JP2013506709A - Effective conjugates and hydrophilic linker - Google Patents

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    • A61K47/6889Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment

Abstract

薬物を細胞結合剤に結合させるためのリンカーを、ポリエチレングリコールスペーサーを組み込むことにより修飾して、親水性リンカーにする。 A linker for coupling the drug to the cell binding agent, and modified by incorporating a polyethylene glycol spacer, to a hydrophilic linker. 細胞結合剤−薬物コンジュゲートの有効性または効能は、細胞表面に少ない数の抗原を発現するものまたは処置に対して耐性である癌細胞を含めた種々の癌細胞タイプにおいて、驚くべきことに数倍向上する。 Cell binding agent - effectiveness or efficacy of the drug conjugate, the number in the variety of cancer cell types, including cancer cells that are resistant to those or treatment expresses the number of antigen less on the cell surface, surprisingly to fold improvement. チオエーテル部位および反応性基を持つメイタンシノイドを調製するための方法であって、本質的に単一の工程においてメイタンシノイドを細胞結合剤に連結させる方法も提供される。 A method for preparing maytansinoids having a thioether sites and reactive groups, a method for essentially linked maytansinoid to a cell binding agent in a single step is also provided.
【選択図】図1 .FIELD 1

Description

本願は、2008年4月30日に提出された米国仮出願第61/049,289号に対する優先権を主張する、2009年4月30日に提出された米国本出願第12/433,668号の一部継続である。 This application claims priority to 2008 April 30, US Provisional Application No. 61 / 049,289, which is submitted to the day, the United States this application Ser. No. 12 / 433,668, filed on April 30, 2009 of which is a continuation-in-part. 先願である出願第12/433,668号および第61/049,289号の全開示内容は、付随する継続出願の開示の部分と見なされ、参照により本明細書に組み込まれる。 The entire disclosure of which is prior application Serial No. 12 / 433,668 and No. 61 / 049,289 is considered to disclose the portion of the continuous application attendant, herein incorporated by reference.

本発明は、薬物(例えば、細胞毒性剤)を、細胞結合剤(例えば、抗体)に、リンカーが薬物の活性を増大させるのに寄与するように連結させる新規のリンカーに関する。 The present invention, drug (e.g., cytotoxic agents), cell binding agents (e.g., antibodies) to relates to novel linkers for linking to a linker contributes in increasing the activity of the drug. 特に、本発明は、新規の親水性リンカーの使用であって、かかるリンカーが、細胞表面に少ない数の抗原を発現するものまたは処置に対して耐性である癌細胞を含めた種々の癌細胞タイプにおいて、細胞結合剤−薬物コンジュゲートの有効性または効能を数倍向上させる、使用に関する。 In particular, the present invention provides the use of novel hydrophilic linkers, such linker, a variety of cancer cell types, including cancer cells that are resistant to those or treatment expresses the number of antigen less on the cell surface in the cell-binding agent - it improves several times the efficacy or potency of the drug conjugates, the use. 本発明はまた、チオエーテル部位および反応性基を持つメイタンシノイドを調製するための方法であって、メイタンシノイドを細胞結合剤に連結させる、方法にも関する。 The present invention also provides a method for preparing maytansinoids having a thioether sites and reactive groups, the maytansinoid is linked to a cell binding agent also relates to a method.

標的特異的治療剤として細胞毒性薬物の抗体コンジュゲートが開発されつつある。 Antibody conjugate of cytotoxic drugs are being developed as target-specific therapeutic agents. 種々の癌細胞表面抗原に対する抗体は、種々の本質的な細胞標的、例えば、微小管(メイタンシノイド、オーリスタチン、タキサン:米国特許第5,208,020号;同第5,416,064号;同第6.333,410号;同第6,441,163号;同第6,340,701号;同第6,372,738号;同第6,436,931号;同第6,596,757号;同第7,276.497号)、DNA(カリケアマイシン、ドキソルビシン、CC−1 065アナログ;米国特許第5,475,092号;同第5,585,499号;同第5,846,545号;同第6,534,660号;同第6,756,397号;同第6,630,579号)を阻害する種々の細胞毒性剤とコンジュゲートされている。 Antibodies against various cancer cell surface antigens, various essential cellular targets, e.g., microtubule (maytansinoid, an auristatin, taxanes: U.S. Patent No. 5,208,020; Nos 5,416,064 ; the No. 6.333,410; Nos 6,441,163; Nos 6,340,701; Nos 6,372,738; the No. 6,436,931; the sixth, No. 596,757; the No. 7,276.497), DNA (calicheamicin, doxorubicin, CC-1 065 analogs; U.S. Pat. No. 5,475,092; the 5,585,499; the first No. 5,846,545; the No. 6,534,660; the No. 6,756,397; are various cytotoxic agents conjugated to inhibit Nos 6,630,579). これらの細胞毒性薬物のいくつかとの抗体コンジュゲートが、癌の治療のための臨床において積極的に調査されている(Richart、A.D.、およびTolcher、A.W.、2007、Nature Clinical Practice、4、245−255)。 Antibody conjugates with some of these cytotoxic drugs are actively investigated in clinical for treatment of cancer (Richart, A.D., And Tolcher, A.W., 2007, Nature Clinical Practice , 4,245-255).

抗体−細胞毒性剤コンジュゲートは、抗体上の反応性部位、例えば、リシンアミノ基、またはシステイン基(天然ジスルフィド結合の還元によって、または分子生物学的方法を用いた、抗体へのさらなる非天然システイン残基のエンジニアリングによって生成される)の初期修飾によって典型的には調製される。 Antibody - cytotoxic agent conjugates, the reactive sites on the antibody, for example, a lysine amino group or by reduction of a cysteine ​​group (natural disulfide bonds, or using molecular biological methods, additional non-native cysteine ​​residue of the antibody It is typically prepared by the initial modification of generated) by engineering groups. したがって、抗体は、ヘテロ二官能性リンカー試薬、例えば、SPDB、SMCCおよびSIABによって例示される、これまでに記載されているもの(米国特許第6,913,758号および米国特許出願公開第20050169933号)によって最初に修飾されて、反応性基、例えば、混合されたピリジルジスルフィド、マレイミドまたはハロアセトアミドを有するリンカーを組み込む。 Therefore, antibodies, heterobifunctional linker reagent, e.g., SPDB, SMCC and are exemplified by SIAB, heretofore those described in (U.S. Patent and U.S. Patent Application Publication No. 20050169933 No. 6,913,758 ) was first modified by incorporating reactive groups, for example, mixed pyridyl disulfides, a linker having a maleimide or haloacetamide. 抗体に組み込まれた反応性リンカー基は、チオール基などの反応性部位を含有する細胞毒性剤によってその後コンジュゲートされる。 Reactive linker groups incorporated in the antibody is subsequently conjugated with a cytotoxic agent containing a reactive site such as a thiol group. 別のコンジュゲーション経路は、チオール反応性基(例えば、ハロアセトアミド、またはマレイミド)を含有する細胞毒性剤誘導体と細胞結合剤上のチオール基との反応によるものである。 Another conjugation route is thiol-reactive groups (e.g., halo acetamide or maleimide) is by reaction with a thiol group on the cytotoxic agent derivative and the cell binding agent containing. チオール基は、天然ジスルフィド残基の還元によって(R.Singhら、Anal.Biochem.、2002、304、147−156)、または組み込まれたジスルフィド部位の還元によって(SPDP、スクシンイミジル3−(2−ピリジルジチオ)プロピオネートを介し、続いて、ジチオトレイトールによって還元、D.G.Gillilandら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.、1980、77、4539−4543)、あるいはさらなる非天然システイン残基(J.B.Stimmelら、J.Biol.Chem.、2000、275、30445−30450)の組み込み、または2−イミノチオラン(R.Jueら、Biochemistry、1978、17、5399−5406)もしくは Thiol groups by reduction of native disulfide residues (R.Singh et, Anal.Biochem., 2002,304,147-156), or by reduction of incorporated disulfide site (SPDP, succinimidyl 3- (2-pyridyl via dithio) propionate, followed by reduction by dithiothreitol, D.G.Gilliland et, Proc.Natl.Acad.Sci.USA., 1980,77,4539-4543), or additional non-native cysteine ​​residues ( J.B.Stimmel et, J.Biol.Chem., 2000,275,30445-30450) incorporation of, or 2-iminothiolane (R.Jue et al, Biochemistry, 1978,17,5399-5406) ​​or チル3−メルカプトプロピオンイミデートエステル(T.P.Kingら、Biochemistry、1978、17、1499−1506)との反応によるチオール基の組み込みによって、細胞結合剤、例えば、抗体に組み込まれる。 Chill mercaptopropionic imidate ester (T.P.King et al, Biochemistry, 1978,17,1499-1506) by incorporation of thiol groups by reaction with, the cell binding agents, for example, it is incorporated into the antibody.

ジスルフィドまたはチオエーテル連結部を有する抗体−細胞毒性剤コンジュゲートは、細胞内で、恐らくはリソソームにおいて開裂して、活性な細胞毒性剤を癌細胞内に送達する(H.K.Ericksonら、2006、Cancer Research、66、4626−4433)。 Antibodies with disulfide or thioether linking portion - cytotoxic agent conjugate in a cell, possibly cleaved in lysosomes, the active cytotoxic agent delivered into the cancer cells (H.K.Erickson et al, 2006, Cancer Research, 66,4626-4433). 還元性ジスルフィド連結部を有する抗体−細胞毒性剤コンジュゲートはまた、標的細胞の死滅に加えて、インビトロにおいておよび異種移植モデルにおいてインビボで抗原陰性細胞と抗原陽性細胞との混合集団中の近接する抗原陰性細胞も死滅させ、これは、不均一な抗原発現を伴う腫瘍内の隣接する非抗原発現細胞に対する有効性を改善させる際の、標的−細胞で放出された細胞毒性剤の役割を示唆している(Y.V.Kovtunら、Cancer Research、2006、66、3214−3221)。 Antibodies with reducing disulfide linkage unit - cytotoxic agent conjugate also, in addition to the killing of target cells, the antigen proximate the mixed population of the in vitro and in xenograft models and antigen-negative cells and antigen-positive cells in vivo negative cells also kill, which, when improving the efficacy against neighboring non-antigen-expressing cells in tumors with heterogeneous antigen expression, the target - suggesting a role of the released cytotoxic agent in a cell are (Y.V.Kovtun et al., Cancer Research, 2006,66,3214-3221).

抗体−細胞毒性薬物コンジュゲートは、インビトロにおいて細胞死滅活性、インビボにおいて抗腫瘍活性を示すが、これらの有効性は、多くの場合において、特に、標的癌細胞における抗原発現が低い場合、または標的細胞が処置に対して耐性である場合に減少する。 Antibody - cytotoxic drug conjugates, the cell killing activity in vitro, exhibit anti-tumor activity in vivo, their effectiveness, in many cases, especially when the antigen expression in target cancer cells is low, or the target cell There is reduced when it is resistant to treatment. これは、臨床的状況においてしばしば起こり、患者において低度から中程度の抗腫瘍活性をもたらす。 This occurs frequently in the clinical situation, resulting in anti-tumor activity of moderate low degrees in patients. 耐性を回避しようとするための可能性のあるアプローチは、親水性または疎油性官能基を持つ新規の薬物を合成することである(G.Szokacsら、Nature Reviews、5;219−235、2006を参照)。 Potential approach with to try to circumvent resistance is to synthesize new drugs with hydrophilic or oleophobic functional groups (G.Szokacs et, Nature Reviews, 5; a 219-235,2006 reference). しかし、このプロセスは、煩雑であり、いくつかのアナログが合成されなければならず、薬物の構造の修飾が、生物学的活性の損失をしばしばもたらす。 However, this process is cumbersome, some analog has to be synthesized, it modified the structure of drugs often results in loss of biological activity. したがって、異なるアプローチが必要とされている。 Therefore, there is a need for a different approach.

非開裂性リンカーを介した細胞結合剤および薬物の細胞毒性コンジュゲートを調製するための、当該分野において記載されている方法は、2つの反応工程を必要とする(米国特許第5,208,020号および米国特許出願公開第2005/0169933号)。 For preparing a cytotoxic conjugate of the cell-binding agent and drug through the non-cleavable linkers, methods described in the art requires two reaction steps (U.S. Patent 5,208,020 and U.S. Patent application Publication No. 2005/0169933). まず、細胞結合剤、例えば、抗体は、細胞結合剤の反応性基、例えば、リシン残基上のアミン基またはシステイン残基上のスルフヒドリル基との反応を経て共有結合による化学結合を形成する二官能性架橋剤によって修飾される。 First, the cell binding agent, e.g., antibody, to form a reactive group of cell binding agents, for example, the chemical binding by covalent bond via reaction with sulfhydryl groups on the amine group or a cysteine ​​residue on lysine residues two It is modified by the crosslinking agent. 細胞結合剤の修飾に続いて、生成物が精製されて、所望の修飾された細胞結合剤を未反応の架橋剤から分離する。 Following modification of the cell binding agent, the product is purified to separate the desired modified cell binding agent from unreacted crosslinking agent. コンジュゲーション工程として知られている第2工程において、反応性薬物誘導体、例えば、チオール含有メイタンシノイドが、修飾された細胞結合剤との反応のために、修飾された細胞結合剤に添加される。 In a second process known as conjugation process, the reactive drug derivative, for example, the thiol-containing maytansinoid is, for reaction with the modified cell-binding agent is added to the modified cell binding agents . この反応に続いて、最終コンジュゲートから、いずれの未反応の薬物種および他の副生成物も除去するためのさらなる精製が必要とされる。 Following this reaction, the final conjugate drug species and other byproducts of any unreacted also require further purification to remove. これらの複数の反応および精製工程は、低収率の最終コンジュゲートをもたらし、これらの工程を大規模で実行することを考えるとき、高価かつ煩雑であり得る。 These multiple reactions and purification steps, resulting in a final conjugate of low yield, when considering performing these steps on a large scale, can be expensive and cumbersome. これらの方法のさらなる欠点は、薬物が付着することなく未反応の架橋剤が細胞結合剤に連結したままであるときに導入される、コンジュゲートの不均一性である。 A further disadvantage of these methods, unreacted crosslinking agent without drug is attached is introduced when it remains linked to a cell binding agent is a non-uniformity of the conjugate. 未反応の架橋剤は、次いで、さらなる副反応、例えば、加水分解および分子内または分子間反応を経る可能性がある。 Unreacted crosslinking agent, then, further side reactions, for example, may undergo hydrolysis and intramolecular or intermolecular reactions. したがって、本質的に1つの反応工程において細胞結合剤、例えば、抗体に非開裂性結合を介して共有結合的に連結され得る、官能化された反応性薬物誘導体、例えば、メイタンシノイドが必要とされている。 Thus, the cell binding agent in essentially one reaction step, for example, can be covalently linked via a non-cleavable bond to the antibody, functionalized reactive drug derivative, for example, requires a maytansinoid It is.

本発明は、薬物を細胞結合剤に、リンカーが薬物の活性を増大させるのに寄与するように連結させる新規のリンカーを設計することによって耐性の問題に対処する。 The present invention, the drug in the cell binding agent, to address the tolerance problem by designing a new linker linking such linker contributes in increasing the activity of the drug. したがって、本発明は、薬物が細胞結合剤に連結される様式を、リンカー設計が、特に抗原発現が低い広範な腫瘍、または薬物耐性腫瘍に対して活性であるコンジュゲートを提供するように、改善する。 Accordingly, the present invention is the manner in which the drug is linked to a cell binding agent, so that the linker design provides conjugates that are active against particularly low extensive tumor antigen expression or drug resistant tumors, improved to.

本発明は、ポリエチレングリコール[PEG ,(−CH CH O) )]スペーサーを組み込むことによって常套のリンカー(米国特許出願公開第20050169933号に記載されている例えば、SMCC、SIABなど)が修飾されて親水性リンカーとされるときの新規の所見に基づいており、細胞結合剤−薬物コンジュゲートの有効性または効能が、細胞表面において少ない数の抗原を発現するものを含めた種々の癌細胞タイプにおいて、驚くべきことに数倍向上する。 The present invention, polyethylene glycol [PEG n, (- CH 2 CH 2 O) n)] are described for example in conventional linker (U.S. Patent Application Publication No. 20050169933 by incorporating a spacer, SMCC, etc. SIAB) is is modified based on the new findings as it is a hydrophilic linker, cell binding agent - effectiveness or efficacy of the drug conjugate, various cancers, including those expressing fewer antigens at the cell surface in cell types, improved several times surprisingly.

また、これらのPEG含有コンジュゲートは、予想外にも、処置に対して耐性である細胞株に対して、これまで記載されているコンジュゲートよりも有効である。 These PEG-containing conjugates unexpectedly, against cell lines that are resistant to treatment, is more effective than conjugates that had been previously described.

さらに、抗体コンジュゲートの場合には、親水性リンカーの組み込みが、抗体1分子あたり最大で15分子の薬物のコンジュゲーションを高収率で凝集も沈澱もなく可能にした。 Furthermore, in the case of antibody conjugates, incorporation of hydrophilic linkers, aggregation conjugation of the drug 15 molecules at maximum per antibody molecule in high yields also allowed without precipitation. 抗体1分子あたり最大で15分子の薬物が連結した、親水性リンカーを有するこれらのコンジュゲートは、(非修飾抗体の場合と同様に)高い親和性によって標的抗原に結合した。 Drug 15 molecules with an antibody Maximum per molecule are linked, these conjugates with hydrophilic linkers bound to the target antigen by (as in the case of the unmodified antibody) high affinity.

本発明はまた、細胞結合剤を有するチオエーテル連結メイタンシノイドコンジュゲートが、細胞結合剤の従来の化学修飾によらず、本質的に1つの反応工程において調製され得るように、細胞結合剤のアミン基またはチオール基に対して反応性である新規のメイタンシノイドも開示する。 The present invention also is a thioether linked maytansinoid conjugates with cell binding agent, regardless of the conventional chemical modification of the cell binding agent, as can be prepared in essentially a single reaction step, the amine of cell binding agents new maytansinoids that are reactive against or thiol group is also disclosed.

本発明は、チオエーテル部位および反応性基を持つ新規のメイタンシノイド誘導体の合成のためのプロセスを開示する。 The present invention discloses a process for the synthesis of novel maytansinoid derivatives having a thioether sites and reactive groups. これらの新規のメイタンシノイドは、細胞結合剤を有するチオエーテル連結コンジュゲートの、本質的に1つの反応工程における調製に有用である。 These novel maytansinoids, thioether linked conjugates with cell binding agents useful in the preparation of essentially one reaction step. これらの新規の反応性メイタンシノイドを使用する細胞結合剤コンジュゲートの調製のためのプロセスも開示される。 Process for the preparation of a cell-binding agent conjugate of using these novel reactive maytansinoid also disclosed.

したがって、本発明は、式(1)の化合物または式(1')の特定の化合物: Accordingly, the invention provides compounds of formula (1) or a specific compound of formula (1 '):
Z−X,−(−CH −CH −O−) −Y −D (1) Z-X, - (- CH 2 -CH 2 -O-) n -Y p -D (1)
D−Y −(−CH −CH −O−) −X −Z (1') D-Y p - (- CH 2 -CH 2 -O-) n -X i -Z (1 ')
式中: In the formula:
Zは、細胞結合剤とアミドまたはチオエーテル結合を形成することができる反応性官能基を表し; Z represents a reactive functional group capable of forming a cell binding agent and an amide or a thioether bond;
Dは、薬物を表し; D represents a drug;
Xは、チオエーテル結合、アミド結合、カルバメート結合、またはエーテル結合を介して細胞結合剤に付着した脂肪族、芳香族または複素環式基を表し; X represents a thioether bond, an amide bond, an aliphatic attached to carbamate linkage or via an ether bond cell binding agent, aromatic or heterocyclic group;
Yは、チオエーテル結合、アミド結合、カルバメート結合、エーテル結合、アミン結合、炭素−炭素結合およびヒドラゾン結合からなる群から選択される共有結合を介して薬物に付着した脂肪族、芳香族または複素環式基を表し; Y is a thioether bond, an amide bond, a carbamate bond, an ether bond, an amine bond, a carbon - aliphatic attached to the drug via a covalent bond selected from the group consisting of carbon bonds and hydrazone bonds, aromatic or heterocyclic It represents a group;
lは、0または1であり; l is 0 or 1;
pは、0または1であり; p is 0 or 1;
nは、1〜2000の整数である; n is an integer of 1 to 2000;
を提供する。 I will provide a.

本発明の別の態様は、式(2)の細胞結合剤薬物コンジュゲートまたは式(2')の特定の化合物: Another aspect of the present invention, certain compounds of cell-binding agent drug conjugate or of the formula (2) (2 '):
CB−[XK−CH −CH −O−) −Y −D] (2) CB- [XK-CH 2 -CH 2 -O-) n -Y p -D] m (2)
[D−Y −(−CH −CH −O−) −X −CB (2') [D-Y p - (- CH 2 -CH 2 -O-) n -X l] m -CB (2 ')
式中、 In the formula,
CBは、細胞結合剤を表し; CB represents a cell binding agent;
Dは、薬物を表し; D represents a drug;
Xは、チオエーテル結合、アミド結合、カルバメート結合、またはエーテル結合を介して細胞結合剤に付着した脂肪族、芳香族または複素環式基を表し; X represents a thioether bond, an amide bond, an aliphatic attached to carbamate linkage or via an ether bond cell binding agent, aromatic or heterocyclic group;
Yは、チオエーテル結合、アミド結合、カルバメート結合、エーテル結合、アミン結合、炭素−炭素結合およびヒドラゾン結合からなる群から選択される共有結合を介して薬物に付着した脂肪族、芳香族、または複素環式基を表し; Y is a thioether bond, an amide bond, a carbamate bond, an ether bond, an amine bond, a carbon - aliphatic attached to the drug via a covalent bond selected from the group consisting of carbon bonds and hydrazone bonds, aromatic or heterocyclic, It represents the Shikimoto;
lは、0または1であり; l is 0 or 1;
pは、0または1であり; p is 0 or 1;
mは、2〜15の整数であり; m is an integer from 2 to 15;
nは、1〜2000の整数である; n is an integer of 1 to 2000;
である。 It is.

本発明の別の態様は、式(3)の化合物または式(3')の特定の化合物: Another aspect of the present invention, the compound of formula (3) or a specific compound of formula (3 '):
Z−X,−(−CH −CH O−) −Y−D (3) Z-X, - (- CH 2 -CH 2 O-) n -Y-D (3)
D−Y−(−CH −CH O−) −Xi−Z (3') D-Y - (- CH 2 -CH 2 O-) n -Xi-Z (3 ')
式中: In the formula:
Zは、細胞結合剤とアミドまたはチオエーテル結合を形成することができる反応性官能基を表し; Z represents a reactive functional group capable of forming a cell binding agent and an amide or a thioether bond;
Dは、薬物を表し; D represents a drug;
Xは、チオエーテル結合、アミド結合、カルバメート結合、またはエーテル結合を介して細胞結合剤に付着した脂肪族、芳香族または複素環式基を表し; X represents a thioether bond, an amide bond, an aliphatic attached to carbamate linkage or via an ether bond cell binding agent, aromatic or heterocyclic group;
Yは、ジスルフィド結合を介して薬物に付着した脂肪族、非芳香族複素環式または芳香族複素環式基を表し; Y represents an aliphatic attached to the drug via a disulfide bond, the non-aromatic heterocyclic or aromatic heterocyclic group;
lは、0または1であり; l is 0 or 1;
nは、1〜14の整数である; n is a 1 to 14 integer;
である。 It is.

本発明の別の態様は、式(4)の細胞結合剤薬物コンジュゲートまたは式(4')の特定の化合物: Another aspect of the present invention, certain compounds of cell-binding agent drug conjugate or of formula (4) (4 '):
CB−(Xi−(−CH −CH O−) −Y−D) (4) CB- (Xi - (- CH 2 -CH 2 O-) n -Y-D) m (4)
[D−Y−(−CH −CH O−) −X,] −CB (4') [D-Y - (- CH 2 -CH 2 O-) n -X,] m -CB (4 ')
式中、 In the formula,
CBは、細胞結合剤を表し; CB represents a cell binding agent;
Dは、薬物を表し; D represents a drug;
Xは、チオエーテル結合、アミド結合、カルバメート結合、またはエーテル結合を介して細胞結合剤に付着した脂肪族、芳香族または複素環式基を表し; X represents a thioether bond, an amide bond, an aliphatic attached to carbamate linkage or via an ether bond cell binding agent, aromatic or heterocyclic group;
Yは、ジスルフィド結合を介して薬物に付着した脂肪族、芳香族または複素環式基を表し; Y is an aliphatic attached to the drug via a disulfide bond, an aromatic or heterocyclic group;
lは、0または1であり; l is 0 or 1;
mは、3〜8の整数であり; m is an integer of 3-8;
nは、1〜14の整数である; n is a 1 to 14 integer;
である。 It is.

本発明のなおさらなる態様は、その方法による処置に対して感受性の癌を処置するための方法であって、有効用量の、式(2)または(4)のコンジュゲートを含む組成物を、処置を必要とする患者に非経口投与することを含む方法である。 A still further aspect of the present invention is a method for treating cancer sensitive to treatment with the method, the effective dose, a composition comprising a conjugate of formula (2) or (4), treatment which method comprises parenterally administering to a patient in need.

本発明のさらに別の態様において、反応性基を持ち、式(5): In yet another aspect of the present invention has a reactive group, the formula (5):
D'−Y'−V−Q−W−Z'(5) D'-Y'-V-Q-W-Z '(5)
式中: In the formula:
D'は、スルフヒドリル保持メイタンシノイド、例えば、N 2' −デアセチル−iV 2' −(3−メルカプト−1−オキソプロピル)−メイタンシン(DM1)またはTV 2' −デアセチル−N 2' −(4−メルカプト−4−メチル−1−オキソペンチル)メイタンシン(DM4)を表し; D 'is sulfhydryl holding maytansinoids, e.g., N 2' - deacetyl -iV 2 '- (3- mercapto-1-oxopropyl) - maytansine (DM1) or TV 2' - deacetyl -N 2 '- (4 - represents a mercapto-4-methyl-1-oxopentyl) maytansine (DM4);
Y'は、チオエーテル結合を表し、 Y 'represents a thioether bond,
Vは、1〜10個の炭素原子を有する、適宜、線状、分枝状または環式のアルキル、アルケニルまたはアルキニル基であり; V has 1 to 10 carbon atoms, as appropriate, be linear, branched or cyclic alkyl, alkenyl or alkynyl group;
Qは、適宜、芳香族または複素環式部位を表し; Q is suitably represents an aromatic or heterocyclic sites;
Wは、1〜10個の炭素原子を有する、適宜、線状、分枝状または環式のアルキル、アルケニルまたはアルキニル基であり; W has 1 to 10 carbon atoms, as appropriate, be linear, branched or cyclic alkyl, alkenyl or alkynyl group;
Z'は、アミンまたはスルフヒドリル反応性基を表す; Z 'represents an amine or sulfhydryl-reactive groups;
によって表される、チオエーテル部位を有する新規のメイタンシノイドが提供される。 Represented by a new maytansinoids having a thioether site is provided.

チオエーテル部位を持つ反応性メイタンシノイド誘導体は、スルフヒドリル保持メイタンシノイド(例えば、DM1およびDM4)およびヘテロ二官能性架橋剤から調製される。 Reactive maytansinoid derivatives having a thioether moiety, a sulfhydryl holding maytansinoid (e.g., DM1 and DM4) are prepared from and heterobifunctional crosslinking agent. 反応は、以下の化学方程式: The reaction is the following chemical equation:
D'+V−V−Q−W−Z'→D'−Y'−V−Q−W−Z' D '+ V-V-Q-W-Z' → D'-Y'-V-Q-W-Z '
式中: In the formula:
D'は、N 2' −デアセチル−TV 2' −(3−メルカプト−1−オキソプロピル)−メイタンシン(DM1)または2−デアセチル−N2−(4−メルカプト−4−メチル−1−オキソペンチル)メイタンシン(DM4)などのスルフヒドリル保持メイタンシノイドを表し; D 'is, N 2' - deacetyl -TV 2 '- (3- mercapto-1-oxopropyl) - maytansine (DM1) or 2- deacetyl-N2- (4-mercapto-4-methyl-1-oxopentyl) It represents sulfhydryl holding maytansinoids such as maytansine (DM4);
Vは、1〜10個の炭素原子を有する、適宜、線状、分枝状または環式のアルキル、アルケニルまたはアルキニル基であり; V has 1 to 10 carbon atoms, as appropriate, be linear, branched or cyclic alkyl, alkenyl or alkynyl group;
Qは、適宜、芳香族または複素環式部位を表し; Q is suitably represents an aromatic or heterocyclic sites;
Wは、1〜10個の炭素原子を有する、適宜、線状、分枝状または環式のアルキル、アルケニルまたはアルキニル基であり; W has 1 to 10 carbon atoms, as appropriate, be linear, branched or cyclic alkyl, alkenyl or alkynyl group;
Z'は、アミンまたはスルフヒドリル反応性基であり; Z 'is an amine or sulfhydryl-reactive groups;
Y”は、スルフヒドリル反応性部位を表し; Y "represents a sulfhydryl reactive sites;
Y'は、スルフヒドリル保持メイタンシノイドと架橋剤との間のチオエーテル結合を表す; Y 'represents a thioether bond between the sulfhydryl holding maytansinoid and a crosslinking agent;
によって表される。 Represented by.

本発明はまた、非開裂結合を介して連結された、メイタンシノイドおよび細胞結合剤の細胞毒性コンジュゲート(式10)の調製のためのプロセスであって、細胞結合剤を式Z'−W−Q−V−Y'−D'の化合物と反応させて、式CB−(Z”−W−Q−V−Y'−D') The present invention also linked via a non-cleavable bond, maytansinoid and a process for the preparation of cytotoxic conjugates of cell binding agents (Equation 10), the cell binding agent formula Z'-W 'it is reacted with a compound of formula CB- (Z "-W-Q- V-Y'-D' -Q-V-Y'-D) m
式中、 In the formula,
Z'は、アミンまたはスルフヒドリル反応性基を表し; Z 'represents an amine or sulfhydryl-reactive groups;
Wは、1〜10個の炭素原子を有する、適宜、線状、分枝状または環式のアルキル、アルケニルまたはアルキニル基であり; W has 1 to 10 carbon atoms, as appropriate, be linear, branched or cyclic alkyl, alkenyl or alkynyl group;
Qは、適宜、芳香族または複素環式部位を表し; Q is suitably represents an aromatic or heterocyclic sites;
Vは、1〜10個の炭素原子を有する、適宜、線状、分枝状または環式のアルキル、アルケニルまたはアルキニル基であり; V has 1 to 10 carbon atoms, as appropriate, be linear, branched or cyclic alkyl, alkenyl or alkynyl group;
Y'は、チオエーテル結合を表し; Y 'represents a thioether bond;
D'は、スルフヒドリル保持メイタンシノイド、例えば、N 2' −デアセチル−iV 2' −(3−メルカプト−1−オキソプロピル)−メイタンシン(DM1)またはN 2' −デアセチル−N 2' −(4−メルカプト−4−メチル−l−オキソペンチル)メイタンシン(DM4)を表し; D 'is sulfhydryl holding maytansinoids, e.g., N 2' - deacetyl -iV 2 '- (3- mercapto-1-oxopropyl) - maytansine (DM1) or N 2' - deacetyl -N 2 '- (4 - represents a mercapto-4-methyl -l- oxopentyl) maytansine (DM4);
CBは、細胞結合剤を表し; CB represents a cell binding agent;
Z”は、アミド結合を表し; Z "represents an amide bond;
mは、2〜8の整数である; m is an integer of 2-8;
の細胞結合剤コンジュゲートを提供することを含むプロセスを開示する。 It discloses a process which comprises providing a cell binding agent conjugate.

細胞結合剤メイタンシノイドコンジュゲートは、さらに精製されてよい。 Cell-binding agent maytansinoid conjugate may be further purified.

本発明の代表的なPEG含有チオスクシンイミジル連結コンジュゲートの構造的表示を示す(mAb=モノクローナル抗体)。 It shows a typical structural representation of PEG-containing thio-succinimidyl linked conjugates of the present invention (mAb = monoclonal antibody). 本発明の代表的なPEG含有チオアセトアミジル連結コンジュゲートの構造的表示を示す。 It shows the structural representation of representative PEG-containing thio acetamidine Gilles coupled conjugate of the present invention. 本発明の代表的なPEG含有ジスルフィド連結化合物の構造的表示を示す。 It shows the structural representation of representative PEG-containing disulfide linked compounds of the present invention. 本発明のPEG含有チオスクシンイミジル連結コンジュゲートのための合成スキームを示す。 It shows a synthetic scheme for the PEG-containing thio-succinimidyl linked conjugates of the present invention. 本発明のPEG含有チオアセトアミジル連結コンジュゲートのための合成スキームを示す。 It shows a synthetic scheme for the PEG-containing thio acetamidine Gilles coupled conjugate of the present invention. 本発明のPEG含有ジスルフィド連結化合物のための合成スキームを示す:a. The synthetic scheme for the PEG-containing disulfide linked compounds of the present invention are shown: a. )細胞結合剤への1工程コンジュゲーションのためのPEG含有ジスルフィド連結化合物の合成;およびb. ) Synthesis of the PEG-containing disulfide linked compound for 1 step conjugation to cell binding agents; and b. )ヘテロ二官能性PEG含有ジスルフィド連結架橋化合物の合成。 ) Synthesis of heterobifunctional PEG-containing disulfide linked crosslinking compound. 本発明のPEG含有チオスクシンイミジル連結コンジュゲートのためのコンジュゲーション手順を示す(1工程コンジュゲーション)。 It shows a conjugation procedure for PEG-containing thio-succinimidyl linked conjugates of the present invention (one-step conjugation). 本発明のPEG含有チオスクシンイミジル連結コンジュゲートのためのコンジュゲーション手順を示す(2工程コンジュゲーション)。 It shows a conjugation procedure for PEG-containing thio-succinimidyl linked conjugates of the present invention (2-step conjugation). 本発明のPEG含有チオエーテル連結(チオアセトアミジル連結)コンジュゲートのためのコンジュゲーション手順を示す(1工程コンジュゲーション)。 PEG-containing thioether linkage of the present invention shows a conjugation procedure for (thio acetamidine Jill linked) conjugate (1 step conjugation). 本発明のPEG含有チオエーテル連結(チオアセトアミジル連結)コンジュゲートのためのコンジュゲーション手順を示す(2工程コンジュゲーション) PEG-containing thioether linkage of the present invention (thio acetamidine Jill coupling) shows a conjugation procedure for conjugation (2 step conjugation) 本発明のPEG含有ジスルフィド連結コンジュゲートのためのコンジュゲーション手順を示す(1工程コンジュゲーション)。 It shows a conjugation procedure for PEG-containing disulfide linked conjugate of the present invention (one-step conjugation). 本発明のPEG含有ジスルフィド連結コンジュゲートのためのコンジュゲーション手順を示す(2工程コンジュゲーション)。 It shows a conjugation procedure for PEG-containing disulfide linked conjugate of the present invention (2-step conjugation). 本発明のPEG含有スルフヒドリル反応性チオスクシンイミジル連結化合物の合成スキームを示す。 The synthesis scheme of the PEG-containing sulfhydryl reactive thio succinimidyl linking compound of the present invention. 本発明のPEG含有チオスクシンイミジル連結コンジュゲートのためのコンジュゲーション手順を示す(1工程コンジュゲーション)。 It shows a conjugation procedure for PEG-containing thio-succinimidyl linked conjugates of the present invention (one-step conjugation). 本発明のPEG含有チオスクシンイミジル連結コンジュゲートのためのコンジュゲーション手順を示す(2工程コンジュゲーション)。 It shows a conjugation procedure for PEG-containing thio-succinimidyl linked conjugates of the present invention (2-step conjugation). 本発明のPEG含有スルフヒドリル反応性チオアセトアミジル連結化合物のための合成スキームを示す;a. It shows a synthetic scheme for the PEG-containing sulfhydryl reactive thio acetamidine Gilles linking compound of the present invention; a. )1工程コンジュゲーションでのPEG含有スルフヒドリル反応性チオアセトアミド連結化合物の合成;およびb. ) 1-step synthesis of PEG-containing sulfhydryl reactive thioacetamide linked compound for conjugation; and b. )2工程コンジュゲーションでのヘテロ二官能性PEG含有スルフヒドリル反応性架橋化合物の合成。 ) Synthesis of heterobifunctional PEG-containing sulfhydryl reactive crosslinking compound for 2-step conjugation. 本発明のPEG含有チオアセトアミジル連結コンジュゲートのためのコンジュゲーション手順を示す(1工程コンジュゲーション)。 It shows a conjugation procedure for PEG-containing thio acetamidine Gilles coupled conjugate of the present invention (one-step conjugation). 本発明のPEG含有チオアセトアミジル連結コンジュゲートのためのコンジュゲーション手順を示す(2工程コンジュゲーション)。 It shows a conjugation procedure for PEG-containing thio acetamidine Gilles coupled conjugate of the present invention (2-step conjugation). 本発明のPEG含有スルフヒドリル反応性チオエーテル連結化合物のための合成スキームを示す:a. The synthetic scheme for the PEG-containing sulfhydryl reactive thioether linked compounds of the present invention showing: a. )1工程コンジュゲーションでのPEG含有スルフヒドリル反応性チオアセトアミジル連結化合物の合成;およびb. ) 1-step synthesis of PEG-containing sulfhydryl reactive thio acetamidine Gilles linking compound in conjugation; and b. )2工程コンジュゲーションでのホモ二官能性PEG含有スルフヒドリル反応性架橋化合物の合成。 ) Synthesis of the homobifunctional PEG-containing sulfhydryl reactive crosslinking compound for 2-step conjugation. 本発明のPEG含有チオアセトアミジル連結コンジュゲートのためのコンジュゲーション手順を示す(1工程コンジュゲーション)。 It shows a conjugation procedure for PEG-containing thio acetamidine Gilles coupled conjugate of the present invention (one-step conjugation). 本発明のPEG含有チオアセトアミジル連結コンジュゲートのためのコンジュゲーション手順を示す(2工程コンジュゲーション)。 It shows a conjugation procedure for PEG-containing thio acetamidine Gilles coupled conjugate of the present invention (2-step conjugation). 脱グリコシル化HuAb−PEG MaI−DM1コンジュゲート(10.7DM1/Ab、平均)の質量スペクトル(MS)を示す。 Deglycosylated HuAb-PEG 4 MaI-DM1 conjugate (10.7DM1 / Ab, average) shows the mass spectrum of (MS). HuAb−PEG MaI−DM1コンジュゲート(10.7DM1/Ab、平均)のサイズ排除クロマトグラフィ(SEC)を示す。 HuAb-PEG 4 MaI-DM1 conjugate (10.7DM1 / Ab, average) indicating the size exclusion chromatography (SEC). HuAb−PEG4MaI−DM1コンジュゲート(10.7メイタンシノイド/抗体)のFACS結合が非修飾抗体の該結合に類似することを示す。 Indicating that FACS binding HuAb-PEG4MaI-DM1 conjugate (10.7 maytansinoid / antibody) is similar to said binding of unmodified antibody. 多剤耐性COLO205−MDR細胞に対する抗EpCAM抗体−メイタンシノイドコンジュゲートの細胞毒性を示す。 Anti-EpCAM antibodies against multidrug resistant COLO205-MDR cells - maytansinol shows the cytotoxicity of maytansinoid conjugates. 多剤耐性COLO205−MDR細胞に対する抗CanAg抗体−メイタンシノイドコンジュゲートの細胞毒性を示す。 Anti CanAg antibody against multidrug resistant COLO205-MDR cells - maytansinol shows the cytotoxicity of maytansinoid conjugates. Molp−8多発性骨髄腫細胞に対する抗CD56抗体−メイタンシノイドコンジュゲートの細胞毒性を示す。 Anti-CD56 antibodies to Molp-8 multiple myeloma cells - maytansinol shows the cytotoxicity of maytansinoid conjugates. HCT15細胞に対するEpCAM抗体−メイタンシノイドコンジュゲートの細胞毒性を示す。 It shows maytansinoid conjugates of cytotoxic - EpCAM antibody against HCT15 cells. COLO205mdr細胞に対する抗EpCAM抗体−メイタンシノイドコンジュゲートの細胞毒性を示す。 Anti-EpCAM antibody to COLO205mdr cells - maytansinol shows the cytotoxicity of maytansinoid conjugates. HCT15異種移植に対する抗EpCAM抗体−メイタンシノイドコンジュゲートのインビボ腫瘍活性を示す。 Anti-EpCAM antibodies against HCT15 xenograft - maytansinol shows in vivo antitumor activity of maytansinoid conjugate. COLO205mdr異種移植に対する抗EpCAM抗体−メイタンシノイドコンジュゲートのインビボ腫瘍活性を示す。 Anti-EpCAM antibodies against COLO205mdr xenotransplantation - maytansinol shows in vivo antitumor activity of maytansinoid conjugate. COLO205異種移植に対する抗EpCAM抗体−メイタンシノイドコンジュゲートのインビボ腫瘍活性を示す。 Anti-EpCAM antibodies against COLO205 xenografts - maytansinol shows in vivo antitumor activity of maytansinoid conjugate. COLO205mdr異種移植に対する抗CanAg抗体−メイタンシノイドコンジュゲートのインビボ腫瘍活性を示す。 Anti CanAg antibody to COLO205mdr xenotransplantation - maytansinol shows in vivo antitumor activity of maytansinoid conjugate. 最大17D/Aを有する抗CanAg抗体(huC242)−PEG24−Mal−DM1コンジュゲートの結合を示す。 Maximum 17D / A anti-CanAg antibody having (huC242) -PEG24-Mal-DM1 shows the binding of the conjugate. COLO205細胞に対する、4〜17D/Aを有する抗CanAg抗体(huC242)−PEG24−MaI−DM1コンジュゲートのインビトロ有効性を示す。 Against COLO205 cells, indicating the in vitro efficacy of the anti-CanAg antibody (huC242) -PEG24-MaI-DM1 conjugates with 4~17D / A. 多剤耐性(pgp+)COLO205−MDR細胞に対する、4〜17D/Aを有する抗CanAg抗体(huC242)−PEG24−MaI−DM1コンジュゲートのインビトロ有効性を示す。 Multidrug resistance (pgp +) for COLO205-MDR cells, indicating the in vitro efficacy of the anti-CanAg antibody (huC242) -PEG24-MaI-DM1 conjugates with 4~17D / A. UO−31細胞に対する抗EGFR抗体−メイタンシノイドコンジュゲートの細胞毒性を示す。 Anti-EGFR antibody against UO-31 cells - maytansinol shows the cytotoxicity of maytansinoid conjugates. 抗体−PEG4−MaI−DM1の血漿薬物動態を示す。 It shows the plasma pharmacokinetics of antibody -PEG4-MaI-DM1. 本発明のチオスクシンイミジル連結コンジュゲートの構造的表示を示す(mAb=抗体、m=2〜8)。 It shows the structural representation of the thio succinimidyl linked conjugates of the present invention (mAb = antibody, m = 2~8). 本発明のチオアセトアミジル連結コンジュゲートの構造的表示を示す(mAb=抗体、m=2〜8)。 It shows the structural representation of the thio acetamidine Gilles coupled conjugate of the present invention (mAb = antibody, m = 2~8). 本発明の化合物によって調製されるチオスクシンイミジル連結コンジュゲートのためのコンジュゲーション手順を示す(mAb=抗体、m=2〜8)。 It shows a conjugation procedure for thio succinimidyl linked conjugates prepared by the compounds of the present invention (mAb = antibody, m = 2~8). 本発明の化合物によって調製されるチオアセトアミジル連結コンジュゲートのためのコンジュゲーション手順を示す(mAb=抗体、m=2〜8)。 It shows a conjugation procedure for thio acetamidine Gilles coupled conjugates prepared by the compounds of the present invention (mAb = antibody, m = 2~8). 本発明のアミン−反応性チオスクシンイミジル連結化合物のための合成スキームを示す。 Amines of the present invention - illustrates a synthetic scheme for the reactive thio succinimidyl linking compound. マレイミドとNHSエステルとの間に直鎖炭化水素を含有するアミン反応性チオスクシンイミジル連結化合物の調製のための合成スキームを示す。 A synthesis scheme for the preparation of amine-reactive thio succinimidyl linking compound containing straight chain hydrocarbons between the maleimide and NHS ester. 本発明の化合物によって調製される脱グリコシル化mAb−SMCC−DM1コンジュゲート(3.42DM1/mAb、平均)の質量スペクトル(MS)を示す。 Deglycosylated mAb-SMCC-DM1 conjugate (3.42DM1 / mAb, average) prepared by the compounds of the present invention the mass spectra of the (MS) shown. マレイミドとNHSエステルとの間にシクロルキル基を含有するアミン−反応性チオスクシンイミジル連結化合物の2工程調製のための合成スキームを示す。 Amine containing Shikurorukiru group between the maleimide NHS ester - shows a synthetic scheme for the two-step preparation of reactive thio succinimidyl linking compound. マレイミドとNHSエステルとの間にサイロアキル基を含有するアミン−反応性非開裂性チオスクシンイミジル連結化合物の2工程調製のための合成スキームを示す。 Amine containing Sairoakiru group between the maleimide NHS ester - shows a synthetic scheme for the two-step preparation of the reactive non-cleavable thio-succinimidyl linking compound. 本発明のチオアセトアミジル連結化合物の調製のための合成スキームを示す。 It shows a synthetic scheme for the preparation of thio acetamidine Gilles linking compound of the present invention. 本発明のチオアセトアミジル連結化合物の2工程調製での合成スキームを示す。 The synthesis scheme of two steps the preparation of the thio acetamidine Gilles linking compound of the present invention. 本発明のチオスクシンイミジル連結コンジュゲート(mAb=抗体、m=2〜8)のための構造を示す。 It shows a structure for thio succinimidyl linked conjugates of the present invention (mAb = antibody, m = 2~8). 本発明の化合物によって調製されるチオスクシンイミジル連結コンジュゲート(mAb=抗体、m=2〜8)のためのコンジュゲーション手順を示す。 It shows a conjugation procedure for thio succinimidyl linked conjugates prepared by the compounds of the present invention (mAb = antibody, m = 2~8). 本発明のスルフヒドリル反応性チオスクシンイミジル連結化合物の調製のための合成スキームである。 It is a synthetic scheme for the preparation of sulfhydryl-reactive thio succinimidyl linking compound of the present invention. 3.8またはD/Aを有する抗CanAg(huC242)−Mal−(CH −Mal−DM1コンジュゲートが抗原陽性COL205細胞に結合することを示す。 Indicating that the anti-CanAg (huC242) -Mal- (CH 2 ) 6 -Mal-DM1 conjugate binds to the antigen positive COL205 cells with 3.8 or D / A. 3.8D/Aを有する抗CanAg抗体(huC242)−Mal−(CH −Mal−DM1コンジュゲートが、抗原陽性COLO205細胞に対して有効であるが、抗原陰性Namalwa細胞に対してはあまり有効でないことを示す。 Anti CanAg antibody (huC242) -Mal- (CH 2) 6 -Mal-DM1 conjugates with 3.8D / A is, is effective against antigen-positive COLO205 cells, much to the antigen-negative Namalwa cells It shows that it is not valid.

