JP2015100326A - Sericin 1 mutant strain of silkworm - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、カイコのセリシン1遺伝子の特定の部位に変異が導入されたカイコのセリシン1変異系統に関する。
The present invention relates to a
カイコ（Bombyx mori）の絹糸腺は、大量のタンパク質を短期間に合成できる能力を有している。そのため、近年、遺伝子組換えカイコを利用して、新しい性質を付与した絹繊維（以下、「機能性絹繊維」という）や有用物質を生産する方法が着目されている。 Silkworm glands of Bombyx mori have the ability to synthesize large amounts of protein in a short period of time. Therefore, in recent years, attention has been focused on methods for producing silk fibers imparted with new properties (hereinafter referred to as “functional silk fibers”) and useful substances using genetically modified silkworms.
カイコの絹糸腺は、形態学的には図１で示すような左右1対の器官であり、それぞれは、前部絹糸腺、中部絹糸腺、及び後部絹糸腺の3つの領域で構成されている。後部絹糸腺細胞は、絹糸の繊維成分であるフィブロインを発現している。また中部絹糸腺細胞は、絹糸の被覆成分であり、ゼラチン様の糊状タンパク質セリシンを発現している。発現したフィブロインは、後部絹糸腺内腔中に分泌される。その後、中部絹糸腺内腔に移行し、そこでセリシンによって被覆され、絹糸として吐糸される（図１）。このように、セリシンは、フィブロインの周囲を取り巻いて、吐糸や繭の形成における潤滑剤又は接着剤として機能すると考えられている。 The silkworm silk gland is morphologically a pair of left and right organs as shown in FIG. 1, each of which is composed of three regions: an anterior silk gland, a middle silk gland, and a posterior silk gland. . The posterior silk gland cells express fibroin, which is a fiber component of silk. The middle silk gland cells are a silk coating component and express gelatin-like paste-like protein sericin. The expressed fibroin is secreted into the posterior silk gland lumen. Then, it moves to the middle silk gland lumen, where it is covered with sericin and spun as silk (FIG. 1). Thus, sericin is thought to function as a lubricant or adhesive in the formation of spun yarns and folds around fibroin.
カイコの絹糸腺で機能性絹繊維を製造するには、目的の機能を有するタンパク質をフィブロインに付加した遺伝子組換えカイコを作出し、当該カイコが吐糸した絹糸から機能性絹繊維を分離、精製すればよい。機能性絹繊維を分離、精製するためには、絹糸に対してセリシンの除去を目的とした精練処理を行う必要がある。ところが、従来の精練方法では、堅牢なセリシンを溶解するために高温及びアルカリ処理が必須であり、加熱工程やアルカリ廃液の中和処理等に多大な手間やコストを要していた。さらに、このような強条件下での処理は、機能性絹繊維中に付加させた機能性タンパク質をも変性させ、その機能が失われてしまうという本質的な問題があった。それ故、目的の機能を失わせることなく機能性絹繊維を分離、精製する新たな精練方法の開発が求められていた。 In order to produce functional silk fibers from silkworm silk glands, transgenic silkworms with a protein with the desired function added to fibroin are produced, and functional silk fibers are separated and purified from the silk thread spun by the silkworm. do it. In order to separate and purify the functional silk fiber, it is necessary to perform a scouring treatment for the purpose of removing sericin on the silk thread. However, in the conventional scouring method, high temperature and alkali treatment are indispensable in order to dissolve robust sericin, and much labor and cost are required for the heating step and neutralization treatment of the alkaline waste liquid. Furthermore, the treatment under such a strong condition has an essential problem that the functional protein added to the functional silk fiber is also denatured and its function is lost. Therefore, development of a new scouring method for separating and purifying functional silk fibers without losing the intended function has been demanded.
絹糸から特定のタンパク質を効率的に除去する方法の一つとして、標的タンパク質を欠損した変異体の利用が挙げられる。実際、フィブロインの場合には、その合成経路に関与する遺伝子に変異を生じたフィブロイン変異系統として、セリシンカイコ系統（Nd系統、Nd-s系統及びNd-sD系統）が知られている。セリシンカイコ系統は、他のフィブロイン構成タンパク質が正常に発現しているにもかかわらず、ほとんど吐糸できないという特徴をもつ（非特許文献１）。これらの変異系統から作出された営繭性セリシンカイコ系統（セリシンホープカイコ系統）（非特許文献２及び３)は、吐糸可能なフィブロイン変異系統であり、セリシンのみからなる繭を営繭できるため、純粋なセリシンの生産系として利用されている（特許文献１）。
One method for efficiently removing a specific protein from silk thread is to use a mutant lacking the target protein. In fact, in the case of fibroin, sericin silkworm strains (Nd strain, Nd-s strain and Nd-s D strain) are known as fibroin mutant strains in which a gene involved in the synthesis pathway is mutated. The sericin silkworm strain is characterized by almost no spitting despite the normal expression of other fibroin constituent proteins (Non-patent Document 1). The fertile sericin silkworm strains (Sericin Hope silkworm strain) (Non-patent
フィブロインと同様に、セリシンの合成能を欠失した組換えカイコ系統が利用可能になれば、絹糸におけるセリシンを欠失又は低減できることから、絹繊維の精練処理が不要になるか、又は従来よりも低温かつ低アルカリ性の穏やかな条件で処理できることが期待される。セリシン遺伝子は、現在セリシン1（Ser1)遺伝子、セリシン2（Ser2)遺伝子、及びセリシン3（Ser3)遺伝子の3種類のセリシンが知られている。このうち、営繭期に大量に発現する遺伝子は、中部絹糸腺の中区及び後区（図１）で発現するセリシン1遺伝子と中部絹糸腺の前区で発現するセリシン3遺伝子である（非特許文献４及び５）。ところが、セリシンに異常のあるカイコ系統は、これまでにセリシン3遺伝子の一部が欠損した系統が知られているのみであった（非特許文献６）。また、そのセリシン3変異系統は、営繭できるものの、その繭にはセリシン3が多量に包含されており、野生型カイコ系統の繭との間に明確な違いがみられなかった。また、セリシンは、上述のように吐糸時の潤滑剤として機能する。そのため当該分野では、セリシン1、2、3の中で最も発現量が高いセリシン１を欠失した遺伝子組換えカイコを作製しても吐糸できずにそのまま蛹化する「裸蛹」となるか、又は終齢幼虫のまま死亡する「不吐糸蚕」となり、継代による系統維持はできないと考えられていた。それ故に、絹糸中のセリシン1の量を制御できる継代可能なセリシン1変異体は、これまで知られていない。
As with fibroin, if a recombinant silkworm strain that lacks the ability to synthesize sericin becomes available, sericin in the silk thread can be deleted or reduced. It is expected that it can be processed under mild conditions of low temperature and low alkalinity. Three types of sericin are currently known: sericin 1 (Ser1) gene, sericin 2 (Ser2) gene, and sericin 3 (Ser3) gene. Among them, genes that are expressed in large quantities during the growing season are the
本発明は、絹糸中のセリシンの量を制御するために、カイコのセリシン遺伝子に変異を導入し、セリシンが欠失又はその量が低減した絹糸を吐糸可能な変異系統を作出し、それを提供することを課題とする。 In order to control the amount of sericin in the silk thread, the present invention introduces a mutation in the silkworm sericin gene to create a mutant strain capable of spitting silk thread with the sericin deleted or reduced in quantity. The issue is to provide.
上述のようにセリシン遺伝子に変異を導入した遺伝子組換えカイコを作出したとしても、変異遺伝子のホモ接合体は、吐糸できずに最終的には死亡するため、その系統を継代により維持することは困難である、というのが当該分野での通説であった。 Even if a transgenic silkworm in which a mutation is introduced into the sericin gene as described above is produced, a homozygote of the mutant gene cannot be spun and eventually dies, so the line is maintained by passage. It was a common belief in the field that it was difficult.
