JP2011206049A - Necrosis marker and use thereof - Google Patents

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Tsuneo Saga
Sumio Sugano
Koji Tsuji
恒夫 佐賀
神▲崎▼ゆかり
純夫 菅野
厚至 辻
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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a biomarker which has high specificity and can effectively be used for detection and diagnosis for various lesions related to various cancer and foci of necrosis.SOLUTION: The invention provides necrosis marker which has amino acid sequence as bellow: (1) amino acid sequence which shows one of 1 to 35 sequence numbers; (2) amino acid sequence of which one or several number of amino acids are substituted, deleted and/or inserted at each of amino acid sequence of (1); or amino acid sequence which has 90% or more, optimally 95% or more, or more optimally 98% or more of homology with each amino acid sequence of (1) and shows same function, activity, or property with each amino acid sequence of (1) as protein.

Description

本発明は、新規な壊死マーカー、該壊死マーカー量を使用する壊死巣を検出する方法、壊死マーカーと特異的に反応する化合物を含む壊死巣を検出するためのキット、該壊死マーカーと特異的に反応する化合物と標識化合物又は治療に有効な化合物から成る、画像診断用組成物又は治療用コンジュゲート、該コンジュゲートを含む、画像診断用キットもしくは医薬組成物、及び、疾患に関連する壊死を検出する壊死マーカーを同定する方法等に関する。 The present invention relates to novel necrosis markers, methods of detecting the necrosis of using 該壊 death marker amount, a kit for detecting necrosis comprising a compound which specifically reacts with necrosis marker, specifically 該壊 death marker comprising a compound and a labeled compound or a compound effective in the treatment of the reaction, the image diagnostic composition or therapeutic conjugate, comprising the conjugate image diagnostic kit or pharmaceutical composition, and, detecting the necrosis associated with disease : a method for identifying the necrosis markers.

一般に壊死巣は、物理的損傷あるいは血液供給の障害、喪失、減少により各種組織の細胞に対する栄養並びに酸素供給が低下した状態で起こる細胞死により起因する。 Generally necrotic foci, physical damage or blood supply failure, loss, nutritional and oxygen supply to the cells of various tissues by decreasing due by cell death that occurs in a state of reduced. 例えば固形癌の場合は、癌腫が大きくなって癌組織全体に栄養供給が行き渡らなくなった結果として壊死巣が生じる。 For example, in the case of solid tumors, necrosis occurs as a result of nutrient supply is no longer spread carcinoma increases with the whole cancer tissue. また、心筋梗塞や脳梗塞についても必ず壊死が起こる。 Also, be sure to necrosis occurs also for myocardial infarction and cerebral infarction. 更に、血流の悪いことから貧栄養、低酸素となる壊死後性肝硬変 (postnecrotic cirrhosis)、壊死性膵炎 (necrotizing pancreatitis)、皮下組織から筋膜にかけて重症となる炎症である壊死性筋膜炎 (necrotizing fasciitis)なども壊死巣をもつ病態である。 Furthermore, poor nutrition since poor blood flow, necrotic after cirrhosis becomes hypoxic (postnecrotic cirrhosis), necrotizing pancreatitis (necrotizing pancreatitis), inflammation in a necrotizing fasciitis which is a severe toward fascia from the subcutaneous tissue ( necrotizing fasciitis) is a condition that also has a necrosis, such as. その他に、動脈硬化性壊疽、糖尿病性壊疽あるいは閉塞性壊疽についても、壊死巣に関連する病変である。 In addition, atherosclerotic gangrene, for the diabetic gangrene or obstructive gangrene is a disease associated with necrosis.

壊死巣は周囲の組織、細胞に悪影響を与えることから、壊死部位の病勢、病巣などを検出・診断したり、その重症となっている病巣部位を見つけだしその部位をターゲットとして治療することができるようになれば、産業上有用である。 Necrosis around the tissue, since it adversely affects the cells, disease progression of necrotic site, etc. or to detect and diagnose lesions, to be able to treat the site find the lesion site on which it is severe as the target Once in, the present invention is industrially useful.

しかし、壊死巣を検出するバイオマーカーに関する先行技術として、リンパ腫細胞系および肺癌細胞系由来の不溶性細胞内抗原として選択した3種の抗体(特許文献1)、可溶性核マトリックス蛋白に対する抗体(特許文献2)、あるいは腫瘍の壊死中心として同定された核抽出物およびヒストンH1に特異的結合する抗体あるいは低分子抗体(特許文献3)などに限られている。 However, the prior art relates to biomarkers for detecting the necrosis, three antibodies were selected as insoluble intracellular antigens from lymphoma cell lines and lung cancer cell lines (Patent Document 1), antibodies to soluble nuclear matrix protein (Patent Documents 2 ), or nuclear extracts was identified as necrotic core of the tumor and the antibody or low-molecular antibody that specifically binds to a histone H1 (Patent Document 3) is limited to such. 心臓血管関連の壊死も含む悪性度診断用マーカーとして炎症性マーカー(CRP,TNF,IL-1,-6 他)が知られている。 Inflammatory markers as malignancy diagnostic markers also include cardiovascular-related necrosis (CRP, TNF, IL-1, -6, etc.) are known. 心筋ストレスマーカーとしてBNPも使用されている。 BNP has also been used as a myocardial stress marker.

又、癌のバイオマーカーとしては、例えば、すい臓がん及び肺腺癌のバイオマーカーとしてPeroxiredoxin 4(非特許文献1及び2)、及び、大腸がんのバイオマーカーとしてAnnexin A2(特許文献4)が知られている。 As the biomarkers of cancer, for example, Peroxiredoxin 4 as a biomarker for pancreatic cancer and lung adenocarcinoma (non-patent documents 1 and 2), and, as a biomarker for colorectal cancer Annexin A2 (Patent Document 4) Are known. 更に、壊死細胞の細胞核から放出されるHMGB1に対する特異的単クロー ン抗体の治療への開発も進行中である。 Furthermore, the development of the treatment of specific single clone antibody against HMGB1 released from necrotic cells in the cell nucleus is in progress.

特許第2733658号明細書 Pat. No. 2733658 特許第3190042号明細書 Pat. No. 3190042 特表2002-519065号公報 JP-T 2002-519065 JP 特開2008-14937号公報 JP 2008-14937 JP

しかしながら、各種の癌及び壊死巣に関連する様々な病変の検出・診断において、特異性が高く有効に使用できるようなバイオマーカーは未だ得られていない。 However, in the detection and diagnosis of various pathologies associated with various cancers and necrosis, biomarkers such as highly specific be effectively used has not yet been obtained.

