2 or amino acid numbers 78 to 983 (preferably SEQ ID NO: 4) of SEQ ID NO: 4,
About.
The present invention also provides:
A method for diagnosing a fusion gene positive cancer (particularly lung cancer or thyroid cancer) comprising a PIBF1 gene and a RET gene, comprising the following steps:
Detecting the presence of a polynucleotide encoding the polypeptide according to the following (1) to (3) in a sample obtained from a subject;
(1) The identity with the amino acid sequence shown by amino acid number 78-911 (preferably sequence number 2) of sequence number 2 or amino acid number 78-983 (preferably sequence number 4) of sequence number 4 is 90% or more A polypeptide comprising an amino acid sequence and having tumorigenicity,
(2) It includes the amino acid sequence of amino acid numbers 78 to 911 (preferably SEQ ID NO: 2) of SEQ ID NO: 2 or amino acid numbers 78 to 983 of SEQ ID NO: 4 (preferably SEQ ID NO: 4) and has tumorigenicity 1-10 amino acids in the polypeptide or the amino acid sequence shown in amino acid Nos. 78 to 911 (preferably SEQ ID No. 2) of SEQ ID No. 2 and amino acid Nos. 78 to 983 of SEQ ID No. 4 (preferably SEQ ID No. 4) A polypeptide comprising an amino acid sequence in which an amino acid has been deleted, substituted, and / or inserted, and having tumorigenic potential, or
(3) a polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4,
About.

また、本発明は、
下記工程を含むことを特徴とする癌（特には肺癌又は甲状腺癌）の存在の検出方法：
（１）被験者から得た試料を鋳型とし、前記［５］〜［７］に記載されたプライマーセットを用いてＰＣＲを行う工程、及び
（２）ＰＣＲ産物の存在を検出する工程、
に関する。 The present invention also provides:
A method for detecting the presence of cancer (particularly lung cancer or thyroid cancer) characterized by comprising the following steps:
(1) using a sample obtained from a subject as a template, performing PCR using the primer set described in [5] to [7], and (2) detecting the presence of a PCR product,
About.

また、本発明は、
下記工程を含むことを特徴とする癌（特には肺癌又は甲状腺癌）の診断方法：
（１）被験者から得た試料を鋳型とし、前記［５］〜［７］に記載されたプライマーセットを用いてＰＣＲを行う工程、及び
（２）ＰＣＲ産物の存在を検出する工程、
に関する。また、更に、上記方法により癌（特には肺癌又は甲状腺癌）を有すると診断された患者に対して、本発明のポリペプチドを抑制する物質（好ましくはＰＩＢＦ１−ＲＥＴ阻害剤）を投与することを含む方法に関する。 The present invention also provides:
A method for diagnosing cancer (particularly lung cancer or thyroid cancer) comprising the following steps:
(1) using a sample obtained from a subject as a template, performing PCR using the primer set described in [5] to [7], and (2) detecting the presence of a PCR product,
About. Furthermore, a substance (preferably a PIBF1-RET inhibitor) that suppresses the polypeptide of the present invention is administered to a patient diagnosed as having cancer (particularly lung cancer or thyroid cancer) by the above method. Relates to a method of including

また、本発明は、
下記工程を含むことを特徴とする、染色体の再構成（genomic rearrangement）を検出する方法：
被験者から得た試料中の、下記（１）〜（３）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在を検出する工程、
（１）配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１（好ましくは配列番号２）若しくは配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３（好ましくは配列番号４）に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（２）配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１（好ましくは配列番号２）若しくは配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３（好ましくは配列番号４）に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１（好ましくは配列番号２）若しくは配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３（好ましくは配列番号４）に示されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、あるいは、
（３）配列番号２若しくは配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
に関する。 The present invention also provides:
A method of detecting chromosomal rearrangement comprising the following steps:
Detecting the presence of a polynucleotide encoding the polypeptide according to the following (1) to (3) in a sample obtained from a subject;
(1) The identity with the amino acid sequence shown by amino acid number 78-911 (preferably sequence number 2) of sequence number 2 or amino acid number 78-983 (preferably sequence number 4) of sequence number 4 is 90% or more A polypeptide comprising an amino acid sequence and having tumorigenicity,
(2) It includes the amino acid sequence of amino acid numbers 78 to 911 (preferably SEQ ID NO: 2) of SEQ ID NO: 2 or amino acid numbers 78 to 983 of SEQ ID NO: 4 (preferably SEQ ID NO: 4) and has tumorigenicity In the polypeptide or the amino acid sequence shown in amino acid number 78 to 911 (preferably SEQ ID NO: 2) of SEQ ID NO: 2 or amino acid number 78 to 983 of SEQ ID NO: 4 (preferably SEQ ID NO: 4), 1 to 10 A polypeptide comprising an amino acid sequence in which an amino acid has been deleted, substituted, and / or inserted, and having tumorigenic potential, or
(3) a polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4,
About.

さらに、本発明は、
下記工程を含むことを特徴とする、染色体の再構成（genomic rearrangement）を検出する方法：
（１）ｉ）被験者から得た試料、ii）ＰＩＢＦ１遺伝子をコードする５’側ゲノム領域を含む標識プローブ、及びiii）ＲＥＴ遺伝子をコードする３’ゲノム領域を含む蛍光標識プローブを用い、インサイチュハイブリダイゼーションを行う工程、及び
（２）前記標識のシグナルの重なりを検出する工程、
に関する。 Furthermore, the present invention provides
A method of detecting chromosomal rearrangement comprising the following steps:
(1) i) a sample obtained from a subject, ii) a labeled probe containing a 5 ′ genomic region encoding the PIBF1 gene, and iii) a fluorescent labeled probe containing a 3 ′ genomic region encoding the RET gene A step of performing hybridization, and (2) a step of detecting an overlap of signals of the label,
About.

また、本発明は、
下記工程を含むことを特徴とする癌（特には肺癌又は甲状腺癌）の存在の検出方法：
（１）ｉ）被験者から得た試料、ii）ＰＩＢＦ１遺伝子をコードする５’側ゲノム領域を含む標識プローブ、及びiii）ＲＥＴ遺伝子をコードする３’ゲノム領域を含む蛍光標識プローブを用い、インサイチュハイブリダイゼーションを行う工程、及び
（２）前記標識のシグナルの重なりを検出する工程、
に関する。 The present invention also provides:
A method for detecting the presence of cancer (particularly lung cancer or thyroid cancer) characterized by comprising the following steps:
(1) i) a sample obtained from a subject, ii) a labeled probe containing a 5 ′ genomic region encoding the PIBF1 gene, and iii) a fluorescent labeled probe containing a 3 ′ genomic region encoding the RET gene A step of performing hybridization, and (2) a step of detecting an overlap of signals of the label,
About.

また、本発明は、
下記工程を含むことを特徴とする癌（特には肺癌又は甲状腺癌）の診断方法：
（１）ｉ）被験者から得た試料、ii）ＰＩＢＦ１遺伝子をコードする５’側ゲノム領域を含む標識プローブ、及びiii）ＲＥＴ遺伝子をコードする３’ゲノム領域を含む蛍光標識プローブを用い、インサイチュハイブリダイゼーションを行う工程、及び
（２）前記標識のシグナルの重なりを検出する工程、
に関する。また、上記方法の更なる工程として、上記方法により癌（特には肺癌又は甲状腺癌）を有すると診断された患者に対して、本発明のポリペプチドを抑制する物質（好ましくはＰＩＢＦ１−ＲＥＴ阻害剤）を投与する工程を含んでもよい。
また、別の態様として、本発明は、上記の診断方法により癌（特には肺癌又は甲状腺癌）陽性と診断された患者に対してＰＩＢＦ１−ＲＥＴ阻害剤を投与することを含む癌（特には肺癌又は甲状腺癌）の治療方法、に関する。 The present invention also provides:
A method for diagnosing cancer (particularly lung cancer or thyroid cancer) comprising the following steps:
(1) i) a sample obtained from a subject, ii) a labeled probe containing a 5 ′ genomic region encoding the PIBF1 gene, and iii) a fluorescent labeled probe containing a 3 ′ genomic region encoding the RET gene A step of performing hybridization, and (2) a step of detecting an overlap of signals of the label,
About. Further, as a further step of the above method, a substance (preferably a PIBF1-RET inhibitor) that suppresses the polypeptide of the present invention for a patient diagnosed as having cancer (particularly lung cancer or thyroid cancer) by the above method. ) May be included.
As another aspect, the present invention relates to cancer (especially lung cancer) comprising administering a PIBF1-RET inhibitor to a patient diagnosed as positive for cancer (particularly lung cancer or thyroid cancer) by the above diagnostic method. Or thyroid cancer).

また、本発明は、被験者から得た試料中の、下記（１）〜（３）に記載のポリペプチドの存在を検出する工程を含むことを特徴とする、ＰＩＢＦ１とＲＥＴとの融合タンパク質の検出方法：
（１）配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１（好ましくは配列番号２）若しくは配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３（好ましくは配列番号４）に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（２）配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１（好ましくは配列番号２）若しくは配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３（好ましくは配列番号４）に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１（好ましくは配列番号２）、配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３（好ましくは配列番号４）に示されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、あるいは、
（３）配列番号２若しくは配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
に関する。 The present invention also includes detection of a fusion protein of PIBF1 and RET, comprising the step of detecting the presence of the polypeptide described in (1) to (3) below in a sample obtained from a subject: Method:
(1) The identity with the amino acid sequence shown by amino acid number 78-911 (preferably sequence number 2) of sequence number 2 or amino acid number 78-983 (preferably sequence number 4) of sequence number 4 is 90% or more A polypeptide comprising an amino acid sequence and having tumorigenicity,
(2) It includes the amino acid sequence of amino acid numbers 78 to 911 (preferably SEQ ID NO: 2) of SEQ ID NO: 2 or amino acid numbers 78 to 983 of SEQ ID NO: 4 (preferably SEQ ID NO: 4) and has tumorigenicity 1-10 amino acids in the polypeptide or the amino acid sequence shown in amino acid Nos. 78 to 911 (preferably SEQ ID No. 2) of SEQ ID No. 2 and amino acid Nos. 78 to 983 of SEQ ID No. 4 (preferably SEQ ID No. 4) A polypeptide comprising an amino acid sequence in which an amino acid has been deleted, substituted, and / or inserted, and having tumorigenic potential, or
(3) a polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4,
About.

