JP2014193853A - 抗体、フラグメント、医薬組成物、分子及び腫瘍マーカー - Google Patents
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Abstract
【解決手段】従来はクラウディン4抗体としてマウスモノクローナル抗体が作製されているのみに過ぎないが、本発明にかかる抗体は、ラット抗クラウディン4モノクローナル抗体である。このラット抗クラウディン4モノクローナル抗体、ヒトキメラ抗クラウディン4モノクローナル抗体、ヒト化抗クラウディン4モノクローナル抗体を有効成分とする医薬組成物が提供される。この医薬組成物は、膵癌又は膀胱癌等の癌疾患に適用される。
【選択図】図1
Description
本発明にかかる抗CLDN4モノクローナル抗体は、ラット抗CLDN4モノクローナル抗体である。本発明にかかる抗CLDN4モノクローナル抗体は、CLDN4遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、且つ該細胞外領域に結合する。
本実施形態にかかる医薬組成物は、本実施形態にかかるラット抗CLDN4モノクローナル抗体、ヒトキメラ抗CLDN4モノクローナル抗体、ヒト化抗CLDN4モノクローナル抗体若しくはそのフラグメント又はCLDN4エピトープに結合する分子を有効成分とする。
本実施形態にかかる腫瘍マーカーは、癌疾患の予後予測をするための腫瘍マーカーであり、CLDN4からなる。本実施形態においては、腫瘍マーカーとして患者のCLDN4の発現量を測定することにより、癌の検査を行う。CLDN4の発現量が上昇している場合、癌治療に対する予後が不良と予測する。
ヒトCLDN4発現プラスミドの皮下免疫により血清中抗体の上昇が観察されたWistarラット個体(Rt12, 13, 14, 15)に対し、最終免疫(ブースティング)を行った。最終免疫後、常法に従い、動物からリンパ細胞を回収し、マウスミエローマ細胞(P3U1)と細胞融合を行った。融合後の細胞を96well plate 10枚に播種し、培養培地1*にて14日間、37℃、5% CO2下で培養した。
*培養培地1:D-MEM(wako, 044-29765)+10%FCS(Hyclone, Lot.FQF24009), 10% BM condimed H1 Hybridoma cloning supplement(Roche, 1088947), 1×HAT supplement(Invitrogen, 21060017), 50μg/mL Penicillin/Streptomycin(Invitrogen, 15140122), 4mM L-Glutamine(Invitrogen, 25030081)
2)特異モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの樹立
培養後、全てのプレートウェルから培養上清を回収した。ヒトCLDN4発現プラスミドをCHO細胞にLipofectamine2000 (Invitrogen)を用いてトランスフェクションした。トランスフェクション後、24時間で一過性強制発現細胞を回収した。通常のCell-ELISAプロトコルに従い、回収した一過性強制発現細胞を用い、上記で回収した培養上清、及びHRP標識抗ラットIgG抗体で染色した後、蛍光基質Amplex Red reagent(Invitrogen)と反応させ、プレートリーダーで蛍光強度を測定した。この結果、合計84ウェルで陽性を示す蛍光強度が確認された。
*培養培地2:D-MEM(wako, 044-29765)+10%FCS (Hyclone, Lot.FQF24009), 5% BM condimed H1 Hybridoma cloning supplement (Roche, 1088947), 1×HAT supplement (Invitrogen, 21060017), 50μg/mL Penicillin/Streptomycin (Invitrogen, 15140122), 4mM L-Glutamine (Invitrogen, 25030081)
