JP2013067527A - 結晶化プレート - Google Patents

Abstract

【課題】結晶化プレートに設けられている結晶化ウェル内に生成されているタンパク質の生成度合いを観察する場合、強磁場から結晶化プレートを取り出す必要がなく、結晶ができていない場合でも、結晶成長が乱されず、つまり、タンパク質が結晶化する過程をその場観察することができる結晶化プレートを提供する。
【解決手段】柱状空間２０を具備するリング体１０と、タンパク質の結晶化に必要な沈殿剤を収容し、上記リング体１０に設けられているリザーバ３０と、タンパク質の結晶が生成される部位であり、上記リング体１０に設けられている結晶生成部４０とを有することを特徴とする結晶化プレートＰＬ１。
【選択図】図２

Description

本発明は、擬似微小重力状態でタンパク質等を結晶化する結晶化プレートに関する。

従来、多くの重要タンパク質を結晶化することは非常に困難であり、たとえ結晶が得られても、品質が悪く構造解析が可能な分解能のＸ線回折データを取得できない場合が多く、すなわち、結晶化の段階が、タンパク質のＸ線結晶構造解析のボトルネックになっている。

ここで、蒸気拡散法によるタンパク質結晶生成について説明する。

密閉容器内で、結晶化ドロップ（タンパク質溶液と沈殿剤溶液との混合液）内の水が、蒸発し、沈殿剤濃度の高い外液（リザーバ）へ移動するので、結晶化ドロップ内のタンパク質溶液濃度と沈殿剤濃度とが上昇し、過飽和タンパク質溶液において、結晶成長の核となる微結晶が形成される。沈殿剤濃度が適切な範囲であれば、結晶が生成する。

ところで、重力下では、タンパク質の結晶化においてタンパク質溶液の濃度勾配が発生し、これによってタンパク質溶液に自然対流が発生する。つまり、タンパク質溶液の液滴表面から水分が蒸散すると、液滴表面に溶質濃度の高い領域ができ、この高濃度領域が重力によって落ち、これによって、自然対流が発生する。このタンパク質溶液の対流によって、結晶の質が低下する。

重力下では、自然対流によってタンパク質と不純物とが頻繁に供給されるので、結晶成長は早いが不純物が取り込まれ易い。また、自然対流によってタンパク質同士の衝突が起こり易く、多くの結晶核が生成し、生成した結晶核が小さな結晶になり易い。重力下では、上記のように、タンパク質の供給が速いので、誤った配向で結晶表面に付着したタンパク質が結晶に取り込まれ易く、タンパク質の分子配列が乱れる。

重力下でタンパク質の分子配列が乱れることを回避する手段として、宇宙の微小重力環境を利用した結晶化が行われ、高分解能のＸ線回折像を与えるタンパク質結晶生成に有効であることが判明した。しかし、宇宙実験は実験機会が限られ、多種多様なタンパク質の構造解析への網羅的な適用が困難である。そこで、地上において超伝導マグネットを利用した磁気力浮揚による擬似的な微小重力環境を創り出すことが知られ（たとえば、特許文献１参照）、この擬似的な微小重力環境の中でタンパク質結晶を生成するアプローチが行われている。

特許第３２７８６８５号

しかし、上記従来例では、結晶化プレートに設けられている結晶化ウェル内に生成されているタンパク質の生成度合いを観察する場合、強磁場から結晶化プレートを取り出す必要があり、結晶ができているかどうかわからない状態で取り出さなければ状態を確認できず、結晶ができていない場合には、結晶成長が乱されるという問題がある。

つまり、結晶化プレートを取り出すためには、溶液に作用する磁気力が空間的に変化する中を、結晶化プレートを取り出したり戻したりする作業によって、溶液中に流れが生じ、結晶成長が乱されるという問題がある。

本発明は、結晶化プレートに設けられている結晶化ウェル内に生成されているタンパク質の生成度合いを観察する場合、強磁場から結晶化プレートを取り出す必要がなく、結晶ができていない場合でも、結晶成長が乱されず、つまり、タンパク質が結晶化する過程をその場観察することができる結晶化プレートを提供することを目的とする。

本発明の結晶化プレートは、柱状空間を具備するリング体と、タンパク質の結晶化に必要な沈殿剤を収容し、上記リング体に設けられているリザーバと、タンパク質の結晶が生成される部位であり、上記リング体に設けられている結晶生成部とを有することを特徴とする結晶化プレートである。

本発明によれば、強磁場内で結晶化プレートにおいてタンパク質を結晶化する場合、リング体の柱状空間に観察装置を挿入することができ、これによって、結晶化プレートを強磁場から取り出さずに、タンパク質の結晶化を観察することができ、つまり、タンパク質が結晶化する過程を観察することができるという効果を奏する。