また、本発明は、
下記工程を含むことを特徴とするＰＩＢＦ１とＲＥＴとの融合タンパク質陽性の癌（特には肺癌又は甲状腺癌）の存在の検出方法：
被験者から得た試料中の、下記（１）〜（３）に記載のポリペプチドの存在を検出する工程、
（１）配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１（好ましくは配列番号２）若しくは配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３（好ましくは配列番号４）に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（２）配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１（好ましくは配列番号２）若しくは配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３（好ましくは配列番号４）に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１（好ましくは配列番号２）、配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３（好ましくは配列番号４）に示されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、あるいは、
（３）配列番号２若しくは配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
に関する。 The present invention also provides:
A method for detecting the presence of a fusion protein-positive cancer (particularly lung cancer or thyroid cancer) of PIBF1 and RET, comprising the following steps:
Detecting the presence of the polypeptide according to the following (1) to (3) in a sample obtained from a subject;
(1) The identity with the amino acid sequence shown by amino acid number 78-911 (preferably sequence number 2) of sequence number 2 or amino acid number 78-983 (preferably sequence number 4) of sequence number 4 is 90% or more A polypeptide comprising an amino acid sequence and having tumorigenicity,
(2) It includes the amino acid sequence of amino acid numbers 78 to 911 (preferably SEQ ID NO: 2) of SEQ ID NO: 2 or amino acid numbers 78 to 983 of SEQ ID NO: 4 (preferably SEQ ID NO: 4) and has tumorigenicity 1-10 amino acids in the polypeptide or the amino acid sequence shown in amino acid Nos. 78 to 911 (preferably SEQ ID No. 2) of SEQ ID No. 2 and amino acid Nos. 78 to 983 of SEQ ID No. 4 (preferably SEQ ID No. 4) A polypeptide comprising an amino acid sequence in which an amino acid has been deleted, substituted, and / or inserted, and having tumorigenic potential, or
(3) a polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4,
About.

また、本発明は、
下記工程を含むことを特徴とするＰＩＢＦ１とＲＥＴとの融合タンパク質陽性の癌（特には肺癌又は甲状腺癌）の診断方法：
被験者から得た試料中の、下記（１）〜（３）に記載のポリペプチドの存在を検出する工程、
（１）配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１（好ましくは配列番号２）若しくは配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３（好ましくは配列番号４）に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（２）配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１（好ましくは配列番号２）若しくは配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３（好ましくは配列番号４）に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１（好ましくは配列番号２）、配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３（好ましくは配列番号４）に示されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、あるいは、
（３）配列番号２若しくは配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
に関する。また、上記方法の更なる工程として、ＰＩＢＦ１とＲＥＴとの融合タンパク質陽性の癌（特には肺癌又は甲状腺癌）を有すると診断された患者に対して、上記（１）〜（３）に記載のポリペプチドを抑制する物質（好ましくはＰＩＢＦ１−ＲＥＴ阻害剤）を投与する工程を含んでもよい。
また、別の態様として、本発明は、上記の診断方法によりＰＩＢＦ１とＲＥＴとの融合タンパク質陽性の癌（特には肺癌又は甲状腺癌）を有すると診断された患者に対して、上記（１）〜（３）に記載のポリペプチドを抑制する物質（好ましくはＰＩＢＦ１−ＲＥＴ阻害剤）を投与することを含む癌（特には肺癌又は甲状腺癌）の治療方法、に関する。 The present invention also provides:
A method for diagnosing a fusion protein-positive cancer (particularly lung cancer or thyroid cancer) of PIBF1 and RET, comprising the following steps:
Detecting the presence of the polypeptide according to the following (1) to (3) in a sample obtained from a subject;
(1) The identity with the amino acid sequence shown by amino acid number 78-911 (preferably sequence number 2) of sequence number 2 or amino acid number 78-983 (preferably sequence number 4) of sequence number 4 is 90% or more A polypeptide comprising an amino acid sequence and having tumorigenicity,
(2) It includes the amino acid sequence of amino acid numbers 78 to 911 (preferably SEQ ID NO: 2) of SEQ ID NO: 2 or amino acid numbers 78 to 983 of SEQ ID NO: 4 (preferably SEQ ID NO: 4) and has tumorigenicity 1-10 amino acids in the polypeptide or the amino acid sequence shown in amino acid Nos. 78 to 911 (preferably SEQ ID No. 2) of SEQ ID No. 2 and amino acid Nos. 78 to 983 of SEQ ID No. 4 (preferably SEQ ID No. 4) A polypeptide comprising an amino acid sequence in which an amino acid has been deleted, substituted, and / or inserted, and having tumorigenic potential, or
(3) a polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4,
About. Further, as a further step of the above method, the method described in (1) to (3) above for a patient diagnosed as having a fusion protein positive cancer (particularly lung cancer or thyroid cancer) of PIBF1 and RET. A step of administering a substance that suppresses the polypeptide (preferably a PIBF1-RET inhibitor) may be included.
As another aspect, the present invention provides the above-mentioned (1) to (1) to a patient diagnosed as having a fusion protein positive cancer (particularly lung cancer or thyroid cancer) of PIBF1 and RET by the diagnostic method. The present invention relates to a method for treating cancer (particularly lung cancer or thyroid cancer) comprising administering a substance that suppresses the polypeptide according to (3) (preferably a PIBF1-RET inhibitor).

本発明の検出方法は、ＰＩＢＦ１遺伝子と、ＲＥＴ遺伝子との融合遺伝子陽性の癌（特には肺癌又は甲状腺癌）を検出する方法として利用できる。また、本発明の検出方法は、染色体の再構成を検出する方法として利用できる。また、本発明の検出方法によれば、本発明のポリペプチドを抑制する物質（好ましくはＰＩＢＦ１−ＲＥＴ阻害剤）の適用対象者であるか否かを鑑別することができ、これにより、本発明のポリペプチドを抑制する物質（好ましくはＰＩＢＦ１−ＲＥＴ阻害剤）による治療の有効性が期待されるテーラーメード医療が実践できる。本発明の検出用キット及びプライマーセットは、本発明の検出方法に用いることができる。 The detection method of the present invention can be used as a method for detecting cancer that is positive for a fusion gene of PIBF1 gene and RET gene (particularly lung cancer or thyroid cancer). In addition, the detection method of the present invention can be used as a method for detecting chromosome rearrangement. In addition, according to the detection method of the present invention, it is possible to distinguish whether or not the subject is a subject of application of a substance that suppresses the polypeptide of the present invention (preferably a PIBF1-RET inhibitor). It is possible to practice tailor-made medicine in which the effectiveness of treatment with a substance (preferably a PIBF1-RET inhibitor) that suppresses the polypeptide is expected. The detection kit and primer set of the present invention can be used in the detection method of the present invention.

《本発明の検出方法》
本発明の検出方法には、（Ｉ）融合遺伝子の検出方法と、（ＩＩ）前記融合遺伝子によってコードされる融合タンパク質の検出方法とが含まれる。 << Detection Method of the Present Invention >>
The detection method of the present invention includes (I) a detection method of a fusion gene and (II) a detection method of a fusion protein encoded by the fusion gene.

（Ｉ）融合遺伝子の検出方法
本発明における融合遺伝子の検出方法は、被験者から得た試料中の、本明細書のポリヌクレオチドの存在を検出する工程を含む。 (I) Method for detecting fusion gene The method for detecting a fusion gene in the present invention includes a step of detecting the presence of the polynucleotide of the present specification in a sample obtained from a subject.

被験者から得た試料としては、被験者からの採取物（生体から分離した試料）、具体的には、任意の採取された体液（好ましくは血液）、肺胞・気管支洗浄液、生検された試料、喀痰試料を用いるが、好適には、被験者の肺患部の生検試料又は喀痰試料を用いる。試料からゲノムＤＮＡを抽出して用いることができ、またその転写産物（ゲノムが転写及び翻訳される結果生じる産物；例えばｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、蛋白質）を用いることができる。特にはｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを調製して用いることが好ましい。 Samples obtained from the subject include samples collected from the subject (samples separated from the living body), specifically, any collected body fluid (preferably blood), alveolar / bronchial lavage fluid, biopsy sample, A sputum sample is used, but preferably a biopsy sample or sputum sample of the affected lung of the subject is used. Genomic DNA can be extracted from the sample and used, and its transcription product (product resulting from transcription and translation of the genome; for example, mRNA, cDNA, protein) can be used. In particular, it is preferable to prepare and use mRNA or cDNA.

融合遺伝子の検出方法における「本明細書のポリヌクレオチドの存在を検出する工程」において、その検出対象となる本明細書のポリヌクレオチド（以下、「検出対象ポリヌクレオチド」と称する）は、「ＰＩＢＦ１遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合遺伝子」であり、これはＰＩＢＦ１の一部とＲＥＴキナーゼ領域を含むＲＥＴの一部との融合タンパク質であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのことをいう。検出対象ポリヌクレオチドである「ＰＩＢＦ１遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合遺伝子」としては、ＰＩＢＦ１の機能ドメインの一つであるコイルド−コイルドメインとＲＥＴの機能ドメインの一つであるキナーゼドメインを有する融合遺伝子があげられる。 In the “detecting the presence of the polynucleotide of the present specification” in the detection method of the fusion gene, the polynucleotide of the present specification to be detected (hereinafter referred to as “the polynucleotide to be detected”) is the “PIBF1 gene” And a RET gene ", which refers to a polynucleotide encoding a polypeptide that is a fusion protein of a part of PIBF1 and a part of RET including the RET kinase region. The detection target polynucleotide "PIBF1 gene and RET gene fusion gene" includes a fusion gene having a coiled-coil domain that is one of the functional domains of PIBF1 and a kinase domain that is one of the functional domains of RET. can give.

癌を引き起こす融合遺伝子としてＰＴＣ−ＲＥＴ（Ｃｌｉｎ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．２００９；７１１９−７１２３）、ＫＩＦ５Ｂ−ＡＬＫ（Ｃｌｉｎ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．２００９；３１４３−３１４９）、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ（Ｎａｔｕｒｅｍｅｄｉｃｉｎｅ２０１２；３７５−３７７）、ＥＭＬ４‐ＡＬＫ（Ｎａｔｕｒｅ２００７；５６１−５６６）などが知られており、これらの融合遺伝子はＮ末端側にコイルド−コイルドメインを持つ遺伝子とC末端側にリガンド結合部位を欠損したキナーゼが結合した融合遺伝子であり、３Ｔ３細胞に強制的に発現させると形質転換を引き起こすことが知られている。例えば、リガンド結合部位を有さないＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合遺伝子を発現させた３Ｔ３細胞は、リガンド非依存的にＲＥＴキナーゼ活性化に重要である９０５番目のチロシン自己リン酸化が引き起こされ活性化される。この自己リン酸化は、ＲＥＴ阻害剤であるＶａｎｄｅｔａｎｉｂにより抑制され細胞死を引き起こすことが知られている（Ｎａｔｕｒｅｍｅｄｉｃｉｎｅ２０１２；３７５−３７７）。また、同様にリガンド結合部位を有さないＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子を内在的に発現している細胞株でもＡＬＫのキナーゼ活性に重要である１６０４番目のリン酸化が引き起こされており、ＡＬＫに阻害活性をもつＴＡＥ６８４によりリン酸化が抑制され増殖が抑制されることが知られている（Ｃｌｉｎ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．２００８；４２７５−４２８３）。さらに、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子を発現している肺癌患者に対し、ＡＬＫキナーゼ阻害剤であるＣｒｉｚｏｔｉｎｉｂが有効な治療薬であることが示唆されている（ＤｒｕｇＤｅｓ．Ｄｅｖｅｌ．Ｔｈｅｒ．２０１１；４７１−４８５）。これらの融合遺伝子の活性化機構として、コイルド−コイルドメインを介したホモ二量体化により、融合しているキナーゼドメインのリガンド非依存的な恒常的活性化が引き起こされることが示唆されている。さらには、このように活性化された融合遺伝子は融合しているキナーゼの阻害剤を使用することにより、融合遺伝子の機能を阻害することができることが示唆される。 PTC-RET (Clin. Cancer Res. 2009; 7119-7123), KIF5B-ALK (Clin. Cancer Res. 2009; 3143-3149), KIF5B-RET (Nature medicine 2012; 375-377) , EML4-ALK (Nature 2007; 561-566), etc. are known, and in these fusion genes, a gene having a coiled-coil domain on the N-terminal side and a kinase lacking a ligand binding site on the C-terminal side are bound. It is a fusion gene and is known to cause transformation when forcedly expressed in 3T3 cells. For example, 3T3 cells expressing a KIF5B-RET fusion gene without a ligand binding site are activated by causing 905th tyrosine autophosphorylation that is important for RET kinase activation in a ligand-independent manner. This autophosphorylation is known to be suppressed by the RET inhibitor Vandetanib and cause cell death (Nature medicine 2012; 375-377). Similarly, in cell lines that endogenously express the EML4-ALK fusion gene without a ligand binding site, phosphorylation of 1604, which is important for the kinase activity of ALK, has been induced, and ALK has an inhibitory activity. It is known that phosphorylation is suppressed and proliferation is suppressed by TAE684 having (Clin. Cancer Res. 2008; 4275-4283). Furthermore, it has been suggested that Crizotinib, an ALK kinase inhibitor, is an effective therapeutic agent for lung cancer patients expressing the EML4-ALK fusion gene (Drug Des. Devel. Ther. 2011; 471-485). ). As an activation mechanism of these fusion genes, it has been suggested that homodimerization via a coiled-coil domain causes constitutive activation independent of the fused kinase domain. Furthermore, it is suggested that the fusion gene activated in this way can inhibit the function of the fusion gene by using an inhibitor of the fused kinase.

