JP2013517490A5

JP2013517490A5 -

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Publication number: JP2013517490A5
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Filing date: 2011-01-18
Publication date: 2014-01-16
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Description

すべての化学結合は、それらに固有の振動数を有する。光と物質の相互作用を使用することによって、これらの分子振動に関する情報の取得を目指す方法は、振動感受性の光学技術と呼ばれる。これらの技術のうち最もよく知られているのは、赤外（ＩＲ）分光法である。赤外分光法は、サンプル中に存在する化学結合に特異的な吸収線を観察する。１９２８年に発見されたラマン散乱（この効果を発見した物理学者であるチャンドラシェーカル・ヴェンカタ・ラーマンの名前に由来する）は、使用される可視光線を、光線と相互作用する分子の振動スペクトルに接近させることを可能にする。ラマン散乱では、分子に入射する角振動数ω_ｐのポンプ波が、ストークス波と呼ばれる角振動数ω_ｓの波（図１（Ａ））およびアンチストークス波と呼ばれる角振動数ω_ＡＳの波（図１（Ｂ））の中へと非弾性的に散乱される。生成された波とポンプ波との間の振動数の差は、ω_ｐ−ω_ｓ＝ω_ａｓ−ω_ｐ＝Ω_Ｒとなるように（角振動数Ω_Ｒの）分子ラマン遷移に依存する。この過程を光子的に見ると、ストークス波およびアンチストークス波は、それぞれ基底振動準位および励起振動準位からの吸収に相当する。励起振動準位（Ｂ）からアンチストークス波を生成する過程は、ストークス波を生成する過程よりもずっと起こりにくい。ストークス波を生成する過程は、自発的ラマン分光法において実際に観察される唯一の過程である。ストークス波のスペクトル分布の詳細な研究によって、サンプル中に存在する化学結合の密度に関する情報が生み出される。この非弾性散乱の自発的過程は、蛍光発光に比べて非常に非効率である（１０^−１６ｃｍ^２／分子に達するフルオロフォア１光子の吸収断面積に対して、ラマン断面積は１０^−３０ｃｍ^２／分子のオーダーである）。

ＣＡＲＳ（コヒーレントアンチストークスラマン散乱）ラマン分光法は、４つの波を混合する過程であって、サンプル中に存在する振動性結合を検出することができる。この過程は、たとえばＲ．Ｗ．Ｂｏｙｄの非線形光学（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、ボストン、１９９２年）に記載されている。本方法は、角振動数ω_ｐおよびω_ｓ（または振動数ν_ｐおよびν_ｓ）の２つのレーザパルスを送出することを含む。この方法の角振動数差は、解析中の振動準位における角振動数Ωに等しい。ω_ｐ−ω_ｓ＝Ωというこの共鳴の形態において、角振動数Ωの振動準位は活性化された状態で存在しており、角振動数ω_ｐのビームを角振動数ω_ａｓ＝２ω_ｐ−ω_ｓのビームへと非弾性的に散乱させることが可能であろう（図２（Ａ））。この新たな放射ω_ａｓが存在することは、サンプル中に角振動数Ωにて振動する結合が存在する痕跡（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）である。ＣＡＲＳの第１の実装は、スペクトル的にピコ秒という狭さの２つのパルスをサンプルに向けることを含む。これらのパルスの角振動数差によって、たった１つの特異的な振動性結合を検出することができるだけである。同定を最適にするためには、サンプル中に存在するすべての振動性結合がテストされる。これは「多重ＣＡＲＳ」（たとえばＭ．ＭｕｌｌｅｒおよびＪ．Ｓｃｈｉｎｓの「多重ＣＡＲＳ分光法を用いた脂質膜の熱力学的状態の画像化」（ＰｈｙｓｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙＢ１０６巻、３７１５〜３７２３頁（２００２年）を参照）と呼ばれるモードの操作により行われる。ここではスペクトル的に狭いパルスω_ｐとスペクトル的に広いパルスω_ｓとがサンプルに向けられる（図２（Ｂ））。したがって、サンプル中に存在するすべての振動準位Ω_ｉを検出することができ、生じた信号ω_ａｓのスペクトルを得ることができる。技術的な観点から、狭スペクトルはたとえばピコ秒のレーザから生じ、広域スペクトルはたとえばフェムト秒のレーザ、または超連続体（ＳＣ）を生み出すフォトニック結晶ファイバーから生じる。