本発明の実施例１である結晶化プレートＰＬ１と、結晶化プレートＰＬ１を観察する観察装置ＯＢ１とを示す図である。 結晶化プレートＰＬ１の平面と、結晶化プレートＰＬ１の断面とを示す図である。 本発明の実施例２である結晶化プレートＰＬ２を示すブロック図である。 本発明の実施例３である結晶化プレートＰＬ３を示すブロック図である。 本発明の実施例４である結晶化プレートＰＬ４を示すブロック図である。 結晶化プレートＰＬ２における嵌合構造を示す図である。 本発明の実施例６である結晶化プレートＰＬ５を示すブロック図である。 本発明の実施例７である結晶化プレートの観察装置における観察系５０を示す図である。 観察系５０において、観察点がＹ軸方向で異なる場合に、Ｙ軸を位置決めする例を示す図である。 観察系５０において、観察点がＺ軸方向で異なる場合に、傾斜鏡５１の位置を固定し、対物レンズ５２を移動させることによって焦点調節する例を示す図である。

発明を実施するための形態は、以下の実施例である。

図１は、本発明の実施例１である結晶化プレートＰＬ１と、結晶化プレートＰＬ１を観察する観察装置ＯＢ１とを示す図である。

図２は、結晶化プレートＰＬ１の平面と、結晶化プレートＰＬ１の断面とを示す図である。

すなわち、図２（１）は、結晶化プレートＰＬ１のみの平面を示す図であり、図２（２）は、図２（１）のＩＩ−ＩＩ線から見た断面図であり、観察系５０を同時に示す図である。

結晶化プレートの観察装置ＯＢ１は、超伝導マグネットＭｇ１の中心部に、図１中、縦穴が設けられ、この縦穴を上下動自在（軸方向に移動自在）であり、軸を中心として回転可能な（周方向に回転可能である）観察系５０が設けられている。また、観察系５０に設けられている光源５５も、超伝導マグネットＭｇ１の上記縦穴を上下動自在であり、軸を中心として回転可能である。

観察系５０は、傾斜鏡５１と、対物レンズ５２と、チューブレンズ５３（結像レンズともいう）と、ＣＣＤカメラ５４と、光源５５と、回転手段と、移動手段とを有する。傾斜鏡５１は、結晶生成部４０で生成されている結晶の像を反射し、対物レンズ５２は、傾斜鏡５１で反射した光を一旦平行光とし、チューブレンズ５３によってＣＣＤカメラ５４に結像する。ＣＣＤカメラ５４は、ＣＣＤ等の受光素子を有し、結晶生成部４０で生成されている結晶の像を電気信号に変換する。なお、ＣＣＤカメラの代わりに、他の観察手段を設けるようにしてもよい。

上記回転手段は、リング体１０の内周に形成されている柱状空間２０で、傾斜鏡５１である反射手段を、リング体１０の周方向に回転する手段である。上記移動手段は、柱状空間２０で、上記反射手段を、リング体１０の軸方向に移動する手段と、上記各部を固定したまま対物レンズ５２だけを移動させ焦点調節を行う手段である。

光源５５は、図１、図２（２）中、傾斜鏡５１の下であって、結晶化プレートＰＬ１の柱状空間２０に設けられ、図１、図２（２）中、横（側面）から、結晶生成部４０に光を照射する。

結晶化プレートＰＬ１は、リング体１０と、リザーバ３０と、結晶生成部４０と、反射面Ｍ１とを有する。反射面Ｍ１において、全反射を利用すれば、ミラー面でなくても、ミラー面と同様の効果を得ることができる。

リング体１０は、合成樹脂、ガラス等の透明な材料で形成され、図２に示すように、柱状空間２０と、１２個の室とが設けられ、１つの室に、１つのリザーバ３０と２つの結晶生成部４０とがそれぞれ設けられている。なお、上記実施例において、上記室として１２個以外の個数を設けるようにしてもよい。

また、結晶生成部４０がリング体１０の内側に設けられている。結晶生成部４０をリング体１０の内側に設けた理由は、リング体１０の中心に近いほど、磁気力場の均一性が良いからであり、つまり、結晶生成部４０をリング体１０の内側に設けることによって、より均一な磁気力場を利用することができる。また、リザーバ３０と結晶生成部４０とを組とすると、リング体１０に、上記組が複数、設けられている。なお、１つの室に、１つのリザーバ３０と１つの結晶生成部４０とを設けるようにしてもよい。

リザーバ３０は、ポリエチレングリコール、硫酸アンモニウム、ＮａＣｌ等の沈殿剤の濃度の高い外液を収容する部分である。また、リザーバ３０の上部に段差３１、３２が設けられ、リザーバ３０と結晶生成部４０との間に空隙３３が設けられている。

結晶生成部４０は、結晶ウェルまたはドロップウェルとも言われ、強磁場内に置かれているタンパク質が結晶化される部位である。なお、図１に示すように、結晶化プレートＰＬ１の外周に、高磁気力場発生用超伝導マグネットＭｇ１が設けられている。この超伝導マグネットＭｇ１が発生する高磁気力場によって、超伝導マグネットＭｇ１の中心空洞部に、擬似的な微小重力環境が創られる。

また、結晶生成部４０は、タンパク質溶液と沈殿剤溶液との混合液である結晶化ドロップを載置する部位であり、タンパク質の結晶化が進行する部位であり、リング体１０の内周１１の近傍に設けられている。つまり、結晶生成部４０は、リザーバ３０とリング体１０の内周１１との間（リザーバ３０とリング体１０の中心軸との間）に設けられている。なお、結晶生成部４０とリザーバ３０とを、リング体１０の中心軸からほぼ同距離に設けるようにしてもよい。