各抗体のクラス、サブクラス決定についての結果を下記表1に記載する。
3−1)ヒト膵癌細胞株に対するCLDN44抗体クローン4D3(以下CLDN4/4D3抗体)の細胞増殖阻害活性
CLDN4を発現するヒト膵癌細胞株MIA-PaCa細胞を2000細胞/200μL/穴になるよう10%ウシ胎児血清(Sigma社製)添加DMEM培養液(Sigma社製)に希釈し96穴プレート(ベクトン・ディッキンス社製)に播種した。このとき1群12穴とした。培養液中には、CLDN4/4D3抗体、又は、CLDN1抗体クローン2C1(VHは、QVQLQQPGAELVKTGASVKLSCKASGYTFASYWMHWVKQRPGQGPEWIGMSHPNIGATKYNEKFKTKATLTVEKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCATSGFDYWGQGTTLTVSS(配列番号17)、VLは、DIVLTQSPDTLSVTPGDSVSLSCRATQSISNNLHWYRQKSHESPRLLIKYASQSVSGIPSRFSGSGSGTDFTLNINSVETEDFGMYFCQQSNSWPFTFGSGTKLEIKR(配列番号18))を最終タンパク濃度が0.25, 0.5, 1.0μg/mLになるように添加し、対照としてPBSを10μL/穴加えた。また、陰性対照として培養液のみをウェルに加えた。
ヒト膵癌細胞株MIA-PaCa細胞を2000細胞/200μL/穴になるよう10%ウシ胎児血清(Sigma社製)添加DMEM培養液(Sigma社製)に希釈し96穴プレート(ベクトン・ディッキンス社製)に播種した。このとき1群8穴とした。培養液中には、CLDN4/4D3抗体を最終タンパク濃度が0.25, 0.5, 1.0μg/mLになるように添加した。対照としてPBSを10μL/穴加えた。また、同時に5-FU(和光純薬社製)を10, 50μg/mLになるように添加した。一方、陰性対照として培養液のみをウェルに加えた。以上の条件で、37℃、24時間培養したのち、MTT試薬(Sigma社製)を25μg/mLになるように培養液に添加し、1時間後に培養液を吸引除去し、DMSO(和光純薬社製)を200μL添加振盪後、マイクロプレート分光光度計を用い、595nm吸光度を測定した。陰性対照の吸光度を除いた吸光値について、PBS対照群を100%として、各抗体濃度における吸光値を相対増殖率(%)として算出した。棒グラフは3回施行した実験の平均±SDを示している。
ヒト膵癌細胞株MIA-PaCa細胞を1×105細胞/10 mL/10 cm培養皿になるよう10%ウシ胎児血清(Sigma社製)添加DMEM培養液(Sigma社製)に希釈し播種した。細胞が90%コンフルエントに増加した状態で、培養液中にCLDN4/4D3抗体を最終濃度が0.25, 0.5, 1.0μg/mLになるように添加した。対照としてPBSを10μL/穴加えた。また、同時に5-FU(和光純薬社製)を1, 10, 50, 100μg/mLになるように添加した。以上の条件で、37℃、24時間培養したのち、細胞をトリプシン処理し回収しタンパク抽出キット(GEヘルスケア社製)にてタンパクを可溶化し、5-FU濃度をELISA(メイベル社製)にて測定し、5-FU処理濃度10μg/mLの際の5-FU細胞内濃度を1.0として相対的濃度を算出した。グラフは3回施行した実験の平均±SDを示している。
ヒト膵癌細胞株MIA-PaCa細胞1x107細胞をHank’s Balanced Salt液(Sigma社製)200μLに懸濁し、BALB/cヌードマウス・オス・4週齢20匹の背部皮下に接種した。これを各群5匹の4群に分け、対照群(PBS投与)、5FU群(5-FU 10 mg/kg体重)、抗体群(CLDN4/4D3抗体 1mg/kg体重)、及び、併用群(5-FU 10 mg/kg体重+CLDN4/4D3抗体 1mg/kg体重)の各処理を行った。投与は腹腔内投与で行い、併用群では5-FUと抗体は混合せず別途投与した。投与は、腫瘍細胞接種時、接種後3日後及び7日後の3回施行した。皮下腫瘍は接種後4週まで毎週直径を測定し、平均±SDとして表示した。
