JP2014227350A - 化粧料 - Google Patents

Abstract

【課題】皮膚に対する浸透性、及び使用感（べとつき感等）を改善し、かつ、すぐれた美肌効果（肌のハリ、ツヤ等の向上、肌のタルミ、シワ等の予防、改善）を奏する低分子ヒアルロン酸を有効成分とする化粧料を得ることを目的とする。【解決手段】 本発明は、不飽和型の低分子ヒアルロン酸又はその塩を有効成分とする化粧料であって、すぐれた皮膚浸透性及び使用感を有すると共に、当該不飽和型の低分子ヒアルロン酸又はその塩が有する表皮細胞賦活効果、コラーゲン産生促進効果、及びセラミド合成酵素活性亢進効果に基づく、すぐれた美肌効果を発揮するものである。【選択図】図１

Description

本発明は、低分子の不飽和型ヒアルロン酸を有効成分とし、すぐれた皮膚生理活性、使用感及び生体安全性を有する化粧料に関する。

ヒアルロン酸は、Ｄ−グルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンの２糖が直鎖状に結合した枝分かれのない高分子多糖であり、動物のあらゆる結合組織に存在し、その分子量は数万から数百万とされている。ヒアルロン酸又はその塩は、保湿効果にすぐれ、かつ生体成分であるため安全性が高く、化粧料、健康食品等に利用されている。
しかし、ヒアルロン酸を化粧料等の配合成分として使用する場合、ヒアルロン酸は分子量が非常に大きく、水に溶解した場合には低濃度でも水溶液の粘弾性が非常に大きくなるため、工業的規模で水に溶解させるには非常に時間と手間がかかるという問題が生じた。また、上述のように分子量が非常に大きく粘度が高いため、特に化粧料の配合成分として利用する場合には、皮膚に対する浸透性、及び使用感（べとつき感等）の点で問題を有していた。

上述したように、ヒアルロン酸は特に化粧料に配合する場合に、種々の問題点があり、それらを解決するために、ヒアルロン酸を低分子化して得られる低分子ヒアルロン酸を配合した化粧料が提案されている（特許文献１〜５）。しかし、従来の低分子化ヒアルロン酸では化粧料配合剤として見た場合、十分な有効性を発揮しないという問題点を有していた。また、従来、ヒアルロン酸又はその塩から低分子の糖鎖を有する不飽和型ヒアルロン酸を製造する方法については提案されているが（特許文献６，７、非特許文献１〜６）、それらの文献には不飽和型ヒアルロン酸の化粧料成分としての有効性については何ら明らかにされていなかった。

特開昭62-292710号公報 特公平05-077681号公報 特開昭64-013008号公報 特表2002-533376号公報 特開2006-271351号公報 特開2007-291133号公報 特開2008-035858号公報 Ohya T, Kaneko Y. Novelhyaluronidase from Streptomyces. Biochim. Biophys. Acta 198: 607-609, 1970. Tam Y-C, Chan EC. Purificationand characterization of hyaluronidase from oral Peptostreptococcus species.Infect.Immun. 47: 508-513, 1985. Hiyama K, Okada S.Crystallization and some properties of chondroitinase from Arthrobacteraurescens. J. Biol. Chem.250: 1824-1828, 1975. Yamagata T, Saito H, Habuchi O,SuzukiS. Purification and properties of bacterial chondroitinases andchondrosulfatases. J. Biol. Chem. 243: 1523-1535, 1968. Nicola Volpi. On-LineHPLC/ESI-MS Separation and Characterization of Hyaluronan Oligosaccharides from2-mers to 40-mers. Anal. Chem. 2007, 79, 6390-6397 Akira Tawada, Takahiro Masa etal. Large-scale preparation, purification, and characterization of hyaluronan oligosaccharides4-mers to 52-mers. Glycobiology vol 12 no.7 pp.421-426, 2002

本発明者らは、上記従来技術の問題点を克服すべく鋭意研究、検討を重ねた結果、低分子の不飽和型ヒアルロン酸糖鎖が格段にすぐれた表皮細胞賦活作用、コラーゲン合成促進効果、及びセラミド合成酵素活性化促進効果を有することを見出して本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明は不飽和型の低分子ヒアルロン酸又はその塩を有効成分とする化粧料である。
また、本発明は、２糖、４糖、６糖及び８糖の糖鎖を有する不飽和型のヒアルロン酸又はそれらの塩のうちのいずれか１以上を有効成分とする化粧料である。
また、本発明は、ヒアルロン酸又はその塩を酵素又は微生物により分解して得られる不飽和型の低分子ヒアルロン酸又はその塩を有効成分とする化粧料である。
なお、本発明において化粧料なる文言は、所謂化粧料のほかに医薬部外品をも含む広義で用いる。

本発明によれば、低分子の不飽和型ヒアルロン酸を有効成分とする化粧料であって、当該有効成分が、格段にすぐれた表皮細胞賦活効果、コラーゲン合成促進効果、及びセラミド合成酵素活性亢進効果を有することから、肌のハリ、ツヤを向上させて、肌のシワ、たるみを予防、改善し、すぐれた美肌効果を有する化粧料を提供することができる。さらに、上記有効成分である不飽和型ヒアルロン酸は低分子化されているため、皮膚への浸透性及び使用感にすぐれた化粧料を提供することができる。

図１は、製造例１の不飽和型の低分子ヒアルロン酸のＬＣ−ＭＳ分析結果を示す図である。 図２は、製造例２の不飽和型の低分子ヒアルロン酸のＬＣ−ＭＳ分析結果を示す図である。

以下に本発明について詳細に説明する。
本発明の有効成分である不飽和型ヒアルロン酸は、非還元末端糖であるＤ−グルクロン酸の４位と５位に二重結合を有している２糖ユニットの不飽和型ヒアルロン酸（化学式１）である。本発明においては、皮膚への浸透性及び効果の有効性の観点から、８糖以下の低分子の不飽和型ヒアルロン酸糖鎖が好ましい。