本発明者らは、上記課題を解決するために、部位特異的なヌクレアーゼであるTALENを用いてセリシン1（以下、しばしば「Ser1」と表記する）遺伝子に様々な変異を導入したところ、Ser1遺伝子の特定の部位に変異を導入した場合に、その変異体はSer1が顕著に減少した絹糸を吐糸でき、かつ継代が可能となることを見出した。本発明は、当該知見に基づくものであって、以下を提供する。 In order to solve the above problems, the present inventors introduced various mutations into the sericin 1 (hereinafter often referred to as “Ser1”) gene using TALEN, which is a site-specific nuclease. It was found that when a mutation was introduced at a specific site, the mutant was able to spun a silk thread in which Ser1 was significantly reduced and was able to be passaged. This invention is based on the said knowledge, Comprising: The following are provided.
（１）カイコの野生型Ser1遺伝子における第２イントロンのドナー領域にスプライス変異を生じさせる1〜4個の塩基の欠失、付加及び／又は置換の変異を含むSer1変異遺伝子を有するカイコのSer1変異系統。
（２）Ser1変異遺伝子が第２エクソンの3’末端領域に1〜15個の塩基の欠失、付加及び／又は置換の変異をさらに含む、（１）に記載のSer1変異系統。
（３）第２イントロンのドナー領域に含まれるドナー部位における1塩基の欠失、及び第２エクソンの3’末端を含む連続する3塩基の欠失を含む、（２）に記載のSer1変異系統。
（４）前記ドナー部位の1塩基の欠失がドナー部位を含む連続する3塩基の欠失及び当該欠失箇所への2塩基の付加に基づく、（３）に記載のSer1変異系統。
（５）配列番号５に示す塩基配列を有する第２エクソン及び配列番号６に示す塩基配列を有する第２イントロンを含むSer1変異遺伝子を有する、（４）に記載のSer1変異系統。
（６）第２イントロンのドナー部位2塩基の欠失、並びに第２エクソンの3’末端を含む6塩基の欠失を含む、（２）に記載のSer1変異系統。
（７）前記第２エクソンにおける6塩基の欠失が第２エクソンの3’末端を含む連続する12塩基の欠失及び当該欠失箇所への6塩基の付加に基づく、（６）に記載のSer1変異系統。
（８）配列番号７に示す塩基配列を有する第２エクソン及び配列番号８に示す塩基配列を有する第２イントロンを含むSer1変異遺伝子を有する、（７）に記載のSer1変異系統。
（９）Ser1変異遺伝子がホモ接合型である、（１）〜（８）のいずれかに記載のSer1変異系統。
（１０）（９）に記載のカイコのSer1変異系統から得られる絹糸。
（１１）（１０）に記載の絹糸からセリシンを除いて得られる絹繊維。
(1) A silkworm Ser1 mutation having a Ser1 mutant gene containing a deletion, addition and / or substitution mutation of 1 to 4 bases that causes a splice mutation in the donor region of the second intron in the wild type Ser1 gene of the silkworm system.
(2) The Ser1 mutant strain according to (1), wherein the Ser1 mutant gene further comprises a deletion, addition and / or substitution mutation of 1 to 15 bases in the 3 ′ end region of the second exon.
(3) The Ser1 mutant strain according to (2), comprising a deletion of one base at the donor site contained in the donor region of the second intron and a deletion of three consecutive bases including the 3 ′ end of the second exon. .
(4) The Ser1 mutant strain according to (3), wherein the deletion of 1 base at the donor site is based on the deletion of 3 consecutive bases including the donor site and the addition of 2 bases to the deleted site.
(5) The Ser1 mutant strain according to (4), which has a Ser1 mutant gene comprising a second exon having the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 and a second intron having the base sequence shown in SEQ ID NO: 6.
(6) The Ser1 mutant strain according to (2), comprising a deletion of 2 bases of the donor site of the second intron and a deletion of 6 bases including the 3 ′ end of the second exon.
(7) The deletion of 6 bases in the second exon is based on the deletion of 12 consecutive bases including the 3 ′ end of the second exon and the addition of 6 bases to the deletion site. Ser1 mutant strain.
(8) The Ser1 mutant strain according to (7), which has a Ser1 mutant gene comprising a second exon having the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 and a second intron having the base sequence shown in SEQ ID NO: 8.
(9) The Ser1 mutant strain according to any one of (1) to (8), wherein the Ser1 mutant gene is homozygous.
(10) A silk thread obtained from the silkworm Ser1 mutant strain described in (9).
(11) A silk fiber obtained by removing sericin from the silk yarn according to (10).
本発明のカイコのSer1変異系統によれば、Ser1が欠失又はその量が減少した絹糸を吐糸する継代可能なカイコ変異系統を提供することができる。 According to the silkworm Ser1 mutant strain of the present invention, it is possible to provide a silkworm mutant strain capable of being passaged that spouts a silk thread in which Ser1 has been deleted or decreased in amount.
本発明のSer1変異系統から得られる絹糸は、野生型カイコ系統の絹糸と比較してSer1が欠失又はその量が減少していることから、絹繊維を分離、精製する際の手間やコストを削減することができる。 The silk thread obtained from the Ser1 mutant line of the present invention has Ser1 deleted or reduced in amount compared to the silk thread of the wild-type silkworm line, so that labor and cost for separating and purifying silk fibers are reduced. Can be reduced.
本発明のSer1変異系統から得られる絹糸は、Ser1が欠失又はその量が減少していることから、従来の精練方法よりも穏やかな条件で処理することができる。そのため、絹繊維であるフィブロインに組換え遺伝子技術を用いて機能性タンパク質を付加した組換えタンパク質を失活させることなく、機能性絹繊維として調製することができる。 The silk thread obtained from the Ser1 mutant line of the present invention can be treated under milder conditions than conventional scouring methods because Ser1 is deleted or the amount thereof is reduced. Therefore, it can be prepared as a functional silk fiber without inactivating a recombinant protein obtained by adding a functional protein to fibroin, which is a silk fiber, using a recombinant gene technique.
１．セリシン1変異系統
１−１．概要
本発明の第１の態様は、カイコのSer1変異系統である。本発明のSer1変異系統は、野生型Ser1遺伝子の特定の部位に変異を有するカイコ変異系統で、Ser1の量が欠失、又は著しく減少した絹糸を吐糸することができる。それ故に、営繭可能であり、裸蛹や不吐糸蚕とならずに変異系統として継代することができる。
1.
１−２．構成
「Ser1変異系統」とは、カイコの野生型Ser1遺伝子の特定の部位に変異を含むSer1変異遺伝子をゲノム上に有するカイコの変異系統をいう。
1-2. Structure “Ser1 mutant strain” refers to a silkworm mutant strain having a Ser1 mutant gene containing a mutation at a specific site in the wild-type Ser1 gene of silkworm on the genome.
カイコの野生型Ser1遺伝子は、図２及び配列番号１に示すように、9つのエクソンと8つのイントロンで構成される（ただし、配列番号１において、nで示した塩基は、塩基配列が未だ決定されておらず、a、t、g、cのいずれの塩基であるかが不明である。またセリシン1は、繰り返し配列が多く、nの数も厳密ではない。）。このうち第３〜第６エクソンは、選択的スプライシングにより様々な組み合わせで選択される。それ故に、Ser1タンパク質は、現在までに5種類のスプライスバリアント（Ser1A、Ser1A'、Ser1B、Ser1C、Ser1D)が知られている。一方、第１、第２及び第７〜第９エクソンは、全てのスプライスバリアントに存在する。また、第１及び第２エクソンは、シグナルペプチドをコードすることが知られている。
The silkworm wild-type Ser1 gene is composed of 9 exons and 8 introns as shown in FIG. 2 and SEQ ID NO: 1 (however, in SEQ ID NO: 1, the base sequence indicated by n has not been determined yet). It is not known whether the base is a, t, g, or c.
