JP2014221801A - ペプチド模倣大環状分子 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】生物学的に活性な架橋ポリペプチド、更に、前記改善されたポリペプチドを特定および作製する方法。一実施形態では、ヒト全血において有効性が改善された架橋ポリペプチドを特定する方法は、親の架橋ポリペプチドのアナログを合成する工程と、ヒト血清タンパク質の非存在下で、また1つ以上の濃度のヒト血清の存在下で細胞アッセイを行い、それによってヒト血清タンパク質に対する各々の架橋ポリペプチドのみかけの親和性を決定する工程と、を包含する。
【選択図】なし
Description
この出願は、2008年9月22日に出願された表題「Organic Compounds」の米国仮出願第61/099,063号(代理人整理番号35224−742.102)の利益を主張する。この仮出願は、参考としてその全体が本明細書に援用される。
本発明は、血清の存在下で良好な活性を可能にするように、血清タンパク質に対して親和性が低下しており、一方で細胞内へ容易に輸送されるように細胞膜に対する十分な親和性を維持したままであり、受容可能な薬物動態を有するように血清タンパク質に対する十分な親和性を維持しており、かつ細胞内の標的レセプター(単数または複数)に対する高い親和性結合を保持している、架橋ポリペプチドの特定および最適化のための方法を開示する。本発明者らは、これらの目的を達成するためには架橋ポリペプチドへの血清タンパク質結合の最適範囲があることを発見した。本発明はさらに、血清の存在下での優れた細胞透過および生物学的活性、ならびに改善された治療効力または診断活性を有する架橋ポリペプチドの最適化を可能にする構造−活性相関を有する最適化合物を提供する。
ここでnが1であり、EC50がヒト血清の非存在下での全細胞アッセイで測定されるインビトロの効力であり、かつEC’50がN%のヒト血清における全細胞アッセイで測定されたインビトロの効力であり、ここでPが(N/100)×(700)マイクロモルである式によって規定される。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される:
(項目1)
ヒトの全血において最適化された細胞効力を有するポリペプチドを調製する方法であって:
(a)該ポリペプチドの第一のアミノ酸および第二のアミノ酸を接続する架橋剤を含む親ポリペプチドを提供する工程であって、ここで該親ポリペプチドがエネルギー依存性プロセスによって細胞膜を透過して、かつ細胞内標的に結合する工程と;
(b)疎水性が高い側鎖に隣接した酸性の側鎖からなる該親ポリペプチド中の1つ以上のジペプチドモチーフを特定する工程であって、該酸性の側鎖が該標的に結合するのに必須ではない工程と;
(c)該モチーフ中の該酸性の側鎖を中性の側鎖で置き換えて改変された親ポリペプチドを調製する工程と;
(d)全細胞アッセイ中の該改変された親ポリペプチドポリペプチドのインビトロの効力を測定する工程であって、ここで活性が、ヒト血清の存在および非存在において、該細胞内標的に結合することによって媒介される工程と;
(e)ヒト血清タンパク質に対する該改変されたポリペプチドの見かけの親和性(Kd *)およびそのEC50を算出する工程と;
(f)該改変された親ポリペプチドが、該親ポリペプチドのKd *よりも高いKd *および該親ポリペプチドのEC50以下のEC50を有する場合、該改変された親ポリペプチドを最適化ポリペプチドとして選択する工程と、
を包含する、方法。
(項目2)
ポリペプチドの第一のアミノ酸および第二のアミノ酸を接続する架橋剤を含むポリペプチドをスクリーニングする方法であって、該ポリペプチドが、エネルギー依存性のプロセスによって細胞膜を透過して、かつ細胞内標的に結合する方法であって、
(a)全細胞アッセイ中の該ポリペプチドのインビトロの効力を測定する工程であって、ここで活性が、ヒト血清の存在および非存在において、該細胞内標的に結合することによって媒介される工程と;
(b)ヒト血清タンパク質に対する該ポリペプチドの見かけの親和性(Kd *)およびそのEC50を算出する工程と;
(c)1〜700マイクロモル濃度のKd *を有する化合物を選択する工程と、を包含する、方法。
(項目3)
前記選択されたポリペプチドが70マイクロモル濃度未満のKd *を有する、項目1または2に記載の方法。
(項目4)
前記選択されたポリペプチドが約1〜10マイクロモル濃度のKd *を有する、項目1または2に記載の方法。
(項目5)
前記選択されたポリペプチドが約0.1〜50%というヒト血液中の推定遊離画分を保有し、ここで該推定遊離画分が式
によって規定され、かつ[HSA]総が700マイクロモル濃度である、項目1または2に記載の方法。
(項目6)
前記選択されたポリペプチドが約0.5〜10%というヒト血液中の推定遊離画分を保有する、項目1または2に記載の方法。
(項目7)
前記エネルギー依存性の細胞透過機構がエンドサイトーシスである、項目1または2に記載の方法。
(項目8)
前記第一のアミノ酸および前記第二のアミノ酸のうちの少なくとも1つがα,α−二置換アミノ酸である、項目1または2に記載の方法。
(項目9)
前記第一のアミノ酸および前記第二のアミノ酸の両方がα,α−二置換されている、項目1または2に記載の方法。
(項目10)
前記選択されたポリペプチドがらせんを含む、項目1または2に記載の方法。
(項目11)
前記選択されたポリペプチドがαらせんを含む、項目1または2に記載の方法。
(項目12)
前記第一のアミノ酸および前記第二のアミノ酸が、3つのアミノ酸で隔てられている、項目1または2に記載の方法。
(項目13)
前記架橋剤が、6と14との間の連続した結合を含む、項目1または2に記載の方法。
(項目14)
前記架橋剤が、8と12との間の連続した結合を含む、項目1または2に記載の方法。
(項目15)
前記選択されたポリペプチドが約18原子〜26原子の環を含む、項目1または2に記載の方法。
(項目16)
前記第一のアミノ酸および前記第二のアミノ酸が、6つのアミノ酸で隔てられている、項目1または2に記載の方法。
(項目17)
前記架橋剤が、8と16との間の連続した結合を含む、項目1または2に記載の方法。