Ｄ．Ｇａｃｈｅｔらによる「ノイズのないコヒーレントアンチストークスラマン分光法に対する焦点場（Ｆｏｃｕｓｅｄｆｉｅｌｄ）の対称性」（ＰｈｙｓｉｃａｌＲｅｖｉｅｗＡ７７巻（２００８年））という論文には、原法が示されている。この方法は、非共鳴寄与を除去することを可能にする。図４〜６は本方法を説明する。本方法の特徴は、共鳴媒質（ｍｅｄｉｕｍ）（図４（Ａ）（Ｂ）の参照数字４１）と非共鳴媒質（図４（Ａ）（Ｂ）の参照数字４２）との間の横断界面４３に関して、物体とその鏡像との間の差動的な（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）ＣＡＲＳ画像を生成することにある。三次非線形感受率は、共鳴媒質４１において共鳴項χ^（３） _１Ｒおよび非共鳴項χ^（３） _１ＮＲによって規定される。非共鳴媒質４２では、三次非線形感受率は非共鳴項χ^（３） _２ＮＲによって規定される。図４（Ａ）（Ｂ）は、共鳴媒質と非共鳴媒質との横断界面４３に位置する能動（ａｃｔｉｖｅ）ＣＡＲＳ体（ｖｏｌｕｍｅ）４５（それぞれ振動数ω_ｐとω_ｓのポンプビームとストークスビームの焦点）を示す。２つの状況が想定される。つまり、ポンプビームとストークスビームが非共鳴媒質側にて入射するケースαと、ポンプビームとストークスビームが共鳴媒質側にて入射するケースβである。この論文で実証されているのは、ケースαとケースβで得られたＣＡＲＳ信号間の差が共鳴媒質の共鳴寄与のみを含むということである。図５は、図４（Ａ）（Ｂ）に示すように横断界面に焦点が合わせられたポンプビームとストークスビームのベクトル特性を考慮に入れた数値計算の結果を示す。この解析の特徴は、問題α（Ｉ_α（Ｆｗｄ））およびβ（Ｉ_β（Ｆｗｄ））にて放射されたＣＡＲＳ信号の差ΔＩ_Ｆｗｄを、標準化ラマン偏移ζ＝（ω_ｐ−ω_ｓ−Ω_Ｒ）／Γ（式中、Γは研究された振動線の分光幅である）の関数として研究する点にある。差ΔＩ_Ｆｗｄはχ^（３） _１Ｒの虚数部に厳密に従うことが実証されている。χ^（３） _１Ｒは中央値１のラマンスペクトルであることが知られている。本方法の実験実装が図６（Ｂ）に示されている。実験結果が図６（Ａ）に示されている。図６（Ｂ）は、２つのスライドガラス６２，６３の間におけるＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）の層６１から構成されたサンプルを表す。ケースαは、ポンプビームとストークスビームとがガラス−ＤＭＦ界面（６２と６１の間の界面）に焦点を合わせられた場合に相当する。一方、ケースβは、励起ビームがＤＭＦ−ガラス界面（６１と６３の間の界面）で焦点を合わせられた場合に相当する。図６（Ａ）では、それぞれラマン偏移の関数として、曲線Ｃ１は（励起ビームが共鳴媒質中に焦点を合わせられた場合に）ＤＭＦ単独のＣＡＲ強度を示す。曲線Ｃ２は強度Ｉ_α（Ｆｗｄ）を示す。曲線Ｃ３は強度Ｉ_β（Ｆｗｄ）を示す。曲線Ｃ４は差（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）ΔＩ_Ｆｗｄを示す。曲線Ｃ５はラマンスペクトルを示す。理論的に実証されるように、本方法は曲線Ｃ１で表されるＣＡＲＳ散乱信号のノイズとなる非共鳴成分を除去することを可能にするようである。

