JP2014524574A - 歯内イメージング - Google Patents
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Abstract
【選択図】図1
Description
摘出した歯の処理
20個の新たに摘出した単根歯を倫理的承認の元に得た(サウスイーストロンドン倫理的承認番号10/H0804/056)。11−1180 Isomet低速ソー(Buehler、ドイツ、デュッセルドルフ)上で0.3mm厚のダイヤモンドウェハ形成ブレード(Extec、米国コネチカット州エンフィールド)を用いて、それぞれの歯の歯冠を除去し、15mm長の被検査物を得た。根管の開存性を、ISO 10のK−ファイルを用いて確認した。根管に冠状漸拡のためにゲーツグリッデンドリル(番号2〜4)、その後プロテーパーF3器具及び作業長が1mmと短いISO 45のK−ファイルを備えた根尖器具を適用した(instrumented)。器具の洗浄は滅菌生理食塩水を用いて行った。次いでそれぞれの歯根を、低速ソーを用いて根管を通って縦に分割した。その後、被検査物の半分を再び合わせて(reapproximated)、5ml容のビジューバイアルに入った新たに混合した印象材のブロック(Aquasil(商標) Hard Putty/Fast Set、Dentsply)に、歯根の歯冠部とともにボトルの開口部と同一面となるように設置した。セッティング後、歯根の半分を15%EDTAに1分間浸漬させ、スメア層を除去し、十分に生理食塩水でリンスした。次いで被検査物を134℃のオートクレーブ内で10分間滅菌処理した。
シークエンシングより同定された、臨床単離株からの複数種の成熟バイオフィルム(アクチノミセス・ラジシデンティス(Actinomyces radicidentis)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、プロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acnes:アクネ菌)、ストレプトコッカス・エピデルミディス(Streptococcus epidermidis:表皮ブドウ球菌)、ストレプトコッカス・オラリス(Streptococcus oralis))を、確立された5日間バイオフィルムプロトコル(Gmuer & Guggenheim 1983)の変法を用いて歯根の半分に対して24マルチウェルプレートにおいて2週間培養した。要約すると、菌株を、5%脱線維ウマ血液を添加したFastidious Anaerobe Agar(LabM)において37℃で常法に従って嫌気培養した。開始培養物を、増殖が適度な懸濁として現れるまで37℃で3時間嫌気的にインキュベートした濾過滅菌済みの汎用の変性液体培地中で構築した。濁度は新たなmFUMを用いて0.5の540nmでのODに調整した(LabsystemsのiEMS Reader MF)。それぞれの歯根を24ウェルトレーにおいて1.5mlの複数種のバイオフィルム培養物とともにインキュベートして、培地は初めの7日間毎日交換した。バイオフィルム増殖後、歯根の半分をシリコンブロックに再び組み込んだ。続いて被検査物を実験群にランダムに割り当て、バイオフィルムの微小内視鏡による可視化を試験した。
1.群A)1% NaOCl溶液洗浄(5ml)
2.群B)生理食塩水洗浄(5ml)
3.群C)対照−洗浄なし
微小内視鏡観察のために、50μlの100nMカルセインアセトキシメチルエステル(Fluka Analytical、イギリス、ギリンガム)を根管腔に注入し、室温で10分間インキュベートした。イメージングを、300μmのミニ−O光ファイバープローブが取り付けられたプロトタイプのCellvizio−GI共焦点微小内視鏡(Mauna Kea Technologies、フランス、パリ)を用いて行った。プローブを、20mmシースから外す(de-sheathing)ことにより調整して、根管腔へのアクセスを可能にした。488nmのレーザ励起源を用い、515nmのロングパス放射フィルタリングを利用して反射成分からの蛍光放射を識別することで根管を検査した後、12画像/秒のフレームレートで画像を検出した。250μmのフィールド直径の画像を300μmのファイバーによって得た。各被検査物の画像を根管腔の標準深さ(−2mm、−8mm、−14mm)で得て、独占的ソフトウェア(Mauna Kea Technologies)を用いてエクスポートした。蛍光対照を純粋なバイオフィルムと、カルセイン AMを含む象牙質被検査物及びカルセイン AMを含まない象牙質被検査物(自己蛍光バックグラウンド決定)とから調製した。各サンプルタイプの代表的な画像、プローブ深さ及びプローブ径を、CellVizioソフトウェアパッケージ(Mauna Kea Technologies)を用いて得た。蛍光対照をカルセイン AMにおいてインキュベートした天然の歯髄細胞から調製した。
