JP2014020938A - Method for manufacturing biochip, and biochip - Google Patents

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JP2014020938A
JP2014020938A JP2012160072A JP2012160072A JP2014020938A JP 2014020938 A JP2014020938 A JP 2014020938A JP 2012160072 A JP2012160072 A JP 2012160072A JP 2012160072 A JP2012160072 A JP 2012160072A JP 2014020938 A JP2014020938 A JP 2014020938A
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JP2012160072A
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Japanese (ja)
Inventor
Go Yamanouchi
豪 山之内
Original Assignee
Sumitomo Bakelite Co Ltd
住友ベークライト株式会社
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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for manufacturing a biochip capable of detecting a physiologically active substance, with high sensitivity and high throughput, by immobilizing protein on an arbitrary position on a substrate surface without coating with an adsorption inhibitor, preventing unnecessary physiologically active substances from being adsorbed to and combined with parts except the position, and maintaining its good spot shape.SOLUTION: A method for manufacturing a biochip formed by immobilizing protein on a substrate surface comprises the steps of: dissolving protein in an aqueous solution containing a hydrophilic high-molecular substance to make an aqueous solution for immobilizing protein; and (2) immobilizing protein by spotting or applying the aqueous solution for immobilizing protein on a substrate surface.

Description

本発明は、生体試料中の多数の蛋白質の検出および分析に用いられるバイオチップの製造方法に関する技術であり、さらに詳しくは、抗原抗体反応を用いた免疫分析、プロテオミクス、ならびに遺伝子活性の細胞内蛋白質レベルでの測定に用いられるバイオチップの製造方法に関するものである。 The present invention is a technique related to a manufacturing method of a biochip used for detection and analysis of multiple proteins in a biological sample, more particularly, immunoassay using an antigen-antibody reaction, proteomics, and intracellular protein gene activity a method of manufacturing a biochip used in the measurement of the level.

現状のバイオチップの一つである蛋白質チップは一般にDNAチップの延長線上に位置付けられて開発がなされているため、ガラス基板上に蛋白質、またはそれを捕捉する分子をチップ表面に固定化する検討がなされている(例えば特許文献1参照)。 Since it is one of the state of the biochip protein chips are generally been developed positioned on the extension of the DNA chip, it is considered to be immobilized protein on the glass substrate, or a molecule that captures it to the chip surface It has been made (for example, see Patent Document 1).

蛋白質、またはそれを捕捉する分子を基板上に固定化した後、該表面上で他の蛋白質(例えば抗原抗体反応では、蛋白質に対してはその抗体、また蛋白質を捕捉する分子に対してはその蛋白質)と反応させて検出機等で検出する場合、蛋白質、またはそれを捕捉する After protein, or a molecule that captures it was immobilized on a substrate, in other proteins (e.g., antigen-antibody reaction on the surface, its relative molecular against the protein to capture the antibodies, also protein If detected by detector or the like is reacted with a protein), to capture the protein, or it

分子が固定されていない部分に該分子以外の蛋白質が固定されると、検出時にノイズとなり信号対雑音比(S/N 比) を低下させる原因となり、検出精度を低下させる(例えば非特許文献1参照) 。 When molecules proteins other than 該分 element in a portion which is not fixed is fixed, it causes to lower the noise and becomes the signal-to-noise ratio during detection (S / N ratio), decreasing the detection accuracy (for example, Non-Patent Document 1 reference).
このため通常は、蛋白質、またはそれを捕捉する分子を固定化した後に、これらの分子が固定されていない部分で他の蛋白質が非特異的に吸着するのを防止するため、吸着防止剤のコーティングが行われるが、これらの非特異吸着防止能は十分でない。 Therefore Typically, after immobilizing the molecule for capturing protein, or it, since the other proteins in portions of these molecules is not fixed to prevent the nonspecific adsorption, coating of adsorption inhibitor Although is performed, preventing capability these nonspecific adsorption is not sufficient. また、蛋白質、またはそれを捕捉する分子を固定化した後に吸着防止剤をコーティングするため、固定化した蛋白質、またはそれを捕捉する分子の上に吸着防止剤がコーティングされてしまう場合があり、続く反応、即ち他の蛋白質(例えば抗原抗体反応では、蛋白質に対してはその抗体、また蛋白質を捕捉する分子に対してはその蛋白質)との反応において、反応性が低下するという問題があった。 Also, for coating the adsorption inhibitor after immobilizing the molecule for capturing protein, or it may adsorption inhibitor on the molecule to capture immobilized protein, or it will be coated, followed by reaction, i.e. (for example in the antigen-antibody reaction, the antibody against the protein, also for molecules to capture protein the protein) other proteins in the reaction with, reactivity is lowered. このため、一次抗体固定化後の吸着防止剤コーティング工程がなく、かつ蛋白質、またはそれを捕捉する分子が固定されていない部分での非特異吸着量の少ないバイオチップが求められている。 Therefore, the primary antibody immobilized adsorption inhibitor coating process without post, and proteins or small biochip of nonspecific adsorption of a portion where the molecule for capturing is not fixed to it, has been required.

また、すべての蛋白質(プロテオーム)の変動をプロファイリングする技術面では、超微量の蛋白質や数ナノリットルというような超微量の溶液の操作を可能とするマイクロフルイディクスの技術や、チップ上での前処理、分離、検出を目標とする「ラボ・オン・チップ」の概念が重要となってくる。 Further, in the technical profiling variations of all proteins (proteome) technology and microfluidics to allow manipulation of the solution of trace amounts, such as that protein and the number nanoliter ultratrace previous on-chip processing, separation, the concept of detection of the target "lab-on-a-chip" becomes important. この技術においては、サンプルである蛋白質などの生理活性物質が、流路内に固定化されたキャプチャーと特異的に反応し、かつキャプチャー部以外の流路の内壁への非特異吸着を抑制することが必要となる。 In this technique, the physiologically active substances such as proteins that are samples have been captured specifically reactive immobilized in the flow path, and to suppress the nonspecific adsorption to the inner wall of the flow path of the non-capturing unit Is required.
例えば、特許文献2や3の発明においては、生理活性物質固定のためのアミノ基含有ポリマーと親水性ポリマーを組み合わせることで、この目的を達成しようとした。 For example, in the invention of Patent Document 2 and 3, the combination of amino group-containing polymer and a hydrophilic polymer for the physiologically active substance fixed, tried to achieve this goal. 基体の親水性を高めることで非特異吸着を抑制することが可能になった。 It has become possible to suppress non-specific adsorption by increasing the hydrophilicity of the substrate.
しかしながら、親水性を高めることは、基体表面に水を落とした時の前進接触角を低くすることでもあり、その結果、生理活性物質を含む水溶液を基体表面にスポットした場合に、スポット面積が広がり、さらにスポット外周部がにじんで真円のスポットにならないなどの問題が生じた。 However, increasing the hydrophilicity, also means to reduce the advancing contact angle when dropped water on the surface of the substrate, resulting in an aqueous solution containing a physiologically active substance when spotted on the substrate surface, spread spot area , problems such as not a true circle of spot occurs further blurred spot the outer periphery. このようにスポットの形状が安定しないと、定量測定は困難である。 With such a shape of the spot is not stable, quantitative measurement is difficult.