結晶化ドロップの初期条件は、たとえば、結晶生成部４０における沈殿剤濃度が、リザーバ３０における沈殿剤濃度の半分である。

すなわち、結晶化プレート観察装置ＯＢ１は、タンパク質の溶液を収容するリザーバ３０とタンパク質の結晶が生成される結晶生成部４０とが設けられているリング体１０から成る結晶化プレートＰＬ１において、結晶生成部４０における結晶化の様子を観察する観察装置である。

また、リング体１０には、反射面Ｍ１が設けられている。反射面Ｍ１は、リング体１０において、図２（２）中、結晶生成部４０の下部に設けられている反射面であり、光源５５による図２（２）中の水平の光を、図２（２）中の垂直上方に反射し、結晶生成部４０を照射する。上記上方に向かう光が結晶生成部４０を透過、散乱し、傾斜鏡５１に到達する。つまり、反射面Ｍ１は、光源５５の光が結晶生成部４０を照射し、結晶生成部４０を透過、散乱した光がＣＣＤカメラ５４に到達するように設置されている反射手段であって、リング体１０の内周に形成されている柱状空間に設けられる反射手段である。また、反射面Ｍ１は、全反射手段または鏡面反射手段である。つまり、反射面Ｍ１は、結晶化プレートＰＬ１のリング体１０の柱状空間２０に設けられる光源の光が、結晶生成部４０に達するように、反射する全反射手段または鏡面反射手段である。

さらに、リング体１０の外周の図２中、上部に凹部７１が設けられ、図２中、下部に凸部７２が設けられている。２つ以上の結晶化プレートＰＬ１が互いに重ねられた場合、１つの結晶化プレートＰＬ１の凸部７２とこの上に重ねられている結晶化プレートＰＬ１の凹部７１とが互いに嵌合する。凹部７１、凸部７２については、図６の説明で後述する。なお、図３、図４、図５、図７において、凹部７１、凸部７２の記載を省略して示してある。

次に、結晶化プレート観察装置ＯＢ１の動作について説明する。

まず、超伝導マグネットＭｇ１によって磁場が発生し、この磁気力場に物質が置かれると、その物質の磁化率に依存して磁気力が作用し、この磁気力が重力と釣り合うようにすると擬似微小重力状態を発生する。

結晶化プレートＰＬ１の結晶生成部４０とリザーバ３０とが密閉され、結晶生成部４０に設けられた結晶化ドロップ（タンパク質溶液と沈殿剤溶液との混合液）内の水が、蒸発し、リザーバ３０に設けられている沈殿剤濃度の高い外液へ移動する。したがって、結晶生成部４０に設けられた結晶化ドロップ内のタンパク質溶液濃度と沈殿剤濃度とが上昇し、過飽和タンパク質溶液において、結晶成長の核となる微結晶が形成される。そして、沈殿剤濃度が適切な範囲であれば、タンパク質の結晶が生成される。また、実施例１では、擬似微小重力状態でタンパク質の結晶化が行われるので、タンパク質の結晶化においてタンパク質溶液の濃度勾配が発生しても、タンパク質溶液に自然対流が発生せず、自然対流による結晶の質の低下が生じない。

そして、結晶化プレートＰＬ１を観察する場合、まず、強磁場に結晶化プレートＰＬ１を置き、結晶化プレートＰＬ１の柱状空間２０に、観察系５０を設置する。光源５５からの光が、反射面Ｍ１で反射し、結晶生成部４０を透過、散乱し、傾斜鏡５１で反射し、対物レンズ５２によって平行光となり、チューブレンズ５３によってＣＣＤカメラ５４の受光面に結像する。この場合、結晶化プレートＰＬ１が強磁場に設置されているので、タンパク質が微小重力下で結晶し、この結晶化の過程を観察することができる。

つまり、環状構造を有する結晶化プレートＰＬ１の軸部に観察系（顕微鏡光学系）５０が配置されるので、超強磁場環境下でのその場観察が可能である。そして、光源５５からの照明光を、結晶化プレートＰＬ１内で全反射または鏡面反射させるので、結晶生成部（ドロップウェル）４０を透過方向あるいは側方から照明することになり、コントラストを向上させることができる。

擬似微小重力状態下では、分子の移動は拡散によって起こるので、結晶成長は遅いが不純物が取り込まれ難い。また、擬似微小重力状態下では、タンパク質同士の衝突が起こり難いので、生成される結晶核の数が少なく、生成された結晶核は大きくなり易い。また、擬似微小重力状態下では、上記のように、タンパク質の供給が遅いので、誤った配向で結晶表面に付着したタンパク質が、再配向し易く、タンパク質の分子配列の乱れが少ない。つまり、実施例１によれば、重力場に曝されることによる品質劣化を阻止することができる。

過飽和タンパク質溶液中から蒸気拡散等によって水を除去することによって、タンパク質結晶を析出させる。結晶中の規則正しく配列したタンパク質分子層によって、Ｘ線が回折し、結晶の性質を反映した回折斑点として観測される。つまり、溶液中に不純物が取り込まれたり、分子配列が乱れることによって、結晶が不均一になると、Ｘ線回折能が低下し、あいまいな立体構造しか得られないが、実施例１によれば、分子配列が乱れることがないので、結晶品質を向上させることができ、したがって、タンパク質の精密な構造情報を得ることができる。