本発明は、ポリエチレングリコールまたはポリエチレンオキサイドリンカー((−CH CH O) )によって薬物、例えば細胞毒性剤に連結した細胞結合剤、例えば抗体のコンジュゲートが、典型的な脂肪族リンカーおよび同様の薬物負荷を有する常套の細胞結合剤薬物コンジュゲートとの比較に基づいて予測したよりも数倍高い細胞毒性を標的癌細胞に対して示すという新規の所見を開示する。 The present invention, polyethylene glycol or polyethylene oxide linkers ((-CH 2 CH 2 O) n) by the drug, e.g., cell binding agent linked to a cytotoxic agent such conjugates of antibodies, typical aliphatic linkers and similar several times higher cytotoxicity than predicted discloses a novel finding that indicates to the target cancer cells based in the comparison with the conventional cell-binding agent drug conjugates with a drug loading. 重要なことに、本発明において記載されているコンジュゲートは、多剤耐性(mdr)であり、細胞毒性薬物による処置に対して低い感度を有する癌細胞に対してかなり有効または効果的である。 Importantly, the conjugates described in the present invention is a multi-drug resistant (mdr), which is quite effective, or effective against cancer cells with low sensitivity to treatment with cytotoxic drugs. 癌の治療は、異なる化学治療剤による複数のラウンドの処置の後にしばしば遭遇する薬物耐性メカニズムを克服するという困難を有する。 Treatment of cancer has the difficulty of overcoming drug resistance mechanisms frequently encountered after treatment of a plurality of rounds with different chemotherapeutic agents. 癌細胞において観察されるかかる1つのメカニズムは、多剤耐性と呼ばれ、ATP結合カセット(ABC)輸送体による薬物の輸送の向上によって引き起こされる(C.Drumond、B.I.Sikic、J Clin.Oncology、1999, 17、1061−1070、G、Szokacsら、Nature Reviews、5;219−234、2006)。 One such mechanism observed in cancer cells, called multidrug resistance, is caused by increase of the transport of the drug by ATP-binding cassette (ABC) transporters (C.Drumond, B.I.Sikic, J Clin. Oncology, 1999, 17,1061-1070, G, Szokacs et, Nature Reviews, 5; 219-234,2006). これらの薬物耐性メカニズムを克服する治療、例えば、癌細胞によるかかる薬物流出を妨げるまたは克服することがかなり有用である。 Treatment to overcome these drug resistance mechanisms, for example, is quite useful to impede or overcome such drug efflux by cancer cells. 細胞結合剤および細胞毒性薬物のPEG連結コンジュゲートの細胞毒性が、多剤耐性癌細胞に対して評価されて、PEGリンカーが、これらの耐性細胞に対して何らかの利点を付与するかを試験した。 Cytotoxicity of PEG-linked conjugates of cell-binding agents and cytotoxic drugs, are evaluated against multidrug resistant cancer cells, PEG linker was tested whether to grant some benefit to these resistant cells. mdr細胞に対するかかるアッセイにおいて、細胞結合剤および細胞毒性薬物のPEG連結コンジュゲートは、従来のリンカーから誘導されるはるかに有効でないコンジュゲートと比較して予想外に有効なmdr細胞死滅を示した。 In such assays against mdr cells, PEG linked conjugates of cell-binding agents and cytotoxic drugs showed effective mdr cell killing unexpectedly compared to the much more ineffective conjugates derived from conventional linkers. 加えて、本発明のコンジュゲートはまた、多剤耐性腫瘍細胞によって確立された動物モデルにおいて顕著に、より高い抗腫瘍活性を示す。 In addition, conjugates of the invention are also conspicuously in an animal model established by the multidrug resistant tumor cells, indicating a higher antitumor activity.

親水性ポリエチレングリコールまたはポリエチレンオキシドリンカー(PEGまたはPEO;(−CH CH O) )の使用はまた、治療用途に望まれる1mg/mlを超える濃度において90%を超える高いタンパク質モノマーレベルで、細胞結合剤分子あたり比較的多数の薬物の組み込みも可能にする。 Hydrophilic polyethylene glycol or polyethylene oxide linkers (PEG or PEO; (- CH 2 CH 2 O) n) use of also at high protein monomer level of greater than 90% at a concentration of greater than 1mg / ml desired for therapeutic applications, relatively large number of built-in drug per cell binding agent molecules also possible. さらに、広範な細胞毒性薬物負荷(細胞結合剤あたり2の小さな値から例えば15の多数までの薬物が連結)を有する細胞結合剤のポリエチレングリコール(PEG)連結コンジュゲートは、標的癌細胞に対して、コンジュゲートの薬物負荷の増大に基づく薬物送達の化学量論的増大から予想されたものより著しく向上した細胞毒性を示した。 Furthermore, polyethylene glycol (PEG) linked conjugate of a wide range of cytotoxic drug loading cell binding agent (drug to a number of example 15 from a small value of the cell binding agent per 2 connecting) having, relative to target cancer cells , exhibited significantly improved cytotoxicity than expected from the stoichiometric increase in drug delivery based on increased drug load of the conjugates. PEGスペーサーを有する、細胞結合剤および薬物のコンジュゲートが、本発明において記載されており、これらは、標的癌細胞に対し、同様の薬物負荷を有する常套的に調製されたコンジュゲートと比較して260〜650倍もの有効性の向上という超化学量論的増大を細胞毒性において示した(例えば、図29を参照)。 Having a PEG spacer, conjugates of cell-binding agents and drugs are described in the present invention, these, to target cancer cells, as compared with routinely prepared conjugates with similar drug loads 260-650 times of the superstoichiometric increase of improved efficacy shown in cytotoxicity (e.g., see Figure 29).

したがって、本発明の一態様において、ポリエチレングリコールスペーサー(−CH CH O) および細胞結合剤と反応することが可能である反応性基を有するリンカーを有する薬物が記載される。 Accordingly, in one aspect of the present invention, drugs with linkers having a polyethylene glycol spacer (-CH 2 CH 2 O) n and a reactive group capable of reacting with the cell-binding agent is described.

この態様において特に考慮されるのは、式(1)の修飾化合物または式(1')の特定の化合物: Of particular consideration in this embodiment, the modified compound of the formula (1) or a specific compound of formula (1 '):
Z−X,−(−CH −CH −O−) −Y −D (i) Z-X, - (- CH 2 -CH 2 -O-) n -Y p -D (i)
D−Y −(−CH −CH −O−) −X −Z (1') D-Y p - (- CH 2 -CH 2 -O-) n -X i -Z (1 ')
式中: In the formula:
Zは、細胞結合剤とアミドまたはチオエーテル結合を形成することができる反応性官能基を表し; Z represents a reactive functional group capable of forming a cell binding agent and an amide or a thioether bond;
Dは、薬物を表し; D represents a drug;
Xは、チオエーテル結合、アミド結合、カルバメート結合、またはエーテル結合を介して細胞結合剤に付着した脂肪族、芳香族または複素環式基を表し; X represents a thioether bond, an amide bond, an aliphatic attached to carbamate linkage or via an ether bond cell binding agent, aromatic or heterocyclic group;
Yは、チオエーテル結合、アミド結合、カルバメート結合、エーテル結合、アミン結合、炭素−炭素結合およびヒドラゾン結合からなる群から選択される共有結合を介して薬物に付着した脂肪族、芳香族または複素環式基を表し; Y is a thioether bond, an amide bond, a carbamate bond, an ether bond, an amine bond, a carbon - aliphatic attached to the drug via a covalent bond selected from the group consisting of carbon bonds and hydrazone bonds, aromatic or heterocyclic It represents a group;
lは、0または1であり; l is 0 or 1;
pは、0または1であり; p is 0 or 1;
nは、1〜2000の整数である; n is an integer of 1 to 2000;
である。 It is.

好ましくは、Yを薬物に付着させる共有結合は、チオエーテル結合またはアミド結合である。 Preferably, covalent bond to attach the Y to the drug is a thioether bond or an amide bond.

好ましくは、nは、1〜100の整数である。 Preferably, n is an integer of 1 to 100. なおより好ましくは、nは、1〜14の整数である。 Still more preferably, n is an integer of 1 to 14. 最も好ましい態様において、nは、1〜4の整数である。 In a most preferred embodiment, n is an integer of 1 to 4.

本発明の第2態様において、ポリエチレングリコールリンカー(−CH CH O) を有する、細胞結合剤および薬物の新規のコンジュゲートが記載される。 In a second aspect of the present invention, having a polyethylene glycol linker (-CH 2 CH 2 O) n , novel conjugates of cell-binding agents and drugs are described. これらのコンジュゲートは、常套のリンカーおよび等価の薬物負荷を有するコンジュゲートよりも癌細胞に対して有効である。 These conjugates are effective against cancer cells than conjugates with drug loading of conventional linkers and equivalent.

好ましい態様において特に考慮されるのは、式(2)の、細胞結合剤および薬物のコンジュゲート、または式(2')の特定の化合物: Of particular considered in a preferred embodiment, the formula (2), the cell binding agent and a drug conjugate or a specific compound of formula (2 '):
CB−[X,−(−CH −CH −O−) −Y −D] (2) CB- [X, - (- CH 2 -CH 2 -O-) n -Y p -D] m (2)
[D−Y −(−CH −CH −O−) −X [D-Y p - (- CH 2 -CH 2 -O-) n -X! −CB (T) ] M -CB (T)
式中、 In the formula,
CBは、細胞結合剤を表し; CB represents a cell binding agent;
Dは、薬物を表し; D represents a drug;
Xは、チオエーテル結合、アミド結合、カルバメート結合、またはエーテル結合を介して細胞結合剤に付着した脂肪族、芳香族または複素環式基を表し; X represents a thioether bond, an amide bond, an aliphatic attached to carbamate linkage or via an ether bond cell binding agent, aromatic or heterocyclic group;
Yは、チオエーテル結合、アミド結合、カルバメート結合、エーテル結合、アミン結合、炭素−炭素結合およびヒドラゾン結合からなる群から選択される共有結合を介して薬物に付着した脂肪族、芳香族、または複素環式基を表し; Y is a thioether bond, an amide bond, a carbamate bond, an ether bond, an amine bond, a carbon - aliphatic attached to the drug via a covalent bond selected from the group consisting of carbon bonds and hydrazone bonds, aromatic or heterocyclic, It represents the Shikimoto;
lは、0または1であり; l is 0 or 1;
pは、0または1であり; p is 0 or 1;
mは、2〜15の整数であり; m is an integer from 2 to 15;
nは、1〜2000の整数である; n is an integer of 1 to 2000;
である。 It is.

好ましくは、共有結合は、チオエーテル結合またはアミド結合である。 Preferably, covalent bond is a thioether bond or an amide bond.

好ましくは、mは、3〜8の整数である。 Preferably, m is an integer of 3-8.

好ましくは、nは、1〜100の整数である。 Preferably, n is an integer of 1 to 100. なおより好ましくは、nは、1〜14の整数である。 Still more preferably, n is an integer of 1 to 14. 最も好ましい態様において、nは、1〜4の整数である。 In a most preferred embodiment, n is an integer of 1 to 4.

本発明は、抗体が細胞毒性薬物にジスルフィド結合を介して連結している抗体コンジュゲートの場合、イムノコンジュゲートの有効性または効能を向上させる際、連結される薬物の数とポリエチレングリコールスペーサーの長さとの間に重要な相関が存在するという新規の所見にも基づく。 The present invention, when the antibody is an antibody conjugate linked via a disulfide bond to a cytotoxic drug, in improving the efficacy or potency of the immunoconjugates, the number and the polyethylene glycol spacer length of the drug to be coupled also based on a novel finding that significant correlation exists between Sato. このリンカー設計のさらなる利益は、抗体−薬物コンジュゲートの望ましい高いモノマー比および最小限の凝集である。 A further benefit of this linker design is the antibody - desired high monomer ratio of drug conjugates and minimal aggregation. したがって、一態様において、本発明は、ジスルフィド連結コンジュゲートのためのポリエチレングリコールスペーサーが2〜8のエチレンオキシ基からなり、連結された薬物の数が3〜8の範囲であるとき、それは、抗体−薬物コンジュゲートに最高の生物学的有効性または効能を与え、また、望ましい高いモノマー含量を与えるという重要な所見に基づく。 Therefore, when in one aspect, the present invention is polyethylene glycol spacer for a disulfide-linked conjugate consists of ethyleneoxy group having 2 to 8, the number of concatenated drug is in the range of 3-8, it is an antibody - gave the highest biological effectiveness or efficacy in drug conjugates, also based on an important observation that providing a high monomer content desired.

好ましい態様において、短いポリエチレングリコールスペーサー((CH CH O) n=I〜I4 )を有するジスルフィド基(−S−S−)を介して、細胞結合剤と反応することが可能な官能基と連結された細胞毒性薬物が記載される。 In a preferred embodiment, via a short polyethylene glycol spacers ((CH 2 CH 2 O) n = I~I4) disulfide group having (-S-S-), a functional group capable of reacting with a cell binding agent linked cytotoxic drugs is described.

この態様において特に考慮されるのは、式(3)の修飾細胞毒性化合物または式(3')の特定の化合物: Of particular consideration in this embodiment, the modified cytotoxic compound of formula (3) or a specific compound of formula (3 '):
Z−XH−CH −CH O−) −Y−D (3) Z-XH-CH 2 -CH 2 O-) n -Y-D (3)
D−Y−(−CH −CH O−) −X,−Z (3') D-Y - (- CH 2 -CH 2 O-) n -X, -Z (3 ')
式中: In the formula:
Zは、細胞結合剤とアミドまたはチオエーテル結合を形成することができる反応性官能基を表し; Z represents a reactive functional group capable of forming a cell binding agent and an amide or a thioether bond;
Dは、薬物を表し; D represents a drug;
Xは、チオエーテル結合、アミド結合、カルバメート結合、またはエーテル結合を介して細胞結合剤に付着した脂肪族、芳香族または複素環式基を表し; X represents a thioether bond, an amide bond, an aliphatic attached to carbamate linkage or via an ether bond cell binding agent, aromatic or heterocyclic group;
Yは、ジスルフィド結合を介して薬物に付着した脂肪族、非芳香族複素環式または芳香族複素環式基を表し; Y represents an aliphatic attached to the drug via a disulfide bond, the non-aromatic heterocyclic or aromatic heterocyclic group;
lは、0または1であり; l is 0 or 1;
nは、1〜14の整数である; n is a 1 to 14 integer;
である。 It is.

好ましくは、nは、2〜8の整数である。 Preferably, n is an integer of 2-8.

別の好ましい態様において、ポリエチレングリコールスペーサー((CH CH O) n=I〜I4 )を有するジスルフィド基(−S−S−)を介して3〜8の狭い薬物負荷によって連結された、細胞結合剤および薬物のコンジュゲートが記載され、これは、癌細胞に対して相対的に高い有効な生物学的活性を示し、また最小限のタンパク質凝集で望ましい生化学的特性:高いコンジュゲーション収率および高いモノマー比;を有する。 In another preferred embodiment, connected by a narrow drug load of 3-8 via a polyethylene glycol spacer ((CH 2 CH 2 O) n = I~I4) disulfide group having (-S-S-), cells binders and described conjugates of drugs, which exhibit a relatively high effective biological activity against cancer cells, also biochemical properties desired with minimal protein aggregation: high conjugation yield and high monomer ratio; having.

この態様において特に考慮されるのは、式(4)の細胞結合剤薬物コンジュゲートまたは式(4')の特定の化合物: Of particular consideration in this embodiment, certain compounds of cell-binding agent drug conjugate or of formula (4) (4 '):
CB−(XK−^H −CH O−V−Y−D) ln (4) CB- (XK- ^ H 2 -CH 2 O-V-Y-D) ln (4)
[D−Y−(−CH −CH O−) −X,] −CB(4') [D-Y - (- CH 2 -CH 2 O-) n -X,] m -CB (4 ')
式中: In the formula:
CBは、細胞結合剤を表し; CB represents a cell binding agent;
Dは、薬物を表し; D represents a drug;
Xは、チオエーテル結合、アミド結合、カルバメート結合、またはエーテル結合を介して細胞結合剤に付着した脂肪族、芳香族または複素環式基を表し; X represents a thioether bond, an amide bond, an aliphatic attached to carbamate linkage or via an ether bond cell binding agent, aromatic or heterocyclic group;
Yは、ジスルフィド結合を介して薬物に付着した脂肪族、芳香族または複素環式基を表し; Y is an aliphatic attached to the drug via a disulfide bond, an aromatic or heterocyclic group;
lは、0または1であり; l is 0 or 1;
mは、3〜8の整数であり; m is an integer of 3-8;
nは、1〜14の整数である; n is a 1 to 14 integer;
である。 It is.

好ましくは、mは、3〜6の整数である。 Preferably, m is an integer of 3 to 6.

また、好ましくは、nは、2〜8の整数である。 Also, preferably, n is an integer of 2-8.

本発明において、薬物は親油性分子であり、これらは細胞結合剤、例えば、抗体にコンジュゲートされると、タンパク質の凝集または沈殿に起因してしばしば収率の損失が生じる。 In the present invention, the drug is a lipophilic molecule, these cell-binding agents, for example, when it is conjugated to an antibody, often the loss of yield due to aggregation or precipitation of proteins occurs. 細胞結合剤あたりの薬物の数を増大させることで、さらに悪いタンパク質の凝集または沈殿を典型的にはもたらし、これによりモノマー百分率が低くなり、収率が低下する。 By increasing the number of drugs per cell-binding agent, it brings more typically aggregation or precipitation of the bad protein, thereby monomer percentage is lowered, the yield is lowered. 従来のリンカーによる典型的なコンジュゲート挙動と対照的に、PEGリンカーは、治療適用に有用である1mg/ml以上の高濃度で、細胞結合剤と薬物とのコンジュゲートのモノマー百分率(>90%のモノマー)および収率(>70%)において望ましい改善をもたらす。 In contrast to the typical conjugate behavior of conventional linker, PEG linker, at a high concentration of more than 1mg / ml are useful in therapeutic applications, a monomer percentage of conjugates of cell-binding agent and the drug (> 90% resulting in monomer) and desired improvement in the yield (> 70%). 加えて、これらのコンジュゲートは、4℃での長期貯蔵に際して安定である。 In addition, these conjugates are stable upon prolonged storage at 4 ° C..

本発明において、反応性基を持つチオエーテル部位を有する新規のメイタンシノイドが開示され、これらの化合物は、式(5): In the present invention, novel maytansinoids are disclosed having a thioether site having a reactive group, these compounds of formula (5):
D'−Y'−V−Q−W−Z'(5) D'-Y'-V-Q-W-Z '(5)
式中: In the formula:
Vは、好ましくは、1〜10個の炭素原子を有する、適宜、線状、分枝状または環式のアルキル、アルケニルまたはアルキニル基であり;より好ましくは、1〜5個の炭素原子を有する線状アルキルであり、さらにより好ましくは、Vは、1個の炭素のアルキル基(CH )であり; V preferably has 1 to 10 carbon atoms, as appropriate, be linear, branched or cyclic alkyl, alkenyl or alkynyl group; more preferably, having 1-5 carbon atoms a linear alkyl, even more preferably, V is located with one alkyl group having a carbon (CH 2);
Wは、1〜10個の炭素原子を有する;より好ましくは、2〜8個の炭素原子を有する、適宜、線状、分枝状または環式のアルキル、アルケニルまたはアルキニル基であり;さらにより好ましくは、Wは、シクロヘキシル基であり; W has 1 to 10 carbon atoms; more preferably, 2 to 8 carbon atoms, as appropriate, be linear, branched or cyclic alkyl, alkenyl or alkynyl group; still more preferably, W is is cyclohexyl group;
D'は、スルフヒドリル保持メイタンシノイドを表し、より好ましくは、DM1、DM3およびDM4から選択され; D 'represents a sulfhydryl holding maytansinoid, more preferably, is selected from DM1, DM3 and DM4;
Y'は、チオエーテル結合を表し; Y 'represents a thioether bond;
Qは、適宜、芳香族または複素環式部位を表し、好ましくは、Qは、存在せず; Q is suitably represents an aromatic or heterocyclic sites, preferably, Q is absent;
Z'は、限定されないが、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、N−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、パラまたはオルトニトロフェニルエステル、ジニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステルおよびスルホテトラフルオロフェニルエステルから選択されるアミン反応性基またはチオール反応性基であり;マレイミドまたはハロアセトアミドであり、より好ましくは、Zは、Nヒドロキシスクシンイミド、N−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステルまたはマレイミドである; Z 'include, but are not limited to, N- hydroxysuccinimide esters, N- hydroxysulfosuccinimide ester, para or ortho-nitrophenyl ester, dinitrophenyl ester, amine-reactive groups selected from pentafluorophenyl esters and sulfo tetrafluorophenyl ester or be thiol-reactive group; a maleimide or haloacetamide, more preferably, Z is is a N-hydroxysuccinimide, N- hydroxy sulfosuccinimide ester or maleimide;
によって表されるようになっている。 It has become as represented by.

別の実施形態において、チオエーテル部位を持つ反応性メイタンシノイド誘導体は、スルフヒドリル保持メイタンシノイド(例えば、DM1およびDM4)およびヘテロ二官能性架橋剤から調製される。 In another embodiment, the reactive maytansinoid derivatives having a thioether moiety, a sulfhydryl holding maytansinoid (e.g., DM1 and DM4) are prepared from and heterobifunctional crosslinking agent. 反応順序は、式(6): The reaction sequence is the formula (6):
D'+γ”−V−Q−W−Z'→D'−Y'−V−Q−W−Z' (6) D '+ γ "-V-Q-W-Z' → D'-Y'-V-Q-W-Z '(6)
式中: In the formula:
Vは、好ましくは1〜10個の炭素原子を有する、適宜、線状、分枝状または環式のアルキル、アルケニルまたはアルキニル基;より好ましくは、1〜5個の炭素原子を有する線状アルキルであり、さらにより好ましくは、Vは1個の炭素のアルキル基(CH )であり; V preferably has 1 to 10 carbon atoms, optionally a linear, branched or cyclic alkyl, alkenyl or alkynyl group; more preferably, a linear alkyl having 1 to 5 carbon atoms , still more preferably, V is located with one alkyl group having a carbon (CH 2);
Wは、1〜10個の炭素原子を有する;より好ましくは、2〜8個の炭素原子を有する、適宜、線状、分枝状または環式のアルキル、アルケニルまたはアルキニル基であり、さらにより好ましくは、Wは、シクロヘキシル基であり; W has 1 to 10 carbon atoms; more preferably, 2 to 8 carbon atoms, as appropriate, a linear, branched or cyclic alkyl, alkenyl or alkynyl group, still more preferably, W is is cyclohexyl group;
Y”は、マエイミドまたはハロアセトアミドから選択されるチオール反応性基、好ましくはマレイミドを表し; Y "is a thiol reactive group selected from Maeimido or halo acetamide, preferably represents a maleimide;
D'は、スルフヒドリル保持メイタンシノイドを表し、より好ましくは、DM1、DM3およびDM4から選択され; D 'represents a sulfhydryl holding maytansinoid, more preferably, is selected from DM1, DM3 and DM4;
Y'は、チオエーテル結合を表しQは、適宜、芳香族または複素環式部位を表し、好ましくは、Qは存在せずZ'は、限定されないが、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、N−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、パラまたはオルトニトロフェニルエステル、ジニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステルおよびスルホテトラフルオロフェニルエステルから選択されるアミン反応性基またはチオール反応性基を表し;マレイミドまたはハロアセトアミド、より好ましくは、Zは、Nヒドロキシスクシンイミド、N−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステルまたはマレイミドを表しY'は、チオエーテル結合を表す; Y 'is Q represents a thioether bond, as appropriate, represents an aromatic or heterocyclic sites, preferably, Q is without Z presence' include, but are not limited to, N- hydroxysuccinimide esters, N- hydroxysulfosuccinimide esters, para or ortho-nitrophenyl esters, dinitrophenyl esters, represent amine-reactive groups or thiol-reactive groups are selected from pentafluorophenyl esters and sulfo tetrafluorophenyl ester; maleimide or haloacetamide, more preferably, Z is , N-hydroxysuccinimide, Y 'represents a N- hydroxy sulfosuccinimide ester or maleimide represents a thioether bond;
によって表される。 Represented by.

本発明はまた、非開裂結合を介して連結された、メイタンシノイドおよび細胞結合剤の細胞毒性コンジュゲートの調製のためのプロセスであって、細胞結合剤を式Z'−W−Q−V−Y'−D'の化合物と反応させて、式CB−(Z”−W−Q−V−Y'−D') The present invention also linked via a non-cleavable bond, a process for the preparation of cytotoxic conjugates of maytansinoids and cell-binding agent, a cell-binding agent formula Z'-W-Q-V -Y'-D 'by a compound reacting the formula CB- (Z "-W-Q- V-Y'-D') m
式中、 In the formula,
Wは、1〜10個の炭素原子を有する;より好ましくは、2〜8個の炭素原子を有する、適宜、線状、分枝状または環式のアルキル、アルケニルまたはアルキニル基であり、さらにより好ましくは、Wは、シクロヘキシル基であり; W has 1 to 10 carbon atoms; more preferably, 2 to 8 carbon atoms, as appropriate, a linear, branched or cyclic alkyl, alkenyl or alkynyl group, still more preferably, W is is cyclohexyl group;
Qは、適宜、芳香族または複素環式部位を表し、好ましくは、Qは存在せず; Q is suitably represents an aromatic or heterocyclic sites, preferably, Q is absent;
Vは、好ましくは1〜10個の炭素原子を有する、適宜、線状、分枝状または環式のアルキル、アルケニルまたはアルキニル基であり;より好ましくは、1〜5個の炭素原子を有する線状アルキル基であり、さらにより好ましくは、Vは、1個の炭素のアルキル基(CH2)であり; V preferably has 1 to 10 carbon atoms, as appropriate, be linear, branched or cyclic alkyl, alkenyl or alkynyl group; more preferably, a line having 1-5 carbon atoms an Jo alkyl group, even more preferably, V is located with one alkyl group having a carbon (CH2);
Y'は、チオエーテル結合を表し; Y 'represents a thioether bond;
D'は、メイタンシノイドを持つスルフヒドリルを表し、より好ましくは、DM1、DM3およびDM4から選択され; D 'represents a sulfhydryl with maytansinoid, more preferably, is selected from DM1, DM3 and DM4;
CBは、抗体、単鎖抗体、抗体フラグメント、ペプチド、成長因子、ホルモン、ビタミン、またはアンキリンリピートタンパク質(DARPin)から選択される細胞結合剤を表し、好ましくは、細胞結合剤は、抗体もしくは抗体フラグメントまたはDarpinであり; CB represents antibodies, single chain antibodies, antibody fragments, peptides, growth factors, hormones, vitamins or ankyrin repeat protein cell binding agent selected from (DARPins),, preferably, the cell binding agent is an antibody or antibody fragment or be a Darpin;
Z'は、限定されないが、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、N−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、パラまたはオルトニトロフェニルエステル、ジニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステルおよびスルホテトラフルオロフェニルエステルから選択されるアミン反応性基またはチオール反応性基であり;マレイミドまたはハロアセトアミドであり、より好ましくは、Zは、Nヒドロキシスクシンイミド、N−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステルまたはマレイミドであり; Z 'include, but are not limited to, N- hydroxysuccinimide esters, N- hydroxysulfosuccinimide ester, para or ortho-nitrophenyl ester, dinitrophenyl ester, amine-reactive groups selected from pentafluorophenyl esters and sulfo tetrafluorophenyl ester or be thiol-reactive group; a maleimide or haloacetamide, more preferably, Z is located in the N-hydroxysuccinimide, N- hydroxy sulfosuccinimide ester or maleimide;
Z”は、チオエーテル結合またはアミド結合を表す; Z "represents a thioether bond or an amide bond;
の細胞結合剤コンジュゲートを提供することを含むプロセスも提供する。 Also provides a process comprising providing a cell binding agent conjugate.

プロセスは、細胞結合剤、例えば抗体の、最大で20%の有機溶媒を適宜、含有する、細胞結合剤の水性緩衝液中の溶液と、有機溶媒または有機溶媒および水性緩衝液もしくは水の混合物中の溶液中の式Z'−W−Q−V−Y'−D'の化合物とを混合し、反応を5分〜72時間の間進行させることによって行われ得る。 Process, the cell binding agent, for example an antibody, most appropriately 20% of an organic solvent, containing a solution in an aqueous buffer cell binding agent, an organic solvent or an organic solvent and an aqueous buffer or a mixture of water of a compound of formula Z'-W-Q-V-Y'-D 'in the solution was mixed, it may be done by advancing during the reaction for 5 minutes to 72 hours. コンジュゲートは、クロマトグラフィ、透析、クロスフロー濾過または前記方法の組み合わせによって精製されてよい。 Conjugates, chromatography, dialysis, may be purified by a combination of cross-flow filtration or the method.

全ての態様において、「脂肪族基」は、アルキル、アルケニルまたはアルキニル基として定義される。 In all embodiments, "aliphatic group", the alkyl is defined as an alkenyl or alkynyl group. アルキル基は、鎖に好ましくは1〜20個の炭素原子を有する直鎖または分枝状であってよい脂肪族炭化水素基、または好ましくは3〜10個の炭素原子を有する環状である脂肪族炭化水素基である。 Alkyl group is preferably a chain 1-20 straight-chain or branched which may be an aliphatic hydrocarbon group having carbon atoms or, preferably, a cyclic having 3 to 10 carbon atoms in the aliphatic it is a hydrocarbon group. より好ましいアルキル基は、鎖に1〜12個の炭素原子を有する。 More preferred alkyl groups have 1 to 12 carbon atoms in the chain. 「分枝状」は、1種以上の低級アルキル基、例えば、メチル、エチルまたはプロピルが、線状アルキル鎖に付着していることを意味する。 "Branched" means one or more lower alkyl groups such as methyl, ethyl or propyl, which means that it is attached to a linear alkyl chain. 例示的なアルキル基として、メチル、エチル、nプロピル、i−プロピル、n−ブチル、t−ブチル、n−ペンチル、3−ペンチル、オクチル、ノニル、デシル、シクロペンチルおよびシクロヘキシルが挙げられる。 Exemplary alkyl groups include methyl, ethyl, n-propyl, i- propyl, n- butyl, t- butyl, n- pentyl, 3-pentyl, octyl, nonyl, decyl, cyclopentyl and cyclohexyl.

アルケニル基は、炭素−炭素二重結合を含有し、好ましくは2〜15個の炭素原子を鎖に有する、直鎖または分枝状であってよい脂肪族炭化水素基である。 Alkenyl group, a carbon - carbon double bonds, preferably 2 to 15 carbon atoms having a chain, a straight or branched an aliphatic hydrocarbon group which may be. より好ましいアルケニル基は、鎖に2〜12個の炭素原子;より好ましくは、鎖に約2〜4個の炭素原子を有する。 More preferred alkenyl groups, 2-12 carbon atoms in the chain; and more preferably about 2 to 4 carbon atoms in the chain. 例示的なアルケニル基として、エテニル、プロペニル、n−ブテニル、i−ブテニル、3−メチルブタ−2−エニル、n−ペンテニル、ヘプテニル、オクテニル、ノネニル、デセニルが挙げられる。 Exemplary alkenyl groups include ethenyl, propenyl, n- butenyl, i- butenyl, 3-methylbut-2-enyl, n- pentenyl, heptenyl, octenyl, nonenyl, and decenyl.

アルキニル基は、炭素−炭素三重結合を含有し、好ましくは2〜15個の炭素原子を鎖に有する、直鎖または分枝状であってよい脂肪族炭化水素基である。 Alkynyl group, a carbon - containing carbon triple bonds, preferably 2 to 15 carbon atoms having a chain, a straight or branched an aliphatic hydrocarbon group which may be. より好ましいアルキニル基は、鎖に2〜12個の炭素原子;より好ましくは、鎖に約2〜4個の炭素原子を有する。 More preferred alkynyl groups have 2 to 12 carbon atoms in the chain; and more preferably about 2 to 4 carbon atoms in the chain. 例示的なアルキニル基として、エチニル、プロピニル、n−ブチニル、2−ブチニル、3−メチルブチニル、n−ペンチニル、ヘプチニル、オクチニルおよびデシニルが挙げられる。 Exemplary alkynyl groups include ethynyl, propynyl, n- butynyl, 2-butynyl, n- pentynyl, heptynyl, and octynyl and decynyl.

本明細書において用いられるとき、用語「芳香族基」は、6〜14個の炭素原子、好ましくは6〜10個の炭素原子の芳香族単環式または多環式炭化水素環系からなる置換または非置換のアリール基を意味する。 As used herein, the term "aromatic group", from 6 to 14 carbon atoms, preferably of 6 to 10 aromatic monocyclic or polycyclic hydrocarbon ring system carbon atoms substituted or it means an unsubstituted aryl group. 例示的なアリール基として、フェニルおよびナフチルが挙げられる。 Exemplary aryl groups include phenyl and naphthyl. 置換基として、限定されないが、アルキル基、ハロゲン、ニトロ、アミノ、ヒドロキシルおよびアルコキシ基が挙げられる。 As substituents include, but are not limited to, alkyl, halogen, nitro, amino, hydroxyl and alkoxy groups.

ハロゲンとして、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素原子が挙げられる。 Halogen, fluorine, chlorine, bromine and iodine atoms. フッ素および塩素原子が好ましい。 Fluorine and chlorine atoms are preferred.

用語「複素環式基」は、本明細書において用いられるとき、飽和、部分不飽和または不飽和の、非芳香族の安定な3〜14、好ましくは5〜10員の単、二または多環式環であって、環の少なくとも一員が、ヘテロ原子であるもの、あるいは、少なくとも1個のヘテロ原子を有する芳香族の好ましくは5〜10員の単、二または多環式環を称する。 The term "heterocyclic group", as used herein, saturated, partially unsaturated or unsaturated, non-aromatic stable 3 to 14, preferably 5 to 10 membered mono-, bi- or polycyclic a formula ring, at least one member of the ring, as a heteroatom, or, preferably aromatic having at least one heteroatom referred to a single 5-10 membered, two or polycyclic ring. 典型的には、ヘテロ原子として、限定されないが、酸素、窒素、硫黄、セレニウム、およびリン原子が挙げられる。 Typically, as a hetero atom include, but are not limited to, oxygen, nitrogen, sulfur, selenium, and phosphorus atom. 好ましいヘテロ原子は、酸素、窒素および硫黄である。 Preferred heteroatoms are oxygen, nitrogen and sulfur.