本発明者は壊死巣が栄養並びに酸素供給が低下した状態で起こることに着目し、壊死巣に特徴的なタンパク質あるいはその断片を、低栄養、低酸素、高密度および足場非依存的な条件下で培養したヒト細胞から、蛍光標識二次元ディファレンスゲル電気泳動(2D-DIGE)、質量分析計(MS)、N-末端アミノ酸分析法を用いた疾患プロテオミクス手法を用いて、上記のような汎用性を有する壊死マーカーとしての機能を有する、9種類の遺伝子の発現産物であるタンパク質又はその断片を同定することに成功し、本発明を完成した。 The present inventor has focused on what happens in the state in which necrosis nutrition and oxygen supply is reduced, the characteristic protein or fragment thereof to necrotic foci, malnutrition, hypoxia, high density and anchorage-independent conditions from in cultured human cells, fluorescently labeled two-dimensional Difference gel electrophoresis (2D-DIGE), mass spectrometer (MS), using a disease proteomics technique using N- terminal amino acid analysis, general purpose, such as the functions as necrosis markers with sex, succeeded in identifying the protein or fragment thereof is an expression product of the nine genes, and have completed the present invention.

更に、上記タンパク質に対する抗体が乳癌と肺癌の病巣標本の切片における壊死巣を特異的に認識し、染め分けることが出来ることが確認された。 Furthermore, antibodies to the protein can specifically recognize necrotic foci in the sections of the lesion specimens of breast and lung cancer, dye in different colors it was confirmed possible. 更に、アイソトープ標識した該抗体が癌細胞を移植したヌードマウスの担癌部分の壊死叢周囲を特異的に認識し、イメージング可能であることが今回初めて示された。 Furthermore, isotope-labeled antibody is specifically recognizes necrosis flora surrounding tumor-bearing portion of the nude mice transplanted with cancer cells, it is possible imaging showed for the first time.

