JP2013235011A - アフィニティークロマトグラフィーのための媒体 - Google Patents

Abstract

【課題】大量の生産タンパク質の結合および精製にとって十分な容量を有するクロマトグラフィー材料を作り出す必要性がある。
【解決手段】本発明は一般に、クロマトグラフィー用の固相担体に関する。特定の実施形態において、本発明は、アフィニティークロマトグラフィーに適した固相担体を、同固相担体を使用する方法、システムおよびキットと共に提供する。
【選択図】図１

Description

本発明は、一般にクロマトグラフィーの分野に関する。ある特定の実施形態において、本発明は、クロマトグラフィーで使用するための固相担体、例えば、アフィニティークロマトグラフィー用媒体をおよび同固相担体を使用する方法およびキットならびにクロマトグラフィープロセスを実施するためのシステムを提供する。

アフィニティークロマトグラフィーは、単クローン抗体（Ｍａｂ）を含めたタンパク質の研究、開発および製造において重要な役割を担っている。アフィニティークロマトグラフィー媒体は一般的に、標的分子と相互作用することができる結合リガンドを有する固相担体を含む。アフィニティークロマトグラフィーは、固相担体上に配置されたビードなどのリガンドが通常標的分子に対して選択的であるため、有用である。この選択性により、優れた収率および標的分子の高速で経済的な精製が可能となる。単クローン抗体を含めた免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ）について、プロテインＡは、大部分のサブクラスと結合する選択的アフィニティーリガンドである。Ｂｏｙｌｅ，Ｍ．Ｄ．ＰおよびＲｅｉｓ，Ｋ．Ｊ．，１９８７，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，５：６９７。プロテインＧは、ＩｇＧについての別のアフィニティーリガンドである。Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．；Ｍａｌｌｉａ，Ａ．Ｋ．；Ｓｍｉｔｈ，Ｐ．Ｋ．Ｉｍｍｏｂｉｌｉｓｅｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｌｉｇａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９２。

プロテインＡおよびプロテインＧの両方とも１以上のＩｇＧと結合することができる。これらは共に、樹脂、膜または他の媒体などの多孔質クロマトグラフィ担体上に一旦固定されると、多クローンＩｇＧまたは単クローン抗体（Ｍａｂ）の精製および商業生産に有用である。

プロテインＡは、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）から天然型で分離することができる。ＰｒｏＳｅｐ ｖＡ−ＨＣおよびｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗなどの現在市販されているプロテインＡ媒体製品は、黄色ブドウ球菌から得られたプロテインＡ（天然またはｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ）が使用されている。ＰｒｏＳｅｐ−ｒＡおよびＭａｂＳｅｌｅｃｔ（登録商標）などの他の市販のアフィニティー媒体製品は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（組み換え型またはｒ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ）において組み換えにより製造されるプロテインＡが採用されている。例えば、米国特許第５，１５１，３５０号を参照のこと。他の修飾組み換え型のプロテインＡについても記載されている。例えば、米国特許第５，０８４，５５９号、米国特許第６，３９９，７５０号、米国特許出願公開第２００５／０１４３５６６号を参照のこと。システイン残基を含むプロテインＡリガンドも知られている。米国特許第５，０８４，５５９号、米国特許第６，３９９，７５０号。システインアミノ酸の添加により、ベースマトリックスまたは樹脂へのリガンド結合が促進される。プロテインＡのＢドメインに対する修飾についても記載されている。米国特許出願公開第２００５／０１４３５６６号。

アフィニティークロマトグラフィー媒体の性能を決定し得るいくつかのパラメーターがある。選択性、有効物質移動、結合容量および充填層の透過率はすべて、所望の分離に影響を及ぼす媒体の実用性の決定において役割を担う。樹脂の選択性は、リガンドおよびその特性による。性能特性の多くは、ベースマトリックス特性の組合せおよび相互作用、リガンド結合に使用する化学修飾のタイプおよびリガンドの特性によって決まる。

ベースマトリックスは、媒体の加圧流特性の決定において役割を担い、吸着に影響を及ぼすためにその中へ標的分子が拡散しなければならない「有効細孔径」も決定する。合成および天然ポリマーについて、多くの場合、材料の細孔径と観測された剛性との間に関係がある。通常、細孔径が大きくなればなるほど、材料の剛性はより小さくなる。このことは、アガロースなどのヒドロゲルに特に当てはまる。非修飾アガロースで作製された材料は非常に剛性に乏しく、架橋結合による化学修飾を行って初めて所望の剛性が得られる。米国特許第４，９７３，６８３号。これらの課題を克服しようと試みるために、さらなる化学架橋が開発され、これにより適切な加圧流特性を有する粒子が提供される。例えば、米国特許第６，６０２，９９０号、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃａｔａｌｏｇ ２００７を参照のこと。しかしながら、これらの材料は依然として圧縮性で、これにより動作流速が制限され、さらに圧力が通常＜２バールに制限され、従って生産性およびエンドユーザーが利用可能な動作ウインドウが制限される。アガロースまたは修飾アガロースを用いて作製された市販のプロテインＡアフィニティー媒体としては、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（登録商標）、ｒ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（登録商標）、Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ（登録商標）およびＭａｂｓｅｌｅｃｔ Ｘｔｒａ（登録商標）が挙げられる。米国特許出願公開第２００６／０１３４８０５号。Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ Ｘｔｒａ（登録商標）は、アガロース担体について細孔径、粒径およびリガンド密度が調整されている修飾アガロースの別の形態である。ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃａｔａｌｏｇ ２００７。

シリカをベースとする固相担体は、アガロース担体に伴う欠点の多くが問題とならない。シリカ（例えば、ガラス）またはセラミックを含む固相担体を用いる１つの利点は、本質的に非圧縮性であることである。これにより、媒体の機械的特性からの媒体細孔径の切り離しが可能となる。媒体の機械的特性、例えば圧縮性により、最大加圧流性能がほぼ決まる。従って、シリカをベースとする固相単体は基本的に、切り離された細孔径および加圧流特性を有し、これにより一方の特性を他方に影響を及ぼすことなく変更することができる。多孔質シリカに基づくアフィニティー媒体、特に調節された細孔ガラス（ＣＰＧ）は、容量が大きく加圧流特性が適切であるため、商業的実用性が見出されている。ＭｃＣｕｅ，Ｊ．ｅｔ．ａｌ．，２００３，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，９８９：１３９。これまでは、１０００Åおよび７００Åの細孔径および５６μｍから１００μｍの粒径を有する材料が記述されている。ＭｃＣｕｅ，Ｊｕｓｔｉｎ ｅｔ．ａｌ．Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ，２２５ｔｈ ＡＣＳ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｏｒｌｅａｎｓ，ＬＡ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ，Ｍａｒｃｈ ２３−２７，２００３（２００３）。とりわけ、粒径および細孔径が小さいと容量は大きくなったが、容量の改善は減圧流特性の点で付加的であった。従って、特に、タンパク質治療薬および他の生物製剤のための大規模な調製方法の生産能力を考えると、容量の改善の必要性は依然としてある。

米国特許第５，１５１，３５０号明細書 米国特許第５，０８４，５５９号明細書 米国特許第６，３９９，７５０号明細書 米国特許出願公開第２００５／０１４３５６６号明細書 米国特許第４，９７３，６８３号明細書 米国特許第６，６０２，９９０号明細書 米国特許出願公開第２００６／０１３４８０５号明細書 国際公開第９０／０９２３７号 米国特許第５，８７４，１６５号明細書 米国特許第３，９３２，５５７号明細書 米国特許第４，７７２，６３５号明細書 米国特許第４，２１０，７２３号明細書 米国特許第５，２５０，６１２３号明細書 欧州特許出願公開第１３５２９５７号明細書 国際公開第２００４／０７４４７１号 米国特許第５，２６０，３７３号明細書 国際公開第９５／１９３７４号

Ｂｏｙｌｅ，Ｍ．Ｄ．ＰおよびＲｅｉｓ，Ｋ．Ｊ．，１９８７，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，５：６９７ Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．；Ｍａｌｌｉａ，Ａ．Ｋ．；Ｓｍｉｔｈ，Ｐ．Ｋ．Ｉｍｍｏｂｉｌｉｓｅｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｌｉｇａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９２ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃａｔａｌｏｇ ２００７ ＭｃＣｕｅ，Ｊ．ｅｔ．ａｌ．，２００３，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，９８９：１３９ ＭｃＣｕｅ，Ｊｕｓｔｉｎ ｅｔ．ａｌ．Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ，２２５ｔｈ ＡＣＳ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｏｒｌｅａｎｓ，ＬＡ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ，Ｍａｒｃｈ ２３−２７，２００３（２００３） Ｎｉｌｋｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １（２）：１０７

現在、単クローン抗体の生産は、バイオリアクター内の哺乳類細胞の発酵により、１０，０００から２０，０００リットルの規模で行われている。清澄化の後、これらの量は、通常プロテインＡカラムである第１のクロマトグラフィー段階により処理しなければならない。発酵プロセスおよび技術が向上するにつれて、未処理産物中のタイター濃度が継続的に増大し、得られるタイターは１ｇ／Ｌ以上となる。これらのより高いタイター発酵バッチは、総生産タンパク質量＞２０ｋｇをもたらすことができる。総タンパク質／バッチの増大により、プロテインＡカラム結合容量についての要求が増大している。従って、これら大量の生産タンパク質の結合および精製にとって十分な容量を有するクロマトグラフィー材料を作り出す必要性がある。本明細書中に記載する本発明の様々な実施形態はこの必要性に応じ、また他の必要性にも同様に応じる。

発明の要旨
様々な実施形態において、本発明は、これまでに記載されたアフィニティークロマトグラフィー媒体と比較して、より高い容量、例えば、動的容量およびより高い充填層の透過率を兼ね備えている改善されたアフィニティークロマトグラフィー媒体を提供し、従ってプロセスのスループットが向上し、これによりコストおよび時間が節約され、また他の利益がもたらされる。

ある実施形態において、本発明は、６３０Åより大きく１０００Åより小さい細孔径および５５μｍより大きく、例えば５５μｍより大きく、７０μｍより小さい平均粒径を有するシリカ粒子を含む、アフィニティークロマトグラフィーの実施に適した固相担体を提供する。粒径は、以下に記載する光散乱手段によって測定することができるが、粒径を測定する他の方法を使用することもできることは当業者に理解される。この固相担体は、粒径分布が例えば平均で＋／−１３μｍである粒子を含むことができる。この固相担体は、１つ以上のアフィニティーリガンドをさらに含むことができる。

他の実施形態において、本発明は、直径≧３．２ｃｍを有するカラムにおける充填層高さが２０ｃｍである場合に、破過１０％における動的容量（Ｑｄ）≧４５ｇ／Ｌ（グラム／リットル）および流量≧４００ｃｍ／時間における圧力降下≦２バールを有するアフィニティークロマトグラフィー媒体、例えばシリカを含む固相担体を提供する。このアフィニティークロマトグラフィー媒体は、１つ以上のアフィニティーリガンドをさらに含むことができる。

さらに他の実施形態において、本発明は、８３９Åの細孔径および６３μｍの平均粒径およびビードに結合したプロテインＡまたはこの機能性変異体を含むアフィニティーリガンドを含む調節された調節された細孔ガラスビードを提供する。

さらに他の実施形態において、本発明は、７００Åの細孔径および５５μｍの平均粒径（粒径分布＋／−１３μｍを有する。）およびアフィニティーリガンドを含む調製された細孔ガラス粒子、例えばビードを提供する。アフィニティーリガンドは、粒子に結合したプロテインＡまたはこの機能性変異体を含むことができる。

