JP2013145250A - 毒性試験方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】哺乳類に対して細胞毒性を示す被検対象物の、哺乳類に対する細胞毒性の急性毒性を評価する方法であって、該被検対象物を投与したカイコにおける該被検対象物の代謝状況を測定することによって行うことを特徴とする毒性試験方法、及び、被検対象物の哺乳動物中における代謝状況を推定する方法であって、カイコを、哺乳動物を代替する実験動物として用いることを特徴とする薬物代謝推定方法。
【選択図】図4
Description
(1)入手が容易である。
(2)飼育する方法が既に確立されており、更に飼育に利便性がある。
(3)ヒト等の哺乳類の内臓・器官と類似する性質が、これまでの研究である程度分かっている。
(4)遺伝系統が確立されており、遺伝的均一性の維持ができている。
(5)比較的大型で、動きが緩慢であり、実質上無毛なので、定量的に注射できる等、薬物の投与が容易であり、血液等の採取も容易である。
(6)脂肪体を有しており、脂肪体を取り出して、含有する物質の定量が可能である。
(7)マウス、ラット等に比べると安価で、狭いスペースで多数の個体を飼育でき、倫理的な問題も少ない。
(8)被検物質が少量しかない場合でも評価を行うことができる。
(9)齢を揃える等、同じ状態の個体を揃えることが容易である。
カイコの受精卵(交雑種Hu・Yo x Tukuba・Ne)は、愛媛蚕種株式会社から購入した。孵化した幼虫は室温で人工飼料シルクメイト2S(日本農産工業株式会社製)を与えて5齢幼虫まで育てた。飼育容器は卵から2齢幼虫までを角型2号シャーレ(栄研器材製)、それ以降をディスポーザブルのプラスチック製フードパック(フードパックFD 大深、中央化学株式会社製)を用いた。飼育温度は27℃とした。
(1)血液内投与試料の例
塩化ナトリウム(Sodium chloride)を生理食塩水にて、500mg/mLから5mg/mLまでの濃度水準で2倍希釈系列の濃度調製し、1濃度10頭のカイコに0.05mLずつ腹部から注射により投与した。
(2)腸管内投与試料の例
硫酸第一鉄(ferrous sulfate)を生理食塩水にて、600mg/mLから6mg/mLまでの濃度水準で2倍希釈系列の濃度調製し、1濃度10頭のカイコに0.05mLずつ注射筒を用いて腸管内に投与した。
<カイコによる被検対象物のLD50値の算出とげっ歯類で得られた値との比較>
5齢1日目のカイコに、上記の投与方法に従って各被検対象物を投与した後、各カイコを1日間飼育し、1日後に半数が死亡する体重1gあたりの投与量(μg)をLD50値とした。値の確定のため、必要に応じて投与濃度を更に変動させて同様の操作を繰り返した。
被検対象物の毒性試験においては、LD50値の算定と共に、被検対象物の体内動態を予測するために、その代謝物の分析を行う必要がある。従って、カイコにおいて行った代謝物の分析結果が哺乳類での結果を代替できるものであるならば、カイコを用いて行う毒性試験方法の有用性が更に増す結果となる。そこで、以下にカイコを用いた被検対象物の代謝物分析の具体例を示すと共に、代謝機構の哺乳類との類似性について検討した。
(1)7−ヒドロキシ−4−メチルクマリンの血中半減期の確認
表1に示す多くの化合物のLD50値が哺乳動物と一致しているという結果は、カイコにおける薬物の体内動態が哺乳動物と共通した機構によっていることを示唆している。哺乳動物における薬物の体内動態のモデル薬物として使用されている、蛍光物質である7−ヒドロキシ−4−メチルクマリンについて、カイコにおける体内動態を検討した。
7−ヒドロキシ−4−メチルクマリンは、哺乳類ではグルクロン酸抱合及び硫酸抱合を受ける。そこでカイコにおいても抱合反応を受けるか否かについて検討した。
カイコのどの臓器がグルコース抱合反応を担うかについて、以下のin vitroでの組織培養によって検討した。カイコから分離した脂肪体、腸管、絹糸腺及びその他の臓器をTC100培地(日本農産社製)に加えた後、0.16μmoLの7−ヒドロキシクマリンを加えて30℃でインキュベートした。各時間において培養液上清をサンプリングし、β−グルコシダーゼで処理後に蛍光強度(Ex:368nm,Em:456nm)を測定した。
次に、カイコの糞中へ排泄される投与薬剤の代謝産物について検討した。先に記したように鱗翅目昆虫の幼虫では、代謝された物質は昆虫の排泄器官であるマルピーギ管を介して糞中に排泄されることが知られている。そこで、投与した7−エトキシクマリンとその脱エチル化体である7−ヒドロキシクマリンの糞中の代謝産物につき検討を行った。
カイコの血液中に0.275μmoLの7−ヒドロキシクマリンを注射後、経時的に糞を回収し、メタノール抽出後、β−グルコシダーゼ処理を行ったサンプルと行わなかったサンプルの両者の蛍光強度(Ex:368nm,Em:456nm)を測定した。未抱合体の量はβ−グルコシダーゼ処理を行わなかったサンプルの蛍光強度より求めた。
操作は(4−a)と同様に行い、投与された7−エトキシクマリンの11%が未抱合体の7−ヒドロキシクマリンとして、45%がそのグルコース抱合体として排泄されていることが分かった(表3)。従って、7−エトキシクマリンはシトクロームP450によって脱エトキシ化されて7−ヒドロキシクマリンに変換された後、更に抱合反応によりグルコース抱合体へと代謝されると考えられる。また、7−エトキシクマリンの排泄は7−ヒドロキシクマリンに比べると速度が遅く、24時間後にも排泄が認められた(図5)。7−エトキシクマリンの血中半減期は6時間であることから(図6)、カイコにおける7−エトキシクマリンの代謝の場合、初段階であるP450による脱エチル反応が律速段階であり、脱エチル化された後は反応物である7−ヒドロキシクマリンは速やかにグルコース抱合されて排泄されると考えられる(図7)。
Claims (6)
- 哺乳類に対して細胞毒性を示す被検対象物の、哺乳類に対する細胞毒性の急性毒性を評価する方法であって、該被検対象物を投与したカイコにおける該被検対象物の代謝状況を測定することによって行うことを特徴とする毒性試験方法。
- 上記被検対象物が、哺乳類に対して神経毒性を示す化合物を除いた被検対象物である請求項1に記載の毒性試験方法。
- 哺乳類に対して細胞毒性を示す被検対象物の、哺乳類に対する細胞毒性の急性毒性を評価する方法であって、該被検対象物を投与したカイコの血液中又は糞中から被検対象物の代謝物を分析することによって行う請求項1又は請求項2記載の毒性試験方法。
- 上記「被検対象物の代謝物」がグルコース抱合体である請求項3に記載の毒性試験方法。
- 被検対象物の哺乳動物中における代謝状況を推定する方法であって、カイコを、哺乳動物を代替する実験動物として用いることを特徴とする薬物代謝推定方法。
- 被検対象物の哺乳動物中における代謝状況を推定する方法であって、カイコを、哺乳動物を代替する実験動物として用い、グルコース抱合体を分析することによって行う請求項5記載の薬物代謝推定方法。
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