第１の態様によると、本願発明は、界面を形成する共鳴媒質および非共鳴媒質を含むタイプのサンプル中に誘導された、共鳴非線形光信号を検出するための装置に関する。本装置は、所定タイプのサンプルの共鳴媒質を励起するための第１の所定の角振動数ωｐにおけるポンプビームと呼ばれる少なくとも１つの第１の励起光ビームの放射源と、前記入射ポンプビームとサンプルの共鳴媒質−非共鳴媒質間の軸方向界面との相互作用から生じた非線形光信号を検出するための第１の光モジュールと、前記入射ポンプビームと実質的に同じ位置にて、前記反射ポンプビームが前記横断界面を横断するように配置された前記ポンプビームの反射手段と、前記反射ポンプビームとサンプルとの相互作用から生じた非線形光信号を検出するための第２の光モジュールと、共鳴媒質の振動共鳴もしくは電子共鳴の指標である検出信号の差の計算を含む、前記第１および第２の検出モジュールによって検出された光信号処理モジュールと、を含む。

別の変形態様によると、本願発明の装置は、入射励起ビームの焦点を共通の焦点体（ｆｏｃａｌｖｏｌｕｍｅ）中に合せることにより、共鳴媒質と非共鳴媒質との間の前記界面を横断することを可能にするための焦点レンズと、入射ビームに焦点を合せる焦点レンズと同一のレンズであって、入射励起ビームとサンプルとの相互作用から生じた非線形信号を集めるための集光レンズと、を含む。前記集光レンズは、反射励起ビームの焦点を合せるためのレンズを形成する。入射ビームの焦点を合わせるための焦点レンズは、反射励起ビームとサンプルとの相互作用から生じた非線形信号を集めるためのレンズを形成する。

第２の態様によると、本願発明は、サンプル中に誘導された共鳴非線形光信号を検出するための方法に関する。サンプルは、界面を形成する共鳴媒質と非共鳴媒質とを含む。本方法は、ポンプビームと呼ばれる共鳴媒質を励起させるための少なくとも１つの第１の光線を、第１の所定の角振動数ωｐにて放射するステップと、１つ以上の前記ビームとサンプルとの相互作用から生じた第１の非線形光信号を検出するステップと、１つ以上の前記励起ビームを反射することにより、反射した１つ以上の前記励起ビームが１つ以上の入射励起ビームと実質的に同じ位置にて前記横断界面を横断するステップと、１つ以上の前記反射励起ビームとサンプルとの相互作用から生じた第２の非線形光信号を検出するステップと、共鳴媒質の振動共鳴または電子共鳴の指標である検出信号間の差を計算することを含む、検出された第１の光信号および第２の光信号を処理するステップと、を含む。前記ポンプビームは、光軸に沿ってサンプルへ入射されることにより、共鳴媒質と非共鳴媒質との間の横断界面の所定位置にてサンプルを横断する。