即ち、本発明は以下の各態様に係るものである。 That is, the present invention according to the following aspects.
[態様1]以下の9つの群に含まれるいずれか一つのアミノ酸配列をコードする遺伝子の発現産物又は該発現産物に対する自己抗体から成る、壊死マーカー: [Aspect 1] consisting of autoantibodies against the expression product or said expression product of the gene encoding any one of the amino acid sequence contained in the following nine groups, necrosis markers:
(1)配列番号1で示されるアミノ酸配列、又は、該アミノ酸配列において一個又は数個のアミノ酸が置換、欠失及び/又は挿入されたアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、該アミノ酸配列とタンパク質としての同一の機能、活性、又は性質を示すアミノ酸配列; (1) amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, or, having one or several amino acids are substituted, deleted and / or inserted amino acid sequence or the amino acid sequence and 90% homology in the amino acid sequence an amino acid sequence, the same function as the amino acid sequence and protein, amino acid sequence shown activity or properties;
(2)配列番号2〜4のいずれかで示されるアミノ酸配列、又は、各アミノ酸配列において一個又は数個のアミノ酸が置換、欠失及び/又は挿入されたアミノ酸配列若しくは各アミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、各アミノ酸配列とタンパク質としての同一の機能、活性、又は性質を示すアミノ酸配列; (2) the amino acid sequence as shown in any of SEQ ID NO: 2-4, or, one or several amino acids in the amino acid sequence substitutions, deletions and / or insertions in the amino acid sequence or the amino acid sequence at least 90% an amino acid sequence having a homology, identical function as the amino acid sequence and protein, activity or the amino acid sequence indicate the nature;
(3)配列番号5〜9のいずれかで示されるアミノ酸配列、又は、各アミノ酸配列において一個又は数個のアミノ酸が置換、欠失及び/又は挿入されたアミノ酸配列若しくは各アミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、各アミノ酸配列とタンパク質としての同一の機能、活性、又は性質を示すアミノ酸配列; (3) amino acid sequence shown in any of SEQ ID NO: 5-9, or, one or several amino acids in the amino acid sequence substitutions, deletions and / or insertions in the amino acid sequence or the amino acid sequence at least 90% an amino acid sequence having a homology, identical function as the amino acid sequence and protein, activity or the amino acid sequence indicate the nature;
(4)配列番号10〜15のいずれかで示されるアミノ酸配列、又は、各アミノ酸配列において一個又は数個のアミノ酸が置換、欠失及び/又は挿入されたアミノ酸配列若しくは各アミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、各アミノ酸配列とタンパク質としての同一の機能、活性、又は性質を示すアミノ酸配列; (4) the amino acid sequence as shown in any of SEQ ID NO: 10-15, or one or several amino acids in the amino acid sequence substitutions, deletions and / or insertions in the amino acid sequence or the amino acid sequence at least 90% an amino acid sequence having a homology, identical function as the amino acid sequence and protein, activity or the amino acid sequence indicate the nature;
(5)配列番号16〜18のいずれかで示されるアミノ酸配列、又は、各アミノ酸配列において一個又は数個のアミノ酸が置換、欠失及び/又は挿入されたアミノ酸配列若しくは各アミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、各アミノ酸配列とタンパク質としての同一の機能、活性、又は性質を示すアミノ酸配列; (5) the amino acid sequence as shown in any of SEQ ID NO: 16-18, or one or several amino acids in the amino acid sequence substitutions, deletions and / or insertions in the amino acid sequence or the amino acid sequence at least 90% an amino acid sequence having a homology, identical function as the amino acid sequence and protein, activity or the amino acid sequence indicate the nature;
(6)配列番号19〜22のいずれかで示されるアミノ酸配列、又は、各アミノ酸配列において一個又は数個のアミノ酸が置換、欠失及び/又は挿入されたアミノ酸配列若しくは各アミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、各アミノ酸配列とタンパク質としての同一の機能、活性、又は性質を示すアミノ酸配列; (6) the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NO: 19-22, or one or several amino acids in the amino acid sequence substitutions, deletions and / or insertions in the amino acid sequence or the amino acid sequence at least 90% an amino acid sequence having a homology, identical function as the amino acid sequence and protein, activity or the amino acid sequence indicate the nature;
(7)配列番号23〜26のいずれかで示されるアミノ酸配列、又は、各アミノ酸配列において一個又は数個のアミノ酸が置換、欠失及び/又は挿入されたアミノ酸配列若しくは各アミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、各アミノ酸配列とタンパク質としての同一の機能、活性、又は性質を示すアミノ酸配列; (7) amino acid sequence shown in any of SEQ ID NO: 23-26, or one or several amino acids in the amino acid sequence substitutions, deletions and / or insertions in the amino acid sequence or the amino acid sequence at least 90% an amino acid sequence having a homology, identical function as the amino acid sequence and protein, activity or the amino acid sequence indicate the nature;
(8)配列番号27〜29のいずれかで示されるアミノ酸配列、又は、各アミノ酸配列において一個又は数個のアミノ酸が置換、欠失及び/又は挿入されたアミノ酸配列若しくは各アミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、各アミノ酸配列とタンパク質としての同一の機能、活性、又は性質を示すアミノ酸配列; (8) the amino acid sequence as shown in any of SEQ ID NO: 27-29, or one or several amino acids in the amino acid sequence substitutions, deletions and / or insertions in the amino acid sequence or the amino acid sequence at least 90% an amino acid sequence having a homology, identical function as the amino acid sequence and protein, activity or the amino acid sequence indicate the nature;
(9)配列番号30〜35のいずれかで示されるアミノ酸配列、又は、各アミノ酸配列において一個又は数個のアミノ酸が置換、欠失及び/又は挿入されたアミノ酸配列若しくは各アミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、各アミノ酸配列とタンパク質としての同一の機能、活性、又は性質を示すアミノ酸配列。 (9) the amino acid sequence as shown in any of SEQ ID NO: 30-35, or one or several amino acids in the amino acid sequence substitutions, deletions and / or insertions in the amino acid sequence or the amino acid sequence at least 90% an amino acid sequence having a homology, identical function as the amino acid sequence and protein, activity or amino acid sequence that indicates the nature.
[態様2]遺伝子の発現産物が、該遺伝子のmRNA,cDNA,若しくは、それらの部分塩基配列を含む核酸分子、又は、該遺伝子がコードするタンパク質又はその部分ポリペプチドである、態様1記載の壊死マーカー。 [Aspect 2] gene expression products, mRNA of the gene, cDNA, or nucleic acid molecules including their partial nucleotide sequence, or a protein or its partial polypeptide said gene encodes necrosis aspect 1, wherein marker.
[態様3]配列番号1、又は、配列番号2〜4のいずれか一つで示されるアミノ酸配列を有するタンパク質の部分ポリペプチドから成る、態様1又は2記載の壊死マーカー。 [Aspect 3] SEQ ID NO: 1, or consists of partial polypeptide of a protein having an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NO: 2-4, embodiment 1 or 2 necrosis markers described.
[態様4]態様1ないし3のいずれか一項に記載の壊死マーカーから選択された一つ又はそれらの任意の組み合わせから成る壊死マーカーの量を測定することにより、壊死巣を検出する方法。 [Aspect 4] by measuring the amount of necrosis markers consisting of one or any combination thereof selected from necrosis marker according to any one of Aspects 1 to 3, a method of detecting a necrosis.
[態様5](1)試料中に含まれる態様1ないし3のいずれか一項に記載の壊死マーカーから選択された一つ又はそれらの任意の組み合わせから成る壊死マーカーの濃度を測定し、その測定値が正常レベルよりも上昇していることを指標として壊死巣を検出する、態様4記載の方法。 [Embodiment 5] (1) measuring the concentration of necrosis markers consisting of one or any combination thereof selected from necrosis marker according to any one of modes 1 to 3 contained in a sample, the measurement detecting the necrosis as an indication that the value is higher than the normal level, aspect 4 the method according.
[態様6]配列番号1〜35のいずれか一つで示されるアミノ酸配列を有するタンパク質又はその部分ポリペプチドに対する抗体を用いて、該タンパク質又はその部分ポリペプチドの量を測定することを特徴とする、態様4又は5記載の方法。 Using an antibody against the protein or its partial polypeptide having the amino acid sequence represented by any one of the embodiments 6] SEQ ID NO: 1-35, and measuring the amount of the protein or its partial polypeptide , aspect 4 or 5 method described.
[態様7]各遺伝子の発現産物であるタンパク質又はその部分ポリペプチドを抗原として用いて、該発現産物に対する自己抗体から成る壊死マーカーの量を測定する、態様4又は5記載の方法。 [Aspect 7] using the protein or its partial polypeptide is an expression product of each gene as an antigen, determining the amount of necrosis markers consisting of autoantibodies to the expression product, aspect 4 or 5 method described.
[態様8]試料として全血又は血清を使用する、態様4ないし7のいずれか一項に記載の方法。 [Aspect 8] using whole blood or serum as a sample, aspects 4-7 The method according to any one of.
[態様9]壊死巣が、各種固形癌、心筋梗塞、脳梗塞、壊死後性肝硬変 (postnecrotic cirrhosis)、壊死性膵炎 (necrotizing pancreatitis)、壊死性筋膜炎 (necrotizing fasciitis)、動脈硬化性壊疽、糖尿病性壊疽、又は、閉塞性壊疽に関連することを特徴とする、態様4ないし8のいずれか一項に記載の方法。 [Embodiment 9] necrotic foci, various solid tumors, myocardial infarction, cerebral infarction, necrosis after cirrhosis (postnecrotic cirrhosis), necrotizing pancreatitis (necrotizing pancreatitis), necrotizing fasciitis (necrotizing fasciitis), atherosclerotic gangrene, diabetic gangrene, or, characterized in that associated with obstructive gangrene the method according to any one of aspects 4-8.
[態様10]態様4ないし8のいずれか一項に記載の方法に用いる検出キットであって、態様1ないし3のいずれか一項に記載の壊死マーカーと特異的に反応する化合物を含む該キット。 A detection kit used in the method according to any one of [embodiment 10] Embodiment 4 to 8, modes 1 to the kit including necrosis markers specifically reactive compound according to any one of 3 .
[態様11]特異的に反応する化合物が抗体である、態様10記載のキット。 [Aspect 11] specifically compounds which react is an antibody, aspects 10 kit according.
[態様12]態様1ないし4のいずれか一項に記載の壊死マーカーと特異的に反応する化合物と標識化合物又は治療に有効な化合物から成る、画像診断用又は治療用コンジュゲート。 [Embodiment 12] In embodiment 1 to consist of a compound effective to necrosis markers specifically reactive compound and a labeled compound or treatment according to any one of 4, an image diagnostic or therapeutic conjugate.
[態様13]態様12に記載のコンジュゲートを活性成分として含む、画像診断用キット又は医薬組成物。 [Aspect 13] comprising a conjugate according to embodiment 12 as an active ingredient, image diagnostic kit or pharmaceutical composition.
[態様14] [Aspect 14]
疾患に関連する壊死を検出する壊死マーカーを同定する方法であって、ヒト細胞を低栄養、低酸素、高密度および足場非依存的な条件下の培養で誘導して得られる壊死細胞が発現するタンパク質と、通常の培養条件で培養した同細胞が発現するタンパク質とを比較して、該壊死細胞においてより高濃度で存在するタンパク質あるいはその断片を該壊死マーカー選択することを特徴とした前記方法。 A method of identifying a necrosis marker for detecting a necrosis associated with a disease, a human cell malnutrition, hypoxia, necrosis cells obtained by inducing a high density and scaffold-independent conditions culture expressing and protein, by comparing the protein the cells cultured to express under normal culture conditions, the method characterized by 該壊 death marker selecting proteins or fragments thereof present in higher concentration in 該壊 dead cells.