本発明の低分子の不飽和型ヒアルロン酸は、市販品を用いても良いが、ヒアルロン酸又はその塩を分解する方法によっても得られる。分解方法としては、例えば、酵素分解法、微生物による分解法、アルカリ分解法、加熱処理法、又は超音波処理法等が挙げられるが、微生物による分解法又は酵素分解法が好ましい。

上述した分解方法によって不飽和型ヒアルロン酸を得る場合に、原料として用いるヒアルロン酸又はその塩類は、特に限定されるものではないが、市販品或いはヒアルロン酸又はその塩類を得ることができる天然物由来の素材から調製したものが使用できる。本発明に使用するヒアルロン酸の分子量は、特に限定されるものではなく、いずれの分子量を有するヒアルロン酸も使用可能である。ヒアルロン酸は、遊離型若しくは塩型でもよいが、安定に使用することができる塩型が特に好ましい。

ヒアルロン酸の塩類としては、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、セシウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩などの無機金属塩類、リジン塩、アルギニン塩、ヒスチジン塩等の塩基性アミノ酸塩、アンモニウム塩、テトラブチルアンモニウム塩、トリエタノールアミン塩、ジイソプロパノールアミン塩等の有機塩類がヒアルロン酸の好適な塩として挙げられ、特に汎用的であるアルカリ金属塩が好ましく、ナトリウム塩がより好ましい。

次に、上記ヒアルロン酸又はその塩を微生物により発酵させて低分子の不飽和型ヒアルロン酸を得る場合について説明する。微生物としては、ヒアルロン酸又はその塩類を不飽和型ヒアルロン酸に分解する微生物としては、例えば、ストレプトマイセス（Streptomyces）属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属、ペプトコッカス（Peptococcus）属、アルスロバクター（Arthrobacter）属、シノモナス（Sinomonas）属、プロテウス（Proteus）属、フラボバクテリウム（Flavobacterium）属などが挙げられる。

本発明に使用される微生物の培養に用いられる培地は、本発明の微生物が資化することができる炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、本発明の微生物の培養を効率的に行える培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。

培地中の炭素源の具体例としては、例えば、グルコース、マンノース、フルクトース、マンニトール、イノシトール、スターチ等の炭水化物を挙げることができる。窒素源の具体例としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、乳酸アンモニウム等の各種無機アンモニウム塩や有機アンモニウム塩、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、大豆粉、綿実かす等を挙げることができる。

無機物の具体例としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、硫酸亜鉛、炭酸カルシウム等を挙げることができる。また、必要に応じて、チアミン、ビオチン等のビタミン類、グルタミン酸、アスパラギン酸等のアミノ酸、アデニン、グアニン等の核酸関連物質を添加してもよい。

本発明の菌株によるヒアルロン酸又はその塩類の発酵処理方法は、菌株の培養菌体そのままを用いて、ヒアルロン酸又はその塩類が含有している水溶液に接触させる。具体的には、培養菌体を滅菌水で１０^７〜１０^８個/ｍＬ程度に懸濁し、その懸濁液をヒアルロン酸又はその塩類を含有した水溶液の重量に対し、１．０ｗ/ｖ％接種する。

本発明に用いられる菌株の培養方法としては、振盪培養、通気攪拌培養、平板静置培養等のいずれの方法を用いても良い。培養温度は使用する菌の最適生育温度とすることが好ましく、一般的には、２０〜４５℃の温度範囲で行うことが好ましい。培養時間は、２０〜４５℃で培養する場合、一般的には１８時間〜７日間程度とすることが好ましい。また、培養中のｐＨとしては、ｐＨ４．０〜９．０とすることができるが、中性付近に保持することが好ましい。ｐＨ調整は、無機酸あるいは有機酸、アルカリ溶液、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行うことができる。

処理生成物であるヒアルロン酸又はその塩類の発酵物の滅菌方法としては、加熱滅菌、高圧蒸気滅菌、ろ過滅菌、紫外線殺菌等が好ましく、加熱殺菌で行うことがより好ましい。

酵素分解方法を用いる場合には、その分解酵素としてヒアルロン酸分解酵素（ヒアルロニダーゼ）が挙げられる。これらの酵素は既に市販されているものでも、また、微生物から単離・精製したものであっても良い。不飽和型ヒアルロン酸を製造する酵素としては、例えば、非特許文献５，６に記載されているヒアルロニダーゼが挙げられる。

以上の方法により生成された発酵処理物及び酵素分解物には、Ｄ−グルクロン酸の４位と５位に二重結合を有している不飽和型ヒアルロン酸が含まれる。上述した本発明の発酵条件によれば、２糖、４糖、６糖及び８糖の糖鎖を有する不飽和型のヒアルロン酸又はそれらの塩のうちのいずれか１以上を得ることができる。

以上のようにして得られる不飽和型の低分子ヒアルロン酸を配合してなる化粧料（医薬部外品も含む）としては、例えば乳液、クリーム、ローション、エキス、パック、洗顔料などの基礎化粧料、口紅、ファンデーション、リキッドファンデーション、メイクアッププレスパウダーなどのメイクアップ化粧料、洗顔料、ボディシャンプー、石けんなどの清浄用化粧料、さらには浴剤、毛髪用化粧料（シャンプー、コンディショナー）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

本発明の化粧料における不飽和型の低分子ヒアルロン酸の配合量は、固形分として、基礎化粧料の場合は、一般に０．００１〜１０重量％、好ましくは０．０１〜１重量％の範囲、メイクアップ化粧料の場合は、一般に０．００１〜５重量％、好ましくは０．０１〜０．５重量％の範囲、清浄用化粧料の場合は、一般に０．０１〜０．５重量％、また、浴剤の場合は、一般に０．００１〜１０重量％、好ましくは０．０１〜１重量％の範囲である。

