JP2014514919A - 幹細胞の多能性を高めるための組成物及び方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2011年3月23日に出願された米国仮特許出願第61/466,667号に基づく優先権を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に援用される。
(ベクターを含む)を提供する。組換えZscan4−ERT2融合タンパク質もまた提供される。Zscan4−ERT2核酸分子及び融合タンパク質を含む組成物及び細胞(例えば、ES細胞又はiPS細胞)もまた本明細書に提供される。
添付の配列表に列挙されている核酸及びアミノ酸配列は、37CFR1.822で定義されるようなヌクレオチド塩基の標準的な文字の略語、及びアミノ酸の3文字コードを使用して示されている。各核酸配列の一方の鎖のみが示されているが、相補鎖は、表示された鎖への任意の参照によって含まれるものとして理解される。添付の配列表においては以下の通りである:
配列番号1及び2は、ヒトZSCAN4のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列である。
配列番号3及び4は、マウスZscan4aのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列である。
配列番号5及び6は、マウスZscan4bのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列である。
配列番号7及び8は、マウスZscan4cのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列である。
配列番号9及び10は、マウスZscan4dのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列である。
配列番号:11及び12は、マウスZscan4eのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列である。
配列番号:13及び14は、マウスZscan4fのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列である。
配列番号15〜18は、Zscan4とH2AのqRT−PCR分析に使用されるプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号19は、プラスミドpPyCAGmZscan4c−ERT2のヌクレオチド配列である。
配列番号20は、プラスミドpPyCAG−hZscan4ERT2のヌクレオチド配列である。
配列番号21は、ヒトERT2のアミノ酸配列である。
配列番号22は、マウスZscan4c−ERT2融合タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号23は、ヒトZSCAN4−ERT2融合タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号24は、プラスミドpCAG−Zscan4−ΔCのヌクレオチド配列である。
配列番号25は、マウスZscan4c−ΔC(4つ全てのジンクフィンガードメインを欠損している)のアミノ酸配列である。
I.省略形
a.a. アミノ酸
cDNA 相補デオキシリボ核酸
Em エメラルド
ES 胚性幹
hCg ヒト絨毛性ゴナドトロピン
ICM 内部細胞塊
LIF 白血病抑制因子
MEF マウス胎児線維芽細胞
ORF オープンリーディングフレーム
PFA パラホルムアルデヒド
qPCR 定量的ポリメラーゼ連鎖反応
qRT−PCR 定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応
shRNA 短ヘアピンリボ核酸
Tmx タモキシフェン
特記しない限り、技術用語は、慣例的用法に従って使用される。分子生物学における一般的な用語の定義は、Oxford University Press出版のBenjamin Lewin, Genes V(1994)(ISBN 0−19−854287−9);Blackwell Science Ltd.出版のKendrew et al.(eds.),The Encyclopedia of Molecular Biology(1994)(ISBN 0−632−02182−9);及びVCH Publishers, Inc.出版のRobert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference(1995)(ISBN 1−56081−569−8)に見出され得る。本開示の様々な態様の概説を容易にするため、特定の用語の以下の説明を提供する。