実施例１によれば、強磁場内で結晶化プレートにおいてタンパク質を結晶化する場合、リング体の柱状空間に観察装置を挿入することができ、これによって、結晶化プレートを強磁場から取り出さずに、タンパク質の結晶化を観察することができ、つまり、タンパク質が結晶化する過程を観察することができる。

また、従来例では、結晶化プレートを取り出すためには、溶液に作用する磁気力が空間的に変化する中を、結晶化プレートを取り出したり戻したりする作業によって、溶液中に流れが生じ、結晶成長が乱される。しかし、実施例１によれば、結晶化の過程で結晶化プレートを取り出す必要がないので、結晶化プレートを取り出したり戻したりする作業がなく、結晶化プレートを移動することによる溶液中の流れが生じず、結晶成長が乱されることがない。

また、実施例１によれば、磁気力によって擬似微小重力状態を発生させる場合、実験機会を豊富に得ることができ、つまり、実験サイクルが迅速化され、必要なときに観察することができる。また、実験条件をカスタマイズすることができ、つまり、結晶化温度、実験期間、結晶化方法、結晶化プレートの形状を任意に選択することができる。また、重力が与える影響を検討することができる。

なお、光源５５とは別の方向から光を照射する光源５６を設けると、この光源５６からの光が結晶生成部４０およびその周辺に到達し、結晶生成部４０を透過、散乱する光の量が多くなる。

さらに、実施例１によれば、創薬分野において、対象とするタンパク質の立体構造を１Å台の分解能で精密に決定することができ、その有用度は飛躍的に向上する。疾患関連タンパク質の立体構造を高精度に決定することができ、立体構造に基づくドラッグデザインが可能になり、創薬プロセスの大幅な迅速化が期待される。また、有用タンパク質の立体構造に基づいて酵素機能の改変（安定性、反応特異性、反応速度の向上等）を行えば、高機能なタンパク質の創薬が可能になり、低コストで、環境に対して低負荷・高効率・省スペースの工業プロセスを構築することができる。

なお、実施例１において、リング体１０に施されたミラーコーティング、大きな屈折率を具備する透過部材と小さな屈折率を具備する透過部材とによって全反射を起こさせる手段を、反射面Ｍ１として使用するようにしてもよい。

なお、上記実施例において、柱状空間２０に余裕があれば、傾斜鏡５１を複数、設けるようにしてもよい。このようにすることによって、観察系５０を周方向に回転する必要はない。

さらに、実施例１において、段差３１、３２が設けられ、この段差３１、３２によってリザーバ３０の面積が増加し、この増加した面積の分、擬似微小重力状態において水溶液の上昇を抑制することができる。

図３は、本発明の実施例２である結晶化プレートＰＬ２を示すブロック図である。

図３（１）は、結晶化プレートＰＬ２を示す平面図であり、図３（２）は、図３（１）におけるＩＩＩ‐ＩＩＩ断面を示す図である。

結晶化プレートＰＬ２は、結晶化プレートＰＬ１において、結晶生成部４０の代わりに、結晶生成部４１を設けた実施例である。結晶生成部４１は、結晶生成部４１の内周１１側の段差（図２（２）に示す段差４０ｓ）を無くした実施例である。

結晶生成部４０の内周側の段差４０ｓ（図２（２）参照）が存在すると、結晶化溶液（タンパク質＋沈殿剤）の液滴側面（内周１１側）に平らではない領域が形成される。特に、液滴中で空気との界面近傍で結晶が生成した場合、光学系による観察の妨げになる可能性がある。そこで、図３（２）に示すように、結晶生成部４０において内周１１側だけでもフラットにし、つまり、段差４０ｓを除去してある。

図４は、本発明の実施例３である結晶化プレートＰＬ３を示すブロック図である。

図４（１）は、結晶化プレートＰＬ３を示す平面図であり、図４（２）は、図４（１）におけるＩＶ‐ＩＶ断面と観察系５０とを示す図である。

結晶化プレートＰＬ３は、結晶化プレートＰＬ２において、反射面Ｍ１の代わりに、反射面Ｍ２が設けられている実施例である。反射面Ｍ２は、光源５５からの光が結晶生成部４１を透過、散乱した光を、傾斜鏡５１に反射するミラーである。そして、２つの結晶化プレートＰＬ２が重ねられ、図４（２）中、下の結晶化プレートＰＬ２の結晶生成部４１を透過、散乱した光が、上の結晶化プレートＰＬ２に設けられている反射面Ｍ２で反射し、傾斜鏡５１に向かう。

なお、図４（２）に示す結晶化プレートＰＬ３は、シッティングドロップ法によってタンパク質を結晶化するプレートである。

図４（３）は、結晶化プレートＰＬ３ａを示し、プレートＰＬ３ａは、ハンギングドロップ法によってタンパク質を結晶化するプレートである。

ある結晶化プレートＰＬ３ａ（この場合、図４（３）に示す２つの結晶化プレートＰＬ３ａのうちの図中、上に設けられている結晶化プレート）に設けられている反射面Ｍ２は、上記ある結晶化プレートＰＬ３ａの下にセットされている結晶化プレートＰＬ３ａの結晶生成部４１からの光を上記ある結晶化プレートＰＬ３ａの柱状空間２０に反射する手段である。