したがって、当該融合遺伝子についても、ＲＥＴのキナーゼドメインとＰＩＢＦ１のコイルド−コイルドメインを有する融合遺伝子が癌化を引き起こす重要なドメインと予測される。 Therefore, also for the fusion gene, a fusion gene having a kinase domain of RET and a coiled-coil domain of PIBF1 is predicted to be an important domain causing canceration.

そのため前記「検出対象ポリヌクレオチド」としては、例えば、ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ融合遺伝子のうち、ＰＩＢＦ１のコイルド−コイルドメインからＲＥＴのキナーゼドメインに該当する配列である、下記（１）乃至（３）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが好ましい。
（１）配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１若しくは配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１若しくは配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド（以下、機能的等価改変体と称する）、
（２）配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１又は配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３で表されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド（以下、相同ポリペプチドと称する）、並びに、
（３）配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１又は配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３）で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。 Therefore, as the “detection target polynucleotide”, for example, among the PIBF1-RET fusion gene, the sequence corresponding to the kinase domain of RET from the coiled-coil domain of PIBF1 is described in (1) to (3) below: A polynucleotide encoding a polypeptide is preferred.
(1) A polypeptide comprising the amino acid sequence represented by amino acid numbers 78 to 911 of SEQ ID NO: 2 or amino acid numbers 78 to 983 of SEQ ID NO: 4 and having tumorigenicity, or amino acid numbers 78 to 911 or an amino acid sequence represented by amino acid numbers 78 to 983 of SEQ ID NO: 4, comprising an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids are deleted, substituted, and / or inserted, and having a tumorigenic ability (Hereinafter referred to as a functional equivalent variant),
(2) a polymorphism comprising an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence represented by amino acid numbers 78 to 911 of SEQ ID NO: 2 or amino acid numbers 78 to 983 of SEQ ID NO: 4 and having tumorigenic potential A peptide (hereinafter referred to as a homologous polypeptide), and
(3) A polypeptide comprising an amino acid sequence represented by amino acid numbers 78 to 911 of SEQ ID NO: 2 or amino acid numbers 78 to 983 of SEQ ID NO: 4).

好ましい前記「検出対象ポリヌクレオチド」としては、下記（１）乃至（３）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが挙げられる：
（１）配列番号２若しくは配列番号４で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２若しくは配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（２）配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド（以下、相同ポリペプチドと称する）、並びに、
（３）配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。 Preferred examples of the “polynucleotide to be detected” include polynucleotides encoding the polypeptides described in (1) to (3) below:
(1) A polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 and having tumorigenicity, or 1 to 10 amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 A polypeptide comprising an amino acid sequence in which an amino acid is deleted, substituted, and / or inserted, and having tumorigenic potential,
(2) a polypeptide comprising an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 and having tumorigenicity (hereinafter referred to as a homologous polypeptide); ,
(3) A polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4.

配列番号２で表されるアミノ酸配列は、配列番号１で表される塩基配列によりコードされる配列である。配列番号４で表されるアミノ酸配列は、配列番号３で表される塩基配列によりコードされる配列である。配列番号２で表されるアミノ酸からなるポリペプチドである蛋白質を「ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ融合ポリペプチドｖ１」と称し、配列番号４で表されるアミノ酸からなるポリペプチドである蛋白質を「ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ融合ポリペプチドｖ２」と称する。「ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ融合ポリペプチドｖ１」及び「ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ融合ポリペプチドｖ２」を総称して「ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ融合ポリペプチド」と称する。ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ融合ポリペプチドｖ１をコードする遺伝子を「ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ融合ポリヌクレオチドｖ１」と称し、ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ融合ポリペプチドｖ２をコードする遺伝子を「ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ融合ポリヌクレオチドｖ２」と称する。ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ融合ポリペプチドをコードする遺伝子を「ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ融合ポリヌクレオチド」と称する。 The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is a sequence encoded by the base sequence represented by SEQ ID NO: 1. The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 is a sequence encoded by the base sequence represented by SEQ ID NO: 3. A protein which is a polypeptide consisting of the amino acid represented by SEQ ID NO: 2 is referred to as “PIBF1-RET fusion polypeptide v1”, and a protein which is a polypeptide consisting of the amino acid represented by SEQ ID NO: 4 is referred to as “PIBF1-RET fusion polypeptide”. It will be referred to as “peptide v2”. “PIBF1-RET fusion polypeptide v1” and “PIBF1-RET fusion polypeptide v2” are collectively referred to as “PIBF1-RET fusion polypeptide”. The gene encoding PIBF1-RET fusion polypeptide v1 is referred to as “PIBF1-RET fusion polynucleotide v1”, and the gene encoding PIBF1-RET fusion polypeptide v2 is referred to as “PIBF1-RET fusion polynucleotide v2.” A gene encoding a PIBF1-RET fusion polypeptide is referred to as a “PIBF1-RET fusion polynucleotide”.

さらに好ましい前記検出対象ポリヌクレオチドとしては、配列番号１又は配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。 More preferable examples of the polynucleotide to be detected include a polynucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3.

配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、ＰＩＢＦ１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿００６３４６．２）の塩基番号３０６（エキソン２のファーストメチオニンに対応）から２１３８（エキソン１４の３’末端に対応）とＲＥＴ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿０２０６３０．４）の塩基番号２３２７（エキソン１２の５’末端に対応）から３４０９（エキソン１９のストップコドンに対応）までの塩基配列からなるポリヌクレオチドである。配列番号１に示される塩基配列の内、塩基番号１〜１８３３の配列はＰＩＢＦ１遺伝子に由来し、塩基番号１８３４〜２９１６の配列はＲＥＴ遺伝子に由来する。この融合ポリヌクレオチドを、Ｐ１４Ｒ１２又はＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ１とも称する。配列番号１の塩基番号１〜２９１６は、融合タンパク質のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であり、このＯＲＦにコードされるアミノ酸配列を配列番号２に示す。 The polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is from the base number 306 (corresponding to the first methionine of exon 2) to 2138 (corresponding to the 3 'end of exon 14) of the PIBF1 gene (GenBank accession number: NM_006346.2) And the RET gene (GenBank accession number: NM — 0206630.4), a nucleotide sequence from base number 2327 (corresponding to the 5 ′ end of exon 12) to 3409 (corresponding to the stop codon of exon 19). Of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, the sequence of base numbers 1-1833 is derived from the PIBF1 gene, and the sequence of base numbers 1834-2916 is derived from the RET gene. This fusion polynucleotide is also referred to as P14R12 or PIBF1-RET_v1. Base numbers 1 to 2916 of SEQ ID NO: 1 are the open reading frame (ORF) of the fusion protein, and the amino acid sequence encoded by this ORF is shown in SEQ ID NO: 2.

配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、ＰＩＢＦ１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿００６３４６．２）の塩基番号３０６（エキソン２のファーストメチオニンに対応）から２３５４（エキソン１６の３’末端に対応）とＲＥＴ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿０２０６３０．４）の塩基番号２３２７（エキソン１２の５’末端に対応）から３４０９（エキソン１９のストップコドンに対応）までの塩基配列からなるポリヌクレオチドである。配列番号３に示される塩基配列の内、塩基番号１〜２０４９の配列はＰＩＢＦ１遺伝子に由来し、塩基番号２０５０〜３１３２の配列はＲＥＴ遺伝子に由来する。この融合ポリヌクレオチドを、Ｐ１６Ｒ１２又は＿ｖ２とも称する。配列番号３の塩基番号１〜３１３２は、融合タンパク質のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であり、このＯＲＦにコードされるアミノ酸配列を配列番号４に示す。 The polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 is from the base number 306 (corresponding to the first methionine of exon 2) to 2354 (corresponding to the 3 ′ end of exon 16) of the PIBF1 gene (GenBank accession number: NM_006346.2) And the RET gene (GenBank accession number: NM — 0206630.4), a nucleotide sequence from base number 2327 (corresponding to the 5 ′ end of exon 12) to 3409 (corresponding to the stop codon of exon 19). Among the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 3, the sequences of nucleotide numbers 1 to 2049 are derived from the PIBF1 gene, and the sequences of nucleotide numbers 2050 to 3132 are derived from the RET gene. This fusion polynucleotide is also referred to as P16R12 or _v2. Base numbers 1 to 3132 of SEQ ID NO: 3 are the open reading frame (ORF) of the fusion protein, and the amino acid sequence encoded by this ORF is shown in SEQ ID NO: 4.

別の態様における前記検出対象ポリヌクレオチドとしては、配列番号１の塩基番号２３３〜２７３３に対応するＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ１（Ｐ１４Ｒ１２）の部分配列及び配列番号３の塩基番号２３３〜２９４９に対応するＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ２（Ｆ１６Ｒ１２）の部分配列などが挙げられる。 In another embodiment, the polynucleotide to be detected includes a partial sequence of PIBF1-RET_v1 (P14R12) corresponding to base numbers 233 to 2733 of SEQ ID NO: 1 and PIBF1-RET_v2 corresponding to base numbers 233 to 2949 of SEQ ID NO: 3 ( F16R12) and the like.

「機能的等価改変体」としては、「配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１（好ましくは配列番号２）又は配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３（好ましくは配列番号４）で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個、好ましくは１〜数個、更に好ましくは１〜７個、最も好ましくは１〜５個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド」が好ましく、「配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１（好ましくは配列番号２）又は配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３（好ましくは配列番号４）で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド」が特に好ましい。 The “functional equivalent variant” is an amino acid sequence represented by “amino acid numbers 78 to 911 (preferably SEQ ID NO: 2) of SEQ ID NO: 2 or amino acid numbers 78 to 983 (preferably SEQ ID NO: 4) of SEQ ID NO: 4. 1 to 10, preferably 1 to several, more preferably 1 to 7, most preferably 1 to 5 amino acid sequences substituted, deleted and / or inserted, and tumors A polypeptide having the ability to form ", and the amino acid sequence represented by" amino acid numbers 78 to 911 (preferably SEQ ID NO: 2) of SEQ ID NO: 2 or amino acid numbers 78 to 983 (preferably SEQ ID NO: 4) of SEQ ID NO: 4 ". And a polypeptide having tumorigenicity is particularly preferred.