試料において本発明の壊死マーカー量を測定することによって、各種固形癌、心筋梗塞又は脳梗塞の壊死巣(組織)のみならず、壊死後性肝硬変、壊死性膵炎、壊死性筋膜炎等の壊死巣、更に、動脈硬化性壊疽、糖尿病性壊疽あるいは閉塞性壊疽における壊死巣となる部位を検出することが可能となる。 By measuring the necrosis markers of the present invention in a sample, various solid tumors, not only necrosis of myocardial infarction or cerebral infarction (tissue), necrosis after cirrhosis, necrotizing pancreatitis, necrosis, such as necrotizing fasciitis nest, further, it is possible to detect the site of the necrotic foci in atherosclerotic gangrene, diabetic gangrene or obstructive gangrene.

又、本発明の壊死マーカーであるタンパク質あるいはその断片に対する抗体は、乳癌と肺癌の病巣標本の切片における壊死巣を染め分けることが出来ることが確認され、これらはヒトの乳癌及び肺癌の壊死巣組織を陽性として検出可能な癌の壊死マーカーとして有用であることが具体的に示された。 Also, antibodies against the protein or fragment thereof is a necrosis marker of the present invention is confirmed to be able to dye in different colors and necrosis in sections of the lesion specimens of breast and lung cancer, they necrosis tissues of human breast and lung cancer that was specifically indicated to be useful as markers of necrosis of detectable cancerous as positive.

更に、アイソトープ標識した該抗体によって、癌細胞を移植したヌードマウスの担癌部分の壊死叢周囲を特異的に認識してイメージング可能であることが示された。 Moreover, the isotope-labeled antibody, was shown to be imaged specifically recognize necrotic flora surrounding tumor-bearing portion of the nude mice transplanted with cancer cells.

図1は本発明の実施例において、ネクローシスを誘導したHeLa細胞と通常培養のHeLa細胞から調製した細胞抽出精製液を蛍光標識二次元ディファレンシャルゲル電気泳動(2D-DIGE)法を用いてプロテオミクス解析したゲルの写真である。 Figure 1 in the embodiment of the present invention, and proteomic analysis using Method induced HeLa cells and normal fluorescent labeled two-dimensional differential gel electrophoresis of cell extracts purified solution prepared from HeLa cells cultured (2D-DIGE) and necrosis is a photograph of the gel. 図1Aはネクローシス誘導1日後、図1Bはネクローシス3日後、図1Cはネクローシス誘導6日後の2D-DIGE法で解析した結果をそれぞれ示す。 Figure 1A after necrosis induction day, Figure 1B shows after necrosis 3 days, Figure 1C shows the results of the analysis by 2D-DIGE method after necrosis induced 6 days respectively. 図1C中の矢印で示したスポットは質量分析法およびN末端アミノ酸解析により同定したスポットを示し、各スポット番号は表1のスポット番号(群)に対応する。 Spot indicated by the arrow in Figure 1C shows the spots were identified by mass spectrometry and N-terminal amino acid analysis, each spot numbers corresponding to Table 1 of the spot number (s). 図2は本発明の実施例において、壊死巣特異的マーカーに対する各種の抗体を用いて、壊死巣を含むヒト乳がんおよびヒト肺がん組織を免疫染色した典型的な組織免疫染色像である。 Figure 2 is the embodiment of the present invention, using a variety of antibodies to necrotic foci specific markers, a typical tissue immunostaining image immunostained human breast and human lung cancer tissues including necrosis. 図中のaはヒト乳がん組織の壊死巣を含む癌部、bは非癌部の染色像を示す。 Cancer section a including necrosis of human breast cancer tissue in the figure, b shows a stained image of a non-cancerous portion. 図中のcはヒト肺がん組織の壊死巣を含む癌部、dは非癌部の染色像を示す。 Cancer portion c, including a necrosis of a human lung cancer tissue in the figure, d shows a stained image of a non-cancerous portion. ヒト乳がんおよび肺がん組織の壊死巣を含む癌細胞は各抗体により強く染色され、ところどころにヘマトキシリン液で対比染色された核が認められた。 Cancer cells, including necrosis of human breast and lung cancer tissues are strongly stained by the antibody was observed were counterstained here and there with hematoxylin solution nucleus. 抗PRDX4抗体とビオチン化ペプチドとの相互作用を測定してカイネティック解析したBIACoreのセンサグラムを示す。 Shows a sensorgram of BIACore that kinetic analysis by measuring its interaction with an anti PRDX4 antibody and biotinylated peptide. セルロースアセテート電気泳動により、精製前と精製後のDTPA-IgGの泳動後のオートラジオグラフィーの写真を示す。 The cellulose acetate electrophoresis, showing a photograph of autoradiography after electrophoresis of DTPA-IgG after purification and before purification. 各In-111標識モノクローナル抗体とHeLa生細胞との反応をガンマカウンターで測定した結果を示す。 The reaction between the In-111 labeled monoclonal antibody and HeLa cells showing the results of measurement with a gamma counter. In-111標識モノクローナル抗体を用いた担癌マウスに於けるイメージングの結果を示すレントゲン写真である。 Is a radiograph showing the results of in imaging the tumor-bearing mice using In-111-labeled monoclonal antibody. In-111標識モノクローナル抗体投与4日目の撮像終了後に、腫瘍を摘出し、凍結標本を複数作製し、作製した複数の標本のうち隣接標本でオートラジオグラフィーとヘマトキシリン・エオシン染色(HE染色)を実施した結果を示す。 In-111 labeling monoclonal antibody administered 4 days after the end of imaging, tumors excised, frozen specimens were more prepared, autoradiography and hematoxylin-eosin stained with adjacent samples of the plurality of samples were manufactured (HE staining) It shows the results was carried out. In-111標識モノクローナル抗体が集積する壊死巣周辺部の細胞の形態を示す。 In-111 labeled monoclonal antibody exhibits the form of necrosis periphery of the cell to accumulate.