本発明のSer1変異系統が有するSer1変異遺伝子は、野生型Ser1遺伝子の特定の部位に変異を含む。この特定の部位の変異とは、第２イントロンのドナー領域に、スプライス変異を生じさせる変異をいう。本明細書で「ドナー領域」とは、ドナー部位（gt）を含むイントロンの5’末端側の連続する2〜5塩基からなる領域をいう。「スプライス変異を生じさせる変異」とは、ドナー領域内における1〜4個、好ましくは1〜3個又は1若しくは2個の塩基の欠失、付加、置換、又はそれらの組み合わせであって、正規の（オーセンティクな）スプライス部位でのスプライシングを阻害する変異をいう。通常、2塩基からなるドナー部位のいずれか一方の塩基が欠失又は置換した場合、そのドナー部位を含むイントロンのスプライシングは阻害される。したがって、本発明における「スプライス変異を生じさせる変異」は、上記ドナー領域におけるドナー部位の少なくとも一方の塩基に変異を有することが好ましい。この変異によって、Ser1変異遺伝子は、mRNAスプライシングに異常を生じる結果、Ser1変異遺伝子産物において、フレームシフト、アミノ酸配列の付加又は欠失等の変異が生じる。 The Ser1 mutant gene of the Ser1 mutant line of the present invention contains a mutation at a specific site of the wild-type Ser1 gene. The mutation at this specific site refers to a mutation that causes a splice mutation in the donor region of the second intron. In the present specification, the “donor region” refers to a region consisting of 2 to 5 consecutive bases on the 5 ′ end side of the intron including the donor site (gt). A “mutation that causes a splice mutation” is a deletion, addition, substitution, or combination of 1 to 4, preferably 1 to 3, or 1 or 2 bases in the donor region, A mutation that inhibits splicing at the (authentic) splice site. Usually, when any one base of a donor site consisting of 2 bases is deleted or substituted, splicing of an intron containing the donor site is inhibited. Therefore, the “mutation causing a splice mutation” in the present invention preferably has a mutation in at least one base of the donor site in the donor region. As a result of the mutation, the Ser1 mutant gene has an abnormality in mRNA splicing, and as a result, mutations such as frame shift, addition or deletion of amino acid sequence occur in the Ser1 mutant gene product.
Ser1変異遺伝子は、前記第２イントロンのドナー領域における変異に加えて、特定の部位の変異として第２エクソンの3’末端領域に変異をさらに含むことができる。Ser1遺伝子上で第２エクソンは、第２イントロンの5’末端側に隣接している。本明細書で「3’末端領域」とは、第２エクソンの3’末端を含む連続する1〜15塩基からなる領域をいう。また、ここでいう「変異」とは、3’末端領域内における1〜15個、好ましくは1〜12個、1〜9個、1〜6個又は1〜3個の塩基の欠失、付加、置換、又はそれらの組み合わせの変異をいう。 In addition to the mutation in the donor region of the second intron, the Ser1 mutant gene may further include a mutation in the 3 'terminal region of the second exon as a mutation at a specific site. On the Ser1 gene, the second exon is adjacent to the 5 'end of the second intron. In the present specification, the “3 ′ terminal region” refers to a region consisting of 1 to 15 bases including the 3 ′ end of the second exon. In addition, “mutation” as used herein refers to deletion or addition of 1 to 15, preferably 1 to 12, 1 to 9, 1 to 6, or 1 to 3 bases in the 3 ′ terminal region. , Substitution, or a combination thereof.
上記第２イントロン及び第２エクソンにおける変異の例として、第２イントロンのドナー領域内に含まれるドナー部位における1塩基、すなわちg（グアニン）又はt（チミン）のいずれかの欠失、及び第２エクソンの3’末端を含む連続する3塩基（ACC）の欠失を含む変異が挙げられる。このとき、第２イントロンにおける前記ドナー部位の1塩基の欠失は、ドナー領域における塩基の欠失及び付加の結果であってもよい。例えば、ドナー領域においてドナー部位を含む連続する3塩基（gtg）の欠失及び当該欠失箇所への2塩基（tt）の付加に基づき、結果として見かけ上ドナー部位の1塩基（g）のみが欠失した変異であってもよい。この変異の具体例として、配列番号５に示す塩基配列を有する第２エクソン及び配列番号６に示す塩基配列を有する第２イントロンを含むSer1変異遺伝子が挙げられる。 Examples of mutations in the second intron and the second exon include deletion of one base at the donor site contained in the donor region of the second intron, ie, either g (guanine) or t (thymine), and second A mutation containing a deletion of 3 consecutive bases (ACC) including the 3 ′ end of the exon. At this time, the deletion of one base of the donor site in the second intron may be the result of the deletion and addition of the base in the donor region. For example, based on the deletion of 3 consecutive bases (gtg) including the donor site in the donor region and the addition of 2 bases (tt) to the deleted site, only 1 base (g) of the donor site apparently appears as a result. It may be a deleted mutation. Specific examples of this mutation include a Ser1 mutant gene comprising a second exon having the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 and a second intron having the base sequence shown in SEQ ID NO: 6.
また、上記第２イントロン及び第２エクソンにおける変異の他の例として、第２イントロンのドナー部位2塩基（gt）の欠失、及び第２エクソンの3’末端を含む6塩基の欠失を含む変異が挙げられる。このとき、第２エクソンにおける6塩基の欠失は、3’末端領域における塩基の欠失及び付加の結果であってもよい。例えば、3’末端領域において3’末端を含む連続する12塩基（TCGGTCACCACC）の欠失及び当該欠失箇所への6塩基（GTAAGC）の付加に基づき、結果として見かけ上3’末端を含む6塩基のみが欠失した変異であってもよい。この変異の具体例として、配列番号７に示す塩基配列を有する第２エクソン及び配列番号８に示す塩基配列を有する第２イントロンを含むSer1変異遺伝子が挙げられる。 Other examples of mutations in the second intron and the second exon include a deletion of 2 bases (gt) of the donor site of the second intron and a deletion of 6 bases including the 3 ′ end of the second exon. Mutations. At this time, the deletion of 6 bases in the second exon may be the result of deletion and addition of bases in the 3 'terminal region. For example, based on the deletion of 12 consecutive bases (TCGGTCACCACC) including the 3 'end in the 3' end region and the addition of 6 bases (GTAAGC) to the deletion site, 6 bases apparently including the 3 'end Only the deletion may be a mutation. Specific examples of this mutation include a Ser1 mutant gene comprising a second exon having the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 and a second intron having the base sequence shown in SEQ ID NO: 8.
Ser1変異系統は、前記Ser1変異遺伝子をカイコゲノム上に1つ有するヘテロ接合型であってもよいし、2つ有するホモ接合型であってもよい。Ser1変異遺伝子ホモ接合型のカイコ由来の絹糸が、本発明の目的とする性質を有する絹糸、すなわち、Ser1が欠失又はその量が著しく減少した絹糸であることから、ホモ接合型が好ましい。一方、ヘテロ接合体は、系統維持として利用できる。 The Ser1 mutant line may be a heterozygous type having one Ser1 mutant gene on the silkworm genome or a homozygous type having two Ser1 mutant genes. Since the silk thread derived from silkworms of the Ser1 mutant gene homozygous silkworm is a silk thread having the intended properties of the present invention, that is, a silk thread in which Ser1 has been deleted or the amount thereof is significantly reduced, the homozygous type is preferred. On the other hand, heterozygotes can be used for system maintenance.
従来のカイコのSer1変異系統は、吐糸できずに死亡するため、継代維持ができなかった。しかし、本発明のカイコのSer1変異系統は、野生型Ser1遺伝子の特定の部位、すなわち、少なくとも第２イントロンのドナー部位周辺に変異を導入することで、吐糸が可能となり、前記課題を解決することができた。このような変異を有するSer1変異系統が、従来のSer1変異系統と異なり、吐糸及び継代可能となった理由は現在のところ明らかではない。 The conventional silkworm Ser1 mutant strain could not maintain the passage because it died without spitting. However, the silkworm Ser1 mutant strain of the present invention can be spun by introducing a mutation at a specific site of the wild-type Ser1 gene, that is, at least around the donor site of the second intron. I was able to. The reason why the Ser1 mutant line having such a mutation is different from the conventional Ser1 mutant line and can be spun and passaged is not clear at present.