さらなる実施形態において、本発明は、混合物から標的分子を分離する方法を提供する。この方法は、（ａ）標的分子を含む混合物をアフィニティークロマトグラフィーマトリックス［このマトリックスは、（１）６３０Åより大きく１０００Åより小さい細孔径および５５μｍより大きく７０μｍより小さい平均粒径を有するシリカ粒子を含む固相担体および（２）固相担体に結合した標的分子に対して特異性を有するアフィニティーリガンドを含む。］に接触させる段階、および、（ｂ）アフィニティークロマトグラフィーマトリックスから標的分子を溶出する段階、を含む。

さらに他の実施形態において、本発明は、混合物から標的分子を分離する方法を提供する。この方法は、ａ）標的分子を含む混合物をアフィニティークロマトグラフィーマトリックスに接触させる段階、およびｂ）アフィニティークロマトグラフィーマトリックスから標的分子を場合により溶出する段階を含み、アフィニティークロマトグラフィーマトリックスは、カラムなどのハウジング内に収容され、アフィニティークロマトグラフィーマトリックスにより充填されたカラムは、少なくとも４００ｃｍ／時間の最大流速を有し、マトリックスは、１）シリカ粒子および、２）標的分子に対して特異性を有するアフィニティーリガンドを含み、標的分子についてのマトリックスの動的容量は、破過１０％で少なくとも４５ｇ／リットルである。

さらに他の実施形態において、本発明は、混合物から標的分子を分離するためのシステムを提供する。このシステムは、ａ）アフィニティークロマトグラフィーマトリックス（このマトリックスは、１）６３０Åより大きく１０００Åより小さい細孔径および５５μｍより大きく７０μｍより小さい平均粒径を含むシリカ粒子ならびに、２）固相担体に結合した標的分子に対して特異性を有するアフィニティーリガンドを含む固相担体を含む。）、ならびに、ｂ）アフィニティークロマトグラフィーマトリックスを収容するためのハウジングとを備える。このシステムは、アフィニティークロマトグラフィーマトリックスからの標的分子の溶出を検出するための手段を場合により備えることができる。

さらなる実施形態において、本発明は、混合物から標的分子を分離するためのシステムを提供する。このシステムは、ａ）アフィニティークロマトグラフィーマトリックス（このアフィニティークロマトグラフィーマトリックスは、カラムなどのハウジング内に収容され、このアフィニティークロマトグラフィーマトリックスで充填されたカラムは、少なくとも４００ｃｍ／時間の最大流速を有し、このマトリックスは、１）シリカ粒子および２）標的分子に対して特異性を有するアフィニティーリガンドを含み、標的分子についてのマトリックスの動的容量は、少なくとも４５ｇ／リットルである。）を有する。このシステムは、アフィニティークロマトグラフィーマトリックスからの標的分子の溶出を検出するための手段を場合により備えることができる。

他の実施形態において、本発明は、７００Åより大きく１０００Åより小さい細孔径および５５μｍより大きく７０μｍより小さい平均粒径およびシリカ粒子を含むアフィニティークロマトグラフィーマトリックスと、少なくとも１つの容器とを備えるキットを提供する。

さらなる実施形態において、本発明は、アフィニティークロマトグラフィーマトリックスおよび少なくとも１つの容器とを備えるキットを提供する。このキットにおいて、アフィニティークロマトグラフィーマトリックスは、カラムなどのハウジング内に収容され、アフィニティークロマトグラフィーマトリックスにより充填されたカラムは、少なくとも４００ｃｍ／時間の最大流速を有し、このマトリックスは、１）シリカ粒子および２）標的分子に対して特異性を有するアフィニティーリガンドとを含み、標的分子についてのマトリックスの動的容量は、少なくとも４５ｇ／リットルである。

本発明のある実施形態によるアフィニティー媒体についての動的容量および充填層の透過率を示すグラフである。

発明の詳細な説明
ある実施形態において、本発明は、改善された動的容量、より短い滞留時間でのより大きい流量を有する大きいクロマトグラフィーマトリックスを提供する。ある実施形態において、本発明は、規定の細孔径および規定の平均粒径を有するシリカ粒子からなる改善されたアフィニティークロマトグラフィーマトリックスを提供する。この改善されたマトリックスは、例えば、層の高さ２０ｃｍ、圧力＜２バールでカラムにマトリックスを充填した場合、マトリックスを用いて分離することができる標的分子について、例えば３０ｇ／Ｌを超える動的容量の向上、ならびに、例えば４００ｃｍ／時間を超える最大流速の向上をもたらす。特定の実施形態において、本発明は、破過１０％で滞留時間２分における動的容量が４９ｇ／Ｌを超えるアフィニティークロマトグラフィーマトリックスを提供する。従って、本発明によるアフィニティークロマトグラフィーマトリックスは、タンパク質などの標的分子を混合物から精製するための改善された組成物を提供し、この場合標的分子は、１ｇ／Ｌ以上を含めた様々な濃度で存在することができる。

定義
ここにおいて使用されるアフィニティーリガンドは、混合物中の非標的分子と比較して、混合物中に見られる標的分子とより大きい親和力で特異的に結合するタンパク質などの分子を指す。アフィニティーリガンドの例としては、プロテインＡ、プロテインＧまたはいずれかの機能性変異体を挙げることができ、この場合標的分子は、免疫グロブリンもしくは免疫グロブリンのＦｃ領域または免疫グロブリンのＦｃ領域の少なくとも一部からなる分子でよい。適切なアフィニティーリガンドの他の例としては、任意の公知の酵素を挙げることができ、この場合標的分子は酵素の基質となる。または、基質はアフィニティーリガンドとして働くこともでき、この場合基質に対して特異的な酵素が標的分子となる。アフィニティーリガンドのさらに他の例としては、抗体、例えば単クローン抗体、多クローン抗体が挙げられ、この場合標的分子は、抗体の可変領域と結合するエピトープを含む。