幹細胞の多能性を調べるための判断基準は、細胞が、動物の生体全体に寄与することができるかどうかを確認することである。本明細書においては、マウスES細胞におけるZscan4活性化の頻度が増加するだけでなく、長期的な細胞培養においてそれらの発生能を維持することも開示される。潜在力が増大するにつれて、さらに動物全体が、予想外に高い成功率で4N胚盤胞に注入された単一のES細胞から製造することができる。Zscan4活性化された細胞は、2細胞段階のマウス胚で発現される遺伝子も発現するが、ES細胞の一過性のZscan4活性化状態は、ES細胞の高い潜在力に関連付けられていない。理論に束縛されるものではないが、これらの知見は、ES細胞が、通常の状態よりも頻繁に一過性のZscan4活性化状態を経由することによって、より高い潜在力を取得することを示している。まとめると、これらの結果は、Zscan4の頻繁な活性化は、多能性幹細胞を若返らせることができることを示す。
本明細書は、融合タンパク質をコードする単離された核酸分子を提供し、ここで、融合タンパク質は、ERT2タンパク質に融合したZscan4タンパク質を含むERT2は、ヒトエストロゲン受容体のリガンド結合ドメインの突然変異型である。ERT2は、生理学的濃度ではその天然のリガンド(17P−エストラジオール)を結合しないが、タモキシフェン又はその代謝物4−ヒドロキシ(40HT)のナノモル濃度に非常に感受性である。
また、本明細書では、C−末端が切断されたZscan4タンパク質(Zscan4−ΔCと呼ばれる)をコードする単離された核酸分子が提供される。C−末端切断型Zscan4は、少なくとも1つのジンクフィンガードメインの欠失を含む。したがって、いくつかの実施形態において、Zscan4−ΔCタンパク質は、1つ、2つ、3つ又は4つのジンクフィンガードメインの欠失を有する。
本明細書には、Zscan4の再発活性化が幹細胞の多能性を高めるという所見が開示されている。特に、ES細胞でZscan4活性化の頻度を増加させることは、長期培養中に発生能を高め、維持することが本明細書に開示されている。以下の実施例に記載の結果は、ES細胞は、通常の状態よりも頻繁に、一過性Zscan4活性化状態を経由することによって、より高い潜在力を獲得することを示している。
本明細書では、幹細胞又は幹細胞集団の多能性を高める又は持続する方法が提供される。いくつかの実施形態において、方法は、本明細書に開示されるZscan4−ERT2融合タンパク質をコードする核酸分子又はベクターと幹細胞又は幹細胞集団を接触させることを含む。他の実施形態において、本方法は、本明細書に開示されるZscan4−ERT融合タンパク質と幹細胞又は幹細胞集団を接触させることを含む。
また、本明細書では、幹細胞集団におけるZscan4陽性細胞の頻度を増加させる方法が提供される。いくつかの実施形態において、本方法は、本明細書で開示されているZscan4−ERT2融合タンパク質をコードする核酸分子又はベクターで幹細胞集団を接触させることを含む。
幹細胞又は幹細胞集団において、ゲノム安定性を促進し、又はテロメア長を促進する方法、又はその両方がさらに提供される。いくつかの実施形態において、本方法は、本明細書で開示されたZscan4−ERT2融合タンパク質をコードする核酸分子又はベクターで幹細胞又は幹細胞集団を接触させることを含む。他の実施形態において、本方法は、本明細書に開示されたZscan4−ERT融合タンパク質を幹細胞又は幹細胞集団を接触させることを含む。
この実施例は、実施例2に記載の研究に使用される実験手順を記載する。