(項目18)
前記架橋剤が、10と13との間の連続した結合を含む、項目1または2に記載の方法。
(項目19)
前記選択されたポリペプチドが約29原子〜37原子の環を含む、項目1または2に記載の方法。
(項目20)
前記架橋剤がα−らせんの1ターン〜5ターンまでの間に架かる、項目1または2に記載の方法。
(項目21)
前記架橋剤がα−らせんの1ターンに架かる、項目1または2に記載の方法。
(項目22)
前記架橋剤がα−らせんの2ターンに架かる、項目1または2に記載の方法。
(項目23)
前記架橋剤の長さがα−らせんの1ターンあたり約5Å〜約9Åである、項目1または2に記載の方法。
(項目24)
前記選択されたポリペプチドがpH7.4で正味の正の電荷を担持する、項目1または2に記載の方法。
(項目25)
前記選択されたポリペプチドが、1つ以上のハロゲン、アルキル基、蛍光性部分、親和性標識、標的部分または放射性同位元素のうちの1つ以上を含む、項目1または2に記載の方法。
(項目26)
前記選択されたポリペプチドが治療効果を提供する、項目1または2に記載の方法。
(項目27)
前記選択されたポリペプチドが、約1マイクロモル濃度以下というヒト血清タンパク質に対するみかけの親和性を有する、項目1または2に記載の方法。
(項目28)
前記選択されたポリペプチドが、約3マイクロモル濃度以下というヒト血清タンパク質に対するみかけの親和性を有する、項目1または2に記載の方法。
(項目29)
前記選択されたポリペプチドが、約10マイクロモル濃度以下というヒト血清タンパク質に対するみかけの親和性を有する、項目1または2に記載の方法。
(項目30)
前記選択されたポリペプチドが、対応する非架橋ポリペプチドに比べて、エネルギー依存性のプロセスによって細胞膜を透過する能力が改善されている、項目1または2に記載の方法。
(項目31)
前記ジペプチドモチーフ中の前記酸性側鎖および前記疎水性が高い側鎖が前記標的に結合するのに必須ではなく、それぞれ中性または疎水性がより低い側鎖で置換されている、項目1に記載の方法。
(項目32)
前記ポリペプチドの第一のアミノ酸および第二のアミノ酸を接続する架橋剤を含むポリペプチドであって、エネルギー依存性のプロセスによって細胞膜を透過し、かつ細胞内標的に結合する、項目1または2に記載の方法によって選択される、ポリペプチド。
(項目33)
異常なBCL−2ファミリーメンバーの発現または活性に関連する障害を処置または制御する方法であって、該処置または制御の必要な被験体に対して項目1〜32のいずれかに記載のポリペプチドの有効量を投与する工程を包含する、方法。
(項目34)
過剰増殖性細胞において、MAMLタンパク質とNotchタンパク質またはCSLタンパク質との間の相互作用または結合によって媒介される過剰増殖性の疾患または状態を処置または制御する方法であって、該処置または制御の必要な被験体に対して、項目1〜33のいずれかに記載のポリペプチドの有効量を投与する工程を包含する、方法。
(項目35)
異常なBCL−2ファミリーメンバーの発現もしくは活性に関連する障害を処置または制御するため、または過剰増殖性細胞において、MAMLタンパク質とNotchタンパク質またはCSLタンパク質との間の相互作用もしくは結合によって媒介される過剰増殖性の疾患または状態を処置または制御するための医薬の製造における項目1〜34のいずれかに記載のポリペプチドの使用。
(項目36)
項目1または2に記載の方法であって、ここでKd *が式
によって規定され、
ここでnが1であり、かつEC50が任意のヒト血清の非存在下での全細胞アッセイで測定されるインビトロの効力であり、かつEC’50がN%のヒト血清における全細胞アッセイで測定されたインビトロの効力であり、Pが(N/100)×(700)マイクロモル濃度である、方法。
本明細書において言及される全ての刊行物、特許、および特許出願は、各個々の刊行物、特許、または特許出願が、具体的にかつ個々に参照により組み込まれて示されるのと同程度まで、参照により本明細書に援用される。
MDM2結合ドメイン)。「必須」アミノ酸残基とは、ポリペプチドの野生型配列から改変された場合に、結果として、ポリペプチドの必須の生物学的または生化学的活性を消失し、または実質的に消失することになる残基である。
一実施形態では、本発明は、ヒト全血において効力が改善された架橋ポリペプチドを特定する方法を提供し、この方法は、親架橋ポリペプチドのアナログを合成する工程と、ヒト血清タンパク質の非存在下で、およびヒト血清についての2つ以上の濃度の存在下でも細胞アッセイを行って、ヒト血清タンパク質の各々の架橋ポリペプチドの見かけの親和性を決定し、かつ数学的外挿によって全血中のEC50を算出する工程とを包含する。
Lett.2004,14:2309〜2312に見出され得る。
細胞内タンパク質、タンパク質ドメインまたは核酸標的(単数または複数)との相互作用によって生物学的活性を付与すると考えられる、二次構造を含む公知の一次アミノ酸配列を有する任意のタンパク質またはポリペプチドが、本発明の主題である。例えば、ポリペプチドの配列は、分析することが可能で、大環状分子化(macrocyclization)試薬と反応性の基を含有するアミノ酸アナログは、適切な位置で置換することができる。適切な位置は、二次構造のどの分子表面(単数または複数)が、生物学的活性に必要とされ、従って、どの他の表面(単数または複数)を介して、本発明の大環状分子形成リンカーが、生物学的活性に必要とされる表面(単数または複数)を立体的にブロッキングすることなく、大環状分子を形成することができるかを確認することによって決定される。そのような決定は、活性にとって重要な残基(および表面)を可視化するための、二次構造と天然の結合パートナーとの間の複合体のX線結晶解析などの方法を用いるか;活性にとって重要な残基(および表面)を機能的に同定するための、二次構造における残基の配列の変異誘発によるか;または他の方法によって行われる。そのような決定によって、適切なアミノ酸は、本発明のアミノ酸アナログおよび大環状分子形成リンカーで置換される。例えば、α−らせん二次構造については、らせんの1つの表面(例えば、らせんの軸に沿って縦方向にかつらせんの軸のまわりで45〜135°で放射状にわたる分子表面)は、生物学的活性のために、インビボまたはインビトロにおいて、別の生体分子と接触するために必要とされる場合がある。そのような場合において、大環状分子形成リンカーは、活性に直接必要とされないその表面の部分におけるらせんの表面に沿って縦方向にのびながら、らせんの2つのα−炭素を連結するように設計される。