本発明の壊死マーカーは、本明細書の実施例に記載したように、適当なヒト細胞(例えば、子宮頸がん細胞株であるHeLa細胞株等の樹立培養細胞株)を低栄養、低酸素、高密度および足場非依存的な条件下の培養で誘導して得られるヒト壊死細胞が発現するタンパク質と通常の培養条件で培養した同細胞が発現するタンパク質を、当業者に公知の蛍光標識二次元ディファレンスゲル電気泳動(2D-DIGE)、質量分析計(MS)、N-末端アミノ酸分析法を用いた疾患プロテオミクス手法を用いて同定・比較することにより得ることができる。 Necrosis markers of the present invention, as described in the Examples herein, a suitable human cells (e.g., HeLa cell lines established cell lines, such as a cervical cancer cell line) malnutrition, hypoxia , high density and scaffold-independent conditions proteins the cell expresses the human necrotic cells obtained by inducing in culture were cultured in protein and normal growth conditions for the expression of, known to those skilled fluorescently labeled secondary dimension Difference gel electrophoresis (2D-DIGE), mass spectrometer (MS), may be obtained by identification and compared using a disease proteomics technique using N- terminal amino acid analysis.

従って、本発明は、疾患に関連する壊死を検出する壊死マーカーを同定する方法も提供する。 Accordingly, the present invention also provides a method of identifying a necrosis marker for detecting a necrosis associated with the disease. 従って、この方法は、ヒト細胞を低栄養、低酸素、高密度および足場非依存的な条件下の培養で誘導して得られる壊死細胞が発現するタンパク質と、通常の培養条件で培養した同細胞が発現するタンパク質とを比較して、該壊死細胞においてより高濃度で存在する(高発現する)タンパク質あるいはその断片(限定分解物又は部分タンパク質)を該壊死マーカー選択することを特徴とする。 Therefore, this method is a human cell malnutrition, hypoxia, high density and anchorage-independent and proteins necrotic cells obtained is expressed by induction under the conditions of culture of, the cells cultured under normal culture conditions there is compared with the protein expressed, and characterized in that 該壊 death marker select present at higher concentrations (high expression) protein or fragment thereof (limited hydrolysis or partial protein) in 該壊 dead cells.

本明細書において、「低栄養、低酸素、高密度および足場非依存的な条件」とは、例えば、1x10 個/ml程度の細胞密度でチューブに蓋をした嫌気条件で培地交換せずに約1週間〜2週間培養チューブ中で浮遊させて培養するような条件を意味する。 As used herein, "malnutrition, hypoxia, high density and anchorage-independent conditions" are, for example, without medium change under anaerobic conditions was capped tubes at a cell density of approximately 1x10 7 cells / ml about suspended 1 week in 2 weeks culture tubes meant conditions such as culturing.
一方、「通常の培養条件」とは、例えば、血清含有DMEM 培地(Dulbecco's modified Eagle medium) 中で、2x10 4 〜1x10 5個/mlの細胞密度で、37℃, 5% CO 2存在下95%空気の気相、飽和湿度の条件で培養することを意味する。 On the other hand, the "normal culture conditions", for example, in serum-containing DMEM medium (Dulbecco's modified Eagle medium), 2x10 4 ~1x10 5 cells / ml density, 37 ° C., 5% CO 2 the presence of 95% gas phase air, means culturing in conditions of saturated humidity.
更に、「より高濃度で存在する(高発現する)タンパク質」とは、例えば、通常の培養条件で培養した細胞と比較して、蛍光標識二次元ディファレンスゲル電気泳動において約2倍以上の蛍光強度があり、壊死が誘導された細胞内で経時的に増加するスポットに含まれるタンパク質を意味する。 Furthermore, the "higher concentration present in (highly expressed) proteins", for example, as compared to cells cultured in normal growth conditions, more than twice in the fluorescence-labeled two-dimensional Difference Gel Electrophoresis fluorescence is strong, means a protein contained in increased over time to spot in the necrosis induced cells.

このような比較の結果、実施例に記載の表1に示すような、Peroxiredoxin 4, ERp29, VDAC-1, Annexin A2, Calreticulin, GRP78, PDIA6, HSP60及びERp57の9種類(群)の遺伝子産物であるタンパク質又はその部分ポリペプチドが、通常の培養条件で培養した正常なヒト細胞と比較して、ヒト壊死細胞において有意なレベルのより高濃度で存在することを初めて見出した。 As a result of such comparison, as shown in Table 1 described in the Examples, in Peroxiredoxin 4, ERp29, VDAC-1, Annexin A2, Calreticulin, GRP78, PDIA6, gene products of HSP60 and ERp57 9 type (s) a protein or its partial polypeptide, as compared to normal human cells cultured in normal culture conditions were found for the first time be present in higher concentrations of significant levels in human necrotic cells. 因みに、これらの遺伝子自体は公知であるが、それが、壊死組織に特異的に高発現することはこれまで知られていなかった。 Incidentally, although these genes are known per se, it is, it has not been known so far that high expression specifically in necrotic tissue.

従って、上記の遺伝子の発現産物又は該発現産物に対する自己抗体は壊死マーカーとして有用である。 Therefore, autoantibodies against the expression product or said expression product of said gene are useful as markers of necrosis.

このような壊死マーカーとして使用できる遺伝子の発現産物として、例えば、該遺伝子のmRNA,cDNA,若しくは、それらの部分塩基配列を含む核酸分子、又は、該遺伝子がコードするタンパク質又はその部分ポリペプチドを挙げることが出来る。 As the expression product of a gene that can be used as such a necrosis marker, eg, mRNA of the gene, cDNA, or nucleic acid molecules including their partial nucleotide sequence, or, given the protein or its partial polypeptide the gene encoding it can be. 例えば、上記遺伝子が発現するタンパク質は、壊死組織に特異的に高発現する「壊死巣特異的マーカータンパク質」として有用である。 For example, a protein which the gene is expressed is useful as a "necrosis-specific marker proteins" that specifically highly expressed in the necrotic tissue.