特開2001−116750号公報 JP 2001-116750 JP 特開2005−091245号公報 JP 2005-091245 JP 特表2010−008378号広報 JP-T 2010-008378 Patent Public Relations

本発明は、吸着防止剤をコーティングすることなしに、蛋白質を基体表面の任意の位置に固定化し、それ以外の部分への不要な生理活性物質の吸着および結合を抑制し、かつ良好なスポット形状を維持することで高感度でハイスループットな生理活性物質の検出ができるバイオチップの製造方法を提供することを目的とする。 The present invention, without coating the adsorption inhibitor, a protein immobilized on an arbitrary position of the substrate surface to suppress the adsorption and binding unwanted biologically active substance to the other portions, and good spot shape and to provide a method for manufacturing a biochip can detect high-throughput physiologically active substance with high sensitivity by maintaining.

(1)基体表面に蛋白質を固定化するバイオチップの製造方法であって、(1)親水性高分子物質を含有する水溶液に該蛋白質を溶解し、蛋白質固定用水溶液を作製する工程、(2)基体表面に蛋白質固定用水溶液を点着または塗布し蛋白質を固定化する工程を含むことを特徴とするバイオチップの製造方法。 (1) A process for producing a biochip for immobilizing proteins on the surface of the substrate, (1) a step of the protein dissolved in an aqueous solution containing a hydrophilic polymer material, to produce a protein fixing solution, (2 ) a method of manufacturing a biochip which comprises a step of fixing the spotted or applied protein a protein fixing solution on the substrate surface.
(2)前記(1)工程の親水性高分子物質が、アルブミン、スキムミルク、カゼインおよび免疫グロブリンを含む群より選択される1種以上の親水性高分子物質である(1)記載のバイオチップの製造方法。 (2) wherein (1) is a hydrophilic polymer material of step, albumin, skim milk, is one or more hydrophilic polymeric material selected from the group comprising casein and immunoglobulins (1) according biochip Production method.
(3)蛋白質が基体表面にスポット状に固定化されている(1)または(2)記載のバイオチップの製造方法。 (3) the protein is immobilized in a spot shape on the surface of the substrate (1) or (2) A method of manufacturing a biochip according.
(4)複数種の蛋白質のスポットが基体表面の同一区画中に存在している(3)記載のバイオチップの製造方法。 (4) a plurality of kinds of proteins spots are present in the same compartment of the substrate surface (3) A method of manufacturing a biochip according.
(5)前記(2)工程の固定化が共有結合または物理化学吸着である(1)乃至(4)いずれか1項に記載のバイオチップの製造方法。 (5) the (2) fixing step is a covalent bond or physicochemical adsorption (1) to (4) A method of manufacturing a biochip according to any one.
(6)前記基体にポリマーを塗布した(1)乃至(5)いずれか1項に記載のバイオチップの製造方法。 (6) The polymer was applied to the substrate (1) to (5) A method of manufacturing a biochip according to any one.
(7)前記ポリマーがホスホリルコリン基を有する単量体とブチルメタクリレート基を有する単量体と蛋白質を固定化する官能基を有する単量体との共重合体である(1)乃至(6)いずれか1項に記載のバイオチップの製造方法。 (7) said polymer is a copolymer of a monomer having a functional group for fixing a monomer and a protein having a monomer and a butyl methacrylate group having a phosphorylcholine group (1) to (6) any method for manufacturing a biochip according to any one of claims.
(8)前記ホスホリルコリン基が2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基である(1)乃至(7)いずれか1項に記載のバイオチップの製造方法。 (8) the phosphorylcholine group is 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine group (1) to (7) A method of manufacturing a biochip according to any one.
(9)前記の蛋白質を固定化する官能基が活性エステル基である(8)記載のバイオチップの製造方法。 (9) a functional group to immobilize the protein is an active ester group (8) The method according biochip.
(10)前記活性エステル基がp−ニトロフェニルエステル又はN−ヒドロキシスクシンイミドエステルである((9)記載のバイオチップの製造方法。 (10) The active ester group is a p- nitrophenyl ester or N- hydroxysuccinimide ester ((9) The method according biochip.
(11)基体の形状がスライドガラス状である(1)乃至(10)いずれか1項に記載のバイオチップの製造方法。 (11) the shape of the substrate is a slide glass (1) to (10) A method of manufacturing a biochip according to any one.
(12)基体の材質がプラスチックである(1)乃至(11)いずれか1項に記載のバイオチップの製造方法。 (12) the material of the substrate is a plastic (1) to (11) A method of manufacturing a biochip according to any one.
(13)前記プラスチックがポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、飽和環状ポリオレフィン、ポリペンテン、ポリアミド及びそれらの共重合体よりなる群より選ばれる少なくとも1種である(12)記載のバイオチップの製造方法。 (13) wherein the plastic is polycarbonate, polyethylene, polypropylene, polystyrene, saturated cyclic polyolefins, polypentene, at least one selected from polyamide and the group consisting of copolymers thereof (12) The method according biochip.
(14)前記蛋白質が、抗体である(1)乃至(13)いずれか1項に記載のバイオチップの製造方法(15)(1)乃至(14)いずれか1項に記載の製造方法で作製したバイオチップ。 (14) the protein is an antibody (1) to (13) prepared by the method of any of the biochip manufacturing according to item 1 (15) (1) to (14) The process according to any one the bio-chip.

本発明により、不要な生理活性物質の吸着および結合を抑制し、かつ良好なスポット形状を維持することで高感度でハイスループットな生理活性物質の検出ができるバイオチップを作製することが可能となる。 The present invention suppresses adsorption and binding unwanted bioactive substance, and it is possible to manufacture a biochip can be detected with good high-throughput physiologically active substance with high sensitivity by maintaining a spot shape .