129S6/SvEvTac由来のMC1 ES細胞とC57BL/6J由来のEC2 ES細胞(Olson et al,Cancer Res 63:6602−6606,2003)は、ジョンズホプキンス大学医学部のトランスジェニック・コア研究所(Baltimore,MD)から購入した。F1ハイブリッド菌株(C57BL/6×129/Sv)由来のV6.5 ES細胞(Eggan et al,Proc Natl Acad Sci USA 98:6209−6214,2001)は、Thermo Scientific Open Biosystemから購入した。全てのES細胞株は、TA1 ES細胞株(下記参照)を除き、37℃、5%CO2にて、以前(Zalzman et al,Nature 464:858−863,2010)に記載の完全にES培地:DMEM(Gibco)、15%FBS(Atlanta Biologicals)、1000U/ml白血病抑制因子(LIF)(ESGRO,Chemicon)、1mMピルビン酸ナトリウム、0.1mM非必須アミノ酸(NEAA)、2mMのGlutaMAX(商標)、0.1mMのβ−メルカプトエタノール、及びペニシリン/ストレプトマイシン(50U/50μg/ml)中で培養された。上述したように、TA1 ES細胞株を培養した。全ての細胞株について、培地は毎日交換し、細胞を2〜3日毎に日常的に継代した。
C57BL/6J雌(The Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)と129S6/SvEvTacオス(Taconic)は、自然に交配させ、2細胞期胚を回収し、次に、KSOM培地中で3日間、37℃、5%CO2にて培養させた得られた胚盤胞は、マイトマイシンC(Sigma)で処理されたマウス胚線維芽フィーダー細胞(MEF)に移され、15%FBSを15%KSR(Invitrogen)で置換し、50nMのPD98059(MEK1阻害剤)を添加した後、完全なES培地(上記)中で7日間培養された。内部細胞塊(ICM)をピッキングし、ACCUTASE(商標)(Millipore)でそれらを解離させた後、それらを新鮮なフィーダー細胞上に播種し、さらに7日間同じ条件で培養した。新たに誘導されたES細胞株は、直接、4N−相補性(下記参照)によってその発生能について試験された。
遺伝子は、第7染色体の約850kb領域上にクラスター化された6つのパラログ遺伝子と3つ偽遺伝子からなる、総称Zscan4と呼ばれる(Falco et al.,Dev Biol 307:539−550,2007)。Zscan4a〜Zscan4fとして命名された6つのパラログのうち、Zscan4c、Zscan4d、及びZscan4fのオープンリーディングフレーム(ORF)は互いに非常に類似し、SCANドメインと4つのジンクフィンガードメインをコードする(Falco et al.,Dev Biol 307:539550,2007)。pCAG−Zscan4−ERT2プラスミドを構築するために、マウスZscan4c遺伝子(Falco et al.,Dev Biol 307:539−550,2007)の全ORF(506a.a.)をERT2(Feil et al,Proc Natl Acad Sci USA 93:10887−10890,1996)と融合させ、pPyCAG−BstXI−IP(Niwa et al.,Gene 108:193−199,1991)のXhoI/NotI部位にクローニングした。得られたプラスミドベクターは、強力なCAGプロモーター下で、Zscan4c−ERT2融合タンパク質−IRES−ピューロマイシン耐性タンパク質を発現する。
6ウェルプレートにおいてES細胞を増殖させた。ZE ES細胞クローンについて、懸濁液中の5×105ES細胞は、製造業者のプロトコールに従って、EFFECTENE(商標)(QIAGEN)を用いて、1μgの線状化されたpZscan4−エメラルドベクター(Zalzman et al.,Nature 464:858−863,2010)でトランスフェクトされ、100mmディッシュに播種された。8日間の5μg/mlブラストサイジンによる選択後、得られたES細胞コロニーをピックアップし、増殖させ、さらなる分析のために凍結した。ZERT2 ES細胞クローンについて、懸濁液中の5×105ES細胞は、製造業者のプロトコールに従って、EFFECTENE(商標)(QIAGEN)を用いて、線状化されたpCAG−Zscan4−ERT2ベクターと0.5μgのPL452(PGKプロモーター−Neo)でコトランスフェクションされ(Liu et al.,Genome Res 13:476−484,2003)、100mmディッシュに播種された。8日間のG418による選択後、得られたES細胞コロニーをピックアップし、増殖させ、さらなる分析のために凍結した。