「相同ポリペプチド」は、「配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１（好ましくは配列番号２）又は配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３（好ましくは配列番号４）で表されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド」であるが、該同一性が、好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上であるアミノ酸配列を含むポリペプチドが好ましい。 The “homologous polypeptide” is the same as the amino acid sequence represented by amino acid numbers 78 to 911 (preferably SEQ ID NO: 2) of SEQ ID NO: 2 or amino acid numbers 78 to 983 (preferably SEQ ID NO: 4) of SEQ ID NO: 4. A polypeptide comprising an amino acid sequence having a sexiness of 90% or more and having a tumorigenicity ", wherein the identity is preferably 95% or more, more preferably 98% or more. Is preferred.

なお、本明細書における前記「同一性」とは、ＮＥＥＤＬＥｐｒｏｇｒａｍ（J Mol Biol 1970; 48: 443-453）検索によりデフォルトで用意されているパラメータを用いて得られた値Ｉｄｅｎｔｉｔｙを意味する。前記のパラメータは以下のとおりである。
Ｇａｐｐｅｎａｌｔｙ＝１０
Ｅｘｔｅｎｄｐｅｎａｌｔｙ＝０．５
Ｍａｔｒｉｘ＝ＥＢＬＯＳＵＭ６２ In the present specification, the “identity” means a value Identity obtained by using a parameter prepared as a default by a NEEDLE program (J Mol Biol 1970; 48: 443-453) search. The parameters are as follows:
Gap penalty = 10
Extended penalty = 0.5
Matrix = EBLOSUM62

あるポリペプチドが「腫瘍形成能を有する」ことは、一例として、実施例５および６の方法で確認することが挙げられる。具体的には、当該ポリペプチドを発現するプラスミドを導入した宿主（Ｂａ／Ｆ３細胞）がインターロイキン３非要求性の増殖能の有無を確認すること、または、当該ポリペプチドを発現するプラスミドを導入した宿主（３Ｔ３繊維芽細胞）がスフェロイドプレートを用いた足場非依存的増殖能の有無を確認することで判断する。 An example of confirming that a certain polypeptide has “tumor-forming ability” by the methods of Examples 5 and 6 is mentioned. Specifically, the host (Ba / F3 cell) into which the plasmid that expresses the polypeptide is introduced confirms the presence or absence of interleukin-3 non-requiring growth ability, or a plasmid that expresses the polypeptide is introduced. The host (3T3 fibroblasts) determined is confirmed by confirming the presence or absence of anchorage-independent growth ability using a spheroid plate.

本発明の検出方法における検出対象ポリヌクレオチドとしては、「配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１（好ましくは配列番号２）２又は配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３（好ましくは配列番号４）で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、腫瘍形成能を有するポリペプチド」をコードするポリヌクレオチドが好ましく、「配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１（好ましくは配列番号２）又は配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３（好ましくは配列番号４）で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」をコードするポリヌクレオチドが最も好ましい。 The polynucleotide to be detected in the detection method of the present invention is represented by “amino acid numbers 78 to 911 (preferably SEQ ID NO: 2) 2 of SEQ ID NO: 2 or amino acid numbers 78 to 983 of SEQ ID NO: 4 (preferably SEQ ID NO: 4). A polynucleotide that encodes a “polypeptide having an oncogene-forming amino acid sequence” and encoding a “tumor-forming ability” is preferred. The polynucleotide encoding “polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by ˜983 (preferably SEQ ID NO: 4)” is most preferable.

本発明のポリヌクレオチドの検出方法における「ポリヌクレオチドの存在を検出する工程」は、被験者から得た試料のゲノム中の検出対象ポリヌクレオチド（融合点を含むゲノム配列）の存在を検出すること、あるいは、被験者から得た試料から抽出したゲノムＤＮＡの転写産物（例えばｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ）を調製し、検出対象ポリヌクレオチドに対応するｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの存在を検出することにより実施する。 In the method for detecting a polynucleotide of the present invention, the “step of detecting the presence of a polynucleotide” comprises detecting the presence of a polynucleotide to be detected (genomic sequence including a fusion point) in the genome of a sample obtained from a subject, or This is carried out by preparing a transcript (for example, mRNA or cDNA) of genomic DNA extracted from a sample obtained from a subject and detecting the presence of mRNA or cDNA corresponding to the polynucleotide to be detected.

ゲノムＤＮＡの抽出は公知の方法で行うことができ、市販のＤＮＡ抽出キットを用いて簡便に行うことができる。 Extraction of genomic DNA can be performed by a known method, and can be easily performed using a commercially available DNA extraction kit.

検出工程は公知の遺伝子解析法（例えば遺伝子検出法として常用されるＰＣＲ，ＬＣＲ（Ligase chain reaction）、ＳＤＡ（Strand displacement amplification）、ＮＡＳＢＡ（Nucleic acid sequence-based amplification）、ＩＣＡＮ（Isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids）、ＬＡＭＰ（Loop-mediated isothermal amplification）法、ＴＭＡ法（Gen-Probe’s TMA system）、インサイチュハイブリダイゼーション法、更にマイクロアレイなど周知の方法）に従って実施することができる。例えば、検出対象ポリヌクレオチドにハイブリダイズする核酸をプローブとしたハイブリダイゼーション技術、又は、検出対象ポリヌクレオチドにハイブリダイズするＤＮＡをプライマーとした遺伝子増幅技術等を利用する。 The detection process includes known gene analysis methods (for example, PCR, LCR (Ligase chain reaction), SDA (Strand displacement amplification), NASBA (Nucleic acid sequence-based amplification), ICAN (Isothermal and chimeric primer-), which are commonly used as gene detection methods. Initiated amplification of nucleic acids), LAMP (Loop-mediated isothermal amplification) method, TMA method (Gen-Probe's TMA system), in situ hybridization method, and well-known methods such as microarray). For example, a hybridization technique using a nucleic acid that hybridizes to the detection target polynucleotide as a probe, or a gene amplification technique using a DNA that hybridizes to the detection target polynucleotide as a primer is used.

具体的には、被験者から得た試料由来の核酸、例えばｍＲＮＡ等を用いて測定する。ｍＲＮＡ量の測定は、検出対象ポリヌクレオチド配列を特異的に増幅できるように設計したプライマーを用いて遺伝子増幅反応方法にて測定する。本発明の検出方法に用いられるプライマー、又は、検出用キットに含まれるプライマーは、検出対象ポリヌクレオチド配列を特異的に増幅できるものであれば、特には限定されず、検出対象ポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて設計する。ＰＣＲ増幅モニター法におけるプライマー設計は、プライマー設計ソフトウェア（例えば、Primer Express; PE Biosystems）などを利用してできる。また、ＰＣＲ産物のサイズが大きくなると増幅効率が悪くなるため、センスプライマーとアンチセンスプライマーは、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを対象に増幅したときの増幅産物の大きさが１ｋｂ以下になるように設定するのが適切である。 Specifically, it is measured using a nucleic acid derived from a sample obtained from a subject, such as mRNA. The amount of mRNA is measured by a gene amplification reaction method using primers designed so that the polynucleotide sequence to be detected can be specifically amplified. The primer used in the detection method of the present invention or the primer included in the detection kit is not particularly limited as long as it can specifically amplify the polynucleotide sequence to be detected, and the base sequence of the polynucleotide to be detected Design based on. Primer design in the PCR amplification monitoring method can be performed using primer design software (eg, Primer Express; PE Biosystems). In addition, since the amplification efficiency decreases as the PCR product size increases, the sense primer and the antisense primer should be set so that the size of the amplified product when amplified for mRNA or cDNA is 1 kb or less. Is appropriate.

より具体的には、センスプライマー（５’−プライマー）をＰＩＢＦ１をコードする部分から、アンチセンスプライマー（３’−プライマー）をＲＥＴをコードする部分から設計する。好ましくは、本発明の検出用キットに含まれるプライマーを用い、更に好ましくは、検出用キットに最も好適に含まれるプライマーを用いる。ＰＣＲ増幅モニター法では、各遺伝子に対応した上記センスプライマーを混ぜることにより、１反応液により全ての融合ポリヌクレオチドを検出するマルチプレックスＰＣＲ（Multiplex PCR）を設計することもできる。各増幅技術に適した方法によって目的とした遺伝子（全体又はその特異的部分）が増幅されたか否かを確認することができる。例えば、ＰＣＲ法では、ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって分析し、エチジウムブロマイド染色等によって目的とするサイズの増幅断片が得られたか否かを確認できる。目的とするサイズの増幅断片が得られた場合は、被験者から得た試料において、検出対象ポリヌクレオチドが存在していたことになる。このように、検出対象ポリヌクレオチドの存在を検出することができる。 More specifically, a sense primer (5'-primer) is designed from a portion encoding PIBF1, and an antisense primer (3'-primer) is designed from a portion encoding RET. Preferably, the primer contained in the detection kit of the present invention is used, and more preferably, the primer most suitably contained in the detection kit is used. In the PCR amplification monitoring method, it is possible to design a multiplex PCR that detects all fusion polynucleotides in one reaction solution by mixing the sense primers corresponding to each gene. It can be confirmed whether or not the target gene (whole or a specific portion thereof) has been amplified by a method suitable for each amplification technique. For example, in the PCR method, a PCR product is analyzed by agarose gel electrophoresis, and it can be confirmed whether or not an amplified fragment of a target size is obtained by ethidium bromide staining or the like. When an amplified fragment of the desired size is obtained, the detection target polynucleotide is present in the sample obtained from the subject. Thus, the presence of the polynucleotide to be detected can be detected.

本発明の融合遺伝子の検出方法としては、被験者から得た試料中の、特定のポリヌクレオチドの存在を遺伝子増幅反応により検出する工程に加え、さらに目的とするサイズの増幅断片が得られたか否かを検出する工程を含むことが好ましい。 As a method for detecting a fusion gene of the present invention, in addition to the step of detecting the presence of a specific polynucleotide in a sample obtained from a subject by a gene amplification reaction, whether or not an amplified fragment of a desired size has been obtained. It is preferable to include the process of detecting.

ハイブリダイゼーション技術を利用した検出は、例えば、ノーザンハイブリダイゼーション、ドットブロット法、ＤＮＡマイクロアレイ法、ＲＮＡプロテクション法などを使用して行う。ハイブリダイゼーションに用いるプローブとしては、検出対象ポリヌクレオチド又はそれらの相補鎖にストリンジェントな条件下で（好ましくはよりストリンジェントな条件下で）ハイブリダイズする連続した少なくとも３２塩基の核酸分子であって、融合点を中心にその上流及び下流のそれぞれ１６塩基からなる配列又はそれらの相補鎖を含むプローブを用いることができる。 Detection using a hybridization technique is performed using, for example, Northern hybridization, dot blot method, DNA microarray method, RNA protection method, or the like. The probe used for hybridization is a nucleic acid molecule of at least 32 bases that hybridizes under stringent conditions (preferably under more stringent conditions) to a polynucleotide to be detected or a complementary strand thereof, A probe comprising a sequence consisting of 16 bases each upstream and downstream from the fusion point or a complementary strand thereof can be used.