1次抗体のスポット濃度10 (ug/mL)の実施例1の蛍光スポット像 Fluorescent spot images of Example 1 of the primary antibody of interest Concentration 10 (ug / mL) 1次抗体のスポット濃度20 (ug/mL)の実施例1の蛍光スポット像 Fluorescent spot images of Example 1 of the primary antibody of interest Concentration 20 (ug / mL) 1次抗体のスポット濃度180(ug/mL)の実施例1の蛍光スポット像 Fluorescent spot images of Example 1 of the primary antibody spot density 180 (ug / mL) 1次抗体のスポット濃度10 (ug/mL)の実施例2の蛍光スポット像 Fluorescent spot images of Example 2 of primary antibody of interest Concentration 10 (ug / mL) 1次抗体のスポット濃度20 (ug/mL)の実施例2の蛍光スポット像 Fluorescent spot images of Example 2 of primary antibody of interest Concentration 20 (ug / mL) 1次抗体のスポット濃度180(ug/mL)の実施例2の蛍光スポット像 Fluorescent spot images of Example 2 of primary antibody spot density 180 (ug / mL) 1次抗体のスポット濃度10 (ug/mL)の実施例3の蛍光スポット像 Fluorescent spot image of Example 3 of the primary antibody of interest Concentration 10 (ug / mL) 1次抗体のスポット濃度20 (ug/mL)の実施例3の蛍光スポット像 Fluorescent spot image of Example 3 of the primary antibody of interest Concentration 20 (ug / mL) 1次抗体のスポット濃度180(ug/mL)の実施例3の蛍光スポット像 Fluorescent spot image of Example 3 of the primary antibody spot density 180 (ug / mL) 1次抗体のスポット濃度10 (ug/mL)の比較例の蛍光スポット像 Fluorescent spot images of Comparative Example 1 antibody spot concentration 10 (ug / mL) 1次抗体のスポット濃度20 (ug/mL)の比較例の蛍光スポット像 Fluorescent spot images of Comparative Example 1 antibody spot concentration 20 (ug / mL) 1次抗体のスポット濃度180(ug/mL)の比較例の蛍光スポット像 Fluorescent spot images of Comparative Example 1 antibody spot density 180 (ug / mL)

本発明者らは鋭意検討した結果、以下に示す工程によりバイオチップを製造することにより、上記課題を解決できることを見出した。 The present inventors have a result of intensive studies, by manufacturing a biochip by the steps shown below, it has been found the above problems can be solved.
(1)親水性高分子物質を含有する水溶液に該蛋白質を溶解し、蛋白質固定用水溶液を作製する工程、 (1) in an aqueous solution containing a hydrophilic polymeric substance to dissolve the protein, to produce a protein fixing solution process,
(2)基体表面に蛋白質固定用水溶液を点着または塗布し蛋白質を固定化する工程、 (2) immobilizing the spotted or applied protein a protein fixing solution on the surface of the substrate,

まず工程(1)について詳細に説明する。 First, the step (1) will be described in detail.
工程(1)は、基体表面に固定化するための蛋白質を含む溶液の調製に関する工程である。 Step (1) is a step for the preparation of a solution containing a protein to be immobilized on the substrate surface.
(溶液の組成) (Composition of the solution)
溶媒としては、特に限定するものではないが、蛋白質溶液であるので、蛋白質の変性を防ぐ意味から水溶性の溶液であることが好ましい。 The solvent is not particularly limited, since it is the protein solution is preferably a solution in the sense of a water-soluble to prevent protein denaturation. 水溶性溶液の溶媒としては、一般的な緩衝液を用いることができる。 The solvent of the aqueous solution, it is possible to use a common buffer. 例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、生理食塩水等が挙げられ、特に限定するものではないが、免疫分析の分野で良く使用される、リン酸緩衝液を好適に使用することができる。 For example, phosphate buffer, Tris buffer, include physiological saline or the like is not particularly limited, is often used in the field of immunoassay, can be preferably used a phosphoric acid buffer solution.

本発明の特徴としては、前記蛋白質溶液に親水性高分子物質を含有させることにある。 A feature of the present invention lies in the inclusion of a hydrophilic polymeric substance in the protein solution.
親水性高分子物質としては、合成高分子材料や生体由来高分子材料を用いることができる。 The hydrophilic polymeric substance can be employed including synthetic polymeric material and biopolymer material. 特に生体高分子材料を用いることが好ましい。 It is particularly preferable to use a biopolymer material. 生体高分子であれば、溶液中での全体的な蛋白質濃度を増やし、固定化対象である蛋白質の安定化に寄与すると考えられる。 If biopolymers, increase the overall protein concentration in solution, believed to contribute to the stabilization of the protein is immobilized target.
前記生体高分子は、他の生体高分子物質に不活性なアルブミン、スキムミルク、またはカゼインを含む群より選択される1種以上を用いることが好ましい。 The biopolymers, it is preferable to use at least one selected from the group comprising inert albumin, skim milk, or casein to another biopolymer material. また、免疫グロブリンを用いても良いが、この場合、チップを免疫分析に用いる場合には、交差反応を惹起しない免疫グロブリンを選択することが重要であるである。 Further, it may be used to immunoglobulins, in this case, in the case of using a chip in immunoassays, is is important to select the immunoglobulins that do not induce cross-reactivity.

次に工程(2)について説明する。 Will now be described step (2).
工程(2)は、工程(1)において作製した蛋白質固定化用水溶液を、基体表面に固定化する工程になる。 Step (2) consists of aqueous protein solution for the immobilized prepared in step (1), the step of immobilizing the substrate surface. 基体表面への固定化は、化学結合でも、物理化学的結合でもよい。 Immobilization to the substrate surface, also a chemical bond, or a physicochemical bond.
蛋白質は基体表面にスポット状に固定化されていることが好ましい。 Protein is preferably immobilized in a spot shape on the substrate surface. スポット状に点着させる方法としては、市販のスポッター(例えばAmersham Pharmacia Biotech社製 Microrraysystem Generation III spotter)を使用することができるが、特にこれにこだわるものではない。 As a method for spotted on the spot, it can be used a commercially available spotter (e.g. manufactured by Amersham Pharmacia Biotech Microrraysystem Generation III spotter), not particularly stick thereto. 市販のスポッターを用いた場合のスポットのサイズは、直径0.2〜0.5mmである。 Spot size in the case of using a commercially available spotter, a diameter 0.2 to 0.5 mm.
用いる蛋白質の種類は1種類以上であればよく、マイクロチップの特性状、複数種の蛋白質のスポットを有する方が、一度に複数の検出が可能であるので効果的である。 Type of protein used may be one or more microchip properties like, is better to have a spot of a plurality of types of proteins, it is effective because it is capable of multiple detection at a time. 複数種の蛋白質のスポットが基体表面の同一区画中に存在していても良い。 A plurality of types of protein spots may be present in the same compartment of the substrate surface.