表4は、ヒトGタンパク質共役レセプターを標的とし、かつ多くのヒト疾患状態に関係する配列を挙げている(Tyndallら(2005)、Chem.Rev.105:793〜826)。
この方法のいくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、1つの架橋を含む。この方法の他の実施形態において、上記ポリペプチドは、2つの架橋を含む。この方法のいくつかの実施形態において、1つの架橋は、2つのα−炭素原子を連結する。この方法の他の実施形態において、1つの架橋が結合した1つのα−炭素原子は、式R−の置換基で置換されている。この方法の別の実施形態において、1つの架橋が結合している2つのα−炭素原子は、式R−の独立した置換基で置換される。本発明の方法の一実施形態において、R−は、アルキルである。例えば、R−は、メチルである。あるいは、R−と1つの架橋の任意の部分は一緒になって環状構造を形成することができる。この方法の別の実施形態において、1つの架橋は、連続した炭素−炭素結合から形成される。例えば、1つの架橋は、少なくとも8、9、10、11、または12個の連続した結合を含んでもよい。他の実施形態において、1つの架橋は、少なくとも7、8、9、10、または11個の炭素原子を含んでもよい。
式中:
A、C、D、およびEはそれぞれ独立して、天然または非天然のアミノ酸であり;
Bは、天然もしくは非天然アミノ酸、アミノ酸アナログ、
R1およびR2は独立して、非置換であるかもしくはハロ−で置換される、−H、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアルキル、またはヘテロシクロアルキルであり;
R3は、必要に応じてR5で置換される、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルキルアルキル、シクロアリール、またはヘテロシクロアリールであり;
Lは、式−L1−L2−の大環状分子形成リンカーであり;
L1およびL2は独立して、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、シクロアリーレン、ヘテロシクロアリーレン、または[−R4−K−R4−]nであり、それぞれ、必要に応じてR5で置換され;
R4はそれぞれ、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、またはヘテロアリーレンであり;
Kはそれぞれ、O、S、SO、SO2、CO、CO2、またはCONR3であり;
R5はそれぞれ独立して、ハロゲン、アルキル、−OR6、−N(R6)2、−SR6、−SOR6、−SO2R6、−CO2R6、蛍光性部分、放射性同位体、または治療剤であり;
R6はそれぞれ独立して、−H、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、蛍光性部分、放射性同位体、または治療剤であり;
R7は、必要に応じてR5で置換される、−H、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアリール、もしくはヘテロシクロアリール、またはD残基を有する環状構造の一部であり;
R8は、必要に応じてR5で置換される、−H、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアリール、もしくはヘテロシクロアリール、またはE残基を有する環状構造の一部であり;
uは0〜10の整数であり;
vは1〜1000の整数であり;
wは1〜1000の整数であり;
xは0〜10の整数であり;
yは0〜10の整数であり;
zは0〜10の整数であり;かつ
nは1〜5の整数である。
である。
式中、「AA」は、任意の天然または非天然アミノ酸側鎖を表し、かつ
いくつかの実施形態では、本発明の架橋ポリペプチドは、式(II):
式中:
A、C、DおよびEはそれぞれ独立して、天然または非天然のアミノ酸であり;
Bは、天然もしくは非天然のアミノ酸、アミノ酸アナログ、
R1およびR2は独立して、非置換であるかもしくはハロ−で置換される、−H、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアルキル、またはヘテロシクロアルキルであり;
R3は、必要に応じてR5で置換される、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルキルアルキル、シクロアリール、またはヘテロシクロアリールであり;
Lは、式
L1、L2、およびL3は独立して、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、シクロアリーレン、ヘテロシクロアリーレン、または[−R4−K−R4−]nであり、それぞれ、必要に応じてR5で置換され;
R4はそれぞれ、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、またはヘテロアリーレンであり;
Kはそれぞれ、O、S、SO、SO2、CO、CO2、またはCONR3であり;
R5はそれぞれ、独立して、ハロゲン、アルキル、−OR6、−N(R6)2、−SR6、−SOR6、−SO2R6、−CO2R6、蛍光性部分、放射性同位体、または治療剤であり;
R6はそれぞれ、独立して、−H、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、蛍光性部分、放射性同位体、または治療剤であり;
R7は、必要に応じてR5で置換される、−H、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアリール、もしくはヘテロシクロアリール、またはD残基を有する環状構造の一部であり;