ヒト膀胱癌細胞株T24細胞を2000細胞/200μL/穴になるよう10%ウシ胎児血清(Sigma社製)添加DMEM培養液(Sigma社製)に希釈し96穴プレート(ベクトン・ディッキンス社製)に播種した。このとき1群12穴とした。培養液中には、CLDN4/4D3抗体を最終タンパク濃度が1.0μg/mLになるように添加した。対照としてPBSを10μL/穴加えた。また、同時にCDDP(Alexis社製)を5, 12.5μg/mLになるように添加した。一方、陰性対照として培養液のみをウェルに加えた。以上の条件で、37℃、24時間培養したのち、MTT試薬(Sigma社製)を25μg/mLになるように培養液に添加し、1時間後に培養液を吸引除去し、DMSO(和光純薬社製)を200μL添加震盪後、マイクロプレート分光光度計を用い、595nm吸光度を測定した。陰性対照の吸光度を除いた吸光値について、PBS対照群を100%として、各抗体濃度における吸光値を相対増殖率(%)として算出した。グラフは3回施行した実験の平均±SDを示している。
ヒト膀胱癌細胞株T24細胞を1×109細胞/10 mL/15 cm培養皿になるよう10%ウシ胎児血清(Sigma社製)添加DMEM培養液(Sigma社製)に希釈し96穴プレート(ベクトン・ディッキンス社製)に播種した。このとき1群12穴とした。細胞が90%コンフルエントになった状態で、培養液中にCLDN4/4D3抗体を最終タンパク濃度が1.0 μg/mLになるように添加した。対照としてPBSを10μL/穴加えた。また、同時にCDDP(Alexis社製)を5, 12.5μg/mLになるように添加した。以上の条件で、37℃、24時間培養したのち、細胞をトリプシン処理し回収しタンパク抽出キット(GEヘルスケア社製)にてタンパクを可溶化し、CDDP濃度を原子吸光分析(島津テクノリサーチ)にて測定し、CDDP無処理細胞のCDDP細胞内濃度を1.0として相対的濃度を算出した。グラフは3回施行した実験の平均±SDを示している。
奈良県立医科大学分子病理で診断した91例の膵癌(膵管癌)症例の病理組織標本の代表的パラフィン包埋組織ブロックから作成した薄切標本(4μm厚)を脱パラフィン後、内因性ペルオキシダーゼを0.01%H2O2-50%メタノール液 (和光純薬社製)によりブロックした。TBS(Sigma社製)により加水した後、CLDN4/4D3抗体、又は、CLDN1抗体クローン2C1の0.5μg/mL TBS希釈液にて、室温・2時間インキュベートした後、0.5%Tween-TBS(Sigma社製)にて洗浄した。更に、ペルオキシダーゼ標識抗ラットIgG抗体(DAKO社製)の1%希釈液にて、室温・1時間インキュベートした後、0.5%Tween-TBS(Sigma社製)にて洗浄した。DAB発色キット(DAKO社製)にて発色後、ヘマトキシリン液(Sigma社製)にて核染色を行った。流水にて洗浄後、エタノール脱水・キシレン透徹し封入し免疫染色標本を作製した。標本は、光学顕微鏡にて観察し、染色強度(0, 1, 2, 3の4段階に評価)と染色腫瘍細胞(%)の積(0〜300)で半定量化した。有意差はANOVA法にて検定した。棒グラフは平均±SDを示している。