ここにおいて使用される機能性変異体は、天然アミノ酸配列において少なくとも１つの変性を有するが、天然配列に伴われている少なくとも１つの機能をなお維持しているタンパク質を指す。天然配列には、本来自然に発生するアミノ酸配列が含まれる。アミノ酸の変化としては、１つ以上のアミノ酸の別のアミノ酸への置換、１つ以上のアミノ酸の削除および／または１つ以上のアミノ酸の追加またはこれらのいずれかの組合せを挙げることができる。天然配列に対して行われる追加、削除および置換の組合せのような切り詰めも考えられる。機能性変異体は、タンパク質の断片またはドメインを含むこともできる。一例として、機能性変異体は、その天然配列と比較して変性アミノ酸を少なくとも１つ有するプロテインＡの全長分子、全長プロテインＡ分子の断片、または変異体が天然プロテインＡに伴われている少なくとも１つの機能、例えば免疫グロブリンのＦｃ部分と特異的に結合する能力を維持するならば、天然配列と比較して変化したアミノ酸を少なくとも１つ有する全長プロテインＡ分子の断片を含むことができる。機能性変異体の追加の例には、ドメイン、例えば、プロテインＡのＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥドメインならびにＺドメインまたはプロテインＺ（文献（Ｎｉｌｋｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １（２）：１０７）に記載されているプロテインＡのＢドメインの変異体）が含まれる。機能性変異体のアミノ酸配列は、天然アミノ酸配列と少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９８％同一であり得、天然配列に伴われている少なくとも１つの機能をなお維持している。

ここにおいて使用されるタンパク質は、アミノ酸のポリマーを含み、特定の長さを必要とする。従って、この定義は、タンパク質、ペプチドおよびポリペプチド、ならびに、例えばグリコシル化またはＰＥＧ化を含めたタンパク質に対する任意の発現後の修飾を含むものである。

ここにおいて使用されるシリカには、シリカおよびシリカから誘導され得るいずれもの物質（これにはガラスが含まれるがこれに限定されない。）が含まれる。

アフィニティークロマトグラフィー媒体
アフィニティークロマトグラフィー媒体は、通常固相担体および固相単体に結合したアフィニティーリガンドを含む。固相担体にアフィニティーリガンドを結合させる方法は、当分野で公知である。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９０／０９２３７、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．１９９２，Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｌｉｇａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、米国特許第５，８７４，１６５号、第３，９３２，５５７号、第４，７７２，６３５号、第４，２１０，７２３号、第５，２５０，６１２３号、欧州特許出願ＥＰ１３５２９５７Ａ１、ＷＯ２００４／０７４４７１を参照のこと。アフィニティーリガンドは、１つ以上の共有結合によって固相担体と結合することができる。共有結合は、アフィニティーリガンドの１つ以上の化学官能基を、固相担体の１つ以上の化学官能基と反応させることによって形成することができる。求核結合法を、適切な官能基と共に使用することができる。化学官能基の例として、ヒドロキシル基、アミン基、チオール基、カルボニル基等を挙げることができる。または、固相担体の表面の官能基を活性化することもできる。適切な基として、ＮＨＳエステル、エポキシドまたはアルデヒドを挙げることができる。アフィニティーリガンドを固相担体に直接結合させることも、または介在リンカー分子を使用してアフィニティーリガンドを固相担体に結合させることもできる。リンカーは、例えば立体障害を克服し、従って標的分子のアフィニティーリガンドへの結合を容易にするために役に立つことができる。適切なリンカーの設計は、十分に当業者の範囲内である。

固相担体は、当分野で公知のいずれもの適切な材料で構成することができる。従って固相担体は、いずれもの多孔質材料を含むことができる。一例として、多孔質材料は、膜、ビード、ゲル、カセット、カラム、チップ、スライド、プレートまたはモノリスの形をとることができる。さらに、多孔質材料は、不ぞろいな形の粒子を含むこともできる。多孔質材料は、有機もしくは無機分子、または有機および無機分子の組合せで構成することができ、またアフィニティーリガンドとの反応および／またはアフィニティーリガンドの結合に適した１つ以上の官能基、例えばヒドロキシル基で構成することができる。多孔質材料は、親水性化合物、疎水性化合物、疎油化合物、親油化合物またはこれらの任意の組合せで構成することもできる。

ある実施形態において、固相担体（例えば、粒子）は、無機分子などの硬質材料で構成することができる。適切な無機分子として、ケイ質材料を挙げることができる。適切なケイ質材料の例には、粒状ガラス、調節された細孔ガラス、コロイド状シリカ、ケイ灰石、シリカゲルおよびベントナイトが含まれる。固相担体が調節された細孔ガラス粒子で構成されているいくつかの実施形態において、この粒子は７００Åを超える細孔径を有することができる。さらなる実施形態において、細孔径は１０００Å未満でよい。他の実施形態において、細孔径は、６３０Åから１１７５Å、７２０Åから９５０Å、７８２Åから９３２Å、８００Åから９３２Åの範囲の寸法を有することができる。ある実施形態において、細孔径は８３９Åでよい。