１−３．作出方法
（１）Ser1遺伝子への変異導入
カイコの野生型Ser1遺伝子における第２イントロンのドナー領域や第２エクソンの3’末端領域への変異の導入は、当該分野で公知の遺伝子変異導入技術を用いることができる。
1-3. Production method (1) Mutation introduction into the Ser1 gene Introduction of mutations into the donor region of the second intron and the 3 'end region of the second exon in the wild type Ser1 gene of the silkworm is carried out by a gene mutation introduction technique known in the art. Can be used.
例えば、Ser1遺伝子における第２イントロンのドナー領域にスプライス変異を生じさせる1〜4個の塩基の欠失、付加及び／又は置換を導入する場合や、第２エクソンの3’末端領域に1〜15個の塩基の欠失、付加及び／又は置換を導入する場合には、TALEN（Transcription Activator-Like Effector Nuclease）（Cermak T, et al., 2011, Nucleic Acids Res 39: e82）、ZFN（Zinc Finger Nuclease）（Kim, Y.-G., et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:1156-1160.）、又はCRISPR/Cas9システム（Cong, L. et al., 2013, Science, 339, 819-823.）のようなゲノム編集技術を用いればよい。これらの技術は、目的とする生物のゲノム上の所望の配列を切断して変異を導入することができる。例えば、TALENを用いる場合であれば、Ser1遺伝子の第２エクソンの3’末端領域及び第２イントロンのドナー領域のセンス鎖及びアンチセンス鎖のそれぞれを標的とするDNA塩基配列認識部位（リピート部位）を構築し、TALEN発現ベクター内に挿入する。続いて、調製したTALEN発現ベクターからin vitro転写法によってTALEN mRNAを合成した後、カイコの発生初期卵にインジェクションすればよい。なお、後述する実施例１でTALENを用いたSer1遺伝子への変異導入の具体例を示している。 For example, when introducing a deletion, addition and / or substitution of 1 to 4 bases causing a splice mutation in the donor region of the second intron in the Ser1 gene, or 1 to 15 in the 3 ′ end region of the second exon. When introducing single base deletions, additions and / or substitutions, TALEN (Transcription Activator-Like Effector Nuclease) (Cermak T, et al., 2011, Nucleic Acids Res 39: e82), ZFN (Zinc Finger Nuclease) (Kim, Y.-G., et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1156-1160.) Or the CRISPR / Cas9 system (Cong, L. et al., 2013, Science, 339, 819-823.). These techniques can introduce a mutation by cleaving a desired sequence on the genome of a target organism. For example, when TALEN is used, DNA base sequence recognition sites (repeat sites) targeting the sense strand and antisense strand of the 3 ′ end region of the second exon of Ser1 gene and the donor region of the second intron, respectively. Is inserted into the TALEN expression vector. Subsequently, TALEN mRNA is synthesized from the prepared TALEN expression vector by an in vitro transcription method, and then injected into an early egg of silkworm development. A specific example of mutation introduction into the Ser1 gene using TALEN is shown in Example 1 described later.
また、Ser1遺伝子における第２エクソンの3’末端領域や第２イントロンのドナー領域に特定の塩基配列を有する変異を導入する場合、具体的には、例えば、第２エクソンの3’末端領域に配列番号５に示す塩基配列を有する欠失変異を、また第２イントロンのドナー領域に配列番号６に示す塩基配列を有する欠失及び付加変異を、導入する場合には、例えば、一本鎖DNAをドナーとする相同組換え法が利用できる（Chen, F., et al., 2011 Nat. Methods 9:753-755.）。この方法は、TALEN mRNA及びTALENによる切断部位近傍配列のそれぞれに相同性を有する数十塩基の一本鎖DNAを宿主カイコに同時にインジェクションすることによって、その一本鎖DNAをゲノムの目的の位置に挿入する方法である。カイコゲノム内へのSer1変異遺伝子導入は、変異Ser1遺伝子を有するプラスミドベクターを水やバッファー等の溶媒によって溶解又は希釈して、投与溶液を調製し、その投与溶液にトランスポゾン転移酵素をコードするDNAを有するヘルパーベクターを加えて、カイコの発生初期卵にインジェクションすればよい。また、変異を導入するカイコがヘルパーベクターを既に有する場合には、前記投与溶液をそのままカイコの発生初期卵にインジェクションすればよい。その後、プラスミドベクター中の選抜マーカーに基づいて形質転換体を選抜することによって、目的のSer1変異系統を得ることができる。 In addition, when a mutation having a specific base sequence is introduced into the 3 ′ end region of the second exon or the donor region of the second intron in the Ser1 gene, specifically, for example, the sequence is inserted into the 3 ′ end region of the second exon. When introducing a deletion mutation having the nucleotide sequence shown in No. 5 and a deletion and addition mutation having the nucleotide sequence shown in SEQ ID No. 6 into the donor region of the second intron, for example, a single-stranded DNA is introduced. Homologous recombination methods can be used as donors (Chen, F., et al., 2011 Nat. Methods 9: 753-755.). In this method, TALEN mRNA and a single-stranded DNA having several tens of bases having homology to sequences near the cleavage site by TALEN are simultaneously injected into the host silkworm, thereby bringing the single-stranded DNA into the target position of the genome. How to insert. Ser1 mutant gene introduction into the silkworm genome is prepared by dissolving or diluting a plasmid vector having a mutated Ser1 gene with a solvent such as water or a buffer to prepare an administration solution, and the administration solution has DNA encoding a transposon transferase. What is necessary is just to add a helper vector and inject | pour into the egg development initial stage egg. In addition, when the silkworm into which the mutation is introduced already has a helper vector, the administration solution may be injected as it is into the silkworm initial egg. Thereafter, the desired Ser1 mutant strain can be obtained by selecting a transformant based on the selection marker in the plasmid vector.
（２）Ser1変異系統ホモ接合型個体の作出
（１）でSer1変異遺伝子を導入したカイコでは、Ser1変異遺伝子がヘテロ接合型となっていることから、必要に応じて、Ser1変異遺伝子のホモ接合型個体を得てもよい。ホモ接合型個体は、同系交配又は兄妹交配を行い、指標となる形質に基づいて目的のホモ接合型個体を選抜すればよい。なお、本明細書において「同系交配」（sib mating）とは、対象とする変異遺伝子（ここではSer１変異遺伝子）が同一である個体間の交配をいう。また、「兄妹交配」とは、同腹の雌雄どうしで行う同系交配をいう。
(2) Creation of Ser1 mutant strain homozygous individuals In silkworms that have introduced the Ser1 mutant gene in (1), the Ser1 mutant gene is heterozygous. Type individuals may be obtained. A homozygous individual may be inbred or sibling mated, and the target homozygous individual may be selected based on the trait that serves as an index. In the present specification, “sib mating” refers to mating between individuals having the same target mutant gene (here, Ser1 mutant gene). In addition, “brother and sister mating” refers to inbred mating between males and females of the same litter.
１−４．効果
本発明のカイコのSer1変異系統によれば、Ser1が欠失又はその量が著しく減少した絹糸を吐糸できる。それ故に、営繭が可能であり、また継代によって系統維持が可能なカイコ変異系統を提供することができる。
1-4. Effect According to the silkworm Ser1 mutant strain of the present invention, silk thread in which Ser1 is deleted or the amount thereof is significantly reduced can be spun. Therefore, it is possible to provide a silkworm mutant strain that can be managed and can be maintained by passage.
２．絹糸
２−１．概要
本発明の第２の態様は、絹糸である。本発明の絹糸は、前記第１態様に記載のカイコのSer1変異系統におけるホモ接合型個体に由来する絹糸である。
2. Silk thread 2-1. Outline | summary The 2nd aspect of this invention is a silk thread. The silk thread of the present invention is a silk thread derived from a homozygous individual in the silkworm Ser1 mutant strain described in the first aspect.