奈良県立医科大学分子病理で診断した86例の膀胱癌(尿路上皮癌)症例の病理組織標本の代表的パラフィン包埋組織ブロックから作成した薄切標本(4μm厚)を脱パラフィン後、内因性ペルオキシダーゼを0.01%H2O2-50%メタノール液 (和光純薬社製)によりブロックした。TBS(Sigma社製)により加水した後、CLDN4/4D3抗体、または、CLDN1抗体クローン2C1の0.5μg/mL TBS希釈液にて、室温・2時間インキュベートした後、0.5%Tween-TBS(Sigma社製)にて洗浄した。更に、ペルオキシダーゼ標識抗ラットIgG抗体(DAKO社製)の1%希釈液にて、室温・1時間インキュベートした後、0.5%Tween-TBS(Sigma社製)にて洗浄した。DAB発色キット(DAKO社製)にて発色後、ヘマトキシリン液(Sigma社製)にて核染色を行った。流水にて洗浄後、エタノール脱水・キシレン透徹し封入し免疫染色標本を作製した。標本は、光学顕微鏡にて観察し、染色強度(0, 1, 2, 3の4段階に評価)と染色腫瘍細胞(%)の積(0〜300)として半定量化した。有意差はANOVA法にて検定した。棒グラフは平均±SDを示している。
各CLDN4抗体の抗体依存性細胞傷害活性(ADCC活性)をFcγ受容体の活性化を指標に評価した。96穴プレートに標的細胞(1×104細胞/穴)を播種し、炭酸ガスインキュベーター内で24時間培養した。培養液を除去し、OPTI-MEM培地(Invitrogen社製)に懸濁した各CLDN4抗体及びFcγ受容体とルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するエフェクター細胞(1×105細胞/100 μl/穴)を添加した。炭酸ガスインキュベーター内で6時間培養後、各ウェルに100 μlのONE-Glo Luciferase Assay試薬(Promega社製)を添加し5分間反応させた後、発光プレートリーダー(パーキンエルマー社製)を用いて各ウェルのルシフェラーゼ活性を測定した。結果を図12(a)(b)に示す。各CLDN4抗体の添加濃度に依存して、エフェクター細胞の活性化が確認され、これらの抗体によりFcγ受容体を介したADCC活性が発揮されることが示された。上述の実施例ではCLDN4/4D3抗体の抗癌活性が実証されたが、本実験により各CLDN4抗体のADCC活性が確認されたことにより、CLDN4/4D3抗体と同様にこれ以外の抗体についても抗癌活性が存在することが示唆された。
細胞は、マウスCLDN4(mCL4)発現L細胞、ヒトCLDN4(hCLDN4)発現HT1080細胞を使用し、コントロールとしてmockHT1080細胞を用いた。濃度はそれぞれ5×105cells/wellとした。抗体は、ラット抗CLDN4モノクローナル抗体(3B11、3G2、4D3、4F4、4F10、5A5、4B8、5D12)を使用した。
一次抗体として各クローンの抗体(ラット精製抗体:5μg/mL、キメラ抗体:培養上清原液)を使用した(100μL/well, 10μg/mL)。0.2%BSA-PBSで1回洗浄した後に、二次抗体としてanti-rat又はanti-human IgG-FITC(1/500)(15000倍希釈, 100μL/well)を用いた。そして0.2%BSA-PBSで2回洗浄した後に、FACS caliburにて測定して結合性評価を試みた。
Balb/c Slc-nu/nuマウス(雌性、7週齢)にヒト胃癌細胞株MKN74細胞もしくはヒト結腸癌細胞株LoVo細胞(1 × 107cells)を皮下移植した。移植後、PBS, rat IgG, rat anti-CLDN1 Ab (5A5)(0.1, 1 mg/kg body weight)を週2回腹腔内投与し、腫瘍増殖抑制効果を解析した。尚、腫瘍体積は、長径×(短径)2/2で計算した。
5A5以外の抗体クローンも、Fcγ IIIa受容体活性化能を有していたことから(特願2013-40211)、いずれのクローンもADCC活性を介してCLDN4発現癌細胞に対して抗腫瘍活性を引き起こすものと期待される。
6−1)発現ベクター作製
各抗体クローンの可変部領域のVL領域およびVH領域のアミノ酸をコードする遺伝子をPCR法により増幅した。なお、VL遺伝子の上流にAgeサイト、下流にBsiWサイト、VH遺伝子の上流にEcoRサイト、下流にNheサイトを付加した。PCR産物を電気泳動により分離・精製した。