本発明の化粧料には、上記の必須成分の他に、通常の化粧料に用いられる配合成分、例えば油性成分、界面活性剤、保湿剤、増粘剤、防腐・殺菌剤、粉体成分、紫外線吸収剤、色素、香料、抗酸化剤、金属イオン封鎖剤、ｐＨ調整剤等を配合しても良い。

ここで、油性成分としては、例えばオリーブ油、ホホバ油、ヒマシ油、大豆油、米油、米胚芽油、ヤシ油、パーム油、カカオ油、メドウフォーム油、シアーバター、ティーツリー油、アボガド油、マカデミアナッツ油、植物由来スクワランなどの植物由来の油脂類；ミンク油、タートル油などの動物由来の油脂類；ミツロウ、カルナウバロウ、ライスワックス、ラノリンなどのロウ類；流動パラフィン、ワセリン、パラフィンワックス、スクワランなどの炭化水素類；ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、イソステアリン酸、ｃｉｓ−１１−エイコセン酸などの脂肪酸類；ラウリルアルコール、セタノール、ステアリルアルコールなどの高級アルコール類；ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、オレイン酸ブチル、２−エチルヘキシルグリセライド、高級脂肪酸オクチルドデシル（ステアリン酸オクチルドデシルなど）などの合成エステル類及び合成トリグリセライド類などが挙げられる。

界面活性剤としては，例えばポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステルなどの非イオン界面活性剤；脂肪酸塩、アルキル硫酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、ポリオキシエチレン脂肪アミン硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル燐酸塩、α−スルホン化脂肪酸アルキルエステル塩、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル燐酸塩などのアニオン界面活性剤；第四級アンモニウム塩、第一級〜第三級脂肪アミン塩、トリアルキルベンジルアンモニウム塩、アルキルピリジニウム塩、２−アルキル−１−アルキル−１−ヒドロキシエチルイミダゾリニウム塩、Ｎ，Ｎ−ジアルキルモルフォルニウム塩、ポリエチレンポリアミン脂肪酸アミド塩などのカチオン界面活性剤；Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−アルキル−Ｎ−カルボキシメチルアンモニオベタイン、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリアルキル−Ｎ−アルキレンアンモニオカルボキシベタイン、Ｎ−アシルアミドプロピル−Ｎ′，Ｎ′−ジメチル−Ｎ′−β−ヒドロキシプロピルアンモニオスルホベタインなどの両性界面活性剤などを使用することができる。

また、乳化剤乃至乳化助剤として、酵素処理ステビアなどのステビア誘導体、レシチン及びその誘導体、乳酸菌発酵米、乳酸菌発酵発芽米、乳酸菌発酵穀類（麦類、豆類、雑穀など）、ビャッキュウ抽出物、ジョアゼイロ（Zizyphus joazeiro)抽出物などを配合することもできる。

保湿剤としては、例えばグリセリン、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ポリエチレングリコール、ソルビトール、キシリトール、ピロリドンカルボン酸ナトリウムなどがあり、さらにトレハロースなどの糖類、乳酸菌発酵米、ヒアルロン酸及びその誘導体（例えば分子量数千から数百万のヒアルロン酸又はその塩類、アセチル化ヒアルロン酸、ヒアルロン酸プロピレングリコール、ヒアルロン酸ヒドロキシプロピルトリモニウムなど）、ムコ多糖類（例えばコンドロイチン及びその誘導体、ヘパリン及びその誘導体など）、エラスチン及びその誘導体、コラーゲン及びその誘導体、加水分解シルク蛋白質、ＮＭＦ関連物質、乳酸、尿素、高級脂肪酸オクチルドデシル、フィトステロール、大豆リン脂質、イソステアリン酸コレステリル、海藻抽出物、魚介類由来コラーゲン及びその誘導体、各種アミノ酸及びそれらの誘導体（例えばトリメチルグリシンなど）、ヘチマ抽出物、ビャッキュウ抽出物、豆乳発酵液、納豆エキス、米由来抽出物及びその発酵物などが挙げられる。

増粘剤としては、例えばアルギン酸、寒天、カラギーナン、フコイダンなどの褐藻、緑藻或いは紅藻由来成分、ビャッキュウ抽出物、ペクチン、ローカストビーンガム、アロエ多糖体などの多糖類、キサンタンガム、トラガントガム、グアーガムなどのガム類、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロースなどのセルロース誘導体、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アクリル酸・メタクリル酸共重合体などの合成高分子類、ポリグルタミン酸及びその誘導体、グルコシルトレハロースと加水分解水添澱粉を主体とする糖化合物などが挙げられる。

防腐・殺菌剤としては、例えば尿素、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチルなどのパラオキシ安息香酸エステル類、フェノキシエタノール、ジクロロフェン、ヘキサクロロフェン、塩酸クロルヘキシジン、塩化ベンザルコニウム、サリチル酸、エタノール、ウンデシレン酸、フェノール類、ジャマール（イミダゾデイニールウレア）、１，２−ペンタンジオール、１，３−ブチレングリコール、各種精油類、樹皮乾留物、プロポリスエキス、メチルイソチアゾリノンなどがある。

粉体成分としては、例えばセリサイト、酸化チタン、タルク、カオリン、ベントナイト、酸化亜鉛、炭酸マグネシウム、酸化マグネシウム、酸化ジルコニウム、硫酸バリウム、無水ケイ酸、雲母、６−又は１２−ナイロンパウダー、ポリエチレンパウダー、シルクパウダー、セルロース系パウダー、穀類（米、麦、トウモロコシ、キビなど）のパウダー、豆類（大豆、小豆など）のパウダーなどがある。

紫外線吸収剤としては、例えばパラアミノ安息香酸エチル、パラジメチルアミノ安息香酸エチルヘキシル、サリチル酸アミル及びその誘導体、パラメトキシ桂皮酸２−エチルヘキシル、桂皮酸オクチル、オキシベンゾン、２，４−ジヒドロキシベンゾフェノン、２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン−５−スルホン酸塩、４−ターシャリーブチル−４−メトキシベンゾイルメタン、２−（２−ヒドロキシ−５−メチルフェニル）ベンゾトリアゾール、ウロカニン酸、ウロカニン酸エチル、アロエ抽出物などがある。