各歯根に対して個別の洗浄プロトコル及びイメージング工程を行った後、歯根の半分を無菌状態で9cm径のペトリ皿(SLS、イギリス、イースト・ライディング・オブ・ヨークシャー)に入れた。2つの滅菌ペーパーポイント(Dentsply、Maillefer)を歯根の半分にそれぞれ使用して、根管を採取し、生菌数を定量化した。採取されたバイオフィルムを、滅菌ガラスビーズを用いて十分にボルテックスすることにより分散させた。BHI(ブレインハートインフュージョン培地、Lab M、イギリス)を0.9mlずつ分割したものの中で段階希釈液を調製し、0.1mlずつ分割したものを、二連のFAAプレート上にプレーティングした。プレートを無菌状態で7日間インキュベートした。インキュベーション後、FAAプレートのコロニー数をカウントした。統計分析を単一因子:ANOVAを用いたSPSSPC(バージョン18.0)で行い、3つの実験群間の定量的生菌数を比較した。
処理の前後での根管腔に存在する生存細菌の蛍光を定量化するために、分光光度アプローチを考案した。LED光源と、ダイクロイックミラーと、ビームスプリッターとからなる実験構成を、先端をシースから外した200μmの単一光ファイバーケーブルに連結した。ダイクロイックミラービームスプリッターを、USBを介してラップトップに接続された分光光度計に連結し、スペクトル曲線を記録した。
上述の微小内視鏡/分光光度法はペーパーポイント採取を用いて間接的にも試験している。
MKTプローブの直接可視化
図2に、根管治療の異なる段階での根管の根尖部の例を示す。およそ5μm径の細菌の塊が視認可能である。摘出歯に適用する場合、根管全体に亘る優れた根管内イメージングは300μmの微小内視鏡検査プローブを用いることで得た。根管腔に感染する細菌の放射蛍光を定量化して分析することが可能であった。この方法は再検査に適用することもできたが、図2に示されるように検出可能な蛍光シグナルの非存在によって臨床エンドポイントを容易に決定することができる。
表1に、複数種のバイオフィルムの実験後の生菌数を示す。バイオフィルムは三連で増殖させ、プレーティングし、FAAプレート上で7日間、無菌状態でインキュベートした。値は三連の細菌数の平均±S.Dのlog10として表す。細菌数の値は群B)及び群C)と比較して群A)で有意に低かった。
図3に、群A)における1%NaOCl溶液での洗浄の前後での分光光度測定値のグラフを示す。理想的な歯内エンドポイントは、検出される蛍光性の生存細菌細胞のない分光光度計のゼロ測定値で表される。
同様の結果を間接的ペーパーポイントアプローチによって得た。このシステムの感度は直接アプローチと同程度であった。ペーパーポイントの自己蛍光は無視できるものであり、回収された生存バイオフィルムは視認可能であり、分光光度計により定量化することができた(図4)。
Claims (30)
- 歯内サンプル中の生存細胞の存在を検出する方法であって、
生存細胞指標を歯内サンプルとともに所定期間、インキュベートする工程と、
指標結果が得られるように、前記生存細胞指標に関連するパラメータの変化について測定及び検出の少なくとも一方を行う工程と、
を備え、前記パラメータの所定の変化を表す指標結果が前記歯内サンプル中の生存細胞を示すものである、方法。 - A)前記インキュベートする工程が生存細胞指標を歯内窩洞に加えることにより該歯内窩洞内において実施され、前記測定及び検出の少なくとも一方を行う工程が該歯内窩洞内で実施されるか、又は、
B)前記インキュベートする工程が生存細胞指標を前記歯内窩洞に加えることにより該歯内窩洞内において実施され、前記測定及び検出の少なくとも一方を行う工程がex vivoで実施されるか、又は、