別の態様によると、１以上の励起ビームが、角度スキャンを受けることにより、共鳴媒質と非共鳴媒質との間の界面の様々な位置にてサンプルを横断する。

（説明済）図１（Ａ）と図１（Ｂ）は、ラマン散乱過程におけるストークス放射およびアンチストークス放射の原理を示す。（説明済）図２（Ａ）と図２（Ｂ）は、２つの異なるモードにおけるＣＡＲＳ放射の原理を示す。（説明済）図３（Ａ）と図３（Ｂ）は、共鳴および非共鳴ＣＡＲＳ過程の図である。（説明済）図４（Ａ）と図４（Ｂ）は、従来技術に従った方法を実装するためのケースαおよびβの図である。（説明済）従来技術に従った方法によって得られた数値シミュレーションの結果である。（説明済）図６（Ａ）と図６（Ｂ）は、従来技術に従った方法によって対称なサンプルを用いて得られた実験結果である。図７（Ａ）と図７（Ｂ）は、本願発明に従った方法を実装するためのケースαおよびβの図である。図８（Ａ）と図８（Ｂ）は、本願発明に従った方法を実装するための実験設定の例である。図８（Ｂ）に示すタイプのサンプルを用いて得られた実験結果である。図１０（Ａ）〜図１０（Ｄ）は、本願発明に従った方法によって、屈折率ｎ＝１．３３の水溶液中に浸された直径３μｍのポリスチレンビーズを用いた数値シミュレーションによって得られた画像である。本願発明のある変形態様に従った方法を実装するための実験設定の例である。図１２（Ａ）と図１２（Ｂ）は、図１１の例における方法を実装するためのケースαおよびケースβの図である。共鳴媒質と非共鳴媒質との間の軸方向界面において、ＣＡＲＳ散乱を実装するための幾何学的条件を示す略図である。図１４（Ａ）〜図１４（Ｅ）は、励起ビームの焦点の相対位置の関数として、共鳴媒質と非共鳴媒質との間の軸方向界面とともにＣＡＲＳ散乱信号のずれを示す図である。図１５（Ａ）〜図１５（Ｃ）は、数値シミュレーションにより得られた曲線である。図１５（Ａ）は、パラメータζ＝（ω_ｐ−ω_ｓ−Ω_Ｒ）／Γ（標準化ラマン偏移）の関数としてＣＡＲＳ散乱信号における偏移を説明する。図１５（Ｂ）は、パラメータζの関数として、空間（ｋ_ｘ＞０）および空間（ｋ_ｘ＜０）にてそれぞれ計算された光強度および光強度差を表す。図１５（Ｃ）は、軸方向界面に対する励起ビームの焦点のＸ座標上の位置の関数として、空間（ｋ_ｘ＞０）および空間（ｋ_ｘ＜０）にてそれぞれ計算された光強度および光強度差を表す。本願発明に従ったＣＡＲＳ検出を実装するための３つの可能なモダリティを説明する図である。

（詳細な説明）
図７（Ａ）および図７（Ｂ）は、２つの図を用いてＣＡＲＳ散乱のケースにおける本願発明に従った検出方法の原理を説明する。本方法によると、同一直線上（ｃｏｌｌｉｎｅａｒ）にある角振動数ωｐのポンプビームおよび角振動数ωｓのストークビームが横断界面７０、つまり、入射ビームの軸（光軸）と垂直な平面に沿って非ゼロ成分を有する非共鳴媒質と共鳴媒質との間の界面を横断する。一般に、これら２つのビームの焦点が合わせられる。７１は、横断界面７０を横断する共通の焦点体を示す。本願発明によると、励起ビームが第１の方向に界面を横断し（ケースαと呼ぶ）、次に、同じ界面を実質的に同じ位置ではあるが反対方向に横断するように、サンプルに向かって反射する（ケースβ）。図７に示す例では、励起ビームが最初に非共鳴媒質／共鳴媒質の方向（図７（Ａ）：ケースα）、次に共鳴媒質／非共鳴媒質の方向（図７（Ｂ）：ケースβ）へと界面を横切る。αおよびβの２つのケースでは、ＣＡＲＳ散乱信号強度Ｉα（Ｆｗｄ）およびＩβ（Ｆｗｄ）がそれぞれ測定され、これらの差ΔＩＦｗｄが計算される。校正後、信号が得られる。出願人が実証した信号は、共鳴媒質の三次非線形感受率の虚数部Ｉｍ［χ（３）１Ｒ］に比例する。本願発明によると、ケースαとβでサンプルを励起するためにポンプビームとストークスビームの単一パルスが使用される。これにより、図４〜６に示した従来技術の方法と比較して、ＳＮ比を増大させることが可能となる。