RNAは、生物学的に3点測定において、TRIZOL(商標)(Invitrogen)によって細胞から単離された。1μgの総RNAは、製造業者のプロトコールに従って、Superscript(商標)III(Invitrogen)により逆転写された。反応あたり100ngのオリゴdTプライマー(Promega)を使用した。qPCRについて、SYBR(商標)グリーンマスターミックス(Applied Biosystems)を製造業者のプロトコールに従って使用した。25μlの総反応体積を有する96ウェルの光学プレートを用い、10ngのcDNAをウェルあたりに使用した。プレートは、7300又は7500システム(Applied Biosystems)上で実行された。誘導倍率は、正規としてH2Aを用いて、AACt法(Livak et al,Methods 25:402−408,2001)によって計算された。
4〜6週齢のB6D2F1雌マウスは、5IUのPMSG(Sigma)と5IUのヒト絨毛性性腺刺激ホルモン(hCG)(Sigma)を用いて過剰排卵された。qRT−PCR実験のための卵や胚は、それぞれ、MII(未受精卵卵母細胞)、1細胞、初期及び後期の2細胞、4細胞、8細胞、桑実胚と胚盤胞の胚について、hCG注射の20、23、30、43、55、66、80及び102時間後に回収された。10個の同期化された卵や胚の3セットを液体窒素中に保存し、cDNA調製鋳型のために凍結/融解ステップによって機械的に破裂させた。オリゴdTプライマー及びSuperscript(商標)III逆転写酵素(Invitrogen)を製造業者の指示に従って使用した。分析は、ABI7300ファーストリアルタイムPCRシステム(Applied Biosystems)上で行われた。データは、AACt法(Livak et al,Methods 25:402−408,2001)を用いるChuk(Falco et al,Reprod Biomed Online 13:394−403,2006)によって正規化された。
全量インサイチュハイブリダイゼーションは、従前(Carter et al,Gene Expr Patterns 8:181−198,2008)に記載のように行われた。簡潔には、3点測定のES細胞は、3日間増殖させ、4℃で一晩、4%パラホルムアルデヒド(PFA)中で固定された。プロテイナーゼKで消化した後、細胞を62℃にて、一晩、1μg/mlジゴキシゲニン標識リボプローブでハイブリダイズさせた。次に、細胞を洗浄し、ブロッキングし、アルカリホスファターゼをコンジュゲートした抗ジゴキシゲニン抗体とともにインキュベートし、30分間又は一晩、NBT/BCIP検出緩衝液中でインキュベートした。
ジゴキシゲニン(DIG)標識RNAプローブ及びビオチン(BIO)標識RNAプローブを、RNA Labeling Mix(Roche)を用いて、PCR産物の鋳型から転写した。エタノール沈殿させたプローブを水に再懸濁し、2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies)においてRNA 6000 Nano Assayによって定量した。細胞(105細胞/ウェル)をガラスチャンバースライドに播き、3日間培養し、PFAで固定し、0.5%TritonX−100で透過処理した。細胞を洗浄し、ハイブリダイゼーション溶液中、60℃において12時間にわたって1μg/mlのDIGプローブ及びBIOプローブとともにインキュベートした。プローブをマウス抗DIG抗体及びヒツジ抗BIO抗体によって検出し、フルオロフォアをコンジュゲートした二次抗体によって可視化した。核をDAPI(青色)で染色した。
DNAマイクロアレイ分析は、報告されているように(Aiba et al.,DNA Res.16:73−80,2009)行った。簡潔には、ユニバーサルマウス参照RNA(Stratagene)をCy5色素で標識し、Cy3標識試料と混合し、NIA Mouse 44K Microarray v2.2(Carterら、Genome Biol.6:R61,2005)(Agilent Technologiesによる製造、#014117)におけるハイブリダイゼーションのために使用した。各遺伝子特徴の強度をFeature Extraction 9.5.1.1ソフトウェア(Agilent Technologies)を用いて、スキャンされたマイクロアレイ画像から抽出した。