蛋白質の固定化に関しては、表面に固定化され分析の際の洗浄工程によって蛋白質が表面から脱離しなければ特に限定しない。 For the immobilization of proteins, protein by washing step in the immobilized on the surface analysis is not particularly limited unless desorbed from the surface. 具体的な固定化の方法としては、共有結合または物理吸着であることが好ましい。 As a specific method of immobilization is preferably a covalent bond or physical adsorption.
タンパク質を共有結合によって固定化する方法としては、チップ表面に官能基を導入し当該官能基と蛋白質中に存在する官能基とを反応させて結合させることで達成される。 Protein as a method of covalently immobilized to is accomplished by binding by reacting a functional group capable of introducing a functional group to the chip surface present in the functional group and the protein.
また、基体表面に固定化のための官能基を有する親水性を持つポリマーを塗布することにより官能基を導入する方法がある。 Further, there is a method of introducing a functional group by applying a polymer having a hydrophilic having a functional group for immobilization on the substrate surface. 以下の具体的なポリマーについて述べる。 It describes the following specific polymers.

(ポリマーの構成) (The configuration of the polymer)
ホスホリルコリン基を有するポリマーは、生体膜(リン脂質二重層膜)類似の構造を有しているポリマーであって、生理活性物質の吸着を抑制する効果を有する(例えばI shi Polymer having a phosphorylcholine group, a biological membrane (phospholipid bilayer membrane) a polymer having a similar structure, has the effect of suppressing the adsorption of a physiologically active substance (e.g. I shi
hara K , T suji T , K urosaki T , N akabayashi N ,J ou rn alof B iomedical M aterials R esearch , 2 8 ( 2 ) , pp . hara K, T suji T, K urosaki T, N akabayashi N, J ou rn alof B iomedical M aterials R esearch, 2 8 (2), pp.
2 2 5 - 2 3 2 , ( 1 9 9 4 )4 など) 。 2 2 5 - 2 3 2, etc. (1 9 9 4) 4).
ホスホリルコリン基は、例えば2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、2−メタクリロイルオキシエトキシエチルホスホリルコリン、6−メタクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン、10−メタクリロイルオキシエトキシノニルホスホリルコリン、アリルホスホリルコリン、ブテニルホスホリルコリン、ヘキセニルホスホリルコリン、オクテニルホスホリルコリン、デセニルホスホリルコリン等を挙げられるが、2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンが好ましい。 Phosphorylcholine groups, such as 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine, 2-methacryloyloxy-ethoxyethyl phosphorylcholine, 6- methacryloyloxyhexyl phosphorylcholine, 10-methacryloyloxy-ethoxy nonyl phosphorylcholine, allyl phosphorylcholine, butenyl phosphorylcholine, hexenyl phosphorylcholine, octenyl phosphorylcholine, des like a cell nil phosphorylcholine, etc., but 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine is preferred.

さらに、本発明に使用するポリマーは生理活性物質を固定化するための官能基を有することが好ましい。 Furthermore, the polymer used in the present invention preferably has a functional group for immobilizing a physiologically active substance. 本発明に用いる生理活性物質を固定化する官能基をとしては、化学的に活性な基、受容体基、リガンド基などがあるが、これらに限定されない。 As functional groups for immobilizing a physiologically active substance used in the present invention, active groups, acceptor groups, but there is such a ligand group, but is not limited thereto. 具体的な例としては、アルデヒド基、活性エステル基、エポキシ基、ビニルスルホン基チオール基、アミノ基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、ヒドロキシル基、アクリレート基、マレイミド基、ヒドラジド基、アジド基、アミド基、スルホネート基などがあるがこれらに限定されない。 Specific examples include aldehyde group, active ester group, an epoxy group, a vinyl sulfone group a thiol group, an amino group, isocyanate group, isothiocyanate group, a hydroxyl group, acrylate group, a maleimide group, a hydrazide group, an azide group, an amide group , but it is not limited to such sulfonate groups. これらの中でも生理活性物質に多く含まれるアミノ基との反応性の点からアルデヒド基、活性エステル基、エポキシ基、ビニルスルホン基が好ましい。 Reactive aldehyde groups in terms of the amino group contained much in the physiologically active substances Among these, an active ester group, an epoxy group, a vinyl sulfone group. 特に、活性エステル基が生理活性物質との結合において良く用いられ、実績もあることから最も好ましい。 In particular, the active ester group is often used in binding a physiologically active substance, the most preferred since it results also.
基体表面とポリマーとの結合は、共有結合、静電的相互作用、水素結合、疎水効果による結合等どのような結合様式であっても良いが、表面処理の簡易性等の観点から、基体表面とポリマーとの疎水効果によって結合していることが好ましい。 Binding of the substrate surface and the polymer, covalent bonds, electrostatic interactions, hydrogen bonding, may be coupled such any binding mode by hydrophobic effect but, from the viewpoint of ease of the surface treatment, the substrate surface it is preferably bonded by hydrophobic effect of the polymer.
また、本発明に使用するポリマーは、ホスホリルコリン基以外に他の基を含んでもよく、ホスホリルコリン基を有する単量体、活性エステル基を有する単量体とブチルメタクリレート基を有する単量体との三元共重合体が好ましい。 The polymer used in the present invention may contain other groups in addition to phosphorylcholine group, third and monomer having a monomer and a butyl methacrylate group having monomeric, active ester group having a phosphorylcholine group terpolymer are preferable.