抗酸化剤としては、例えばブチルヒドロキシアニソール、ブチルヒドロキシトルエン、没食子酸プロピル、ビタミンＥ及びその誘導体、ユビデカキノン（ユビキノン）、ルチン、ルチングルコシド、白芥子抽出物、イネ抽出物、ムラサキシキブ抽出物、シラカバ抽出物、ハマメリス抽出物、ウーロン茶抽出物、黒豆加水分解抽出液、シャクヤク抽出物、ビャッキュウ抽出物、ハゴロモグサ抽出液などがある。

金属イオン封鎖剤としては、例えばエチレンジアミンヒドロキシエチル三酢酸三ナトリウム、エデト酸又はその塩類、グルコン酸、フィチン酸、ポリリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム、ヒドロキシエタンジホスホン酸四ナトリウムなどがある。

ｐＨ調整剤としては、例えばクエン酸又はその塩類、乳酸又はその塩類、グリコール酸、コハク酸、塩酸、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどがある。

さらに必要ならば、本発明で用いる不飽和型ヒアルロン酸糖鎖の作用効果及び特長を損なわない範囲で、他の生理活性成分（美白剤、皮膚老化防止・肌荒れ改善剤など）を配合してもよい。

美白剤としては、ｔ−シクロアミノ酸誘導体、コウジ酸及びその誘導体、アスコルビン酸及びその誘導体、ハイドロキノン又はその誘導体、エラグ酸及びその誘導体、ニコチン酸及びその誘導体、レゾルシノール誘導体、トラネキサム酸及びその誘導体、４−メトキシサリチル酸カリウム塩、マグノリグナン（５,５'−ジプロピル−ビフェニル−２,２’−ジオール）、４−ＨＰＢ（ロドデノール、４−(４−ヒドロキシフェニル）−４−ブタノール））、ヒドロキシ安息香酸及びその誘導体、ビタミンＥ及びその誘導体、α−ヒドロキシ酸、ＡＭＰ（アデノシンモノホスフェイト、アデノシン１リン酸）、例えば、美白成分として、胎盤抽出液、ソウハクヒ抽出物、ユキノシタ抽出物、米糠抽出物又はその加水分解物、白芥子抽出物又はその加水分解物、白芥子の発酵物、シャクヤク抽出物又はその加水分解物、乳酸菌醗酵米、乳酸菌醗酵発芽米、乳酸菌醗酵穀類（麦類、豆類、雑穀類）、ムラサキシキブ抽出物、ハス種子抽出物又はその加水分解物、ハス種子発酵物、党参抽出物、ハトムギ加水分解物、ハトムギ種子発酵物、ローヤルゼリー発酵物、酒粕発酵物、パンダヌス・アマリリフォリウス(Pandanus amaryllifolius Roxb.)抽出物、アルカンジェリシア・フラバ（Arcangelicia flava Merrilli）抽出物、カミツレ抽出物等が上げられ、これらを単独で配合しても、複数を組み合わせて配合しても良い。上記のコウジ酸誘導体としては、例えばコウジ酸モノブチレート、コウジ酸モノカプレート、コウジ酸モノパルミテート、コウジ酸ジブチレートなどのコウジ酸エステル類、コウジ酸エーテル類、コウジ酸グルコシドなどのコウジ酸糖誘導体等が、アスコルビン酸誘導体としては、例えばＬ−アスコルビン酸−２−リン酸エステルナトリウム、Ｌ−アスコルビン酸−２−リン酸エステルマグネシウム、Ｌ−アスコルビン酸−２−硫酸エステルナトリウム、Ｌ−アスコルビン酸−２−硫酸エステルマグネシウムなどのアスコルビン酸エステル塩類、Ｌ−アスコルビン酸−２−グルコシド、Ｌ−アスコルビン酸−５−グルコシドなどのアスコルビン酸糖誘導体、それらアスコルビン酸糖誘導体の６位アシル化物（アシル基は、ヘキサノイル基、オクタノイル基、デカノイル基など）、Ｌ−アスコルビン酸テトライソパルミチン酸エステル、Ｌ−アスコルビン酸テトララウリン酸エステルなどのＬ−アスコルビン酸テトラ脂肪酸エステル類、３−Ｏ−エチルアスコルビン酸、Ｌ−アスコルビン酸−２−リン酸−６−Ｏ−パルミテートナトリウム、グリセルアスコルビン酸等が、ハイドロキノン誘導体としては、アルブチン（ハイドロキノン−β−Ｄ−グルコピラノシド）、α−アルブチン（ハイドロキノン−α−Ｄ−グルコピラノシド）等が、トラネキサム酸誘導体としては、トラネキサム酸エステル（例えば、トラネキサム酸ラウリルエステル、トラネキサム酸ヘキサデシルエステル、トラネキサム酸セチルエステル又はその塩）、トラネキサム酸のアミド体（例えば、トラネキサム酸メチルアミド）などが挙げられ、レゾルシノール誘導体としては、例えば、４−ｎ−ブチルレゾルシノール、４−イソアミルレゾルシノール等が、２，５−ジヒドロキシ安息香酸誘導体としては、例えば２，５−ジアセトキシ安息香酸、２−アセトキシ−５−ヒドロキシ安息香酸、２−ヒドロキシ−５−プロピオニルオキシ安息香酸等が、ニコチン酸誘導体としては、例えばニコチン酸アミド、ニコチン酸ベンジル等が、ビタミンＥ誘導体としては、例えばビタミンＥニコチネート、ビタミンＥリノレート等が、α−ヒドロキシ酸としては、例えば乳酸、リンゴ酸、コハク酸、クエン酸、α−ヒドロキシオクタン酸等がある。