より具体的には、上記の各遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列として、夫々、以下のアミノ酸配列挙げることが出来る: More specifically, as the amino acid sequence of a protein the gene of the encoded, respectively, may be mentioned the following amino acid sequence:
(1)配列番号1〜35のいずれか一つで示されるアミノ酸配列、 (1) amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NO: 1-35,
(2)(1)の各アミノ酸配列において一個又は数個のアミノ酸が置換、欠失及び/又は挿入されたアミノ酸配列、又は(1)の各アミノ酸配列と90%以上、好ましくは95%以上、更に好ましくは98%以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、(1)の各アミノ酸配列とタンパク質としての同一の機能、活性、又は性質を示すアミノ酸配列。 (2) (1) one or several amino acids are substituted in the amino acid sequences of, deletion and / or inserted amino acid sequence, or (1) the amino acid sequence at least 90%, preferably 95% or more, more preferably an amino acid sequence having a homology of 98% or more, the same function as the amino acid sequence and protein (1), activity, or amino acid sequence that indicates the nature.

更に、該遺伝子がコードするタンパク質の部分ポリペプチドの一例として、実施例2で同定されたような、Peroxiredoxin 4(配列番号1)及びERp29(配列番号2〜4)の部分ポリペプチドを挙げることができる。 Furthermore, as an example of a partial polypeptide of the protein encoded by the gene, as identified in Example 2, there may be mentioned a partial polypeptide of Peroxiredoxin 4 (SEQ ID NO: 1) and ERp29 (SEQ ID NO: 2-4) it can.

尚、2つのアミノ酸配列における配列の相同性(同一性)を決定するために、配列は比較に最適な状態に前処理される。 In order to determine the homology of sequences in the two amino acid sequences (identity) sequence is pre-treated to become in an optimum condition for comparison. 例えば、一方の配列にギャップを入れることにより、他方の配列とのアラインメントの最適化を行う。 For example, gaps may be inserted into one of the array, to optimize alignment with the other sequence. その後、各部位におけるアミノ酸残基又は塩基が比較される。 Thereafter, amino acid residues or bases in each region will be compared. 第一の配列における、ある部位に、第二の配列の相当する部位と同じアミノ酸残基又は塩基が存在する場合、それらの配列は、その部位において同一である。 In the first sequence, to a site, if the same amino acid residue or nucleotide as the corresponding site in the second sequence are present, their sequences are identical at that site. 2つの配列における相同性は、配列間での同一である部位数の全部位(全アミノ酸又は全塩基)数に対する百分率で示される。 Homology between two sequences is represented as a percentage of total sites (total amino acids or total base) number of number of sites are identical between the sequences.

上記の原理に従い、2つのアミノ酸配列における相同性は当業者に公知の任意の方法で決定することができる。 In accordance with the principles described above, homology in two amino acid sequences can be determined by any method known to those skilled in the art. 例えば、Karlin及びAltshulのアルゴリズム(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264−2268,1990及びProc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873−5877,1993)により決定することが出来る。 For example, the algorithm of Karlin and Altshul (Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87: 2264-2268,1990 and Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90: 5873-5877,1993) can be determined by. このようなアルゴリズムを用いたBLASTプログラムがAltshulらによって開発された(J.Mol.Biol.215:403−410,1990)。 BLAST program using such an algorithm has been developed by Altshul et al. (J.Mol.Biol.215: 403-410,1990). さらに、Gapped BLASTはBLASTより感度良く相同性を決定するプログラムである(Nucleic Acids Res.25:3389−3402,1997)。 Further, Gapped BLAST is a program that determines the sensitivity homology than BLAST (Nucleic Acids Res.25: 3389-3402,1997). 上記のプログラムは、主に与えられた配列に対し、高い相同性を示す配列をデータベース中から検索するために用いられる。 The above program, to mainly given sequence is used to find the sequences showing high homology from the database. これらは、例えば米国National Center for Biotechnology Informationのインターネット上のウェブサイトにおいて利用可能である。 These are available at the web site on the Internet, for example, the United States National Center for Biotechnology Information.

或いは、配列間の相同性として、Tatiana A. Alternatively, the homology between sequences, Tatiana A. Tatusovaらによって開発されたBLAST 2 Sequencesソフトウェア(FEMS Microbiol Lett.,174:247−250,1999)を用いて決定した値を用いることも可能である。 Tatusova et al. BLAST 2 Sequences software developed by (FEMS Microbiol Lett, 174:. 247-250,1999) it is also possible to use a value determined using. このソフトウェアは米国National Center for Biotechnology Informationのインターネット上のウェブサイトにおいて利用可能であり、入手も可能である。 This software is available at the web site on the Internet of the United States National Center for Biotechnology Information, it is also possible to obtain. 用いるプログラム及びパラメーターは以下のとおりである。 Program and parameters used are as follows. アミノ酸配列の場合、blastpプログラムを用いパラメーターとしては、Open gap:11 and extension gap:1 penalties,gap x_dropoff:50,expect:10,word size:3,Filter:ONを用いる。 For amino acid sequences, the parameters used blastp program, Open gap: 11 and extension gap: 1 penalties, gap x_dropoff: 50, expect: 10, word size: 3, Filter: using ON. 更に、高感度なFASTAソフトウェア(W.R.Pearson and D.J.Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:2444−2448,1988)を用いて相同性を示す配列をデータベースから検索することもできる。 Furthermore, sensitive FASTA software (W.R.Pearson and D.J.Lipman, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 85: 2444-2448,1988) search a sequence showing homology with the database it is also possible to. いずれのパラメーターも、ウェブサイト上でデフォルト値として用いられているものである。 Both parameters are also those which are used as the default value on the website.

本発明に係る壊死巣を検出する方法は、上記の本発明の壊死マーカー量を測定することを含むものである。 Method for detecting the necrosis of the present invention comprises measuring the necrosis markers of the present invention described above. より具体的には、例えば、(1)試料中に含まれる本発明の壊死マーカーから選択された一つ又はそれらの任意の組み合わせから成る壊死マーカーの濃度を測定し、その測定値が正常レベルよりも上昇していることを指標として壊死巣を検出することから成る。 More specifically, for example, (1) the concentration of the necrosis marker consisting of one or any combination thereof selected from necrosis markers of the present invention contained in a sample is measured, the measured value is higher than normal levels also it consists of detecting the necrosis as an index to be elevated.

本発明方法に使用する試料としては、壊死巣からの上記発現産物が含まれているような生体由来の試料である限り、その由来・形態等に特に制限は無いが、好適例として、全血又は血清を挙げることが出来る。 The sample used in the process of the present invention, as long as the biological sample, such as contains the expression product from necrosis, is not particularly limited in origin, forms and the like, as a suitable example, whole blood or serum can be mentioned.