ANOVA及び他の分析を行うために開発されたアプリケーション(NIA Array Analysisソフトウェア;lgsun.grc.nia.nih.gov/ANOVA/を参照のこと)(Sharov et al.,Bioinformatics 21:2548−2549,2005)を使用することによって、マイクロアレイデータの分析を行った。全てのDNAマイクロアレイデータは、NCBI Gene Expression Omnibus(GEO,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)に寄託されており、GEO Seriesアクセッション番号(GSE#15604)及びNIA Array Analysisソフトウェアウェブサイト(オンラインlgsun.grc.nia.nih.gov/ANOVA/)(Sharov et al.,Bioinformatics 21:2548−2549,2005)を介してアクセス可能である。GEOの校閲リンクについては、下記の通りである:www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?token=fhaxtmiueykigvm&acc=GSE26278。
CD1雌(Charles River、8〜12週齢)は、hCG(Sigma)投与による48時間後、PMSG(Sigma)により過剰排卵のために使用された。hCG投与後、雌を同系統の雄と交配させ、2細胞胚を卵管のフラッシングによって回収した。回収された胚を37℃で3日間、5%CO2にてKSOM(Millipore)培地において培養した。回収された2細胞胚を直接0.3Mマンニトール溶液中に移し、電気融合チャンバー内で交流(AC)パルスによって自動的に整列させた。その後、140V/mmの2つの直流(DC)のパルスを40μs間、LF101電気細胞融合発生装置を用いて適用した。1つの割球を有する融合した胚(4N)は、培養60分にて回収され、それらは胚盤胞期に達するまでKSOM培地中で培養が続けられた。単一のES細胞又は10〜15個のES細胞は、それらの発生能を評価するために2N又は4Nの胚盤胞に注入され、次にE2.5レシピエント雌に移された。ES細胞に対するTmxの効果を研究するために、ES細胞は、注射前の2〜3日間、200nMのTmxの存在下で培養された。
この実施例は、マウスES細胞のZscan4活性化の頻度を増加させることが、長期的な細胞培養での発生能を増加させるだけでなく、維持もするという知見を記載する。
ES細胞のZscan4+状態を特徴付けるための最初のステップとして、全体的な遺伝子発現プロフィールは、Zscan4+とES細胞のZscan4+の間で比較された。先の研究においては、レポーター細胞株、pZscan4−エメラルド細胞(以下「MCIZE」と呼ぶ)を確立し、ここでは、Zscan4c−プロモーター駆動のリポーター緑色蛍光タンパク質GFP−エメラルド(Em)が、内因性Zscan4の発現を再現した(Zalzman,et al.,Nature 464:858−863,2010)。FACSソートされたEm+及びEm−細胞のDNAマイクロアレイ分析を行った。Em+細胞は、たった161個の示差的に発現された遺伝子を有するEm−細胞と、非常に類似した発現プロフィールを示した(図5;PCT出願公開WO2008/118957及びFalco et al,Dev Biol 307:539−550,2007も参照)。多能性関連マーカーは、Em細胞と比較してEm細胞では変わらなかったが、TcstvlとTcstv3(2細胞特異的転写産物改変体1と3)遺伝子(Struwe及びSolter,GenBankアクセッションAF067057.1;Zhang et al.,Nucleic Acids Res 34:4780−4790,2006)は、最も非常に上方制御された遺伝子に含まれた(図5)。RNA全量インサイチュハイブリダイゼーションは、リスト中の7つの他の遺伝子について「Zscan4様」発現を示した(Tcstvl/3、Eifla、Pifl、AF067063、EG668777、RP23−149D11.5、BC061212、及びEG627488;PCT公開WO2008/118957を参照されたい。参照により本明細書に援用される)。