結晶化プレートＰＬ３ａは、ドロップの側面から、光学系で観察するのではなく、ドロップを上から観察できるので、ドロップウェル（結晶生成部４０）が円形であっても観察に支障がないことが重要である。また、Ｘ線回折実験のために結晶を取り出す際に、ドロップウェルが円形である方が有利である点も意味がある。

なお、結晶化プレートＰＬ３ａにおけるドロップを上から観察できる点は、結晶化プレートＰＬ３においても同様である。つまり、下にセットされている結晶化プレートＰＬ３の結晶生成部４１からの光を、上にセットされている結晶化プレートＰＬ３の柱状空間２０に反射するために、反射面Ｍ２が設けられている。

図４（３）において、観察系５０を、目のマークで代用して示してある。

つまり、結晶化プレートＰＬ３、ＰＬ３ａにおける反射面Ｍ２は、結晶化プレートのリング体の柱状空間に設けられる光源の光が、結晶生成部に達し、結晶生成部からの光を全反射する全反射手段または、結晶生成部からの光を鏡面反射する鏡面反射手段であり、１つの結晶化プレートに設けられている結晶生成部からの光を観察系に反射させるミラーであって、別の結晶化プレートに設けられているミラーである。

反射面Ｍ２による鏡面反射手段によって、ハンギングドロップ法に対応するためには、結晶化プレートＰＬ３ａを密閉するシール（カバー）を変更すればよい。つまり、ハンギングドロップ法に適した素材のシール（市販されているシール）を、実施例の結晶化プレート群に適した形に切り出し、使用することによって、密閉するシール（カバー）を変更すれば、ハンギングドロップ法を実現することができる。

また、結晶化プレートＰＬ３ａは、密閉用シールＳＬの接着面側（図４（３）中、下側）にリング状の突起４２ｂを有する。突起４２ｂは、図４（３）において、結晶化ドロップ４２ａの左右に描かれている矩形の構造を有し、図４（３）は断面図であるので、突起４２ｂは、２つの突起として描かれているが、実際には、リング状である。突起４２ｂは、結晶化ドロップ４２ａを囲い込むように設置されている。突起４２ｂを設けることによって、ハンギングドロップ法において、柱状空間２０から観察し易い位置に結晶化ドロップ４２ａを保持することができる。図４（４）は、突起４２ｂの周辺の拡大図である。

つまり、結晶化プレートＰＬ３ａは、ハンギングドロップ法において、密閉用シールＳＬの接着面側に設けられる結晶化ドロップ４２ａを囲むように形成されているリング状の突起４２ｂを有する。

なお、リング状の突起４２ｂは、擬似微小重力状態でタンパク質等を結晶化する場合に限らず、擬似微小重力状態以外の状態、たとえば通常の重力状態でタンパク質等を結晶化する場合にも有効である。

図５は、本発明の実施例４である結晶化プレートＰＬ４を示すブロック図である。

図５（１）は、結晶化プレートＰＬ４を示す平面図であり、図５（２）は、図５（１）におけるＶ‐Ｖ断面と観察系５０とを示す図である。

結晶化プレートＰＬ４は、結晶化プレートＰＬ１において、リザーバ３０と結晶生成部４０とを組とし、この組が複数、設けられ、上記複数の組のうちの１つの組と他の組との間に、気体流路６０が設けられている実施例である。

超伝導マグネットＭｇ１のマグネットボア（マグネットＭｇ１の中心空洞部）に、少なくとも１つの結晶化プレートＰＬ４を配置した場合、マグネットボア中で、気体流路６０を介して空気等を流すことができ、この空気の温度を調節することによって、結晶化プレートＰＬ４を温度調節することができる。つまり、温度制御しない場合、超伝導マグネットＭｇ１の内部に液体ヘリウム等が設けられ、超伝導マグネットＭｇ１が冷却されているので、僅かではあるが結晶化プレートが冷却され、これによって、結晶化プレートの環境温度が設定温度以下になる場合には、適温を維持することができない。また、他の要因によって結晶化プレートの環境温度が設定温度以外の温度になる場合には、適温を維持することができない。

しかし、結晶化プレートＰＬ４によれば、気体流路６０に流す気体の温度を制御することによって、結晶化プレートＰＬ４を適温に維持することができる。

なお、結晶化プレートにおける気体流路６０の位置は任意であり、また、気体流路６０の個数も任意である。

また、上記実施例において、実際は、気体流路６０がなくても温調は可能であるが、気体流路６０を設ければ、より確実に温調が可能になることが期待される。

図６は、結晶化プレートＰＬ２における嵌合構造を示す図である。

図６（１）は、図３（１）に示す結晶化プレートＰＬ２におけるＶＩ−ＶＩ断面を示す図であり、図６（２）は、結晶化プレートＰＬ２の一部を示す斜視図である。

結晶化プレートＰＬ２における嵌合構造は、図６（１）中、結晶化プレートＰＬ２の上面の一部に設けられている凹部７１と、図６（１）中、結晶化プレートＰＬ２の下面の一部に設けられている凸部７２とによって構成されている。また、２つの結晶化プレートＰＬ２を重ねると、下の結晶化プレートＰＬ２の凹部７１と、上の結晶化プレートＰＬ２の凸部７２とが嵌合し、下の結晶化プレートＰＬ２の上面と上の結晶化プレートＰＬ２の下面とが密着する。また、２つの結晶化プレートＰＬ２を重ね、下の結晶化プレートＰＬ２の凹部７１と、上の結晶化プレートＰＬ２の凸部７２とが嵌合した場合、下の結晶化プレートＰＬ２のリザーバ３０と上の結晶化プレートＰＬ２のリザーバ３０とが、結晶化プレートＰＬ２の周方向で一致し、また、下の結晶化プレートＰＬ２の結晶生成部４０と上の結晶化プレートＰＬ２の結晶生成部４０とが、結晶化プレートＰＬ２の周方向で一致するように、凹部７１と凸部７２とが設けられている。