好ましい複素環式基として、限定されないが、ピロリジニル、ピラゾリジニル、イミダゾリジニル、オキシラニル、テトラヒドロフラニル、ジオキソラニル、テトラ−ピラニル、ジオキサニル、ジオキソラニル、ピペリジル、ピペラジニル、モルホリニル、ピラニル、イミダゾリニル、ピロリニル、ピラゾリニル、チアゾリジニル、テトラチオピラニル、ジチアニル、チオモルホリニル、ジヒドロピラニル、テトラピラニル、ジヒドロピラニル、テトラ−ピリジル、ジヒドロピリジル、テトラピリニジニル、ジヒドロチオピラニル、アゼパニル、ピロリル、ピリジル、ピラゾリル、チエニル、ピリミジニル、ピラジニル、テトラゾリル、インドリル、キノリニル、プリニル、イミダゾリル、チエニル、チアゾリル、ベンゾチアゾリル、フラニ Preferred heterocyclic groups include, but are not limited to, pyrrolidinyl, pyrazolidinyl, imidazolidinyl, oxiranyl, tetrahydrofuranyl, dioxolanyl, tetra - pyranyl, dioxanyl, dioxolanyl, piperidyl, piperazinyl, morpholinyl, pyranyl, imidazolinyl, pyrrolinyl, pyrazolinyl, thiazolidinyl, Tetorachio pyranyl, dithianyl, thiomorpholinyl, dihydropyranyl, Tetorapiraniru, dihydropyranyl, tetra - pyridyl, dihydropyridyl, tetra pyridyl Nizhny Le, dihydro tetrahydrothiopyranyl, azepanyl, pyrrolyl, pyridyl, pyrazolyl, thienyl, pyrimidinyl, pyrazinyl, tetrazolyl, indolyl, quinolinyl, purinyl, imidazolyl, thienyl, thiazolyl, benzothiazolyl, Fulani 、ベンゾフラニル、1,2,4−チアジアゾリル、イソチアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、イソキノリル、ベンゾチエニル、イソベンゾフリル、ピラゾリル、カルバゾリル、ベンズイミダゾリル、およびイソオキサゾリル、ピリジル−N−オキシド、ならびにフェニル基との縮合から得られる融合系が挙げられる。 , Benzofuranyl, obtained 1,2,4-thiadiazolyl, isothiazolyl, triazolyl, tetrazolyl, isoquinolyl, benzothienyl, isobenzofuryl, pyrazolyl, carbazolyl, benzimidazolyl, and isoxazolyl, pyridyl -N- oxide, and the condensation with a phenyl group It is fusion system, and the like.

XおよびYによって表される脂肪族、芳香族および複素環式基は、荷電した置換基を保有することもできる。 Aliphatic represented by X and Y, aromatic and heterocyclic groups can also possess a charged substituent. 荷電した置換基は、限定されないがカルボキシレート、スルホネートおよびホスフェートから選択され、負に帯電していても、第三級または第四級アミノ基から選択され、正に帯電していてもよい。 Charged substituents, but not limited to carboxylates, are selected from sulfonate and phosphates, also be negatively charged selected from a tertiary or quaternary amino group, it may be positively charged.

表記「細胞結合剤に連結された」は、本明細書において用いられるとき、好適な連結基、またはその前駆体を介して、細胞結合剤に結合した少なくとも1個の薬物誘導体を含むコンジュゲート分子を称する。 Notation "cell binding agent linked to" as used herein, suitable linking group or via a precursor thereof, a conjugate molecule comprising at least one drug derivative bound to a cell binding agent It is referred to. 好ましい連結基は、チオールもしくはジスルフィド結合、またはその前駆体である。 Preferred linking groups are thiol or disulfide bonds, or precursors thereof.

本明細書において用いられるとき、所与の基の「前駆体」は、いずれかの保護、化学修飾、またはカップリング反応によって基を生じ得るいずれの基も称する。 As used herein, "precursor" of a given group, any protecting, also referred to any group which can cause groups by chemical modification, or coupling reaction. 例えば、前駆体は、チオール前駆体としてのチオエステルまたはチオエーテルによって例示される適切に保護された官能基であり得る。 For example, the precursor may be suitably protected functional groups which are exemplified by a thioester or thioether as a thiol precursor.

本明細書において用いられるとき、用語「反応性官能基」は、アミン−、チオール−またはヒドロキシル−反応性官能基を称する。 As used herein, the term "reactive functional group", amine -, thiol - or hydroxyl - refers to reactive functional groups. 換言すると、反応性官能基は、細胞結合剤に存在するアミン、スルフヒドリル(チオール)、またはヒドロキシル基と反応し得る。 In other words, the reactive functional groups may react with an amine present in the cell binding agent, sulfhydryl (thiol), or hydroxyl groups. 例えば、アミン反応性官能基では、官能基は、アミド結合を提供する、反応性カルボン酸エステル(iV−スクシンイミジル、N−スルホスクシンイミジル、N−フタルイミジル、N−スルホフタルイミジル、2−ニトロフェニル、4−ニトロフェニル、2,4−ジニトロフェニル、3−スルホ−4−ニトロフェニル、3−カルボキシ−4−ニトロフェニル、テトラフルオロフェニルエステルを含む)、反応性スルホン酸誘導体、または反応性チオエステルであり得;チオール反応性官能基では、官能基は、チオエター結合を提供するマレイミド、ハロアセトアミド、またはビニルスルホンであり得;ヒドロキシル反応性官能基では、官能基は、エステル結合を提供する反応性カルボン酸エステルであり得る。 For example, the amine-reactive functional group, the functional group provides an amide bond, a reactive carboxylic acid ester (Iv- succinimidyl, N- sulfosuccinimidyl, N- phthalimidyl, N- sulfo phthalic succinimidyl 2- nitrophenyl, 4-nitrophenyl, 2,4-dinitrophenyl, 3-sulfo-4-nitrophenyl, 3-carboxy-4-nitrophenyl, including tetrafluorophenyl esters), a reactive sulfonic acid derivative or a reactive, the thiol-reactive functional group, the functional group is a maleimide which provides Chioeta bond, haloacetamide or vinylsulfonic a is obtained,; thioester a is obtained in the hydroxyl-reactive functional groups, the functional groups provide an ester bond reactions It may be sex-carboxylic acid ester.

修飾された薬物および修飾された細胞結合剤を有する親水性リンカーリンカーは、薬物、例えばメイタンシノイドを細胞結合剤に安定な共有結合様式で連結させることが可能であるあらゆる化学部位である。 Hydrophilic linker linker with modified drug and modified cell binding agent, a drug, for example, a maytansinoid is any chemical moiety that can be linked in a stable covalent bonding mode to a cell binding agent. リンカーは、薬物または細胞結合剤が活性を維持する条件で、酸誘発開裂、光誘発開裂、ペプチダーゼ誘発開裂、エステラーゼ誘発開裂、およびジスルフィド結合開裂に対して、感受性または実質的に耐性の可能性がある。 Linker under conditions where the drug or cell binding agent to maintain the activity, acid-induced cleavage, light-induced cleavage, peptidase-induced cleavage, esterase-induced cleavage, and with respect to the disulfide bond cleavage, the possibility of sensitive or substantially resistant is there. 図1、2および3は、本発明のコンジュゲートの構造的表示を例示的に提供する。 1, 2 and 3 provide a structural representation of the conjugate of the present invention exemplarily.

薬物と細胞結合剤との間にリンカーを形成する親水性PEG鎖を含む好適な架橋試薬は当該分野で周知であるか、あるいは市販されている(例えば、Quanta Biodesignから、オハイオ州パウエル)。 Or Suitable crosslinking reagents comprising hydrophilic PEG chains that form linkers between a drug and a cell binding agent are well known in the art, or are commercially available (e.g., from Quanta Biodesign, Powell, Ohio). 好適なPEG含有架橋剤は、市販のPEG自体から、当業者に公知の標準的な合成化学技術を用いて合成することもできる。 Suitable PEG-containing crosslinkers can also be from commercially available PEG itself, synthesized using known standard synthetic chemistry techniques known to those skilled in the art. 薬物は、本明細書に記載の方法により、二官能性PEG含有架橋剤と反応して、式(1)、Z−X −(−CH −CH −O−) −Y −Dの化合物を与えることができる。 Drugs, by the methods described herein, the two react with functional PEG-containing cross-linking agent, formula (1), Z-X i - (- CH 2 -CH 2 -O-) n -Y p - it can give a compound of D. 例えば、チオール含有メイタンシノイド薬物は、PEGスペーサーを有するビスマレイミド架橋剤と反応して、チオエーテル結合を介してPEGスペーサーに結合されたメイタンシノイド薬物を与えることができる(例えば、図13を参照)。 For example, thiol-containing maytansinoid drug can be reacted with a bismaleimide crosslinking agent having a PEG spacer can provide maytansinoid drug coupled to PEG spacer via a thioether bond (e.g., see Figure 13 ). PEGスペーサーおよび末端マレイミド基を有するこの修飾されたメイタンシノイドは、次いで例えば図14に示される細胞結合剤と反応して、本発明の式(2)の細胞結合剤−薬物コンジュゲートを提供することができる。 This modified maytansinoid with PEG spacer and a terminal maleimido group can then react with cell-binding agent shown in Figure 14 for example, the cell binding agent of formula (2) of the present invention - to provide a drug conjugate be able to.

代替的には、細胞結合剤は、反応性アミン基、例えばN−ヒドロキシスクシンイミドエステルを持つ二官能性PEG含有架橋剤の一方の端でまず反応して、リンカーにアミド結合を通して共有結合的に結合した修飾された細胞結合剤を与えることができる(例えば、図15を参照)。 Alternatively, the cell binding agent reactive amine groups, for example N- hydroxysuccinimide ester is first reacted with one end of the bifunctional PEG containing cross-linking agent having, covalently bonded through an amide bond to the linker it can provide the modified cell-binding agent (e.g., see Figure 15). 次の工程で、メイタンシノイドは、PEGスペーサーの他方の端のマレイミド置換基と反応して、本発明の細胞結合剤−薬物コンジュゲートを与える。 In the next step, maytansinoid reacts with the maleimide substituent other end of the PEG spacer, the cell binding agent of the present invention - providing a drug conjugate.

図16および17は、例えばPEG架橋剤の合成、およびチオアセトアミド連結を通してのそれとメイタンシノイドとの反応を示す。 16 and 17 show an example synthesis of PEG cross-linking agent, and therewith reaction with maytansinoid through thioacetamide linked. 次いでマレイミド置換基は、PEGに組み込まれて、チオエーテル結合を介しての細胞結合剤との反応を可能にする。 Then maleimide substituents built into the PEG, to allow reaction with the cell-binding agent via a thioether bond. 代替的には、例えば図18に示されるように、細胞結合剤が、まずPEG架橋剤にチオエーテル結合を通して連結する。 Alternatively, for example, as shown in FIG. 18, the cell binding agent is first linked through a thioether bond to the PEG crosslinker. 修飾された細胞結合剤は、次いで、メイタンシノイド薬物と反応して、コンジュゲートを与える。 Modified cell binding agent is then reacted with maytansinoid drug, giving the conjugate. PEGスペーサーの両端がヨードアセトアミド部分を含みホモ二官能性PEG架橋剤であって、細胞毒性薬物と細胞結合剤の両方をチオエーテル結合を介して連結させて親水性PEGスペーサーを含むコンジュゲートを与えることができるホモ二官能性PEG架橋剤の合成は、例えば図19に示される。 Both ends of the PEG spacer to a homobifunctional PEG crosslinker include iodoacetamide moieties, to give a conjugate comprising a hydrophilic PEG spacer both cytotoxic drug and the cell binding agent are linked via a thioether bond synthesis of homobifunctional PEG crosslinker can is shown in Figure 19, for example. 本発明のコンジュゲートを提供するためのコンジュゲーション手順は、例えば図20および21に示される。 Conjugation procedure for providing a conjugate of the present invention is shown for example in FIGS. 20 and 21.

当業者は、種々の反応性基を持つ他のPEG含有架橋剤が、本明細書に記載されている方法により容易に合成され得ることを理解するであろう。 Those skilled in the art will appreciate that other PEG-containing crosslinkers with different reactive groups can be readily synthesized by methods described herein. 例えば、ヒドロキシル基を持つ薬物、例えば19−デメチルメイタンシノイド(米国特許第4,361,650号)が、ヨード−アセチル−PEGリンカー(図5)と、塩基、例えば炭酸カリウムの存在下で反応されて、メイタンシノイドを、エーテル結合を介して連結させることができる。 For example, drugs with hydroxyl groups, for example, 19-demethyl maytansinoid (US Pat. No. 4,361,650) is iodo - acetyl -PEG linker (Figure 5), in the presence of a base such as potassium carbonate are reacted, a maytansinoid, may be linked through an ether bond. 同様に、アミン含有メイタンシノイド(米国特許第7,301,019号に記載されているように合成)が、ヨードアセチルPEG(図5に示される)と、塩基、例えばピリジンまたはトリエチルアミンの存在下で反応されて、アミン連結を介してPEGに連結されたメイタンシノイドを提供することができる。 Similarly, amine-containing maytansinoid (synthesized as described in U.S. Pat. No. 7,301,019) is the iodoacetyl PEG (shown in Figure 5) the presence of a base such as pyridine or triethylamine in is reacted, it is possible to provide a maytansinoid linked to the PEG via a amine coupling. アミド結合を介したPEGへの薬物の連結部については、カルボキシ−PEG(図5に示される)が、アミン含有メイタンシノイドと、縮合剤、例えばジシクロヘキシルカルボジイミドの存在下で反応して、アミド結合されたPEG−メイタンシノイドを提供することができる。 The coupling portion of the drug to the PEG via an amide bond, the carboxy-PEG (shown in Figure 5) is an amine-containing maytansinoid, condensing agent, for example, reaction in the presence of dicyclohexyl carbodiimide, the amide bond been PEG- maytansinoids can provide proteinoid. 薬物をPEGスペーサーにカルバメート連結を介して連結させるためには、PEGがまずジホスゲンと反応されてPEGクロロホルメートを付与し、次いでこれがアミン含有メイタンシノイドと、塩基、例えばトリエチルアミンの存在下で反応して、カルバメート連結されたPEG−メイタンシノイドを与えることができる。 Drug to link via a carbamate linkage to PEG spacer, PEG is first reacted with diphosgene to impart PEG chloroformate, which is then with an amine-containing maytansinoid, a base, for example in the presence of triethylamine , it is possible to give a carbamate linked PEG- maytansinoid.

好適なリンカーの例として、細胞結合剤との反応のためのiV−スクシンイミジルエステルまたはN−スルホスクシンイミジルエステル部位、および薬物との反応のためのマレイミドまたはハロアセチルをベースとする部位を有するリンカーが挙げられる。 Examples of suitable linkers have a site based on maleimide or haloacetyl for the reaction of iV- succinimidyl ester or N- sulfosuccinimidyl ester moiety, and the drug for reaction with the cell-binding agent linkers, and the like. PEGスペーサーが、本明細書に記載されている方法によって当該分野において公知のいずれの架橋剤によって組み込まれてもよい。 PEG spacer may be incorporated by any known cross-linking agents in the art by the methods described herein. マレイミド系部位を含む架橋試薬であってPEGスペーサーが組み込まれ得る架橋試薬として、限定されないが、N−スクシンイミジル4−(マレイミドメチル)シクロヘキサンカルボキシレート(SMCC)、7V−スクシンイミジル−4−(N−マレイミドメチル)−シクロヘキサン−1−カルボキシ−(6−アミドカプロエート):これはSMCCの「長鎖」アナログである(LC−SMCC)、κ−マレイミドウンデカン酸N−スクシンイミジルエステル(KMUA)、γ−マレイミド酪酸N−スクシンイミジルエステル(GMBS)、ε−マレイミドカプロン酸N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(EMCS)、m−マレイミドベンゾイル−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(MBS)、N−(α−マレイミドアセトキシ As a crosslinking reagent PEG spacer can be incorporated a cross-linking reagent containing a maleimide-based site, but are not limited to, N- succinimidyl 4- (maleimidomethyl) cyclohexanecarboxylate (SMCC), 7V- succinimidyl-4-(N-maleimido methyl) - cyclohexane-1-carboxy - (6-amido caproate): This is a "long chain" analog of SMCC (LC-SMCC), κ- maleimidoundecanoic acid N- succinimidyl ester (KMUA), γ - maleimide butyric acid N- succinimidyl ester (GMBS), .epsilon.-maleimidocaproic acid N- hydroxysuccinimide ester (EMCS), m-maleimidobenzoyl--N- hydroxysuccinimide ester (MBS), N- (α- maleimidoacetoxy −スクシンイミドエステル(AMAS)、スクシンイミジル−6−(β−マレイミドプロピオンアミド)ヘキサノエート(SMPH)、N−スクシンイミジル4−(p−マレイミドフェニル)−ブチレート(SMPB)、およびN−(p−マレイミドフェニル)イソシアネート(PMPI)が挙げられる。 - succinimide ester (AMAS), succinimidyl-6-(beta-maleimidopropionamido) hexanoate (SMPH), N-succinimidyl 4-(p-maleimido-phenyl) - butyrate (SMPB), and N-(p-maleimido phenyl) isocyanate (PMPI), and the like. ハロアセチルをベースとする部位を含む架橋試薬として、N−スクシンイミジル−4−(ヨードアセチル)−アミノベンゾエート(SIAB)、N−スクシンイミジルヨードアセテート(SIA)、N−スクシンイミジルブロモアセテート(SBA)、およびN−スクシンイミジル3−(ブロモアセトアミド)プロピオネート(SBAP)が挙げられる。 Haloacetyl as a crosslinking reagent containing the site based, N- succinimidyl-4- (iodoacetyl) - aminobenzoate (SIAB), N- succinimidyl iodoacetate (SIA), N- succinimidyl bromoacetate ( SBA), and N- succinimidyl 3- (bromoacetamido) propionate (SBAP), and the like.

硫黄原子を含まない他の架橋試薬も本発明方法に用いられ得る。 Other crosslinking reagents containing no sulfur atom may also be used in the methods present invention. かかる架橋試薬は、ジカルボン酸をベースとする部位から誘導され得る。 Such cross-linking reagent can be derived from a portion of the dicarboxylic acid-based. ジカルボン酸をベースとする好適な部位として、限定されないが、以下に示される一般式: Formula dicarboxylic acid as a preferred site based, but are not limited to, as shown below:
HOOC−A' −E' −(CH CH O) G' −COOH HOOC-A 'p -E' q - (CH 2 CH 2 O) n G 'r -COOH
式中:A'は2〜20個の炭素原子を有する、適宜、直鎖または分枝鎖アルキル、アルケニルまたはアルキニル基であり、E'は3〜10個の炭素原子を有する、適宜、シクロアルキルまたはシクロアルケニル基であり、G'は6〜10個の炭素原子を有する、適宜、置換もしくは非置換芳香族基、またはヘテロ原子がN、OもしくはSから選択される置換もしくは非置換複素環式基であり、p、qおよびrはそれぞれ0または1であり、ただし、p、qおよびrが同時にすべてゼロであることはなく、nは1から2000までの整数である;のα,ω−ジカルボン酸が挙げられる。 Wherein: A 'has from 2 to 20 carbon atoms, optionally straight or branched chain alkyl, alkenyl or alkynyl group, E' has 3 to 10 carbon atoms, as appropriate, cycloalkyl or a cycloalkenyl group, G 'has 6 to 10 carbon atoms, optionally, substituted or unsubstituted aromatic group or a substituted or unsubstituted heterocyclic heteroatoms selected from N, O or S, a group, p, q and r are each 0 or 1, provided that, p, never q and r are all simultaneously zero, n represents an integer from 1 to 2000; the alpha, .omega. include the dicarboxylic acid.

本明細書に開示されているリンカーの多くは米国特許出願公開第20050169933号に詳細に記載されている。 Many linkers disclosed herein are described in detail in U.S. Patent Application Publication No. 20050169933.

本発明の別の態様において、細胞結合剤は、二官能性架橋試薬を細胞結合剤と反応させることにより修飾され、これにより細胞結合剤へのリンカー分子の共有結合が得られる。 In another aspect of the present invention, the cell binding agent is a bifunctional cross-linking reagents modified by reaction with a cell binding agent, thereby covalent attachment of the linker molecule to the cell-binding agent is obtained. 「二官能性架橋試薬」は、本明細書において用いられるとき、細胞結合剤を薬物、例えば本明細書に記載されている薬物に共有結合的に連結させるあらゆる化学部位である。 "Bifunctional crosslinking reagent", as used herein, is any chemical moiety that covalently linked to the cell binding agent drug, a drug that is described herein. 本発明の好ましい態様において、連結部位の一部は薬物により与えられる。 In a preferred embodiment of the present invention, a portion of the connecting portion is provided by the drug. この態様において、薬物は、細胞結合剤を薬物につなげるために用いられる、より大きいリンカー分子の部分である連結部位を含む。 In this embodiment, the drug is used to connect the cell binding agent to a drug, comprising the linking site is a part of a larger linker molecule. 例えば、メイタンシノイドDM1を形成するために、メイタンシンのC−3ヒドロキシ基における側鎖が、遊離スルフヒドリル基(SH)を有するように修飾される。 For example, in order to form the maytansinoid DM1, the side chain at C-3 hydroxy group of maytansine is modified to have a free sulfhydryl group (SH). このチオール化された形態のメイタンシンは、修飾された細胞結合剤と反応して、コンジュゲートを形成することができる。 Maytansine This thiolated form is reacted with modified cell binding agents, it is possible to form a conjugate. したがって、最終リンカーは2成分から組み立てられ、その一方は架橋試薬によって付与され、他方はDM1からの側鎖により付与される。 Therefore, the final linker is assembled from two components, one of which is provided by the crosslinking reagent, while the other is provided by the side chain from DM1.

本発明の別の態様において、薬物は、ジスルフィド結合を通して細胞結合剤に連結される。 In another aspect of the present invention, the drug is linked to a cell binding agent through a disulfide bond. リンカー分子は、細胞結合剤と反応し得る反応性化学基を含む。 Linker molecule comprises a reactive chemical group capable of reacting with a cell binding agent. 細胞結合剤との反応に好ましい反応性化学基は、N−スクシンイミジルエステルおよびN−スルホスクシンイミジルエステルである。 Preferred reactive chemical groups for reaction with the cell-binding agent is N- succinimidyl esters and N- sulfosuccinimidyl esters. さらにリンカー分子は、薬物と反応してジスルフィド結合を形成し得る反応性化学基、好ましくはジチオピリジル基を含む。 Further linker molecule, the reactive chemical group that reacts with the drug to form a disulfide bond, preferably a dithiopyridyl group. 特に好ましいリンカー分子にとして、例えば、N−スクシンイミジル3−(2−ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP)(例えば、Carlssonら、Biochem.J.,173:723−737(1978)を参照)、N−スクシンイミジル4−(2−ピリジルジチオ)ブタノエート(SPDB)(例えば、米国特許第4,563,304号)、N−スクシンイミジル4−(2−ピリジルジチオ)ペンタノエート(SPP)(例えば、CAS登録番号341498−08−6)、および他の反応性架橋剤、例えば、米国特許第6,913,748号に記載されているもの:その全体が参照によって本明細書に組み込まれる;が挙げられる。 Particularly preferred linker molecules include, for example, N- succinimidyl 3- (2-pyridyldithio) propionate (SPDP) (e.g., Carlsson et al, Biochem. J., 173:. See 723-737 to (1978)), N- succinimidyl 4- (2-pyridyldithio) butanoate (SPDB) (e.g., U.S. Pat. No. 4,563,304), N-succinimidyl 4- (2-pyridyldithio) pentanoate (SPP) (e.g., CAS Registry number 341498-08 -6), and other reactive cross-linking agent, for example, those described in U.S. Pat. No. 6,913,748: entirely incorporated herein by reference; and the like.

代替的には、米国特許第6,441,163B1号に開示されるように、薬物が、まず修飾されて、細胞結合剤と反応するのに好適な反応性エステルを導入することができる。 Alternatively, as disclosed in U.S. Patent No. 6,441,163B1, drug, it is first modified, it is possible to introduce a suitable reactive ester to react with a cell-binding agent. 活性化されたリンカー部位を含むこれらの薬物と細胞結合剤との反応は、細胞結合剤−薬物コンジュゲートを製造する別の方法を提供する。 The reaction of these drugs and cell binding agent containing an activated linker moiety, cell binding agent - provides another method for producing a drug conjugate. siRNAの連結部のために、siRNAが、オリゴヌクレオチドの修飾に一般に用いられる方法により、本発明の架橋剤に連結され得る(例えば、米国特許出願公開第20050107325号および同第20070213292号)。 For connection of siRNA, siRNA is by a method commonly used for the modification of the oligonucleotides can be linked to the cross-linking agent of the present invention (e.g., U.S. Patent Application Publication No. 20050107325 and the No. 20070213292). したがって、3'または5'−ホスホロアミダイト形態のsiRNAが、ヒドロキシル官能基を持つ架橋剤の一方の端と反応して、siRNAと架橋剤との間にエステル結合を与える。 Accordingly, 3 'or 5'-phosphoramidite forms of siRNA reacts with one end of the cross-linking agent having a hydroxyl functionality to give an ester bond between the siRNA and the crosslinker. 同様に、siRNAホスホロアミダイトと末端アミノ基を持つ架橋剤との反応により、アミンを通しての架橋剤のsiRNAへの連結をもたらす。 Similarly, by reaction with a crosslinking agent having an siRNA phosphoramidite with terminal amino groups results in the connection to the cross-linking agent of the siRNA through an amine.

B. B. 細胞結合剤本発明に用いられる細胞結合剤は、癌細胞上の標的抗原に特異的に結合するタンパク質(例えば免疫グロブリンおよび非免疫グロブリンタンパク質)である。 Cell binding agent used in the cell binding agent present invention is a protein that specifically binds to a target antigen on a cancer cell (e.g., immunoglobulin and non-immunoglobulin protein). これらの細胞結合剤として、以下: As these cell binding agent, the following:
−以下を含む抗体: - antibody, including the following:
−表面再構成抗体(米国特許第5,639,641号); - surface reconstruction antibodies (U.S. Pat. No. 5,639,641);
−ヒト化抗体または完全ヒト抗体(ヒト化抗体または完全ヒト抗体は、限定されないが、huMy9−6、huB4、huC242、huN901、DS6、CD38、IGF−IR、CNTO95、B−B4、トラスツヅマブ、ビバツヅマブ、シブロツヅマブ、ペルツヅマブおよびリツキシマブ(例えば、米国特許第5,639,641号、同第5,665,357号、および同第7,342,110号;米国仮特許出願第60/424,332号、国際特許出願WO02/16,401号、米国特許出願公開第20060045877号、米国特許出願公開第20060127407号、米国特許出願公開第20050118183号、Pedersenら(1994)J.Mol.Biol.235,959−973,Roguska - humanized antibodies or fully human antibodies (humanized antibodies or fully human antibodies include, but are not limited to, huMy9-6, huB4, huC242, huN901, DS6, CD38, IGF-IR, CNTO95, B-B4, trastuzumab, Bibatsudzumabu, Shiburotsudzumabu, Perutsudzumabu and rituximab (see, e.g., U.S. Patent No. 5,639,641, the No. 5,665,357, and the No. 7,342,110; U.S. provisional Patent application No. 60 / 424,332, International Patent application WO02 / 16,401, U.S. Patent application Publication No. 20060045877, U.S. Patent application Publication No. 20060127407, U.S. Patent application Publication No. 20,050,118,183, Pedersen et al. (1994) J.Mol.Biol.235,959-973, Roguska 、(1994) Proceedings of the National Academy of Sciences,Vol91,969−973,Colomerら、Cancer Invest.,19:49−56(2001),Heiderら、Eur.J.Cancer,31A:2385−2391(1995),Weltら、J.Clin.Oncol.,12:1193−1203(1994)、およびMaloneyら、Blood,90:2188−2195(1997));ならびに −抗体のエピトープ結合フラグメント、例えば、sFv、Fab、Fab'、およびF(ab') (Parham,J.Immunol.131:2895−2902(1983);Springら、J.Immunol.113:47 , (1994) Proceedings of the National Academy of Sciences, Vol91,969-973, Colomer et al., Cancer Invest, 19:. 49-56 (2001), Heider et al., Eur.J.Cancer, 31A: 2385-2391 (1995 .), Welt et al., J.Clin.Oncol, 12: 1193-1203 (1994), and Maloney et al., Blood, 90: 2188-2195 (1997)); and - epitope-binding fragments of antibodies, for example, sFv, Fab , Fab ', and F (ab') 2 (Parham , J.Immunol.131: 2895-2902 (1983); Spring et al., J.Immunol.113: 47 〜478(1974);Nisonoffら、Arch.Biochem.Biophys.89:230〜244(1960)); ~478 (1974); Nisonoff et al., Arch.Biochem.Biophys.89: 230~244 (1960));
が挙げられる。 And the like.

さらなる細胞結合剤として、限定されないが: As a further cell-binding agents include, but are not limited to:
−アンキリンリピートタンパク質(DARPin;Zahndら、J.Biol.Chem.,281,46,35167−35175,(2006);Binz,H.K.,Amstutz,P.& Pluckthun,A.(2005)Nature Biotechnology,23,1257−1268)、または、例えば米国特許出願公開第20070238667号;米国特許第7,101,675号;WO/2007/147213;およびWO/2007/062466に記載されているアンキリン様リピートタンパク質もしくは合成ペプチド); - ankyrin repeat protein (DARPin;... Zahnd et al., J.Biol.Chem, 281,46,35167-35175, (2006); Binz, H.K., Amstutz, P & Pluckthun, A (2005) Nature Biotechnology , 23,1257-1268), or, for example, US Patent application Publication No. 20070238667; U.S. Pat. No. 7,101,675; WO / 2007/147213; and WO / 2007/062466 ankyrin-like repeat protein that is described in or synthetic peptides);
−インターフェロン(例えばα、β、γ); - interferon (e.g. α, β, γ);
−リンホカイン、例えばIL−2、IL−3、IL−4、IL−6; - lymphokines, e.g. IL-2, IL-3, IL-4, IL-6;
−ホルモン、例えば、インスリン、TRH(チロトロピン放出ホルモン)、MSH(メラノサイト刺激ホルモン)、ステロイドホルモン、例えばアンドロゲンおよびエストロゲン;ならびに−成長因子およびコロニー刺激因子、例えばEGF、TGF−α、IGF−I、G−CSF、M−CSFおよびGM−CSF(Burgess,Immunology Today 5:155−158(1984)); - hormones, such as insulin, TRH (thyrotropin releasing hormone), MSH (melanocyte-stimulating hormone), steroid hormones, such as androgens and estrogens; and - growth factors and colony-stimulating factors, for example EGF, TGF-α, IGF-I, G -CSF, M-CSF and GM-CSF (Burgess, Immunology Today 5: 155-158 (1984));
によって例示される他の細胞結合性タンパク質およびポリペプチドが挙げられる。 It includes other cell-binding proteins and polypeptides exemplified by.

細胞結合剤は、抗体である場合、ポリペプチドでありかつ膜貫通分子(例えば受容体)であり得る抗原、またはリガンド、例えば成長因子に結合する。 Cell binding agent, if an antibody, an antigen can be a a polypeptide and a transmembrane molecule (e.g. receptor) or ligand, binds to, for example, growth factors. 例示的な抗原として、分子、例えば、レニン;ヒト成長ホルモンおよびウシ成長ホルモンを含む成長ホルモン;成長ホルモン放出ホルモン;副甲状腺ホルモン;甲状腺刺激ホルモン;リポタンパク質;α−1−アンチトリプシン;インスリンA鎖;インスリンB鎖;プロインスリン;卵胞刺激ホルモン;カルシトニン;黄体形成ホルモン;グルカゴン;凝固因子、例えばvmc因子、IX因子、組織因子(TF)、およびフォンビルブラント因子;抗凝固因子、例えばプロテインC;心房性ナトリウム利尿因子;肺表面活性物質;プラスミノーゲン活性化因子、例えばウロキナーゼもしくはヒトの尿、または組織タイプのプラスミノーゲン活性化剤(t−PA);ボンベシン;トロンビン;造血性成長因子;腫瘍壊死因子−αおよび−β;エン Exemplary antigens, molecules, e.g., renin, a growth hormone releasing hormone; parathyroid hormone; thyroid stimulating hormone; lipoproteins; alpha-1-antitrypsin; insulin A-chain growth hormone, including human growth hormone and bovine growth hormone ; insulin B-chain; proinsulin; follicle stimulating hormone; calcitonin; luteinizing hormone; glucagon; clotting factors such vmc factors, IX factor, tissue factor (TF), and von Willebrand factor; anti-clotting factors such as protein C; atrial natriuretic factor; lung surfactant; plasminogen activator, for example urokinase or human urine or tissue-type plasminogen activator (t-PA); bombesin; thrombin; hemopoietic growth factor; tumor necrosis factor -α and -β; ene ファリナーゼ;RANTES(regulated on activation normally T−cell expressed and secreted);ヒトマクロファージ炎症性タンパク質(MIP−I−α);血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミン;ミュラー管抑制物質;リラキシンA鎖;リラキシンB鎖;プロリラキシン;マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド;微生物タンパク質、例えばβラクタマーゼ;DNアーゼ;IgE;細胞毒性T−リンパ球関連抗原(CTLA)、例えばCTLA−4;インヒビン;アクチビン;血管内皮成長因子(VEGF);ホルモンまたは成長因子の受容体;プロテインAまたはD;リウマチ因子;神経栄養因子、例えば骨由来神経栄養因子(BDNF)、ニューロトロフィン−3、 Farinaze; RANTES (regulated on activation normally T-cell expressed and secreted); human macrophage inflammatory protein (MIP-I-α); serum albumin, such as human serum albumin; mullerian-inhibiting substance; relaxin A-chain; relaxin B-chain; prorelaxin; mouse gonadotropin-associated peptide; microbial protein, such as β-lactamase; DN DNase; IgE; cytotoxic T- lymphocyte associated antigen (CTLA), such as CTLA-4; inhibin; activin; vascular endothelial growth factor (VEGF) ; receptor hormone or growth factor; protein a or D; rheumatoid factor; neurotrophic factor such as bone-derived neurotrophic factor (BDNF), neurotrophin-3, −4、−5もしくは−6(NT−3、NT4、NT−5またはNT−6)、または神経成長因子、例えばNGF−β;血小板由来成長因子(PDGF);線維芽細胞成長因子、例えばaFGFおよびbFGF;上皮成長因子(EGF);トランスフォーミング成長因子(TGF)、例えばTGF−αおよびTGF−β:TGF−β1、TGF−β2、TGF−β3、TGF−β4またはTGF−β5を含む;インスリン様成長因子−Iおよび−II(IGF−IおよびIGF−II);デス(1−3)−IGF−I(脳IGF−I)、インスリン様成長因子結合タンパク質、EpCAM、GD3、FLT3、PSMA、PSCA、MUC1、MUC16、STEAP、CEA、TENB2、EphA受容体、EphB受容体、葉酸受容体、FOLR -4, -5, or -6 (NT-3, NT4, NT-5 or NT-6), or nerve growth factors such as NGF-beta; platelet-derived growth factor (PDGF); fibroblast growth factors such as aFGF and bFGF; epidermal growth factor (EGF); transforming growth factor (TGF), e.g. TGF-alpha and TGF-β: TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, including TGF-beta4 or TGF-.beta.5; insulin like growth factor -I and -II (IGF-I and IGF-II); des (1-3) -IGF-I (brain IGF-I), insulin-like growth factor binding protein, EpCAM, GD3, FLT3, PSMA, PSCA, MUC1, MUC16, STEAP, CEA, TENB2, EphA receptors, EphB receptor, folate receptor, FOLR 1、メソテリン、クリプト、α β 、インテグリン、VEGF、VEGFR、トランスフェリン受容体、IRTA1、IRTA2、IRTA3、IRTA4、IRTA5;CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD8、CD11、CD14、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD26、CD28、CD30、CD33、CD36、CD37、CD38、CD40、CD44、CD52、CD55、CD56、CD59、CD70、CD79、CD80、CD81、CD103、CD105、CD134、CD137、CD138、CD152;エリスロポエチン;骨誘導因子;イムノトキシン;骨形態形成タンパク質(BMP);インターフェロン、例えばインターフェロン−α、−β、および−γ 1, mesothelin, cryptoxanthin, alpha v beta 6, integrins, VEGF, VEGFR, transferrin receptor, IRTA1, IRTA2, IRTA3, IRTA4 , IRTA5; CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD8, CD11, CD14, CD19, CD20 , CD21, CD22, CD23, CD25, CD26, CD28, CD30, CD33, CD36, CD37, CD38, CD40, CD44, CD52, CD55, CD56, CD59, CD70, CD79, CD80, CD81, CD103, CD105, CD134, CD137 , CD138, CD152; erythropoietin; osteoinductive factors; immunotoxins; a bone morphogenetic protein (BMP); an interferon such as interferon-.alpha.,-beta, and -γ コロニー刺激因子(CSF)、例えばM−CSF、GM−CSFおよびG−CSF;インターロイキン(IL)、例えばIL−1〜IL−10;スーパーオキシドジスムターゼ;T細胞受容体;表面膜タンパク質;崩壊促進因子;ウイルス抗原、例えばHIVエンベロープの一部;輸送タンパク質;ホーミング受容体;アドレシン;調節タンパク質;インテグリン、例えばCD11a、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、VLA−4およびVCAM;腫瘍関連抗原、例えばHER2、HER3またはHER4受容体;ならびに先に列挙したポリペプチドのいずれかのフラグメント、抗体模倣体アドネクチン(米国特許出願第20070082365号)、または1種以上の腫瘍関連抗原もしくは細胞表面受容体に結合する抗体: Colony stimulating factor (CSF), for example, M-CSF, GM-CSF and G-CSF; interleukins (IL), for example IL-1 to IL-10; superoxide dismutase; T-cell receptor; surface membrane proteins; decay accelerating factor; viral antigen, for example, a portion of the HIV envelope; transport proteins; homing receptors; addressins; regulatory proteins; integrins, for example CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ICAM, VLA-4 and VCAM; tumor associated antigens, for example HER2, HER3 or HER4 receptor; and fragments of any of the polypeptides listed above, antibody mimics Adnectins (US Patent application No. 20070082365), or one or more tumor-associated antigens or antibodies that bind to cell surface receptors: 全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第20080171040号または米国特許出願公開第20080305044号に開示されているものが挙げられる。 Whole include those disclosed in U.S. Patent Application Publication No. 20080171040 or US Patent Application Publication No. 20080305044, incorporated herein by reference.

さらに、骨髄細胞に結合するGM−CSFが、急性骨髄性白血病由来の罹患細胞に対する細胞結合剤として用いられ得る。 Additionally, GM-CSF which binds to myeloid cells can be used as a cell binding agent to diseased cells from acute myelogenous leukemia. 活性T細胞に結合するIL−2は、移植の移植片拒絶の予防のために、移植片対宿主疾患の治療および予防のために、ならびに急性T細胞性白血病の処置のために用いられ得る。 IL-2 which binds to activated T cells, for the prevention of graft rejection of transplanted for the treatment and prevention of graft-versus-host disease, as well as be used for the treatment of acute T-cell leukemia. メラノサイトに結合するMSHは、黒色腫の処置のために用いられ得る。 MSH which binds to melanocytes, can be used for the treatment of melanoma. 葉酸が用いられて、卵巣および他の腫瘍に発現する葉酸受容体を標的化することができる。 Folic acid is used, the folate receptor expressed on ovarian and other tumors can be targeted. 上皮成長因子が用いられて、扁平上皮癌、例えば肺癌および頭頚部癌を標的化することができる。 Used is epidermal growth factor, squamous cell carcinoma, e.g., lung cancer and head and neck cancer can be targeted. ソマトスタチンが用いられて、神経芽細胞腫および他の腫瘍タイプを標的化することができる。 Somatostatin is used, neuroblastoma and other tumor types can be targeted.

乳腺および精巣の癌は、それぞれ細胞結合剤としてのエストロゲン(またはエストロゲンアナログ)またはアンドロゲン(またはアンドロゲンアナログ)によって成功裏に標的化され得る。 Cancer of breast and testes can be targeted successfully estrogen as each cell binding agent (or estrogen analogues) or androgen (or androgen analog).