(ポリマーのコーティング) (Coating of polymer)
本発明のバイオチップは、基体表面を該ポリマーでコーティングすることにより、生理活性物質の非特異的吸着を抑制する性質、特定の生理活性物質を固定化する性質を容易に付与することが可能である。 Biochip of the present invention, by coating the substrate surface with the polymer, property of inhibiting nonspecific adsorption of a physiologically active substance, can be easily applied the property of fixing a specific physiologically active substance is there.
基体へのポリマーのコーティングは、例えば有機溶剤に高分子化合物を0.05〜10重量%濃度になるように溶解した高分子溶液を調製し、浸漬、吹きつけなどの公知の方法で基材表面に塗布した後、室温下ないしは加温下にて乾燥させることにより行われる。 Coating of the polymer to the substrate, for example, in an organic solvent to prepare a dissolved polymer solution so that the polymer compound 0.05 to 10 wt% concentration, dipping, blowing a substrate surface by a known method such as wearing after application to be performed by drying at room temperature or under heating.

有機溶剤としては、2−ブタノン、エタノール、メタノール、t−ブチルアルコール、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトン、メチルエチルケトンなどの単独溶媒またはこれらの混合溶剤が使用される。 As the organic solvent, 2-butanone, ethanol, methanol, t- butyl alcohol, benzene, toluene, tetrahydrofuran, dioxane, dichloromethane, chloroform, acetone, single solvent or a mixed solvent thereof, such as methyl ethyl ketone are used. 中でも、エタノール、メタノールがプラスチック基材を変性させず、乾燥させやすいため好ましい。 Of these, ethanol, methanol does not denature the plastic substrate is preferable because easily dried. また、溶液中で高分子化合物を加水分解させる場合にも、水と任意の割合で混ざるので好ましい。 Also, when a polymer compound is hydrolyzed in solution, since the mixed water at an arbitrary ratio preferred.

本発明の高分子化合物を溶解した溶液を基材表面に塗布した後、溶液を除去し、有機溶媒で洗浄したのち、遠心乾燥するのが好ましい。 After a solution obtained by dissolving the polymer compound of the present invention was applied to the substrate surface, the solution was removed, after washing with an organic solvent, preferably a centrifugal drying. 遠心乾燥は、高速回転による遠心力と熱風で部品などを乾燥させるもので、様々な専用機が市販されており、メーカーによって「遠心分離乾燥機」「脱水乾燥機」「スピンドライヤー」と呼ばれている。 Centrifugal drying is used for drying the like parts centrifugal force and hot air by the high-speed rotation, it is commercially available various special-purpose machine, called a "centrifuge drier" "dehydrating dryer" "Spin Dryer" by the manufacturer ing.
または、単純にチップ表面に存在する溶液を遠心操作で除去した後、乾燥させることで遠心乾燥と同じ効果を得ることができる。 Or simply after removing solution Centrifuge present on the chip surface, it is possible to obtain the same effect as centrifugal drying by drying. 具体的には、1時間40℃で処理し、チップ表面に存在する溶液を除去、その後乾燥させる。 Specifically, treated with 1 hour 40 ° C., remove solution present on the chip surface, and then dried.

(基体の形状) (Shape of the substrate)
本発明に使用する基体の形状は、特に限定しないが、スライドガラス状の基板、マルチウェルプレート、ビーズ状の球体等が挙げられる。 Shape of the substrate used in the present invention is not particularly limited, a slide glass substrate, a multi-well plate, bead-like spheres, and the like. これらの基体表面に微細な流路を有していてもよく、流路内に抗体を固定化させることも可能である。 May be those substrate surface have minute channels, it is also possible to immobilize the antibody in the flow path.
特に一般的なスライドガラス状での場合、市販の測定装置(例えばFigen社製GenePix4000B)で測定できるメリットがあり好適である。 Especially in the case of a general slide glass, it is preferred has the advantage that can be measured with commercially available measuring device (e.g. Figen Co. GenePix 4000B).

(基体の材質) (Material of the substrate)
前記基体の材質は、例えばガラス、プラスチック、金属を用いることが可能である。 The material of the substrate may be used, for example a glass, plastic, metal. これらの中で、プラスチック製の基体は、加工性、使用後の焼却処理等の点で最も好適である。 Among these, a plastic substrate, workability, it is most preferred in terms of incineration or the like after use.
基体に用いるプラスチックの素材は特に限定するものではないが、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、飽和環状ポリオレフィン、ポリペンテン、ポリアミド、及びそれらの共重合体よりなる群より選ばれる少なくとも1種であることが好ましい。 Is not particularly limited plastic material used for the substrate, polycarbonate, polyethylene, polypropylene, polystyrene, saturated cyclic polyolefins, polypentene, polyamides, and be at least one selected from the group consisting of a copolymer thereof preferable. 特に、透明性に優れたポリカーボネート、ポリスチレン、環状ポリオレフィンや、自家蛍光発色の少ない環状ポリオレフィンが好適に用いることができる。 In particular, excellent polycarbonate transparency, polystyrene, and cyclic polyolefins, low cyclic polyolefin autofluorescent color can be suitably used.

バイオチップに固定化する蛋白質は、特に限定するものではないが、生体由来分子を用いることが多く、特に抗体を用いることが多い。 Protein to be immobilized on the biochip is not particularly limited, often used biological molecules, in particular is often used antibodies. 抗体を固定化したバイオチップは、ELISA分析に用いることができる。 Biochip with immobilized antibodies can be used in ELISA analysis.