つまり、上記凹部７１、凸部７２は、結晶化プレートの上下面に設けられている嵌合構造であり、また、結晶化プレートの周方向に設けられている位置決め手段である。

上記のように、結晶化プレートの上下面を嵌合構造にすることによって、結晶化プレートを複数、積層した場合、上下の結晶化プレート同士の間隔を均一に維持することができる。また、上記のように、結晶化プレートの上下面を嵌合構造にする（結晶化プレートの周方向に位置決め手段を設ける）ことによって、各結晶生成部の位置を周方向で一致させることができ、これによって、結晶化プレートにおける周方向の座標情報を保存することができる。

リング体１０の外周１２を等間隔に１２分割した位置のうち、１箇所を除いた１１箇所に凹凸を設けることにより、積層したプレート間で周方向の座標情報が完全に一致する。つまり、結晶化プレートを積層した場合、下段の結晶化プレートの１つ目の室の上には、上段の結晶化プレートの１つ目の室が必ず配置される。すなわち、結晶化プレートの外周１２の複数箇所のうちの少なくとも１箇所に、凹凸（嵌合構造）を非対称的に配置することによって、積層したプレート間で周方向の座標情報が完全に一致する。

なお、上記とは逆に、結晶化プレートＰＬ２の上部に凸部７２を設け、結晶化プレートＰＬ２の下部に凹部７１を設けるようにしてもよい。また、凹部７１、凸部７２の断面が、図６に示す実施例では、四角形であるが、四角形の代わりに、三角形、半円形等、他の形状を使用するようにしてもよい。

つまり、上記嵌合手段は、１つの上記結晶化プレートの所定の一面に設けられている第１の嵌合手段と、上記１つの結晶化プレートの他面に設けられている第２の嵌合手段とを有し、上記第１の嵌合手段と上記第２の嵌合手段とが互いに嵌合する手段である。

さらに、結晶化プレートＰＬ２における嵌合構造を、結晶化プレートＰＬ１、ＰＬ３、ＰＬ４に設けるようにしてもよい。

実施例１〜実施例４において、リング体１０の外周１２に、ＥＬ等のような面光源を設けるようにしてもよい。リング体１０の外周１２に面光源を設ける場合、柱状空間２０に光源５５を設けなくてもよい。

結晶生成部をリング体の内周側に配置すれば、外周側に配置した場合よりも、分解能、コントラストが相当量向上する。

図７は、本発明の実施例６である結晶化プレートＰＬ５を示すブロック図である。

結晶化プレートＰＬ５は、結晶化プレートＰＬ１において、リザーバ３０と結晶生成部４０との配置を入れ替えた実施例である。また、結晶化プレートＰＬ５は、リング体１０の外周に面光源５７が設けられている。

結晶化プレートＰＬ５の柱状空間２０に観察系５０を設けると、面光源５７からの光が結晶生成部４０で透過、散乱し、この光が傾斜鏡５１で反射し、ＣＣＤカメラ５４に送られ、ＣＣＤカメラ５４が、結晶生成部４０における結晶化の過程の画像を電気信号に変換し、出力する。これによって、結晶化プレートＰＬ５を強磁場から取り出さずに結晶化する過程を確実に観察することができる。

実施例６において、外周１２に結晶生成部４０が設けられているが、この場合でも、リザーバ３０内の溶液の液面よりも、結晶生成部４０の下部が高ければ、結成生成過程を観察することができ、光学系観測に支障がない。

なお、上記各実施例では、リング体１０は、その外径が円形である円形環状体であるが、外形が四角形、五角形、六角形等の環状体である角形環状体であってもよい。

つまり、上記各実施例において、結晶化プレートＰＬ１等の結晶化プレートを強磁場に置き、上記結晶化プレートの柱状空間２０に、観察系５０を設置する。上記面光源からの光が、結晶生成部４０を通過し、傾斜鏡５１で反射し、対物レンズ５２によってＣＣＤカメラ５４の受光面に結像する。この場合、結晶化プレートが強磁場に設置されているので、微小重力下で結晶し、この結晶化を観察することができる。

このようにすれば、強磁場内で結晶化プレートにおいてタンパク質を結晶化する場合、ＥＬ等の光が結晶生成部４０を透過し、この透過光によって照明された画像を見るので、その画像のコントラストが向上され、したがって、結晶化プレートＰＬ１等を強磁場から取り出さずに結晶化する過程を確実に観察することができる。