レーザシステム８０１は、たとえばいわゆる２色用途において、２つのスペクトル的に狭く調節可能なレーザ光源８０８を含む。レーザ光源８０８は、たとえば６９０〜１０００ｎｍの波長にて放射され、ポンプレーザ８０９によって送出されるチタン：サファイア型、または５３２ｎｍにて放射されるネオジム：ＹＶＯ４型である。調節可能なレーザは、たとえば通常３ピコ秒のオーダーのピコ秒のパルスを放射することにより、角振動数ω_ｐ（通常は波長７３０ｎｍ）のポンプ励起ビームおよび角振動数ω_ｓのストークス励起ビームを形成する。パルスピッカー（ｐｉｃｋｅｒ）８１０が使用されることにより、ピークパルス力を減らすことなく、ポンプ励起レーザおよびプローブ励起レーザのパルス反復振動数を減少させてもよい。調節可能なストークスビームまたはポンプビームを用いることにより、特にアンチストークス放射スペクトルを、共鳴媒質のラマンスペクトルを決定することを目的とした分光法における用途に対して、スキャンすることができる。たとえば光学パラメータ式発振器（ＯＰＯ）、光学的パラメトリック増幅器（ＯＰＡ）、ピコ秒ネオジム：ガラス発振器、イッテルビウムまたはエルビウム添加光ファイバーなどの他の調整可能なレーザ光源が使用されてもよい。また光源は、観察されるラマン線の分光幅に応じて、ナノ秒またはフェムト秒のレーザ光源であってもよい。しかし、ナノ秒パルスはスペクトル的には非常に良いが、ピコ秒パルスよりも低い最大出力しか有さない。さらに、ナノ秒パルスに関連した熱的効果は、生物学的サンプルによりダメージを与えうる。未加工のフェムト秒パルスは一般に、スペクトルが広すぎる。凝縮相（固体または液体）では線幅が約１０〜２０ｃｍ^−１である。これはピコ秒パルスの使用に対応する。

図８（Ｂ）に見られるように、本願発明による装置は、同じポンプパルスおよびストロークパルスが、それぞれおケースαおよびβの場合に横断界面の同じ位置にてサンプルを横断することを可能にする。本方法はしたがって、単に対称または可逆的なサンプルではなく、共鳴媒質と非共鳴媒質との間に界面を呈する任意のタイプのサンプルに対して使用することができる。

ある例によると、装置８００はまた、サンプルのＸＹ平面中に励起ビームスキャン装置を含む（図示せず）。このスキャン装置は、サンプルを形成する共鳴媒質および非共鳴媒質の横断界面に対して励起ビームの焦点を調節するために、分光法用途において、つまり画像化用途においても有用であってもよい。このスキャン装置は、サンプルの置換を可能とする装置、または好ましくは励起ビームスキャン装置として機能してもよい。励起ビームを逆平行方向に反射できるように、球状励起ビーム−反射鏡８１３を使用できることが有利である。これにより、反射励起ビーム（ケースβ）が入射ビーム（ケースα）と同じ位置にてサンプルを横断することができる。

図１３は、たとえば解析される媒質を含む媒質、つまり生物学的に興味のある媒質である共鳴媒質１３１、および通常は溶媒を含む媒質である非共鳴媒質１３２を含むサンプルを示す。三次非線形感受率は、共鳴媒質１３１では共鳴項χ（３）１Ｒおよび非共鳴項χ（３）１ＮＲによって定義される。非共鳴媒質１３２では、三次非線形感受率は非共鳴項χ（３）２ＮＲによって定義される。本願発明による方法のこの態様によると、同一直線上にある角振動数ωｐのポンプ励起ビームと角振動数ωｓのプローブ励起ビームは、焦点体１３５にてサンプルに入射し、サンプルの軸方向界面１３３を横断する。本方法のこの態様によると、以下において詳細に説明するように、波動ベクトルｋの空間、つまりＣＡＲＳプロセスにより放射された信号の放射方向の空間における、界面の両側に対する非線型光ビームの光強度が解析される。この強度は、それぞれ界面の両側にて、ＩＦｗｄ（ベクトルｋ）およびＩＦｗｄ（ベクトルｋ´）として図１３に示されている。「Ｆｗｄ」との省略形は、後ろ方向に散乱された「Ｅｐｉ」と呼ばれる信号の対語として、前方ＣＡＲＳ散乱信号を表す。