R8は、必要に応じてR5で置換される、−H、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアリール、もしくはヘテロシクロアリールまたはE残基を有する環状構造の一部であり;
uは0〜10の整数であり;
vは1〜1000の整数であり;
wは1〜1000の整数であり;
xは0〜10の整数であり;
yは0〜10の整数であり;
zは0〜10の整数であり;かつ
nは1〜5の整数である。
を提供し、
式中:
A、C、D、およびEはそれぞれ独立して、天然または非天然アミノ酸であり;
Bは、天然もしくは非天然アミノ酸、アミノ酸アナログ、
R1およびR2は独立して、非置換であるかもしくはハロ−で置換される、−H、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアルキル、またはヘテロシクロアルキルであり;
R3は、非置換であるかもしくはR5で置換される、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルキルアルキル、シクロアリール、またはヘテロシクロアリールであり;
L1、L2、L3、およびL4は、独立して、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、シクロアリーレン、ヘテロシクロアリーレン、または[−R4−K−R4−]nであって、それぞれ、非置換であるかまたはR5で置換され;
Kは、O、S、SO、SO2、CO、CO2、またはCONR3であり;
R4はそれぞれ、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、またはヘテロアリーレンであり;
R5はそれぞれ、独立して、ハロゲン、アルキル、−OR6、−N(R6)2、−SR6、−SOR6、−SO2R6、−CO2R6、蛍光性部分、放射性同位体、または治療剤であり;
R6はそれぞれ、独立して、−H、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、蛍光性部分、放射性同位体、または治療剤であり;
R7は、非置換であるかもしくはR5で置換される、−H、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアリール、もしくはヘテロシクロアリールまたはD残基を有する環状構造の一部であり;
R8は、非置換であるかもしくはR5で置換される、−H、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアリール、もしくはヘテロシクロアリールまたはE残基を有する環状構造の一部であり;
uは0〜10の整数であり;
vは1〜1000の整数であり;
wは1〜1000の整数であり;
xは0〜10の整数であり;
yは0〜10の整数であり;
zは0〜10の整数であり;かつ
nは1〜5の整数である。
A、C、D、およびEはそれぞれ独立して、天然または非天然アミノ酸であり;
Bは、天然もしくは非天然アミノ酸、アミノ酸アナログ、
R1およびR2は独立して、非置換であるかもしくはハロ−で置換される、−H、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアルキル、もしくはヘテロシクロアルキル、またはE残基を有する環状構造の一部であり;
R3は、必要に応じてR5で置換される、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルキルアルキル、シクロアリール、またはヘテロシクロアリールであり;
Lは、式−L1−L2−の大環状分子形成リンカーであり;
L1およびL2は独立して、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、シクロアリーレン、ヘテロシクロアリーレン、または[−R4−K−R4−]nであり、それぞれ、必要に応じてR5で置換され;
R4はそれぞれ、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、またはヘテロアリーレンであり;
Kはそれぞれ、O、S、SO、SO2、CO、CO2、またはCONR3であり;
R5はそれぞれ、独立して、ハロゲン、アルキル、−OR6、−N(R6)2、−SR6、−SOR6、−SO2R6、−CO2R6、蛍光性部分、放射性同位体、または治療剤であり;
R6はそれぞれ、独立して、−H、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、蛍光性部分、放射性同位体、または治療剤であり;
R7は、必要に応じてR5で置換される、−H、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアリール、またはヘテロシクロアリールであり;
uは0〜10の整数であり;
vは1〜1000の整数であり;
wは1〜1000の整数であり;
xは0〜10の整数であり;
yは0〜10の整数であり;
zは0〜10の整数であり;かつ
nは1〜5の整数である。
本発明の架橋ポリペプチドは、当技術分野において公知の任意の種々の方法によって調製され得る。例えば、表1、2、3または4において「X」で示される任意の残基が、同じ分子中の第2の残基またはそのような残基の前駆体と架橋剤を形成し得る残基で置換されてもよい。
Amino Acids」を参照のこと。
式中、v、w、x、y、z、A、B、C、D、E、R1、R2、R7、R8、L1およびL2は式(II)で定義されたとおりであり、大環状分子化試薬がCu試薬である場合R12は−Hであり、大環状分子化試薬がRu試薬である場合R12は−Hまたはアルキルである、ペプチド模倣物前駆体を、大環状分子化試薬と接触させる工程を含み、さらにこの接触させる工程が、式IIIまたは式IVにおいてアルキンとアジド部分との間に形成される共有結合をもたらす、方法を提供する。例えば、大環状分子化試薬がRu試薬である場合、R12はメチルであってもよい。
式中、A、C、D’、およびE’はそれぞれ独立して、天然または非天然のアミノ酸であり;
Bは、天然もしくは非天然アミノ酸、アミノ酸アナログ、