インサイチュハイブリダイゼーション技術を利用した検出は、公知のFISH法（fusion assay）に従って実施することができる。または、クロモジェニックインサイチュハイブリダイゼーション（CISH）法とシルバーインサイチュハイブリダイゼーション（SISH）法を組み合わせたヒュージョンアッセイで実施することができる。 Detection using an in situ hybridization technique can be performed according to a known FISH method (fusion assay). Alternatively, a fusion assay combining a chromogenic in situ hybridization (CISH) method and a silver in situ hybridization (SISH) method can be performed.

なお、本明細書における融合点とは、ＰＩＢＦ１の各遺伝子由来の部分とＲＥＴ遺伝子由来の部分とが融合した点を意味する。 In addition, the fusion point in this specification means the point which the part derived from each gene of PIBF1, and the part derived from RET gene fused.

また、本明細書における「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーションのための条件として、「５×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、２００μｇ／ｍＬ鮭精子ＤＮＡ、４２℃オーバーナイト」、洗浄のための条件として、「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」の条件である。「よりストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーションのための条件として、「５×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、２００μｇ／ｍＬ鮭精子ＤＮＡ、４２℃オーバーナイト」、洗浄のための条件として、「０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」の条件である。 In addition, the “stringent conditions” in this specification are the conditions for hybridization: “5 × SSPE, 5 × Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 200 μg / mL spermatozoa “DNA, 42 ° C. overnight” and “0.5 × SSC, 0.1% SDS, 42 ° C.” as conditions for washing. “More stringent conditions” means “5 × SSPE, 5 × Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 200 μg / mL sperm DNA, over 42 ° C.” “Night”, the conditions for cleaning are “0.2 × SSC, 0.1% SDS, 65 ° C.”.

さらには、ＲＴ−ＰＣＲ等の遺伝子増幅技術を利用することができる。ＲＴ−ＰＣＲ法においては、遺伝子の増幅過程においてＰＣＲ増幅モニター（リアルタイムＰＣＲ）法（Genome Res., 6(10), 986, 1996）を用いることにより、検出対象ポリヌクレオチドの存在について、より定量的な解析を行うことが可能である。ＰＣＲ増幅モニター法としては、例えば、ＡＢＩＰＲＩＳＭ７９００（ＰＥバイオシステムズ社）を用いることが出来る。リアルタイムＰＣＲは公知の方法であり、そのための装置およびキットは市販されており、これらを利用して簡便に行える。 Furthermore, gene amplification techniques such as RT-PCR can be used. In the RT-PCR method, by using the PCR amplification monitor (real-time PCR) method (Genome Res., 6 (10), 986, 1996) in the gene amplification process, the presence of the polynucleotide to be detected is more quantitatively determined. Analysis is possible. As a PCR amplification monitoring method, for example, ABI PRISM 7900 (PE Biosystems) can be used. Real-time PCR is a known method, and devices and kits for the real-time PCR are commercially available, and can be easily performed using these.

（ＩＩ）前記融合遺伝子によってコードされる融合タンパク質の検出方法
本発明における融合タンパク質の検出方法は、被験者から得た試料における、特定のポリペプチド、すなわち、検出対象ポリヌクレオチドにコードされるポリペプチド（以下、「検出対象ポリペプチド」と称する）の存在を検出する工程を含む。当該検出対象ポリペプチドは、「ＰＩＢＦ１とＲＥＴとの融合タンパク質」である。 (II) Method for detecting a fusion protein encoded by the fusion gene The method for detecting a fusion protein in the present invention is a method for detecting a specific polypeptide in a sample obtained from a subject, that is, a polypeptide encoded by a polynucleotide to be detected ( Hereinafter, a step of detecting the presence of “polypeptide to be detected”) is included. The polypeptide to be detected is “a fusion protein of PIBF1 and RET”.

このような検出する工程は、被験者から得た試料（例えば、被験者から得た癌組織や細胞）由来の可溶化液を調製し、その中に含まれる検出対象ポリペプチドを、ＰＩＢＦ１に対する抗体と、抗ＲＥＴ抗体とを組み合わせることによる免疫学的測定法又は酵素活性測定法等により実施できる。好適には、検出対象ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を用いた、酵素免疫測定法、２抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法、ウェスタンブロッティング法等の手法を用いることができる。 In such a detecting step, a solubilized solution derived from a sample obtained from a subject (for example, cancer tissue or cells obtained from the subject) is prepared, and the detection target polypeptide contained therein is an antibody against PIBF1, It can be carried out by an immunological measurement method or an enzyme activity measurement method by combining with an anti-RET antibody. Preferably, techniques such as an enzyme immunoassay, a two-antibody sandwich ELISA, a fluorescence immunoassay, a radioimmunoassay, and a Western blotting method using a monoclonal antibody or a polyclonal antibody specific for the polypeptide to be detected are used. be able to.

本発明の検出方法における検出対象ポリヌクレオチド又は検出対象ポリペプチドが、被験者から得た試料から検出された場合は、当該被験者は、当該ポリヌクレオチド陽性の癌を有する対象（患者）であり、本発明のポリヌクレオチドを抑制する物質（好ましくはＰＩＢＦ１−ＲＥＴ阻害剤）による治療の適用対象となる。検出又は診断の対象としては、癌であれば特に制限はないが、特には肺癌又は甲状腺癌などであり、より好ましくは肺癌であり、更に好ましくは細気管支肺細胞癌治療剤である。 When the detection target polynucleotide or detection target polypeptide in the detection method of the present invention is detected from a sample obtained from a subject, the subject is a subject (patient) having the polynucleotide-positive cancer, and the present invention This is a target for treatment with a substance that suppresses the polynucleotide (preferably a PIBF1-RET inhibitor). The target of detection or diagnosis is not particularly limited as long as it is cancer, but is particularly lung cancer or thyroid cancer, more preferably lung cancer, and still more preferably a bronchiolopulmonary cell cancer therapeutic agent.

《本発明の検出用キット、本発明のプライマーセット》
本発明の検出用キットには、少なくとも、本発明の検出方法における検出対象ポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したセンス及びアンチセンスプライマーが含まれる。センス及びアンチセンスプライマーセットは、検出対象ポリヌクレオチド増幅用のプライマーとして機能するポリヌクレオチドのセットである。 << Detection Kit of the Present Invention, Primer Set of the Present Invention >>
The detection kit of the present invention includes at least sense and antisense primers designed to specifically amplify the polynucleotide to be detected in the detection method of the present invention. The sense and antisense primer set is a set of polynucleotides that function as primers for amplification of the polynucleotide to be detected.

「ＰＩＢＦ１遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合遺伝子」とは、ＰＩＢＦ１遺伝子の一部とＲＥＴ遺伝子の一部とが融合した遺伝子のことをいう。 The “fusion gene of PIBF1 gene and RET gene” refers to a gene in which a part of the PIBF1 gene and a part of the RET gene are fused.

本発明のプライマーセットには、
（１）ＰＩＢＦ１をコードする部分から設計されるセンスプライマー及びＲＥＴをコードする部分から設計されるアンチセンスプライマーを含む、ＰＩＢＦ１遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、アンチセンスプライマーは「検出対象ポリヌクレオチド」にストリンジェントな条件下（好ましくは、よりストリンジェントな条件下）でハイブリダイズする核酸分子（好ましくは、少なくとも１６塩基の核酸分子）からなり、センスプライマーは「検出対象ポリヌクレオチド」の相補鎖にストリンジェントな条件（好ましくは、よりストリンジェントな条件下）でハイブリダイズする核酸分子（好ましくは、少なくとも１６塩基の核酸分子）からなるプライマーセット
が含まれる。 In the primer set of the present invention,
(1) A primer set for detecting a fusion gene of a PIBF1 gene and a RET gene, comprising a sense primer designed from a portion encoding PIBF1 and an antisense primer designed from a portion encoding RET, The antisense primer consists of a nucleic acid molecule (preferably a nucleic acid molecule of at least 16 bases) that hybridizes with the “polynucleotide to be detected” under stringent conditions (preferably under more stringent conditions). A primer set consisting of a nucleic acid molecule (preferably a nucleic acid molecule of at least 16 bases) that hybridizes with a complementary strand of “polynucleotide to be detected” under stringent conditions (preferably under more stringent conditions) is included.

また、前記プライマーセット（１）のより具体的な態様として、本発明のプライマーセットには、以下の（２）及び（３）のプライマーセットが含まれる。
（２）配列番号１の塩基番号１から１８３３間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号１の塩基番号１８３４から２９１６間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。
（３）配列番号３の塩基番号１から２０４９間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号３の塩基番号２０４５から３１３２間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。 Moreover, as a more specific aspect of the primer set (1), the primer set of the present invention includes the following primer sets (2) and (3).
(2) a sense primer composed of an arbitrary consecutive at least 16 base oligonucleotide between base numbers 1 to 1833 of SEQ ID NO: 1 and an arbitrary continuous at least 16 base oligonucleotide between base numbers 1834 to 2916 of SEQ ID NO: 1 A primer set of antisense primers consisting of oligonucleotides that are complementary to.
(3) a sense primer composed of an arbitrary consecutive at least 16 base oligonucleotide between base numbers 1 to 2049 of SEQ ID NO: 3 and an arbitrary continuous at least 16 base oligonucleotide between base numbers 2045 to 3132 of SEQ ID NO: 3 A primer set of antisense primers consisting of oligonucleotides that are complementary to.

これらのプライマーセット（１）〜（３）においては、センスプライマーとアンチセンスセンスプライマーの選択位置の間隔が１ｋｂ以下であるか、あるいは、センスプライマーとアンチセンスセンスプライマーにより増幅される増幅産物の大きさが１ｋｂ以下であることが好ましい。 In these primer sets (1) to (3), the interval between the selected positions of the sense primer and the antisense sense primer is 1 kb or less, or the size of the amplification product amplified by the sense primer and the antisense sense primer Is preferably 1 kb or less.

また、本発明のプライマーは、通常、１５〜４０塩基、好ましくは１６〜２４塩基、更に好ましくは１８〜２４塩基、特に好ましくは２０〜２４塩基の鎖長を有する。 In addition, the primer of the present invention usually has a chain length of 15 to 40 bases, preferably 16 to 24 bases, more preferably 18 to 24 bases, and particularly preferably 20 to 24 bases.

本発明のプライマーセットは、本発明の検出方法において、検出対象ポリヌクレオチドを増幅及び検出するために用いることができる。また、本発明のプライマーセットに含まれる各プライマーは、特に限定されるものではないが、例えば、化学合成法によって製造することができる。 The primer set of the present invention can be used for amplifying and detecting a polynucleotide to be detected in the detection method of the present invention. Moreover, although each primer contained in the primer set of this invention is not specifically limited, For example, it can manufacture by a chemical synthesis method.