２−２．構成
本発明の絹糸は、前記カイコのSer1変異系統のホモ接合型個体が吐糸する絹糸である。
本明細書において「絹糸」とは、カイコが吐糸する繊維状のタンパク質複合体をいう。野生型の絹糸は、繊維成分であるフィブロインとそのフィブロインを被覆する水溶性の糊状成分であるセリシンから構成される。フィブロインは、フィブロインH鎖（Fib H)、フィブロインL鎖（Fib L)及びp25/FHX（p25）の3つのタンパク質がFib H：Fib L：p25＝6:6:1の比率で複合体（silk fibroin elementary unit； SFEU複合体）を形成して構成される。セリシンは、現在Ser1、Ser2又はSer3の3種類が知られており、繭糸にはSer1及びSer3が、幼虫期の足場糸にはSer2が含まれる。
2-2. Configuration The silk thread of the present invention is a silk thread spun by a homozygous individual of the silkworm Ser1 mutant strain.
In the present specification, “silk thread” refers to a fibrous protein complex spun by silkworms. Wild-type silk thread is composed of fibroin, which is a fiber component, and sericin, which is a water-soluble paste-like component that covers the fibroin. Fibroin is a complex of three proteins, fibroin H chain (Fib H), fibroin L chain (Fib L) and p25 / FHX (p25), in a ratio of Fib H: Fib L: p25 = 6: 6: 1 (silk fibroin elementary unit (SFEU complex). Three types of sericin are currently known, Ser1, Ser2 or Ser3, and Ser1 and Ser3 are included in the silk thread, and Ser2 is included in the scaffold thread in the larval stage.
本明細書における絹糸は、原則として、乾繭、及び煮繭後に製糸した状態の絹糸であって、精練処理を行っていない生糸である。 The silk thread in this specification is a raw silk thread that has been produced after drying and boiling as a rule, and has not been subjected to scouring.
本発明の絹糸は、Ser1変異系統のホモ接合型個体に由来する絹糸であることから、野生型のカイコ絹糸と比較して、セリシン1が欠失しているか、又はその量が著しく少ないことを特徴とする。
Since the silk thread of the present invention is a silk thread derived from a homozygous individual of the Ser1 mutant line, the
２−３．効果
本発明の絹糸は、野生型カイコ系統の絹糸と比較して糊状成分であるセリシン1が欠失しているか、又はその量が著しく減少していることから、セリシンの溶解性が向上しており、煮繭条件を従来の条件よりも緩和することが可能となる。それによって、加熱に要するコストを低減し、また製糸作業の手間を軽減することができる。
2-3. Effect Since the silk thread of the present invention lacks or significantly reduces the amount of
また本発明の絹糸は、絹糸から絹繊維を分離、精製する際の精練工程における温度やアルカリ度を低く設定することができる。それによって、精練工程における加熱量、加熱時間及び精練に用いたアルカリ溶液の排水の処理量を低減し、精練作業の手間を軽減することが可能となる。 Moreover, the silk thread of this invention can set the temperature and alkalinity in a scouring process when separating and purifying silk fibers from silk thread to a low level. Thereby, it is possible to reduce the amount of heating in the scouring process, the heating time, and the amount of drainage of the alkaline solution used for scouring, thereby reducing the labor of the scouring work.
本発明の絹糸が機能性絹繊維を含む場合、従来法よりも穏やかな精練条件で、機能性絹繊維が有する機能を失活させることなく絹繊維を分離、精製することができる。 When the silk thread of the present invention contains a functional silk fiber, the silk fiber can be separated and purified under mild scouring conditions as compared with the conventional method without deactivating the function of the functional silk fiber.
３．絹繊維
３−１．概要
本発明の第３の態様は、絹繊維である。本発明の絹繊維は、前記第２態様における絹糸からセリシンを除いて得られる。
3. Silk fiber 3-1. Outline | summary The 3rd aspect of this invention is a silk fiber. The silk fiber of the present invention is obtained by removing sericin from the silk thread in the second embodiment.
３−２．構成
本発明の絹繊維は、第２態様の絹糸を処理して得られる絹繊維をいう。
本明細書において「絹繊維」とは、前記絹糸に対して精練処理等を行い、セリシンを除去した残りの成分をいう。この残りの成分の多くは、絹糸の繊維成分であるフィブロインである。本発明の絹繊維において、セリシンは完全に除去されていてもよいし、一部が残っていてもよい。
3-2. Structure The silk fiber of this invention says the silk fiber obtained by processing the silk thread of a 2nd aspect.
In the present specification, the “silk fiber” refers to a remaining component obtained by scouring the silk thread and removing sericin. Much of this remaining component is fibroin, the fiber component of silk. In the silk fiber of the present invention, sericin may be completely removed or a part thereof may remain.
本発明の絹繊維は、機能性絹繊維を包含する。本明細書において「機能性絹繊維」とは、遺伝子組み換え技術を用いて目的の機能を付加した組換えフィブロインをいう。目的の機能を付加したフィブロインとは、変異を導入したフィブロインや他のタンパク質を融合したフィブロイン等をいう。例えば、蛍光タンパク質と融合させた蛍光フィブロイン（蛍光シルク）が挙げられる。 The silk fiber of the present invention includes a functional silk fiber. In the present specification, the “functional silk fiber” refers to a recombinant fibroin to which a target function is added using a gene recombination technique. Fibroin added with a target function refers to fibroin into which mutations have been introduced, fibroin fused with other proteins, and the like. An example is fluorescent fibroin (fluorescent silk) fused with a fluorescent protein.
３−３．効果
本発明の絹繊維によれば、遺伝子組み換え技術により付加的な機能を付与された機能性絹繊維を、その機能を失うことなく提供することができる。
3-3. Effect According to the silk fiber of the present invention, a functional silk fiber provided with an additional function by a genetic recombination technique can be provided without losing its function.
＜Ser１変異系統の作出＞
（目的）
カイコゲノム上のSer1遺伝子における第２エクソンの3’末端領域及び第２イントロンのドナー領域にTALENを用いて変異導入し、本発明のカイコのSer1変異系統を作出する。
<Creation of Ser1 mutant strain>
(the purpose)
Mutation is introduced into the 3 ′ end region of the second exon and the donor region of the second intron in the Ser1 gene on the silkworm genome using TALEN, thereby producing the silkworm Ser1 mutant strain of the present invention.
（方法及び結果）
（１）カイコ系統及び飼育
カイコ系統には、茨城県農業生物資源研究所（日本）の遺伝子組換えカイコ研究開発ユニットで保存されている白眼非休眠系統（w1-pnd）を用いた。カイコの飼育には人工飼料
として、桑葉含有率の低いシルクメイトL4M（日本農産工業）又は桑葉含有率の高い原蚕種1〜3齢用（日本農産工業）、あるいは桑葉を用いた。
(Method and result)
(1) Silkworm strain and breeding The white-eye non-dormant strain (w1-pnd) preserved by the transgenic silkworm research and development unit of the Ibaraki Prefectural Agricultural and Bioresource Research Institute (Japan) was used as the silkworm strain. Silk mate L4M (Nippon Agricultural Industry) with a low mulberry leaf content, or 1 to 3 years old potato species with a high mulberry leaf content (Nippon Agricultural Industry), or mulberry leaf was used as an artificial feed for raising silkworms.