C)前記インキュベートする工程が前記歯内窩洞から採取された歯内サンプルとともに前記生存細胞指標をインキュベートすることによりex vivoで実施され、前記測定及び検出の少なくとも一方を行う工程がex vivoで実施される、請求項1に記載の方法。 - 前記インキュベートする工程が生存細胞指標を前記歯内窩洞に加えることにより該歯内窩洞内において実施され、前記測定及び検出の少なくとも一方を行う工程が該歯内窩洞内で実施され、さらに該測定及び検出の少なくとも一方を行う工程が、検出プローブを該歯内窩洞に挿入することと、指標結果が得られるように、前記生存細胞指標に関連するパラメータを検出すること又は該生存細胞指標に関連するパラメータに関するデータを検出器に伝送することとを含むことを特徴とする、請求項2に記載の方法。
- 前記インキュベートする工程が生存細胞指標を前記歯内窩洞に加えることにより該歯内窩洞内において実施され、前記測定及び/又は検出する工程がex vivoで実施され、前記方法が前記生存細胞指標を前記歯内サンプルとともに前記歯内窩洞内においてインキュベートした後に、該歯内窩洞からインキュベートした前記サンプルの少なくとも一部を取り出すことと、指標結果が得られるように、取り出した前記一部に対して、好適な基板上で又は好適な容器内で前記生存細胞指標に関連するパラメータの測定及び検出の少なくとも一方を行うこととを含む、請求項2に記載の方法。
- 前記歯内窩洞からインキュベートした前記サンプルの少なくとも一部を取り出す工程を、吸収性ペーパーポイントを用いて達成して、任意で前記基板が該吸収性ペーパーポイントである、請求項4に記載の方法。
- 前記インキュベートする工程が前記生存細胞指標を前記歯内窩洞から採取された歯内サンプルとともにインキュベートすることによりex vivoで実施され、前記測定及び検出の少なくとも一方を行う工程がex vivoで実施され、前記方法が、前記生存細胞指標とともにインキュベートする歯内サンプルが採取されるように、前記歯内窩洞を、吸収性ペーパーポイントを用いて採取、擦過又はクリーニングすることと、前記吸収性ペーパーポイントを前記生存細胞指標の溶液中に浸すことにより前記歯内サンプルを該生存細胞指標とともにインキュベートすることとを含む、請求項2に記載の方法。
- 発光媒介性である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生存細胞指標が発光媒介性指標であり、該生存細胞指標に関連するパラメータが発光であり、前記測定及び検出の少なくとも一方を行う工程が、発光について測定及び検出の少なくとも一方を行う工程である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生存細胞指標が、生存細胞の非存在下で第1の発光挙動を示す第1の形態をとり、生存細胞の存在下で第2の発光挙動を示す第2の形態をとる、請求項8に記載の方法。
- 前記発光が蛍光である、請求項8又は9に記載の方法。
- 前記生存細胞指標が、生存細胞の非存在下で蛍光性ではない不活性形態をとり、生存細胞の存在下では蛍光性である活性形態をとる蛍光色素を含み、検出及び測定の少なくとも一方を行う工程により、サンプル中の蛍光を検出して、指標結果を得ることができる、請求項10に記載の方法。
- 蛍光測定工程が共焦点蛍光微小内視鏡検査を用いて行われる、請求項11に記載の方法。
- 前記蛍光色素を最大10分間、好ましくは最大2分間、前記歯内サンプルとともにインキュベートする、請求項11又は12に記載の方法。
- 前記生存細胞指標が、インドシアニングリーン、フルオレセインナトリウム、カルボキシフルオレセイン、カルセイン、メチレンブルー及びProSense 750の1つ又は複数から選択される、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生存細胞指標がカルセイン−AMである、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 歯内感染症又は歯内感染症の再発の診断、予防及び治療の少なくとも1つに使用される生存細胞指標。
- 歯内サンプル中の細胞又は細胞性物質の存在を検出する方法であって、
細胞指標を歯内サンプルとともに所定期間、インキュベートする工程と、
指標結果が得られるように、前記細胞指標に関連するパラメータの変化について測定及び検出の少なくとも一方を行う工程と、