本発明に包含される抗体に対する好ましい抗原として、CDタンパク質、例えば、CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD8、CD11、CD14、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD25、CD26、CD27、CD28、CD30、CD33、CD36、CD37、CD38、CD40、CD44、CD52、CD55、CD56、CD70、CD79、CD80、CD81、CD103、CD105、CD134、CD137、CD138、およびCD152;ErbB受容体ファミリーのメンバー、例えば、EGF受容体、HER2、HER3またはHER4受容体;細胞接着分子、例えば、LFA−1、Mac1、pi50.95、VLA−4、ICAM−1、VCAM、EpCAM、α4/β7イ Preferred antigens for antibodies encompassed by the present invention, CD proteins such, CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD8, CD11, CD14, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD25, CD26, CD27, CD28 , CD30, CD33, CD36, CD37, CD38, CD40, CD44, CD52, CD55, CD56, CD70, CD79, CD80, CD81, CD103, CD105, CD134, CD137, CD138, and CD152; ErbB receptor family members, e.g. , EGF receptor, HER2, HER3 or HER4 receptor; cell adhesion molecules, for example, LFA-1, Mac1, pi50.95, VLA-4, ICAM-1, VCAM, EpCAM, α4 / β7 Lee ンテグリン、およびα /β インテグリン(そのαまたはβサブユニットを含む)(例えば、抗−CD11a、抗−CD18または抗−CD11b抗体);成長因子、例えばVEGF;組織因子(TF);TGF−β;αインターフェロン(α−IFN);インターロイキン、例えばIL−8;IgE;血液型抗原Apo2、デス受容体;flk2/flt3受容体;肥満(OB)受容体;mpl受容体;CTLA−4;プロテインCなどが挙げられる。 Integrin, and alpha v / beta 3 integrin (including its alpha or beta subunit) (e.g., anti -CD11a, anti -CD18 or anti -CD11b antibodies); growth factors such as VEGF; tissue factor (TF); TGF- beta; alpha interferon (alpha-IFN); interleukins such IL-8; IgE; blood group antigens Apo2, death receptor; flk2 / flt3 receptor; obesity (OB) receptor; mpl receptor; CTLA-4; such as protein C, and the like. 本明細書において最も好ましい標的は、IGF−IR、CanAg、EphA2、MUC1、MUC16、VEGF、TF、CD19、CD20、CD22、CD33、CD37、CD38、CD40、CD44、CD56、CD138、CA6、Her2/neu、EpCAM、クリプト(大部分のヒト乳癌細胞において高レベルで産生されるタンパク質)、ダルピン、α /β インテグリン、α /β インテグリン、α /β インテグリン、TGF−β、CD11a、CD18、Apo2およびC242、または、全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第20080171040号もしくは米国特許出願公開第20080305044号に開示されている、1以上の腫瘍関連抗原もしくは細胞表面受容体 The most preferred target herein, IGF-IR, CanAg, EphA2, MUC1, MUC16, VEGF, TF, CD19, CD20, CD22, CD33, CD37, CD38, CD40, CD44, CD56, CD138, CA6, Her2 / neu , EpCAM, crypt (protein produced at high levels in the majority of human breast cancer cells), DARPins, alpha v / beta 3 integrin, alpha v / beta 5 integrin, alpha v / beta 6 integrin, TGF-beta, CD11a, CD18, Apo2 and C242, or a whole is disclosed in U.S. Patent application Publication No. 20080171040 or US Publication No. 20080305044, incorporated herein by reference, one or more tumor-associated antigens or cell-surface receptors 結合する抗体が挙げられる。 Antibodies that bind, and the like.

本発明に包含される抗体に対する好ましい抗原として、CDタンパク質、例えばCD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD34、CD37、CD38、CD46、CD56およびCD138;ErbB受容体ファミリーのメンバー、例えばEGF受容体、HER2、HER3またはHER4受容体;細胞接着タンパク質、例えばLFA−1、Mac1、p150.95、VLA−4、ICAM−1、VCAM、EpCAM、α4/β7インテグリン、およびαv/β3インテグリン(そのαまたはβサブユニットを含む)(例えば、抗−CD11a、抗−CD18または抗−CD11b抗体);成長因子、例えばVEGF;組織因子(TF);TGF−β;αインターフェロン(αIFN);インターロイキン、例えばIL−8;IgE Preferred antigens for antibodies encompassed by the present invention, CD proteins such CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD34, CD37, CD38, CD46, CD56 and CD138; ErbB receptor family members, for example, EGF receptor, HER2, HER3 or HER4 receptor; cell adhesion proteins, e.g. LFA-1, Mac1, p150.95, VLA-4, ICAM-1, VCAM, EpCAM, α4 / β7 integrin, and .alpha.v / .beta.3 integrin (the α or β including subunit) (e.g., anti -CD11a, anti -CD18 or anti -CD11b antibodies); growth factors such as VEGF; tissue factor (TF); TGF-beta; alpha interferon (alpha IFN); interleukins such IL- 8; IgE 血液型抗原Apo2、デス受容体;flk2/flt3受容体;肥満(OB)受容体;mpl受容体;CTLA−4;プロテインCなども挙げられる。 Blood group antigens Apo2, death receptor; flk2 / flt3 receptor; obesity (OB) receptor; mpl receptor; CTLA-4; such as protein C can also be mentioned. 本発明において最も好ましい標的は、IGF−IR、CanAg、EGF−R、EphA2、MUC1、MUC16、VEGF、TF、CD19、CD20、CD22、CD33、CD37、CD38、CD40、CD44、CD56、CD138、CA6、Her2/neu、クリプト(大部分のヒト乳癌細胞において高レベルで産生されるタンパク質)、α /β インテグリン、α /β インテグリン、TGF−β、CD11a、CD18、Apo2、EpCAMおよびC242である。 The most preferred target in the present invention, IGF-IR, CanAg, EGF-R, EphA2, MUC1, MUC16, VEGF, TF, CD19, CD20, CD22, CD33, CD37, CD38, CD40, CD44, CD56, CD138, CA6, her2 / neu, crypt (protein produced at high levels in the majority of human breast cancer cells), α v / β 3 integrin, alpha v / beta 5 integrin, in TGF-β, CD11a, CD18, Apo2, EpCAM and C242 is there.

モノクローナル抗体技術により、モノクローナル抗体の形態の特異的細胞結合剤の製造を可能にする。 By monoclonal antibody technology allows the production of specific cell binding agents in the form of monoclonal antibodies. 当該分野において特に周知のものは、マウス、ラット、ハムスター、またはいずれかの他の哺乳動物を、目的とする抗原、例えば無傷の標的細胞、標的細胞から分離された抗原、全ウイルス、弱毒化した全ウイルス、およびウイルスタンパク質、例えばウイルスコートタンパク質で免疫化することにより産生されるモノクローナル抗体を作製するための技術である。 Especially those known in the art, mouse, rat, hamster or any other mammalian, and antigen, such as an intact target cell, antigens isolated from the target cell, whole virus, attenuated intended whole virus, and viral proteins such as viral coat proteins is a technique for producing monoclonal antibody produced by immunizing. 感作されたヒト細胞も用いられ得る。 Sensitized human cells can also be used. モノクローナル抗体を作製する別の方法は、sFv(一本鎖可変領域)、特にヒトsFvのファージライブラリーの使用である(例えば、Griffithsら、米国特許第5,885,793号;McCaffertyら、WO92/01047;Limingら、WO99/06587)。 Another method of making monoclonal antibodies, sFv (single chain variable region), in particular the use of phage libraries of human sFv (e.g., Griffiths et al., U.S. Patent No. 5,885,793; McCafferty et al, WO92 / 01047; Liming et al., WO99 / ​​06587).

適切な細胞結合剤の選択は、標的化されるべき特定の細胞集団に依存する選択肢であるが、適切なものが利用可能であるならば、一般にモノクローナル抗体およびそのエピトープ結合フラグメントが好ましい。 Selection of the appropriate cell binding agent is a choice that depends upon the particular cell population to be targeted, if appropriate are available, typically monoclonal antibodies and epitope binding fragments thereof are preferred.

例えば、モノクローナル抗体My9は、急性骨髄性白血病(AML)細胞上に見出されるCD33抗原に対して特異的なネズミIgG 2a抗体であり(Royら、Blood 77:2404−2412(1991))、AML患者を処置するのに用いられ得る。 For example, the monoclonal antibody My9 is a specific murine IgG 2a antibody against acute myeloid leukemia (AML) CD33 antigen found on the cell (Roy et al., Blood 77: 2404-2412 (1991) ), AML patients It can be used to treat. 同様に、モノクローナル抗体、抗−B4は、B細胞上のCD19抗原に結合するネズミIgGiであり(Nadlerら、J.Immunol.131:244−250(1983))、非ホジキンリンパ腫または慢性リンパ芽球性白血病の場合などの標的細胞がこの抗原を発現するB細胞または罹患細胞であるとき用いられ得る。 Similarly, monoclonal antibodies, anti -B4 are murine IgGi, that binds to the CD19 antigen on B cells (Nadler et al., J.Immunol.131: 244-250 (1983)), non-Hodgkin's lymphoma or chronic lymphoblastic target cells, such as the case of sexual leukemia may be used when a B cell or diseased cells that express this antigen. 抗体N901は、小細胞性肺癌腫細胞上および神経内分泌由来の他の腫瘍の細胞上に見出されるCD56に結合するネズミモノクローナルIgGi抗体である(Royら、J.Nat.Cancer Inst.88:1136−1145(1996));huC242はCanAg抗原に結合する抗体である;トラスツヅマブはHER2/neuに結合する抗体である;抗EGF受容体抗体はEGF受容体に結合する。 Antibody N901 is a murine monoclonal IgGi antibody that binds to CD56 found on cells of other tumors derived from small cell lung carcinoma cells and on neuroendocrine (Roy et al., J.Nat.Cancer Inst.88: 1136- 1145 (1996)); huC242 is an antibody that binds to the CanAg antigen; trastuzumab is an antibody that binds to HER2 / neu; anti-EGF receptor antibody binds to EGF receptor.

C. C. 薬物本発明に用いられる薬物は、細胞結合剤に連結され得る細胞毒性薬物である。 Drugs used in the drug present invention are cytotoxic drugs that can be linked to cell binding agents. 好適な薬物の例にとして、メイタンシノイド、DNA結合性薬物、例えばCC−1065およびそのアナログ、カリケアマイシン、ドキソルビシンおよびそのアナログ、ビンカアルカロイド)、クリプトフィシン、ドラスタチン、オーリスタチンおよびそのアナログ、ツブライシン、エポチロン、タキソイド、およびsiRNAが挙げられる。 As examples of suitable drugs, maytansinoids, DNA-binding drugs, e.g., CC-1065 and its analogs, calicheamicin, doxorubicin and its analogs, vinca alkaloids), cryptophycin, dolastatin, auristatin and analogs thereof, Tsuburaishin , epothilones, taxoids, and siRNA and the like.

好ましいメイタンシノイドは、米国特許第5,208,020号;同第5,416,064号;同第6,333.410号;同第6,441,163号;同第6,716,821;RE39,151および同第7,276,497号に記載されているものである。 Preferred maytansinoids are disclosed in U.S. Patent No. 5,208,020; Nos 5,416,064; the No. 6,333.410; Nos 6,441,163; the 6,716,821 ; RE39,151 and those described in the No. 7,276,497. 好ましいCC−1065アナログは、米国特許第5,475,092号;同第5,595,499号;同第5,846,545号;同第6,534,660号;同第6,586,618号;同第6,756,397号および同第7,049,316に記載されているものである。 Preferred CC-1065 analogs are described in U.S. Pat. No. 5,475,092; the first 5,595,499 Patent; the 5,846,545 Patent; the second 6,534,660 Patent; the first 6,586, 618 No.; are those described in the first 6,756,397 and EP 7,049,316. 好ましいドキソルビシンおよびそのアナログは、米国特許第6,630,579号に記載されているものである。 Preferred doxorubicin and its analogs are those described in U.S. Patent No. 6,630,579. 好ましいタキソイドは、米国特許第6,340,701号;同第6,372,738号;同第6.436,931号;同第6,596,757号;同第6,706,708号;同第7,008,942号;同第7,217,819号および同第7,276,499号に記載されているものである。 Preferred taxoids, U.S. Pat. Nos. 6,340,701; Nos 6,372,738; the No. 6.436,931; same No. 6,596,757; the No. 6,706,708; the No. 7,008,942; those that are described in the No. and the No. 7,276,499 7,217,819. カリケアマイシンは、米国特許第5,714,586号および同第5739,116号に記載されている。 Calicheamicin is described in U.S. Pat. No. 5,714,586 and EP 5739,116.

ビンカアルカロイド化合物、ドラスタチン化合物、およびクリプトフィシン化合物は、WO01/24763に詳細に記載されている。 Vinca alkaloid compounds, dolastatin compounds, and cryptophycin compounds are described in detail in WO01 / 24763. オーリスタチンとして、オーリスタチンE、オーリスタチンEB(AEB)、オーリスタチンEFP(AEFP)、モノメチルオーリスタチンE(MMAE)が挙げられ、米国特許第5,635,483号、Int. As auristatin, auristatin E, auristatin EB (AEB), auristatin EFP (AEFP), monomethyl auristatin E (MMAE) can be mentioned, U.S. Patent No. 5,635,483, Int. J. J. Oncol. Oncol. 15:367−72(1999);Molecular Cancer Therapeutics,vol. 15: 367-72 (1999); Molecular Cancer Therapeutics, vol. 3,No. 3, No. 8,pp. 8, pp. 921−932(2004);米国特許出願第11/134826号、米国特許出願公開第20060074008号、同第2006022925号に記載されている。 921-932 (2004); U.S. Patent Application No. 11/134826, U.S. Patent Application Publication No. 20060074008, are described in Nos. No. 2006022925. ツブライシン化合物は、米国特許出願公開第20050249740号に記載されている。 Tsuburaishin compounds are described in U.S. Patent Application Publication No. 20050249740. クリプトフィシン化合物は、米国特許第6,680,311号および同第6,747,021号に記載されている。 Cryptophycin compounds are described in U.S. Pat. No. 6,680,311 and EP 6,747,021. エポチロンは、米国特許第6,956,036号および同第6,989,450号に記載されている。 Epothilones are described in U.S. Pat. No. 6,956,036 and EP 6,989,450.

siRNAは、米国特許出願公開第20070275465号、同第20070213292号、同第20070185050号、同第20070161595号、同第20070054279号、同第20060287260号、同第20060035254号、同第20060008822号、同第20050288244号、同第20050176667号に詳細に記載されている。 siRNA are described in U.S. Patent Application Publication No. 20070275465, the No. 20070213292, the No. 20070185050, the No. 20070161595, the No. 20070054279, the No. 20060287260, the No. 20060035254, the No. 20060008822, the No. 20050288244 , it is described in detail in Nos. No. 20050176667.

アナログおよび誘導体細胞毒性剤の当業者は、本明細書に記載されている細胞毒性剤のそれぞれが、得られる化合物が出発化合物の特異性および/または活性を依然として保持する様式で修飾され得ることを容易に理解するであろう。 That those skilled in the analogs and derivatives cytotoxic agent, each of which cytotoxic agents are described herein, the resulting compound can be modified in a manner that still retains the specificity and / or activity of the starting compound It will readily understand. 当業者は、これらの化合物の多くが本明細書に記載されている細胞毒性剤の代わりに用いられ得ることも理解するであろう。 Those skilled in the art will also appreciate that many of these compounds may be used in place of the cytotoxic agents described herein. したがって、本発明の細胞毒性剤には、本明細書に記載されている化合物のアナログおよび誘導体が含まれる。 Thus, the cytotoxic agent of the invention include analogs and derivatives of the compounds described herein.

細胞結合剤は、これまでに記載されている方法(米国特許第6,013,748号;同第6,441,1631号、および同第6,716,821号;米国特許出願公開第20050169933号;ならびにWO2006/034488A2)によって細胞毒性薬物にコンジュゲートされ得る。 Cell binding agent, this method has been described previously (U.S. Pat. No. 6,013,748; the No. 6,441,1631, and Nos. 6,716,821; U.S. Patent Application Publication No. 20050169933 ; and WO2006 / 034488A2) may be conjugated to cytotoxic drugs by.

治療的用途本発明の細胞結合剤−薬物コンジュゲート(例えばイムノコンジュゲート)は、化学治療剤とも併用され得る。 Cell binding agent therapeutic applications present invention - drug conjugates (e.g., immunoconjugates) can be used in combination with chemotherapeutic agents. かかるそのような化学治療剤は、米国特許第7,303,749号に記載されている Such Such chemotherapeutic agents are described in U.S. Patent No. 7,303,749

本発明の細胞結合剤−薬物コンジュゲート(例えば、イムノコンジュゲート)は、インビトロ、インビボおよび/またはエクスビボで投与されて、患者を処置し、および/または選択された細胞集団の成長を調節することができ、これには、例えば以下が含まれる:肺、血液、血漿、乳腺、大腸、前立腺、腎臓、膵臓、脳、骨、卵巣、精巣、およびリンパ器官の癌;自己免疫疾患、例えば全身性狼瘡、関節リウマチ、および多発性硬化症;移植片拒絶、例えば腎移植拒絶、肝移植拒絶、肺移植拒絶、心臓移植拒絶、および骨髄植拒絶;移植片対宿主疾患;ウイルス感染症、例えばCMV感染症、HIV感染症、およびAIDS;ならびに寄生虫感染症、例えばジアルジア症、アメーバ症、住血吸虫症など。 Cell binding agent of the present invention - drug conjugates (e.g., immunoconjugates) in vitro, is administered in vivo and / or ex vivo, to regulate the growth of treated patients, and / or selected cell populations can be, this includes for example the following: lung, blood, plasma, breast, colon, prostate, kidney, pancreas, brain, bones, ovary, testes, and lymphatic organs cancer; autoimmune diseases such as systemic lupus lupus, rheumatoid arthritis, and multiple sclerosis; graft rejection, such as renal transplant rejection, liver transplant rejection, lung transplant rejection, cardiac transplant rejection, and bone marrow explants rejection; graft versus host disease; viral infections such as CMV infection disease, HIV infection, and AIDS; and parasitic infections, for example giardiasis, amebiasis, such as schistosomiasis. 好ましくは、本発明のイムノコンジュゲートおよび化学治療剤は、インビトロ、インビボおよび/またはエクスビボで投与されて、患者の癌を処置し、および/または癌細胞の成長を調節することができ、これには例えば血液、血漿、肺、乳腺、大腸、前立腺、腎臓、膵臓、脳、骨、卵巣、精巣、およびリンパ器官の癌;より好ましくは肺、大腸前立腺、血漿、血液または大腸の癌が含まれる。 Preferably, the immunoconjugate and chemotherapeutic agents of the present invention, in vitro, is administered in vivo and / or ex vivo, to treat cancer patients, and / or can regulate the growth of cancer cells, in this for example blood, plasma, lung, breast, colon, prostate, kidney, pancreas, brain, bones, ovary, testes, and lymphatic organs; contained more preferably lung, colon prostate, blood plasma, cancer of the blood or large intestine . 最も好ましい態様において、癌は多発性骨髄腫である。 In a most preferred embodiment, the cancer is multiple myeloma.

「選択された細胞集団の成長を調節する」こととして、選択された細胞集団(例えば多発性骨髄腫の細胞集団、例えばMOLP−8細胞、OPM2細胞、H929細胞など)の分裂による増殖によりさらなる細胞を生ずることを阻害すること;例えば非処置細胞と比較して、細胞分裂が増加する速度を低下させること;選択された細胞集団を死滅させること;および/または選択された細胞集団(例えば癌細胞)が転移するのを防止することが含まれる。 As to "regulate the growth of selected cell populations", (cell populations such as multiple myeloma, for example, MOLP-8 cells, OPM2 cells, H929 cells, etc.) were selected cell populations further cell by proliferation by division it inhibits the produce; as compared to for example non-treated cells, it reduces the rate at which cell division is increased; that killing selected cell populations; and / or selected cell populations (e.g., a cancer cell ) it is included to prevent metastasis. 選択された細胞集団の成長は、インビトロ、インビボまたはエクスビボで調節され得る。 Growth of selected cell populations in vitro, can be regulated in vivo or ex vivo.

本発明の方法において、細胞結合剤−薬物コンジュゲート(例えばイムノコンジュゲート)が、インビトロ、インビボまたはエクスビボで投与され得る。 In the method of the present invention, the cell binding agent - drug conjugates (e.g., immunoconjugates) can vitro, can be administered in vivo or ex vivo. 細胞結合剤−薬物コンジュゲート(例えばイムノコンジュゲート)は、好適な、薬学的に許容される担体、希釈剤および/または賦形剤と共に用いられ得、これらは周知であり、臨床状況に応じて当業者によって決定され得る。 Cell binding agent - drug conjugates (e.g., immunoconjugates) a suitable, pharmaceutically acceptable carrier, the resulting used with diluents and / or excipients, which are well known, depending on the clinical situation It can be determined by those skilled in the art. 適切な担体、希釈剤および/または賦形剤の例として:(1)約1mg/ml〜25mg/mlのヒト血清アルブミンを含有する、ダルベッコのリン酸緩衝化生理食塩水、pH約6.5、(2)0.9%生理食塩水(0.9% w/v NaCl)、および(3)5%(w/v)デキストロースが挙げられる。 Suitable carriers, examples of diluents and / or excipients: (1) about 1 mg / 25 mg / ml of containing human serum albumin, phosphate buffered saline Dulbecco, pH about 6.5 , (2) 0.9% saline (0.9% w / v NaCl), and (3) include 5% (w / v) dextrose.

本明細書に記載されている化合物および組成物は、適切な形態で、好ましくは非経口的に、より好ましくは静脈内に投与されてよい。 The compounds and compositions described herein, in an appropriate form, preferably parenterally, more preferably may be administered intravenously. 非経口投与のために、化合物または組成物は、水性または非水性の無菌の液剤、懸濁液または乳剤であり得る。 For parenteral administration, the compound or composition, solution in aqueous or non-aqueous sterile, may be suspensions or emulsions. プロピレングリコール、植物油、および注射可能な有機エステル、例えば、オレイン酸エチルが、溶剤またはビヒクルとして用いられ得る。 Propylene glycol, vegetable oils, and injectable organic esters such as ethyl oleate may be used as the solvent or vehicle. 組成物は、助剤、乳化剤または分散剤を含有することもできる。 The composition may also contain auxiliaries, emulsifiers or dispersing agents.

該組成物は、無菌水またはいずれかの他の注射可能な無菌媒体に溶解または分散され得る無菌固体組成物の形態であってもよい。 The composition may be in the form of a sterile water or any other injectable sterile medium dissolved or sterile solid compositions which can be dispersed.

本明細書に記載されている細胞結合剤−薬物コンジュゲート(例えばイムノコンジュゲート)の「治療有効量」は、選択された細胞集団の成長を調節しおよび/または患者の疾患を処置するための投薬計画を称し、患者の年齢、体重、性別、食事および医学的状態、疾患の重症度、投与経路、ならびに薬理学的考慮事項、例えば、用いられる特定の化合物の活性、効能、薬物動態および毒性プロファイルを含めた種々の因子に従って選択される。 Cell binding agents are described herein - "therapeutically effective amount" of a drug conjugate (e.g., immunoconjugates) is to treat adjusted and / or the patient's disease growth of selected cell populations referred to regimen, patient's age, weight, sex, diet and medical condition of the subject, the severity of the disease, the route of administration, and pharmacological considerations, such as the activity of the specific compound employed, efficacy, pharmacokinetics and toxicity It is selected in accordance with a variety of factors including the profile. 「治療有効量」は、標準的な医療テキスト、例えばPhysicians Desk Reference 2004を参照して決定することもできる。 "Therapeutically effective amount" can also be determined by reference to standard medical texts, such as the Physicians Desk Reference 2004. 患者は、好ましくは動物、より好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトである。 Patient is preferably an animal, more preferably a mammal, most preferably a human. 患者は雄または雌であってよく、乳児、小児または成人であってよい。 The patient may be a male or female, infant, it may be a child or adult.

細胞結合剤−薬物コンジュゲート(例えばイムノコンジュゲート)投与の好適なプロトコルの例は、以下の通りである。 Cell binding agent - Examples of drug conjugates (e.g., immunoconjugates) suitable protocol of administration are as follows. コンジュゲートは、毎日の静脈内ボーラスとして約5日間、または約5日間の連続注入として、1日1回、約5日間与えられ得る。 Conjugates, as a continuous infusion as an intravenous bolus daily for about 5 days, or about 5 days, once a day may be given about 5 days.

代替的には、コンジュゲートは、週1回、6週間以上投与され得る。 Alternatively, conjugates, once a week, can be administered more than 6 weeks. 別の代替法として、コンジュゲートは、2または3週毎に1回投与され得る。 As another alternative, the conjugates can be administered once every two or three weeks. ボーラス用量は、約50〜約400mlの通常の生理食塩水中で与えられ、これに約5〜約10mlのヒト血清アルブミンが添加され得る。 Bolus dose is given in normal saline from about 50 to about 400 ml, human serum albumin from about 5 to about 10ml thereto may be added. 連続注入は、24時間の期間あたり、約250〜約500mlの通常の生理食塩水中で与えられ、これに約25〜約50mlのヒト血清アルブミンが添加され得る。 Continuous infusion, per 24 hour period is given in normal saline from about 250 to about 500 ml, human serum albumin from about 25 to about 50ml thereto may be added. 投与量は、静脈内に一人あたり約10pg〜約1000mg/kg(約100ng〜約100mg/kgの範囲)であろう。 Doses will be from about per person intravenously 10pg~ about 1000 mg / kg (ranging from about 100ng~ about 100 mg / kg).

処置の約1〜4週間後、患者は第2コースの処置を受けることができる。 After about 1-4 weeks of treatment, the patient can receive the treatment of the second course. 投与経路、賦形剤、希釈剤、投与量および時間に関する具体的な臨床プロトコルは、臨床状況に応じて当業者によって決定され得る。 The route of administration, excipients, diluents, specific clinical protocols regarding dose and time can be determined by those skilled in the art depending on the clinical situation.

組成物およびコンジュゲート(例えばイムノコンジュゲート)は、例えば異常な細胞成長を特徴とする障害(例えば癌)の処置またはその重症度の軽減に有用な医薬の製造にも用いられ得る。 The compositions and conjugates (e.g. immunoconjugates) can also be used in the manufacture of a medicament useful for example the treatment of disorders characterized by abnormal cell growth (e.g. cancer) or reduction of the severity.

本発明は、1種以上のイムノコンジュゲートおよび1種以上の化学治療剤を含む本発明の医薬化合物および/または組成物の1種以上の成分を充填した1個以上の容器を含む医薬キットも提供する。 The present invention also provides a pharmaceutical kit comprising one or more containers filled with one or more of the ingredients of the pharmaceutical compounds and / or compositions of the invention comprising one or more immunoconjugates and one or more chemotherapeutic agents provide. かかるキットは、例えば他の化合物および/または組成物、それらの化合物および/または組成物を投与するため装置(複数可)、ならびに医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関により指示された形態の指示書を含むこともできる。 Such kit can comprise, for example other compounds and / or compositions, devices for administering these compounds and / or compositions (s), as well as pharmaceuticals or biological products manufacturing, a governmental agency regulating the manufacture, use or sale It can also include instructions form prescribed by.

癌治療ならびにそれらの投与量、投与経路および推奨される用途は当該分野で公知であり、Physician's Desk Reference(PDR)などの文献に記載されている。 Cancer therapy as well as their dosages, routes of administration and recommended usage are known in the art and are described in the literature, such as Physician's Desk Reference (PDR). PDRには、種々の癌の処置に用いられている薬剤の投与量が開示されている。 The PDR, the dose of the drug used in the treatment of various cancers have been disclosed. 治療的に有効であるこれらの前記化学治療薬物の投与計画および投与量は、処置されている特定の癌、疾患の程度、および当該分野の医師によく知られている他の因子に依存し、医師によって決定され得る。 Dosing regimen and dosages of these the chemotherapeutic drugs that are therapeutically effective, particular cancer being treated, the extent of the disease and dependent on other factors well known to the physician of the art, It may be determined by a physician. 例えば、2006年版のPhysician's Desk Referenceには、タキソテール(2947頁を参照)がチューブリン脱重合の阻害剤であること、ドキソルビシン(786頁を参照)、ドキシル(3302頁を参照)およびオキサリプラチン(2908頁を参照)がDNA相互作用剤であること、イリノテカル(2602頁を参照)がトポイソメラーゼI阻害剤であること、エルビタックス(937頁を参照)およびタルセバ(2470頁を参照)が上皮成長因子受容体と相互作用することが開示されている。 For example, (see 786 pages) in the Physician's Desk Reference 2006 edition, Taxotere (see p. 2947) to be an inhibitor of tubulin depolymerization, doxorubicin, (pp 3302) Doxil and oxaliplatin (see page 2908) to be a DNA-interactive agents, it Irinotekaru (see 2602 pages) is a topoisomerase I inhibitor, (see 937 pages) Erbitux and Tarceva (see p. 2470) is an epidermal growth it is disclosed to interact with factor receptors. PDRの内容は、全体が本明細書に明確に組み込まれる。 The contents of the PDR, the whole is expressly incorporated herein. 当業者は、以下のパラメータのうち1個以上を用いてPDRを検討して、本発明の教示に従って用いられ得る化学治療剤およびコンジュゲートの投与計画および投与量を決定することができる。 Those skilled in the art can consider PDR using one or more of the following parameters, to determine dosing regimen and dosages of the chemotherapeutic agents and conjugates that can be used in accordance with the teachings of the present invention. これらのパラメータとして以下が挙げられる: It is mentioned below as these parameters:
1. 1. 包括的インデックスa)製造業者によるb)製品(企業名または商標薬物名による) Comprehensive index a) b by the manufacturer) products (by company name or trademark drug names)
c)カテゴリーインデックス(例えば「抗ヒスタミン」、「DNAアルキル化剤」、タキサンなど) c) Category index (for example, "antihistamine", "DNA alkylating agents", taxanes, etc.)
d)一般/化学インデックス(商標でない一般の薬物名) d) General / chemical index (drug name of the general is not a trademark)
2. 2. 医薬の外観3. The appearance of the pharmaceutical 3. FDA標識と一致した製品情報a)化学的情報b)機能/作用c)適応症および配合禁忌d)試験研究、副作用、警告。 Product information consistent with FDA labeling a) Chemical information b) Function / action c) Indications and contraindications d) research, side effects, warnings.

上記の参考文献、特許出願、および特許のそれぞれの全内容は、限定されないが、明細書、特許請求の範囲および要約ならびにあらゆる図、表または図式を含めて全体が参照により本明細書に明確に組み込まれる。 The above references, patent applications, and each of the entire contents of the patents include, but are not limited to, specification, scope and summary, as well as any Figure of the appended claims, expressly incorporated herein by reference in entirety, including tables or graphically It is incorporated.

E. E. 反応性基を持つチオエーテル部位を有するメイタンシノイドの合成反応性基を持つ非開裂性チオエーテル部位を有する新規のメイタンシノイドは、式(5)、D'−Y'−V−Q−W−Z'の化合物である。 New maytansinoids having a non-cleavable thioether sites with synthetic reactive groups maytansinoids having a thioether site with a reactive group of the formula (5), D'-Y'-V-Q-W- it is a compound of the Z '. 細胞結合剤との反応のための化学基Z'として、限定されないが、iV−スクシンイミジルエステル、iV−スルホスクシンイミジルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、テトラフルオロスルホフェニル、およびニトロフェニルエステルが挙げられる。 As chemical group Z 'for reaction with cell-binding agents include, but are not limited to, Iv- succinimidyl ester, Iv- sulfosuccinimidyl esters, include pentafluorophenyl ester, tetrafluoro-sulfophenyl, and nitrophenyl ester It is. これらの化合物の調製の方法は、本明細書に記載されている。 The method of preparing these compounds are described herein. スルフヒドリル保持メイタンシノイドは、反応性基を持つヘテロ二官能性架橋剤に非開裂性チオエーテル結合を介して共有結合的に連結されており、細胞結合剤とのコンジュゲーションの前に単離される。 Sulfhydryl holding maytansinoid is covalently linked via a non-cleavable thioether bond heterobifunctional crosslinking agent having a reactive group, it is isolated prior to conjugation with cell-binding agents.

非開裂性リンカーは、安定な共有結合により細胞毒性薬物を細胞結合剤に連結することが可能であるあらゆる化学部位である。 Non-cleavable linkers are any chemical moiety can be a cytotoxic drug linked to a cell binding agent through a stable covalent bond. 非開裂性リンカーは、酸誘発開裂、光誘発開裂、ペプチダーゼ誘発開裂、エステラーゼ誘発開裂、およびジスルフィド結合開裂に実質的に耐性である。 Non cleavable linkers, acid-induced cleavage, light-induced cleavage, peptidase-induced cleavage, esterase-induced cleavage, and disulfide bond cleavage substantially resistant. 非開裂性リンカーの例として、メイタンシノイドとの反応のためのiV−スクシンイミジルエステルまたはTV−スルホスクシンイミジルエステル部位およびマレイミド−もしくはハロアセチル系部位を有するリンカーが挙げられる。 Examples of non-cleavable linkers, Iv- succinimidyl ester or TV- sulfosuccinimidyl ester moiety and maleimide for reaction with maytansinoid - include linkers with or haloacetyl-based site. マレイミド系部位を含む架橋試薬として、SMCC(LC−SMCC)の「長鎖」アナログであるiV−スクシンイミジル4−(マレイミドメチル)シクロヘキサンカルボキシレート(SMCC)、iV−スクシンイミジル−4−(N−マレイミドメチル)−シクロヘキサン−1−カルボキシ−(6−アミドカプロエート);κ−マレイミドウンデカン酸Nスクシンイミジルエステル(KMUA)、γ−マレイミド酪酸iV−スクシンイミジルエステル(GMBS)、ε−マレイミドカプロン酸N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(EMCS)、m−マレイミドベンゾイル−iVヒドロキシスクシンイミドエステル(MBS)、N−(α−マレイミドアセトキシ)−スクシンイミドエステル(AMAS)、スクシンイミジル−6−(β−マレ As cross-linking reagents comprising a maleimide-based site, SMCC (LC-SMCC) of the "long-chain" is an analog Iv- succinimidyl 4- (maleimidomethyl) cyclohexanecarboxylate (SMCC), Iv- succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl ) - cyclohexane-1-carboxy - (6-amido caproate); .kappa. maleimidoundecanoic acid N-succinimidyl ester (KMUA), γ- maleimide butyric iV- succinimidyl ester (GMBS), .epsilon.-maleimidocaproic acid N - hydroxysuccinimide ester (EMCS), m-maleimidobenzoyl -iV-hydroxysuccinimide ester (MBS), N- (α- maleimidoacetoxy) - succinimide ester (AMAS), succinimidyl-6-(beta-Male イミドプロピオンアミド)ヘキサノエート(SMPH)、N−スクシンイミジル4−(p−マレイミドフェニル)−ブチレート(SMPB)、および7V−(p−マレイミドフェニル)イソシアネート(PMPI)が挙げられる。 Imide propionamide) hexanoate (SMPH), N-succinimidyl 4-(p-maleimido-phenyl) - butyrate (SMPB), and 7V- (p- maleimidophenyl) isocyanate (PMPI) and the like. ハロアセチル−系部位を含む架橋試薬として、iV−スクシンイミジル−4−(ヨードアセチル)−アミノベンゾエート(SIAB)、7V−スクシンイミジルヨードアセテート(SIA)、iV−スクシンイミジルブロモアセテート(SBA)、およびiV−スクシンイミジル3−(ブロモアセトアミド)プロピオネート(SBAP)が挙げられる。 Haloacetyl - based as a crosslinking reagent containing the site, Iv- succinimidyl-4- (iodoacetyl) - aminobenzoate (SIAB), 7V- succinimidyl iodoacetate (SIA), Iv- succinimidyl bromoacetate (SBA) and iV- succinimidyl 3- (bromoacetamido) propionate (SBAP), and the like.

本発明において用いられて、細胞結合剤に共有結合的に連結され得る、チオエーテル部位を持つ反応性メイタンシノイド誘導体を生成することができるメイタンシノイドが当該分野において周知であり、公知の方法に従って天然源から単離され得る。 Used in the present invention may be covalently linked to a cell binding agent, the maytansinoid which can generate a reactive maytansinoid derivatives having a thioether sites are well known in the art, according to known methods from natural sources can be isolated.

反応性基を持つチオエーテル部位を有するメイタンシノイドの合成は、図1〜4を参照して記載され得、ここで、反応性基を持つチオエーテル保持メイタンシノイドが調製される。 Synthesis of maytansinoids having a thioether site having a reactive group can be described with reference to FIGS. 1-4, wherein the thioether holding maytansinoids having a reactive group are prepared.

本発明の代表的な化合物を、チオール含有メイタンシノイドから調製した:構造式(1)によって表される、N 2' −デアセチル−N 2' −(3−メルカプト−1−オキソプロピル)−メイタンシンと呼ばれるDM1:および構造式(2)によって表されるN 2' −デアセチル−N 2' −(4−メルカプト−4−メチル−1−オキソペンチル)メイタンシンと呼ばれるDM4を以下に示す: Representative compounds of the present invention were prepared from the thiol-containing maytansinoid: represented by structural formula (1), N 2 '- deacetyl -N 2' - (3- mercapto-1-oxopropyl) - maytansine DM1 called: and N 2 are represented by the structural formula (2) '- deacetyl -N 2' - (4-mercapto-4-methyl-1-oxopentyl) shows the DM4 called below as maytansine:

反応性基を持つチオエーテル部位を有する新規のメイタンシノイドは、以下の新たに記載されている方法によって調製される。 New maytansinoids having a thioether site having a reactive group are prepared by the methods described in New follows.

式(5):D'−Y'−V−Q−W−Z'(5)の、反応性基を持つチオエーテル部位を有する新規のメイタンシノイドの合成が記載され、以下の工程から構成される: Equation (5): D'-Y'-V-Q-W-Z '(5), the synthesis of the novel maytansinoids having a thioether site having a reactive group is described, which consists of the following steps that:
a. a. )式V−V−Q−W−Z'のヘテロ二官能性リンカーを、チオール保持メイタンシノイドD'と共有結合的に連結させる工程;ここで、Y”は、マレイミドまたはハロアセトアミドなどのチオール反応性基であり;Vは、好ましくは1〜10個の炭素原子を有する、より好ましくは、1〜5個の炭素原子を有する、適宜、線状、分枝状または環式のアルキル、アルケニルまたはアルキニル基であり;Wは、好ましくは1〜10個の炭素原子を有する、より好ましくは、1〜5個の原子を有する、適宜、線状、分枝状または環式のアルキル、アルケニルまたはアルキニル基であり、Qは、適宜、芳香族または複素環式部位を表し;Z'は、アミン反応性基、例えば、限定されないが/V−スクシンイミジルエステル、7V−スルホスクシンイミジル ) 'A heterobifunctional linker, a thiol retention maytansinoid D' formula V-V-Q-W-Z step is covalently linked to; wherein, Y "is a thiol, such as maleimide or haloacetamide It is reactive group; V is preferably has 1 to 10 carbon atoms, more preferably, having from 1 to 5 carbon atoms, as appropriate, a linear, branched or cyclic alkyl, alkenyl or alkynyl group; W is preferably has 1 to 10 carbon atoms, more preferably, having 1-5 atoms, optionally a linear, branched or cyclic alkyl, alkenyl or an alkynyl group, Q is suitably represents an aromatic or heterocyclic sites; Z 'is an amine reactive group, for example, but not limited to / V- succinimidyl ester, 7V- sulfosuccinimidyl ステル、ペンタフルオロフェニルエステル、テトラフルオロスルホフェニル、またはニトロフェニルエステルである。反応は、順序(6)から構成される: . Ester, pentafluorophenyl ester, a tetrafluoro-sulfophenyl or nitrophenyl esters, reaction consists of the sequence (6):
D'+V−V−Q−W−Z'→D'−Y'−V−Q−W−Z' (6) D '+ V-V-Q-W-Z' → D'-Y'-V-Q-W-Z '(6)
b. b. )チオール保持メイタンシノイド、D'、例えば、DM1およびDM4に対して化学量論または過剰当量のヘテロ二官能性架橋剤V−V−QW−Z'が用いられてよい。 ) Thiol retention maytansinoid, D ', for example, DM1 and stoichiometric or excess equivalents of heterobifunctional crosslinking agent V-V-QW-Z against DM4' may be used. 反応は、完了まで進行し、分析方法、例えば、HPLCおよびTLCによってモニタリングされ得る。 The reaction proceeds to completion, analytical methods, for example, may be monitored by HPLC and TLC. 反応は、ヘテロ二官能性リンカー、V−V−Q−W−Z'に対して過剰のチオール保持メイタンシノイドD'によって実施されてもよい。 The reaction is a heterobifunctional linker, V-V-Q-W-Z may be carried out by 'excess thiol retention maytansinoid D against'.
c. c. )反応は、チオール保持メイタンシノイドD'およびヘテロ二官能性リンカーV−V−Q−W−Z'が完全に可溶性であるように、好適な有機溶媒または水性緩衝液と有機溶媒との混合物において実施されてよい。 ) Reactions, thiol retention maytansinoid D 'and heterobifunctional linkers V-V-Q-W-Z' as is completely soluble, suitable organic solvents or aqueous buffers and mixture of an organic solvent it may be performed in. 好適な有機溶媒の例として、テトラフラン(THF)、1,2−ジメトキシエタン、N,iV−ジメチルホルムアミド(DMF)、iV,7V−ジメチルアセトアミド(DMA)、メタノールおよびエタノールが挙げられる。 Examples of suitable organic solvents, tetra furan (THF), 1,2-dimethoxyethane, N, Iv- dimethylformamide (DMF), iV, 7V- dimethylacetamide (DMA), include methanol and ethanol. 有機溶媒と水性緩衝液との混合物中で反応を実施するとき、pHは、アミン反応性基Zの加水分解の可能性を最小にしながらスルフヒドリル保持メイタンシノイドとマレイミドまたはハロアセトアミドY”との反応を促進するように制御されなければならない。この反応に好適なpH範囲は、pH3〜10であり、好ましいpHは、5〜9であり、最も好ましいpHは、pH6〜8である。 When carrying out the reaction in a mixture of organic solvent and an aqueous buffer, pH, the reaction with sulfhydryl holding maytansinoid and maleimide or haloacetamide Y "while the possibility of hydrolysis of the amine-reactive group Z to a minimum must be controlled to facilitate. suitable pH range for the reaction is pH 3-10, preferably pH is 5 to 9, most preferred pH is pH 6-8.
d. d. )チオール保持メイタンシノイドD'とチオール反応性基Y”との間のチオエーテル形成は、好適な有機塩基および純有機溶媒、例えば上記されているものを用いて調製されてもよい。有機塩基、例えば、N,N−ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)、1,8−ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデカ−7−エン(DBU)、トリエチルアミンおよび4−メチルモルホリンが用いられて、式(5)D'−Y'−V−Q−W−Z'の、反応性基を持つ所望のチオエーテル含有メイタンシノイドを形成してよい。 ) Thioether formation between the thiol retention maytansinoid D 'and the thiol-reactive group Y "is a suitable organic bases and pure organic solvents, for example may be prepared using what is described above. Organic base, For example, N, N- diisopropylethylamine (DIPEA), 1,8-diazabicyclo [5.4.0] undec-7-ene (DBU), used is triethylamine and 4-methylmorpholine, equation (5) D ' of -Y'-V-Q-W-Z ', they may form a desired thioether-containing maytansinoids having a reactive group.
e. e. )式(5)D'−Y'−V−Q−W−Z'の化合物が単離されて、続いて反応が完了し得る。 ) Equation (5) compounds of the D'-Y'-V-Q-W-Z 'is isolated, may be followed by reaction is complete. アミン反応性基Z'を持つチオエーテル部位を有するメイタンシノイド(例えば、iV−スクシンイミジルエステル)の精製に好適な技術として、シリカゲルクロマトグラフィ、順または逆相高速液体クロマトグラフィ(HPLC)、分取薄層クロマトグラフィ(TLC)および結晶化が挙げられる。 Maytansinoids having a thioether sites with amine-reactive group Z '(for example, Iv- succinimidyl ester) as the preferred technique for purification of silica gel chromatography, forward or reverse phase high performance liquid chromatography (HPLC), preparative thin layer chromatography (TLC) and crystallization and the like.
f. f. )式(5)D'−Y'−V−Q−W−Z'の単離された生成物の純度および同定は、HPLC、質量分析(MS)、LC/MS、 H NMRおよび13 C NMRを含めた分析方法によって確立され得る。 ) Equation (5) D'-Y'-V -Q-W-Z purity and identification of the isolated product of 'the, HPLC, mass spectrometry (MS), LC / MS, 1 H NMR and 13 C It may be established by analytical methods, including NMR.