「本発明のポリペプチドを抑制する物質」としては、本発明のポリペプチドを阻害する物質又は本発明のポリペプチドの発現を抑制する物質（例えば、二重鎖核酸、抗体又は抗体断片を含む蛋白質、ペプチド、又はそれ以外の化合物］）等が挙げられ、好ましくはＰＩＢＦ１とＲＥＴとの融合タンパク質の活性を阻害する物質（ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ阻害剤とも称する）である。これらの物質は、癌治療剤、特には肺癌又は甲状腺癌治療剤として用いることができ、より好ましくは肺癌治療剤、さらに好ましくは細気管支肺細胞癌治療剤である。 The “substance that suppresses the polypeptide of the present invention” refers to a substance that inhibits the polypeptide of the present invention or a substance that suppresses the expression of the polypeptide of the present invention (for example, a protein comprising a double-stranded nucleic acid, an antibody or an antibody fragment) , Peptides, or other compounds]) and the like, and preferably a substance that inhibits the activity of a fusion protein of PIBF1 and RET (also referred to as a PIBF1-RET inhibitor). These substances can be used as a cancer therapeutic agent, particularly a lung cancer or thyroid cancer therapeutic agent, more preferably a lung cancer therapeutic agent, and still more preferably a bronchiolopulmonary cell cancer therapeutic agent.

以下、実施例によって本発明を詳述するが、本発明は該実施例によって限定されるものではない。なお、特に断りがない場合は、公知の方法に従って実施可能である。また、市販の試薬やキット等を用いる場合には市販品の指示書に従って実施可能である。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention in detail, this invention is not limited by this Example. In addition, when there is no notice in particular, it can implement according to a well-known method. Moreover, when using a commercially available reagent, kit, etc., it can implement according to the instruction manual of a commercial item.

［実施例１］ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ融合ポリヌクレオチドｖ１（ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ１（Ｐ１４Ｒ１２）およびＰＩＢＦ１−ＲＥＴ融合ポリヌクレオチドｖ２（ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ２（Ｐ１６Ｒ１２）の単離
細気管支肺細胞癌患者肺癌組織由来ＲＮＡ（米国アステランド社）Ｌｇ２８０検体ＲＮＡに対して、逆転写酵素（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ、ライフテクノロジーズ社）およびオリゴ（ｄＴ）プライマー（オリゴ（ｄＴ）２０プライマー、ライフテクノロジーズ社）を用いて、キットのプロトコールにしたがって逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。
次に、配列番号５で示されるＰＩＢＦ１＿ＲＥＴ＿ｃｌｏｎｉｎｇ＿Ｆおよび配列番号６で示されるＰＩＢＦ１＿ＲＥＴ＿ｃｌｏｎｉｎｇ＿Ｒのプライマーを用いて、上記で得たｃＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ −ｐｌｕｓ− Ｖｅｒ．２；東洋紡績株式会社）を行いてＰＣＲ（９８℃１５秒、５５℃１５秒、６８℃４分を２５サイクル）を行った。その後、１０倍希釈した前述ＰＣＲ産物を鋳型として、配列番号７で示されるＰＩＢＦ１＿ＲＥＴ＿ｃｌｏｎｉｎｇ＿ＰａｃＩ＿Ｆおよび配列番号８で示されるＰＩＢＦ１＿ＲＥＴ＿ｃｌｏｎｉｎｇ＿ＮｏｔＩ＿Ｒのプライマー、同じＤＮＡポリメラーゼ、同じプロトコルでＰＣＲを行い、電気泳動したところ、約２．９ｋｂのＰＣＲ産物と約３．１ｋｂのＰＣＲ産物を得たことがわかった。それぞれのＰＣＲ産物をクローニングベクター（ＴＯＰＯＸＬＰＣＲＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ；ライフテクノロジーズ株式会社）にクローニングした。インサートはダイデオキシシーケンス法により配列を決定した（ＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒｖ３．１ＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＫｉｔ；ライフテクノロジーズ）。この結果、約２．９ｋｂのＰＣＲ産物では、ＮＣＢＩに登録されているＰＩＢＦ１（ＮＭ＿００６３４６．２）のコーディングシーケンス（以下ＣＤＳ）のＮ末端からエキソン１４の３’末端までが、ＲＥＴ（ＮＭ＿０２０６３０）のＣＤＳのエキソン１２の５’末端からＣＤＳのＣ末端までと融合している転写産物（ＰＩＢＦ１−ＲＥＴｖ１）（配列番号１）が存在していることが明らかになった。配列番号１によりコードされるポリペプチドを配列番号２に示す。また、約３．１ｋｂのＰＣＲ産物では、ＮＣＢＩに登録されているＰＩＢＦ１（ＮＭ＿００６３４６．２）のコーディングシーケンス（以下ＣＤＳ）のＮ末端からエキソン１６の３’末端までが、ＲＥＴ（ＮＭ＿０２０６３０）のＣＤＳのエキソン１２の５’末端からＣＤＳのＣ末端までと融合している転写産物（ＰＩＢＦ１−ＲＥＴｖ２）（配列番号３）が存在していることが明らかになった。配列番号３によりコードされるポリペプチドを配列番号４に示す。
また、ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ１およびＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ２のＯＲＦ全長をタンパク質として発現するため、それぞれ制限酵素ＰａｃＩで３７℃、３時間の酵素反応を行い制限酵素処理したＤＮＡ断片を精製し、さらにＮｏｔＩで３７℃、３時間の酵素反応を行い制限酵素処理したＤＮＡ断片を精製した。このＯＲＦを含むＤＮＡ断片を発現ベクター（ｐＭＸｓ−ｐｕｒｏ；コスモバイオ社）のマルチクローニングサイトに存在するＰａｃＩおよびＮｏｔＩサイトにクローニングし発現プラスミドを構築した。（ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ１（Ｐ１４Ｒ１２）／ｐＭＸｓ−ｐｕｒｏおよびＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ２（Ｐ１６Ｒ１２）／ｐＭＸｓ−ｐｕｒｏ） [Example 1] Isolation of PIBF1-RET fusion polynucleotide v1 (PIBF1-RET_v1 (P14R12) and PIBF1-RET fusion polynucleotide v2 (PIBF1-RET_v2 (P16R12)) RNA derived from lung cancer tissue of bronchiolopulmonary cell carcinoma patients (US asterisk) Land) Using reverse transcriptase (SuperScriptIII, Life Technologies) and oligo (dT) primer (Oligo (dT) 20 primer, Life Technologies) for Lg280 sample RNA, reverse transcription reaction according to the protocol of the kit To synthesize cDNA.
Next, DNA polymerase (KOD-plus-Ver.2; Toyobo Co., Ltd.) was prepared using the above-obtained cDNA as a template using the PIBF1_RET_cloning_F represented by SEQ ID NO: 5 and the PIBF1_RET_cloning_R represented by SEQ ID NO: 6. The PCR was performed (25 cycles of 98 ° C. for 15 seconds, 55 ° C. for 15 seconds, 68 ° C. for 4 minutes). Thereafter, PCR was carried out using the PCR product diluted 10-fold as a template, PIBF1_RET_cloning_PacI_F represented by SEQ ID NO: 7 and PIBF1_RET_cloning_NotI_R represented by SEQ ID NO: 8, the same DNA polymerase, and the same protocol. It was found that a 9 kb PCR product and an approximately 3.1 kb PCR product were obtained. Each PCR product was cloned into a cloning vector (TOPO XL PCR Cloning Kit; Life Technologies, Inc.). The insert was sequenced by the dideoxy sequencing method (BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit; Life Technologies). As a result, in the PCR product of about 2.9 kb, from the N terminal of the coding sequence (hereinafter CDS) of PIBF1 (NM_006346.2) registered in NCBI to the 3 ′ terminal of exon 14, the CDS of RET (NM — 020630) It was revealed that there is a transcript (PIBF1-RETv1) (SEQ ID NO: 1) fused from the 5 ′ end of exon 12 to the C terminus of CDS. The polypeptide encoded by SEQ ID NO: 1 is shown in SEQ ID NO: 2. In addition, in the PCR product of about 3.1 kb, the N-terminal of the coding sequence (hereinafter CDS) of PIBF1 (NM_006346.2) registered in NCBI to the 3 ′ end of exon 16 is the CDS of RET (NM_020630). It was revealed that there is a transcript (PIBF1-RETv2) (SEQ ID NO: 3) fused from the 5 ′ end of exon 12 to the C terminus of CDS. The polypeptide encoded by SEQ ID NO: 3 is shown in SEQ ID NO: 4.
In addition, in order to express the full length of the ORFs of PIBF1-RET_v1 and PIBF1-RET_v2 as proteins, the DNA fragments treated with the restriction enzymes were purified by carrying out an enzyme reaction at 37 ° C. for 3 hours with the restriction enzyme PacI, respectively, and further with NotI at 37 ° C. A DNA fragment treated with a restriction enzyme was purified by performing an enzyme reaction for 3 hours. The DNA fragment containing this ORF was cloned into the PacI and NotI sites present at the multiple cloning site of the expression vector (pMXs-puro; Cosmo Bio) to construct an expression plasmid. (PIBF1-RET_v1 (P14R12) / pMXs-puro and PIBF1-RET_v2 (P16R12) / pMXs-puro)

［実施例２］ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ（Ｐ１４Ｒ１２）融合ポリヌクレオチドｖ１の検出
肺癌臨床検体由来ｃＤＮＡ（米国アステランド社）２００サンプルを基質とし、配列番号９で示されるＰ１４Ｒ１２＿ｑＰＣＲ＿Ｆおよび配列番号１０で示されるＰ１４Ｒ１２＿ｑＰＣＲ＿Ｒの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして、定量的ＰＣＲキット（ＰｏｗｅｒＳＹＢＲＧｒｅｅｎＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ；ライフテクノロジーズ社）を用い、アプライドバイオシステムズ７９００ＨＴシステムにて、定量ＰＣＲ（９５℃ １０分の後、９５℃１５秒、５９℃６０秒を４５サイクル）を行い遺伝子発現量を測定した。その結果、上述のサンプルＬｇ２８０から合成したｃＤＮＡのみで増幅が確認された。またＰＩＢＦ１−ＲＥＴ（Ｐ１６Ｒ１２）＿ｖ２配列を持つプラスミドＤＮＡでは増幅は確認できなかった。以上から、上記方法により、肺癌臨床検体由来の試料中のＰＩＢＦ１−ＲＥＴ（Ｐ１４Ｒ１２）融合ポリヌクレオチドｖ１の存在を検出することができ、ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ（Ｐ１４Ｒ１２）ポリヌクレオチドｖ１陽性患者を選択できることが示された。 [Example 2] Detection of PIBF1-RET (P14R12) fusion polynucleotide v1 Using 200 samples of lung cancer clinical specimen-derived cDNA (Asterland, USA) as a substrate, P14R12_qPCR_F represented by SEQ ID NO: 9 and P14R12_qPCR_R represented by SEQ ID NO: 10 Quantitative PCR (95 ° C., 10 minutes, 95 ° C.) using Applied Biosystems 7900HT system using a quantitative PCR kit (Power SYBR Green PCR Master Mix; Life Technologies) with oligonucleotides consisting of base sequences as primer sets The gene expression level was measured by 45 cycles of 15 seconds and 59 ° C. and 60 seconds. As a result, amplification was confirmed only with the cDNA synthesized from the sample Lg280. In addition, amplification could not be confirmed with plasmid DNA having the PIBF1-RET (P16R12) _v2 sequence. From the above, it is shown that the presence of PIBF1-RET (P14R12) fusion polynucleotide v1 in a sample derived from a lung cancer clinical specimen can be detected by the above method, and a PIBF1-RET (P14R12) polynucleotide v1-positive patient can be selected. It was done.