また、皮膚老化防止・肌荒れ改善成分としては、サンゴ草抽出物、イネの葉の抽出物又はその加水分解物、ナス（水ナス、長ナス、賀茂ナス、米ナス等）抽出物又はその加水分解物、カタメンキリンサイ等の海藻の抽出物、アマモ等の海産顕花植物の抽出物、クラゲ水、米抽出物又はその加水分解物、米醗酵エキス、発芽米抽出物又はその加水分解物、発芽米発酵物、黒豆抽出物又はその加水分解物、リノール酸及びその誘導体もしくは加工物（例えばリポソーム化リノール酸など）、動物又は魚由来のコラーゲン及びその誘導体、エラスチン及びその誘導体、セラミドなどの細胞間脂質、グリチルリチン酸及びその誘導体（ジカリウム塩等）、ｔ−シクロアミノ酸誘導体、ビタミンＡ及びその誘導体、ｔ−シクロアミノ酸誘導体、ビタミンＡ及びその誘導体、ビタミンＥ及びその誘導体（ｄ，ｌ−α−トコフェリルリン酸ナトリウムなど）、アラントイン、α−ヒドロキシ酸類、ジイソプロピルアミンジクロロアセテート、γ−アミノ−β−ヒドロキシ酪酸、コエンザイムＱ−１０、α−リポ酸、エルゴチオネイン、アラントイン、ジイソプロピルアミンジクロロアセテート、γ−アミノ−β−ヒドロキシ酪酸、ゲンチアナ抽出物、甘草抽出物、ニンジン抽出物、アロエ抽出物、ミツイシコンブ抽出物、アナアオサ抽出物、ジュアゼイロ（Zizyphus joazeiro)抽出物、ブナ抽出物、キダチアロエ抽出物、マンネンロウ抽出物、イチョウ抽出物、スギナ抽出物、ベニバナ抽出物、オタネニンジン抽出物、セイヨウニワトコ抽出物、ハゴロモグサ抽出物、レンゲ抽出物、マンゴー抽出物、チェリモヤ抽出物、マンゴスチン抽出物、タベブイア・インペティギノーサ抽出物、酵母抽出物、卵殻膜抽出蛋白質、デオキシリボ核酸カリウム塩、ハス種子発酵液、花粉荷エキスなどが挙げられる。

次に、製造例、実施例（皮膚外用剤の処方例）、及び試験例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はそれらに限定されるものではない。なお、以下において、部はすべて重量部を、また％はすべて重量％を意味する。本発明の不飽和型の低分子ヒアルロン酸は、市販のものを利用してよいが、下記のようにヒアルロン酸から製造することも可能である。

製造例１：微生物を用いた不飽和型の低分子ヒアルロン酸の製造
ヒアルロン酸ナトリウム塩（キッコーマンバイオケミファ(株)製、商品名：FCH-SU、分子量５〜１１万）の粉末５ｇを水４９５ｇに加えて１％水溶液を調製し、加熱殺菌した。この液にSinomonas atrocyaneaを１０^８個／ｍＬに調整した菌懸濁液５ｍＬを接種し、３２℃で５日間培養した。培養終了後、培養液を加熱殺菌して、ろ過し、低分子ヒアルロン酸溶液を得た（液量：４４０ｇ、固形分１．０％）。

製造例１により得られたヒアルロン酸に対して下記の条件でＬＣ−ＭＳ分析（質量分析）を行った。
[ＬＣ−ＭＳ条件]
・カラム：Gemini（登録商標）C18 110Å（4.6×150nm），Gurad
Column
・カラム温度：30℃
・移動相Ａ：１５ｍＭトリブチルアミンと５０ｍＭ酢酸アンモニウムを含むアセトニトリル／水（２０：８０）溶液、酢酸でｐＨ７．０に調整
・移動相Ｂ：１５ｍＭトリブチルアミンと５０ｍＭ酢酸アンモニウムを含むアセトニトリル／水（６５：３５）溶液、酢酸でｐＨ７．０に調整
・流速：０．３ｍＬ／分
・溶出：溶媒Ａから溶媒Ｂへの直線濃度勾配（０〜２５％：３０分）
・試料注入量：２０μＬ
・イオン源温度：１１０℃
・イオンモード：ＥＳＩ Ｎｅｇａｔｉｖｅ
・キャピラリー電圧：３．５０ｋＶ
・脱溶媒ガス：窒素
・脱溶媒ガス流量：５００Ｌ／ｈ
・脱溶媒ガス温度：３５０℃
・コーンガス流量：５０Ｌ／ｈ
・ＬＣ検出器：Waters Alliance（登録商標）2695／PDA2996
・ＭＳ：Quattro micro API

上記の条件によるＬＣ−ＭＳ分析結果を図１に示す。図1に示すように、ＬＣ分析の結果、保持時間６．４分付近でピークを確認した。このピークをＭＳ解析した結果、不飽和型の２糖由来の(Ｍ−Ｈ)⁻イオンが検出されたことから、製造例１により得られるヒアルロン酸は不飽和型の２糖であることが同定された。

製造例２．微生物を用いた不飽和型の低分子ヒアルロン酸の製造
ヒアルロン酸ナトリウム塩（資生堂(株)社製、商品名：HA12N、平均分子量１２０万）の粉末５ｇを水４９５ｇに加えて１％水溶液を調製し、加熱殺菌した。この液に、Sinomonas atrocyaneaを１０^８個／ｍＬに調整した菌懸濁液５ｍＬを接種し、３２℃で５日間培養した。培養終了後、培養液を加熱殺菌して、ろ過し、低分子ヒアルロン酸溶液を得た（液量：４５０g、固形分１．１％）。