次に、本発明の具体的実施例について説明する。 Next, detailed embodiments of the present invention.
1. 1. ポリマーの調製 (1)ポリマーの合成 2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン(以下、「MPC」と記載)、n− Preparation of Polymer (1) Synthesis of 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine polymer (hereinafter referred to as "MPC"), n-
ブチルメタクリレート(以下、「BMA」と記載)、p−ニトロフェニルオキシカルボニル−ポリエチレングリコールメタクリレート(以下、「MEONP」と記載。)を脱水エタノールに溶解させた。 Butyl methacrylate (hereinafter, described as "BMA"), p-nitrophenyl oxycarbonyl - polyethylene glycol methacrylate (. Hereinafter referred to as "MEONP") were dissolved in dehydrated ethanol.
そこに、さらに2、2−アゾビスイソブチロニトリル(以下、「AIBN」と記載、和光純薬工業社製)を添加し、均一になるまで撹拌することで、モノマー混合溶液を作製した。 There, further 2,2-azobisisobutyronitrile was added (hereinafter, described, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd. as "AIBN"), and by stirring until homogeneous, to prepare a monomer mixture solution.
なお、モノマー混合溶液中における、それぞれのモル比は、MPC、BMA、MEON Incidentally, in the monomer mixed solution, the respective molar ratios, MPC, BMA, Meon
Pの順に70:27:3である。 In the order of P 70: 27: 3.
その後、アルゴンガス雰囲気下、60℃で6時間反応させた後、反応溶液をジエチルエーテル中に滴下し、沈殿を収集することにより第1のポリマーを得た。 Thereafter, an argon gas atmosphere, and reacted for 6 hours at 60 ° C., the reaction solution was dropped into diethyl ether to give a first polymer by collecting the precipitate.
なお、上述したMEONPについては、以下の(2)に示すようにして合成した。 Note that the MEONP described above, was synthesized as shown in the following (2).
(2)p−ニトロフェニルオキシカルボニル−ポリエチレングリコールメタクリレート(MEONP)の合成 0.01molのポリエチレングリコールモノメタクリレート(日本油脂製、「Blenmer PE−200」)を20mLのクロロホルムに溶解させた後、−30℃まで冷却した。 (2) p-nitrophenyl oxycarbonyl - polyethylene glycol monomethacrylate synthetic 0.01mol polyethylene glycol methacrylate (MEONP) (manufactured by NOF, "Blenmer PE-200") was dissolved in chloroform 20 mL, -30 ℃ and then cooled to.
−30℃に保ちながらこの溶液に、予め作製しておいた0.01molのp−ニトロフェニルクロロフォーメート(Aldrich社製)と0.01molのトリエチルアミン(和光純薬工業社製)およびクロロホルム20mLの均一溶液をゆっくりと滴下した。 To this solution while maintaining the -30 ° C., preformed which had been 0.01mol of p- nitrophenyl chloroformate and (Aldrich Co.) 0.01mol of triethylamine (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and chloroform 20mL homogeneous solution was slowly added dropwise.
−30℃にて1時間反応させた後、室温でさらに2時間溶液を攪拌した。 After reacting for 1 hour at -30 ° C., and stirred for a further 2 hours the solution at room temperature. その後反応液から塩をろ過により除去し、溶媒を留去してMEONPを得た。 Salts were removed by filtration from the subsequent reaction to give the MEONP and evaporated.

2. 2. 抗原の検出 [実施例1](BSAを含むスポット液でRAT ALBUMIN抗体を固定化) Detection of antigen [Example 1] (immobilized RAT Albumin antibody spot solution containing BSA)
まず、RAT ALBUMINの検出のために、以下の部材および原材料等を用意した。 First, for the detection of RAT Albumin, we were prepared following members and raw materials.
基材:穴部を備えるポリエチレン樹脂基板を用意した。 Substrate: was prepared polyethylene resin substrate provided with a hole.
特異抗体(一次抗体):RABBIT IGG FRACTION TO RAT ALBUMIN(Cappel社製)を用意した。 Specific antibody (primary antibody): RABBIT IGG FRACTION TO RAT ALBUMIN (manufactured by Cappel Co., Ltd.) was prepared.
標識化特異抗体(二次抗体):ビオチン標識 SHEEP IGG FRACTION TO RATALBUMIN(Cappel社製)を用意した。 Labeled specific antibody (secondary antibody): it was prepared biotin-labeled SHEEP IGG FRACTION TO RATALBUMIN (Cappel Co., Ltd.).
抗原:Albumin ,Rat (-)(Cappel社製)を用意した。 Antigen: Albumin, Rat (-) were prepared (Cappel Co., Ltd.).
洗浄液:0.05% triton X100 /PBS を用意した。 Washing solution: was prepared 0.05% triton X100 / PBS.

次に、ポリマーの0.5wt%エタノール溶液を調整し、これを成型品の穴部に点着したのち乾燥させ、エタノールを用いて洗浄し、底面にポリマーを導入した。 Then, by adjusting the 0.5 wt% ethanol solution of the polymer, which was dried After spotting the hole of the molded article, washed with ethanol, it was introduced polymer on the bottom.
次に、BSAを含むリン酸バッファー溶液で各々10,20,180ug/mLに調整した特異抗体溶液を穴部に点着したのち、50%以下の乾燥状態、室温下で一晩静置。 Then, the glass substrate was spotted specific antibody solution each was adjusted to 10,20,180ug / mL in phosphate buffer solution containing BSA in the hole, 50% or less of the dry, left to stand overnight at room temperature. 次に、洗浄液を用いて3回洗浄した。 Then washed 3 times with washing solution.

次に、抗原の70μg/mLPBS溶液(検体)を調製し、これを穴部に点着したのち、37℃の環境下に1.5時間静置して、抗原抗体反応を実施、余剰の検体を洗浄液を用いて3回洗浄した。 Next, antigen 70 [mu] g / ml PBS solution (sample) was prepared, after spotting the hole so, standing 1.5 hours at 37 ° C. environment implementing an antigen-antibody reaction, the excess of the analyte It was washed 3 times with washing solution.

次に、標識化特異抗体の1ug/mL PBS溶液(0.05% triton X100)を調製し、これを穴部に点着したのち、37℃の環境下に1時間静置して、抗原抗体反応を実施し、洗浄液を用いて3回洗浄を行った。 Then, 1 ug / mL PBS solution of labeled specific antibody (0.05% triton X100) was prepared, after spotting the hole so, allowed to stand for 1 hour under 37 ° C. environment an antigen-antibody reaction was performed, it was performed three times washed with the washing liquid.
次に、Cy3標識されたストレプトアビジンのPBS溶液(0.05%triton X100)を調製し、 Next, Cy3-labeled streptavidin PBS solution (0.05% triton X100) was prepared,
これを穴部に点着したのち、37℃の環境下に0.5時間静置した。 After this was spotted on the hole, and allowed to stand 0.5 hours at 37 ° C. environment.
洗浄液を用いて3回洗浄を行った後、穴部について、それぞれ、蛍光測定(励起波長:550nm蛍光波長:570nm)を行った。 After 3 washes with washing solution, the holes, respectively, fluorescence measurement (excitation wavelength: 550 nm fluorescence wavelength: 570 nm) was carried out.

その結果、1次抗体濃度が低い場合でもシグナルが検出され、各スポットの形も図1、 As a result, the detected signal even if the primary antibody concentration is low, and shape of each spot Figure 1,
図2、図3にしめすように形状のよい円を提示した。 2, presented good circular shapes as shown in the FIG.

[実施例2](スキムミルクを含むスポット液でRAT ALBUMIN抗体を固定化) [Example 2] (immobilized RAT Albumin antibody spot solution containing skim milk)
実施例1と同様にしてポリエチレン樹脂基板にポリマーを導入した。 It was introduced polymer polyethylene resin substrate in the same manner as in Example 1.