本発明方法によって検出することができる壊死巣の種類・由来組織等に特に制限はなく、例えば、各種固形癌、心筋梗塞、脳梗塞、壊死後性肝硬変 (postnecrotic cirrhosis)、壊死性膵炎 (necrotizing pancreatitis)、壊死性筋膜炎 (necrotizing fasciitis)、動脈硬化性壊疽、糖尿病性壊疽、又は、閉塞性壊疽に関連すること壊死巣を挙げることが出来る。 There is no particular limitation on the kind-derived tissue, such as necrotic foci that can be detected by the method of the present invention, for example, various solid tumors, myocardial infarction, cerebral infarction, necrosis after cirrhosis (postnecrotic cirrhosis), necrotizing pancreatitis (necrotizing pancreatitis ), necrotizing fasciitis (necrotizing fasciitis), atherosclerotic gangrene, diabetic gangrene, or it can include necrosis be associated with obstructive gangrene.

上記各遺伝子の発現産物の発現量の測定は、測定方法・原理に応じて、定量的、半定量的、又は定性的であり得る。 Measurement of expression level of the expression product of each gene, depending on the measuring method, principle, quantitative, semi-quantitative, or can be qualitative. 指標となる上昇のレベルは、検出方法において用いた試料及び壊死マーカーの種類、測定手段・方法の原理及び条件等において有意な差を示すものである。 Level rise is indicative shows a significant difference in the detection sample type and necrosis markers used in the method, the principle of the measuring means, methods and conditions. 例えば、定量的な測定においては、正常レベルに対して、1.5倍以上とすることができる。 For example, in the quantitative measurement, relative to normal levels, it can be 1.5 times or more.

上記遺伝子がコードするタンパク質又はその部分ポリペプチドの量は、当業者に公知の任意の方法で測定することが可能である。 The amount of protein or its partial polypeptide the gene encodes may be measured by any method known to those skilled in the art. 例えば、該適当な抗体を用いたウェスタンブロット等の免疫染色及びEIA等の各種の免疫学的特異反応を利用する方法、エドマン法を用いた気相シークエンサー等ペプチドのアミノ酸配列分析法、更には、MALDI−TOF/MS及びESI Q−TOF/MS法等に代表される質量分析によって検出することが出来る。 For example, a method of using various immunological specificity reactions such as immunostaining and EIA Western blot or the like using the appropriate antibodies, amino acid sequence analysis of the gas phase sequencer or the like peptides using the Edman method, furthermore, MALDI-TOF / MS and ESI Q-TOF / MS method can be detected by mass spectrometry represented by like.

上記の方法の中でも、ウェスタンブロット法及びEIA等の酵素免疫測定法等の、該タンパク質又はその部分ポリペプチドに特異的な抗体との抗原抗体反応によって該白質の発現量又はその部分ポリペプチドを測定する検査方法が好適である。 Among the above methods, an enzyme immunoassay such as Western blot and EIA, measuring the expression level or its partial polypeptide of the white matter in the protein or its partial polypeptide by the antigen-antibody reaction with an antibody specific test method to is preferred.

更には、上記の各遺伝子の発現産物であるタンパク質又はその部分ポリペプチドを抗原として用いて、該発現産物に対する自己抗体から成る壊死マーカーの量を抗原抗体反応によって測定する方法を挙げることができる。 Furthermore, the protein or its partial polypeptide is an expression product of each gene above using as an antigen, the amount of necrosis markers consisting of autoantibodies to the expression product can be a method of measuring the antigen-antibody reaction.

従って、上記抗体は、該タンパク質又はその適当な部分ポリペプチド(ペプチド断片)又はそれらの各種誘導体又は複合体等を抗原物質又は免疫原として用いて、当業者に公知の適当な方法で調製することが可能である。 Accordingly, the antibody, the protein or a suitable part polypeptide (peptide fragments) thereof or their various derivatives or complexes such as using as an antigen substance or immunogen, be prepared in any suitable manner known to those skilled in the art it is possible. 例えば、ポリクローナル抗体の場合には、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ニワトリ等の適当な動物に投与し、その抗血清から調製することが可能である。 For example, in the case of polyclonal antibodies, administered mice, rats, rabbits, goats, in appropriate animal chicken, etc., it may be prepared from the antiserum. 或いは、モノクローナル抗体作成法(「単クローン抗体」、長宗香明、寺田弘共著、廣川書店、1990年; "Monoclonal Antibody" James W. Goding, third edition, Academic Press, 1996)等に記載の公知の細胞融合を用いる方法でモノクローナル抗体として調製することも可能である。 Alternatively, a monoclonal antibody preparation method ( "monoclonal antibody", Nagamune KaoruAkira, Hiroshi Terada, co-authored, Hirokawa Shoten, 1990; "Monoclonal Antibody" James W. Goding, third edition, Academic Press, 1996) known as described in, etc. it is also possible to prepare a monoclonal antibody by a method using a cell fusion.

更に、遺伝子工学的手法によって調製することができる、キメラ抗体、ヒト化抗体、並びに、一本鎖抗体、重鎖CDR1〜3を有する重鎖可変ドメインと、軽鎖CDR1〜3を有する軽鎖可変ドメインとをリンカーで結合した構造からなる単鎖可変領域抗体断片(scFv)、Fab断片抗体、及びFab'断片抗体等の低分子抗体等の当業者に公知の任意の形態を有する各種の人工抗体を挙げることが出来る。 Furthermore, it can be prepared by genetic engineering technique, chimeric antibodies, humanized antibodies, as well as single chain antibodies, and the heavy chain variable domain having a heavy chain CDRs 1 to 3, a light chain variable having the light chain CDRs 1 to 3 single chain variable region antibody fragment comprising a domain from structures attached by a linker (scFv), various artificial antibodies having any form of known to those skilled in the art such as low molecular antibodies such as Fab fragments antibodies, and Fab 'fragments antibodies it can be mentioned. これらは当業者に公知の任意の方法によって容易に製造することができる。 These can be readily prepared by any method known in the art.

このような抗体には、酵素、放射性同位体、ナノ粒子、蛍光色素、及び金属原子等の当業者に公知の各種の標識物質で標識されているものも含まれる。 Such antibodies, enzymes, radioisotopes, nanoparticles, fluorescent dyes, and also those that are labeled with various known labeling substances to those skilled in the art such as metal atoms.