F. F. チオエーテル部位を有するメイタンシノイド誘導体の生成反応性基を持つ非開裂性のチオエーテル部位を含有するメイタンシノイドの調製に有用である、チオエーテル部位を含有する新規のメイタンシノイド誘導体が本明細書に記載されている。 Useful for preparing maytansinoids containing thioether sites non-cleavable with generating reactive groups maytansinoid derivatives having a thioether site, new maytansinoid derivatives containing a thioether site herein Are listed. DM1(1)およびDM4(2)からのこれらの誘導体の調製が開示されており、式(10): DM1 (1) and preparation of these derivatives is disclosed from DM4 (2), formula (10):
D'−Y'−V−Q−W−COOH(10) D'-Y'-V-Q-W-COOH (10)
式中、 In the formula,
Vは、好ましくは1〜10個の炭素原子を有する、より好ましくは、1〜5個の炭素原子を有する、適宜、線状、分枝状または環式のアルキル、アルケニルまたはアルキニル基であり、 V is preferably, more preferably having 1 to 10 carbon atoms, having from 1 to 5 carbon atoms, as appropriate, a linear, branched or cyclic alkyl, alkenyl or alkynyl group,
Wは、好ましくは1〜10個の炭素原子を有する、より好ましくは、1〜5個の炭素原子を有する、適宜、線状、分枝状または環式のアルキル、アルケニルまたはアルキニル基であり、 W preferably has 1 to 10 carbon atoms, more preferably has 1 to 5 carbon atoms, as appropriate, a linear, branched or cyclic alkyl, alkenyl or alkynyl group,
D'は、スルフヒドリル保持メイタンシノイド、DM1またはDM4を表し; D 'represents a sulfhydryl holding maytansinoid, DM1 or DM4;
Y'は、チオエーテル結合を表し; Y 'represents a thioether bond;
Qは、適宜、芳香族または複素環式部位を表す; Q is suitably represents an aromatic or heterocyclic sites;
によって表される。 Represented by.

式(10)の、カルボン酸を持つチオエーテル部位を有する新規のメイタンシノイド誘導体の合成が記載されており、以下の工程から構成される: Formula (10), describes the synthesis of novel maytansinoid derivatives having a thioether site with carboxylic acid, comprises the following steps:
a. a. )式V−V−Q−W−COOHのカルボン酸リンカーをチオール保持メイタンシノイドD'に共有結合的に連結させる工程;ここで、Y”は、マレイミドまたはハロアセトアミドなどのチオール反応性基であり;Qは、適宜、芳香族または複素環式部位を表す。反応順序は、式(11): ) Type V-V-Q-W-COOH of thiol holding carboxylic acid linker maytansinol step covalently linked to maytansinoids D '; wherein, Y "is a thiol-reactive groups such as maleimide or haloacetamide . There; Q is optionally reaction sequence representing an aromatic or heterocyclic moiety, formula (11):
D'+Y”−V−Q−W−COOH→D'−Y'−V−Q−W−COOH (11) D '+ Y "-V-Q-W-COOH → D'-Y'-V-Q-W-COOH (11)
式中: In the formula:
VおよびWは、先に定義されている通りであり; V and W are as defined above;
D'は、先に定義されている通りであり; D 'are as defined above;
Y”は、先に定義されている通りであり; Y "are as defined above;
Y'は、スルフヒドリル保持メイタンシノイドとカルボン酸COOHとの間のチオエーテル結合であり; Y 'is an thioether bond between the sulfhydryl holding maytansinoids and carboxylic acid COOH;
Qは、適宜、芳香族または複素環式部位を表す; Q is suitably represents an aromatic or heterocyclic sites;
によって表される。 Represented by.
b. b. )チオール保持メイタンシノイド、D'、例えば、DM1およびDM4に対して化学量論または過剰当量の式Y”−V−Q−W−COOHのカルボン酸リンカーが用いられてよい。反応は、完了まで進行し、分析方法、例えば、HPLCおよびTLCによってモニタリングされ得る。反応は、式Y”−VQ−W−COOHのカルボン酸リンカーに対して過剰のチオール保持メイタンシノイドD'によって実施されてもよい。 ) Thiol retention maytansinoid, D ', for example, DM1 and DM4 stoichiometric or excess equivalents of formula Y "-V-Q-W-COOH may carboxylic acid linker is used in. Response to the completion to proceed, process analysis, for example, may be monitored by HPLC and TLC. the reaction can also be carried out by the equation Y "-VQ-W-COOH of an excess of thiol retention to the carboxylic acid linker maytansinoid D ' good.
c. c. )反応は、チオール保持メイタンシノイド、D'および式V−V−Q−W−COOHのカルボン酸リンカーが完全に可溶性であるように、好適な有機溶媒または水性緩衝液と有機溶媒との混合物において実施されてよい。 ) Reactions, thiol retention maytansinoid, D 'and as the carboxylic acid linker of the formula V-V-Q-W-COOH is completely soluble, suitable organic solvents or aqueous buffers and mixture of an organic solvent it may be performed in. 好適な有機溶媒の例として、テトラフラン(THF)、1,2−ジメトキシエタン、NJN−ジメチルホルムアミド(DMF)、N,N−ジメチルアセトアミド(DMA)、メタノールまたはエタノールが挙げられる。 Examples of suitable organic solvents, tetra furan (THF), 1,2-dimethoxyethane, NJN- dimethylformamide (DMF), N, N-dimethylacetamide (DMA), methanol or ethanol may be mentioned. 有機溶媒と水性緩衝液との混合物中で反応を実施するとき、pHは、スルフヒドリルとマレイミドまたはハロアセトアミドY”との反応を促進するように制御されなければならない。この反応に好適なpH範囲は、pH3〜10、好ましいpHは、5〜9であり、最も好ましいpHは、pH6〜8である。 When carrying out the reaction in a mixture of organic solvent and an aqueous buffer solution, pH must be controlled to facilitate a reaction between sulfhydryl and maleimide or haloacetamide Y ". Suitable pH range for this reaction is , pH 3-10, preferably pH is 5 to 9, most preferred pH is pH 6-8.
d. d. )チオール保持メイタンシノイドD'とチオール反応性基Y”との間のチオエーテル形成は、好適な有機塩基および純有機溶媒、例えば上記されているものを用いるときにも起こる。有機塩基、例えば、N,N−プロピルエチルアミン(DIPEA)、1,8−ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデカ−7−エン(DBU)、トリエチルアミンおよび4−メチルモルホリンが用いられて、カルボン酸を持つ所望のチオエーテル含有メイタンシノイドを形成してよい。 ) Thioether formation between the thiol retention maytansinoid D 'and the thiol-reactive group Y "is a suitable organic bases and pure organic solvents, for example also occur when using what is described above. Organic bases, for example, N, N-propylethylamine (DIPEA), 1,8-diazabicyclo [5.4.0] undec-7-ene (DBU), used is triethylamine and 4-methylmorpholine, desired thioether containing with carboxylic acid maytansinoids may form a proteinoid.
e. e. )式(10)D'−Y'−V−Q−W−COOHの化合物が単離されて、続いて反応が完了し得る。 ) Formula (10) compounds of the D'-Y'-V-Q-W-COOH is isolated, may be followed by reaction is complete. カルボン酸を持つチオエーテル部位を有するメイタンシノイドの精製に好適な技術として、シリカゲルクロマトグラフィ、順または逆相高速液体クロマトグラフィ(HPLC)、分取薄層クロマトグラフィ(TLC)または結晶化が挙げられる。 Suitable techniques for the purification of maytansinoid having a thioether site with carboxylic acid, silica gel chromatography, forward or reverse phase high performance liquid chromatography (HPLC), preparative thin layer chromatography (TLC) or crystallization and the like.
f. f. )式(10)D'−Y'V−Q−WCOOHの単離された生成物の純度および同定は、HPLC、質量分析(MS)、LC/MS、 H NMRおよび13 C NMRを含めた分析方法によって確立され得る。 ) Equation (10) D'-Y'V-Q -WCOOH purity and identification of the isolated product was included HPLC, mass spectrometry (MS), the LC / MS, 1 H NMR and 13 C NMR It may be established by the analytical method.

式(11)D'−Y'−V−Q−W−COOHの、末端カルボン酸を持つチオエーテル部位を含有する新規のメイタンシノイド誘導体は、式(5)D'−Y'−V−Q−W−Z'の化合物の調製において有用である。 Equation (11) of the D'-Y'-V-Q-W-COOH, novel maytansinoid derivatives containing a thioether site having terminal carboxylic acid of the formula (5) D'-Y'-V-Q useful in the preparation of compounds of -W-Z '. 式(11)D'−Y'−V−Q−W−COOHのメイタンシノイド誘導体は、アミン反応性基Zを与えるようにさらに誘導体化されてよい。 Maytansinoid derivative of formula (11) D'-Y'-V-Q-W-COOH may be further derivatized to provide amine-reactive group Z. 好ましいアミン反応性基Z'は、活性エステル、例えば、限定されないがiV−スクシンイミジルエステル、7V−スルホスクシンイミジルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、テトラフルオロスルホフェニル、またはニトロフェニルエステルである。 Preferred amine-reactive groups Z 'is an active ester, for example, but not limited iV- succinimidyl ester, 7V- sulfosuccinimidyl ester, pentafluorophenyl ester, a tetrafluoro-sulfophenyl or nitrophenyl esters. 式(11)の化合物からの式(5)の化合物の調製のための方法は、反応順序: Methods for the preparation of compounds of formula (5) from the compound of formula (11), the reaction sequence:
D'−Y'−V−Q−W−COOH+X→D−Y'−V−Q−W−Z' D'-Y'-V-Q-W-COOH + X → D-Y'-V-Q-W-Z '
式中、Xは、活性化されたエステルZ'を与えるN−ヒドロキシスクシンイミドである、すなわち、アミン反応性である; Wherein, X is activated giving the ester Z 'is a N- hydroxysuccinimide, i.e., an amine-reactive;
に従う。 According to the.

式(5)D'−Y'−V−Q−W−Z'のメイタンシノイドは、本明細書に記載されている公知の方法によって、式(11)D'−Y'−V−Q−W−COOHの新規のメイタンシノイドから調製されてよい。 Equation (5) maytansinoid D'-Y'-V-Q-W-Z 'by known methods described herein, the formula (11) D'-Y'-V-Q from a new maytansinoids of -W-COOH may be prepared.
a. a. )式(11)D'−Y'−V−Q−W−COOHのメイタンシノイドは、1−(3−ジメチルアミノプロピル)−3−エチル−カルボジイミド塩酸塩(EDCHCl)の存在下に、乾燥有機溶媒(例えば、塩化メチレン、ジメチルホルムアミド、テトラフラン、ジオキサン、ジエチルエーテル)中、僅かに過剰のTV−ヒドロキシスクシンイミド(X)と反応されてよい。 ) Equation (11) of the D'-Y'-V-Q-W-COOH maytansinoids, 1- (3-dimethylaminopropyl) -3-ethyl - in the presence of a carbodiimide hydrochloride (EDCHCl), dried organic solvents (e.g., methylene chloride, dimethylformamide, tetra-furan, dioxane, diethyl ether) in, may be reacted with a slight excess of TV- hydroxysuccinimide (X). EDCHCl以外の縮合剤が反応に使用され得る。 Condensing agents other than EDCHCl may be used in the reaction.
b. b. )反応の完了は、標準の化学技術、例えば、TLCまたはHPLCを用いてモニタリングされてよい。 ) Completion of the reaction, standard chemical techniques, for example, may be monitored using TLC or HPLC.
c. c. )反応の完了後に、反応性7V−ヒドロキシスクシンイミジルエステルを持つメイタンシノイド誘導体が、シリカゲルクロマトグラフィによって、またはHPLCによって、または結晶化によって精製されてよい。 ) After completion of the reaction, maytansinoid derivatives having a reactive 7V- hydroxysuccinimidyl esters, by silica gel chromatography or by HPLC, or may be purified by crystallization.
d. d. )式(5)D'−Y'−V−Q−W−Z'の単離された生成物の純度および同定は、HPLC、質量分析(MS)、LC/MS、 H NMRおよび13 C NMRを含めた分析方法によって確立され得る。 ) Equation (5) D'-Y'-V -Q-W-Z purity and identification of the isolated product of 'the, HPLC, mass spectrometry (MS), LC / MS, 1 H NMR and 13 C It may be established by analytical methods, including NMR.

G. G. 反応性基を持つチオエーテル部位を有するメイタンシノイドとの抗体コンジュゲートの調製式(8)CB−(Z”−W−Q−VY'−D') の、反応性基を持つチオエーテル部位を有する単離された反応性メイタンシノイド誘導体を用いた、細胞結合剤による非開裂性チオエーテル連結メイタンシノイドコンジュゲートの調製のためのプロセス(図39および40)が記載されており、以下の工程から構成される: The antibody conjugate Preparation of Formula (8) CB- (Z "-W -Q-VY'-D ') m and maytansinoids having a thioether site having a reactive group, a thioether site having a reactive group reactive maytansinoid derivatives isolated with using describes a process for the preparation by cell binding agents of the non-cleavable thioether linked maytansinoid conjugate (FIGS. 39 and 40), the following steps consisting of:
a. a. )細胞結合剤のリシン残基とチオエーテル結合を有するメイタンシノイドに連結したアミン反応性基との間で、共有結合によるアミド結合形成を介して、細胞結合剤CB(抗体)に、本発明の式(5)D'−Y'−W−Q−V−Z'の、チオエーテル部位を持つ精製されたアミン反応性メイタンシノイドを共有結合的に連結させる工程。 ) With the amine-reactive group linked to the maytansinoid having a thioether bond and the lysine residue of the cell binding agent via an amide bond formation by covalent bonds, to a cell binding agent CB (antibodies) of the present invention equation (5) D'-Y'-W-Q-V-Z 'of, the step of covalently linking the purified amine reactive maytansinoid having a thioether site.
b. b. )コンジュゲーション反応は、抗体の性質に応じて0.5〜10mg/mLの抗体濃度で実施されてよい。 ) Conjugation reaction may be carried at an antibody concentration of 0.5 to 10 mg / mL, depending on the nature of the antibody.
b. b. )チオエーテル部位を持つアミン反応性非開裂性メイタンシノイドの原液は、抗体とのコンジュゲーションの前に純有機溶媒中で調製されてよい。 ) Stock solution of amine-reactive non-cleavable maytansinoid having a thioether moiety may be prepared in pure organic solvent prior to conjugation with antibody. 原液の調製に好適な有機溶媒として、メタノール、エタノール、N,iV−ジメチルアセトアミド(DMA)、N,iV−ジメチルホルムアミド(DMF)およびジメチルスルホキシド(DMSO)が挙げられる。 Suitable organic solvents for the preparation of the stock solution, methanol, ethanol, N, Iv- dimethylacetamide (DMA), N, iV- dimethylformamide (DMF) and dimethyl sulfoxide (DMSO).
c. c. )メイタンシノイドの疎水性の性質に起因して、メイタンシノイドがコンジュゲーションの間に溶液中に残存することを確実にするには、水性緩衝液と有機溶媒との混合物中での抗体へのコンジュゲーションを行う必要があり得る。 ) Due to the maytansinoid hydrophobic nature of maytansinoid, to the maytansinoid to ensure that remaining in solution during the conjugation to an antibody in a mixture of aqueous buffer and an organic solvent It may be necessary to perform the conjugation. 水性緩衝液中の好ましい有機溶媒量は、これらの条件下で試薬の溶解度および抗体の挙動に応じて0〜30%(v/v)の範囲である。 Preferred organic solvents of the aqueous buffer solution is in the range of solubility of the reagent under these conditions and 0-30% depending on the behavior of the antibody (v / v). コンジュゲーションは、pH3〜10で行われてよく、好ましいpHは5〜9であり、最も好ましいpHは、pH6〜8である。 Conjugation may be carried out at pH 3-10, preferably pH is 5 to 9, most preferred pH is pH 6-8. コンジュゲーション反応に用いられる緩衝液は、このpH範囲付近のpKa値を有する緩衝液、例えば、リン酸およびHEPES緩衝液である。 Buffer used for conjugation reactions, buffers having a pKa value near this pH range, for example, a phosphate and HEPES buffer.
c. c. )抗体に対して5〜50倍過剰の、チオエーテル部位を持つアミン反応性メイタンシノイドは、コンジュゲーション反応に用いられて、抗体1分子あたり所望の数の連結されたメイタンシノイド分子とのコンジュゲートを生じることができる。 ) Of 5 to 50 fold excess relative to antibody, amine-reactive maytansinoid having a thioether moiety, used in conjugation reactions, Gongju of linked maytansinoid molecules desired number per antibody molecule gate can produce. 1抗体につき好ましくは2〜8個の範囲の連結されたメイタンシノイドが、最終コンジュゲートに望ましい。 Linked maytansinoid preferably 2 to 8 range per antibody is desired in the final conjugate. 条件、例えば、抗体濃度、試薬の溶解度およびpHは、所要のメイタンシノイド試薬の過剰倍数ならびに最終コンジュゲートにおける抗体1モルあたりの連結されたメイタンシノイド分子の数に影響し得る。 Conditions, for example, antibody concentration, solubility and pH of the reagent can affect the number of linked maytansinoid molecules of the antibody per mole of the excess fold and the final conjugate of the required maytansinoid reagent.
d. d. )クロスフロー濾過、透析、またはクロマトグラフィ(ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ)またはこれらの組み合わせによる、式(8)CB−(Z”−V−Q−W−Y'−D') の非開裂性コンジュゲートの精製。 ) Cross-flow filtration, dialysis, or chromatography (gel filtration, ion exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography), or a combination thereof, wherein (8) CB- (Z "-V-Q-W-Y'-D ' ) non-cleavable conjugate purification of the m.
実施例 Example

いずれの特定の態様にも拘束されないが、細胞結合剤とのコンジュゲーションのための種々の反応性リンカーによるポリエチレングリコール((CH CH O) )連結薬物の合成のための方法が記載される。 Not being bound to any particular embodiment, but a method is described for a variety of polyethylene glycol ((CH 2 CH 2 O) n) Synthesis of linking the drug by reactive linkers for conjugation with cell-binding agents that. これらのコンジュゲーション方法として、抗体と薬物、例えば、7V−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)反応性基における反応によってポリエチレングリコール((CH CH O) )リンカーを介して連結されたメイタンシノイドとの1工程コンジュゲーションが挙げられる。 As these conjugation methods, the antibody and drug, for example, 7V- hydroxysuccinimide (NHS) polyethylene glycol by the reaction of the reactive groups ((CH 2 CH 2 O) n) with maytansinoids linked via a linker 1 step conjugation and the like.

また、抗体による、コンジュゲーションのための種々の反応性リンカーを有するジスルフィド基含有ポリエチレングリコール((CH CH θ) )連結薬物を合成する方法も記載される。 Further, according to the antibody, a method of synthesizing the various disulfide group-containing polyethylene glycol having a reactive linker ((CH 2 CH 2 θ) n) connecting the drug for conjugation described. これらのコンジュゲーション方法として、抗体と薬物、例えば、iV−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)反応性基における反応を介して、ジスルフィド基保有ポリエチレングリコール((CH CH O) )リンカーと連結したメイタンシノイドとの1工程コンジュゲーションが挙げられる。 As these conjugation methods, the antibody and drug, for example, via reaction of iV- hydroxysuccinimide (NHS) reactive group, linked with disulfide groups held polyethylene glycol ((CH 2 CH 2 O) n) linker Meitanshi 1 step conjugation with maytansinoids and the like.

以下の実施例は、例示のみであって、本発明を限定することは意図されない。 The following examples are illustrative only and are not intended to limit the present invention.

実施例I Example I
常套の脂肪族炭素スペーサーを含有するジスルフィドリンカーによる、抗体と、抗体分子あたり数個の連結されたメイタンシノイド分子とのコンジュゲーション: By disulfide linker containing a conventional aliphatic carbon spacer, conjugation of the antibody, and several linked maytansinoid molecules per antibody molecule:

抗体と数個のメイタンシノイドDM4またはDM1分子とをコンジュゲートする2工程プロセスにおいて、ヒト化抗体を、アミン反応性N−ヒドロキシスクシンイミド基(NHS基)およびチオール反応性2−ピリジルジチオ基(−SSPy基)の両方を含有する市販のヘテロ二官能性リンカー(SPDB)によってまず修飾し、数個のリンカー分子を抗体分子に組み込んだ(W.C.Widdisonら、J Med.Chem.、2006、49、4392−4408に記載されている)。 In 2-step process the antibody and several maytansinoid DM4 or DM1 molecules conjugated, humanized antibodies, amine-reactive N- hydroxysuccinimide group (NHS group) and a thiol-reactive 2-pyridyldithio group (- first modified by commercially available heterobifunctional linkers containing both SSPy group) (SPDB), incorporating several linker molecule to the antibody molecules (W.C.Widdison et, J Med.Chem., 2006, It is described in 49,4392-4408). 抗体分子への反応性リンカーの組み込みに続いて、第2反応工程において、反応性チオール基を有するメイタンシノイドDM4またはDM1をリンカー修飾抗体に添加して、ジスルフィド結合によってメイタンシノイドを抗体にコンジュゲートした。 Following the incorporation of the reactive linkers to an antibody molecule, Gongju in a second reaction step, the maytansinoid DM4 or DM1 having a reactive thiol group was added to the linker-modified antibody, the maytansinoid via a disulfide bond to an antibody the gate. 具体例では、5〜10mg/mlの濃度のヒト化抗体を、10〜15倍モル過剰の、−(CH )− アルキル基を有する市販のヘテロ二官能性リンカー(例えば、SPDB、SPP、SPDP)を用いて、水性緩衝液中pH6.5〜8で0.25〜3時間、周囲温度で修飾し、次いで、ゲル濾過(例えば、Sephadex G25クロマトグラフィを用いる)によって精製して、抗体1分子あたり平均8〜12個のリンカー基によって修飾された抗体を高収率で得た(典型的には80〜90%の収率)。 In a specific example, a humanized antibody at a concentration of 5 to 10 mg / ml, 10 to 15-fold molar excess, - (CH 2) - Commercially available heterobifunctional linker having n-alkyl group (e.g., SPDB, SPP, using SPDP), 0.25 to 3 hours in an aqueous buffer PH6.5~8, modified at ambient temperature, then purified by gel filtration (e.g., using a Sephadex G25 chromatography), antibody molecule the antibody modified by the per average 8-12 linker groups was obtained in high yield (typically 80-90% yield in). 連結された基を、過剰の1,4−ジチオトレイトール(DTT)試薬を少量のアリコートのリンカー修飾抗体サンプルに添加する際の343nmの吸光度に基づいて(343nm=8080M −1 cm −1 )2−チオピリドンの放出を測定することによって推定した。 The ligated groups, based on the excess of 1,4-dithiothreitol (DTT) reagent and absorbance of 343 nm when added to the linker-modified antibody sample small aliquots (343nm = 8080M -1 cm -1) 2 - it was estimated by measuring the release of thiopyridone. 抗体に連結された反応性基を測定した後、2.5mg/mlの濃度のリンカー修飾抗体を過剰のメイタンシノイドDM4(反応性リンカーに対して1.7倍モル過剰のDM4チオール)によってpH6.5でコンジュゲートした。 After measuring the linked reactive groups on the antibody, the 2.5 mg / ml concentration of linker-modified antibody excess maytansinoid DM4 (1.7 fold molar excess of DM4 thiol respect reactive linker) pH 6 conjugated with .5. しかし、抗体−メイタンシノイドコンジュゲーション反応の間に沈澱が見られ、ゲル濾過による抗体−メイタンシノイドコンジュゲートの精製の際には低い収率の抗体−メイタンシノイドコンジュゲート(−38〜60%の収率)を得た。 However, antibody - maytansinoid conjugation precipitated during the reaction was observed, the antibody by gel filtration - maytansinoid conjugates low yields of antibody during purification - maytansinoid conjugates (-38~60 % yield). 抗体1分子あたりの連結メイタンシノイドの数を、252nmおよび280nmにおける吸光度の測定値から、メイタンシノイドおよび抗体について252nmおよび280nmにおける減衰係数を用いて求めた。 The number of connecting maytansinoid per antibody molecule, from measurements of absorbance at 252nm and 280nm, was determined using an extinction coefficient at 252nm and 280nm for maytansinoid and antibody. 抗体−メイタンシノイドコンジュゲートの沈澱および約1〜1.5mg/mlの低い収量に加えて、抗体1分子あたりの組み込まれたメイタンシノイドの数は、抗体1分子あたりの組み込まれた最初の反応性リンカー基のはるかに高い平均数(抗体1分子あたり−8〜12個の反応性リンカー基)に基づいて予想したよりもはるかに低かった(抗体1分子あたり平均で−5.2〜5.5個のメイタンシノイド分子)。 Antibody - maytansinoids In addition to precipitation and about 1 to 1.5 mg / ml low yield of maytansinoid conjugates, the number of maytansinoid incorporated a per antibody molecule, the per antibody molecule incorporated first was much higher average number of reactive linker groups at a much lower (average per antibody molecule than expected on the basis of (the antibody molecule -8~12 one reactive linker groups per) -5.2~5 .5 one maytansinoid molecules). これは、より多くのメイタンシノイド保持抗体コンジュゲートの沈澱を示唆している。 This suggests precipitation of more maytansinoid held antibody conjugate. 別の例において、ヒト化抗体を、SPDBヘテロ二官能性リンカーによってまず修飾し、抗体1分子あたり11個のピリジルジチオ基を組み込み、これは、1.7倍モル過剰のDM4メイタンシノイドチオールによる第2反応の際、反応混合物中にかなり沈澱することを示し、<30%の抗体−メイタンシノイドコンジュゲートの非常に低い回収を結果としてもたらした。 In another example, a humanized antibody, is first modified by SPDB heterobifunctional linker incorporate 11 pyridyldithio groups per antibody molecule, which is 1.7-fold molar excess by DM4 maytansinoid thiol during the second reaction, it indicates that significant precipitation in the reaction mixture, <30% of the antibody - brought as a result a very low recovery of maytansinoid conjugates. 市販のヘテロ二官能性リンカー、例えば、脂肪族スペーサーを有するSPDBまたはSPDPを用いるとき、1mg/ml以上の抗体−メイタンシノイドコンジュゲート濃度では高いコンジュゲーションの収率で1抗体あたり4または5個を超えるメイタンシノイド分子を組み込むことが典型的には困難である。 Commercially available heterobifunctional linkers, for example, when using SPDB or SPDP with aliphatic spacers, 1 mg / ml or more antibody - 4 or 5 per antibody of high conjugation yield was maytansinoid conjugate concentrations typically it is difficult to incorporate a maytansinoid molecules for over. これにより、SPDB−またはSPDP誘導リンカーを有する抗体−メイタンシノイドコンジュゲートの沈澱および低収率が、抗体の最初のSPDB−またはSPDPリンカー修飾の際(メイタンシノイドによるコンジュゲーションの前)に見られなかったことが観察された。 Thus, antibodies with SPDB- or SPDP derived linker - maytansinoid conjugates of precipitation and low yield, seen upon initial SPDB- or SPDP linker-modified antibody (maytansinoid before conjugation by) that is it did not was observed. これは、抗体−メイタンシノイドコンジュゲートの凝集および沈澱が疎水性分子の付着によって恐らく引き起こされたことを示唆した。 This antibody - maytansinoids aggregation and precipitation of maytansinoid conjugates suggesting that it was probably caused by adhesion of the hydrophobic molecule.

実施例II Example II
親水性ポリエチレンオキシドスペーサー(PEG 、または(−CH −CH −O) n=1−14 )を含有するジスルフィドリンカーによる、抗体と、抗体分子あたり数個の連結メイタンシノイド分子とのコンジュゲーション 親水性スペーサー、例えばポリエチレンオキシド(PEG 、または(−CH −CH −O) n=Ui4 )が、高い個数のメイタンシノイド分子(抗体分子当たり平均>4)を含む抗体−メイタンシノイドコンジュゲートの凝集および沈殿を防止することができるかを調査するために、いくつかの新規のヘテロ二官能性および一官能性メイタンシノイド誘導体を調製し、これらを、直接修飾により、または抗体のリジン残基における最初の誘導体化、続いてのメイタンシノイドの反応による2工程反 Gongju of by disulfide linkers containing hydrophilic polyethyleneoxide spacers (PEG n or (-CH 2 -CH 2 -O) n = 1-14,), and the antibody, and several connecting maytansinoid molecules per antibody molecule Geshon hydrophilic spacer, such as polyethylene oxide (PEG n or (-CH 2 -CH 2 -O) n = Ui4,) antibody included in the high number of maytansinoid molecules (average per antibody molecule> 4) - Meitanshi to investigate if it is possible to prevent aggregation and precipitation of maytansinoid conjugates, several new heterobifunctional and monofunctional maytansinoid derivatives were prepared, these by direct modification or antibody the first derivatized at lysine residues, followed by maytansinoid reaction by two-step reaction of により、抗体にコンジュゲートさせることができた(例えば、図3、6、11および12を参照)。 The could be conjugated to an antibody (e.g., see Figure 3,6,11 and 12).

15−(2−ピリジルジチオ)−4,7,10,13−テトラオキサペンタデカン酸の合成 アルドリチオール−2(1.17g,5.31mmol)の溶液を、10mLの丸底フラスコにおいて5.0mLの1,2−ジメトキシエタン中で調製した。 15- (2-pyridyldithio) -4,7,10,13- synthetic aldrithiol tetra oxa pentadecane acid -2 (1.17 g, 5.31 mmol) to a solution of, 5.0 mL in a round bottom flask 10mL 1,2 was prepared in dimethoxyethane. この反応フラスコに、1.0mLの1,2−ジメトキシエタンに溶解した3−(2−チオテトラエチレングリコール)プロピオン酸(QuantaBiodesign,490mg,1.73mmol)の溶液を添加した。 To the reaction flask was added a solution of was dissolved in 1,2-dimethoxyethane 1.0 mL 3- (2-thio-tetraethylene glycol) propionic acid (QuantaBiodesign, 490mg, 1.73mmol). 撹拌しながら3.5時間、反応を進行させ、生成物をシリカクロマトグラフィにより、塩化メチレン中5%のメタノールで溶離して精製した。 Stirring 3.5 hours, the reaction was allowed to proceed for, by the product silica chromatography, eluting with 5% methanol in methylene chloride. 溶媒を真空中で除去して、432mg(64%の収率)の所望の生成物を得た。 The solvent was removed in vacuo to afford the desired product 432 mg (64% yield).

PySS−PEG −NHS[15−(2−ピリジルジチオ)−4,7,10,13−テトラオキサペンタデカン酸−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル]の合成 10mLの丸底フラスコに、15−(2−ピリジルジチオ)−4,7,10,13−テトラオキサペンタデカン酸(431mg,1.10mmol)、5.0mLの塩化メチレンおよび撹拌棒を投入した。 Round bottom flask 10mL of PySS-PEG 4 -NHS [15- ( 2- pyridyldithio) -4,7,10,13- tetra oxa pentadecane acid -N- hydroxysuccinimide ester], 15- (2-pyridyl dithio) -4,7,10,13- tetra oxa pentadecane acid (431 mg, 1.10 mmol), was charged with methylene chloride and stirring bar 5.0 mL. 7V−ヒドロキシスクシンイミド(3.6mg,0.31mmol)および1−[3−(ジメチルアミノ)プロピル]−3−エチルカルボジイミド塩酸塩(6.8mg,0.036mmol)を反応容器に添加し、室温で2時間、撹拌しながら反応を進行させた。 7V- hydroxysuccinimide (3.6 mg, 0.31 mmol) and 1- [3- (dimethylamino) propyl] -3-ethylcarbodiimide hydrochloride (6.8 mg, 0.036 mmol) was added to the reaction vessel, at room temperature 2 hours, the reaction was allowed to proceed with stirring. 生成物をシリカクロマトグラフィにより、塩化メチレン中7%の1,2−ジメトキシエタンで溶離して精製した。 The product silica chromatography, eluting with a 7% 1,2-dimethoxyethane in methylene chloride. 溶媒を真空中で除去して、206mg(38%の収率)の所望の生成物を得た。 The solvent was removed in vacuo to afford the desired product 206 mg (38% yield). MS:m/z:実測値:511.1(M+Na) ,計算値:511.2。 MS: m / z: Found: 511.1 (M + Na) + , calcd: 511.2.

15−(DM4−ジチオ)−4,7,10,13−テトラオキサペンタデカン酸の合成 N 2' −デアセチル−N 2' −(4−メルカプト−4−メチル−1−オキソペンチル)メイタンシン(DM4,18.6mg,0.0239mmol)および15−(2−ピリジルジチオ)−4,7,10,13−テトラオキサペンタデカン酸(14.0mg,0.0358mmol)の溶液を、0.75mLの1,2−ジメトキシエタン中で調製した。 15- (DM4- dithio) -4,7,10,13- Synthesis of N 2 tetraoxacyclononane pentadecane acid '- deacetyl -N 2' - (4-mercapto-4-methyl-1-oxopentyl) maytansine (DM4, 18.6mg, 0.0239mmol) and 15 (2-pyridyldithio) -4,7,10,13- tetra oxa pentadecane acid (14.0 mg, the solution 0.0358mmol), 1,2 of 0.75mL - it was prepared in dimethoxyethane. 4−メチルモルホリン(6.0mg,0.0597mmol)を反応容器に添加し、室温で24時間、撹拌しながら反応を進行させた。 Was added 4-methylmorpholine (6.0mg, 0.0597mmol) to the reaction vessel at room temperature for 24 hours, The reaction was allowed to proceed with stirring. 反応が完了すると、粗反応混合物を真空中で乾燥させ、さらに精製せずに用いた(図6)。 Upon completion of the reaction, the crude reaction mixture was dried in vacuo and used without further purification (Figure 6).

15−(DM4−ジチオ)−4,7,10,13−テトラオキサペンタデカン酸−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(DM4−SPEG −NHS)の合成 粗15−(DM4−ジチオ)−4,7,10,13−テトラオキサペンタデカン酸を2.0mLの塩化メチレンに溶解し、7V−ヒドロキシスクシンイミド(3.6mg,0.31mmol)および1−[3−(ジメチルアミノ)プロピル]−3−エチルカルボジイミド塩酸塩(6.8mg,0.036mmol)と合わせた。 15- (DM4- dithio) -4,7,10,13- synthetic crude 15- (DM4- dithio) of tetra oxa pentadecane acid -N- hydroxysuccinimide ester (DM4-SPEG 4 -NHS) -4,7,10 , 13-tetra oxa pentadecane acid was dissolved in 2.0mL of methylene chloride, 7V- hydroxysuccinimide (3.6 mg, 0.31 mmol) and 1- [3- (dimethylamino) propyl] -3-ethylcarbodiimide hydrochloride combined (6.8mg, 0.036mmol) and. 溶液を2.5時間撹拌し、生成物をシリカクロマトグラフィにより、塩化メチレン中4%のメタノールで溶離して精製した。 The solution was stirred for 2.5 hours, the product was purified by silica chromatography, eluting with a 4% methanol in methylene chloride. 溶媒を真空下で除去して、15.0mg(54%の収率)の所望の生成物を得た。 The solvent was removed in vacuo to give the desired product 15.0 mg (54% yield). MS:m/z:実測値:1179.3(M+Na) ,計算値:1179.4(図6)。 MS: m / z: Found: 1179.3 (M + Na) + , calcd: 1179.4 (Figure 6).