フラスコに5×105cells/mLに調製したCHO-S細胞を150 mL入れ、37 ℃、8% CO2環境下で一晩培養した。作製した発現ベクター187.5 μg(VL:VH=1:1)にOptiPRO SFMを加え3 mLに調製し、FreeStyleMAX Reagent (Invitrogen) 187.5 μLとOptiPRO SFM 2812.5 μLを混和した溶液に加え、10分間常温で静置した。その後、CHO-S細胞の入ったフラスコに、混合液を全量加え、37 ℃、8% CO2環境下で培養し、培養6日目に培養上清を回収した。
ヒトCLDN1、ヒトCLDN2、ヒトCLDN3、ヒトCLDN4、ヒトCLDN6、ヒトCLDN7、ヒトCLDN9発現HT1080細胞をトリプシン処理により回収した。5.0 x 105 cellsに対し、各抗体5 μg/mLを100 μL添加し、撹拌し氷上で1時間静置した。0.2% BSA-PBSにて1回洗浄後、1% BSA-PBSにて希釈したGoat anti-human IgG(H+L)-FITC抗体(Jackson Immuno Research)を添加、撹拌、氷上で遮光し30分静置した。0.2% BSA-PBSにて2回洗浄後、0.2% BSA-PBSにて終濃度5 μg/mLとなるように希釈したPI (Miltenyi Biotec)を加え、FCM解析を行った。
MKN74細胞、もしくはMia Paca-2細胞を96穴プレートに5 × 104 cells/穴/45 μLで播種し、ヒトIgG1キメラ抗体を終濃度0.005、0.05、0.5 μg/mLとなるように添加、37 ℃で1時間培養した。その後、ヒト血清をヒト終濃度10%となるように添加、37 ℃で3時間培養後、WST-8法により生細胞を測定した。
96穴プレートにヒトCLDN4発現HT1080細胞(1 x 104細胞/穴)を播種し、炭酸ガスインキュベーター内で一晩培養した。培養液を除去し、OPTI-MEM培地(Invitrogen)に懸濁した各CLDN4抗体およびFcγ受容体とルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するエフェクター細胞(1x105細胞/100 μL/穴)を添加した。炭酸ガスインキュベーター内で6時間培養後、各ウェルに100 μLのONE-Glo Luciferase Assay試薬(Promega)を添加し5分間反応させた後、発光プレートリーダー(Perkin Elmer)を用いて各ウェルのルシフェラーゼ活性を測定した。
Balb/c Slc-nu/nuマウス(雌性、7週齢)にMKN74細胞またはLoVo細胞(1×107 cells)を皮下移植した。移植後、PBS, ラットIgG (5A5)、ヒトIgG1キメラ(xi5A5) (1 mg/kg body weight)を週2回、4週間腹腔内投与し、腫瘍増殖抑制効果を解析した。
xi5A5はFcγ受容体活性化能を有すること、Balb/c Slc-nu/nuマウスにNK細胞が存在することから、xi5A5の抗腫瘍活性にはADCC活性が関与していると推察される。xi5A5と同様、Xi3B11, xi3G2, xi4b8, xi5D12もFcγ受容体活性化能を示していることから、これらいずれのクローンも抗癌剤シーズとして有用であると期待される。
サポリンを付加した抗ラットIgG抗体(rat-ZAP)を用いて、5A5のCLDN4ターゲティング能を解析した。尚、サポリンはリボソームに作用することでタンパク質合成を阻害、細胞毒性発揮する分子であり、単独では細胞内に取り込まれることはない。
以上の結果より、CLDN4抗体を用いることで、CLDN4発現癌細胞に対するDDS技術の開発が期待される。