Claims

界面を形成する共鳴媒質（６１）および非共鳴媒質（６２および／または６３）を含むタイプのサンプル（８０５）中に誘導された共鳴非線形光信号を検出するための装置であって、
第１の所定の角振動数ω_ｐにて所定タイプのサンプルの共鳴媒質を励起するための、ポンプビームと呼ばれる少なくとも１つの第１の励起ビームの放射源（８０１）と、
前記ポンプビームが光軸に沿ってサンプルに入射することによって、共鳴媒質と、光軸に垂直な平面に沿って非ゼロ成分を有するサンプルの非共鳴媒質との間に形成された界面である横断界面の所定位置にてサンプルを横断した場合に、前記ポンプビームとサンプルとの相互作用から生じた非線形光信号を検出するための第１の光検出モジュール（８０３）と、
入射したポンプビームと実質的に同じ位置にて、反射したポンプビームが前記横断界面を横断するように配置された、反射したポンプビームを形成するための前記ポンプビームの反射手段（８１３）と、
前記反射したポンプビームとサンプルとの相互作用から生じた非線形光信号を検出するための第２の光検出モジュール（８０６）と、
共鳴媒質の振動共鳴もしくは電子共鳴の指標である検出された非線形光信号の差の計算を含み、前記第１および第２の光検出モジュールによって検出された非線形光信号を処理するための処理モジュール（８３０）と、を含む装置。
放射源（８０１）は、第１の角振動数ω_ｐとは異なる少なくとも第２の角振動数ω_ｓにて、共鳴媒質を励起するための少なくとも１つの第２の励起ビームの放射を可能とし、
励起ビームのすべては、同一線上にあって、共通の焦点体中の前記位置にて前記横断界面を横断するように配置されており、
反射手段は、前記横断界面上の同じ位置にてすべての励起ビームを前記横断界面に反射するように配置され、
第１および第２の光検出モジュールによって検出された非線形光信号の差は、第１および第２の角振動数の線形結合に等しい角振動数における共鳴媒質の振動共鳴または電子共鳴の指標である請求項１に記載の装置。
放射源（８０１）は、角振動数ω_ｐのポンプビームおよび角振動数ω_ｓのストークスビームの放射を可能とし、
前記ポンプビームとストークスビームとの相互作用から生じた非線形光信号は、角振動数ω_ａｓ＝２ω_ｐ−ω_ｓのＣＡＲＳ散乱信号と呼ばれる信号であって、
第１および第２の光検出モジュールにより検出された非線形光信号の差は、共鳴媒質のラマン共鳴の指標である請求項２に記載の装置。
反射手段は、１以上の励起ビームを反射でき、前記非線形光信号を透過可能な反射鏡（８１３）により形成されている請求項１〜３のいずれか１項に記載の装置。
反射鏡（８１３）が球状である請求項４に記載の装置。
１以上の入射した前記励起ビームの焦点を共通の焦点体（７１）中にて合せることにより、共鳴媒質と非共鳴媒質との間の前記界面を横断することを可能にするための焦点レンズ（８０７）と、
入射した励起ビームとサンプルとの相互作用から生じた非線形光信号を集めるための集光レンズ（８１１）と、をさらに含み、
前記集光レンズ（８１１）は、反射した励起ビームの焦点を合せるための焦点レンズを形成し、
入射した前記励起ビームの焦点を合せるための前記焦点レンズ（８０７）は、反射した励起ビームとサンプルとの相互作用から生じた非線形光信号を集めるための集光レンズを形成する請求項１〜５のいずれか１項に記載の装置。
放射源（８０１）により放射された１以上の励起ビームをサンプルに向けることを可能とし、１以上の反射した励起ビームとサンプルとの相互作用から生じた非線形光信号を通過させることを可能とする２色性ビームスプリッタ（８０４）をさらに含む請求項１〜６のいずれか１項に記載の装置。
前記第１および第２の光検出モジュールのそれぞれは、画像記録装置を含み、