［実施例３］ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ（Ｐ１６Ｒ１２）融合ポリヌクレオチドｖ２の検出
肺癌臨床検体由来ｃＤＮＡ（米国アステランド社）２００サンプルを基質とし、配列番号１１で示されるＰ１６Ｒ１２＿ｑＰＣＲ＿Ｆおよび配列番号１２で示されるＰ１６Ｒ１２＿ｑＰＣＲ＿Ｒの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして、定量的ＰＣＲキット（ＰｏｗｅｒＳＹＢＲＧｒｅｅｎＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ；ライフテクノロジーズ社）を用い、アプライドバイオシステムズ７９００ＨＴシステムにて、定量ＰＣＲ（９５℃ １０分の後、９５℃１５秒、５９℃６０秒を４５サイクル）を行い遺伝子発現量を測定した。その結果、上述のサンプルＬｇ２８０から合成したｃＤＮＡのみで増幅が確認された。またＰＩＢＦ１−ＲＥＴ（Ｐ１４Ｒ１２）＿ｖ１配列を持つプラスミドＤＮＡでは増幅は確認できなかった。以上から、上記方法により、肺癌臨床検体由来の試料中のＰＩＢＦ１−ＲＥＴ（Ｐ１４Ｒ１２）融合ポリヌクレオチドｖ２の存在を検出することができ、ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ（Ｐ１４Ｒ１２）ポリヌクレオチドｖ２陽性患者を選択できることが示された。 [Example 3] Detection of PIBF1-RET (P16R12) fusion polynucleotide v2 Using 200 samples of lung cancer clinical specimen-derived cDNA (Asterland, USA) as a substrate, P16R12_qPCR_F represented by SEQ ID NO: 11 and P16R12_qPCR_R represented by SEQ ID NO: 12 Quantitative PCR (95 ° C., 10 minutes, 95 ° C.) using Applied Biosystems 7900HT system using a quantitative PCR kit (Power SYBR Green PCR Master Mix; Life Technologies) with oligonucleotides consisting of base sequences as primer sets The gene expression level was measured by 45 cycles of 15 seconds and 59 ° C. and 60 seconds. As a result, amplification was confirmed only with the cDNA synthesized from the sample Lg280. In addition, amplification could not be confirmed with plasmid DNA having the PIBF1-RET (P14R12) _v1 sequence. From the above, it is shown that the presence of PIBF1-RET (P14R12) fusion polynucleotide v2 in a sample derived from a lung cancer clinical specimen can be detected by the above method, and a PIBF1-RET (P14R12) polynucleotide v2-positive patient can be selected. It was done.

[実施例４] ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ（Ｐ１４Ｒ１２）融合ポリヌクレオチド＿ｖ１およびＰＩＢＦ１−ＲＥＴ（Ｐ１６Ｒ１２）融合ポリヌクレオチド＿ｖ２のレトロウイルス液の作成
上記、ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ１（Ｐ１４Ｒ１２）／ｐＭＸｓ−ｐｕｒｏおよびＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ１（Ｐ１６Ｒ１２）／ｐＭＸｓ−ｐｕｒｏを各９μｇ、トランスフェクション試薬（ＦＵＧＥＮＥョＨＤ、ロシュ社）を用いて、Ｐｌａｔｉｎｕｍ−Ｅ細胞にトランスフェクションを実施した。トランスフェクション２４時間後に１０％牛血清（ニチレイバイオサイエンス社）を含むＤ−ＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅＭｅｄｉｕｍ培地；インビトロジェン社）を交換し、さらに２４時間の培地上清を採取しレトロウイルス溶液を作成した。 [Example 4] Preparation of PIBF1-RET (P14R12) fusion polynucleotide_v1 and PIBF1-RET (P16R12) fusion polynucleotide_v2 retroviral fluid PIBF1-RET_v1 (P14R12) / pMXs-puro and PIBF1-RET_v1 (P16R12) ) / PMXs-puro, 9 μg each, and transfection reagent (FUGENE HD, Roche) was used to transfect Platinum-E cells. 24 hours after transfection, the D-MEM medium (Dulbecco's Modified Eagle Medium medium; Invitrogen) containing 10% bovine serum (Nichirei Bioscience) was replaced, and the medium supernatant was further collected for 24 hours to obtain a retrovirus solution. It was created.

[実施例５]ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ１（Ｐ１４Ｒ１２）融合ポリヌクレオチドおよびＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ２（Ｐ１６Ｒ１２）融合ポリヌクレオチドによる増殖因子非依存性増殖促進作用の検討
実施例４において、ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ１（Ｐ１４Ｒ１２）／ｐＭＸs−ｐｕｒｏおよびＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ２（Ｐ１６Ｒ１２）／ｐＭＸs−ｐｕｒｏを用いて作成したウイルス溶液にポリブレン（Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ；Ｓｉｇｍａ社）を４μｇ／ｍＬの濃度で添加したのち、ＢＡ／Ｆ３細胞に添加し感染させた。感染６時間後に１０％牛血清（ニチレイバイオサイエンス社）、1ｎｇ／ｍＬのマウスリコンビナントＩＬ−３（Ｒ＆Ｄ社）を含むＲＰＭＩ１６４０（ＲｏｓｗｅｌｌＰａｒｋＭｅｍｏｒｉａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅ１６４０；インビトロジェン社）培地に交換し培養した。感染１日後に１０％牛血清（ニチレイバイオサイエンス社）および１μｇ／ｍＬのピューロマイシン（シグマ社）を含むＲＰＭＩ１６４０（ＲｏｓｗｅｌｌＰａｒｋＭｅｍｏｒｉａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅ１６４０；インビトロジェン社）培地を用いて、５％ＣＯ₂存在下、３７℃で４週間培養を続け、ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ１（Ｐ１４Ｒ１２）およびＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ２（Ｐ１６Ｒ１２）／ｐＭＸs−ｐｕｒｏを安定発現するＢＡ／Ｆ３細胞を取得した。（それぞれＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ１（Ｐ１４Ｒ１２）発現／ＢＡ／Ｆ３細胞およびＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ２（Ｐ１６Ｒ１２）発現／ＢＡ／Ｆ３細胞と命名した。）
ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ１（Ｐ１４Ｒ１２）発現／ＢＡ／Ｆ３細胞およびＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ２（Ｐ１６Ｒ１２）発現／ＢＡ／Ｆ３細胞のＩＬ−３非存在下での増殖能を検討した。ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ１（Ｐ１４Ｒ１２）発現／ＢＡ／Ｆ３細胞、ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ２（Ｐ１６Ｒ１２）発現／ＢＡ／Ｆ３細胞およびＣＤＳ領域を含まない空ベクターであるｐＭＸｓ−ｐｕｒｏ感染ＢＡ／Ｆ３細胞（Ｍｏｃｋ／ＢＡ／Ｆ３細胞）を増殖因子ＩＬ−3の非存在下で、１ウェル当り１×１０³個となるように１０％牛血清（ニチレイバイオサイエンス社）を含みマウスリコンビナントＩＬ−３を含まないＲＰＭＩ１６４０培地（インビトロジェン社）で９６ウェルプレートに撒き、５％ＣＯ₂存在下、３７℃で培養後、翌日（Ｄａｙ１）および４日後（Ｄａｙ４）の細胞数を細胞数測定試薬（ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ−Ｇｌｏ^TMＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔＣｅｌｌＶｉａｂｉｌｉｔｙＡｓｓａｙ；Ｐｒｏｍｅｇａ社）をマニュアルの方法に従って測定した。検出には発光測定装置（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ；パーキンエルマー社）を用いた。Ｍｏｃｋ／ＢＡ／Ｆ３細胞はＤａｙ１からＤａｙ４までで細胞数のカウントは増加しなかったのに対して、ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ１（Ｐ１４Ｒ１２）発現／ＢＡ／Ｆ３細胞はＤａｙ１からＤａｙ４までで約２３倍の細胞数の増加が観察された。また、ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ２（Ｐ１６Ｒ１２）発現／ＢＡ／Ｆ３細胞はＤａｙ１からＤａｙ４までで約１３倍の細胞数の増加が観察された。以上により、ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ１（Ｐ１４Ｒ１２）融合ポリヌクレオチドおよびＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ２（Ｐ１６Ｒ１２）融合ポリヌクレオチドは増殖因子非依存性増殖亢進作用を有することがわかった。 [Example 5] Examination of growth factor-independent growth promoting action by PIBF1-RET_v1 (P14R12) fusion polynucleotide and PIBF1-RET_v2 (P16R12) fusion polynucleotide In Example 4, PIBF1-RET_v1 (P14R12) / pMXs-puro Polybrene (Sigma) was added to a virus solution prepared using PIBF1-RET_v2 (P16R12) / pMXs-puro at a concentration of 4 μg / mL, and then added to BA / F3 cells for infection. Six hours after infection, the culture medium was replaced with RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute 1640; Invitrogen) medium containing 10% bovine serum (Nichirei Bioscience) and 1 ng / mL mouse recombinant IL-3 (R & D). One day after the infection, using RPMI1640 (Roswell Park Memorial Institute 1640; Invitrogen) medium containing 10% bovine serum (Nichirei Bioscience) and 1 μg / mL puromycin (Sigma) in the presence of 5% CO ₂ , The culture was continued at 37 ° C. for 4 weeks to obtain BA / F3 cells stably expressing PIBF1-RET_v1 (P14R12) and PIBF1-RET_v2 (P16R12) / pMXs-puro. (They were named PIBF1-RET_v1 (P14R12) expression / BA / F3 cells and PIBF1-RET_v2 (P16R12) expression / BA / F3 cells, respectively).
The proliferation ability of PIBF1-RET_v1 (P14R12) expression / BA / F3 cells and PIBF1-RET_v2 (P16R12) expression / BA / F3 cells in the absence of IL-3 was examined. PIBF1-RET_v1 (P14R12) expression / BA / F3 cells, PIBF1-RET_v2 (P16R12) expression / BA / F3 cells and pMXs-puro-infected BA / F3 cells (Mock / BA / F3 cells) that are empty vectors without the CDS region ) In the absence of growth factor IL-3, RPMI1640 medium (Invitrogen) containing 10% bovine serum (Nichirei Biosciences) and no mouse recombinant IL-3 to 1 × 10 ³ per well ) In a 96-well plate and cultured at 37 ° C. in the presence of 5% CO ₂ , and the number of cells on the following day (Day 1) and 4 days (Day 4) is determined as a cell number measuring reagent (CELLTITER-Glo ^™ Luminescent Cell Viability Assay; Promega Company) It was measured according to the method of Le. A luminescence measuring device (Envision; Perkin Elmer) was used for detection. Mock / BA / F3 cells did not increase in cell count from Day 1 to Day 4, whereas PIBF1-RET_v1 (P14R12) expression / BA / F3 cells had approximately 23 times the number of cells from Day 1 to Day 4. An increase in was observed. In addition, PIBF1-RET_v2 (P16R12) expression / BA / F3 cells were observed to have an approximately 13-fold increase in the number of cells from Day 1 to Day 4. From the above, it was found that the PIBF1-RET_v1 (P14R12) fusion polynucleotide and the PIBF1-RET_v2 (P16R12) fusion polynucleotide have a growth factor-independent growth promoting action.