上記条件により製造例２のヒアルロン酸に対してＬＣ−ＭＳ分析を行った。その結果を図２に示す。図２に示すように、ＬＣ分析の結果、保持時間が、６．４分、７．８分、１０．３分、及び１２．９分付近でピークを確認した。これらのピークについてＭＳ解析した結果、不飽和型の２糖由来の(Ｍ−Ｈ)⁻イオン、４糖由来の（Ｍ−Ｈ)⁻イオン、６糖由来の（Ｍ−Ｈ)⁻イオン及び（Ｍ−２Ｈ)^２−イオン、８糖由来の（Ｍ−Ｈ)⁻イオン及び（Ｍ−２Ｈ)^２−イオンが検出されたことから、製造例２により得られるヒアルロン酸は不飽和型の２糖、４糖、６糖及び８糖であることが同定された。

製造例３．微生物を用いた不飽和型の低分子ヒアルロン酸の製造
ヒアルロン酸ナトリウム塩（キッコーマンバイオケミファ(株)製、商品名：FCH-SU、分子量５〜１１万）の粉末５ｇを水４９５ｇに加えて１％水溶液を調製し、加熱殺菌した。この液に、Streptococcus dysgalactiae を１０^８個／ｍＬに調整した菌懸濁液５ｍＬを接種し、３７℃で５日間培養した。培養終了後、培養液を加熱殺菌して、ろ過し、低分子ヒアルロン酸溶液を得た（液量：４２５ｇ、固形分０．８％）。

上記条件により製造例３のヒアルロン酸溶液に対してＬＣ−ＭＳ分析を行ったところ、当該ヒアルロン酸は、製造例１の低分子ヒアルロン酸と同様に、不飽和型の２糖であることが同定された。

製造例４．酵素を用いた不飽和型ヒアルロン酸の製造
ヒアルロン酸ナトリウム塩（キッコーマンバイオケミファ(株)製、商品名：FCH-SU、分子量５〜１１万）の粉末５ｍｇに０．１％ＢＳＡを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．２）４９０μＬを加えて溶解し、加熱殺菌した。この液にヒアルロニダーゼ（Sigma Aldrich社製、商品名：Hyaluronate Lyase from
Streptococcus pyogenes）を３７℃、６時間を作用させた後、限外ろ過（ＭＥＲＣＫ社製、商品名：Amicon Ultra-0.5(Cut off MW.10,000)）を行い、低分子ヒアルロン酸溶液を得た（液量：４５０μＬ、固形分４ｍｇ、ただし塩類を含む）。

上記条件により製造例４のヒアルロン酸に対してＬＣ−ＭＳ分析を行ったところ、当該ヒアルロン酸は、製造例１の低分子ヒアルロン酸と同様に、不飽和型の２糖であることが同定された。

比較例１：ヒアルロン酸水溶液の製造
ヒアルロン酸ナトリウム塩（キッコーマンバイオケミファ(株)製、商品名：FCH-SU、分子量５〜１１万）の粉末１ｇを精製水９９ｇに加えて、ヒアルロン酸水溶液を得た。

実施例１．クリーム
［Ａ成分］ 部
流動パラフィン ５．０
トリオクタン酸グリセリル ４．０
パラフィン ５．０
グリセリルモノステアレート ２．０
ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノステアレート ６．０
ブチルパラベン ０．１
［Ｂ成分］
製造例１の不飽和型の低分子ヒアルロン酸 １０．０
グリセリン ５．０
カルボキシメチルモノステアレート ０．１
エデト酸ナトリウム ０．１
精製水 全量が１００部となる量
［Ｃ成分］
香料 適量
上記のＡ成分とＢ成分をそれぞれ８０℃以上に加熱した後、攪拌混合した。これを５０℃まで冷却した後、Ｃ成分を加えてさらに攪拌混合してクリームを得た。

実施例２．クリーム
実施例１のクリームのＢ成分に含まれる製造例１の不飽和型の低分子ヒアルロン酸に代えて、製造例２の不飽和型の低分子ヒアルロン酸を用いる他は、実施例１と同様にしてクリームを得た。

実施例３．乳液
［Ａ成分］ 部
流動パラフィン ６．０
ヘキサラン ４．０
ホホバ油 １．０
ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノステアレート ２．０
大豆レシチン １．５
メチルパラベン ０．１５
エチルパラベン ０．０３
［Ｂ成分］
製造例１の不飽和型の低分子ヒアルロン酸 １０．０
グリセリン ３．０
１，３−ブチレングリコール ２．０
カルボキシメチルセルロース ０．３
ヒアルロン酸ナトリウム ０．０１
エデト酸ナトリウム ０．１
精製水 全量が１００部となる量
［Ｃ成分］
香料 適量
上記のＡ成分とＢ成分をそれぞれ８０℃以上に加熱した後、攪拌混合した。これを５０℃まで冷却した後、Ｃ成分を加えてさらに攪拌混合して乳液を得た。

実施例４．乳液
実施例１のＢ成分に含まれる製造例１の低分子ヒアルロン酸に代えて、製造例３の不飽和型の低分子ヒアルロン酸を用いる他は、実施例３と同様にして乳液を得た。

実施例５．乳液
［Ａ成分］ 部
流動パラフィン ６．０
ヘキサラン ４．０
ホホバ油 １．０
ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート ２．０
大豆レシチン １．５
メチルパラベン ０．１５
エチルパラベン ０．０３
［Ｂ成分］
製造例１の不飽和型の低分子ヒアルロン酸 １０．０
Ｌ−アスコルビン酸−２−グルコシド ２．０
水酸化カリウム ０．５
グリセリン ３．０
１，３−ブチレングリコール ２．０
カルボキシメチルセルロース ０．３
水溶性コラーゲン ０．０１
エデト酸ナトリウム ０．１
精製水 全量が１００部となる量
［Ｃ成分］
香料 適量
上記のＡ成分とＢ成分をそれぞれ８０℃以上に加熱した後、攪拌混合した。これを５０℃まで冷却した後、Ｃ成分を加えてさらに攪拌混合して乳液を得た。