次に、スキムミルクを含むリン酸バッファー溶液で各々10,20,180ug/mLに調整した特異抗体を穴部に点着したのち、50%以下の乾燥状態、室温下で一晩静置、洗浄液を用いて3回洗浄を行った。 Next, using After spotting specific antibodies each was adjusted to 10,20,180ug / mL in phosphate buffer solution containing skim milk into the hole, more than 50% of the dry overnight standing at room temperature, the washing liquid It was washed three times with Te.

次に、抗原の70μg/mLPBS溶液(検体)を調製し、これを穴部に点着したのち、37℃の環境下に1.5時間静置して、抗原抗体反応を実施し、洗浄液を用いて3回洗浄を行った。 Next, antigen 70 [mu] g / ml PBS solution (sample) was prepared, after which was spotted in the hole, allowed to stand for 1.5 hours under 37 ° C. environment to implement an antigen-antibody reaction, a washing liquid was three times washed with.

次に、標識化特異抗体の1ug/mL PBS溶液(0.05% triton X100)を調製し、これを穴部に点着したのち、37℃の環境下に1時間静置して、抗原抗体反応を実施し、洗浄液を用いて3回洗浄を行った。 Then, 1 ug / mL PBS solution of labeled specific antibody (0.05% triton X100) was prepared, after spotting the hole so, allowed to stand for 1 hour under 37 ° C. environment an antigen-antibody reaction was performed, it was performed three times washed with the washing liquid.

次に、Cy3標識されたストレプトアビジンのPBS溶液(0.05%triton X100)を調製し、 Next, Cy3-labeled streptavidin PBS solution (0.05% triton X100) was prepared,
これを穴部に点着したのち、37℃の環境下に0.5時間静置し、3回洗浄を行った。 After this was spotted in the hole, it allowed to stand for 0.5 hours under 37 ° C. environment, and washed three times with.
その後、穴部について、それぞれ、蛍光測定(励起波長:550nm蛍光波長:570nm)を行った。 Thereafter, the holes, respectively, fluorescence measurement (excitation wavelength: 550 nm fluorescence wavelength: 570 nm) was carried out.

その結果、1次抗体濃度が低い場合でもシグナルが検出され、各スポットの形も図4、 As a result, the detected signal even if the primary antibody concentration is low, and shape of each spot 4,
図5、図6に示すように形状のよい円を提示した。 5, presented a good circular in shape as shown in FIG.

[実施例3](IgGを含むスポット液でRAT ALBUMIN抗体を固定化) [Example 3] (immobilized RAT Albumin antibody spot solution containing IgG)
実施例1と同様にしてポリエチレン樹脂基板にポリマーを導入した。 It was introduced polymer polyethylene resin substrate in the same manner as in Example 1.

次に、BSAを含むリン酸バッファー溶液で各々10,20,180ug/mLに調整した特異抗体を穴部に点着したのち、50%以下の乾燥状態、室温下で一晩静置、洗浄液を用いて3回洗浄を行った。 Then, the glass substrate was spotted specific antibodies were each adjusted to 10,20,180ug / mL in phosphate buffer solution containing BSA in the hole, more than 50% of the dry overnight standing at room temperature, the washing liquid used It was washed three times with Te.

次に、抗原の70μg/mLPBS溶液(検体)を調製し、これを穴部に点着したのち、37℃の環境下に1.5時間静置して、抗原抗体反応を実施し、洗浄液を用いて3回洗浄を行った。 Next, antigen 70 [mu] g / ml PBS solution (sample) was prepared, after which was spotted in the hole, allowed to stand for 1.5 hours under 37 ° C. environment to implement an antigen-antibody reaction, a washing liquid was three times washed with.

次に、標識化特異抗体の1ug/mL PBS溶液(0.05% triton X100)を調製し、これを穴部に点着したのち、37℃の環境下に1時間静置して、抗原抗体反応を実施し、洗浄液を用いて3回洗浄を行った。 Then, 1 ug / mL PBS solution of labeled specific antibody (0.05% triton X100) was prepared, after spotting the hole so, allowed to stand for 1 hour under 37 ° C. environment an antigen-antibody reaction was performed, it was performed three times washed with the washing liquid.

次に、Cy3標識されたストレプトアビジンのPBS溶液(0.05%triton X100)を調製し、 Next, Cy3-labeled streptavidin PBS solution (0.05% triton X100) was prepared,
これを穴部に点着したのち、37℃の環境下に0.5時間静置し、洗浄液を用いて3回洗浄を行った。 After this was spotted in the hole, it allowed to stand for 0.5 hours under 37 ° C. environment was 3 times washed with washing solution.
その後、穴部について、それぞれ、蛍光測定(励起波長:550nm蛍光波長:570nm)を行った。 Thereafter, the holes, respectively, fluorescence measurement (excitation wavelength: 550 nm fluorescence wavelength: 570 nm) was carried out.

その結果、1次抗体濃度が低い場合でもシグナルが検出され、各スポットの形も図7、図8、図9に示すように形状のよい円を提示した。 As a result, the detected signal even if the primary antibody concentration is low, and shape of each spot 7, 8, presented a good circular in shape as shown in FIG.

比較例1 Comparative Example 1
実施例1と同様にしてポリエチレン樹脂基板にポリマーを導入した。 It was introduced polymer polyethylene resin substrate in the same manner as in Example 1.

次に、リン酸バッファー溶液で各々10,20,180ug/mLに調整した特異抗体を穴部に点着したのち、50%以下の乾燥状態、室温下で一晩静置し、洗浄液を用いて3回洗浄を行った。 Then, the glass substrate was spotted specific antibodies were each adjusted to 10,20,180ug / mL with phosphate buffer solution into the hole, 50% or less of the dry, and allowed to stand overnight at room temperature, using a washing liquid 3 cleaning was carried out times.

次に、抗原の70μg/mLPBS溶液(検体)を調製し、これを穴部に点着したのち、37℃の環境下に1.5時間静置して、抗原抗体反応を実施し、洗浄液を用いて3回洗浄を行った。 Next, antigen 70 [mu] g / ml PBS solution (sample) was prepared, after which was spotted in the hole, allowed to stand for 1.5 hours under 37 ° C. environment to implement an antigen-antibody reaction, a washing liquid was three times washed with.