を含み、前記パラメータの所定の変化を表す指標結果が前記歯内サンプル中の細胞又は細胞性物質を示すものである、方法。 - A)前記インキュベートする工程が細胞指標を歯内窩洞に加えることにより該歯内窩洞内において実施され、前記測定及び検出の少なくとも一方を行う工程が該歯内窩洞内で実施されるか、又は、
B)前記インキュベートする工程が細胞指標を前記歯内窩洞に加えることにより該歯内窩洞内において実施され、前記測定及び/又は検出する工程がex vivoで実施されるか、又は、
C)前記インキュベートする工程が前記細胞指標を前記歯内窩洞から採取された歯内サンプルとともにインキュベートすることによりex vivoで実施され、前記測定及び検出の少なくとも一方を行う工程がex vivoで実施される、請求項17に記載の方法。 - 前記インキュベートする工程が細胞指標を前記歯内窩洞に加えることにより該歯内窩洞内において実施され、前記測定及び検出の少なくとも一方を行う工程が該歯内窩洞内で実施され、さらに該測定及び検出の少なくとも一方を行う工程が、検出プローブを該歯内窩洞に挿入することと、指標結果が得られるように前記細胞指標に関連するパラメータを検出すること又は該細胞指標に関連するパラメータに関するデータを検出器に伝送することとを含むことを特徴とする、請求項18に記載の方法。
- 前記インキュベートする工程が細胞指標を前記歯内窩洞に加えることにより該歯内窩洞内において実施され、前記測定及び検出の少なくとも一方を行う工程がex vivoで実施され、該方法が前記細胞指標を前記歯内サンプルとともに前記歯内窩洞内においてインキュベートした後に、該歯内窩洞からインキュベートした前記サンプルの少なくとも一部を取り出すことと、指標結果が得られるように、取り出した前記一部に対して、好適な基板上で又は好適な容器内で前記細胞指標に関連するパラメータの測定及び検出の少なくとも一方を行うこととを含む、請求項18に記載の方法。
- インキュベートしたサンプルの少なくとも一部を前記歯内窩洞から取り出す工程を、吸収性ペーパーポイントを用いて達成して、任意で前記基板が該吸収性ペーパーポイントである、請求項20に記載の方法。
- 前記インキュベートする工程が前記細胞指標を前記歯内窩洞から採取された歯内サンプルとともにインキュベートすることによりex vivoで実施され、前記測定及び検出の少なくとも一方を行う工程がex vivoで実施され、該方法が、前記細胞指標とともにインキュベートする歯内サンプルが採取されるように、前記歯内窩洞を、吸収性ペーパーポイントを用いて採取、擦過又はクリーニングすることと、前記吸収性ペーパーポイントを前記細胞指標の溶液中に浸すことにより前記歯内サンプルを該細胞指標とともにインキュベートすることとを含む、請求項18に記載の方法。
- 発光媒介性である、請求項17〜22のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞指標が発光媒介性指標であり、該細胞指標に関連するパラメータが発光であり、前記測定及び検出の少なくとも一方を行う工程が、発光について測定及び検出の少なくとも一方を行う工程である、請求項17〜23のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞指標が、細胞又は細胞性物質の非存在下で第1の発光挙動を示す第1の形態をとり、細胞又は細胞性物質の存在下で第2の発光挙動を示す第2の形態をとる、請求項24に記載の方法。
- 前記発光が蛍光である、請求項24又は25に記載の方法。
- 前記細胞指標が、細胞又は細胞性物質の非存在下で蛍光性ではない不活性形態をとり、細胞又は細胞性物質の存在下では蛍光性である活性形態をとる蛍光色素を含み、前記検出及び測定の少なくとも一方を行う工程により、サンプル中の蛍光を検出して、指標結果を得ることができる、請求項26に記載の方法。
- 蛍光測定工程が共焦点蛍光微小内視鏡検査を用いて行われる、請求項27に記載の方法。
- 前記蛍光色素を最大10分間、好ましくは最大2分間、前記歯内サンプルとともにインキュベートする、請求項27又は28に記載の方法。
- 前記細胞が生存細胞であり、該方法が生存細胞を検出する方法であり、前記細胞指標が生存細胞指標であり、前記指標結果が前記歯内サンプル中の生存細胞を示すものである、請求項17〜29のいずれか一項に記載の方法。
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