実施例６．乳液
実施例５のＢ成分中、Ｌ−アスコルビン酸−２−グルコシド２．０部及び水酸化カリウム０．５部に代えてＬ−アスコルビン酸−２−リン酸エステルマグネシウム２．０部を用いるほかは実施例５と同様にして乳液を得た。

実施例７．乳液
実施例５のＢ成分中、Ｌ−アスコルビン酸−２−グルコシド２．０部及び水酸化カリウム０．５部に代えてトラネキサム酸２．０部を用いるほかは実施例５と同様にして乳液を得た。

実施例８．乳液
実施例５のＢ成分中、Ｌ−アスコルビン酸−２−グルコシド２．０部及び水酸化カリウム０．５部に代えてアルブチン２．０部を用いるほかは実施例５と同様にして乳液を得た。

実施例９．乳液
実施例５のＢ成分中、Ｌ−アスコルビン酸−２−グルコシド２．０部及び水酸化カリウム０．５部に代えて米糠抽出物加水分解物（固形分濃度3.5％）５．０部を用いるほかは実施例５と同様にして乳液を得た。

実施例１１．乳液
［Ａ成分］ 部
流動パラフィン ６．０
ヘキサラン ４．０
ホホバ油 １．０
ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート ２．０
大豆レシチン １．５
［Ｂ成分］
製造例１の不飽和型の低分子ヒアルロン酸 １０．０
Ｌ−アスコルビン酸−２−グルコシド ２．０
水酸化カリウム ０．５
アルブチン ３．０
グリセリン ３．０
１，３−ブチレングリコール ２．０
カルボキシメチルセルロース ０．３
ヒアルロン酸ナトリウム ０．０１
精製水 全量が１００部となる量

実施例１２．ローション
［成分］ 部
製造例１の不飽和型の低分子ヒアルロン酸 １０．０
エタノール １０．０
グリセリン ３．０
１、３−ブチレングリコール ２．０
メチルパラベン ０．２
クエン酸 ０．１
クエン酸ナトリウム ０．３
カルボキシビニルポリマー ０．１
エデト酸ナトリウム ０．１
香料 適量
水酸化カリウム 適量

精製水 全量が１００部となる量
上記の成分を混合してローションを得た。

実施例１３．ボディシャンプー
［Ａ成分］ 部
Ｎ−ラウロイルメチルアラニンナトリウム ２５．０
ヤシ油脂肪酸カリウム液（４０％） ２６．０
ヤシ油脂肪酸ジエタノールアミド ３．０
メチルパラベン ０．１
［Ｂ成分］
製造例１の不飽和型の低分子ヒアルロン酸 １０．０
１，３−ブチレングリコール ２．０
エデト酸ナトリウム ０．１
精製水 全量が１００部となる量
Ａ成分及びＢ成分をそれぞれ８０℃に加温して均一に溶解した後、Ａ成分にＢ成分を加え、攪拌を続けて室温まで冷却してボディシャンプーを得た。

実施例１４．石けん
［Ａ成分］ 部
硬化ヒマシ油 ２６．０
ヤシ油 １０．０
オリーブ油 ４．０
［Ｂ成分］
水酸化ナトリウム ６．０
砂糖 １０．０
グリセリン ５．０
製造例１の不飽和型の低分子ヒアルロン酸 ５．０
エデト酸ナトリウム ０．１
精製水 全量が１００部となる量
［Ｃ成分］
エタノール ２０．０
香料 適量
Ａ成分及びＢ成分をそれぞれ８０℃に加温して均一に溶解した後、Ａ成分にＢ成分を加えてケン化した。これを攪拌しながら５０℃まで冷却し、Ｃ成分を加えた。これを型に流し込み冷却した後、室温下で数日間乾燥させ、充分に乾燥したものを型から取りだして石けんを得た。

試験例１．表皮細胞賦活効果試験
本試験では、ヒト表皮細胞ＰＨＫ１６−０ｂを、ＨＫＧＳ（クラボウ社製）含有ＭＣＤＢ１５３培地（ＳＩＧＭＡ社製）を入れた９６穴マイクロプレートに１×１０^４
個／穴播種し、３７℃，５．０％ＣＯ_２の条件下に３日間プレ培養した後、製造例１，２の不飽和型の低分子ヒアルロン酸溶液（試料溶液）を０．５％、１．０％の濃度（培地に対する溶液としての最終濃度）となるように上記培地に添加し、同条件でさらに４日間培養した。次に、培地を除去し、０．０３％のＭＴＴを添加して３７℃に１時間保持した後、生成したホルマザンをイソプロパノールで抽出し、マイクロプレートリーダー(Ｍｏｄｅｌ４５０、バイオラッド社製)を用いて波長５７０−６３０ｎｍでＭＴＴ値を測定した。また、試料溶液として比較例１のヒアルロン酸水溶液（培地に対する溶液としての最終濃度が１．０％）を用いて上記と同様の操作を行い、ＭＴＴ値を測定した。さらに、試料溶液に代えてＰＢＳ(-)を添加した試料無添加の場合（対照）についても上記と同様の操作を行い、ここに得られたＭＴＴ値に対する各試料添加区のＭＴＴ値の相対値を求め、この相対値を表皮細胞ＭＴＴ活性率（％）とした。なお、試験系が正常に機能しているかを確認するために、試料溶液の代わりに陽性対照として１００ｍＭのグルコースを添加した場合についても、同様の試験を行った。

試験例１の結果を表１に示す。
[表１]

表１に示すように、製造例１により得られる不飽和型の２糖のヒアルロン酸、及び製造例２により得られる不飽和型の２糖、４糖、６糖及び８糖のヒアルロン酸の混合物は、濃度に依存して格段にすぐれた表皮細胞賦活効果を示し、また、それは同濃度のヒアルロン酸水溶液（比較例１）と比較しても、すぐれた効果を示した。なお、陽性対照であるグルコースの試験結果から本試験系が正常に行われたことも確認された。