CLDN4を発現するヒト肺腺癌細胞株PC-9細胞を2000細胞/200μL/穴になるよう10%ウシ胎児血清(Sigma社製)添加DMEM培養液(Sigma社製)に希釈し96穴プレート(ベクトン・ディッキンス社製)に播種した。このとき1群12穴とした。培養液中には、CLDN4/4D3抗体、または、CLDN1抗体クローン2C1を最終タンパク濃度が0.25, 0.5, 1.0 μg/mLになるように添加し、対照としてPBSを10 μL/穴加えた。また、陰性対照として培養液のみをウェルに加えた。以上の条件で、37℃、48時間培養したのち、MTT試薬(Sigma社製)を25 μg/mLになるように培養液に添加し、1時間後に培養液を吸引除去し、DMSO(和光純薬社製)を200 μL添加震盪後、マイクロプレート分光光度計を用い、595 nm吸光度を測定した。陰性対照の吸光度を除いた吸光値について、PBS対照群を100%として、各抗体濃度における吸光値を相対増殖率(%)として算出した。棒グラフは3回施行した実験の平均±SDを示している。図22(a)(b)に示されるように、CLDN4/4D3抗体は、ヒト肺腺癌細胞株PC-9細胞に対して細胞増殖阻害活性を示した。
ヒト肺癌細胞株PC-9細胞を2000細胞/200μL/穴になるよう10%ウシ胎児血清(Sigma社製)添加DMEM培養液(Sigma社製)に希釈し96穴プレート(ベクトン・ディッキンス社製)に播種した。このとき1群8穴とした。培養液中には、CLDN4/4D3抗体を最終タンパク濃度が0.25, 0.5, 1.0 μg/mLになるように添加した。対照としてPBSを10 μL/穴加えた。また、同時に5-FU(和光純薬社製)を10, 50 μg/mLになるように添加した。一方、陰性対照として培養液のみをウェルに加えた。以上の条件で、37℃、24時間培養したのち、MTT試薬(Sigma社製)を25 μg/mLになるように培養液に添加し、1時間後に培養液を吸引除去し、DMSO(和光純薬社製)を200 μL添加震盪後、マイクロプレート分光光度計を用い、595 nm吸光度を測定した。陰性対照の吸光度を除いた吸光値について、PBS対照群を100%として、各抗体濃度における吸光値を相対増殖率(%)として算出した。棒グラフは3回施行した実験の平均±SDを示している。図23に示されるように、5-FUの細胞増殖阻害活性は、CLDN4/4D3抗体の添加濃度依存的に増大していた。
ヒト肺癌細胞株PC-9細胞を1x105細胞/10mL/10cm培養皿になるよう10%ウシ胎児血清(Sigma社製)添加DMEM培養液(Sigma社製)に希釈し播種した。細胞が90%コンフルエントに増加した状態で、培養液中にCLDN4/4D3抗体を最終濃度が0.25, 0.5, 1.0 μg/mLになるように添加した。対照としてPBSを10 μL/穴加えた。また、同時に5-FU(和光純薬社製)を10, 50 μg/mLになるように添加した。以上の条件で、37℃、24時間培養したのち、細胞をトリプシン処理し回収しタンパク抽出キット(GEヘルスケア社製)にてタンパクを可溶化し、5-FU濃度をELISA(メイベル社製)にて測定し、5-FU処理濃度10 μg/mLの際の5-FU細胞内濃度を1.0として相対的濃度を算出した。グラフは3回施行した実験の平均±SDを示している。図24に示されるように、5-FUのPC-9ヒト肺癌細胞株細胞内移行は、CLDN4/4D3抗体の添加濃度依存的に増大していた。
ヒト肺癌細胞株PC-9細胞1x107細胞をHank’s Balanced Salt液(Sigma社製)200 μLに懸濁し、BALB/cヌードマウス・オス・4週齢20匹の背部皮下に接種した。これを各群5匹の4群に分け、対照群(PBS投与)、5FU群(5-FU 10 mg/kg体重)、抗体群(CLDN4/4D3抗体 1 mg/kg体重)、および、併用群(5-FU 10 mg/kg体重+CLDN4/4D3抗体 1 mg/kg体重)の各処理を行った。投与は腹腔内投与で行い、併用群では5-FUと抗体は混合せず別途投与した。投与は、腫瘍細胞接種時、接種後3日後および7日後の3回施行した。皮下腫瘍は接種後4週まで毎週直径を測定し、平均±SDとして表示した。図25に示されるように、in vivoにおいて、ヒト肺癌細胞株皮下腫瘍に対する5-FU腫瘍増殖阻害活性がCLDN4/4D3抗体により増強していた。