ES細胞は、胚盤胞の内部細胞塊(ICM)中の細胞と同等であると考えられる(Nichols and Smith,Development 138:3−8,2011;Yoshikawa et al.,Gene Expr Patterns 6:213−224,2006)。Zscan4+状態と2細胞胚の間の共通性は、標準的な細胞培養条件において、ES細胞は、2細胞様の細胞の約5%とICM様の細胞の約95%の混合集団であることを示唆する。核移植(クローニング)によって、2細胞核はICM核よりも高い発生能を有するため(Tsunoda et al.,Development 107:407−411,1989;Kono et al.,J Reprod Fertil 93:165−172,1991)、Zscan4+状態は、通常のES細胞集団のうち高い潜在的な真の幹細胞を表す可能性がある。
Zscan4の断続的及び一過性の活性化は、ES細胞培養の長期的な維持のために必要とされる(Zalzman et al.,Nature464:858−863、2010)。したがって、Zscan4のより頻繁な活性化は、さらに、それらの発生能を含むES細胞の品質を改善すると仮定された。Zscan4の一過性の発現を模倣するシステムが求められていた。この目的のために、ERT2、タモキシフェン(Tmx)誘導システムを選択した(Feil et al.,Proc Natl Acad Sci USA 93:10887−10890,1996)。このシステムは、Tmxの不存在下でトランス遺伝子をオフにしておき、Tmxの存在下で随意にそれをオンにすることができる(Feil et al.,Proc Natl Acad Sci USA 93:10887−10890,1996)。第一に、プラスミド構築物のpCAG−Zscan4−ERT2を作製し、そこでは、ERT2ドメインと融合されたZscan4cオープンリーディングフレーム(ORF)は、強力なユビキタスなプロモーターCAGによって駆動することができる(Niwa et al.,Gene 108:193−199,1991)(図1A)。
上述の結果に基づくと、ERT2の効果は、タンパク質のC末端でZscan4ジンクフィンガードメインの機能をブロックしたことによるものと仮定された。従って、C末端が切断されたZscan4がZscan4の再発活性化を誘導するZscan4−ERT2と同様の効果を有するか否かを評価するために、C末端切断型(4つすべてのジンクフィンガードメインを欠損している)又はN末端切断型(SCANドメインを欠損している)Zscan4のいずれかをコードするベクターを構築した。図2Aは、Zscan4c、Zscan4c−ERT2、Zscan4c−ΔC、及びZscan4c−ΔNタンパク質の構造の概略を示す。Zscan4c−ΔCのアミノ酸配列は、配列番号25として本明細書に記載されている。
ES細胞の発生能に対してZscan4−ERT2の効果を評価するために、種々のES細胞をマウス胚盤胞に注入し、子宮に移し、それらを発生させた。ES細胞能力の程度は、コート色に基づいて、イヌにおけるキメラの割合によって評価された:高い(>70%キメラ化)、中等度(40%〜70%)、低い(<40%)、及びアルビノ(0%)(図3A)。
発生能についての最終試験は、単独で4倍体(4N)胚盤胞に注射されたES細胞が、全マウスになっている(Nagy et al.,Development 110:815−821,1990)かどうかを確認することであるが広く認識されている。期間終了時に生存していた15〜25%のイヌを達成している、従前(Eggan et al.,Proc Natl Acad Sci USA 98:6209−6214,2001)に報告されている初期継代V6.5 ES細胞と比較して、継代18のV6.5 ES細胞だけが、2%の生存胚を生成した(図4A)。対照的に、継代19のV6.5 ZERT2 #18ES細胞は、非常に高い成功率を示し、43%が生存胚であった(図4A及び4C)。同様に、他の2つの独立したクローン(V6.5 ZERT2 #7;V6.5 ZERT2 #10)は、10〜15個のES細胞が4Nの胚盤胞に注入した場合、高い成功率の生存胚の生成を示した(図4A)。
本明細書では、Zscan4−ERT2の構成的存在は、通常の活性化因子TMXなしに、内因性Zscan4活性化の頻度を増加させることができ、結果としてES細胞の発生能の増加をもたらすことが開示されている。加速されたZscan4活性化サイクルにおいて培養されたES細胞は、改善されたキメラ化と潜在力を示し、これらは、キメラマウス及び単一のES細胞からの全マウスの効率的な生成における高い寄与によって実証される。