試験例２．コラーゲン産生促進効果試験
ヒト表皮細胞ＰＨＫ１６−０ｂを、ＨＫＧＳ（クラボウ社製）含有ＭＣＤＢ１５３培地（ＳＩＧＭＡ社製）を入れた９６穴マイクロプレートに１×１０^４
個／穴播種し、３７℃，５．０％ＣＯ_２の条件下に３日間プレ培養した後、製造例１，２の不飽和型の低分子ヒアルロン酸（試料溶液）を１．０％、２．０％の濃度（培地に対する溶液としての最終濃度）となるように培地に添加し、同条件でさらに４日間培養した。培養終了後、培養上清中に分泌されたIV型コラーゲンをCollagenIV human ELISA kit（Exocell社製）を用いて測定した。培養上清を１００μＬずつヒト胎盤由来のIV型コラーゲンがプレコートされたウエルに添加し、更にGoat Anti-human CollagenIV Antibodyを１００μＬ添加して室温で1時間反応させた。反応液を除去した後充分にウエルを洗浄してRabbit
Anti-Goat IgG HRP Conjugateを１００μＬ添加して室温で1時間反応させた。反応液を除去した後充分にウエルを洗浄してColor Developerを１００μＬ添加し、５〜１０分間反応させた後Color
Stopperを１００μＬ添加して反応を停止させ、ＡＢＳ４５０ｎｍを測定してIV型コラーゲン合成量値とした。また、試料溶液として比較例１のヒアルロン酸水溶液（培地に対する溶液としての最終濃度が２．０％）を用いて上記と同様の操作を行い、IV型コラーゲン合成量値を測定した。また、試料溶液に代えてＰＢＳ(-)を添加した試料無添加の場合（対照）についても上記と同様の操作を行い、ここに得られたIV型コラーゲン合成量値に対する各試料添加区のIV型コラーゲン合成量の相対値を求め、この値をIV型コラーゲン合成率（％）とした。

試験例２の結果を表２に示す。
[表２]

表２に示すように、比較例１のヒアルロン酸水溶液はIV型コラーゲン合成促進効果を全く示さなかったのに対して、製造例１により得られる不飽和型の２糖のヒアルロン酸、及び製造例２により得られる不飽和型の２糖、４糖、６糖及び８糖のヒアルロン酸の混合物は、濃度に依存して格段にすぐれたIV型コラーゲン合成促進効果を示した。

試験例３．セラミド合成酵素活性亢進効果
ヒト表皮細胞ＰＨＫ１６−０ｂを、ＨＫＧＳ（クラボウ社製）含有ＭＣＤＢ１５３培地（ＳＩＧＭＡ社製）を入れた９６穴マイクロプレートに１×１０^４
個／穴播種し、３７℃，５．０％ＣＯ_２の条件下に３日間プレ培養した後、製造例１，２の不飽和型の低分子ヒアルロン酸溶液（試料溶液）を１．０％、２．０％の濃度（培地に対する溶液としての最終濃度）となるように培地に添加し、同条件でさらに４日間培養した。次に、培地を除去し、１ｍＭ Phenylmethyl sulfonyl fluoride（PMSF)、１％Triton-X含有ＰＢＳ(-)溶液を２０μＬ添加して５分間室温で静置して細胞を破砕し、粗酵素液とした。１ｍＭ 4-methylumbelliferyl-β-Glucopyranoside、１０ｍＭ sodium taurocholate、０．１％Triton-X in ０．１Ｍ citrate phosphate buffer (pH5.6)２０μＬ添加して３７℃条件下で1時間反応させた。反応終了後、０．２Ｍ carbonate bicarbonate
buffer (pH10.5)を２００μＬ添加して反応を停止させた。その後、反応液のＥｘ３５５/Ｅｍ４６０における蛍光強度を測定してβ-グルコセレブロシダーゼ活性値とした。また、試料溶液として比較例１のヒアルロン酸水溶液（培地に対する溶液としての最終濃度が２．０％）を用いて上記と同様の操作を行い、β-グルコセレブロシダーゼ活性値を測定した。また、試料溶液に代えてＰＢＳ(-)を添加した試料無添加の場合（対照）についても上記と同様の操作を行い、ここに得られたβ-グルコセレブロシダーゼ活性値に対する各試料添加区のβ-グルコセレブロシダーゼ活性の相対値を求め、この値をβ−グルコセレブロシダーゼ活性率（％）とした。また、試験系が正常に機能しているかを確認するために、試料溶液の代わりに陽性対照として０．００５％ガラクトセレブロシドを添加した場合についても同様の試験を行った。

試験例３の結果を表３に示す。
[表３]

表３に示すように、製造例１により得られる不飽和型の２糖のヒアルロン酸、及び製造例２により得られる不飽和型の２糖、４糖、６糖及び８糖のヒアルロン酸の混合物は、濃度に依存して格段にすぐれたセラミド合成酵素（β-グルコセレブロシダーゼ）活性亢進効果を示し、また、それは同濃度のヒアルロン酸水溶液（比較例１）と比較しても、すぐれた効果を発揮した。なお、陽性対照であるガラクトセレブロシドの試験結果から本試験系が正常に行われたことも確認された。

以上のように、本発明の不飽和型の低分子ヒアルロン酸は、すぐれた表皮細胞賦活効果、コラーゲン産生促進効果、及びセラミド合成酵素活性亢進効果を併せ持ち、かつ、皮膚への浸透性及び使用感にすぐれていることから化粧料の配合成分として有用である。

Claims (3)

1. 不飽和型の低分子ヒアルロン酸又はその塩を有効成分とする化粧料。
2. ２糖、４糖、６糖及び８糖の糖鎖を有する不飽和ヒアルロン酸又はそれらの塩のうちのいずれか１以上を有効成分とする請求項１に記載の化粧料。
3. 上記不飽和型の低分子ヒアルロン酸又はその塩は、ヒアルロン酸又はその塩を酵素又は微生物により分解して得られるものであることを特徴とする請求項１又は２に記載の化粧料。