R1およびR2は独立して、非置換であるかもしくはハロ−で置換される、−H、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアルキル、もしくはヘテロシクロアルキル、またはE残基を有する環状構造の一部であり;
R3は、必要に応じてR5で置換される、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルキルアルキル、シクロアリール、またはヘテロシクロアリールであり;
L1およびL2は独立して、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、シクロアリーレン、ヘテロシクロアリーレン、または[−R4−K−R4−]nであり、それぞれ、必要に応じてR5で置換されており;
R4はそれぞれ、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、またはヘテロアリーレンであり;
Kはそれぞれ、O、S、SO、SO2、CO、CO2、またはCONR3であり;
R5はそれぞれ独立して、ハロゲン、アルキル、−OR6、−N(R6)2、−SR6、−SOR6、−SO2R6、−CO2R6、蛍光性部分、放射性同位体、または治療剤であり;
R6はそれぞれ独立して、−H、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、蛍光性部分、放射性同位体、または治療剤であり;
R7は、必要に応じてR5で置換される、−H、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアリール、またはヘテロシクロアリールであり;
vは1〜1000の整数であり;
wは1〜1000の整数であり;かつ
xは0〜10の整数である。
を有し、式中、置換基は、前段落において定義されたとおりである。
City、CA)、430A、431、または433型)において合成される。
スキーム8において、ペプチド模倣物前駆体は2つ以上の−SH部分を含んでおり、その2つが特別に保護されており、大環状分子形成のため、その選択的な脱保護およびその後のアルキル化が可能になる。ペプチド模倣物前駆体は、N−α−Fmoc−S−p−メトキシトリチル−L−システイン、N−α−Fmoc−S−p−メトキシトリチル−D−システイン、N−α−Fmoc−S−S−t−ブチル−L−システイン、およびN−α−Fmoc−S−S−t−ブチル−D−システインなどの市販のN−α−Fmocアミノ酸を用いる固相ペプチド合成(SPPS)によって合成される。D−システインまたはL−システインのα−メチル化バージョンは、公知の方法(Seebachら(1996)、Angew.Chem.Int.Ed.Engl.35:2708−2748、およびその参照文献)によって作製され、次いで公知の方法(その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、「Bioorganic Chemistry:Peptides and Proteins」、Oxford University Press、New York:1998)によって、適切に保護されたN−α−Fmoc−S−p−メトキシトリチルまたはN−α−Fmoc−S−S−t−ブチルモノマーに変換される。ペプチド模倣物前駆体のS−S−tブチル保護基は、公知の条件によって選択的に切断される(例えば、DMF中20%2−メルカプトエタノール、参照:Galandeら(2005)、J.Comb.Chem.7:174−177)。次いで前駆体ペプチド模倣物を、樹脂上で、有機溶液においてモル過剰のX−L2−Yと反応させる。例えば、反応は、ジイソプロピルエチルアミンなどの立体障害塩基の存在下で起こる。次いでペプチド模倣物前駆体のMmt保護基は、標準的な条件(例えば、DCM中1%TFAなどの弱酸)によって選択的に切断される。次いでペプチド模倣物前駆体は、樹脂上で有機溶液における立体障害塩基による処理によって環化される。いくつかの実施形態において、アルキル化反応は、NH3/MeOHまたはNH3/DMF(Orら(1991)、J.Org.Chem.56:3146−3149)などの有機溶液中で行われる。次いで架橋ポリペプチドは、標準的な条件(例えば、95%TFAなどの強酸)によって脱保護され、固相樹脂から切断される。
本発明の架橋ポリペプチドの特性を、例えば、以下に記述される方法を用いることによってアッセイする。
溶液中で、α−らせんドメインを有するポリペプチドの二次構造は、ランダムコイル構造とα−らせん構造との間の動的平衡に到達し、「ヘリシティパーセント(percent helicity)」として表される場合が多い。従って、例えば、非改変プロアポトーシスBH3ドメインは大部分が、溶液中で通常25%未満のα−らせん含量を有するランダムコイルである。一方、最適化されたリンカーを有するペプチド模倣大環状分子は、例えば、対応する架橋されていないポリペプチドのそれよりも少なくとも2倍高いα−ヘリシティを有する。いくつかの実施形態において、本発明の大環状分子は、50%より高いα−ヘリシティを有する。BH3ドメインベースの大環状分子などの本発明のペプチド模倣大環状分子のヘリシティをアッセイするために、上記化合物を、水性溶液(例えば、pH7の50mMのリン酸カリウム溶液、または蒸留水(distilled H2O)、25〜50μMの濃度まで)に溶解する。標準的な測定パラメーター(例えば、温度、20℃;波長、190〜260nm;ステップ分解能、0.5nm;速度、20nm/秒;蓄積、10;応答、1秒;帯域幅、1nm;光路長(path length)、0.1cm)を用いて、分光偏光計(例えば、Jasco J−710)において円二色性(CD)スペクトルを得る。平均残基楕円率(例えば、[Φ]222obs)をらせんデカペプチドモデル(Yangら(1986)、Methods Enzymol.130:208)について報告されている値で割ることによって、各ペプチドのα−らせん含量を計算する。