いくつかの実施形態において、本発明は、シリカ粒子からなる先に記載したアフィニティークロマトグラフィー媒体と比較して、標的分子に対する結合容量（例えば、動的結合容量）が強化されたシリカ粒子からなるアフィニティークロマトグラフィーマトリックスを提供する。動的結合容量は、関心があるマトリックスの充填層に取り込まれるタンパク質を監視することによって測定することができる。最初は、タンパク質が完全に吸着され、カラムから出る貫流分画中にタンパク質は観測できない。カラムがさらにタンパク質で飽和する（タンパク質容量が利用される）につれて、タンパク質初期濃度の分画が貫流分画中に観測され始めることになる。最終的に、カラムが完全に飽和し、貫流中のタンパク質濃度が、カラムに入る初期タンパク質濃度と等しくなる（タンパク質容量のすべてが利用される）。実際には、貫流中のタンパク質を失うことなくカラムをできる限り充填することが望まれる。従って、貫流分画中の低レベルのタンパク質濃度または「破過」（全タンパク質濃度の１から１０％）における動的容量により、使用時の充填容量の代表的測定値がもたらされる。従って、破過１％または１０％で異なるアフィニティーマトリックスを比較することにより、エンドユーザーに対して有用な容量の比較が提供される。従って、本発明によるクロマトグラフィーマトリックスは、少なくとも４０ｇ／Ｌ、少なくとも４５ｇ／Ｌ、少なくとも５０ｇ／Ｌ、少なくとも６０ｇ／Ｌの動的結合容量を、標的分子について有することができる。いくつかの実施形態において、動的容量は５０ｇ／Ｌでよい。他の実施形態において、クロマトグラフィー媒体の動的容量が４０ｇ／Ｌから６０ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌから５０ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌから４９ｇ／Ｌ、４２ｇ／Ｌから４９ｇ／Ｌ、４１ｇ／Ｌから４７ｇ／Ｌ、５０から６０ｇ／Ｌの範囲に及ぶことができる。特定の実施形態において、本発明は、破過１０％で滞留時間２分における動的容量が４９から６０ｇ／Ｌであるアフィニティークロマトグラフィー媒体を提供する。他の実施形態において、本発明は、破過１％で滞留時間２分における動的容量が４０から５５ｇ／Ｌであるアフィニティークロマトグラフィー媒体を提供する。

シリカ粒子は、用途に応じて適切ないずれの寸法でもよい。この粒子は、５５μｍを超える平均粒径を有することができる。この粒子は、１００μｍ未満の平均粒径を有することができる。ある実施形態において、平均粒径は５５μｍから９０μｍ、６０μｍから８０μｍ、６０μｍから７０μｍ、５５μｍから６７μｍの範囲に及ぶことができる。特定の一実施形態において、平均粒径は６３μｍである。粒径分布は±３０μｍ、±２５μｍ、±２０μｍ、±１３μｍでよい。特定の一実施形態において、本発明は±１３μｍの粒径分布を有する。

本発明の実施に際して、関心がある標的分子の特異的結合パートナーであるならば、いずれものアフィニティーリガンドを使用することができる。アフィニティーリガンドは、全長タンパク質であっても、全長タンパク質の機能性変異体であってもよい。アフィニティーリガンドは、全長タンパク質または機能性変異体の単量体、二量体または多量体でよい。タンパク質リガンドの例としては、プロテインＡ、プロテインＧ、抗体のＦｃ受容体、ホルモンまたは成長因子に対する受容体を挙げることができる。例えば、米国特許第５，１５１，３５０号、第５，０８４，５５９号、第５，２６０，３７３号、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９５／１９３７４号を参照のこと。他の実施形態において、タンパク質リガンドは免疫グロブリン、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはこれらの機能性変異体でよい。

固相担体に結合するアフィニティーリガンドの量は、用途および標的分子に依存しよう。アフィニティーリガンドは、通常１ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌを超える密度（固相担体１リットル当たりのリガンドのグラム数）で固相担体に結合させられる。リガンド密度は、１ｇ／Ｌから２０ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌから１５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌから１５ｇ／Ｌ、１２ｇ／Ｌから１４ｇ／Ｌ、の範囲に及ぶことができる。

アフィニティーリガンドは、自然に発生する分子であっても、加工分子であってもよい。ある実施形態において、固相担体への結合もしくは固相担体上のタンパク質リガンドの配向を、または両方を容易にするために、自然に発生するアフィニティーリガンドを遺伝学的に変性することが望ましいであろう。従って、使用する会合する基に応じて、当業者は荷電基もしくは疎水基、または両方をアフィニティーリガンド中に設計することができる。これらの変更は、アフィニティーリガンド内のどこにでも加えることができる。

特定の一実施形態において、アフィニティーリガンドはプロテインＡまたはこの機能性変異体である。プロテインＡまたはこの機能性変異体は、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの原核細胞において、組み換えにより製造することができる。別の実施形態において、アフィニティーリガンドは、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）から得られるプロテインＡでよい。いくつかの実施形態において、アフィニティーリガンドは、天然プロテインＡまたはこの機能性変異体の１つ以上のドメイン、例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤまたはＥドメインを含むことができる。他の実施形態において、アフィニティーリガンドは、プロテインＺ（プロテインＡの変性Ｂドメイン）でよい。例えば、米国特許出願公開第２００５／０１４３５６６号を参照のこと。プロテインＡリガンドの性能を向上させる改変も考えられる。アフィニティーリガンドは、プロテインＡの単量体、またはこの機能性変異体、例えば２つ以上のユニットからなるプロテインＡの多量体、またはこの機能性変異体でよい。

標的分子としては、選択したタンパク質リガンドに特異的に結合する任意の分子を挙げることができる。タンパク質リガンドがプロテインＡまたはプロテインＧである場合、標的分子は、ＩｇＧサブクラスの免疫グロブリンまたはＩｇＧのＦｃ部分からなる分子を含むことができる。標的分子の具体例は、単クローン抗体を含むことができる。免疫グロブリンの機能性変異体および断片も、選択したアフィニティーリガンドに結合する能力を保持するならば、標的分子として考えられる。標的分子は融合タンパク質、例えば、Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）（Ａｍｇｅｎ、Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ、ＣＡ）などの免疫グロブリンのＦｃ領域の少なくとも一部からなる分子でもよい。

標的分子を精製する方法
ある実施形態において、本発明は、混合物から標的分子を精製する方法を提供する。この方法は、標的分子が選択的にクロマトグラフィーマトリックスに結合するような条件下で、例えばアフィニティークロマトグラフィー媒体からなるクロマトグラフィーマトリックスを、標的分子を含む混合物に接触させること、および場合により、１つ以上の条件を変更することによって、例えば、溶出緩衝液を適用する段階によって、マトリックスから標的分子を溶出することを含むことができる。溶出緩衝液は、例えば、実際にマトリックスに適用した混合物のｐＨとは異なるｐＨを有することができ、またはマトリックスに適用した元の混合物と比較してより高濃度の塩を有することができる。この方法は、場合により１回以上の洗浄段階を含むことができる。この洗浄段階は、例えば、標的分子がマトリックスと結合した後であり、標的分子をマトリックスから溶出する前に行うことができる。例えば、残留結合材料のマトリックスを取り除くために、標的分子の溶出後に追加の洗浄段階を場合により行うこともできる。洗浄緩衝液は、酸性ｐＨまたは塩基ｐＨを有することができる。