抗体分子あたり高い個数のメイタンシノイド分子を連結するための、親水性ポリエチレンオキシドスペーサー(PEG 、または(−CH −CH −O) n=J−I4 )を含むジスルフィドリンカーを用いる2工程の抗体コンジュゲーション: 2 step using for connecting the maytansinoid molecules higher number per antibody molecule, hydrophilic polyethyleneoxide spacers (PEG n, or (-CH 2 -CH 2 -O) n = J-I4) disulfide linker comprising antibody conjugation of:
親水性スペーサー、例えばポリエチレンオキシド(PEG 、または(−CH −CH −O) n=I−I4 )を含む新規のヘテロ二官能性試薬を用いて抗体を修飾し、続いてDM4チオールとコンジュゲートさせたときに、新規の観察が得られた。 Hydrophilic spacer, modified such as polyethylene oxide (PEG n, or (-CH 2 -CH 2 -O) n = I-I4) antibodies using heterobifunctional reagents novel including, followed DM4 thiol and when conjugated, new observations were obtained. 親水性PEG スペーサーを有する抗体−メイタンシノイドコンジュゲートのコンジュゲーション混合物は、何ら沈殿を示さず、非常に高いモノマー画分(>90%)で高いコンジュゲート収率(>70%)を一貫して与えた。 Antibodies having hydrophilic PEG n spacers - maytansinol conjugation mixture maytansinoid conjugates, no not exhibit precipitation, consistently very high monomer fraction (> 90%) with a high conjugate yield (> 70%) to give. 一例として、8mg/mlの濃度のヒト化抗体を、抗体濃度に対して数倍モル過剰のPySS−PEG −NHS試薬で、pH8の緩衝液中において30℃で1時間修飾し、次いでゲル濾過により精製した。 As an example, a humanized antibody at a concentration of 8 mg / ml, the number-fold molar excess of PySS-PEG 4 -NHS reagents for antibody concentration, then 1 hour modification at 30 ° C. in a buffer at pH 8, followed by gel filtration It was purified by. 抗体分子あたりの連結されたジチオピリジル基は、過剰のジチオトレイトールを用いてアリコートの2−チオピリドン放出アッセイにより約4〜16個であると推定され、これに基づいて、pH6.5、25℃で一晩のコンジュゲーション工程について、1.4倍モル過剰のDM4メイタンシノイドチオールをジチオピリジル−PEG −リンカー修飾した抗体の各溶液に添加し、次いでコンジュゲートをゲル濾過により精製した(図12)。 Linked dithiopyridyl groups per antibody molecule, is estimated to be about 4 to 16 by aliquots of 2-thiopyridone release assay with excess dithiothreitol, and based on this, PH6.5,25 ° C. in the overnight conjugation step, the DM4 maytansinoid thiol 1.4-fold molar excess dithiopyridyl-PEG n - were added to each solution of linker-modified antibody, and then the conjugate was purified by gel filtration (Fig. 12). 種々の初期リンカー組み込みを有する種々のコンジュゲーション混合物について抗体あたり組み込まれたメイタンシノイドの最終値は、抗体分子あたり平均3〜9個のメイタンシノイドの範囲であり、沈殿は観察されず、>70%の収率および非常に高いモノマーであった(20%イソプロパノールまたは0.4M過塩素酸ナトリウムを用いるサイズ排除TSK−GEL G3000 HPLCに基づいて>90%のモノマー)。 The final value of the maytansinoid built antibody per the various conjugation mixtures with different initial linker incorporation, the average 3-9 amino maytansinoids range of maytansinoid per antibody molecule, precipitation was not observed,> It was 70% of the yield and very high monomer (20% isopropanol or on the basis of size exclusion TSK-GEL G3000 HPLC using 0.4M sodium perchlorate> 90% of the monomers). 最終コンジュゲート中のコンジュゲートされていない薬物は0.6%未満であることがHiSep Mixed−Modeクロマトグラフィ(HiSepカラム、Supelco)により測定され、メイタンシノイドが抗体に共有結合的に連結したことを示した。 HiSep Mixed-Mode chromatography (HiSep column, Supelco) be conjugated non drug is less than 0.6% in the final conjugate are determined by, that the maytansinoid is covalently linked to the antibody Indicated. 別の例において、8mg/mlの濃度のヒト化抗体を、抗体濃度に対して数倍モル過剰のPySS−PEG −NHS試薬で、pH6.5の緩衝液中において25℃で1.5時間修飾し、次いでゲル濾過により精製した。 In another example, a humanized antibody at a concentration of 8 mg / ml, the number-fold molar excess of PySS-PEG 4 -NHS reagents for antibody concentration, 1.5 hours at 25 ° C. in a buffer at pH6.5 modified, and then purified by gel filtration. 抗体試料上のジチオピリジル−PEG 保持リンカー基は抗体分子あたり6〜18個と推定され、次いでこれを1.3〜1.7倍モル過剰のDM4メイタンシノイドチオールとpH6.5、25℃で一晩反応させ、次いでゲル濾過により精製した。 Dithiopyridyl-PEG n holding linker groups on antibody samples were estimated as 6-18 per antibody molecule, then 1.3-1.7 fold molar excess of DM4 maytansinoid thiol and PH6.5,25 ° C. This in reacted overnight, then purified by gel filtration. 沈殿は観察されず、約1〜2mg/mlで抗体−メイタンシノイドコンジュゲート最終試料は高いモノマー画分(>90%)を示し、これは、凝集がなく、抗体分子あたり約3.1〜7.1個の高い個数のメイタンシノイドが共有結合的に付着しており、コンジュゲートされていないメイタンシノイドが非常に少ないことを示した(HiSepクロマトグラフィにより推定された、コンジュゲートされていないメイタンシノイドは<1.7%)。 Precipitation is not observed, about 1-2 mg / ml in antibody - maytansinoid conjugates final sample showed high monomer fraction (> 90%), which, aggregation without about per antibody molecule 3.1 to 7.1 pieces of high number of maytansinoid has covalently attached, maytansinoids unconjugated showed that very few (estimated by HiSep chromatography, unconjugated maytansinoid <1.7%). 抗体あたりの薬物負荷が高いこのコンジュゲートは、4℃での貯蔵に際し、分析した最長期間(1.5カ月間)まででも安定であった。 The conjugate drug load is high per antibody, upon storage at 4 ° C., was stable up analyzed maximum period (1.5 months).

抗体分子あたり高い個数のメイタンシノイド分子を連結するための、親水性ポリエチレンオキシドスペーサー(PEG 、または(−CH −CH −O) n=Li4 )を含むジスルフィドリンカーを用いる1工程の抗体コンジュゲーション: For coupling maytansinoid molecules per antibody molecule higher number, hydrophilic polyethylene oxide spacer (PEG n or (-CH 2 -CH 2 -O) n = Li4,) 1 process using a disulfide linker comprising antibodies conjugation:
1工程コンジュゲーションのアプローチにおいて、親水性ポリエチレンオキシドスペーサー(PEG 、または(−CH −CH −O) n=I−I4 )を含むジスルフィドリンカーを用いた抗体−メイタンシノイドコンジュゲートを、4mg/mlの濃度のヒト化抗体と10〜20倍モル過剰のDM4−SPEG −NHS試薬とをpH8の緩衝液中30℃で2時間コンジュゲートさせた後にゲル濾過により精製することによって生成させ、抗体分子あたり6.6個のコンジュゲートされたメイタンシノイド(82%のモノマー)を含む1.4mg/mlの濃度の抗体−メイタンシノイドコンジュゲートを得た(図11)。 In approach one step conjugation, hydrophilic polyethyleneoxide spacers (PEG n, or (-CH 2 -CH 2 -O) n = I-I4) antibodies using a disulfide linker comprising - maytansinoid conjugates, was generated by purifying by gel filtration after 4 mg / ml concentration of the humanized antibody and 10 to 20-fold molar excess and DM4-SPEG 4 -NHS reagent was 2 hours the conjugate in 30 ° C. in a buffer pH8 , 1.4 mg / ml concentration of antibodies including antibody molecules 6.6 amino conjugated maytansinoid per (82% monomer) - maytansinol to give a maytansinoid conjugates (Figure 11). したがって、2工程および1工程のアプローチの両方により、親水性ポリエチレンオキシドスペーサー(PEG 、または(−CH −CH −O) n=M4 )を含むジスルフィドリンカーを用いて、抗体分子あたり高い数の連結されたメイタンシノイドが得られた。 Thus, 2 by both approaches steps and one step, using a disulfide linker comprising a hydrophilic polyethylene oxide spacer (PEG n or, (-CH 2 -CH 2 -O) n = M4), high number per antibody molecule linked maytansinoid was obtained.

実施例HI Example HI
親水性ポリエチレンオキシドスペーサー(PEG 、または(−CH −CH −OU)を含有するチオエーテルリンカーによる、抗体と、抗体分子あたり数個の連結されたメイタンシノイド分子とのコンジュゲーション 抗体のリジン残基を直接修飾するために、SPPから誘導した従来の脂肪族リンカー、例えば常套の脂肪族リンカーを有するメイタンシノイドのiV−ヒドロキシスクシンイミドエステル(W.C.Widdisonら、J.Med.Chem.,2006,49,4392−4408に記載されている)をまず用いて、抗体を1工程方法でコンジュゲートさせた。ヒト化抗体と、試験試薬としての8倍モル過剰の5mg/mlのDM1−SPP−NHS試薬とを、pH8の緩衝液中30℃で2時間コンジュゲートさ Hydrophilic polyethyleneoxide spacers (PEG n or (by thioether linker containing a -CH 2 -CH 2 -OU),, antibody, lysine conjugation antibodies with maytansinoid molecules several linked per antibody molecule to modify the residues directly conventional aliphatic linker derived from SPP, for example, maytansinoids having a conventional aliphatic linker iV- hydroxysuccinimide ester (W.C.Widdison et, J.Med.Chem. using firstly have) been described in 2006,49,4392-4408, antibodies conjugated with 1-step method. humanized antibodies, eight-fold molar excess of 5 mg / ml as test reagent DM1- the SPP-NHS reagent, 2 hours conjugate of at 30 ° C. in a buffer pH8 せる試み(続いてゲル濾過および透析による)は、かなりの沈殿および凝集を生じ、したがって最終コンジュゲートはわずか61%のモノマーであり、抗体あたり連結したメイタンシノイドは約3.3個であった。対照的に、DM1−MaI−PEG −NHS試薬を同様の条件下で用いると1.1mg/mlで抗体あたり5.4個のメイタンシノイド分子が連結したコンジュゲートが得られ、最終コンジュゲート中に沈殿はなかった(図7または9)。同様に、DM1−MaI−PEG −NHS試薬を用いて、抗体分子あたり高い数の連結されたメイタンシノイドがチオエーテル結合を介してコンジュゲートされたものを得た。別の例において、ネズミIgG 抗体を4mg/mlで10および20倍モル過剰のDM1−MaI−P Attempts (by subsequently gel filtration and dialysis) to results in significant precipitation and aggregation, thus the final conjugate was only 61% of the monomers, maytansinoids linked per antibody is about 3.3 units . in contrast, DM1-MaI-PEG 4 conjugate -NHS reagent is 5.4 pieces of maytansinoid molecules per antibody at 1.1 mg / ml when used under similar conditions linked to obtain a final Gongju precipitated in the gate was not (Fig. 7 or 9). Similarly, DM1-MaI-PEG with 2 -NHS reagent conjugate linked maytansinoid high number per antibody molecule via thioether bonds was obtained those in. in another example, 10 and 20 fold molar murine IgG 1 antibody 4 mg / ml excess DM1-MaI-P −NHS試薬と、pH8の緩衝液中30℃で2時間コンジュゲートさせ、続いてゲル濾過して、約1mg/mlの濃度の抗体−メイタンシノイドコンジュゲートを得、抗体分子あたり4.1および7.8個のメイタンシノイド分子が共有結合的にコンジュゲートし(98%のモノマー)、コンジュゲートされていない薬物は検出不可能なレベルであった(HiSep HPLCアッセイ)。別の例において、ヒト化抗体を過剰のDM1−MaI−PEG −NHS試薬とコンジュゲートさせて、抗体あたり平均10.7個の連結メイタンシノイド分子を得た(99%モノマー;1.1mg/mlの濃度)。図8および図10に概説した2工程コンジュゲーション手段を用いて、抗体からPEG 連結チオエーテルコンジュゲートも調製 And G 4 -NHS reagent, for 2 hours the conjugate in 30 ° C. in buffer pH 8, followed by gel filtration to, antibody at a concentration of about 1 mg / ml - give maytansinoid conjugates, per antibody molecule 4. 1 and 7.8 single maytansinoid molecule covalently conjugated (98% monomer), a drug that is not conjugated was undetectable levels (HiSep HPLC assay). another example in the humanized antibody by excess DM1-MaI-PEG 4 -NHS reagent conjugated to obtain an average 10.7 of the connecting maytansinoid molecules per antibody (99% monomer; of 1.1 mg / ml concentration). using a two-step conjugation means outlined in FIGS. 8 and 10, also PEG 4 connected thioether conjugate from the antibody preparation した。 did. したがって、親水性リンカー、例えばPEG または(−CH −CH −O) の使用により、抗体あたり多数のメイタンシノイド分子を導入することができる(例えば図1、2、4、5、7、8、9、10、13、14、15、16、17、18、19、20および21を参照)。 Accordingly, the hydrophilic linker, such as PEG n or by the use of (-CH 2 -CH 2 -O) n , can be introduced a large number of maytansinoid molecules per antibody (e.g. FIG. 1, 2, 4, 5, see 7,8,9,10,13,14,15,16,17,18,19,20 and 21).

DM1−MaI−PEG −NHSの合成 N 2' −デアセチル−7V 2' −(3−メルカプト−1−オキソプロピル)−メイタンシン(DM1,13.4mg,0.0182mmol)の溶液を0.70mLのTHF中で調製し、スクシンイミジル−[(N−マレイミドプロピオンアミド)−ジエチレングリコール]エステル(NHS−PEG −マレイミド,Quanta Biodesign,11.6mg,0.0273mmol)を、水性リン酸カリウム緩衝液(50mM,pH6)およびTHFの1.5mLの2:1(v/v)混合物中において添加した。 DM1-MaI-PEG 2 Synthesis of -NHS N 2 '- deacetyl -7V 2' - (3- mercapto-1-oxopropyl) - maytansine (DM1,13.4mg, 0.0182mmol) solution of 0.70mL of was prepared in THF, succinimidyl - [(N-maleimidopropionamido) - diethylene glycol] ester (NHS-PEG 2 - maleimide, Quanta Biodesign, 11.6mg, 0.0273mmol) and aqueous potassium phosphate buffer (50 mM, pH 6) and THF in 1.5 mL 2: was added in 1 (v / v) mixture. 室温で撹拌しながら1時間、反応を進行させ、TLC分析は反応が完了したことを示した。 1 hour at room temperature with stirring, the reaction proceeded, TLC analysis indicated that the reaction was complete. 粗反応混合物をシリカクロマトグラフィにより、塩化メチレン中8%のエタノールで溶離して精製した;溶媒を真空下で除去して、6.0mg(28%の収率)の所望の生成物を得た。 The crude reaction mixture by silica chromatography, eluting with ethanol 8% in methylene chloride; the solvent was removed in vacuo to give the desired product 6.0 mg (28% yield). MS:m/z実測値:1185.3(M+Na) ,計算値:1184.4(図4)。 MS: m / z Found: 1185.3 (M + Na) + , calcd: 1184.4 (Figure 4).

DM1−MaI−PEG −NHSの合成 N 2' −デアセチル−N 2' −(3−メルカプト−1−オキソプロピル)−メイタンシン(DM1,28.1mg,0.0381mmol)の溶液を0.50mLのTHF中で調製し、スクシンイミジル−[(N−マレイミドプロピオンアミド)−テトラエチレングリコール]エステル(NHS−PEG −マレイミド,Quanta Biodesign,39.1mg,0.0762mmol)を、水性リン酸カリウム緩衝液(50mM,pH6)およびTHFの1.5mLの2:1(v/v)混合物中において添加した。 DM1-MaI-PEG 4 Synthesis of -NHS N 2 '- deacetyl -N 2' - (3- mercapto-1-oxopropyl) - maytansine (DM1,28.1mg, 0.0381mmol) solution of 0.50mL of was prepared in THF, succinimidyl - [(N-maleimidopropionamido) - tetraethylene glycol] ester (NHS-PEG 4 - maleimide, Quanta Biodesign, 39.1mg, 0.0762mmol) and aqueous potassium phosphate buffer ( 50 mM, pH 6) and THF in 1.5 mL 2: was added in 1 (v / v) mixture. 室温で撹拌しながら1時間、反応を進行させ、TLC分析は反応が完了したことを示した。 1 hour at room temperature with stirring, the reaction proceeded, TLC analysis indicated that the reaction was complete. 粗反応混合物をシリカクロマトグラフィにより、塩化メチレン中6%のエタノールで溶離して精製した;溶媒を真空下で除去して、9.6mg(20%の収率)の所望の生成物を得た。 The crude reaction mixture by silica chromatography, eluting with ethanol 6% in methylene chloride; the solvent was removed in vacuo to give the desired product 9.6 mg (20% yield). MS:m/z実測値:1273.5(M+Na) ,計算値:1273.5(図4)。 MS: m / z Found: 1273.5 (M + Na) +, calcd: 1273.5 (Figure 4).

実施例IV Example IV
高メイタンシノイド保持抗体種の質量分析: High maytansinoid retention antibody species mass spectrometry:
親水性PEGリンカーを有する高メイタンシノイド保持抗体種を分析するために、抗体あたり平均10.7個のDM1を含む非常に高いメイタンシノイド保持Ab−PEG −MaI−DM1コンジュゲートを選択した。 To analyze the high maytansinoid retaining antibody species having a hydrophilic PEG linkers were selected very high maytansinoid holding Ab-PEG 4 -MaI-DM1 conjugate comprising an antibody per average 10.7 of DM1 . 該コンジュゲートを脱グリコシル化し、次いでESI−TOF MSにより分析した(図22)。 The conjugate was deglycosylated and then analyzed by ESI-TOF MS (Figure 22). 質量スペクトルは、抗体あたり薬物4〜15個の範囲の種々の数の連結されたメイタンシノイドで標識された種々の抗体種を示し、抗体あたり薬物8〜9個付近に最大値を有する。 Mass spectrum shows various numbers various antibody species labeled with linked maytansinoid ranging 4-15 drugs per antibody, with a maximum in the vicinity of 8-9 pieces antibody per drug. この分布は正規であり、高い薬物保持種について選択的な消失が見られなかったことを示唆し、これは最終コンジュゲートの高い溶解度と一致する。 This distribution is normal, suggesting that did not show a selective loss for high drug retention species, which is consistent with the high solubility of the final conjugate. 抗体あたり平均10.7個のDM1を含む高メイタンシノイド保持Ab−PEG −MaI−DM1コンジュゲートのサイズ排除クロマトグラフィHPLCは、驚くべきことに高い>99%の量のモノマーを示した(図23)。 Size exclusion chromatography HPLC high maytansinoid holding Ab-PEG 4 -MaI-DM1 conjugate containing an average of 10.7 of DM1 per antibody is higher surprisingly> showed 99% of the amount of the monomer (Fig. 23).

実施例V Example V
高メイタンシノイド保持抗体種のFACS結合は非修飾抗体の該結合に類似する: FACS binding of high maytansinoid retaining antibody species is similar to said binding of the unmodified antibody:
EpCAM、CanAgおよびCD56などの種々の標的に対する、いくつかの抗体の高メイタンシノイド保持コンジュゲートの結合を、フローサイトメトリーにより非修飾抗体と比較した。 EpCAM, for various targets, such as CanAg and CD56, some of the binding of the high maytansinoid holding Conjugates of the antibody, compared to non-modified antibody by flow cytometry. 要約すると、抗原陽性細胞をコンジュゲートまたは非修飾抗体と共に4℃でインキュベートし、次いで二次抗体FITCコンジュゲートと共に4℃でインキュベートし、ホルムアルデヒド(PBS中1%)で固定し、フローサイトメトリーにより分析した。 In summary, incubating antigen-positive cells at 4 ° C. with conjugates or unmodified antibodies, followed by incubation at 4 ° C. with the secondary antibody FITC-conjugated, fixed with formaldehyde (1% in PBS), and analyzed by flow cytometry did. 評価したすべてのコンジュゲートについて、コンジュゲートの結合と非修飾抗体の結合との間に有意な差は観察されなかった。 For all of the conjugates evaluated, significant differences between the binding of the binding and non-modified antibody of the conjugate was observed. 一例を図24に示し、ここで、10.7個のメイタンシノイド保持Ab−PEG −MaI−DM1コンジュゲートが非修飾抗体のものに類似する高い親和性によって抗原陽性細胞に結合した。 An example is shown in Figure 24, where, bound to antigen-positive cells by high affinity 10.7 maytansinoid holding Ab-PEG 4 -MaI-DM1 conjugate is similar to that of the unmodified antibody.

実施例VI EXAMPLE VI
ポリエチレンオキシドスペーサー(PEG 、または(−CH −CH −O) )を含有するチオエーテルおよびジスルフィドリンカーを含む、抗体のメイタンシノイドコンジュゲートのインビトロ細胞毒性評価 PEG スペーサーを含有するチオエーテルおよびジスルフィドリンカーを含む抗体−メイタンシノイドコンジュゲートの細胞毒性効果を、WST−8細胞生存率アッセイを用いて、癌細胞とコンジュゲートとの4〜5日連続のインキュベーションの後に典型的に評価した。 Polyethylene oxide spacer comprising (PEG n or (-CH 2 -CH 2 -O) n ,) thioether and disulfide linkers containing, thioethers and containing in vitro cytotoxicity evaluation PEG n spacers antibody maytansinoid conjugates antibody containing disulfide linker - a maytansinol cytotoxic effect of maytansinoid conjugates, using WST-8 cell viability assays were typically evaluated after incubation of 4-5 consecutive days with cancer cells conjugated. 抗原発現癌細胞(約1000〜5000細胞/ウェル)を、96ウェルプレートにおいて、ウシ胎仔血清を種々の濃度の抗体−メイタンシノイドコンジュゲートと共に含有する慣習的な成長培地において約5日間インキュベートした。 The antigen-expressing cancer cells (about 1000 to 5000 cells / well) in 96-well plates, fetal bovine serum and various concentrations of the antibody - incubation in conventional growth medium containing with maytansinoid conjugates for about 5 days. 次いでWST−8試薬を添加し、約2〜5時間後に450nmにおけるプレートの吸光度を測定した。 Then added WST-8 reagent, the absorbance was measured of the plate at 450nm after about 2-5 hours. 生存画分をコンジュゲート濃度に対してプロットして、コンジュゲートの/C 50値(50%の細胞が死滅する濃度)を求めた。 By plotting the survival fraction relative to conjugate concentration was determined / C 50 value of the conjugate (concentration at which 50% of the cells are killed).

図25は、抗EpCAM Ab−メイタンシノイドコンジュゲートの有効性の、PEG 連結チオエーテルコンジュゲート(Ab−PEG −MaI−DM1)のための薬物負荷の増加に伴う向上を示し、これは、抗体あたり約4個のメイタンシノイドの同様の薬物負荷におけるチオエーテル連結SMCC−DM1およびジスルフィド連結SPDB−DM4コンジュゲートよりも、EpCAM抗原陽性COLO205−多剤耐性細胞(COLO205−MDR細胞)に対する有効性が大きいことも示す。 Figure 25 is the efficacy of anti-EpCAM Ab- maytansinoid conjugates, showed improvement with increasing drug loading for PEG 4 linked thioether conjugate (Ab-PEG 4 -MaI-DM1 ), which, than thioether linked SMCC-DM1 and disulfide-linked SPDB-DM4 conjugates at similar drug loads of about 4 maytansinoid per antibody, the effectiveness against EpCAM antigen-positive COLO205- multidrug resistant cells (COLO205-MDR cells) large it is also shown. メイタンシノイド負荷が4.1および7.8のチオエーテル連結抗EpCAM Ab−PEG −MaI−DM1コンジュゲートの有効性は新規であり、治療的適用にとって非常に有望な可能性を有する。 Effectiveness of maytansinol thioether linking the maytansinoid loads 4.1 and 7.8 anti-EpCAM Ab-PEG 4 -MaI-DM1 conjugates are novel, it has a very promising potential for therapeutic application.

図26は、CanAg抗原陽性COLO205−MDRに対する抗CanAg Ab−メイタンシノイドコンジュゲートの細胞毒性を示す。 Figure 26 shows the anti-CanAg Ab- maytansinoid conjugates cytotoxicity to CanAg antigen-positive COLO205-MDR. この場合も、チオエーテル連結Ab−PEG −MaI−DM1およびAb−PEG −MaI−DM1コンジュゲートは、同様のメイタンシノイド負荷を有するチオエーテル連結Ab−SMCC−DM1コンジュゲートと比較して、より大きい有効性を示した。 Again, thioether linked Ab-PEG 4 -MaI-DM1 and Ab-PEG 2 -MaI-DM1 conjugate, as compared to the thioether-linked Ab-SMCC-DM1 conjugates with similar maytansinoid load, more It showed a large effectiveness.

図27は、CD56発現Molp−8多発性骨髄腫細胞に対する、PEG含有チオエーテルおよびジスルフィドリンカーを有する抗CD56抗体−メイタンシノイドコンジュゲートの細胞毒性活性を示す。 27, for CD56 expression Molp-8 multiple myeloma cells, anti-CD56 antibodies with PEG-containing thioether and disulfide linkers - shows maytansinoid conjugates of cytotoxic activity. 抗体あたり7.7個の薬物を有するチオエーテル連結PEG4コンジュゲート(Ab−PEG MaI−DM1)は、3.8個の薬物を持つコンジュゲート(/C 50 =1.9nM)と比較して、細胞毒性有効性の予想されない100倍の増大を示した(/C 50値0.019nM)。 Thioether linked PEG4 conjugates with 7.7 drugs per antibody (Ab-PEG 4 MaI-DM1 ) , as compared to the conjugate with 3.8 units of drug (/ C 50 = 1.9nM), showed increased 100-fold that unexpected cytotoxic efficacy (/ C 50 value 0.019nM).

図28は、EpCAM陽性多剤耐性HCT15細胞に対する、PEG 連結チオエーテルコンジュゲートを持つ抗EpCAM Ab−メイタンシノイドコンジュゲート(Ab−PEG −MaI−DM1)の有効性が、抗体あたり約4個のメイタンシノイドの同様の薬物負荷の従来のチオエーテル連結SMCC−DM1に対して向上したことを示す。 Figure 28 is against EpCAM-positive multi-drug resistant HCT15 cells, efficacy of anti-EpCAM Ab- maytansinoid conjugates with PEG 4 connecting thioether conjugate (Ab-PEG 4 -MaI-DM1 ) is about 4 per antibody indicating that the improved conventional respect thioether linked SMCC-DM1 similar drug loading maytansinoid. チオエーテル連結抗EpCAM Ab−PEG −MaI−DM1コンジュゲートの高い有効性は新規の所見であり、治療的適用にとって非常に有望な可能性を有する。 High efficacy of thioether linked anti EpCAM Ab-PEG 4 -MaI-DM1 conjugate is a novel finding has a very promising potential for therapeutic application. 図29は、EpCAM陽性多剤耐性COLO205細胞に対する、PEG 連結チオエーテルコンジュゲートを持つ抗EpCAM Ab−メイタンシノイドコンジュゲート(Ab−PEG −MaI−DM1)の有効性が、抗体あたり約4個のメイタンシノイドの同様の薬物負荷の従来のチオエーテル連結SMCC−DM1より向上したことを示す。 29, against EpCAM-positive multi-drug resistant COLO205 cells, efficacy of anti-EpCAM Ab- maytansinoid conjugates with PEG 4 connecting thioether conjugate (Ab-PEG 4 -MaI-DM1 ) is about 4 per antibody indicating that improved over conventional thioether linked SMCC-DM1 similar drug loading maytansinoid. チオエーテル連結抗EpCAM Ab−PEG −MaI−DM1コンジュゲートの向上した有効性は新規の所見であり、治療的適用にとって非常に有望な可能性を有する。 Improved effectiveness of the thioether linked anti EpCAM Ab-PEG 4 -MaI-DM1 conjugate is a novel finding has a very promising potential for therapeutic application. 図37は、EGFR陽性UO−31ヒト腎癌腫細胞に対する、親水性チオエーテル結合PEG リンカーを有する抗EGFR Ab−メイタンシノイドコンジュゲート(Ab−PEG −MaI−DM1)の細胞毒性が、3.7個のメイタンシノイド/Abを有する非親水性SMCC−DM1コンジュゲートと比較して著しく向上したことを示す。 Figure 37 is against EGFR positive UO-31 human renal carcinoma cells, the cytotoxicity of anti-EGFR Ab- maytansinoid conjugates (Ab-PEG 4 -MaI-DM1 ) having a hydrophilic thioether bond PEG 4 linker, 3. indicating that the significantly improved as compared to seven maytansinol non-hydrophilic SMCC-DM1 conjugates with proteinoid / Ab. PEG −MaI−DM1の有効性は、常套のリンカーを有するSMCC−DM1コンジュゲートのものより約10倍大きかった。 Efficacy of PEG 4 -MaI-DM1 was about 10 times greater than that of the SMCC-DM1 conjugates with conventional linkers.

実施例VII Example VII
インビボ薬物動態: In vivo Pharmacokinetics:
親水性PEG リンカーを含有し6.7D/A(メイタンシノイド/抗体)を持つヒト化−抗CD56抗体(Ab)−PEG −MaI−DM1コンジュゲートの血漿薬物動態を、常套の脂肪族炭素鎖リンカーを含有し4D/Aを持つAb−SMCC−DM1コンジュゲートのものと比較した(図38A)。 Humanized with containing a hydrophilic PEG 4 linker 6.7D / A (maytansinoid / antibody) - Plasma pharmacokinetics of anti-CD56 antibody (Ab) -PEG 4 -MaI-DM1 conjugate, aliphatic conventional It was compared to that of Ab-SMCC-DM1 conjugates with 4D / a contains a carbon chain linker (Figure 38A). CD1マウスに5mg/kgのコンジュゲートを単回ボーラスにより静脈内注射した(抗体基準の用量;グループあたり3匹のマウス)。 In CD1 mice a conjugate of 5 mg / kg injected intravenously by a single bolus (antibody standard dose; 3 mice per group). 血漿サンプルを4週間までの数回の時点で収集した。 Plasma samples were collected at several time points up to 4 weeks. 血漿サンプルを抗体濃度およびコンジュゲート濃度についてELISAを用いて分析した。 Plasma samples were analyzed using ELISA for antibody concentration and conjugate concentration. 抗体ELISAについては、コーティングした固定化−ヤギ−抗ヒトIgG(H+L)抗体を含有するマイクロタイタープレートに血漿サンプルを添加し、洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートしたヤギ−抗ヒトIgG(Fcγ)抗体を用いて検出した。 For antibody ELISA, coated immobilized - goat - added plasma sample in a microtiter plate containing anti-human IgG (H + L) antibody, washed, horseradish peroxidase-conjugated goat - anti-human IgG (Fc.gamma.) Antibody It was detected using. コンジュゲート濃度については、コーティングした固定化−ヤギ−抗ヒトIgG(H+L)抗体を含有するマイクロタイタープレートに血漿サンプルを添加し、洗浄し、ビオチニル化−抗メイタンシン抗体およびアルカリホスファターゼコンジュゲートしたストレプトアビジンを用いて検出した。 The conjugate concentration, coated immobilized - goat - added plasma sample in a microtiter plate containing anti-human IgG (H + L) antibody, washed, biotinylated - anti maytansine antibody and alkaline phosphatase conjugated streptavidin It was detected using. 抗体濃度およびコンジュゲート濃度の両方のELISA結果は、親水性PEG リンカーを有し6.7DM1/Abの高い負荷を持つAb−PEG −MaI−DM1コンジュゲートが4週間の研究期間にわたって血漿中に良好に保持されることを証明した。 Both ELISA results for antibody concentration and conjugate concentration in plasma over Ab-PEG 4 -MaI-DM1 study period conjugate 4 weeks with a high load of 6.7DM1 / Ab has a hydrophilic PEG 4 linker It proved to be better retained in the.

図38Aは、PEG リンカーを用いた、高いメイタンシノイド負荷(6.7DM1/Ab)を有する抗体−メイタンシノイドコンジュゲートのインビボ薬物動態を、4DM1/Abを持つ標準的なリンカーコンジュゲートと比較して示す。 Figure 38A was used PEG 4 linker, high maytansinoid load (6.7DM1 / Ab) antibodies with - a maytansinol vivo pharmacokinetics of maytansinoid conjugates, a standard linker conjugate with 4DM1 / Ab compared to shows. 高いメイタンシノイド負荷によってでも、6.7個のメイタンシノイド/Abを有するPEG 連結チオエーテルコンジュゲート(Ab−PEG −MaI−DM1)は、標準的なコンジュゲートより長い半減期を有する。 But the high maytansinoid load, 6.7 pieces of maytansinol PEG having a maytansinoid / Ab 4 connected thioether conjugate (Ab-PEG 4 -MaI-DM1 ) have a longer half-life than the standard conjugate. 別の例において、 H標識DM1を有するヒト化C242Ab−PEG −MaI− H−DM1コンジュゲート(3.3個のメイタンシノイド/Ab)の血漿薬物動態を、コンジュゲートしていない抗体、および常套の脂肪族炭素鎖リンカーを含有する同様の4.2D/Aの負荷を持つAb−SMCC− H−DM1コンジュゲートと、CD−1マウスにおいて10〜12mg/kgの静脈内用量で比較した(図38B)。 In another eg, 3 H plasma pharmacokinetics of a humanized having labeled DM1 C242Ab-PEG 4 -MaI- 3 H -DM1 conjugate (3.3 amino maytansinoid / Ab), unconjugated antibody , and the Ab-SMCC- 3 H-DM1 conjugate with loads of similar 4.2D / a containing conventional aliphatic carbon chain linker, intravenous doses of 10-12 mg / kg in CD-1 mice were compared (Fig. 38B). Ab−PEG −MaI− H−DM1コンジュゲートは、4週間にわたって、同様のメイタンシノイド負荷を持つ常套のSMCCリンカーコンジュゲートと比較してより高い血漿濃度を示し、これは、抗体濃度(ELISA;図38B)およびコンジュゲート濃度( H標識計数)の両方により測定された。 Ab-PEG 4 -MaI- 3 H- DM1 conjugate, for 4 weeks, showed higher plasma concentrations compared with conventional SMCC linker conjugates with similar maytansinoid load, which is the antibody concentration ( It measured by both FIG. 38B) and conjugate concentrations (3 H-labeled counting); ELISA. PEG −MaI連結コンジュゲートの半減期は、SMCC連結コンジュゲートについての12.6日と比較して16日であり、したがって、SMCCコンジュゲートよりもはるかに向上した(図38B)。 The half-life of the PEG 4 -MaI linked conjugate is twelve. 6th compared to 16 days with about SMCC linked conjugates, therefore, was much improved over SMCC conjugate (Figure 38B). 重要なことに、CD−1マウスにおいて、3.3D/Aを有するAb−PEG −MaI−DM1コンジュゲートの、10mg/kgの静脈内用量における曲線下面積(AUC)(AUC=38790h.μg/mL)は、コンジュゲートしていない抗体の、同様の12mg/kgの静脈内用量におけるもの(AUC=38798h.μg/mL)と類似しており、4.2D/Aを有するAb−SMCC−DM1コンジュゲートの、10mg/kgの静脈内用量におけるもの(AUC=25910h.μg/mL)よりもはるかに良好であった(図38B)。 Importantly, CD-1 in mice, 3.3D / of Ab-PEG 4 -MaI-DM1 conjugates with A, 10 mg / area under the curve in the intravenous dose of kg (AUC) (AUC = 38790h.μg / mL) is the antibody that is not conjugated, it is similar to ones (AUC = 38798h.μg / mL) in intravenous dose of same 12mg / kg, Ab-SMCC- with 4.2D / a DM1 conjugate was much better than those in the intravenous dose of 10mg / kg (AUC = 25910h.μg / mL) (Figure 38B).

実施例VIII Example VIII
耐性大腸癌(HCT15)異種移植に対する抗EpCAM−メイタンシノイドコンジュゲート、muB38.1−MCC−DM1およびmuB38.1−PEG4−mal−M1コンジュゲートのインビボ抗腫瘍活性の比較 muB38.1−MCC−DM1およびmuB38.1−PEG4−mal−DM1コンジュゲートの抗腫瘍効果を、P糖タンパク質を過剰発現して種々の薬物に対し耐性であることが示されているヒト大腸癌腫HCT15の異種移植モデルにおいて評価した。 Anti EpCAM- maytansinoid conjugates against resistant colon cancer (HCT15) xenografts, comparison of muB38.1-MCC-DM1 and muB38.1-PEG4-mal-M1 conjugate in vivo antitumor activity muB38.1-MCC- DM1 and muB38.1-PEG4-mal-DM1 the antitumor effect of the conjugate, in a xenograft model of human colon carcinomas HCT15 that have been shown to overexpress P-glycoprotein is resistant to various drugs evaluated. HCT15細胞をSCIDマウスの右肩下の領域に皮下注射した(1×10 細胞/動物)。 HCT15 cells were injected subcutaneously in the area under the right shoulder of SCID mice (1 × 10 7 cells / animal). 腫瘍の体積が約140mm のサイズに達した時点で(腫瘍細胞接種後9日)、マウスを腫瘍体積によりランダム化して3グループに分け(5匹/グループ)、各グループをmuB38.1−MCC−DM1(コンジュゲートタンパク質20mg/kg)、muB38.1−PEG4−mal−DM1(コンジュゲートタンパク質20mg/kg)またはリン酸緩衝化生理食塩水(ビヒクル対照)のいずれかの静脈内単回ボーラスで処置した。 When the volume of the tumors reached a size of approximately 140 mm 3 (9 days post tumor cell inoculation), mice were divided into 3 groups by randomized by tumor volume (5 mice / group), each group muB38.1-MCC -DM1 (conjugated protein 20mg / kg), muB38.1-PEG4-mal-DM1 in either single intravenous bolus of (conjugated protein 20 mg / kg) or phosphate buffered saline (vehicle control) We were treated. 腫瘍サイズを週2回測定することにより腫瘍の成長をモニタリングした。 We were monitoring the growth of the tumor by measuring tumor size twice a week. 腫瘍サイズを式:長さ×幅×高さ×1/2;により算出した。 Tumor size formula: length × width × height × 1/2; were calculated by.

腫瘍体積の平均変化を、例えば図30に示す。 The mean change in tumor volume, for example, shown in Figure 30. PBS対照群では、細胞接種後20日目までに腫瘍が600mm の腫瘍体積に達した。 The PBS control group, tumors reached a tumor volume of 600 mm 3 to day 20 after cell inoculation. muB38.1−MCC−DM1による処置は15日の腫瘍成長遅延をもたらした。 Treatment with muB38.1-MCC-DM1 resulted in a tumor growth delay of 15 days. muB38.1−PEG4−mal−DM1による処置は、さらなる抗腫瘍効果を示し、5匹中2匹の動物は完全な腫瘍退縮を有して44日間持続し、3匹は32日間の腫瘍成長遅延を伴った。 Treatment with muB38.1-PEG4-mal-DM1 showed additional anti-tumor effect, two animals in five lasted 44 days have complete tumor regression, tumor growth delay of 3 mice 32 days It was accompanied by.

したがって、本発明のコンジュゲートmuB38.1−PEG4−mal−DM1は、このヒト大腸癌異種移植モデルにおいてmuB38.1−MCC−DM1より有意に有効である。 Thus, the conjugate muB38.1-PEG4-mal-DM1 of the present invention is significantly more effective than muB38.1-MCC-DM1 in this human colon cancer xenograft model.

実施例IX Example IX
耐性大腸癌(COLO205−MDR)の異種移植に対する抗EpCAM−メイタンシノイドコンジュゲート(muB38.1−MCC−DM1およびmuB38.1−PEG4−mal−DM1)のインビボ抗腫瘍活性の比較 muB38.1−MCC−DM1およびmuB38.1−PEG4−mal−DM1コンジュゲートの抗腫瘍効果を、P糖タンパク質を過剰発現するように工学的処理されたヒト大腸癌COLO205−MDRの異種移植モデルにおいて評価した。 Comparison of resistance colon cancer (COLO205-MDR) anti against xenografts EpCAM- maytansinoid conjugates (muB38.1-MCC-DM1 and muB38.1-PEG4-mal-DM1) in vivo antitumor activity muB38.1- the MCC-DM1 and muB38.1-PEG4-mal-DM1 antitumor effect of the conjugates was evaluated in engineered treated xenograft model of human colon cancer COLO205-MDR to overexpress P-glycoprotein. COLO205−MDR細胞をSCIDマウスの右肩下の領域に皮下注射した(1×10 細胞/動物)。 COLO205-MDR cells were injected subcutaneously in the area under the right shoulder of SCID mice (1 × 10 7 cells / animal). 腫瘍の体積が約170mm のサイズに達した時点で(細胞接種後8日)、マウスをランダムに3グループに分け(6匹/グループ)、各グループをmuB38.1−MCC−DM1(コンジュゲートタンパク質20mg/kg)、muB38.1−PEG4−mal−DM1(抗体投与量20mg/kg)またはリン酸緩衝化生理食塩水(ビヒクル対照)のいずれかの静脈内単回ボーラスで処置した。 When the volume of the tumors reached a size of approximately 170 mm 3 (cell inoculation after 8 days), randomly 3 into groups of mice (6 mice / group), each group muB38.1-MCC-DM1 (conjugate protein 20 mg / kg), were treated with either single intravenous bolus of muB38.1-PEG4-mal-DM1 (antibody dose 20 mg / kg) or phosphate buffered saline (vehicle control). 腫瘍サイズを週2回測定することにより腫瘍の成長をモニタリングした。 We were monitoring the growth of the tumor by measuring tumor size twice a week. 腫瘍サイズを式:長さ×幅×高さ×1/2;により算出した。 Tumor size formula: length × width × height × 1/2; were calculated by.

腫瘍体積の平均変化を、例えば図31に示す。 The mean change in tumor volume, for example, shown in Figure 31. PBS対照群では、38日で腫瘍が約1000mm にまで成長した。 The PBS control group, tumors grew to approximately 1000 mm 3 in 38 days. muB38.1−MCC−DM1による処置は、14日の腫瘍成長遅延をもたらした。 Treatment with muB38.1-MCC-DM1 resulted in a tumor growth delay of 14 days. muB38.1−PEG4−mal−DM1による処置は顕著な抗腫瘍効果を有し、6匹すべての動物において完全な腫瘍退縮をもたらした(図31)。 Treatment with muB38.1-PEG4-mal-DM1 has a significant anti-tumor effect, it resulted in complete tumor regression in 6 animals all animals (Figure 31).