α−らせんなどの二次構造を含む本発明のペプチド模倣大環状分子は、例えば、対応する架橋されていないポリペプチドよりも高い融解温度を示す。代表的には、本発明のペプチド模倣大環状分子は、水性溶液中で高度に安定な構造を表す60℃超のTmを示す。融解温度に対する大環状分子形成の影響をアッセイするために、ペプチド模倣大環状分子または非改変ペプチドを、蒸留水中に溶解(例えば、50μMの最終濃度で)し、分光偏光計(例えば、Jasco J−710)において標準的なパラメーター(例えば、波長222nm;ステップ解像度、0.5nm;速度、20nm/秒;蓄積、10;応答、1秒;帯域幅、1nm;温度上昇速度:1℃/分;光路長、0.1cm)を用いて、ある温度範囲(例えば、4〜95℃)にわたって楕円率の変化を測定することによって、Tmを決定する。
ペプチド骨格のアミド結合は、プロテアーゼによる加水分解を受けやすく、そのためペプチド性化合物は、インビボでの急速な分解に対して脆弱になる。しかし、ペプチドらせん形成は、代表的にはアミド骨格を埋没させ、従って、タンパク質分解性の切断からアミド骨格を保護することができる。本発明のペプチド模倣大環状分子をインビトロのトリプシンタンパク質分解に供して、対応する架橋されていないポリペプチドと比較した分解速度の変化について評価し得る。例えば、ペプチド模倣大環状分子および対応する架橋されていないポリペプチドを、トリプシンアガロースでインキュベートし、遠心分離によって種々の時点で反応をクエンチして、その後HPLC注入して、280nmでの紫外線吸収により残存基質を定量する。簡潔に述べると、ペプチド模倣大環状分子およびペプチド模倣物前駆体(5μg(mcg))を、トリプシンアガロース(Pierce)(S/E約125)で0、10、20、90、および180分間インキュベートする。高速での卓上遠心分離によって反応をクエンチし、HPLCによる280nmでのピーク検出によって単離した上清中の残存している基質を定量する。タンパク質分解反応は一次反応速度式(first−order kinetics)を示し、時間に対するln[S](k=−1X勾配)のプロットから速度定数、kを決定する。
最適化されたリンカーを有するペプチド模倣大環状分子は、例えば、対応する架橋されていないポリペプチドのそれよりも少なくとも2倍高いエキソビボ半減期を有し、かつ12時間以上のエキソビボ半減期を有する。エキソビボの血清安定性研究には、種々のアッセイを用いてもよい。例えば、ペプチド模倣大環状分子および/または対応する架橋されていないポリペプチド(2μg)をそれぞれ、新鮮なマウス血清、ラット血清および/またはヒト血清(例えば、1〜2mL)とともに、37℃で0、1、2、4、8、および24時間インキュベートする。異なる大環状分子濃度のサンプルは、血清を用いた段階希釈によって調製することができる。インタクトな化合物のレベルを決定するために、以下の手順を用いてもよい:100μlの血清を2mlの遠心管に移すこと、その後に10μLの50%ギ酸および500μLのアセトニトリルを添加し、4±2℃で10分間、14,000RPMで遠心分離することによって、サンプルを抽出する。次いで上清を新しい2mlのチューブに移し、TurbovapにおいてN2<10psi下、37℃でエバポレートさせる。サンプルを100μLのアセトニトリル:水(50:50)中で再構成し、LC−MS/MS分析にかける。エキソビボ安定性を試験するための同等または同様の手順は公知であり、血清中の大環状分子の安定性を決定するために用いることができる。
アクセプタータンパク質に対するペプチド模倣大環状分子およびペプチド模倣物前駆体の結合および親和性を評価するために、例えば、蛍光偏光アッセイ(FPA)を用いる。FPA技術は、偏光および蛍光トレーサーを用いて分子の配向および運動性を測定する。偏光によって励起されると、高い見かけの分子量を有する分子に結合している蛍光トレーサー(例えば、FITC)(例えば、大きなタンパク質に結合したFITC標識ペプチド)は、より小さい分子に結合している蛍光トレーサー(例えば、溶液中で遊離しているFITC標識ペプチド)と比較してそのより遅い回転速度のために、より高いレベルの偏光蛍光を発する。
ペプチド(例えば、BH3ペプチドまたはp53ペプチド)とアクセプタータンパク質との間の相互作用をアンタゴナイズする化合物の結合および親和性を評価するために、例えば、ペプチド模倣物前駆体配列に由来するフルオレセイン化ペプチド模倣大環状分子を利用する蛍光偏光アッセイ(FPA)を用いる。このFPA技術は、偏光および蛍光トレーサーを用いて分子の配向および運動性を測定する。偏光によって励起されるとき、高い見かけの分子量を有する分子に結合している蛍光トレーサー(例えば、FITC)(例えば、大きなタンパク質に結合したFITC標識ペプチド)は、より小さい分子に結合している蛍光トレーサー(例えば、溶液中で遊離しているFITC標識ペプチド)と比較してそのより遅い回転速度のために、より高いレベルの偏光蛍光を発する。フルオレセイン化ペプチド模倣大環状分子とアクセプタータンパク質との間の相互作用をアンタゴナイズする化合物は、競合的結合FPA実験において検出される。
インタクトな細胞における、それらの天然アクセプターに対するペプチドまたは架橋ポリペプチドの結合は、免疫沈降実験によって測定することが可能である。例えば、インタクトな細胞を、血清の存在または非存在において、フルオレセイン化(FITC標識)化合物とともに4〜24時間インキュベートする。次いで細胞をペレットにして、溶解緩衝液(50mMのTris[pH7.6]、150mMのNaCl、1%CHAPSおよびプロテアーゼ阻害剤カクテル)中で、10分間4℃でインキュベートする。抽出物を14,000rpmで15分間遠心分離にかけ、上清を回収して10μlのヤギ抗FITC抗体と4℃で回転させながら2時間インキュベートし、その後さらに4℃で2時間、プロテインA/Gセファロース(50μlの50%ビーズスラリー)とインキュベートする。短時間の遠心分離の後、ペレットを、漸増する塩濃度(例えば、150、300、500mM)を含有する溶解緩衝液中で洗浄する。次いで、ビーズを、150mMのNaClで再平衡化させて、その後SDS含有サンプル緩衝液の添加および煮沸を行う。遠心分離後、上清を必要に応じて、4%〜12%勾配Bis−Trisゲルを用いて電気泳動し、その後Immobilon−Pメンブレンに移す。ブロッキング後、必要に応じて、ブロットを、FITCを検出する抗体と、またBCL2、MCL1、BCL−XL、A1、BAX、BAK、MDM2またはMDMXを含む、架橋ポリペプチドに結合するタンパク質を検出する1つ以上の抗体とともに、インキュベートする。