CLDN4を発現するヒト大腸癌細胞株HT29細胞を2000細胞/200 μL/穴になるよう10%ウシ胎児血清(Sigma社製)添加DMEM培養液(Sigma社製)に希釈し96穴プレート(ベクトン・ディッキンス社製)に播種した。このとき1群12穴とした。培養液中には、CLDN4/4D3抗体を最終タンパク濃度が0.25, 0.5, 1.0 μg/mLになるように添加し、対照としてPBSを10 μL/穴加えた。また、陰性対照として培養液のみをウェルに加えた。以上の条件で、37℃、48時間培養したのち、MTT試薬(Sigma社製)を25 μg/mLになるように培養液に添加し、1時間後に培養液を吸引除去し、DMSO(和光純薬社製)を200 μL添加震盪後、マイクロプレート分光光度計を用い、595 nm吸光度を測定した。陰性対照の吸光度を除いた吸光値について、PBS対照群を100%として、各抗体濃度における吸光値を相対増殖率(%)として算出した。棒グラフは3回施行した実験の平均±SDを示している。
ヒト大腸癌細胞株HT29細胞を1x105細胞/10 mL/10cm培養皿になるよう10%ウシ胎児血清(Sigma社製)添加DMEM培養液(Sigma社製)に希釈し播種した。細胞が90%コンフルエントに増加した状態で、培養液中にCLDN4/4D3抗体を最終濃度が0.25, 0.5, 1.0 μg/mLになるように添加した。対照としてPBSを10 μL/穴加えた。また、同時に5-FU(和光純薬社製)を10, 50 μg/mLになるように添加した。以上の条件で、37℃、24時間培養したのち、細胞をトリプシン処理し回収しタンパク抽出キット(GEヘルスケア社製)にてタンパクを可溶化し、5-FU濃度をELISA(メイベル社製)にて測定し、5-FU処理濃度10 μg/mLの際の5-FU細胞内濃度を1.0として相対的濃度を算出した。グラフは3回施行した実験の平均±SDを示している。図27に示されるように、5-FUのヒト大腸癌細胞株HT29細胞内移行は、CLDN4/4D3抗体の添加濃度依存的に増大していた。
ヒト大腸癌細胞株HT29細胞1x107細胞をHank’s Balanced Salt液(Sigma社製)200μLに懸濁し、BALB/cヌードマウス・オス・4週齢20匹の背部皮下に接種した。これを各群5匹の4群に分け、対照群(PBS投与)、5FU群(5-FU 10 mg/kg体重)、抗体群(CLDN4/4D3抗体 1 mg/kg体重)、および、併用群(5-FU 10 mg/kg体重+CLDN4/4D3抗体 1 mg/kg体重)の各処理を行った。投与は腹腔内投与で行い、併用群では5-FUと抗体は混合せず別途投与した。投与は、腫瘍細胞接種時、接種後3日後および7日後の3回施行した。皮下腫瘍は接種後4週まで毎週直径を測定し、平均±SDとして表示した(図28(a))。
奈良県立医科大学分子病理で診断した186例の肺癌症例(腺癌86例、扁平上皮癌100例)の病理組織標本の代表的パラフィン包埋組織ブロックから作成した薄切標本(4μm厚)を脱パラフィン後、内因性ペルオキシダーゼを0.01%H2O2-50%メタノール液 (和光純薬社製)によりブロックした。TBS(Sigma社製)により加水した後、CLDN4/4D3抗体、または、CLDN1抗体クローン2C1の0.5 μg/mL TBS希釈液にて、室温・2時間インキュベートした後、0.5%Tween-TBS(Sigma社製)にて洗浄した。さらに、ペルオキシダーゼ標識抗ラットIgG抗体(DAKO社製)の1%希釈液にて、室温・1時間インキュベートした後、0.5%Tween-TBS(Sigma社製)にて洗浄した。DAB発色キット(DAKO社製)にて発色後、ヘマトキシリン液(Sigma社製)にて核染色を行った。流水にて洗浄後、エタノール脱水・キシレン透徹し封入し免疫染色標本を作製した。標本は、光学顕微鏡にて観察し、染色強度(0, 1, 2, 3の4段階に評価)と染色腫瘍細胞(%)の積(0〜300)で半定量化した。有意差はANOVA法にて検定した。図29及び図30に示されるように、CLDN1と比較してCLDN4は肺癌のバイオマーカーとなりうることが判明した。また、図31及び図32に示されるように、CLDN4は、肺腺癌及び肺扁平上皮癌の何れにおいてもバイオマーカーとなりうることが判明した。