（２）TALEN標的部位の決定とTALEN発現用プラスミドの構築
Ser1遺伝子（図２A）は9個のエクソンを有し、選択的スプライシングによって少なくとも5種類のスプライスバリアントを生じる（図２B）。Ser1の全てのスプライスバリアントに対して変異を生じさせ、かつ機能的な領域を除去するために、全てのスプライスバリアントに共通する第２エクソンの3’末端領域及び第２イントロンのドナー領域をTALENの標的部位とした（図３）。第２エクソンの3’末端領域認識側（図３のI）を認識するTALENのDNA塩基配列認識部位の塩基配列を配列番号９に、また第２イントロンのドナー領域認識側（図３のII）を認識するTALENのDNA塩基配列認識部位の塩基配列を配列番号１０に示す。なお、標的部位周辺に位置する制限酵素AleIの認識配列（図３下線部）を変異導入の有無の判定に用いた。
(2) Determination of TALEN target site and construction of TALEN expression plasmid
The Ser1 gene (FIG. 2A) has 9 exons and produces at least 5 splice variants by alternative splicing (FIG. 2B). In order to mutate all the splice variants of Ser1 and remove the functional region, the 3 ′ terminal region of the second exon and the donor region of the second intron common to all the splice variants are changed to TALEN The target site was used (FIG. 3). The base sequence of the DNA base sequence recognition site of TALEN that recognizes the 3 ′ end region recognition side of the second exon (I in FIG. 3) is SEQ ID NO: 9, and the donor region recognition side of the second intron (II in FIG. 3). SEQ ID NO: 10 shows the base sequence of the DNA base sequence recognition site of TALEN that recognizes. In addition, the recognition sequence of the restriction enzyme AleI located in the vicinity of the target site (underlined part in FIG. 3) was used to determine the presence or absence of mutation introduction.
TALENのDNA塩基配列認識部位のクローニングは、Golden gate assembly kit（Addgene）を用いてCermak et al.(前述)の方法に従った。DNA認識部位以外の部分については、発明者らが構築したカイコ用TALEN発現ベクターpBlue-TALを用いた（Takasu Y, 2013., PLOS ONE 8: 9, e73458）。構築したTALEN発現用プラスミドの概念図を図４Aに、また第２エクソンの3’末端領域に対するTALENのアミノ酸配列を図４Bに示す。その後、HiSpeed Plasmid Midi kit（Qiagen）を用いてTALEN発現用プラスミドを精製した後、制限酵素Xba I（タカラバイオ）で処理して直鎖状にして、常法によりプロテイナーゼK処理を行い、RNaseや不純タンパク質を除去した。続いて、フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール (25:24:1)処理によりプロテイナーゼKを失活させ、クロロホルム処理、エタノール沈殿処理、70%エタノールでの洗浄処理を行った。減圧乾燥後に精製した直鎖状TALEN発現用プラスミドを得た。 Cloning of the DNA base sequence recognition site of TALEN was performed according to the method of Cermak et al. (Described above) using a Golden gate assembly kit (Addgene). For the parts other than the DNA recognition site, the silkworm TALEN expression vector pBlue-TAL constructed by the inventors was used (Takasu Y, 2013., PLOS ONE 8: 9, e73458). FIG. 4A shows a conceptual diagram of the constructed TALEN expression plasmid, and FIG. 4B shows the amino acid sequence of TALEN for the 3'-terminal region of the second exon. Then, after purifying the TALEN expression plasmid using the HiSpeed Plasmid Midi kit (Qiagen), it was treated with restriction enzyme Xba I (Takara Bio) to form a linear form, followed by proteinase K treatment by a conventional method, and RNase or Impure protein was removed. Subsequently, proteinase K was inactivated by treatment with phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24: 1), followed by chloroform treatment, ethanol precipitation treatment, and washing treatment with 70% ethanol. A linear TALEN expression plasmid purified after drying under reduced pressure was obtained.
（３）TALEN mRNAの調製
得られた直鎖状TALEN発現用プラスミド1μgを鋳型DNAとして、mMESSAGE mMACHINE kit（life technologies）を用いてTALENのmRNAを調製した。mRNAの精製は、キットに添付の説明書に従って、LiCl沈殿法により行った。
(3) Preparation of TALEN mRNA TALEN mRNA was prepared using mMESSAGE mMACHINE kit (life technologies) using 1 μg of the obtained linear TALEN expression plasmid as template DNA. mRNA was purified by LiCl precipitation according to the instructions attached to the kit.
（４）マイクロインジェクション
得られたTALENのmRNAを0.5μg/μLとなるようインジェクションバッファー（5 M KCl, 0.5 mM リン酸緩衝液pH7.0）に溶解した後、産下後5〜8時間のカイコ受精卵にTamura et al.(上述)の方法に従って3-5 nLをインジェクションした。その後、25℃でインキュベートして孵化させた。幼虫は、人工飼料シルクメイト原蚕種1〜3齢用（日本農産工業）を用いて飼育した。
(4) Microinjection The TALEN mRNA obtained was dissolved in an injection buffer (5 M KCl, 0.5 mM phosphate buffer pH 7.0) to a concentration of 0.5 μg / μL, and then silkworms 5 to 8 hours after delivery. Fertilized eggs were injected with 3-5 nL according to the method of Tamura et al. Then, it incubated at 25 degreeC and hatched. Larvae were bred using artificial feed
（５）カイコ受精卵のサンプリングアッセイ
Ser1遺伝子のノックアウト効率の高い蛾区のみを選抜するために、以下の方法でサンプリングアッセイを実施した。まず、上記インジェクション後に飼育して得られたTALEN処理カイコG0（Generation 0）成虫どうしを交配させて、比較的産卵数の多い12蛾区を選択した。それぞれの蛾区から得られた孵化直前のG1卵（Generation 1)を採取し、そのうち50卵を用いてDNAzol（Life technologies）又はBlood and tissue genomic DNA extractionminiprep system（Viogene）を用いてゲノムDNAを抽出した。具体的な抽出方法については、それぞれに添付の説明書に従った。抽出したゲノムDNA 25ngを鋳型DNAとして、配列番号１４及び配列番号１５に示すプライマーセット及びKOD FX Neo（Toyobo）を用いて、Ser1における標的部位を含む435塩基の領域をPCRにより増幅した。得られた増幅産物を制限酵素AleIで処理した後、アガロースゲル（0.8% SeaKem GTG, 2.4% NuSieve GTG）電気泳動によりDNA断片を分析した。蛾区ごとのPCR増幅産物のAleIによる切断に基づいて、TALENによるSer1遺伝子への変異導入効率を検証した。
(5) Sampling assay of silkworm fertilized eggs
Sampling assay was performed by the following method in order to select only the cocoon ward with high knockout efficiency of Ser1 gene. First, TALEN-treated silkworm G 0 (Generation 0) adults obtained by breeding after the injection were crossed to select 12 cocoons having a relatively large number of eggs. G 1 eggs (Generation 1) immediately before hatching obtained from each cocoon are collected, and 50 of those eggs are used to collect genomic DNA using DNAzol (Life technologies) or Blood and tissue genomic DNA extraction miniprep system (Viogene). Extracted. The specific extraction method was in accordance with the instructions attached to each. Using the extracted genomic DNA 25 ng as a template DNA, a region of 435 bases including the target site in Ser1 was amplified by PCR using the primer set shown in SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15 and KOD FX Neo (Toyobo). The obtained amplified product was treated with the restriction enzyme AleI, and then the DNA fragment was analyzed by agarose gel (0.8% SeaKem GTG, 2.4% NuSieve GTG) electrophoresis. Based on the cleavage of PCR amplification products in each cocoon with AleI, the efficiency of mutagenesis into Ser1 gene by TALEN was verified.
結果を図５に示す。PCR増幅産物は、選択した12蛾区の全てにおいて切断されなかった。これは、TALENにより全ての蛾区でSer1遺伝子に変異が導入されたことを示している。各蛾区の残りのG1卵を25℃でインキュベートしてG1カイコを孵化させた後、幼虫を人工飼料シルクメイト原蚕種1〜3齢用（日本農産工業）を用いて飼育した。
The results are shown in FIG. The PCR amplification product was not cleaved in all 12 selected sections. This indicates that TALEN introduced a mutation in the Ser1 gene in all cocoons. The remaining G 1 eggs in each cocoon section were incubated at 25 ° C. to hatch G 1 silkworms, and then the larvae were bred using the artificial diet
（６）G1カイコにおける繭形状及び絹糸中のSer1量
飼育したG1カイコに営繭させ、その繭形状を分類すると共に、繭を構成する絹糸に含まれるSre1量をSDS-PAGEで検証した。なお、G1段階では、各蛾区に複数の種類のSer1変異遺伝子および正常型遺伝子が混在している可能性があり、これらの遺伝子型についてホモ接合型個体及びヘテロ接合型個体が混在している。
(6) is営繭the cocoon shape and Ser1 amount reared G 1 silkworm in silk in G 1 silkworm, it categorizes the cocoon shape, a Sre1 amount contained in silk constituting the cocoon was verified by SDS-PAGE. In of G 1 phase, may Ser1 mutant gene and the normal-type gene of a plurality of types each moth Ward are mixed, homozygous individuals and heterozygous individuals for these genotypes mixed Yes.