非線形光信号は、光軸に対してそれぞれ対称な方向にて光検出モジュールのそれぞれに集められ、検出された少なくとも１組の非線形光信号のペアに対して差がもたらされる請求項１〜７のいずれか１項に記載の装置。
１以上の励起ビームの角度スキャンをもたらす装置をさらに含むことによって、共鳴媒質と非共鳴媒質との間の界面の異なる位置にて、１以上の励起ビームがサンプルを横断することを可能とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の装置。
放射源が少なくとも１つの可変波長励起ビームを放射することにより、共鳴媒質の振動共鳴または電子共鳴のスペクトルを得ることを可能とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の装置。
サンプル（８０５）中に誘導された共鳴非線形光信号を検出するための方法であって、
サンプル（８０５）は、界面を形成する共鳴媒質（６１）と非共鳴媒質（６２および／または６３）とを含み、
本方法は、
ポンプビームと呼ばれる共鳴媒質の少なくとも１つの第１の励起ビームを、第１の所定の角振動数ω_ｐにて放射するステップと、
１つ以上の前記第１の励起ビームとサンプルとの相互作用から生じた第１の非線形光信号を検出するステップと、
１つ以上の前記励起ビームを反射することにより、反射した１つ以上の前記励起ビームが１つ以上の入射した励起ビームと実質的に同じ位置にて、共鳴媒質と、光軸に垂直な平面に沿って非ゼロ成分を有するサンプルの非共鳴媒質との間に形成された界面である横断界面を横断するステップと、
１つ以上の反射した前記励起ビームとサンプルとの相互作用から生じた第２の非線形光信号を検出するステップと、
共鳴媒質の振動共鳴または電子共鳴の指標である検出された非線型光信号間の差を計算することを含む、検出された第１の非線形光信号および第２の非線形光信号を処理するステップと、を含み、
前記ポンプビームは、光軸に沿ってサンプルへ入射することによって、前記横断界面の所定位置にてサンプルを横断する方法。
第１の角振動数ω_ｐとは異なる少なくとも第２の角振動数ω_ｓにて共鳴媒質を励起するための少なくとも１つの第２の励起ビームを放射するステップを含み、
検出された第１の非線形光信号と第２の非線形光信号との差は、第１の角振動数および第２の角振動数の線形結合に等しい角振動数における共鳴媒質の振動共鳴または電子共鳴の指標であって、
励起ビームはすべて同一線上にあって、共通の焦点体中の前記位置にて前記横断界面を横断する請求項１１に記載の方法。
角振動数ω_ｐのポンプビームおよび角振動数ω_ｓのストークスビームを放射するステップを含み、
前記ポンプビームとストークスビームとの相互作用から生じた非線形光信号は角振動数ω_ａｓ＝２ω_ｐ−ω_ｓのＣＡＲＳ散乱信号と呼ばれる信号であって、
検出された第１の非線形光信号と第２の非線形光信号との差は、共鳴媒質のラマン共鳴の指標である請求項１２に記載の方法。
前記第１および第２の非線形光信号は、入射した励起ビームの光軸に関して対称な方向にそれぞれ検出され、検出された少なくとも１組の非線形光信号のペアに対して差がもたらされる請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
１以上の励起ビームが、角度スキャンを受けることにより、共鳴媒質と非共鳴媒質との間の界面の複数の位置にてサンプルを横断する請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
少なくとも１つの励起ビームが可変の放射波長を有することにより、共鳴媒質の振動共鳴または電子共鳴のスペクトルを得ることが可能となる請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の方法。