なお、面光源５７の代わりに、複数の点光源を設けるようにしてもよい。

また、柱状空間２０における光源５５と、リング体１０の外周１２における面光源（または複数の点光源）とを併用するようにしてもよい。光源５５と外周１２における面光源等とを併用すれば、コントラストをより向上させることができる。

結晶化プレートＰＬ５においても、図５に示す気体流路６０、図６に示す嵌合構造、図６に示す位置決め手段を設けるようにしてもよい。

図８は、本発明の実施例７である結晶化プレートの観察装置における観察系５０を示す図である。

観察系５０は、図１に示すように、傾斜鏡５１と、対物レンズ５２と、チューブレンズ５３と、ＣＣＤカメラ５４とを有する。また、観察系５０には、上記の他に、プッシュロード５６と、アウタースリーブ５７とが設けられている。

プッシュロード５６は、複数の細い糸で構成され、対物レンズ５２のみを、上下方向（結晶化プレートの柱状空間２０の軸方向）に移動するものであり、対物レンズ５２のみを上下に移動することによって、焦点調節を行う。つまり、チューブレンズ５３に細い穴が複数、設けられ、これらの穴に、上記細い糸を挿通し、上記細い糸の図８（１）中、下端に対物レンズ５２が固定されている。上記細い糸の図８（１）中、上端は対物レンズ５２の位置を調整する手段（図示せず）に接続されている。

アウタースリーブ５７は、ＣＣＤカメラ５４、チューブレンズ５３、対物レンズ５２、傾斜鏡５１の全てを固定するチューブであり、観察系５０のＹ軸の位置決め、θ軸の位置決めを行うものである。なお、Ｙ軸は、結晶化プレートの軸方向（柱状空間２０の軸方向）であり、θ軸は、結晶化プレートの周方向である。アウタースリーブ５７を上下に移動する（結晶化プレートの軸方向に移動する）ことによって、Ｙ軸の位置決めを行い、アウタースリーブ５７を回転することによって、θ軸の位置決めを行う。なお、対物レンズ５２とチューブレンズ５３との間は、平行光である。

次に、観察系５０の動作について説明する。

まず、Ｙ軸座標の制御について説明する。Ｙ軸座標を制御する場合、ＣＣＤカメラ５４、チューブレンズ５３、対物レンズ５２、傾斜鏡５１の全てを同時に上下動する。ＣＣＤカメラ５４、チューブレンズ５３、対物レンズ５２、傾斜鏡５１の全てを同時に上下動させるには、アウタースリーブ５７を上下動する。この場合、上下動のストロークは、たとえば１０８ｍｍであり、ステップ移動量は、たとえば２μｍである。

図９は、観察系５０において、観察点がＹ軸方向で異なる場合に、Ｙ軸を位置決めする例を示す図である。この例では、ＣＣＤカメラ５４、チューブレンズ５３、対物レンズ５２、傾斜鏡５１の全てを同時に上下動するのではなく、対物レンズ５２、傾斜鏡５１の２つのみを上下動させる。この場合、対物レンズ５２と傾斜鏡５１との間隔は固定である。

無限遠光学系の倍率ｍは、図９（１）に示すように、ｍ＝ｆ１／ｆ２で定まる。なお、ｆ１は、対物レンズ５２の焦点距離であり、ｆ２は、チューブレンズ５３の焦点距離である。なお、上記無限遠光学系は、結晶生成部４１の結晶（観察点）から対物レンズ５２を経た光線は、対物レンズ５２では結像せずに、無限遠の平行光束としてチューブレンズ５３（結像レンズ）に入り、チューブレンズ５３によって結像する光学系である。つまり、無限遠光学系では、対物レンズ５２とチューブレンズ５３との間の距離を自由に設定することができる。

図９（２）は、図９（１）に示す場合よりも、観察点のＹ軸の位置が図１中、上である場合を示す図である。図９（３）は、図９（１）に示す場合よりも、観察点のＹ軸の位置が図１中、下である場合を示す図である。

図９（１）に示す場合も、図９（２）、（３）に示す場合も、焦点距離ｆ１、ｆ２が同じであるので、無限遠光学系の倍率ｍ＝ｆ１／ｆ２が、図９（１）、（２）、（３）のいずれの場合も互いに同じである。つまり、対物レンズ５２と傾斜鏡５１とを同時に移動してＹ軸位置決めを行った場合、観察点がＹ軸のどの位置であっても、倍率ｍは一定である。

次に、θ制御について説明する。θ制御するには、ＣＣＤカメラ５４、チューブレンズ５３、対物レンズ５２、傾斜鏡５１の全てを同時に回転させて、観察点のθ座標を定める。ＣＣＤカメラ５４、チューブレンズ５３、対物レンズ５２、傾斜鏡５１の全てを同時に回転させるには、アウタースリーブ５７を回転する。この場合、回転量は、たとえば±１８５度であり、ステップ回転量は、たとえば０．０４５度である。

次に、焦点調節について説明する。焦点調節するには、ＣＣＤカメラ５４、チューブレンズ５３、傾斜鏡５１を移動せずに、対物レンズ５２のみを上下動させて、観察点のＺ軸座標を定める。対物レンズ５２のみを上下動させるには、プッシュロード５６を上下させる。なお、Ｚ軸座標は、結晶化プレートの柱状空間２０の中心から放射方向の座標である。焦点調節する場合、対物レンズ５２の移動ストロークは、たとえば１４ｍｍであり、ステップ移動量は、たとえば２μｍである。