同様な実験をCOLO205異種移植に対しても行った。 It was also carried out against COLO205 xenograft a similar experiment. この場合も、B38.1−PEG4−mal−DM1による処置は、より有効であり、完全な腫瘍退縮をもたらした一方で、標準的なSMCCコンジュゲートは中等度の腫瘍成長遅延を示すのみである(図32)。 Again, the treatment with B38.1-PEG4-mal-DM1, is more effective, while resulted in complete tumor regression, standard SMCC conjugate only shows a tumor growth delay of moderate (Figure 32).

同様な結果がヒト化抗CanAg抗体のコンジュゲートによって得られた(図33)。 Similar results were obtained by the conjugate of a humanized anti-CanAg antibody (Figure 33).

したがって、本発明のコンジュゲートmuB38.1−PEG4−mal−DM1は、このヒト大腸癌異種移植モデルにおいて、これまでに記載されたリンカーを用いて調製されたコンジュゲートmuB38.1−MCC−DM1より有意に有効である。 Thus, the conjugate muB38.1-PEG4-mal-DM1 of the present invention, in this human colon cancer xenograft model than conjugates muB38.1-MCC-DM1 prepared using linkers described to date it is significantly more effective.

実施例X Example X
PEGの長さの評価: Evaluation of the length of the PEG:
PEG 、PEG 、PEGi 、PEG 24リンカーを用い、かつ抗体あたり種々の数のDMxを組み込み、いくつかのAb−PEG −MaI−DMxコンジュゲートを調製した。 PEG 4, PEG 8, using PEGI 2, PEG 24 linker, and incorporate DMx various numbers per antibody, several Ab-PEG n -MaI-DMx conjugates were prepared. 図34は、非常に高い17.1D/Aの負荷を有するAb−PEG 24 −MaI−DM1コンジュゲートが、抗原発現癌細胞への非修飾抗体と同様の結合を示すことを示す(フローサイトメトリーによる相対平均蛍光RMF単位で測定された結合)。 Figure 34 is, Ab-PEG 24 -MaI-DM1 conjugates with loads of very high 17.1D / A indicates that the exhibit similar binding and non-modified antibody to the antigen-expressing cancer cells (flow cytometry binding measured in relative mean fluorescence RMF units by). 4〜8D/Aを持つAb−PEG −MaI−DM1およびAb−PEG 12 −MaI−DM1コンジュゲートも、細胞結合フローサイトメトリーによって非修飾抗体と同様の結合を示す。 4~8D / A Ab-PEG 8 -MaI -DM1 and Ab-PEG 12 -MaI-DM1 conjugate also with shows binding similar to unmodified antibody by cell-binding flow cytometry. PEG 、PEG 、PEGj 、PEG 24リンカーを用いて調製したAb−PEG −MaI−DMxコンジュゲートは、抗原陽性細胞に対する細胞毒性において有効であった。 PEG 4, PEG 8, PEGj 2 , Ab-PEG n -MaI-DMx conjugates prepared with PEG 24 linker was effective in cytotoxic to antigen-positive cells. 図35は、4〜17D/Aを有する抗CanAg抗体(huC242)−PEG −Mal−DM1コンジュゲートが、CanAg抗原陽性COLO205細胞を5日間のインキュベーションに際し約0.1〜0.5nMの有効なIC 50で死滅させたことを実証する。 Figure 35 is an anti-CanAg antibody (huC242) -PEG n -Mal-DM1 conjugates with 4~17D / A is effective in about 0.1~0.5nM upon incubation the CanAg antigen-positive COLO205 cells 5 days to demonstrate that the killed in the IC 50. pgp発現多剤耐性COLO205−MDR細胞は、4〜17D/Aを持つhuC242−PEG −Mal−DM1コンジュゲートによって、約0.05〜0.5nMのIC 50で有効に死滅した(図36)。 pgp expression multidrug resistant COLO205-MDR cells, by huC242-PEG n -Mal-DM1 conjugate with 4~17D / A, it was effectively killed with an IC 50 of about 0.05~0.5NM (Figure 36) . 高い17.1D/Aを有するPEG 24 −MaI−DM1コンジュゲートは、細胞毒性において、4D/Aを有するPEG 24 −MaI−DM1コンジュゲートより有効であった(図34、36)。 PEG 24 -MaI-DM1 conjugates with high 17.1D / A is in cytotoxicity was more effective than PEG 24 -MaI-DM1 conjugates with 4D / A (Figure 34, 36).

実施例XI Example XI
アミン反応性基を含有する非開裂性チオスクシンイミジル部位を持つメイタンシノイドの、抗体に対するコンジュゲーション 非開裂性チオスクシンイミジル基を持つメイタンシノイドのN−ヒドロキシスクシンイミドエステルを用いて、1工程方法を用いて抗体をコンジュゲートした(図41)。 Maytansinoids having a non-cleavable thio succinimidyl site containing amine-reactive groups, with a N- hydroxysuccinimide ester of maytansinoids having a conjugation noncleavable thio succinimidyl group to antibody , antibodies using one-step method and conjugate (Figure 41). スルフヒドリル保持メイタンシノイドをヘテロ二官能性マレイミド保持架橋剤によって修飾し、単離し(図43)、その後、抗体によるコンジュゲーションにより非開裂性チオスクシンイミジル連結抗体−メイタンシノイドコンジュゲートを与えた(図39)。 Sulfhydryl holding maytansinoid modified by hetero-bifunctional maleimides holding crosslinking agent, isolated (FIG. 43), then a non-cleavable thio-succinimidyl-linked antibody by conjugation with an antibody - maytansinoid give maytansinoid conjugates It was (Figure 39). 反応をマレイミドとNHSエステルとの間に炭化水素環を含有するSMCC試薬によって行い、同様の方法を用いて、スルフヒドリル保持メイタンシノイドをマレイミドとNHSエステルとの間に直鎖炭化水素を含有するヘテロ二官能性リンカーと反応させることができた(図44)。 The reaction was carried out by SMCC reagent containing a hydrocarbon ring between the maleimide and NHS ester using the same method, containing linear hydrocarbon between the sulfhydryl holding maytansinoid maleimide and NHS ester hetero It could be reacted with a bifunctional linker (Figure 44).

DM1−SMCCの合成 丸底フラスコに、N 2' −デアセチル−iV 2' −(3−メルカプト−1−オキソプロピル)−メイタンシン(DM1、67.9mg、0.092mmol)、スクシンイミジル−4−(7Vマレイミドメチル)シクロヘキサン−1−カルボキシレート(SMCC、32.1mg、0.096mmol、1.05当量)およびTHF(4mL)を投入した。 Synthesis round bottom flask DM1-SMCC, N 2 '- deacetyl -iV 2' - (3- mercapto-1-oxopropyl) - maytansine (DM1,67.9mg, 0.092mmol), succinimidyl-4-(7V maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC, 32.1mg, 0.096mmol, was charged 1.05 eq) and THF (4 mL). 試薬として撹拌された溶液を溶媒に溶解し、透明の無色溶液を生じさせた。 The stirred solution as a reagent is dissolved in a solvent to yield a clear colorless solution. 次いで、pH6のリン酸緩衝液(4mL、100mMのリン酸カリウム、2mMのEDTA)を添加した。 Then, phosphate buffer pH 6 (4 mL, potassium phosphate 100 mM, EDTA in 2 mM) was added. 反応フラスコにセプタムおよび撹拌棒を装備し、激しく撹拌しながら室温で反応を進行させた。 The reaction flask was equipped with a septum and a stir bar, the reaction was allowed to proceed at room temperature with vigorous stirring. 反応は、逆相HPLCによって示されるように、30分以内に完了したと見られた。 The reaction, as indicated by reversed phase HPLC, and found to be complete within 30 minutes. 反応の完了後、反応物体積を真空中で減少させ、白色固体/残渣を与えた。 After completion of the reaction, reduced in vacuo and the reaction volume to give a white solid / residue. 生成物を塩化メチレン中3%のメタノールの混合物で溶離しながら、シリカゲルクロマトグラフィによって単離した。 While the product was eluted with a mixture of 3% methanol in methylene chloride, it was isolated by silica gel chromatography. 生成物含有画分を合わせ、真空中で乾固させて、63mg(63.9%の収率)のDM1−SMCCを白色固体として与えた。 The product-containing fractions were dryness in vacuo to give the DM1-SMCC of 63 mg (63.9% yield) as a white solid. 単離した生成物の質量分析により、予測値m+Na (m/z1094.4)およびm+Cl (m/z1106.2)の主な分子イオン(図43)を与えた。 Mass spectrometry of the isolated product, the predicted value m + Na + (m / z1094.4 ) and m + Cl - gave the main molecular ion (m / z1106.2) (Figure 43).

DM1−SMCCによる抗体の1工程コンジュゲーション DM1−SMCC試薬の10mMの原料(w/v)をDMA(10.7mg/mL)中で調製した。 DM1-SMCC by 1 step conjugation DM1-SMCC reagent 10mM ingredients of antibody (w / v) were prepared in DMA (10.7mg / mL). 原液をEtOHで希釈し、EtOHおよびDMAの試薬のブランクに対して吸光度を280nmで測定した。 The stock solution was diluted with EtOH, and the absorbance was measured at 280nm against a blank of EtOH and DMA reagents. 原料であるDM1−SMCC試薬の濃度を280nmで5700M −1の減衰係数(この波長におけるDM1の減衰係数である)を用いることによって算出した。 Damping coefficient of 5700M -1 concentration of DM1-SMCC reagent as a raw material at 280nm was calculated by using (this is a damping coefficient of DM1 in wavelength). DM1−SMCCの実際の減衰係数を求めていないため、これが唯一の濃度推定値である。 Since no seeking actual damping coefficient of DM1-SMCC, this is the only density estimate.

抗体を、7倍モル過剰の試薬を用いて5mg/mLでDM1−SMCCによってコンジュゲートした。 Antibodies were conjugated by DM1-SMCC at 5 mg / mL using a 7-fold molar excess of the reagent. 数倍過剰のDM1−SMCCによる抗体の滴定を最初に実施して所望のDM1:Ab比を求め、典型的にはこの範囲はヒト抗体に関して6〜10倍モル過剰である。 Titration of antibodies by several-fold excess of DM1-SMCC initially implemented desired DM1: seeking Ab ratio, typically the range is 6 to 10-fold molar excess with respect to human antibodies. 反応をDMA(5%v/v)を含むpH7.5の緩衝液において室温で90分間行った。 Was performed for 90 minutes at room temperature in a buffer of pH7.5 reaction containing DMA (5% v / v). 次いで反応混合物を4℃で12〜36時間維持した。 Then maintained for 12-36 hours the reaction mixture at 4 ° C.. 次いでコンジュゲートを、pH5.5のクエン酸緩衝液において平衡化したNAP−5(Sephadex G25)カラム上で精製し、濾過し、pH5.5のクエン酸緩衝液に対して透析して、あらゆる未反応の遊離薬物を除去した。 Then the conjugate was purified on a NAP-5 (Sephadex G25) column equilibrated in citrate buffer pH 5.5, filtered, dialyzed against citrate buffer pH 5.5, any unreacted the free drug reaction were removed. 透析後、コンジュゲートは、抗体1モルあたり3.1個の連結したDM1分子を有し、検出可能な遊離薬物はコンジュゲートにおいて存在しなかった(図39、m=3.1)。 After dialysis, conjugates have DM1 molecules linked 3.1 per antibody 1 mole detectable free drug was present in the conjugate (FIG. 39, m = 3.1). 最終コンジュゲートにおけるAb抗体分子1個あたりのDM1分子の数(平均)を、252および280nmにおけるコンジュゲートの吸光度を決定し、これらの2波長におけるDM1および抗体についての既知の減衰係数を用いることによって測定した。 The number of DM1 molecules per one Ab antibody molecule in the final conjugate (average) to determine the absorbance of the conjugate at 252 and 280 nm, by using the known attenuation coefficient for DM1 and antibodies in these two wavelengths It was measured.

SEC HPLCをコンジュゲートにおいて実施し、コンジュゲーション後に96.8%がモノマー性であったことを示した。 The SEC HPLC was performed in the conjugate showed that 96.8% after conjugation was monomeric.

最終コンジュゲートもまた、サイズ排除LC/MSによって分析した。 The final conjugate was also analyzed by size exclusion LC / MS. 本発明において記載されている方法を介して作製したコンジュゲートは、脱グリコシル化されたコンジュゲートの、予測されたピーク分布のみを含有する所望のMSスペクトルを示す(図45)。 Conjugates prepared via the methods described in this invention, the conjugates that are deglycosylated, shows the desired MS spectrum containing only the predicted peak distribution (Figure 45).

DM4−SMCCの合成 丸底フラスコに、N 2' −デアセチル−N 2' −(4−メルカプト−4−メチル−1−オキソペンチル)メイタンシン(DM4、22.0mg、0.0282mmol)およびスクシンイミジル−4−(7Vマレイミドメチル)シクロヘキサン−1−カルボキシレート(SMCC、24.2mg、0.0723mmol、2.50当量)およびガラス蒸留したTHF(1mL)を投入した。 Synthesis round bottom flask DM4-SMCC, N 2 '- deacetyl -N 2' - (4- mercapto-4-methyl-1-oxopentyl) maytansine (DM4,22.0mg, 0.0282mmol) and succinimidyl -4 - (7V maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC, 24.2mg, 0.0723mmol, 2.50 eq) was charged and glass distilled THF (1 mL). 試薬として撹拌した溶液を溶媒に溶解し、透明な無色溶液を生じさせた。 The stirred solution as a reagent is dissolved in a solvent to yield a clear colorless solution. 次いで、pH6のリン酸緩衝液(1mL、100raMのリン酸カリウム、2mMのEDTA)を添加した。 Then, phosphate buffer pH 6 (1 mL, potassium phosphate 100RaM, EDTA in 2 mM) was added. 反応フラスコにセプタムおよび撹拌棒を装備し、激しく撹拌しながら室温で反応を進行させた。 The reaction flask was equipped with a septum and a stir bar, the reaction was allowed to proceed at room temperature with vigorous stirring. 反応は、逆相HPLCによって示されるように、7時間後に完了したと見られた。 The reaction, as indicated by reversed phase HPLC, and found to be complete after 7 hours. 反応の完了後、生成物を酢酸エチル中に抽出し(3×25mL)、塩水(5mL)で洗浄させ、真空中で乾燥させた。 After completion of the reaction, the product was extracted into ethyl acetate (3 × 25 mL), was washed with brine (5 mL), and dried in vacuo. 生成物を塩化メチレン中3%のメタノールの混合物で溶離しながら、シリカゲルクロマトグラフィによって単離した。 While the product was eluted with a mixture of 3% methanol in methylene chloride, it was isolated by silica gel chromatography. 生成物含有画分を合わせ、真空中で濃縮して、19.74mg(62.8%の収率)のDM4−SMCCを与えた。 The product-containing fractions were combined and concentrated in vacuo to give the DM4-SMCC of 19.74mg (62.8% yield). 単離した生成物の質量分析により、予測値m+Na (m/z1136.4)およびm+Cl (m/z1148.4)の主な分子イオンを与えた。 Mass spectrometry of the isolated product, the predicted value m + Na + (m / z1136.4 ) and m + Cl - gave the main molecular ion (m / z1148.4).

DM4−SMCCによる、抗体の1工程コンジュゲーション ヒト化抗体(2.5mg/mL)のpH8.0の水性緩衝液(100mMのリン酸ナトリウム)中の溶液を、ジメチルスルホキシド(DMSO)中の10倍モル過剰のDM4−SMCCによってインキュベートして、20%の最終DMSO濃度を与えた。 According to DM4-SMCC, 10 times the solution in an aqueous buffer of pH8.0 for one step conjugation humanized antibody antibody (2.5mg / mL) (sodium phosphate 100 mM), in dimethyl sulfoxide (DMSO) and incubated with a molar excess of DM4-SMCC, to give a final DMSO concentration of 20%. 周囲温度で1時間、コンジュゲーションを進行させた。 1 hour at ambient temperature, was allowed to proceed for conjugation. コンジュゲートを。 A conjugate. pH5.5の緩衝液(10mMのヒスチジン、130mMのグリシン、5%(w/v)のスクロース、pH5.5)中で平衡化させたSephadex G25ゲル濾過カラム上の通過によって精製した。 Buffer pH 5.5 (10 mM histidine, glycine 130 mM, sucrose 5% (w / v), pH5.5) and purified by passage over Sephadex G25 gel filtration column equilibrated in. 最終コンジュゲートにおける抗体1分子あたりの連結されたDM4分子(平均)の数を、252および280nmにおけるコンジュゲートの吸光度を決定し、これらの2波長におけるDM4および抗体についての既知の減衰係数を用いることによって測定した。 The number of linked DM4 molecules per antibody molecule in the final conjugate (average) to determine the absorbance of the conjugate at 252 and 280 nm, using a known attenuation coefficient for DM4 and antibody at these two wavelengths It was measured by.

精製後、コンジュゲートは、抗体1分子あたり3.7個の連結されたDM4分子を有した。 After purification, the conjugate had 3.7 units of connected DM4 molecules per antibody molecule. SEC分析を最終コンジュゲートにおいて実施して、>95%がモノマー性であったことを示したが、>5%の遊離薬物種が最終コンジュゲートにおいて存在した。 The SEC analysis was performed in the final conjugates,> 95% showed that it was monomeric,> 5% free drug species were present in the final conjugate. コンジュゲートの透析は、望ましくない遊離薬物種の存在を減少させた場合がある。 Dialysis of the conjugate may have reduced the presence of unwanted free drug species.

実施例XII Example XII
アミン反応性基を含有する非開裂性チオアセトアミジル部位を持つメイタンシノイドの、抗体へのコンジュゲーション メイタンシノイドDM1を持つスルフヒドリルをブロモ酢酸と反応させ、チオアセトアミジル連結カルボン酸誘導体を与えた。 Maytansinoids having a non-cleavable thio acetamidine Gilles sites containing amine reactive groups, sulfhydryl with conjugation maytansinoid DM1 to antibody is reacted with bromoacetic acid, thio acetamidate Gilles coupling carboxylic acid derivatives Gave. N−ヒドロキシスクシンイミドとのエステル化は、アミン反応性非開裂性チオアセトアミジル連結メイタンシノイドを与えた(図48)。 Esterification with N- hydroxysuccinimide gave amine reactive non-cleavable thio acetamidine Gilles connected maytansinoid (Figure 48). 単離された化合物と抗体との1工程コンジュゲーション(図42)は、非開裂性抗体メイタンシノイドコンジュゲートを与えた(図40)。 1 step conjugation with isolated compounds and antibodies (Figure 42) gave a non-cleavable antibody maytansinoid conjugate (Figure 40).

代替的には、スルフヒドリル保持メイタンシノイドDM4をヘテロ二官能性のハロアセトアミド保持架橋剤によって修飾して、チオアセトアミジル部位を持つアミン反応性メイタンシノイドを与えた(図49)。 Alternatively, the sulfhydryl holding maytansinoid DM4 modified by heterobifunctional haloacetamide holding crosslinking agent, gave amine reactive maytansinoid having a thio acetamidine Jill site (Figure 49). 単離された化合物の抗体による1工程コンジュゲーション(図42)は、非開裂性チオアセトアミジル連結抗体−メイタンシノイドコンジュゲートを与えた(図40)。 1 step conjugation with antibodies isolated compound (42) is non-cleavable thio acetamidine Gilles linked antibody - gave maytansinoid conjugates (Figure 40).

DM1−SBAの合成 丸底フラスコに、N 2' −デアセチル−/V 2' −(3−メルカプト−1-オキソプロピO−メイタンシン(DM1、183.4mg、0.248mmol)および無水N,TV−ジメチルホルムアミド(DMF、3mL)を投入した。ブロモ酢酸(37.9mg、0.273mmol、1.1当量)および1,8−ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデカ−7−エン(DBU、75.6mg、0.497mmol)を順次添加しながら反応溶液を撹拌した。フラスコにセプタムおよび撹拌棒を装備し、1時間の間、激しく撹拌しながら室温で反応を進行させた。反応の完了後、反応物体積を粗油まで真空中で減少させた。粗生成物を最小体積の塩化メチレンに溶解し、生成物を、5%のエタノール、0.5%の酢酸お Synthesis round bottom flask DM1-SBA, N 2 '- deacetyl - / V 2' - (3- mercapto-1-Okisopuropi O- maytansine (DM1,183.4mg, 0.248mmol) and anhydrous N, TV- dimethyl formamide (DMF, 3 mL) was charged. bromoacetate (37.9mg, 0.273mmol, 1.1 eq) and 1,8-diazabicyclo [5.4.0] undec-7-ene (DBU, 75.6 mg , equipped with a septum and a stir bar was stirred and the reaction solution while successively added 0.497 mmol). flask, for one hour, it was allowed to proceed with vigorous stirring the reaction at room temperature. after completion of the reaction, the reaction product It was reduced in vacuo in volume to crude oil. the crude product was dissolved in a minimum volume of methylene chloride, the product, 5% ethanol, up for 0.5% acetic acid び94.5%の塩化メチレンの混合物で溶離しながらシリカゲルクロマトグラフィによって単離した。生成物含有画分を合わせ、体積を真空中で減少させ、HPLCによって、94.6%の純度を有する、158.8mg(80.4%の収率)のチオアセトアミジル連結DM1カルボン酸誘導体を与えた。 Was isolated by silica gel chromatography eluting with a mixture of beauty 94.5% of methylene chloride. The product-containing fractions were reduced in volume in vacuo, the HPLC, have a purity of 94.6% 158 It gave thio acetamidine Gilles connected DM1 carboxylic acid derivative of .8mg (80.4% yield).

丸底フラスコを、先の反応の生成物(158.8mg、0.199mmol)および塩化メチレン(15mL)を投入した。 The round bottom flask was product of the previous reaction (158.8mg, 0.199mmol) and methylene chloride (15 mL) is turned on. 次いで、/V−ヒドロキシスクシンイミド(NHS、25.2mg、0.219mmol、1.1当量)および1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)−カルボジイミド(EDC、57.2mg、0.298mmol)を添加した。 Then, / V- hydroxy succinimide (NHS, 25.2mg, 0.219mmol, 1.1 eq) and 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) - carbodiimide (EDC, 57.2 mg, 0.298 mmol) It was added. 完了するまで室温にて撹拌しながら反応を進行させた。 To complete the reaction was allowed to proceed with stirring at room temperature. 反応の完了後(約45分)、反応混合物を酢酸エチルで希釈し(20mL)、分離漏斗に移し、pH6のリン酸緩衝液(15mL、100mMのリン酸ナトリウム、2mMのEDTA)および塩水(7mL)で洗浄し、無水Na SO 上で乾燥させ、真空中で濃縮して、粗オフホワイト固体を与えた。 After completion of the reaction (about 45 minutes), the reaction mixture was diluted with ethyl acetate (20 mL), transferred to a separatory funnel, phosphate buffer pH 6 (15 mL, 100 mM sodium phosphate, 2mM of EDTA) and brine (7 mL washed with), dried over anhydrous Na 2 SO 4, and concentrated in vacuo to give a crude off-white solid. 生成物を酢酸エチル中10%の1,2−ジメトキシエタンの混合物で溶離しながらシリカゲルクロマトグラフィによって単離した。 The product was isolated by silica gel chromatography eluting with a mixture of 10% 1,2-dimethoxyethane in ethyl acetate. 生成物含有画分を合わせ、真空中で濃縮して、逆相HPLCによって96.0%の純度を有する、34.5mg(19.4%の収率)のDM1−SBAを与えた。 The product-containing fractions were combined and concentrated in vacuo, with 96.0% purity by reverse-phase HPLC, and gave DM1-SBA of 34.5 mg (19.4% of the yield). 単離した生成物の質量分析により、予測値m+Na (m/z915.2)およびm+Cl (m/z927.0)の主な分子イオンを与えた。 Mass spectrometry of the isolated product, the predicted value m + Na + (m / z915.2 ) and m + Cl - gave the main molecular ion (m / z927.0).

DM1−SBAによる、抗体の1工程コンジュゲーション DM1−SBA試薬の10.8mMの原料(w/v)をDMA中で調製した。 According to DM1-SBA, we were prepared 10.8mM of raw material 1 step conjugation DM1-SBA reagent antibody (w / v) in DMA. 抗体を、10.2倍モル過剰の試薬を用いて2.5mg/mLでDM1−SBAによってコンジュゲートした。 Antibodies were conjugated by DM1-SBA at 2.5 mg / mL with 10.2-fold molar excess of the reagent. 反応を、DMA(10%v/v)によって、pH7.5の緩衝液(100mMのリン酸カリウム)中で室温にて90分間行った。 The reaction, by DMA (10% v / v), was carried out for 90 minutes at room temperature in buffer pH 7.5 (potassium phosphate 100 mM). 次いでコンジュゲートをpH6.5の緩衝液(10mMのリン酸カリウム、140mMの塩化ナトリウム)で溶離しながらS300ゲル濾過(Sephadex S300)カラム上で精製した。 Then purified by Con buffer conjugate of pH 6.5 (potassium phosphate 10 mM, 140 mM sodium chloride) eluting with S300 gel filtration (Sephadex S300) column. 精製後、コンジュゲートは、抗体1モルあたり3.7個の連結されたDM1分子、および約0.18%の遊離薬物を有した(図40、m=3.7)。 After purification, the conjugate had 3.7 per antibody 1 mole linked DM1 molecules, and about 0.18% of the free drug (Fig. 40, m = 3.7).

SEC HPLCをコンジュゲートにおいて実施し、コンジュゲーション後に99.6%がモノマー性であったことを示した。 The SEC HPLC was performed in the conjugate showed that 99.6% after conjugation was monomeric.

N−スクシンイミジルブロモアセテート(市販も)の合成 100mLの丸底フラスコに、2−ブロモ酢酸(2.79g、20.08mmol)、7V−ヒドロキシスクシンイミド(2.54g、22.12mmol)および塩化メチレン(30mL)を投入した。 Round bottom flask 100mL of N- succinimidyl bromoacetate (commercially available also), 2-bromo-acetate (2.79g, 20.08mmol), 7V- hydroxysuccinimide (2.54 g, 22.12 mmol) and chloride methylene (30 mL) was charged. TV−TV−ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC、4.46g、22.14mmol)として氷浴中で撹拌した溶液を添加した。 TV-TV- dicyclohexylcarbodiimide (DCC, 4.46g, 22.14mmol) was added a solution prepared by stirring in an ice bath as. 反応物を氷浴で1時間および室温でさらに1時間撹拌した。 The reaction was stirred for an additional 1 hour 1 hour and at room temperature with an ice bath.

反応混合物を焼結ガラス漏斗を通して濾過し、真空中で濃縮して粗白色固体を与えた。 The reaction mixture was filtered through a sintered glass funnel, and concentrated in vacuo to give a crude white solid. 固体を温塩化メチレン(30mL)に溶解し、ヘキサン(25mL)で再結晶した。 The solid was dissolved in warm methylene chloride (30 mL), and recrystallized from hexane (25 mL). 固体を濾過によって収集し、ヘキサンで洗浄し、真空中で乾燥させて、3.99g(84%の収率)のiV−スクシンイミジルブロモアセテートを白色固体として与えた。 The solid was collected by filtration, washed with hexane, and dried in vacuo to give iV- succinimidyl bromoacetate 3.99 g (84% yield) as a white solid. H NMR(CDCl )δ2.864(s、4H)および4.100(s、2H)ppm. 1 H NMR (CDCl 3) δ2.864 (s, 4H) and 4.100 (s, 2H) ppm.

DM4−SBAの合成 丸底に、N 2' −デアセチル−N 2' −(4−メルカプト−4−メチル−1−オキソペンチル)メイタンシン(DM4、71.9mg、0.092mmol)および無水N,Nジメチルホルムアミド(DMF、2.5mL)を投入した。 The DM4-SBA synthetic round bottom, N 2 '- deacetyl -N 2' - (4- mercapto-4-methyl-1-oxopentyl) maytansine (DM4,71.9mg, 0.092mmol) and anhydrous N, N dimethylformamide (DMF, 2.5 mL) was charged. 反応をアルゴン雰囲気下に置き、iV−スクシンイミジルブロモアセテート(SBA、23.9mg、0.101mmol、1.1当量)および1,8−ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデカ−7−エン(DBU、14.7mg、0.097mmol、1.05当量)を順次添加した。 The reaction was placed under an argon atmosphere, Iv- succinimidyl bromoacetate (SBA, 23.9mg, 0.101mmol, 1.1 eq) and 1,8-diazabicyclo [5.4.0] undec-7-ene (DBU, 14.7mg, 0.097mmol, 1.05 eq) were successively added. フラスコにセプタムおよび撹拌棒を装備し、完了まで激しく撹拌しながら室温で反応を進行させた。 Flask equipped with septum and a stir bar, the reaction was allowed to proceed at room temperature with vigorous stirring until completion. 生成物を、ヘキサン中15〜65%の酢酸エチルの勾配で30分かけて、続いて10分間での65〜95%酢酸エチルの増大によって溶離しながら、分取シアノHPLCによって単回注入において単離した。 Single product, over a period of 30 minutes with a gradient of 15-65% ethyl acetate in hexane, followed while eluting with increased 65 to 95% ethyl acetate in 10 minutes, in a single injection by preparative cyano HPLC release was. これらの条件下で、DM4−SBAが22〜24分の間に溶離した。 Under these conditions, DM4-SBA was eluted between 22 to 24 minutes. 生成物を収集し、真空中で濃縮して、50.1mg(55.2%の収率)の所望のDM4−SBA(95%純度)生成物を与えた。 The product was collected and concentrated in vacuo to give the desired DM4-SBA (95% purity) of product 50.1 mg (55.2% yield). 単離した生成物の質量分析により、予測値m+Na (m/z957.4)およびm+Cl (m/z969.2)の主な分子イオンを与えた。 Mass spectrometry of the isolated product, the predicted value m + Na + (m / z957.4 ) and m + Cl - gave the main molecular ion (m / z969.2).

実施例XIII Example XIII
カルボキシル部位を持つ非開裂性チオスクシンイムジル連結メイタンシノイド誘導体の調製 スルフヒドリル保持メイタンシノイド、例えば、DM1およびDM4を修飾して、非開裂性チオスクシンイミジル保持カルボン酸誘導体を与えることができる(図45、46および48)。 Non-cleavable thio disk having a carboxyl sites divine Mujiru linked maytansinoid preparation of maytansinoid derivatives sulfhydryl holding maytansinoids, for example, be to modify the DM1 and DM4, providing a non-cleavable thio succinimidyl holding carboxylic acid derivative it (Figure 45, 46 and 48). これらの誘導体は、本明細書に記載されているアミン反応性の非開裂性チオスクシンイミジル連結メイタンシノイドの調製に有用であろう。 These derivatives may be useful in the preparation of has been being amine-reactive non-cleavable thio-succinimidyl linked maytansinoid described herein. 図45、46および48は、N−ヒドロキシスクシンイミド活性化エステルの形成を示すが、いくつかの他の活性化エステルが形成され得ることが当業者に明らかであり、これらとして、限定されないが、N−スルホスクシンイミジルエステル、ペンタフルオロフェノールエステル、テトラフルオロスルホフェノール、およびニトロフェノールエステルが挙げられる。 Figure 45, 46 and 48, N- hydroxysuccinimide shows the formation of an imide activated ester, it is apparent to those skilled in the art that several other activated ester may be formed, as these include, but are not limited to, N - sulfosuccinimidyl ester, pentafluorophenol ester, tetrafluoro sulfophenol, and nitrophenol esters. スルフヒドリル保持メイタンシノイド、例えば、DM1およびDM4をホモ二官能性マレイミド試薬によって修飾して、図50に示すようなマレイミド基を持つメイタンシノイドを与えることができる。 Sulfhydryl holding maytansinoids, e.g., a DM1 and DM4 modified by homobifunctional maleimides reagent can give maytansinoids having a maleimide group as shown in Figure 50.

DM1−MCCの調製 10mLの丸底フラスコに、DM1(44.6mg、0.0571mmol)、1,2−ジメトキシエタン(2.5mL)を投入し、撹拌棒を装備した。 Round bottom flask was charged with 10mL of DM1-MCC, DM1 (44.6mg, 0.0571mmol), was charged with 1,2-dimethoxyethane (2.5 mL), equipped with a stir bar. N−[4−(カルボキシシクロヘキシルメチル)]マレイミド(Toronto Research Chemicals、Inc.、MCC、20.3mg、0.08430mmol)の1,2−ジメトキシエタン(0.5mL)中の溶液を反応フラスコに添加し、続いて、pH7.5の緩衝液(2.5mL、50mMのリン酸カリウム、2mMのEDTA)を添加した。 N- [4- (carboxymethyl cyclohexylmethyl)] maleimide added (Toronto Research Chemicals, Inc., MCC, 20.3mg, 0.08430mmol) a solution in 1,2-dimethoxyethane (0.5 mL) to the reaction flask and, subsequently buffer pH 7.5 (2.5 mL, potassium phosphate 50 mM, EDTA in 2 mM) was added. 数滴の飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を反応溶液に添加し、反応のpHを維持した。 Saturated aqueous sodium bicarbonate few drops were added to the reaction solution to maintain the pH of the reaction. 反応を室温で進行させ、2時間後に完了した。 The reaction was allowed to proceed at room temperature and complete after two hours. 反応物体積を真空中で半分に減少させ、pH3に酸性化し、生成物を酢酸エチル中に抽出させた(3×10mL)。 The reaction volume was reduced by half in vacuo, pH 3 to acidified and the product was extracted into ethyl acetate (3 × 10mL). 抽出物を合わせ、塩水(5mL)で洗浄し、真空中で濃縮して、粗生成物を生じさせた。 The combined extracts were washed with brine (5 mL), and concentrated in vacuo to yield the crude product. 生成物を塩化メチレンおよびエタノールの93:7混合物で溶離しながらシリカゲルクロマトグラフィによって単離した。 The product of methylene chloride and ethanol 93: 7 mixture was isolated by silica gel chromatography eluting with. 生成物含有画分を合わせ、濃縮して、46.5mg(83.5%の収率)のDM1−MCC(99.3%純度)を白色固体として与えた。 The product-containing fractions were combined and concentrated to give DM1-MCC of 46.5 mg (83.5% yield) (99.3% purity) as a white solid. 単離した生成物の質量分析により、予測値m+Na (m/z997.3)の主な分子イオンを与えた。 Mass spectrometry of the isolated product gave the main molecular ion of the predicted value m + Na + (m / z997.3 ).

DM4−SMCCの調製 3mLのガラスバイアルに、DM4(24.3mg、0.0311mmol)、N−[A−(カルボキシシクロヘキシルメチル)]マレイミド(MCC、Toronto Research Chemicals、Inc,.8.1mg、0.0342mmol)および1,2−ジメトキシエタン(1mL)を投入した。 Glass vials Preparation 3mL of DM4-SMCC, DM4 (24.3mg, 0.0311mmol), N- [A- (carboxymethyl cyclohexylmethyl)] maleimide (MCC, Toronto Research Chemicals, Inc, .8.1mg, 0. 0342Mmol) and 1,2-dimethoxyethane (1 mL) was charged. pH7.5の緩衝液(1mL、50mMのリン酸カリウム、2niMのEDTA)として撹拌した溶液を反応に添加した。 Buffer pH 7.5 (1 mL, potassium phosphate 50 mM, EDTA of 2NiM) was added to the reaction stirred solution as. 室温で反応が進行し、2時間以内に完了した。 The reaction proceeds at room temperature and was complete within 2 hours. 反応物体積を真空中で半分に減少させ、pH3に酸性化し、生成物を酢酸エチル中で抽出させた(3×10mL)。 The reaction volume was reduced by half in vacuo, pH 3 to acidified and the product was extracted into ethyl acetate (3 × 10mL). 抽出物を合わせ、塩水(5mL)で洗浄し、真空中で濃縮して、粗生成物を生じさせた。 The combined extracts were washed with brine (5 mL), and concentrated in vacuo to yield the crude product. 生成物を塩化メチレンおよびエタノールの9:1の混合物で溶離しながらシリカゲルクロマトグラフィによって単離した。 The product of methylene chloride and ethanol 9: was isolated by silica gel chromatography eluting with a mixture of 1. 生成物含有画分を合わせ、濃縮して、14.8mg(46.9%の収率)のDM4−MCC(96.7%純度)を白色固体として与えた。 The product-containing fractions were combined and concentrated to give DM4-MCC of 14.8 mg (46.9% yield) (96.7% purity) as a white solid. 単離した生成物の質量分析により、予測値m+Na (m/z1039.5)の主な分子イオンを与えた。 Mass spectrometry of the isolated product gave the main molecular ion of the predicted value m + Na + (m / z1039.5 ).

実施例XlV Example XlV
チオール反応性部位を持つ非開裂性チオスクシンイムジル連結メイタンシノイド誘導体の調製 非開裂性チオスクシンイミジル基を含有するマレイミド保持メイタンシノイドをチオール含有抗体にコンジュゲートした(図51)。 Maleimide holding maytansinoid containing preparation noncleavable thio succinimidyl group non-cleavable thio disk spirit Mujiru linked maytansinoid derivatives having a thiol-reactive sites conjugated to a thiol-containing antibodies (Figure 51). 非開裂性チオスクシンイミジル基を含有するマレイミド保持メイタンシノイドを、チオール含有メイタンシノイドの、ビス−マレイミド架橋剤(図52)へのカップリングによって調製した。 Maleimide holding maytansinoid containing non-cleavable thio succinimidyl group, a thiol-containing maytansinoid, bis - was prepared by coupling to maleimido crosslinker (Fig. 52). ここで行った反応を、Mal−(CH −Mal試薬によって行ったが、スルフヒドリル保持メイタンシノイドが、マレイミド部位間に異なるスペーサー単位を含有するビス−マレイミド試薬に対してであり得ることが当業者に明らかである。 The reaction was carried out here, has been made by Mal- (CH 2) 6 -Mal reagent, a sulfhydryl holding maytansinoid is bis contain spacer unit different between maleimide site - it could be to a maleimide reagent There is obvious to those skilled in the art.

DM1−MaI−(CJLyMaIの調製 ビス(マレイミド)ヘキサノエート(17.9mg、0.0648mmol、3当量)のTHF(0.75mL)中の溶液を反応バイアルにおいて調製した。DM1(15.9mg、0.0216mmol)をTHF(0.75mL)中に添加しながら溶液を撹拌した。次いで、JV, LT−ジイソプロピルエチルアミン(3.3mg、0.0259mmol、1,2当量)を添加し、室温で撹拌しながら反応を進行させた。反応の完了後、反応物体積を真空中で減少させ、粗油を与えた。粗生成物を最小量のCH Cl に溶解し、CH Cl 中7%メタノールで溶離しながら20cm×20cmの1000ミクロンのガラスプレートにて分取薄層クロマトグラフィによって精製した。生成 DM1-Mai (Preparation of CJLyMaI bis (maleimido) hexanoate (17.9mg, 0.0648mmol, 3 eq) of THF (.DM1 a solution in 0.75 mL) was prepared in a reaction vial (15.9 mg, 0. 0216Mmol) was stirred solution while adding in THF (0.75 mL). then, JV, LT- diisopropylethylamine (3.3mg, 0.0259mmol, 1,2 eq) with stirring at room temperature after completion of the progression is not a. reacting the reaction, the reaction volume was reduced in vacuo to give a crude oil. the crude product was dissolved in the minimum amount of CH 2 Cl 2, CH 2 Cl 2 7% methanol was purified by preparative thin layer chromatography in at 1000 micron glass plate of the eluted while 20 cm × 20 cm. product 含有バンドをプレートから擦り取り、CH Cl 中メタノールで抽出し、焼結ガラス漏斗を通して濾過し、真空中で濃縮して、10mg(45.9%の収率)のDM1−Mal−(CH,) −Mal(95.8%純度)を与えた。単離した生成物の質量分析により、予測値m+Na (m/z1036.4)およびm+Cl (m/z1048.3)の主な分子イオンを与えた。 Scraped-containing band from the plate, extracted into CH 2 Cl 2 methanol, filtered through a sintered glass funnel, and concentrated in vacuo, DM1-Mal- (CH of 10 mg (45.9% yield) ,) 3 gave Mal (95.8% purity) by mass spectrometry of the isolated product, the predicted value m + Na + (m / z1036.4 ) and m + Cl -. the main of (m / z1048.3) It gave a molecular ion.