[実施例６] ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ１（Ｐ１４Ｒ１２）融合ポリヌクレオチドおよびＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ２（Ｐ１６Ｒ１２）融合ポリヌクレオチドの足場非依存的増殖亢進作用の検討
実施例４において、ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ１（Ｐ１４Ｒ１２）／ｐＭＸs−ｐｕｒｏおよびＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ２（Ｐ１６Ｒ１２）／ｐＭＸs−ｐｕｒｏを用いて作成したウイルス溶液にポリブレン（Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ；Ｓｉｇｍａ社）を４μｇ／ｍＬの濃度で添加したのち、ＮＩＨ３Ｔ３細胞に添加し感染させた。添加６時間後に１０％牛血清（ニチレイバイオサイエンス社）を含むＤ−ＭＥＭ培地に交換し、感染１日後に１０％牛血清（ニチレイバイオサイエンス社）および１μｇ／ｍＬのピューロマイシン（シグマ社）を含むＤ−ＭＥＭ培地（インビトロジェン社）に交換し、５％ＣＯ₂存在下、３７℃で４週間培養を続け、ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ１（Ｐ１４Ｒ１２）およびＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ２（Ｐ１６Ｒ１２）を安定発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞を取得した。（それぞれＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ１（Ｐ１４Ｒ１２）発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞およびＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ２（Ｐ１６Ｒ１２）発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞と命名した。）
ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ１（Ｐ１４Ｒ１２）発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞およびＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ２（Ｐ１６Ｒ１２）発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞の足場非依存的増殖亢進能を検討するため、９６ウェルスフェロイドプレート（スミロンセルタイトスフェロイド９６Ｕ；住友ベークライト）にＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ１（Ｐ１４Ｒ１２）発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ２（Ｐ１６Ｒ１２）発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞および空ベクターであるｐＭＸｓ−ｐｕｒｏを感染させたＮＩＨ３Ｔ３細胞（Ｍｏｃｋ／３Ｔ３細胞）を、それぞれ１ウェル当り１×１０³個となるように１０％牛血清（ニチレイバイオサイエンス社）を含むＤ−ＭＥＭ培地（インビトロジェン社）で播種した。５％ＣＯ₂存在下、３７℃で培養後、翌日（Ｄａｙ１）および４日後（Ｄａｙ４）の細胞数を細胞数測定試薬（ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ−Ｇｌｏ^TMＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔＣｅｌｌＶｉａｂｉｌｉｔｙＡｓｓａｙ；Ｐｒｏｍｅｇａ社）をマニュアルの方法に従って測定した。検出には発光測定装置（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ；パーキンエルマー社）を用いた。Ｍｏｃｋ／３Ｔ３細胞はＤａｙ１からＤａｙ４までで細胞数のカウントは増加しなかったのに対してＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ１（Ｐ１４Ｒ１２）発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞はＤａｙ１からＤａｙ４までで約１．７倍の細胞数のカウントの増加が確認された。また、ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ２（Ｐ１６Ｒ１２）発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞はＤａｙ１からＤａｙ４までで約２．９倍の細胞数のカウントの増加が確認された。以上のことから、ＣＬＮ３−ＢＲＡＦ＿ｖ１発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞およびＣＬＮ３−ＢＲＡＦ＿ｖ２発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞は足場非依存的細胞増殖を示すことが明らかとなった。 [Example 6] Examination of anchorage-independent growth-promoting action of PIBF1-RET_v1 (P14R12) fusion polynucleotide and PIBF1-RET_v2 (P16R12) fusion polynucleotide In Example 4, PIBF1-RET_v1 (P14R12) / pMXs-puro and Polybrene (Sigma) was added to a virus solution prepared using PIBF1-RET_v2 (P16R12) / pMXs-puro at a concentration of 4 μg / mL, and then added to NIH3T3 cells for infection. Six hours after the addition, the medium was replaced with D-MEM medium containing 10% bovine serum (Nichirei Bioscience), and 10 days after infection, 10% bovine serum (Nichirei Bioscience) and 1 μg / mL puromycin (Sigma) were exchanged. The medium was replaced with D-MEM medium (Invitrogen), and cultured at 37 ° C. in the presence of 5% CO ₂ for 4 weeks to obtain NIH3T3 cells that stably express PIBF1-RET_v1 (P14R12) and PIBF1-RET_v2 (P16R12). did. (They were named PIBF1-RET_v1 (P14R12) expression / NIH3T3 cells and PIBF1-RET_v2 (P16R12) expression / NIH3T3 cells, respectively).
PIBF1-RET_v1 (P14R12) expression / NIH3T3 cells and PIBF1-RET_v2 (P16R12) expression / NIH3T3 cells were examined for their ability to enhance anchorage-independent growth in a 96-well spheroid plate (Sumilon Celltite Spheroid 96U; Sumitomo Bakelite). -RET_v1 (P14R12) expression / NIH3T3 cells, PIBF1-RET_v2 (P16R12) expression / NIH3T3 cells, and NIH3T3 cells (Mock / 3T3 cells) infected with the empty vector pMXs-puro, 1 × 10 ³ per well Inoculated with D-MEM medium (Invitrogen) containing 10% bovine serum (Nichirei Bioscience) so as to be individual. After culturing at 37 ° C. in the presence of 5% CO ₂ , the number of cells on the following day (Day 1) and 4 days (Day 4) was measured with a cell number measuring reagent (CELLTITER-Glo ^™ Luminescent Cell Viability Assay; Promega) according to the manual method. did. A luminescence measuring device (Envision; Perkin Elmer) was used for detection. Mock / 3T3 cells did not increase in cell number from Day1 to Day4, whereas PIBF1-RET_v1 (P14R12) expression / NIH3T3 cells had a cell number count of about 1.7 times from Day1 to Day4. Increase was confirmed. In addition, PIBF1-RET_v2 (P16R12) expression / NIH3T3 cells were confirmed to increase in cell count by about 2.9 times from Day 1 to Day 4. From the above, it became clear that CLN3-BRAF_v1 expression / NIH3T3 cells and CLN3-BRAF_v2 expression / NIH3T3 cells exhibited anchorage-independent cell proliferation.

本発明の検出方法は、本明細書の融合遺伝子陽性の癌患者の判定に有用である。本発明の検出用キット及びプライマーセットは、前記検出方法に用いることができる。 The detection method of the present invention is useful for determining a fusion gene-positive cancer patient of the present specification. The detection kit and primer set of the present invention can be used in the detection method.

以下の配列表の数字見出し＜２２３＞には、「ＡｒｔｉｆｉｃｉａｌＳｅｑｕｅｎｃｅ」の説明を記載する。具体的には、配列表の配列番号７及び８で表される各塩基配列は、人工的に合成したプライマー配列である。 The description of “Artificial Sequence” is described in the numerical heading <223> of the following sequence listing. Specifically, each base sequence represented by SEQ ID NOs: 7 and 8 in the sequence listing is an artificially synthesized primer sequence.

Claims

Progesterone immunomodulator binding factor 1 characterized by including the step of detecting the presence of the polynucleotide encoding the polypeptide of the following (1) to (3) or the polypeptide in a sample obtained from a subject (Progesterone Immunomodulator binding factor 1) A method for detecting a fusion gene of a gene and a rearranged during transformation (RET) gene or a fusion protein encoded by the fusion gene:
(1) A polypeptide comprising the amino acid sequence represented by amino acid numbers 78 to 911 of SEQ ID NO: 2 or amino acid numbers 78 to 983 of SEQ ID NO: 4 and having tumorigenicity, or amino acid numbers 78 to 911 or an amino acid sequence represented by amino acid numbers 78 to 983 of SEQ ID NO: 4, comprising an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids are deleted, substituted, and / or inserted, and having a tumorigenic ability ,
(2) a polymorphism comprising an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence represented by amino acid numbers 78 to 911 of SEQ ID NO: 2 or amino acid numbers 78 to 983 of SEQ ID NO: 4 and having tumorigenic potential Peptide, or
(3) A polypeptide comprising an amino acid sequence represented by amino acid numbers 78 to 911 of SEQ ID NO: 2 or amino acid numbers 78 to 983 of SEQ ID NO: 4.

The detection method according to claim 1, wherein the polypeptide is a polypeptide according to the following (1) to (3):
(1) A polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 and having tumorigenicity, or 1 to 10 amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 A polypeptide comprising an amino acid sequence in which an amino acid is deleted, substituted, and / or inserted, and having tumorigenic potential,
(2) a polypeptide comprising an amino acid sequence having an identity of 90% or more with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 and having tumorigenicity, or
(3) A polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4.

Kit for detecting a fusion gene of PIBF1 gene and RET gene, comprising a sense primer and an antisense primer designed to specifically amplify a polynucleotide encoding the polypeptide according to (1) to (3) below :
(1) A polypeptide comprising the amino acid sequence represented by amino acid numbers 78 to 911 of SEQ ID NO: 2 or amino acid numbers 78 to 983 of SEQ ID NO: 4 and having tumorigenicity, or amino acid numbers 78 to 911 or an amino acid sequence represented by amino acid numbers 78 to 983 of SEQ ID NO: 4, comprising an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids are deleted, substituted, and / or inserted, and having a tumorigenic ability ,
(2) a polymorphism comprising an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence represented by amino acid numbers 78 to 911 of SEQ ID NO: 2 or amino acid numbers 78 to 983 of SEQ ID NO: 4 and having tumorigenic potential Peptide, or
(3) A polypeptide comprising an amino acid sequence represented by amino acid numbers 78 to 911 of SEQ ID NO: 2 or amino acid numbers 78 to 983 of SEQ ID NO: 4.

The detection kit according to claim 3, wherein the polypeptide is a polypeptide according to the following (1) to (3):
(1) A polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 and having tumorigenicity, or 1 to 10 amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 A polypeptide comprising an amino acid sequence in which an amino acid is deleted, substituted, and / or inserted, and having tumorigenic potential,
(2) a polypeptide comprising an amino acid sequence having an identity of 90% or more with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 and having tumorigenicity, or
(3) A polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4.

A primer set for detecting a fusion gene of a PIBF1 gene and a RET gene, comprising a sense primer designed from a portion encoding a PIBF1 gene and an antisense primer designed from a portion encoding a RET gene, From an antisense primer comprising a nucleic acid molecule that hybridizes under stringent conditions to a polynucleotide encoding the polypeptide of Item 1 or 2, and a nucleic acid molecule that hybridizes under stringent conditions to a complementary strand of the polynucleotide A primer set comprising a sense primer.

Sense primer comprising any continuous at least 16 base oligonucleotide between base numbers 1 to 1833 of SEQ ID NO: 1 and any continuous at least 16 base oligonucleotide between base numbers 1834 to 2916 of SEQ ID NO: 1 A primer set of antisense primers consisting of complementary oligonucleotides.

Sense primer consisting of any consecutive at least 16 base oligonucleotides between base numbers 1 to 2049 of SEQ ID NO: 3 and any continuous at least 16 base oligonucleotides between base numbers 2050 to 3132 of SEQ ID NO: 3 A primer set of antisense primers consisting of complementary oligonucleotides.