Zscan4自体(すなわち、未修飾のZscan4タンパク質)の一過性の過剰発現が、ES細胞の発生能を増加させ得るかどうかを試験するために、本出願人は、PB−tetZsan4c−IRES−ベータ−ジオベクターを作製し、そこでは、Zscan4c ORFの発現は、Dox誘導性tetOプロモーターによって駆動される(図12)。また、ベクターは、ベータ−ジオ、G418耐性遺伝子を含み、その結果、Dox誘導性Zscan4cベクターを含むES細胞だけが、G418の存在下で選択することができる。このpiggyBacベクターは、PB−CAG−rtTAベクター(teOプロモーターのDox消失性に必要なDoxトランス活性化因子)とPcyL43トランスポザーゼベクター(ゲノムにpiggyBacベクターの統合を促進する酵素)でトランスフェクトされた。トランスフェクション後、細胞を6日間、G418及びDox+の存在下で培養し、次に、実質的にDoxの不存在下で培養した。これらの細胞は、V6.5 tetZscan4 ESCと命名された。対照として、親V6.5 ES細胞を用いた。 Zscan4の発現は、培地中にDoxを添加することによって、一過性に増加させた(青色ボックスで示される;図12)。
Claims (50)
- Zscan4−ERT2融合タンパク質をコードする単離された核酸分子。
- Zscan4が、マウスZscan4c、マウスZscan4d、マウスZscan4f若しくはヒトZSCAN4又はそれらの機能的断片若しくは改変体を含む、請求項1に記載の核酸分子。
- Zscan4が、マウスZscan4c又はヒトZSCAN4を含む、請求項1又は2に記載の核酸分子。
- (i)配列番号19のヌクレオチド2465〜4936と少なくとも95%同一である核酸配列;又は(ii)配列番号20のヌクレオチド2479〜4731と少なくとも95%同一である核酸配列を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の核酸分子。
- (i)配列番号19のヌクレオチド2465〜4936の核酸配列;又は(ii)配列番号20のヌクレオチド2479〜4731の核酸配列を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の核酸分子。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載の核酸分子を含むベクター。
- 配列番号19又は配列番号20と少なくとも95%同一である核酸配列を含む、請求項6に記載のベクター。
- 配列番号19又は配列番号20の核酸配列を含む、請求項6に記載のベクター。
- Zscan4−ΔCタンパク質が少なくとも1つのジンクフィンガードメインの欠失を含む、Zscan4−ΔCタンパク質をコードする単離された核酸分子。
- Zscan4−ΔCが、マウスZscan4c、マウスZscan4d、マウスZscan4f若しくはヒトZSCAN4又はそれらの改変体を含む、請求項9に記載の核酸分子。
- Zscan4−ΔCが、マウスZscan4c又はヒトZSCAN4を含む、請求項9又は10に記載の核酸分子。
- 配列番号24のヌクレオチド2465〜3649と少なくとも95%同一である核酸配列を含む、請求項9〜11のいずれか1項に記載の核酸分子。
- 配列番号24のヌクレオチド2465〜3649の核酸配列を含む、請求項9〜11のいずれか1項に記載の核酸分子。
- 請求項9〜13のいずれか1項に記載の核酸分子を含むベクター。
- 配列番号24と少なくとも95%同一である核酸配列を含む、請求項14に記載のベクター。
- 配列番号24の核酸配列を含む、請求項6に記載のベクター。
- 請求項1〜16のいずれか1項に記載の核酸分子又はベクターを含む単離された細胞。
- 幹細胞である、請求項17に記載の単離された細胞。
- 胚性幹(ES)細胞である、請求項18に記載の単離された細胞。
- 誘導された多能性幹(iPS)細胞である、請求項18に記載の単離された細胞。
- 幹細胞が、マウス、ラット、ヒト又はヒト以外の霊長類の幹細胞である、請求項18〜20のいずれか1項に記載の単離された細胞。