DM4−Mal−(CH −Malの調製 丸底フラスコに、ビス(マレイミド)ヘキサノエート(25.0mg、0.090mmol、3当量)およびTHF(1mL)を投入した。 The DM4-Mal- (CH 2) a 6 Mal prepared a round bottom flask and bis (maleimide) hexanoate (25.0 mg, 0.090 mmol, 3 eq) and THF (1 mL) is turned. 完全に溶解したら、N 2' −デアセチル−N 2' −(4−メルカプト−4−メチル−1−オキソペンチル)メイタンシン(DM4、23.5mg、0.030mmol)のTHF(1mL)中の溶液を反応フラスコに添加した。 Once completely dissolved, N 2 '- deacetyl -N 2' - (4- mercapto-4-methyl-1-oxopentyl) maytansine (DM4,23.5mg, 0.030mmol) to a solution in THF (1 mL) of It was added to the reaction flask. 次いで、pH6のリン酸緩衝液(2mL、100mMのリン酸カリウム、2mMのEDTA)を反応フラスコに添加した。 Then, phosphate buffer pH 6 (2 mL, potassium 100mM phosphate, 2mM of EDTA) was added to the reaction flask. 反応フラスコに撹拌棒およびセプタムを装備し、撹拌しながら室温で反応を進行させた。 A stir bar and a septum to the reaction flask equipped The reaction was allowed to proceed at room temperature with stirring. 反応の完了後(約8時間)、反応物体積を真空中で減少させて乾燥させた。 After completion of the reaction (approximately 8 hours), the reaction volume was dried and reduced in vacuo. 粗生成物を最小体積のアセトニトリルに再溶解し、生成物をセミ分取C18HPLCによって単離した。 The crude product was redissolved in a minimum volume of acetonitrile, the product was isolated by semi-preparative C18 HPLC. 生成物含有画分を合わせ、真空中で濃縮して、10.6mg(33.3%の収率)のDM4−Mal−(CH −MaI(99.9%純度)を与えた。 The product-containing fractions were combined and concentrated in vacuo to give 10.6mg DM4-Mal- (CH 2) 6 -MaI (99.9% purity) of (33.3% yield). 単離した生成物の質量分析により、予測値m+Na (m/z1078.4)およびm+Cl (m/z1090.3)の主な分子イオンを与えた。 Mass spectrometry of the isolated product, the predicted value m + Na + (m / z1078.4 ) and m + Cl - gave the main molecular ion (m / z1090.3).

huC242−Mal−(CH −Mal−DM1の調製 5%のジメチルアセトアミドを含有する150mMのHEPES緩衝液(pH8.0)中のhuC242(8mg/mL)を9当量のSPDBで30℃にて1時間修飾し、次いで50mMのリン酸塩、50mMのNaClのpH7.5の緩衝液を用いてNAP5サイジングカラムを通して溶離した。 huC242-Mal- (CH 2) 6 150mM of HEPES buffer containing preparation 5% dimethylacetamide -Mal-DM1 (pH8.0) in huC242 the (8mg / mL) 9 to 30 ° C. equivalents of SPDB Te 1 hour modified, then phosphate 50mM, was eluted through NAP5 sizing column using a buffer of pH7.5 for 50mM of NaCl. 回収された修飾された抗体に2μLの1Mのジチオトレイトールに30℃で添加した。 It was added at 30 ° C. in dithiothreitol 2μL of 1M in recovered modified antibody. 10分後、50mMのリン酸塩、50mMのNaClのpH6.5の緩衝液を用いて反応物をNAPlOカラムにおいて精製した。 After 10 minutes, phosphate 50mM, was purified in NAPlO column reaction with a buffer of pH6.5 for 50mM of NaCl. ジメチルホルムアミド中のDM1−mal−(CH −mal(1.7モル当量)を所望の生成物を含有する画分に添加し、10%v/vのジメチルホルムアミド/緩衝液を得た。 In dimethylformamide DM1-mal a (CH 2) 6 -mal (1.7 molar equivalents) was added to fractions containing the desired product was obtained dimethyl formamide / buffer 10% v / v . 1時間後、粗コンジュゲートを、10mMのクエン酸塩、135mMのNaClのpH5.5の緩衝液で溶離しながらNAP25カラムにおいて精製した。 After 1 hour, the crude conjugate, 10 mM citrate, were purified in NAP25 column eluting with buffer pH5.5 of NaCl of 135 mM. 先に記載した結合アッセイを用いて、huC242−Mal−(CH −Mal−DM1が、ネイキッドhuC242抗体と同程度に抗原陽性COLO205細胞に結合することが示された(図53)。 Previously using binding assays described, huC242-Mal-is (CH 2) 6 -Mal-DM1 , to the same extent as naked huC242 antibody to bind to antigen-positive COLO205 cells (Figure 53). huC242−Mal−(CH −Mal−DM1コンジュゲートは、抗原陰性Namalwa細胞よりも抗原陽性COLO205細胞に対してはるかに細胞毒性であることが示された(図54)。 huC242-Mal- (CH 2) 6 -Mal-DM1 conjugates were shown than antigen-negative Namalwa cells is much more cytotoxic to antigen positive COLO205 cells (Figure 54).

Claims (33)

  1. 式(1)または(T): Equation (1) or (T):
    Z−X,−(−CH −CH −O−) −Yp−D (1) Z-X, - (- CH 2 -CH 2 -O-) n -Yp-D (1)
    D−Y −(−CH −CH −O−) −Xi−Z (V) D-Y p - (- CH 2 -CH 2 -O-) n -Xi-Z (V)
    式中: In the formula:
    Zは、細胞結合剤とアミドまたはチオエーテル結合を形成することができる反応性官能基を表し; Z represents a reactive functional group capable of forming a cell binding agent and an amide or a thioether bond;
    Dは、薬物を表し; D represents a drug;
    Xは、チオエーテル結合、アミド結合、カルバメート結合、またはエーテル結合を介して細胞結合剤に付着した脂肪族、芳香族または複素環式基を表し; X represents a thioether bond, an amide bond, an aliphatic attached to carbamate linkage or via an ether bond cell binding agent, aromatic or heterocyclic group;
    Yは、チオエーテル結合、アミド結合、カルバメート結合、エーテル結合、アミン結合、炭素−炭素結合およびヒドラゾン結合からなる群から選択される共有結合を介して薬物に付着した脂肪族、芳香族または複素環式基を表し; Y is a thioether bond, an amide bond, a carbamate bond, an ether bond, an amine bond, a carbon - aliphatic attached to the drug via a covalent bond selected from the group consisting of carbon bonds and hydrazone bonds, aromatic or heterocyclic It represents a group;
    lは、0または1であり; l is 0 or 1;
    pは、0または1であり; p is 0 or 1;
    nは、1〜2000の整数である; n is an integer of 1 to 2000;
    の化合物。 Of the compound.
  2. 式(2)または(2'): Equation (2) or (2 '):
    CB−[X,−(−CH −CH −O−)n−Yp−D] (2) CB- [X, - (- CH 2 -CH 2 -O-) n-Yp-D] m (2)
    [D−Yp−C−CH −CH −O−V−XJ ln −CB (T) [D-Yp-C-CH 2 -CH 2 -O-V-XJ ln -CB (T)
    式中; In the formula;
    CBは、細胞結合剤を表し; CB represents a cell binding agent;
    Dは、薬物を表し; D represents a drug;
    Xは、チオエーテル結合、アミド結合、カルバメート結合、またはエーテル結合を介して細胞結合剤に付着した脂肪族、芳香族または複素環式基を表し; X represents a thioether bond, an amide bond, an aliphatic attached to carbamate linkage or via an ether bond cell binding agent, aromatic or heterocyclic group;
    Yは、チオエーテル結合、アミド結合、カルバメート結合、エーテル結合、アミン結合、炭素−炭素結合およびヒドラゾン結合からなる群から選択される共有結合を介して薬物に付着した脂肪族、芳香族、または複素環式基を表し; Y is a thioether bond, an amide bond, a carbamate bond, an ether bond, an amine bond, a carbon - aliphatic attached to the drug via a covalent bond selected from the group consisting of carbon bonds and hydrazone bonds, aromatic or heterocyclic, It represents the Shikimoto;
    lは、0または1であり; l is 0 or 1;
    pは、0または1であり; p is 0 or 1;
    mは、2〜15の整数であり; m is an integer from 2 to 15;
    nは、1〜2000の整数である; n is an integer of 1 to 2000;
    の細胞結合剤細胞毒性薬物コンジュゲート。 Cell binding agent cytotoxic drug conjugate of.
  3. 式(3)または(3'): Equation (3) or (3 '):
    Z−XK−CH −CH O−V−Y−D (3) Z-XK-CH 2 -CH 2 O-V-Y-D (3)
    D−Y−(−CH −CH O−) −Xi−Z (3') D-Y - (- CH 2 -CH 2 O-) n -Xi-Z (3 ')
    式中: In the formula:
    Zは、細胞結合剤とアミドまたはチオエーテル結合を形成することができる反応性官能基を表し; Z represents a reactive functional group capable of forming a cell binding agent and an amide or a thioether bond;
    Dは、薬物を表し; D represents a drug;
    Xは、チオエーテル結合、アミド結合、カルバメート結合、またはエーテル結合を介して細胞結合剤に付着した脂肪族、芳香族または複素環式基を表し; X represents a thioether bond, an amide bond, an aliphatic attached to carbamate linkage or via an ether bond cell binding agent, aromatic or heterocyclic group;
    Yは、ジスルフィド結合を介して薬物に付着した脂肪族、非芳香族複素環式または芳香族複素環式基を表し; Y represents an aliphatic attached to the drug via a disulfide bond, the non-aromatic heterocyclic or aromatic heterocyclic group;
    lは、0または1であり; l is 0 or 1;
    nは、1〜14の整数である; n is a 1 to 14 integer;
    の化合物。 Of the compound.
  4. 式(4)または(4'): Equation (4) or (4 '):
    CB−(Xi−(−CH −CH O−) −Y−D) (4) CB- (Xi - (- CH 2 -CH 2 O-) n -Y-D) m (4)
    [D−Y−(−CH −CH O−) −X,] −CB (4') [D-Y - (- CH 2 -CH 2 O-) n -X,] m -CB (4 ')
    式中: In the formula:
    CBは、細胞結合剤を表し; CB represents a cell binding agent;
    Dは、薬物を表し; D represents a drug;
    Xは、チオエーテル結合、アミド結合、カルバメート結合、またはエーテル結合を介して細胞結合剤に付着した脂肪族、芳香族または複素環式基を表し; X represents a thioether bond, an amide bond, an aliphatic attached to carbamate linkage or via an ether bond cell binding agent, aromatic or heterocyclic group;
    Yは、ジスルフィド結合を介して薬物に付着した脂肪族、芳香族または複素環式基を表し; Y is an aliphatic attached to the drug via a disulfide bond, an aromatic or heterocyclic group;
    lは、0または1であり; l is 0 or 1;
    mは、3〜8の整数であり; m is an integer of 3-8;
    nは、1〜14の整数である; n is a 1 to 14 integer;
    の細胞結合剤細胞毒性薬物コンジュゲート。 Cell binding agent cytotoxic drug conjugate of.
  5. 前記細胞結合剤が、抗体、単鎖抗体、標的細胞に特異的に結合する抗体フラグメント、モノクローナル抗体、単鎖モノクローナル抗体、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、標的細胞に特異的に結合するフラグメント、抗体模倣体であるアドネクチン、DARPin、リンホカイン、サイトカイン、ホルモン、成長因子、酵素、または栄養素輸送分子である、請求項2または4に記載のコンジュゲート。 Fragment the cell binding agent is an antibody, single chain antibody, an antibody fragment that specifically binds to a target cell, a monoclonal antibody, a single chain monoclonal antibody, a monoclonal antibody, that specifically binds to the bispecific antibody, the target cell, Adnectins is an antibody mimetic, DARPins, a lymphokine, a cytokine, a hormone, growth factor, an enzyme or a nutrient-, conjugate according to claim 2 or 4.
  6. 前記細胞結合剤が、表面再構成モノクローナル抗体、表面再構成単鎖モノクローナル抗体、または標的細胞に優先的に結合する表面再構成モノクローナル抗体フラグメントである、請求項2または4に記載のコンジュゲート。 The cell binding agent, surface reconstruction monoclonal antibodies, surface reconstruction is a single chain monoclonal antibody or resurfaced monoclonal antibody fragment that preferentially binds to a target cell, conjugate according to claim 2 or 4.
  7. 前記細胞結合剤が、ヒト化モノクローナル抗体、ヒト化単鎖モノクローナル抗体、または標的細胞に優先的に結合するヒト化モノクローナル抗体フラグメントである、請求項2または4に記載のコンジュゲート。 It said cell binding agent is a humanized monoclonal antibody, a humanized monoclonal antibody fragment that preferentially binds to a humanized single-chain monoclonal antibody or a target cell, conjugate according to claim 2 or 4.
  8. 前記抗体が、キメラ抗体、キメラ抗体フラグメント、ドメイン抗体、またはこれらのドメイン抗体フラグメントである、請求項5に記載のコンジュゲート。 Wherein said antibody is a chimeric antibody, a chimeric antibody fragment, a domain antibody or their domain antibody fragments, conjugates of claim 5.
  9. 前記抗体が、MY9、抗B4、EpCAM、CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD11、CD19、CD20、CD22、CD26、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD44、CD56、CD79、CD105、CD138、EphA受容体、EphB受容体、EGFR、EGFRvIII、HER2、HER3、メソテリン、クリプト、αvβ 、αvβ 、αvβ インテグリンまたはC242である、請求項5に記載のコンジュゲート。 Wherein said antibody, MY9, anti-B4, EpCAM, CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD11, CD19, CD20, CD22, CD26, CD30, CD33, CD37, CD38, CD40, CD44, CD56, CD79, CD105, CD138 , EphA receptors, EphB receptors, EGFR, EGFRvIII, HER2, HER3, mesothelin, cryptoxanthin, αvβ 3, αvβ 5, αvβ 6 is integrin or C242, conjugate according to claim 5.
  10. 前記抗体が、My9−6、B4、C242、N901、DS6、EphA2受容体、CD38、IGF−IR、CNTO95、B−B4、トラスツズマブ、ペルツズマブ、ビバツズマブ、シブロツズマブ、またはリツキシマブから選択されるヒト化、ヒトまたは表面再構成抗体である、請求項5に記載のコンジュゲート。 Wherein said antibody, My9-6, B4, C242, N901, DS6, EphA2 receptor, CD38, IGF-IR, CNTO95, B-B4, trastuzumab, pertuzumab, Bibatsuzumabu, humanized selected from sibrotuzumab or rituximab, human or surface reconstruction antibody conjugate according to claim 5.
  11. 前記細胞結合剤が、腫瘍細胞;ウイルス感染細胞、微生物感染細胞、寄生虫感染細胞、自己免疫細胞、活性化細胞、骨髄細胞、活性化T細胞、B細胞、またはメラニン細胞;IGF−IR、CanAg、EGFR、MUC1、MUC16、VEGF、TF、MY9、抗B4、EpCAM、CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD11、CD 11a、CD18、CD19、CD20、CD22、CD26、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD44、CD56、CD70、CD79、CD105、CD138、EphA受容体、EphB受容体、EGFRvIII、HER2/neu、HER3、メソテリン、クリプト、α β インテグリン、α β インテグリン、α β インテグリン、Apo2、およ Said cell binding agent is a tumor cell; virus-infected cells, microorganism infected cells, parasite infected cells, autoimmune cells, activated cells, myeloid cells, activated T cells, B cells, or melanocytes,; IGF-IR, CanAg , EGFR, MUC1, MUC16, VEGF, TF, MY9, anti-B4, EpCAM, CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD11, CD 11a, CD18, CD19, CD20, CD22, CD26, CD30, CD33, CD37, CD38 , CD40, CD44, CD56, CD70 , CD79, CD105, CD138, EphA receptors, EphB receptor, EGFRvIII, HER2 / neu, HER3 , mesothelin, script, α v β 3 integrin, α v β 5 integrin, α v β 6 integrin, Apo2, Hoyo びC242抗原の1種以上を発現する細胞;またはインスリン成長因子受容体、上皮成長因子受容体、および葉酸受容体を発現する細胞から選択される標的細胞に結合する、請求項2または4に記載のコンジュゲート。 Cells expressing one or more beauty C242 antigens; or insulin growth factor receptor, epidermal growth factor receptor, and binds to a target cell selected from cells expressing the folate receptor, according to claim 2 or 4 of the conjugate.
  12. 腫瘍細胞が、乳癌細胞、前立腺癌細胞、卵巣癌細胞、結腸直腸癌細胞、胃癌細胞、扁平上皮癌細胞、小細胞性肺癌細胞、および精巣癌細胞から選択される、請求項11に記載のコンジュゲート。 Tumor cells, breast cancer cells, prostate cancer cells, ovarian cancer cells, colorectal cancer cells, gastric cancer cells, squamous carcinoma cells are selected from small cell lung cancer cells, and testicular cancer cells, Gongju according to claim 11 Gate.
  13. 有効量の請求項2または4に記載の薬物−細胞結合剤コンジュゲート、その薬学的に許容される塩または溶媒和物、および薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む、医薬組成物。 Effective amount of claim 2 or 4 drugs according to - cell-binding agent conjugate, a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof and a pharmaceutically acceptable carrier, diluent, pharmaceutical compositions.
  14. その方法による処置に対して感受性の疾患を処置するための方法であって、有効用量の請求項2または4に記載のコンジュゲートを、該処置を必要とする患者に非経口投与することを含む方法。 A method for treating a disease susceptible to treatment with the method, a conjugate according to claim 2 or 4 effective dose comprises parenterally administering to a patient in need of such treatment Method.
  15. 前記疾患が、腫瘍、自己免疫疾患、移植片拒絶、移植片対宿主疾患、ウイルス感染症、および寄生虫感染症から選択される、請求項14に記載の方法。 It said disease, tumors, autoimmune diseases, graft rejection, graft versus host disease, viral infections, and are selected from the parasitic infection, the method of claim 14.
  16. 前記腫瘍が、肺、血液、血漿、乳腺、大腸、前立腺、腎臓、膵臓、脳、骨、卵巣、精巣、およびリンパ器官の癌のうち1種以上から選択される、請求項15に記載の方法。 Wherein the tumor is selected lung, blood, plasma, breast, colon, prostate, kidney, pancreas, brain, bones, ovary, testes, and the above one of the lymphatic organs, The method of claim 15 .
  17. 前記腫瘍が、IGF−IR、FOLRl、CanAg、EGFR、EphA2、MUC1、MUC16、VEGF、TF、MY9、抗B4、EpCAM、CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD11、CD1Ia、CD18、CD19、CD20、CD22、CD26、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD44、CD56、CD70、CD79、CD105、CD138、EphA、EphB、EGFRvIII、HER2/neu、HER3、メソテリン、クリプト、α β インテグリン、α β インテグリン、α β インテグリン、Apo2、およびC242抗原の1種以上を発現する、請求項15に記載の方法。 Wherein the tumor is, IGF-IR, FOLRl, CanAg, EGFR, EphA2, MUC1, MUC16, VEGF, TF, MY9, anti-B4, EpCAM, CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD11, CD1Ia, CD18, CD19, CD20 , CD22, CD26, CD30, CD33 , CD37, CD38, CD40, CD44, CD56, CD70, CD79, CD105, CD138, EphA, EphB, EGFRvIII, HER2 / neu, HER3, mesothelin, script, α v β 3 integrin, α v beta 5 integrin, alpha v beta 6 integrin, Apo2, and C242 expressing one or more antigens, the method of claim 15.
  18. 式(5): Equation (5):
    D'−Y'−V−Q−W−Z' (5) D'-Y'-V-Q-W-Z '(5)
    式中: In the formula:
    D'は、スルフヒドリル保持メイタンシノイドであり; D 'is an sulfhydryl holding maytansinoid;
    Vは、1〜10個の炭素原子を有する、適宜、線状、分枝状または環式のアルキル、アルケニルまたはアルキニル基であり; V has 1 to 10 carbon atoms, as appropriate, be linear, branched or cyclic alkyl, alkenyl or alkynyl group;
    Wは、1〜10個の炭素原子を有する、適宜、線状、分枝状または環式のアルキル、アルケニルまたはアルキニル基であり; W has 1 to 10 carbon atoms, as appropriate, be linear, branched or cyclic alkyl, alkenyl or alkynyl group;
    Y'は、チオエーテル結合を表し; Y 'represents a thioether bond;
    Qは、適宜、芳香族または複素環式部位を表し; Q is suitably represents an aromatic or heterocyclic sites;
    Z'は、アミンまたはスルフヒドリル反応性基を表す; Z 'represents an amine or sulfhydryl-reactive groups;
    によって表される反応性基を持つチオエーテル部位を有するメイタンシノイド。 Maytansinoids having a thioether site having a reactive group represented by the.
  19. スルフヒドリル保持メイタンシノイドが、N 2' −デアセチル−N 2' −(3−メルカプト−1−オキソプロピル)−メイタンシン(DM1)またはN 2' −デアセチル−N 2' −(4−メルカプト−4−メチル−1−オキソペンチル)メイタンシン(DM4)である、請求項18に記載のメイタンシノイド。 Sulfhydryl holding maytansinoids, N 2 '- deacetyl -N 2' - (3- mercapto-1-oxopropyl) - maytansine (DM1) or N 2 '- deacetyl -N 2' - (4-mercapto-4 methyl-1-oxopentyl) maytansine (DM4), maytansinoids of claim 18.
  20. 以下の構造式: The following structural formula:
    によって表される、請求項18に記載のメイタンシノイド。 Represented by, maytansinoids of claim 18.
  21. 以下の構造式: The following structural formula:
    によって表される、請求項18に記載のメイタンシノイド。 Represented by, maytansinoids of claim 18.
  22. 以下の構造式7aまたは7b: Following structural formula 7a or 7b:
    によって表される、請求項18に記載のメイタンシノイド。 Represented by, maytansinoids of claim 18.
  23. 請求項18に記載のメイタンシノイドの調製のためのプロセスであって: A process for the preparation of maytansinoids of claim 18:
    以下の化学方程式: The following chemical equation:
    D'+Y”.V−Q−W−Z'→D'−Y'−V−Q−W−Z' (6) D '+ Y ".V-Q-W-Z' → D'-Y'-V-Q-W-Z '(6)
    式中D'は、スルフヒドリル保持メイタンシノイドを表し; D wherein 'represents sulfhydryl holding maytansinoid;
    Vは、1〜10個の炭素原子を有する、適宜、線状、分枝状または環式のアルキル、アルケニルまたはアルキニル基であり; V has 1 to 10 carbon atoms, as appropriate, be linear, branched or cyclic alkyl, alkenyl or alkynyl group;
    Qは、適宜、芳香族または複素環式部位を表し; Q is suitably represents an aromatic or heterocyclic sites;
    Wは、1〜10個の炭素原子を有する、適宜、線状、分枝状または環式のアルキル、アルケニルまたはアルキニル基であり; W has 1 to 10 carbon atoms, as appropriate, be linear, branched or cyclic alkyl, alkenyl or alkynyl group;
    Z'は、アミンまたはスルフヒドリル反応性基であり; Z 'is an amine or sulfhydryl-reactive groups;
    Y”は、スルフヒドリル−反応性部位を表し; Y "is a sulfhydryl - represents a reactive site;
    Y'は、スルフヒドリル保持メイタンシノイドと架橋剤との間のチオエーテル結合を表す; Y 'represents a thioether bond between the sulfhydryl holding maytansinoid and a crosslinking agent;
    によって表される、チオール含有メイタンシノイドをヘテロ二官能性架橋剤と反応させることを含む方法。 Methods, including the thiol-containing maytansinoid is reacted with heterobifunctional cross-linking agent represented by.
  24. スルフヒドリル保持メイタンシノイドが、N 2' −デアセチル−iV 2' −(3−メルカプト−1−オキソプロピル)−メイタンシン(DM1)またはN 2' −デアセチル−N 2' −(4−メルカプト−4−メチル−1−オキソペンチル)メイタンシン(DM4)である、請求項23に記載の方法。 Sulfhydryl holding maytansinoids, N 2 '- deacetyl -iV 2' - (3- mercapto-1-oxopropyl) - maytansine (DM1) or N 2 '- deacetyl -N 2' - (4-mercapto-4 methyl-1-oxopentyl) a maytansine (DM4), the method of claim 23.
  25. Y”が、マレイミドまたはハロアセトアミドである、請求項23に記載の方法。 Y "is a maleimide or haloacetamide The method of claim 23.
  26. 非開裂結合を介して連結された、メイタンシノイドおよび細胞結合剤の細胞毒性コンジュゲートの調製のためのプロセスであって、細胞結合剤を式Z'−W−Q−V−Y'−D'の化合物と反応させて、式CB−(Z”−W−Q−V−Y'−D') It linked via a non-cleavable bond, a process for the preparation of cytotoxic conjugates of maytansinoids and cell-binding agent, a cell-binding agent formula Z'-W-Q-V-Y'-D 'by the compound reaction formula CB- (Z "-W-Q- V-Y'-D') m
    式中、 In the formula,
    Z'は、アミンまたはスルフヒドリル反応性基を表し; Z 'represents an amine or sulfhydryl-reactive groups;
    Wは、1〜10個の炭素原子を有する、適宜、線状、分枝状または環式のアルキル、アルケニルまたはアルキニル基であり; W has 1 to 10 carbon atoms, as appropriate, be linear, branched or cyclic alkyl, alkenyl or alkynyl group;
    Qは、適宜、芳香族または複素環式部位を表し; Q is suitably represents an aromatic or heterocyclic sites;
    Vは、1〜10個の炭素原子を有する、適宜、線状、分枝状または環式のアルキル、アルケニルまたはアルキニル基であり; V has 1 to 10 carbon atoms, as appropriate, be linear, branched or cyclic alkyl, alkenyl or alkynyl group;
    Y'は、チオエーテル結合を表し; Y 'represents a thioether bond;
    D'は、メイタンシノイドを持つスルフヒドリルを表し; D 'represents a sulfhydryl with maytansinoid;
    CBは、細胞結合剤を表し; CB represents a cell binding agent;
    Z”は、チオエーテル結合またはアミド結合を表し; Z "represents a thioether bond or an amide bond;
    mは、2〜8の整数である; m is an integer of 2-8;
    の細胞結合剤コンジュゲートを提供することを含むプロセス。 Process comprising providing a cell binding agent conjugate.
  27. スルフヒドリル保持メイタンシノイドが、N 2' −デアセチル−N 2' −(3−メルカプト−1−オキソプロピル)−メイタンシン(DM1)またはN 2' −デアセチル−N 2' −(4−メルカプト−4−メチル−1−オキソペンチル)メイタンシン(DM4)である、請求項26に記載のプロセス。 Sulfhydryl holding maytansinoids, N 2 '- deacetyl -N 2' - (3- mercapto-1-oxopropyl) - maytansine (DM1) or N 2 '- deacetyl -N 2' - (4-mercapto-4 methyl-1-oxopentyl) a maytansine (DM4), process according to claim 26.
  28. CBが、抗体、単鎖抗体または抗体の抗原−結合フラグメントである、請求項26に記載のプロセス。 CB is an antibody, a single chain antibody or antibody antigen - a binding fragment The process of claim 26.
  29. 式CB−(Z”−W−Q−V−Y'−D') の細胞結合剤コンジュゲートが精製される、請求項26〜28のいずれか一項に記載のプロセス。 Cell binding agent conjugate of formula CB- (Z "-W-Q- V-Y'-D ') m is purified The process according to any one of claims 26 to 28.
  30. 細胞結合剤と式Z'−W−Q−V−Y'−D'の化合物とが、最大で20%の有機溶媒を適宜、含有する、細胞結合剤の水性緩衝液中の溶液を、式Z'−W−Q−V−Y'−D'の化合物の有機溶媒または有機溶媒および水性緩衝液もしくは水の混合物中の溶液と混合し、反応を5分〜72時間の間進行させることによって反応する、請求項26〜29のいずれか一項に記載のプロセス。 A compound of the cell binding agent of the formula Z'-W-Q-V-Y'-D 'is at most appropriately 20% of an organic solvent, containing a solution of an aqueous buffer at a cell binding agent, wherein Z'-W-Q-V-Y'-D 'was mixed with an organic solvent or an organic solvent and a solution of aqueous buffer or a mixture of water of the compound of that by proceeding during the reaction for 5 minutes to 72 hours reacting a process according to any one of claims 26 to 29.
  31. コンジュゲートが、クロマトグラフィ、透析、クロスフロー濾過または前記方法の組み合わせによって精製される、請求項26〜29のいずれか一項に記載のプロセス。 Conjugate, chromatography, dialysis, and purified by a combination of cross-flow filtration or the method, process according to any one of claims 26 to 29.
  32. 以下の構造式: The following structural formula:
    によって表される化合物。 Compounds represented by.
  33. 以下の構造式: The following structural formula:
    によって表される化合物。 Compounds represented by.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016518332A (en) * 2013-03-13 2016-06-23 ノバルティス アーゲー Antibody drug conjugates
JP2016528304A (en) * 2013-08-26 2016-09-15 レゲネロン ファーマシューティカルス,インコーポレーテッド A pharmaceutical composition comprising a macrolide diastereomers, methods for their synthesis, and therapeutic uses

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2544608T3 (en) * 2010-11-17 2015-09-02 Genentech, Inc. Conjugates of the antibody and alaninyl-maytansinol
WO2012086857A1 (en) * 2010-12-21 2012-06-28 (주)파낙스이엠 Combination body for photodynamic diagnosis or therapy and a production method therefor
JP6049642B2 (en) * 2011-02-15 2016-12-21 イミュノジェン・インコーポレーテッド A process for the preparation of the complex
CA2831111A1 (en) * 2011-04-01 2012-10-04 Immunogen, Inc. Cd37-binding molecules and immunoconjugates thereof
CN103044677A (en) * 2012-12-28 2013-04-17 上海景宇生物科技有限公司 Heresy base telechelic polyethylene glycol and preparation method thereof
CN103083652B (en) * 2013-02-06 2016-08-10 中国科学院过程工程研究所 Kind of heterobifunctional reagent is a connecting bridge meningococcal polysaccharide conjugate vaccine and its preparation method
US9415118B2 (en) * 2013-03-13 2016-08-16 Novartis Ag Antibody drug conjugates
CN103254311B (en) * 2013-05-09 2015-05-13 齐鲁制药有限公司 Method for preparing antibody-maytansine alkaloid medicine conjugate
KR20160035600A (en) * 2013-08-02 2016-03-31 사노피 Use of anti-muc1 maytansinoid immunoconjugate antibody for the treatment of solid tumors
CN103483357B (en) * 2013-10-12 2015-11-18 齐鲁制药有限公司 Intermediate new crystalline form and preparation method maytansinoid conjugates - an antibody
GB201402009D0 (en) * 2014-02-06 2014-03-26 Oncomatryx Biopharma S L Antibody-drug conjugates and immunotoxins
EP3125943A4 (en) * 2014-04-04 2017-12-06 Merck Sharp & Dohme Corp. Phosphate based linkers for intracellular delivery of drug conjugates
US20180110876A1 (en) * 2015-03-19 2018-04-26 Hangzhou Dac Biotech Co., Ltd. Novel hydrophilic linkers and ligand-drug conjugates thereof
US20180031583A1 (en) * 2015-04-17 2018-02-01 Northwestern University Phosphatidylethanolamine-specific probes
CN105435241A (en) * 2015-12-10 2016-03-30 浙江大学 IRGD-anticancer drug conjugate, and preparation method and application thereof
US9950076B2 (en) 2016-01-25 2018-04-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Maytansinoid derivatives, conjugates thereof, and methods of use

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005517032A (en) * 2001-12-21 2005-06-09 イミュノジェン・インコーポレーテッド Cytotoxic drug having a reactive polyethylene glycol moiety comprises a polyethylene glycol linking groups cytotoxic conjugate, and methods of making and using the same
JP2007514646A (en) * 2003-05-20 2007-06-07 イミュノジェン・インコーポレーテッド Improved cytotoxic agents comprising the novel maytansinoids
JP2007520450A (en) * 2003-10-10 2007-07-26 イミュノジェン・インコーポレーテッド How to the particular cell population targeted by using cell-binding agent maytansinoid conjugates linked via a non-cleavable linker, the conjugate, and the preparation of the complex
JP2011523628A (en) * 2008-04-30 2011-08-18 イミュノジェン・インコーポレーテッド Effective conjugates and hydrophilic linker

Family Cites Families (58)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4307016A (en) 1978-03-24 1981-12-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. Demethyl maytansinoids
US4563304A (en) 1981-02-27 1986-01-07 Pharmacia Fine Chemicals Ab Pyridine compounds modifying proteins, polypeptides or polysaccharides
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
ES2227512T3 (en) 1991-12-02 2005-04-01 Cambridge Antibody Technology Limited Production of antibodies against self-antigens from repertoires of antibody segments fixed in a phage.
DK0563475T3 (en) 1992-03-25 2000-09-18 Immunogen Inc Conjugates of cell binding agents and derivatives of CC-1065
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
GB9320575D0 (en) 1993-10-06 1993-11-24 Amp Gmbh Coaxial connector having improved locking mechanism
DE69433563T2 (en) 1993-12-03 2004-12-23 Astrazeneca Ab Against the CA55.1 antigen binding structures directed
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
US6355780B1 (en) 1995-02-22 2002-03-12 Yeda Research And Development Co. Ltd. Antibodies to the death domain motifs of regulatory proteins
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US6680311B1 (en) 1996-08-30 2004-01-20 Eli Lilly And Company Cryptophycin compounds
FR2763066B1 (en) 1997-05-08 2001-01-05 Agency Ind Science Techn New compound and aromatic ester of nonlinear optical material of second order which is produced
WO1999006587A3 (en) 1997-08-01 1999-07-01 Morphosys Ag Novel method and phage for the identification of nucleic acid sequences encoding members of a multimeric (poly)peptide complex
US7115396B2 (en) 1998-12-10 2006-10-03 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
US7303749B1 (en) 1999-10-01 2007-12-04 Immunogen Inc. Compositions and methods for treating cancer using immunoconjugates and chemotherapeutic agents
WO2001038318A1 (en) 1999-11-24 2001-05-31 Immunogen, Inc. Cytotoxic agents comprising taxanes and their therapeutic use
DE60031793T2 (en) 1999-12-29 2007-08-23 Immunogen Inc., Cambridge Doxorubicin and daunorubicin-containing cytotoxic agents and their therapeutic use
US6956036B1 (en) 2000-03-17 2005-10-18 Alcon, Inc. 6-hydroxy-indazole derivatives for treating glaucoma
US6333410B1 (en) 2000-08-18 2001-12-25 Immunogen, Inc. Process for the preparation and purification of thiol-containing maytansinoids
US6596503B1 (en) 2000-08-18 2003-07-22 East Carolina University Monoclonal antibody DS6, tumor-associated antigen CA6, and methods of use thereof
US6747021B2 (en) 2000-10-02 2004-06-08 Eli Lilly And Company Cryptophycin compound
WO2002030356A3 (en) 2000-10-13 2004-02-19 Univ Mississipi Synthesis of epothilones and relates analogs
US7767802B2 (en) 2001-01-09 2010-08-03 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of anti-apoptotic genes
US6441163B1 (en) 2001-05-31 2002-08-27 Immunogen, Inc. Methods for preparation of cytotoxic conjugates of maytansinoids and cell binding agents
US6560782B2 (en) 2001-06-11 2003-05-13 Playtex Products, Inc. Antimicrobial glove and method of making same
DE10202419A1 (en) 2002-01-22 2003-08-07 Ribopharma Ag A method for inhibiting the expression of a caused by a chromosome aberration target gene
US6756397B2 (en) 2002-04-05 2004-06-29 Immunogen, Inc. Prodrugs of CC-1065 analogs
US6534660B1 (en) 2002-04-05 2003-03-18 Immunogen, Inc. CC-1065 analog synthesis
US6596757B1 (en) 2002-05-14 2003-07-22 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising polyethylene glycol-containing taxanes and their therapeutic use
WO2004005326A3 (en) 2002-07-09 2004-02-19 Morphochem Aktiengellschaft Fu Tubulysin conjugates
DK1545613T3 (en) 2002-07-31 2011-11-14 Seattle Genetics Inc Auristatinkonjugater and their use for treating cancer, an autoimmune disease or an infectious disease
DE60336149D1 (en) 2002-08-16 2011-04-07 Immunogen Inc Crosslinking agent having high reactivity and solubility, and their use in the preparation of conjugates for the targeted delivery of small molecule drugs
JP5354835B2 (en) 2002-11-07 2013-11-27 イミュノジェン・インコーポレーテッド Anti cd33 antibodies, and methods of treating acute myeloid leukemia using the same
EP2660322A3 (en) 2003-04-17 2013-11-13 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Modified iRNA agents
US7276497B2 (en) * 2003-05-20 2007-10-02 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising new maytansinoids
US7595306B2 (en) 2003-06-09 2009-09-29 Alnylam Pharmaceuticals Inc Method of treating neurodegenerative disease
US7786290B2 (en) 2003-06-13 2010-08-31 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Double-stranded ribonucleic acid with increased effectiveness in an organism
US7674778B2 (en) 2004-04-30 2010-03-09 Alnylam Pharmaceuticals Oligonucleotides comprising a conjugate group linked through a C5-modified pyrimidine
RU2404810C9 (en) * 2004-06-01 2015-06-20 Дженентек, Инк. Conjugates antibody-medicinal agent and methods
US7615618B2 (en) 2004-06-30 2009-11-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides comprising a non-phosphate backbone linkage
EP1828215A2 (en) 2004-07-21 2007-09-05 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Oligonucleotides comprising a modified or non-natural nucleobase
JP4193771B2 (en) 2004-07-27 2008-12-10 セイコーエプソン株式会社 Gray-scale voltage generating circuit and a drive circuit
WO2006112872A3 (en) 2004-08-04 2008-07-17 Alnylam Pharmaceuticals Inc Oligonucleotides comprising a ligand tethered to a modified or non-natural nucleobase
CA2486285C (en) 2004-08-30 2017-03-07 Viktor S. Goldmakher Immunoconjugates targeting syndecan-1 expressing cells and use thereof
CA2580141C (en) * 2004-09-23 2013-12-10 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
EP1817341A2 (en) 2004-11-29 2007-08-15 Seattle Genetics, Inc. Engineered antibodies and immunoconjugates
JP5421532B2 (en) 2004-12-09 2014-02-19 セントカー・インコーポレーテツド Anti-integrin immunoconjugates, methods and uses
US20060159838A1 (en) 2005-01-14 2006-07-20 Cabot Corporation Controlling ink migration during the formation of printable electronic features
US7301019B2 (en) 2005-01-21 2007-11-27 Immunogen, Inc. Method for the preparation of maytansinoid esters
US20070213292A1 (en) 2005-08-10 2007-09-13 The Rockefeller University Chemically modified oligonucleotides for use in modulating micro RNA and uses thereof
US8623356B2 (en) 2005-11-29 2014-01-07 The University Of Sydney Demibodies: dimerization-activated therapeutic agents
EP1996612A4 (en) 2006-03-03 2010-10-20 Univ Kingston Compositions for treatment of cancer
ES2543475T3 (en) * 2006-05-30 2015-08-19 Genentech, Inc. anti-CD22 antibodies, immunoconjugates and uses thereof
CA2655379A1 (en) 2006-06-22 2007-12-27 Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research Structure of the insulin receptor ectodomain
ES2528922T3 (en) * 2007-07-16 2015-02-13 Genentech, Inc. Humanized anti-CD79b antibodies and immunoconjugates and methods of use

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005517032A (en) * 2001-12-21 2005-06-09 イミュノジェン・インコーポレーテッド Cytotoxic drug having a reactive polyethylene glycol moiety comprises a polyethylene glycol linking groups cytotoxic conjugate, and methods of making and using the same
JP2007514646A (en) * 2003-05-20 2007-06-07 イミュノジェン・インコーポレーテッド Improved cytotoxic agents comprising the novel maytansinoids
JP2007520450A (en) * 2003-10-10 2007-07-26 イミュノジェン・インコーポレーテッド How to the particular cell population targeted by using cell-binding agent maytansinoid conjugates linked via a non-cleavable linker, the conjugate, and the preparation of the complex
JP2011523628A (en) * 2008-04-30 2011-08-18 イミュノジェン・インコーポレーテッド Effective conjugates and hydrophilic linker

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JPN6014016108; LEWIS,P.G. et al: 'Targeting HER2-Positive Breast Cancer with Trastuzumab-DM1, an Antibody-Cytotoxic Drug Conjugate' Cancer Research Vol.68, No.22, 20081115, p.9280-9290 *
JPN6014016111; ERICKSON,H.K. et al: 'Antibody-Maytansinoid Conjugates Are Activated in Targeted Cancer Cells by Lysosomal Degradation and' Cancer Research Vol.66, No.8, 20060415, p.4426-4433 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016518332A (en) * 2013-03-13 2016-06-23 ノバルティス アーゲー Antibody drug conjugates
JP2016528304A (en) * 2013-08-26 2016-09-15 レゲネロン ファーマシューティカルス,インコーポレーテッド A pharmaceutical composition comprising a macrolide diastereomers, methods for their synthesis, and therapeutic uses

Also Published As

Publication number Publication date Type
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KR20120080611A (en) 2012-07-17 application

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