Claims (25)
- ラット抗クラウディン4モノクローナル抗体。
- VHの配列が配列番号1、VLの配列が配列番号2である請求項1に記載のラット抗クラウディン4モノクローナル抗体。
- VHの配列が配列番号3、VLの配列が配列番号4である請求項1に記載のラット抗クラウディン4モノクローナル抗体。
- VHの配列が配列番号5、VLの配列が配列番号6である請求項1に記載のラット抗クラウディン4モノクローナル抗体。
- VHの配列が配列番号7、VLの配列が配列番号8である請求項1に記載のラット抗クラウディン4モノクローナル抗体。
- VHの配列が配列番号9、VLの配列が配列番号10である請求項1に記載のラット抗クラウディン4モノクローナル抗体。
- VHの配列が配列番号11、VLの配列が配列番号12である請求項1に記載のラット抗クラウディン4モノクローナル抗体。
- VHの配列が配列番号13、VLの配列が配列番号14である請求項1に記載のラット抗クラウディン4モノクローナル抗体。
- VHの配列が配列番号15、VLの配列が配列番号16である請求項1に記載のラット抗クラウディン4モノクローナル抗体。
- 請求項1乃至9の何れか1項に記載の抗体のFabフラグメント、F(ab’)2フラグメント又はFvフラグメント。
- モノクローナル抗体が、遺伝子組換え抗体である請求項1乃至10の何れか1項に記載の抗体。
- 前記遺伝子組換え抗体が、ヒトIgG骨格を有するキメラ抗体あるいはヒト化抗体である請求項11に記載の遺伝子組換え抗体。
- 請求項2乃至9のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体のCDR(相補性決定領域)を含む請求項10乃至12の何れか1項に記載の遺伝子組換え抗体。
- 請求項1乃至13の何れか1項に記載のラット抗クラウディン4モノクローナル抗体、ヒトキメラ抗クラウディン4モノクローナル抗体、ヒト化抗クラウディン4モノクローナル抗体又はそのフラグメントを有効成分とする、癌疾患を治療するための医薬組成物。
- 白金製剤、代謝拮抗剤、植物アルカロイド、ホルモン製剤、分子標的薬、又は血管新生阻害薬の何れからなる抗癌剤と、請求項1乃至13の何れか1項に記載の抗クラウディン4モノクローナル抗体又はそのフラグメントと、を有効成分とする、癌疾患を治療するための医薬組成物。
- 前記白金製剤が、シスプラチンである請求項15記載の医薬組成物。
- 前記代謝拮抗剤が、5−フルオロフラシルである請求項15記載の医薬組成物。
- 前記癌疾患が、膵癌、膀胱癌、乳癌、食道癌、胃癌、大腸癌、肝細胞癌、胆管細胞癌、肺癌、前立腺癌、腎細胞癌、口頸部癌、子宮癌、卵巣癌、又は皮膚癌である請求項14乃至17の何れか1項に記載の医薬組成物。
- クラウディン4からなる癌疾患の予後予測をするための腫瘍マーカー。
- 前記癌疾患が、膵癌、膀胱癌、乳癌、食道癌、胃癌、大腸癌、肝細胞癌、胆管細胞癌、肺癌、前立腺癌、腎細胞癌、口頸部癌、子宮癌、卵巣癌、又は皮膚癌である請求項19に記載の腫瘍マーカー。
- 請求項1及至13の何れか1項に記載の抗クラウディン4モノクローナル抗体のエピトープに結合する分子。
- 請求項21に記載の抗クラウディン4モノクローナル抗体のエピトープに結合する分子と、白金製剤、代謝拮抗剤、植物アルカロイド、ホルモン製剤、分子標的薬、又は血管新生阻害薬の何れからなる抗癌剤と、を有効成分とする、癌疾患を治療するための医薬組成物。
- 前記白金製剤が、シスプラチンである請求項22記載の医薬組成物。
- 前記代謝拮抗剤が、5−フルオロフラシルである請求項22記載の医薬組成物。
- 前記癌疾患が、膵癌、膀胱癌、乳癌、食道癌、胃癌、大腸癌、肝細胞癌、胆管細胞癌、肺癌、前立腺癌、腎細胞癌、口頸部癌、子宮癌、卵巣癌、又は皮膚癌である請求項21乃至24の何れか1項に記載の医薬組成物。
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