- 請求項1〜16のいずれか1項に記載の核酸分子又はベクター、医薬として許容される担体を含む組成物。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載の核酸分子又はベクターによってコードされるZscan4−ERT2融合タンパク質。
- 組換えZscan4−ERT2融合タンパク質。
- Zscan4が、マウスZscan4c、マウスZscan4f若しくはヒトZSCAN4又はそれらの機能的断片若しくは改変体を含む、請求項24に記載の融合タンパク質。
- Zscan4が、マウスZscan4c又はヒトZSCAN4を含む、請求項25に記載の融合タンパク質。
- 配列番号22又は配列番号23のアミノ酸配列と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項24〜26のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- 配列番号22又は配列番号23のアミノ酸配列を含む、請求項27に記載の融合タンパク質。
- 請求項9〜16のいずれか1項に記載の核酸分子又はベクターによってコードされるZscan4−ΔCタンパク質。
- 組換えZscan4−ΔCタンパク質。
- Zscan4−ΔCタンパク質が、少なくとも1つのジンクフィンガードメインの欠失を含むマウスZscan4c、マウスZscan4d、マウスZscan4f又はヒトZSCAN4を含む、請求項30に記載のZscan4−ΔCタンパク質。
- Zscan4−ΔCが、少なくとも1つのジンクフィンガードメインの欠失を含むマウスZscan4c又はヒトZSCAN4を含む、請求項31に記載のZscan4−ΔCタンパク質。
- 配列番号25のアミノ酸配列と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項30〜32のいずれか1項に記載のZscan4−ΔCタンパク質。
- 配列番号25のアミノ酸配列を含む、請求項33に記載のZscan4−ΔCタンパク質。
- 請求項23〜34のいずれか1項に記載のタンパク質を含む単離された細胞。
- 幹細胞である、請求項35に記載の単離された細胞。
- ES細胞である、請求項36に記載の単離された細胞。
- iPS細胞である、請求項36に記載の単離された細胞。
- 幹細胞が、マウス、ラット、ヒト又はヒト以外の霊長類の幹細胞である、請求項36〜38のいずれか1項に記載の単離された細胞。
- 請求項23〜34のいずれか1項に記載のタンパク質及び医薬として許容される担体を含む組成物。
- 幹細胞又は幹細胞集団を請求項1〜16のいずれか1項に記載の核酸分子若しくはベクター、請求項22若しくは40に記載の組成物、又は請求項23〜34のいずれか1項に記載のタンパク質と接触させることを含む、幹細胞又は幹細胞集団の多能性を高める又は持続させるための方法。
- 幹細胞集団を請求項1〜16のいずれか1項に記載の核酸分子若しくはベクター、請求項22若しくは40に記載の組成物、又は請求項23〜34のいずれか1項に記載のタンパク質と接触させることを含む、幹細胞集団におけるZscan4陽性細胞の頻度を増加させる方法。
- 幹細胞又は幹細胞集団を請求項1〜16のいずれか1項に記載の核酸分子若しくはベクター、請求項22若しくは40に記載の組成物、又は請求項23〜34のいずれか1項に記載のタンパク質と接触させることを含む、幹細胞又は幹細胞集団におけるゲノム安定性を促進させる若しくはテロメア長を増加させる又はそれらの両方を行う方法。
- 幹細胞がES細胞である、請求項41〜43のいずれか1項に記載の方法。
- 幹細胞がiPS細胞である、請求項41〜43のいずれか1項に記載の方法。
- 幹細胞が、マウス、ラット、ヒト又はヒト以外の霊長類の幹細胞である、請求項41〜45のいずれか1項に記載の方法。
- Zscan4を一過性に発現させることを含む、幹細胞又は幹細胞集団の発生能を増加させる方法。
- 過剰発現されたZscan4がマウスZscan4cである、請求項47に記載の方法。
- 幹細胞又は幹細胞集団の多能性を高める又は持続させる方法であって、幹細胞又は幹細胞集団を、Zscan4タンパク質をコードする単離された核酸分子又はZscan4タンパク質をコードする核酸分子を含むベクターと接触させることを含む方法。
- ベクター、誘導性プロモーターをさらに含む、請求項49に記載の方法。
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