ペプチドまたは架橋ポリペプチドの細胞透過性を測定するために、インタクトな細胞を、フルオレセイン化架橋ポリペプチド(10μM)と一緒に4時間、37℃で、無血清媒体中で、またはヒト血清を補充された媒体中でインキュベートし、媒体で2回洗浄し、トリプシン(0.25%)で10分間、37℃でインキュベートする。細胞を再度洗浄してPBS中に再懸濁する。細胞の蛍光を、例えば、FACSCaliburフローサイトメーターまたはCellomics’ KineticScan(登録商標)HCS Readerのいずれかを用いることによって分析する。
特定の架橋ポリペプチドの効力は、例えば、ヒトまたはマウス細胞集団に由来する種々の腫瘍形成性および非腫瘍形成性の細胞系統ならびに初代細胞を用いる細胞ベースの死滅アッセイにおいて決定される。細胞生存率を、例えば、架橋ポリペプチド(0.5〜50μM)による24〜96時間のインキュベーションにわたってモニターして、EC50<10μMで死滅させる架橋ポリペプチドを特定する。細胞生存率を測定するいくつかの標準的なアッセイが市販されており、架橋ポリペプチドの効力を評価するために必要に応じて用いられる。さらに、架橋ポリペプチドがアポトーシス機構を活性化することによって細胞を死滅させるか否かを評価するために、アネキシンVおよびカスパーゼ活性化を測定するアッセイが必要に応じて用いられる。例えば、細胞内ATP濃度の関数として細胞生存率を決定するCell Titer−gloアッセイが用いられる。
架橋ポリペプチドのインビボ安定性を検討するために、化合物を、例えば、マウスおよび/またはラットに、IV、IP、POまたは吸入経路によって0.1〜50mg/kgの範囲の濃度で投与し、注入後0分、5分、15分、30分、1時間、4時間、8時間および24時間で血液検体を採取する。次いで25μLの新鮮血清中のインタクトな化合物のレベルをLC−MS/MSによって上記のとおり測定する。
インビボでの本発明の架橋ポリペプチドの抗腫瘍形成活性を決定するために、化合物を、例えば、単独で(IP、IV、PO、吸入または鼻腔内経路によって)または最適以下の用量の関連する化学療法(例えば、シクロフォスファミド、ドキソルビシン、エトポシド)と組み合わせて投与する。一例において、ルシフェラーゼを安定に発現する5×106個のRS4;11細胞(急性リンパ芽球性白血病患者の骨髄から樹立した)を、NOD−SCIDマウスの尾静脈内に、全身照射を受けてから3時間後に注入する。治療しないまま放置した場合、この形態の白血病はこのモデルにおいて3週間以内に死に至る。白血病は、例えば、マウスにD−ルシフェリン(60mg/kg)を注入し、麻酔をかけた動物をイメージングする(例えば、Xenogen In Vivo Imaging System、Caliper Life Sciences、Hopkinton、MA)ことによって、容易にモニターされる。全身の生物発光を、Living Image
Software(Caliper Life Sciences、Hopkinton、MA)による光子フラックス(光子/秒)の積分によって定量する。単独のまたは最適以下の用量の関連する化学療法剤と組み合わせたペプチド模倣大環状分子を、例えば、白血病マウス(注入の10日後/実験の1日目、14〜16の生物発光範囲内)に尾静脈またはIP経路で0.1mg/kg〜50mg/kgの範囲の用量で7〜21日間投与する。必要に応じて、実験中1日おきにマウスをイメージングし、実験期間中、毎日生存をモニターする。死亡したマウスを必要に応じて、実験終了の時点で解剖する。別の動物モデルは、ルシフェラーゼを安定に発現する、ヒト濾胞性リンパ腫に由来する細胞系統DoHH2の、NOD−SCIDマウスへの移植である。これらのインビボ試験では必要に応じて、予備的な薬物動態的、薬力学的および毒性データを作成する。
ヒトの治療に対する本発明の架橋ポリペプチドの適合を決定するために、臨床試験を行う。例えば、癌と診断されかつ治療を必要とする患者を選択して、治療群および1つ以上のコントロール群に分け、治療群には本発明の架橋ポリペプチドを投与し、一方コントロール群には、プラセボ、または公知の抗癌剤を与える。従って、本発明の架橋ポリペプチドの治療の安全性および効力は、生存およびクオリティー・オブ・ライフなどの因子に関して患者群の比較を行うことによって評価することができる。この例において、架橋ポリペプチドで治療した患者群は、プラセボで治療した患者コントロール群と比較して長期生存の改善を示す。
本発明の架橋ポリペプチドはまた、薬学的に受容可能な誘導体またはそのプロドラッグも含む。「薬学的に受容可能な誘導体」とは、レシピエントへの投与の際、本発明の化合物を(直接的または間接的に)提供することができる、本発明の化合物の任意の薬学的に受容可能な塩、エステル、エステルの塩、プロドラッグまたは他の誘導体を意味する。特に好ましい薬学的に受容可能な誘導体は、哺乳動物に投与される場合、本発明の化合物のバイオアベイラビリティを増加させる(例えば、経口投与された化合物の血液中への吸収を増加させることによって)か、またはその親種と比較して生物学的区画(例えば、脳またはリンパ系)への活性な化合物の送達を増加させるものである。いくつかの薬学的に受容可能な誘導体は、水溶解度(aqueous solubility)または胃腸粘膜の能動輸送を増大する化学基を含む。
一局面において、本発明は、架橋ポリペプチドがモデリングされる際にタンパク質またはペプチドの天然リガンド(単数または複数)に結合する因子を特定するための競合的結合アッセイにおいて有用である、新規な架橋ポリペプチドを提供する。例えば、p53MDM2系において、p53に基づく標識され安定化された架橋ポリペプチドを、競合的にMDM2に結合する低分子とともにMDM2結合アッセイにおいて用いる。競合的結合研究によって、p53/MDM2系に特異的な薬物候補の迅速なインビトロ評価および決定が可能になる。同様に、BH3/BCL−XL抗アポトーシス系では、BH3に基づく標識された架橋ポリペプチドを、競合的にBCL−XLに結合する低分子とともにBCL−XL結合アッセイにおいて用いてもよい。競合的結合研究によって、BH3/BCL−XL系に特異的な薬物候補の迅速なインビトロ評価および決定が可能になる。本発明はさらに、架橋ポリペプチドに対する抗体の産生を提供する。いくつかの実施形態において、これらの抗体は、架橋ポリペプチド、およびその架橋ポリペプチドが誘導されるp53またはBH3架橋ポリペプチド前駆体の両方に特異的に結合する。そのような抗体は、例えば、p53/MDM2系またはBH3/BCL−XL系をそれぞれ妨害する。