次に、標識化特異抗体の1ug/mL PBS溶液(0.05% triton X100)を調製し、これを穴部に点着したのち、37℃の環境下に1時間静置して、抗原抗体反応を実施した、洗浄液を用いて3回洗浄を行った。 Then, 1 ug / mL PBS solution of labeled specific antibody (0.05% triton X100) was prepared, after spotting the hole so, allowed to stand for 1 hour under 37 ° C. environment an antigen-antibody reaction was performed, it was performed three times washed with the washing liquid.

次に、Cy3標識されたストレプトアビジンのPBS溶液(0.05%triton X100)を調製し、 Next, Cy3-labeled streptavidin PBS solution (0.05% triton X100) was prepared,
これを穴部に点着したのち、37℃の環境下に0.5時間静置し、洗浄液を用いて3回洗浄を行った。 After this was spotted in the hole, it allowed to stand for 0.5 hours under 37 ° C. environment was 3 times washed with washing solution.
その後、穴部について、それぞれ、蛍光測定(励起波長:550nm蛍光波長:570nm)を行った。 Thereafter, the holes, respectively, fluorescence measurement (excitation wavelength: 550 nm fluorescence wavelength: 570 nm) was carried out.

その結果、1次抗体濃度が高い場合はシグナルが検出されたが、濃度が低い場合はシグナルが低くスポットの形状も図10、図11、図12に示すように真円ではなく、スポット形も小さくなった。 As a result, if the primary antibody concentration is high is detected the signal, the shape of the spot signal low if the concentration is low 10, 11, not a true circle as shown in FIG. 12, also spot-shaped It becomes smaller.

本特許のバイオチップの製造方法を用いることにより、不要な生理活性物質の吸着および結合を抑制し、かつ良好なスポット形状を有するバイオチップを作製でき、免疫分析反応に良好なバイオチップを得ることができる。 By using the manufacturing method of the present patent biochip, it suppresses adsorption and binding unwanted physiologically active substances, and good spot shape can produce a biochip having, to obtain good biochip immunoassay reaction can.

Claims (15)

  1. 基体表面に蛋白質を固定化するバイオチップの製造方法であって、 A method of manufacturing a biochip for immobilizing proteins on the surface of the substrate,
    (1)親水性高分子物質を含有する水溶液に該蛋白質を溶解し、蛋白質固定用水溶液を作製する工程、 (1) in an aqueous solution containing a hydrophilic polymeric substance to dissolve the protein, to produce a protein fixing solution process,
    (2)基体表面に蛋白質固定用水溶液を点着または塗布し蛋白質を固定化する工程、 (2) immobilizing the spotted or applied protein a protein fixing solution on the surface of the substrate,
    を含むことを特徴とするバイオチップの製造方法。 Method for manufacturing a biochip which comprises a.
  2. 前記(1)工程の親水性高分子物質が、アルブミン、スキムミルク、カゼインおよび免疫グロブリンを含む群より選択される1種以上の親水性高分子物質である請求項1記載のバイオチップの製造方法。 Wherein (1) a hydrophilic polymer material step, albumin, skim milk, casein and method for manufacturing a biochip according to claim 1, wherein the one or more hydrophilic polymeric material selected from the group comprising immunoglobulin.
  3. 蛋白質が基体表面にスポット状に固定化されている請求項1または2記載のバイオチップの製造方法。 The process according to claim 1 or 2, wherein the biochip protein is immobilized in a spot shape on the substrate surface.
  4. 複数種の蛋白質のスポットが基体表面の同一区画中に存在している請求項3記載のバイオチップの製造方法。 More protein spots method for manufacturing a biochip according to claim 3, characterized in that present in the same compartment of the substrate surface.
  5. 前記(2)工程の固定化が共有結合または物理化学吸着である請求項1乃至4いずれか1項に記載のバイオチップの製造方法。 Wherein (2) A method of manufacturing a biochip according to 1, wherein any one of claims 1 to 4 immobilized is a covalent bond or physical chemical adsorption process.
  6. 前記基体にポリマーを塗布した請求項1乃至5いずれか1項に記載のバイオチップの製造方法。 Method for manufacturing a biochip according to claims 1 to 5 any one coated polymer to the substrate.
  7. 前記ポリマーがホスホリルコリン基を有する単量体とブチルメタクリレート基を有する単量体と蛋白質を固定化する官能基を有する単量体との共重合体である請求項1乃至6いずれか1項に記載のバイオチップの製造方法。 Claim 1 to 6 any one of a copolymer of a monomer having a functional group for fixing a monomer and a protein having a monomer and butyl methacrylate groups of the polymer having a phosphorylcholine group the method of manufacturing a biochip.
  8. 前記ホスホリルコリン基が2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基である請求項1乃至7いずれか1項に記載のバイオチップの製造方法。 Method for manufacturing a biochip according to claims 1 to 7 any one the phosphorylcholine group is 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine group.
  9. 前記の蛋白質を固定化する官能基が活性エステル基である請求項8記載のバイオチップの製造方法。 Method for manufacturing a biochip according to claim 8, wherein the functional group to immobilize the protein is an active ester group.
  10. 前記活性エステル基がp−ニトロフェニルエステル又はN−ヒドロキシスクシンイミドエステルである請求項9記載のバイオチップの製造方法。 Production method of the active ester group is p- nitrophenyl ester or N- hydroxysuccinimide ester in which claim 9, wherein the biochip.
  11. 基体の形状がスライドガラス状である請求項1乃至10いずれか1項に記載のバイオチップの製造方法。 Method for manufacturing a biochip according to 1, wherein any one of claims 1 to 10 the shape of the substrate is a slide glass.
  12. 基体の材質がプラスチックである請求項1乃至11いずれか1項に記載のバイオチップの製造方法。 Method for manufacturing a biochip according to claims 1 to 11 any one material of the substrate is a plastic.
  13. 前記プラスチックがポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、飽和環状ポリオレフィン、ポリペンテン、ポリアミド及びそれらの共重合体よりなる群より選ばれる少なくとも1種である請求項12記載のバイオチップの製造方法。 Wherein the plastic is polycarbonate, polyethylene, polypropylene, polystyrene, saturated cyclic polyolefins, polypentene, polyamide and at least one kind of claim 12 manufacturing method of a biochip according selected from the group consisting of copolymers thereof.
  14. 前記蛋白質が、抗体である請求項1乃至13いずれか1項に記載のバイオチップの製造方法 The protein, method for producing a biochip according to claims 1 to 13 any one is an antibody
  15. 請求項1乃至14いずれか1項に記載の製造方法で作製したバイオチップ。 Biochip was fabricated by the manufacturing method according to any one of claims 1 to 14.
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