本発明のアフィニティークロマトグラフィーマトリックスは、混合物から標的分子を精製する任意の公知の方法において使用することができる。従って、標的分子を含む混合物にマトリックスを直接加えるバッチ組成でマトリックスを使用することができる。標的分子を含む混合物がマトリックスを含むカラムを通過するように、マトリックスをカラムに充填することもできる。

この方法は、他の公知のアフィニティークロマトグラフィー法と比較して、（例えば、アフィニティークロマトグラフィーマトリックスを含むカラムにわたって）最大流速を増大させることができる。粒径および細孔径を調整することによって、標的分子の結合および流量を共に向上させることができ、従って収率も効率も共に増大させることができる。いくつかの実施形態において、本発明は、混合物から標的タンパク質を分離する方法を提供する。混合物は、ハウジング、例えばカラムに収容されているアフィニティークロマトグラフィーマトリックスに接触し、混合物は、少なくとも４００ｃｍ／時間、少なくとも５００ｃｍ／時間、少なくとも６００ｃｍ／時間、少なくとも７００ｃｍ／時間、少なくとも８００ｃｍ／時間、少なくとも９００ｃｍ／時間の最大流速で、媒体を含むカラムの中を流れる。ある実施形態において、最大流速は、４００ｃｍ／時間から１０００ｃｍ／時間、４００ｃｍ／時間から９００ｃｍ／時間、５００ｃｍ／時間から９００ｃｍ／時間、６００ｃｍ／時間から９００ｃｍ／時間、７００ｃｍ／時間から９００ｃｍ／時間、６００ｃｍ／時間から８００ｃｍ／時間、７００ｃｍ／時間から８００ｃｍ／時間の範囲に及ぶことができる。

流速は、アフィニティークロマトグラフィー媒体の層高さによって決定することができる。例えば、流速が１００から７００ｃｍ／時間の範囲に及ぶ場合、層高さは１０から３０ｃｍの範囲に及ぶことができる。マトリックスの透過率が、使用することができる流量を制限し得る。アガロースの媒体は、例えば層高さ２０ｃｍにおいて流量＞５００ｃｍ／時間で、通常使用することができない。調節された細孔ガラス媒体は、層高さ２０ｃｍにおいて１０００から２５００ｃｍ／時間で実施することができ、これら調節された細孔ガラス媒体は層高さ３０ｃｍで構成することができ、および流量＞５００ｃｍ／時間をなおもたらすことができる。多くの場合、流速により媒体が充填されたカラムの生産性が限定され、このことはタンパク質精製プロセスの経済性（ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ）およびスループットに大きく影響を及ぼし得る。

現在、これらの流速制限を作り出す１つの要因は、タンパク質精製に使用される装置である。大部分のシステムが、比較的低い圧力、＜３バールで動作し、許容範囲は通常２バール未満である。より高い圧力により、アガロース及び他の限定された媒体についての流速の窓が広がり得るが、非圧縮性の調節された細孔ガラスは圧力の上昇をよりよく利用することができる一方で、アガロースなどの圧縮性媒体は、剛性の制限により、付加的な流速の増大を見ることができるだけである。

クロマトグラフィーシステム
いくつかの実施形態において、本発明は、混合物から標的分子を分離するためのシステムを提供する。このシステムは、シリカ粒子を含むアフィニティークロマトグラフィーマトリックスを含み得る。このシステムは、クロマトグラフィーマトリックスの充填に適した１つ以上のカラムを含めた、アフィニティークロマトグラフィーマトリックスの収容に適したハウジングをまた含み得る。カラムは、金属またはプラスチックを含めた任意の適切な材料で構成することができる。このシステムは、混合物の流れをクロマトグラフィーマトリックスにわたって促進するために、１つ以上のポンプを備えることができる。適切なポンプには、蠕動ポンプ、パルスポンプおよび／または容積式ポンプが含まれる。このシステムは、高圧液体クロマトグラフィーシステム（ＨＰＬＣ）中圧液体クロマトグラフィーシステム（ＭＰＬＣ）または低圧液体クロマトグラフィーシステム（ＬＰＬＣ）の形をとることができる。このシステムは、クロマトグラフィー媒体からの溶離液の量を検出するための１つ以上の手段を含むことができる。検出器は、多波長検出または単一波長検出を利用する、光をベースとする検出器であり得る。適切な検出器には、可視波長の光を検出することができる分光光度計、紫外線吸収検出器、蛍光検出器が含まれる。検出器は、レーザー光源を利用する光散乱検出器であっても、または酸化可能もしくは還元可能な物質に反応する電気化学検出器であってもよく、電気出力は、電極の表面で起こる反応によって生成される電子流である。このシステムは、クロマトグラフィー媒体からの溶出物質のクロマトグラムを提供するための１つ以上のプリンタを備えることもできる。システムは、１台以上のパーソナルコンピューターを備えることもできる。パーソナルコンピューターは、溶出分画の吸光度または蛍光などのデータを記録するために適していよう。加えてコンピューターは、溶出分画中の標的分子の濃度を算出するために適切なソフトウエアを装備することができる。クロマトグラフィーマトリックスに試料を加え、１種以上の適切な緩衝液でマトリックスを洗浄し、場合により適切な溶出緩衝液で標的分子をマトリックスから溶出させるように、コンピューターを使用してアフィニティークロマトグラフィーを実行するプロセスを自動化することもできる。このシステムは、コンピューター制御の自動化洗浄段階を提供することもでき、これによりクロマトグラフィー媒体が、適切な洗浄試薬との使用後に再生される。