I. 繭形状による分類
12蛾区のうち2蛾区（52-2及び52-4）を選択し、各蛾区で15頭のG1個体における営繭状態を確認した。営繭状態は、野生型カイコの繭と外見上の差異がほとんど見られない正常繭、野生型カイコの繭と比較して明らかに薄い薄皮繭、営繭せずに蛹化する裸蛹、及び吐糸できずに終齢幼虫のまま死亡する不吐糸蚕の4種に分類した。
I. Classification by ridge shape
Select 12 2 moths District of moths Ward (52-2 and 52-4) were confirmed営繭condition in G 1 individual 15 animals in each moth Ward. As for the state of pupa, normal pupae with almost no difference in appearance from pupae of wild-type silkworms, apparently thin skin pupae compared to pupae of wild-type silkworms, bare pupae that hatch without pupae, and spun yarn It was classified into four types of unemerged spiders that could not die and remained dead larvae.
II. SDS-PAGE
前記繭形状による分類で正常繭又は薄皮繭を形成したカイコが実際にSer1を欠失又はその量を減少した絹糸を吐糸しているか否かを確認するために、SDS-PAGEを行った。まず、繭内の蛹を取り出して保管し、得られた繭の繭層切片約30 mgを80℃に熱した1% 2-メルカプトエタノール含有8 M尿素水溶液に浸漬した。2〜3分間撹拌しながらセリシンを絹糸から抽出する処理を行った。得られた抽出液を20,000×gで2分間遠心分離し、25μLの上清に25μLのサンプルバッファー（0.1 M Tris HCl pH6.8, 1% SDS, 0.05% BPB, 1% 2-メルカプトエタノール）を混合して99℃で5分間加熱して、SDS-PAGE用試料とした。対照用として野生型カイコから得られた繭層切片を用いて、上記と同じ処理を行った。SDS-PAGEは、Green, MR and Sambrook, J, (2012) Molecular Cloning: A Laboratory Manual Fourth Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New Yorkに記載の方法を参照した。泳動には5%の均一ゲルを用い、分子量マーカーとしてプレシジョン Plus プロテイン未着色スタンダード（Bio Rad）を使用した。泳動後のゲルをクマシーブリリアントブルーで染色した。
II. SDS-PAGE
In order to confirm whether silkworms that formed normal wings or thin wings by classification based on the cocoon shape actually spun silks with Ser1 deleted or reduced in quantity, SDS-PAGE was performed. First, the cocoon in the cocoon was taken out and stored, and about 30 mg of cocoon layer slices of the obtained cocoon were immersed in an 8 M urea aqueous solution containing 1% 2-mercaptoethanol heated to 80 ° C. The sericin was extracted from the silk thread while stirring for 2 to 3 minutes. The resulting extract is centrifuged at 20,000 × g for 2 minutes, and 25 μL of the sample buffer (0.1 M Tris HCl pH6.8, 1% SDS, 0.05% BPB, 1% 2-mercaptoethanol) is added to the 25 μL supernatant. The mixture was mixed and heated at 99 ° C. for 5 minutes to prepare a sample for SDS-PAGE. As a control, the same treatment as described above was performed using a cocoon slice obtained from a wild-type silkworm. For SDS-PAGE, the method described in Green, MR and Sambrook, J, (2012) Molecular Cloning: A Laboratory Manual Fourth Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York was referred. A 5% homogeneous gel was used for electrophoresis, and Precision Plus protein uncolored standard (Bio Rad) was used as a molecular weight marker. The gel after electrophoresis was stained with Coomassie Brilliant Blue.
G1カイコの繭形状による分類結果を図６に、また各繭のSDS-PAGEの結果を図７に示す。なお、図６では、図７のSDS-PAGEで判明した正常繭及び薄皮繭におけるSer1量の結果を「Ser1欠失・減少」及び「Ser1正常」と表記して反映させている。 FIG. 6 shows the result of classification of the G 1 silkworm by the cocoon shape, and FIG. 7 shows the result of SDS-PAGE of each cocoon. In FIG. 6, the results of Ser1 amount in normal wrinkles and thin skin wrinkles found by SDS-PAGE in FIG. 7 are reflected as “Ser1 deletion / decrease” and “Ser1 normal”.
図６Aで示すように、52-2蛾区では15個体中5個体が営繭し、そのうち3個体は正常繭、2個体は薄皮繭であった。ここで、図７に示すように正常繭3個体（52-2-1〜52-2-3）は、野生型の繭と同程度のSer1量が検出され、Ser1変異を有するもののSer1量に変化がないことが明らかとなった。一方、図７に示すように薄皮繭2個体（52-2-4〜52-2-5）は、Ser1量が著しく減少していた。したがって、これら2個体に対応する上記保管した蛹を、目的の変異を有するSer1変異個体として分離した。また、52-4蛾区では15個体中11個体が営繭し、そのうち5個体は正常繭、6個体は薄皮繭であった。図７に示すように、営繭した全ての繭の個体（52-4-1〜52-4-11；52-4-11のみ図示せず）でSer1量が著しく減少していた。したがって、これら11個体に対応する上記保管した蛹も、目的の変異を有するSer1変異個体として分離した。 As shown in FIG. 6A, 5 out of 15 individuals managed in the 52-2 蛾 ward, of which 3 individuals were normal pupae and 2 were thin skin pupae. Here, as shown in FIG. 7, three normal cocoon individuals (52-2-1 to 52-2-3) detected Ser1 amount similar to that of the wild type cocoon, and the Ser1 amount of the one having Ser1 mutation was detected. It became clear that there was no change. On the other hand, as shown in FIG. 7, the amount of Ser1 was remarkably decreased in the two thin skin folds (52-2-4 to 52-2-5). Therefore, the stored cocoons corresponding to these two individuals were isolated as Ser1 mutant individuals having the target mutation. In 52-4 IV, 11 out of 15 individuals managed, 5 of which were normal and 6 were thin skin. As shown in FIG. 7, the amount of Ser1 was remarkably decreased in all pupae individuals managed (52-4-1 to 52-4-11; only 52-4-11 not shown). Therefore, the stored cocoons corresponding to these 11 individuals were also isolated as Ser1 mutant individuals having the target mutation.
（７）Ser1変異遺伝子の塩基配列決定
上記（６）で分離したSer1変異体個体の蛹を羽化させて、得られたG1カイコ成虫におけるSer1変異遺伝子のTALENの標的部位における塩基配列を決定した。
(7) Determination of the base sequence of the Ser1 mutant gene The cocoon of the Ser1 mutant individual isolated in (6) above was emerged, and the base sequence of the TALEN target site of the Ser1 mutant gene in the resulting G 1 silkworm adult was determined. .