図１０は、観察系５０において、観察点がＺ軸方向で異なる場合に、傾斜鏡５１の位置を固定し、対物レンズ５２を移動させることによって焦点調節する例を示す図である。

無限遠光学系の倍率ｍは、図１０（１）に示すように、ｍ＝ｆ１／ｆ２で定まる。

図１０（２）は、図１０（１）に示す場合よりも、観察点が近い場合（観察点が結晶化プレートの中心軸に近い場合）を示す図である。図１０（３）は、図１０（１）に示す場合よりも、観察点が遠い場合（観察点が結晶化プレートの中心軸から遠い場合）を示す図である。

図１０（１）に示す場合も、図１０（２）、（３）に示す場合も、焦点距離ｆ１、ｆ２が同じであるので、無限遠光学系の倍率ｍ＝ｆ１／ｆ２が、図１０（１）、（２）、（３）のいずれの場合も互いに同じである。つまり、傾斜鏡５１の位置を固定し、対物レンズ５２だけ移動すれば、焦点調節でき（Ｚ軸位置決めでき）、この場合、観察点がＺ軸のどの位置であっても、倍率ｍは一定である。すなわち、焦点調節する場合、対物レンズ５２のみを上下動させるので、対物レンズ５２とチューブレンズ５３との間隔が変化するが、対物レンズ５２とチューブレンズ５３との間は平行光が存在する空間であり、この空間の距離は、光学系の倍率ｍ＝ｆ１／ｆ２に影響しない距離である。したがって、傾斜鏡５１の位置を固定し、対物レンズ５２のみを上下動させても、光学系の倍率ｍが変化しない。

つまり、対物レンズ５２とチューブレンズ５３との間の空間における光が平行光であり、これによって、倍率ｍが変化しない。

なお、上記反射手段が上記柱状空間に位置し、上記リング体の内周に形成されている柱状空間で、結像光学系の対物レンズを有限遠光学系にするようにしてもよい。上記有限遠光学系は、結晶生成部４１の結晶（観察点）から対物レンズ５２を経た光線が、対物レンズ５２単体で結像する光学系である。

上記各実施例によって、タンパク質結晶を生成させることにより、食品産業利用上有用なタンパク質、疾患関連タンパク質・膜タンパク質、環境産業利用上有用なタンパク質などの結晶構造が迅速に取得可能であると期待される。または、上記各実施例によって、タンパク質結晶を生成させることにより、Ｘ線結晶構造解析のボトルネックとなっている結晶化に費やす時間を減少させることができると期待される。さらには、上記各実施例によって、一般的なタンパク質結晶化や結晶構造解析分野全体への貢献が期待される。

上記各実施例は、タンパク質の結晶化プレートであるが、結晶化する対象はタンパク質に限定されるものではない。つまり、タンパク質以外の有機物について、上記実施例を用いて結晶化するようにしてもよく、また、無機物について、上記実施例を用いて結晶化するようにしてもよい。

ＯＢ１…結晶化プレートの観察装置、
ＰＬ１、ＰＬ２、ＰＬ３、ＰＬ３ａ、ＰＬ４、ＰＬ５…結晶化プレート、
１０…リング体、
２０…柱状空間、
３０…リザーバ、
４０…結晶生成部、
５０…観察系、
５１…反射鏡、
５５…光源、
Ｍ１、Ｍ２…反射面。

Claims (8)

1. 柱状空間を具備するリング体と；
   タンパク質の結晶化に必要な沈殿剤を収容し、上記リング体に設けられているリザーバと；
   タンパク質の結晶が生成される部位であり、上記リング体に設けられている結晶生成部と；
   を有することを特徴とする結晶化プレート。
2. 請求項１において、
   上記リザーバが上記リング体の内周近傍に設けられ、上記結晶生成部が上記リング体の外周近傍に設けられていることを特徴とする結晶化プレート。
3. 請求項１において、
   上記リザーバが上記リング体の外周近傍に設けられ、上記結晶生成部が上記リング体の内周近傍に設けられていることを特徴とする結晶化プレート。
4. 請求項１において、
   上記リザーバと上記結晶生成部とが、ほぼ同一円周上に設けられていることを特徴とする結晶化プレート。
5. 請求項１において、
   上記リング体は、円形環状体または角形環状体であることを特徴とする結晶化プレート。
6. 請求項１において、
   上記リザーバと上記結晶生成部とを組とし、上記組が複数、設けられ、上記複数の組のうちの１つの組と他の組との間に気体流路が設けられていることを特徴とする結晶化プレート。
7. 請求項１において、
   １つの上記結晶化プレートの所定の一面に設けられている第１の嵌合手段と；
   上記１つの結晶化プレートの他面に設けられている第２の嵌合手段と；
   を有し、上記１つの上記結晶化プレートに設けられている第１の嵌合手段と上記１つの上記結晶化プレート以外の結晶化プレートに設けられている上記第２の嵌合手段とが互いに嵌合することを特徴とする結晶化プレート。
8. 請求項１において、
   上記結晶化プレートの周方向に位置決め手段が設けられていることを特徴とする結晶化プレート。

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