キット
本発明は、クロマトグラフィー固相担体および少なくとも１つの容器を備えるキットも提供する。クロマトグラフィー固相担体は、規定の細孔径および規定の粒径を有するシリカ粒子を含むアフィニティークロマトグラフィー固相担体であり得る。シリカ粒子は、以下に記載する粒子属性のいずれかを含むことができる。このキットは、場合により１つ以上のアフィニティーリガンドを含むことができる。固相担体に結合したアフィニティーリガンドを固相担体に提供することも、またはアフィニティーリガンドを固相担体とは別に提供することもできる。このキットは、１つ以上のカラムなど、固相担体を収容するためのハウジングを場合により備えることができ、ハウジングを固相担体で充填することができる。このキットは、場合により１種以上の試薬を含むこともできる。固相担体とアフィニティーリガンドとを別々に提供する場合には、試薬として、固相担体にアフィニティーリガンドを結合させるための試薬を挙げることができる。結合試薬としては、例えば、ヒドロキシル官能基と反応する試薬を挙げることができる。他の場合により用いられる試薬としては、例えば非特異的に結合した分子の除去に適した洗浄緩衝液、例えばリン酸緩衝生理食塩水もしくは水、およびアフィニティークロマトグラフィー媒体からの標的分子の溶出に適した溶出緩衝液、例えば酸性ｐＨを有する溶液を挙げることができる。このキットは、場合により１つ以上の対照を含むことができる。対照としては、免疫グロブリンなどの標的分子、および／またはプロテインＡ、プロテインＧ、いずれかの機能性変異体などのアフィニティーリガンドが挙げられる。このキットは、場合により取扱説明書を備えることができる。この取扱説明書は、以下、固相担体にアフィニティーリガンドを結合させること、シリカ固相担体を含むアフィニティークロマトグラフィー媒体でカラムを充填すること、シリカ固相担体を含むアフィニティークロマトグラフィー媒体を用いて標的分子を分離すること、使用後にクロマトグラフィー媒体を洗浄すること、使用前にクロマトグラフィー媒体の平衡化することのうちの１つ以上に関する指針を提供することができる。

細孔径が異なるシリカアフィニティーマトリックス
ＷＯ９０／０９２３７に記載されている固相担体にプロテインＡを結合させるための方法に従って、細孔径が５００Åから１２００Åである調節された細孔ガラスビード（各５０ｍＬ、平均粒径６３μｍ）をプロテインＡで官能基化した。プロテインＡリガンド密度１２から１４ｇ／Ｌを実現した。リガンド結合の後、各々体積１５０ｍＬの（順に）、ｐＨ８で０．１５ＭのＮａＣｌを有する０．１Ｍのトリス、その後０．０５Ｍの酢酸で試料を３サイクル洗浄した。その後、試料を平衡化し、ＰＢＳｗ／アジド中で保存した。下記実施例５において説明するように、流れの滞留時間２分で動的ＩｇＧ結合容量について試料を試験した。細孔径が異なるアフィニティーマトリックスについての特性を表１に示す。

粒径および粒径分布が異なるシリカアフィニティーマトリックス
ＷＯ９０／０９２３７に記載されている固相担体にプロテインＡを結合させるための方法に従って、記載の平均粒径（光散乱により測定される。）を有する調節された細孔ガラスビード（細孔径７００Å、各５０ｍＬ）をプロテインＡで官能基化した。プロテインＡリガンド密度１２から１４ｇ／Ｌを実現した。リガンド結合の後、各々体積１５０ｍＬの（順に）、ｐＨ８で０．１５ＭのＮａＣｌを有する０．１Ｍのトリス、その後０．０５Ｍの酢酸で試料を３サイクル洗浄した。その後、試料を平衡化し、ＰＢＳｗ／アジド中で保存した。下記実施例５において説明するように、流れの滞留時間２分で動的ＩｇＧ結合容量について試料を試験した。細孔径が異なるアフィニティーマトリックスについての特性を表２に示す。

粒径分布を伴う粒径６５μｍおよび細孔径８４０Åを有するシリカアフィニティーマトリックスの特性
ＷＯ９０／０９２３７に記載されている固相担体にプロテインＡを結合させるための方法に従って、調節された細孔ガラスビード（細孔径８３９Å、平均粒径６３μｍ、体積５０ｍＬ）をプロテインＡで官能基化した。プロテインＡリガンド密度１３ｇ／Ｌを実現した。リガンド結合の後、各々体積１５０ｍＬの（順に）、ｐＨ８で０．１５ＭのＮａＣｌを有する０．１Ｍのトリス、その後０．０５Ｍの酢酸で試料を３サイクル洗浄した。その後、試料を平衡化し、ＰＢＳｗ／アジド中で保存した。下記実施例５において説明するように、動的ＩｇＧ結合容量について試料を試験した。このアフィニティーマトリックスについての特性を図１に示す。

粒径分布を伴う粒径５５μｍおよび細孔径７００Åを有するシリカアフィニティーマトリックスの特性
ＷＯ９０／０９２３７に記載されている固相担体にプロテインＡを結合させるための方法に従って、調節された細孔ガラスビード（細孔径７００Å、平均粒径５５±１３μｍ、体積５０ｍＬ）をプロテインＡで官能基化した。プロテインＡリガンド密度１３ｇ／Ｌを実現した。リガンド結合の後、各々体積１５０ｍＬの（順に）、０．１Ｍのトリス緩衝液、ｐＨ８で０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０５Ｍの酢酸、ＰＢＳｗ／アジドで試料を洗浄した。下記実施例５において説明するように、動的ＩｇＧ結合容量について試料を試験した。このアフィニティーマトリックスについての特性を図１に示す。

ＩｇＧ動的容量の決定
プロテインＡ媒体を、オムニフィット（ｏｍｎｉｆｉｔ）カラム（直径０．６６ｃｍ、層高さ７ｃｍ）（Ｂｉｏ Ｃｈｅｍ Ｖａｌｖｅ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｏｎｔｏｗｎ，ＮＪ）に充填し、多クローンヒト免疫グロブリン（ＩｇＧ）の動的結合容量について試験した。これらのカラムをＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化し、この同じ緩衝液を用いて同等の流量条件下でカラムにタンパク質（２ｇ／Ｌ）を充填した。破過１０％における容量を使用して異なる媒体を比較した。