試料には、羽化したカイコ成虫の脚を1本採取して用いた。80μLのDNAzol（life technologies）で、添付の説明書に従って前記試料からカイコゲノムDNAを抽出した。Ser1遺伝子配列が明らかにされるまで、カイコ成虫は未交配のまま5℃で冷蔵保存した。続いて、抽出したゲノムDNA 25ngを鋳型DNAとして、配列番号１６及び配列番号１７に示すプライマーセット及びKOD FX Neo（Toyobo）を用いて、標的配列を含む187bpの領域をPCRにより増幅した後、ダイレクトシークエンスを行った。塩基配列決定は、上記配列番号１６及び配列番号１７に示すDNAをセンス鎖及びアンチセンス鎖のプライマーとしてBigDye terminator cycle sequence kit ver. 3.1（life technologies）を用いて添付の説明書に従って、ABI Prism 377（life technologies）で分析した。対照用として、野生型カイコ個体、及び52-2蛾区における正常繭由来の個体（52-2 Cont)を用いた。 As a sample, a single leg of an adult silkworm was collected and used. Silkworm genomic DNA was extracted from the sample with 80 μL of DNAzol (life technologies) according to the attached instructions. Until the Ser1 gene sequence was revealed, adult silkworms were stored refrigerated at 5 ° C. without mating. Subsequently, using the extracted genomic DNA 25 ng as a template DNA, the 187 bp region containing the target sequence was amplified by PCR using the primer set shown in SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 17 and KOD FX Neo (Toyobo). The sequence was performed. The nucleotide sequence was determined using ABI Prism 377 according to the attached instructions using BigDye terminator cycle sequence kit ver. 3.1 (life technologies) using the DNAs shown in SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 17 as primers for the sense strand and the antisense strand. (Life technologies) As controls, wild-type silkworm individuals and individuals derived from normal silkworms (52-2 Cont) in the 52-2 cocoon section were used.
図８に結果を示す。この図では、TALENの標的部位を含むSer1遺伝子の第２エクソン全長及び第２イントロンの5’領域の一部を示している。52-2蛾区及び52-4蛾区のG1カイコは、いずれもSer1遺伝子の第２エクソンの3’末端領域及び／又は第２イントロンのドナー領域に欠失、付加の変異を生じていた。一方、52-2 Contも、Ser1遺伝子の第２エクソンの3’末端領域に欠失を生じた。前述のように、52-2蛾区及び52-4蛾区のG1カイコはSer1量の著しく減少した繭を営繭したのに対して、52-2 Contは、野生型の繭と同程度のSer1量を有する繭を営繭した。この結果は、Ser1変異遺伝子であっても、第２イントロンのドナー領域にスプライス変異を生じさせる変異を有する場合に、Ser1量が著しく減少した絹糸を吐糸することができることを示している。 The results are shown in FIG. In this figure, the second exon full length of the Ser1 gene including the target site of TALEN and a part of the 5 ′ region of the second intron are shown. The G 1 silkworms in 52-2 and 52-4 have both deletion and addition mutations in the 3 ′ end region of the second exon of the Ser1 gene and / or the donor region of the second intron. . On the other hand, 52-2 Cont also had a deletion in the 3 ′ end region of the second exon of the Ser1 gene. As described above, while the 52-2 G 1 silkworm moth Ward and 52-4 moth Ward was営繭significantly reduced cocoons Ser1 amount, 52-2 Cont is the wild-type cocoon and comparable I managed a cocoon with Ser1 amount. This result shows that even if the Ser1 mutant gene has a mutation that causes a splice mutation in the donor region of the second intron, a silk thread in which the amount of Ser1 is significantly reduced can be spun.
（８）Ser1変異系統G3ホモ接合型個体の作出
上記（７）で得られた52-2蛾区由来のSer1変異遺伝子を有するG1カイコ成虫を野生型と交配し、Ser1変異遺伝子のヘテロ接合型G2カイコを得た。続いて、G2カイコどうしを交配して、G3カイコを得た。このG3カイコ集団には、52-2蛾区由来のSer1変異ホモ接合型個体が理論上25％含まれる。営繭したG3カイコから蛹を取り出して繭を保存し、羽化した複数のG3カイコ成虫から脚を1本採取して、（７）と同様の方法でゲノムDNAを抽出した後、Ser1変異遺伝子のTALENの標的部位における塩基配列をダイレクトシークエンスを行って確認した。Ser1変異遺伝子をホモ接合で有する個体を選抜し、実施例１と同様の方法で、繭を構成する絹糸中のSer1量をSDS-PAGEで分析した。
(8) Ser1 the G 1 silkworm adults with Ser1 mutant gene from 52-2 moth ku obtained in mutant lines G 3 homozygous individuals produced above (7) and crossed with wild-type, Ser1 heterozygous mutant gene Junction type G 2 silkworm was obtained. Subsequently, G 2 silkworms were crossed to obtain G 3 silkworms. This G 3 silkworm population theoretically contains 25% of Ser1 mutant homozygous individuals derived from 52-2 silkworms. Save the cocoon extracts the pupae from営繭the G 3 silkworm, a leg of a plurality of G 3 silkworm adults that emerged with one collected, after extracting the genomic DNA in the same manner as in (7), Ser1 mutant gene The base sequence at the target site of TALEN was confirmed by direct sequencing. Individuals having a homozygous Ser1 mutant gene were selected, and the amount of Ser1 in the silk constituting the cocoon was analyzed by SDS-PAGE in the same manner as in Example 1.
結果を図９に示す。52-2蛾区由来のSer1変異遺伝子を有するカイコのG3ホモ接合型個体も絹糸中のSer1量が著しく減少していることが確認された。これにより、本発明のSer1変異は、ヘテロ接合体で維持可能であり、ホモ接合体にすることでSer1量が著しく減少した繭を得ることができることが立証された。 The results are shown in FIG. Also G 3 homozygous individuals silkworm comprising a Ser1 mutant gene from 52-2 moth Ward that Ser1 amount in silk is significantly reduced was confirmed. Thus, it was proved that the Ser1 mutation of the present invention can be maintained in a heterozygote and can be obtained as a homozygote to obtain a sputum in which the amount of Ser1 is significantly reduced.
また、上記（７）で得られた52-4蛾区由来のSer1変異遺伝子を有するG1カイコ成虫どうしを交配し、Ser1変異遺伝子についてホモ接合型G2カイコを得た。同腹のG2カイコどうしを兄妹交配して得られたホモ接合型G3カイコを飼育して34頭に営繭させ、その繭形状を（６）と同様の方法で分類した。 Further, by crossing the G 1 silkworm adults each other with a Ser1 mutant gene from 52-4 moth ku obtained in (7), to obtain a homozygous G 2 silkworms for Ser1 mutated gene. Homozygous G 3 silkworms obtained by mating siblings of G 2 silkworms were reared and bred into 34 heads, and the shape of the cocoons was classified by the same method as in (6).
結果を図１０に示す。ほとんどの個体が正常繭又は薄皮繭を営繭することができた。そこで、これらのホモ接合型G3カイコの繭について（６）と同様の方法で絹糸中のSer1量をSDS-PAGEで分析した。その結果、正常繭又は薄皮繭は、全て絹糸中のSer1量が著しく減少していることが確認された。一部の個体のSDS-PAGE分析の結果を図９に示す。この図では、52-4蛾区由来のホモ接合型G3カイコにおける正常繭を示している。これらの結果から、52-4蛾区由来のSer1変異遺伝子を有するカイコのG3ホモ接合型個体も絹糸中のSer1量が著しく減少していることが確認された。また、52-4蛾区由来のSer1変異系統は、ホモ接合型での継代が可能であることが立証された。 The results are shown in FIG. Most individuals were able to manage normal or thin skin wrinkles. Accordingly, the amount of Ser1 in the silk thread was analyzed by SDS-PAGE in the same manner as in (6) for these homozygous G 3 silkworm cocoons. As a result, it was confirmed that the amount of Ser1 in the silk thread was remarkably decreased in all the normal wrinkles or thin skin wrinkles. The result of SDS-PAGE analysis of some individuals is shown in FIG. This figure shows normal cocoons in homozygous G 3 silkworms derived from 52-4 silkworms. From these results, it was confirmed that Ser1 amount of G 3 homozygous individuals also in silk silkworm having Ser1 mutant gene from 52-4 moth Ward is significantly reduced. Moreover, it was proved that the Ser1 mutant line derived from the 52-4 subdivision can be passaged in a homozygous form.
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2013
- 2013-11-27 JP JP2013244477A patent/JP6300302B2/en active Active
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