式(I)の架橋ポリペプチドの合成
α−らせん架橋ポリペプチドを、先に記載されたように(Schafmeisterら(2000),J.Am.Chem.Soc.122:5891〜5892;Walenskyら(2004)Science 305:1466−70;Walenskyら(2006)Mol Cell 24:199−210)および以下に示すとおり、合成し、精製し、分析する。ヒトBID BH3、ヒトBIM BH3およびヒトMAMLペプチド配列由来の以下の大環状分子を、この研究に用いる:
Mercury 400)および質量分析法(Micromass LCT)により特徴付ける。ペプチド合成を、固相条件、リンクアミドAM樹脂(rink amide AM resin)(Novabiochem)およびFmoc主鎖保護基化学を用いて、手作業または自動ペプチド合成装置(Applied Biosystems,model 433A)のいずれかで行う。天然Fmoc保護アミノ酸(Novabiochem)のカップリングのために、10当量のアミノ酸および1:1:2モル比のカップリング試薬HBTU/HOBt(Novabiochem)/DIEAを使用する。非天然のアミノ酸(4当量)を、1:1:2モル比のHATU(Applied Biosystems)/HOBt/DIEAを用いてカップリングする。オレフィンメタセシスを、脱気したジクロロメタンに溶解した10mMのGrubbs触媒(Blackewellら,1994、上記)(Materia)を用いて、固相において行い、室温において2時間反応させる。メタセシスされた化合物の単離は、トリフルオロ酢酸が媒介する脱保護および切断、粗生成物を得るためのエーテル沈殿、ならびに純粋な化合物を得るための逆相C18カラム(Varian)における高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)(Varian ProStar)により達成する。純粋な生成物の化学組成は、LC/MS質量分析(Agilent 1100 HPLCシステムとインターフェース接続したMicromass LCT)およびアミノ酸分析(Applied Biosystems、モデル420A)により確認する。
本発明の架橋ポリペプチドで処理された腫瘍細胞株の細胞生存度アッセイ
Jurkat細胞株(クローンE6−1,ATCCカタログ番号TIB−152)は、ATCCによって推奨されるとおり、特定の血清補充培地(RPMI−1640,Invitrogenカタログ番号22400)で増殖させる、本研究の開始の前の日、細胞を最適の細胞密度(2×105〜5×105細胞/ml)で分けて、細胞の活発な分裂を確実にさせる。翌日、細胞を無血清Opti−MEM培地(Invitrogen,カタログ番号51985)中で2回洗浄し、次いで細胞を、96ウェルホワイト組織培養プレート(Nunc,カタログ番号136102)中の50μlのOpti−MEM培地またはOpti−MEM(2%または10%のヒト血清(Bioreclamation,カタログ番号HMSRM)を補充)中で、最適細胞密度(10,000細胞/ウェル)で、プレート培養する。
ヒト血清タンパク質に対するみかけの親和性(Kd *)の決定
EC50シフト分析による血清タンパク質についてのみかけのKd値の測定によって、HSAおよび他の血清タンパク質に結合する実験化合物の傾向を定量する簡易かつ迅速な手段が得られる。血清タンパク質の存在下におけるみかけのEC50(EC’50)とインビトロアッセイに添加された血清タンパク質の量との間には線形の関係が存在する。この関係は、Kd *として表される血清タンパク質についての化合物の結合親和性によって規定される。この項は、複数の実験的に識別不能な結合事象の累積効果から生じ得る、実験的に決定されるみかけの解離定数である。この関係の形態はここでは式0.3に示しており、その由来は、Copelandら、Biorg.Med Chem Lett.2004,14:2309〜2312に見出され得る。
ヒト血清タンパク質に対するみかけの親和性(Kd *)の構造−活性相関
図4は、本発明の架橋ペプチド対のらせんホイール図を示しており、ここでは1つ以上のアミノ酸が変更されて、全細胞アッセイにおける細胞内標的(単数または複数)にむかう改善された効力を有する架橋ペプチドアナログが得られる。いくつかの配列にまたがって、疎水性が高い側鎖に隣接する酸性(負に荷電した)側鎖からなるジペプチドモチーフでは、アナログ(酸性の側鎖が中性の側鎖で置換されている)に対するアルブミンなどの、ヒト血清タンパク質に対する高い親和性の結合を生じることが観察されている。ある場合には、それぞれ、中性および疎水性がより低い側鎖での酸性および疎水性が高い側鎖の両方の置き換えによって、ヒト血清タンパク質に対するより低い親和性が得られる。この構造と活性との相関は、ヒト血清タンパク質、および詳細にはヒト血清アルブミンが、生理学的条件下で脂肪酸に結合するということ、ならびにこれらの脂肪酸が組み合わされた酸性/疎水性結合モチーフによって認識されるという理解と一致している。ヒトおよび動物の細胞の膜は、リン脂質からなること、ならびに脂質二重層のホスフェートヘッド基が、外部膜において負に荷電した表面を提供し、ペプチドの酸性(負に荷電した)側鎖を静電気的に反発すること、そして従って酸性の側鎖を中性の側鎖で置き換えることによって、細胞膜との架橋ポリペプチドの会合が増大するはずであることも公知である。外部膜とのこの会合は、本発明の架橋されたペプチドのエンドサイトーシスにおいて提唱される必要な第一段階である。
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