アフィニティーマトリックスの平均粒径および粒径分布の決定
レーザー回折Ｍａｌｖｅｒｎ Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ Ｓ（６３３ｎｍ）（Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を用いて、調節された細孔ガラスの粒径分布を決定した。回転子速度は２５００に設定した。関心があるＣＰＧ試料を、最適な検出のためのオブスキュレーション（ｏｂｓｃｕｒａｔｉｏｎ）１５から２０％達するまでＭｉｌｌｉ−Ｑ水に懸濁させた。Ｍｉｅ理論を用いて生成した平均粒径を報告する。

本明細書および特許請求の範囲で使用する材料、反応条件などの量を表す数字はすべて、用語「約」によってすべての場合においては変更されるものと理解すべきである。従って、特に指示がない場合は、本明細書および添付の特許請求の範囲に記載されている数値パラメーターは、本発明によって得ようとする所望の特性に応じて変わることがある近似値である。少なくとも、また特許請求の範囲に対する均等論の適用を制限しない試みとして、各数値パラメーターは、有効桁数および通常の四捨五入手法の観点で解釈すべきである。

当業者には明らかなように、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本発明の多くの変更および変形を行うことができる。本明細書中に記載されている特定の実施形態は、ほんの一例として提供されているにすぎず、決して限定的なものではない。本明細書および実施例は例示として見なされるにすぎないものであり、本発明の真の範囲および精神は添付の特許請求の範囲によって示される。

Claims (25)

1. ６３０Åより大きく１０００Åより小さい細孔径および５５μｍより大きく７０μｍより小さい平均シリカ粒径を有するシリカ粒子を含む、アフィニティークロマトグラフィーの実施に適した固相担体。
2. シリカ粒子がビードである、請求項１に記載の固相担体。
3. シリカ粒子が、７８２Åから９３２Åの範囲の細孔径を有する、請求項１に記載の固相担体。
4. シリカ粒子が、５５μｍから６７μｍの範囲の平均粒径を有する、請求項１に記載の固相担体。
5. シリカ粒子が、粒状ガラス、調節された細孔ガラス、コロイド状シリカ、ケイ灰石、乾燥シリカゲルおよびベントナイトから選択される材料からなる、請求項１に記載の固相担体。
6. 固相担体に結合したアフィニティーリガンドをさらに含む、請求項１に記載の固相担体。
7. アフィニティーリガンド密度が１０ｇ／Ｌより大きい、請求項６に記載の固相担体。
8. 標的分子に対するアフィニティーリガンドの動的容量が４９ｇ／Ｌに等しいまたはそれより大きい、請求項６に記載の固相担体。
9. アフィニティーリガンドが、免疫グロブリンの一部と特異的に結合する、請求項６に記載の固相担体。
10. アフィニティーリガンドが、免疫グロブリンのＦｃ領域の一部と結合する、請求項９に記載の固相担体。
11. アフィニティーリガンドが、プロテインＡ、プロテインＧまたはいずれかの機能性変異体から選択される、請求項９に記載の固相担体。
12. 約８３９Åの孔径、６３μｍの平均粒径およびビードに結合したプロテインＡまたはこの機能性変異体を含むアフィニティーリガンドを含む調節された細孔ガラスビード。
13. 約７００Åの孔径、５５μｍ±１３μｍの平均粒径およびビードに結合したプロテインＡまたはこの機能性変異体を含むアフィニティーリガンドを含む調節された細孔ガラスビード。
14. （ａ）標的分子を含む混合物をアフィニティークロマトグラフィーマトリックス［このマトリックスは、（１）６３０Åより大きく１０００Åより小さい細孔径および５５μｍより大きく７０μｍより小さい平均粒径を有するシリカ粒子を含む固相担体および（２）固相担体に結合した標的分子に対して特異性を有するアフィニティーリガンドを含む。］に接触させる段階、および
    （ｂ）アフィニティークロマトグラフィーマトリックスから標的分子を溶出する段階
    を含む標的分子を分離する方法。
15. アフィニティークロマトグラフィーマトリックスがハウジング内に収容され、接触させる段階が、アフィニティークロマトグラフィーマトリックスの上に、６００ｃｍ／時間から９００ｃｍ／時間の範囲の最大流速で標的分子を含む混合物を流す段階を含む、請求項１４に記載の方法。
16. 標的分子が、免疫グロブリンの少なくとも一部を含む、請求項１４に記載の方法。
17. 標的分子が、単クローン抗体または多クローン抗体を含む、請求項１４に記載の方法。
18. 標的分子が、免疫グロブリンのＦｃ領域の少なくとも一部を含む融合タンパク質を含む、請求項１４に記載の方法。
19. アフィニティーリガンドが、プロテインＡまたはこの機能性変異体を含む、請求項１４に記載の方法。
20. アフィニティーリガンドが、１０ｇ／Ｌまたはそれ以上の密度にてシリカ粒子に結合している、請求項１４に記載の方法。
21. 標的分子が、酸性ｐＨを有するバッファによりアフィニティークロマトグラフィーマトリックスから溶出される、請求項１４に記載の方法。
22. アフィニティークロマトグラフィーマトリックスが、標的分子について少なくとも４５ｇ／リットルの動的結合容量を有する、請求項１４に記載の方法。
23. ６３０Åより大きく１０００Åより小さい細孔径および５５μｍより大きく７０μｍより小さい平均粒径を有するシリカ粒子を含むアフィニティークロマトグラフィー固相担体並びに少なくとも１つの容器を備えるキット。
24. 固相担体との結合に適したアフィニティーリガンドをさらに含む、請求項２３に記載のキット。
25. アフィニティークロマトグラフィー固相担体の充填に適したカラムをさらに含む、請求項２３に記載のキット。

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