又、上記遺伝子のmRNA(又は、cDNA)は、例えば、該遺伝子の塩基配列に基づき適宜設計したプライマー又はプローブを使用したRT−PCR法、リアルタイム逆転写PCR(リアルタイムRT−PCR)等の各種定量的PCR法、並びに各種のマイクロアレイ(DNAチップ)法等の当業者に公知の方法で増幅・検出することが出来る。 Also, the genes of mRNA (or, cDNA), for example, RT-PCR method using appropriately designed primers or probes based on the nucleotide sequence of the gene, real-time reverse transcription PCR (real-time RT-PCR) various quantification of such PCR methods, as well as various microarray (DNA chip) method to those skilled in can be amplified and detected by a known method. PCR法で増幅された核酸分子の検出・同定は、その塩基配列を直接決定する方法(シークエンス法)、又は電気泳動との組み合わせ等、適当な方法で行うことが出来る。 Detection and identification of the amplified nucleic acid molecules by PCR, the method of determining the nucleotide sequence directly (sequencing), or a combination of the electrophoresis can be performed in an appropriate manner.

上記のプライマー又はプローブの塩基配列は、鋳型との特異的な結合が可能となるような塩基数、例えば、15−40塩基、より具体的には、15−25塩基程度を有することが好ましく、更には、プライマー内でヘアピン構造をとったり、センス鎖とアンチセンス鎖とが互いにアニーリングしないような塩基配列とすることも重要である。 Additional primers or probes of the nucleotide sequence, specific binding can become such number of bases as the template, for example, 15-40 bases, and more specifically, preferably has a degree 15-25 bases, Furthermore, take a hairpin structure in the primer, it is also important to the nucleotide sequence as the sense and antisense strands do not anneal to each other. 例えば、OligoTM(National Bioscience Inc.製)のような市販のプライマー設計用のソフトウェアを使用することも可能である。 For example, it is also possible to use software for commercial primer design, such as, Oligo ™ (manufactured by National Bioscience Inc.).

本発明検出の方法に用いる検出キットは、本発明の壊死マーカーと特異的に反応する化合物を含むことを特徴とする。 Detection kit used in the method of the present invention detection is characterized in that it comprises a compound that reacts specifically with necrosis markers of the present invention. このような化合物の好適例として、上記の各種抗体を挙げることが出来る。 Suitable examples of such compounds, may be mentioned the above-mentioned various antibodies.

本発明の検出キットは、測定対象又は測定原理等に応じて、適当な構成をとることが出来る。 Detection kit of the present invention, depending on the measurement object or the measurement principle and the like, may take appropriate configuration. 該キットは、その構成要素として、例えば、上記発現産物、例えば、タンパク質又はその部分ポリペプチドに特異的な抗体、若しくは該発現産物に対する自己抗体に対する抗原である該発現産物であるタンパク質又はその部分ポリペプチド、各種の二次抗体(標識抗体)、上記のmRNA(cDNA)の増幅用プライマー及びDNAチップ等で使用するハイブリダイゼーション用のプローブ(例えば、10〜100個程度の連続した塩基配列から成る)のような、上記遺伝子の発現産物と特異的に反応する化合物を含むことができる。 The kit, as its components, for example, the expression product, e.g., protein or antibody specific to the partial polypeptide, or protein or parts poly thereof is the expression product is an antigen against autoantibody against expression products peptides, various secondary antibody (labeled antibody), a probe for hybridization used in the amplification primers and DNA chips of the above mRNA (cDNA) (e.g., made of 10 to 100 or so contiguous nucleotide sequence) like, it may include compounds that react specifically with the expression product of the gene. 更に、上記キットには、その構成・使用目的などに応じて、当業者に公知の他の要素又は成分、例えば、各種試薬、酵素、緩衝液、反応プレート(容器)等が含まれる。 Furthermore, the above-mentioned kit, depending on its configuration, intended use, other elements or components known to those skilled in the art, for example, various reagents, enzymes, buffers include reaction plate (vessel) or the like. 尚、PCR反応後の検出を容易にするために、これらプライマーの少なくともいずれかの末端に、当業者に公知の任意の蛍光物質等の標識物質が結合していることが好ましい。 In order to facilitate detection after PCR reaction, at least either end of these primers, it is preferable that the labeling material any fluorescent material or the like known to those skilled in the art is attached. 例えば、適当な標識物質として32 P等の放射線標識、Cy3及びCy5のようなシアニン類、6−カルボキシフルオレッセイン(FAM)、4,7,2',4',5',7'−ヘキサクロロー6−カルボキシフルオレッセイン(HEX)及びNED(アプライドシステムズジャパン社)及び6−カルボキシ−X−ローダミン(Rox)等の蛍光物質、並びに、化学発光物質等を挙げることが出来る。 For example, radiolabeled 32 P or the like as appropriate labeling substance, cyanines such as Cy3 and Cy5, 6- carboxy fluorescein (FAM), 4,7,2 ', 4 ', 5 ', 7'- Hekisakuroro 6-carboxyfluorescein fluorescein (HEX) and NED (Applied Systems Japan Ltd.) and 6-carboxy -X- rhodamine (Rox) fluorescent substance and the like, as well, it can be mentioned chemiluminescent substances.

以上の各測定に使用する材料及び器具・装置などは当業者に容易に入手可能であり、各測定操作の手順・条件等は、使用する器具・装置に添付のマニュアルに従うか、又は、使用する細胞の種類等のその他条件に応じて適宜設定することが出来る。 Or more of such materials and equipment and apparatus used in the measurement are readily available to those skilled in the art, the procedure and conditions of each measurement operation, or the equipment and apparatus used according to the manual attached, or, to use it can be appropriately set depending on other conditions such as the type of cell.

更に、上記の壊死マーカーと特異的に反応する化合物、例えば、既に記載したような壊死マーカーに対する各種の抗体、と標識化合物又は治療に有効な化合物とから成る複合体は、例えば、PET又はSPECTのような画像診断用又は治療用医薬品(コンジュゲート:複合体)として有用である。 Further, the necrosis markers specifically reactive compounds, for example, the various relative necrosis markers as previously described antibody, and the labeled compound or therapy comprising a compound effective complexes, for example, PET or SPECT such diagnostic imaging or therapeutic medicament: useful as (conjugate complex). 核医学診断に有効な放射性核種としては、例えば、ポジトロン放出核種(Cu-64など)、ガンマ線放出核種(In-111など)を挙げることが出来る。 Valid radionuclide nuclear medical diagnosis, for example, (such as Cu-64) positron (such as an In-111) gamma-emitting nuclide can be cited. 更に、標識化合物としては、 15 O、 13 N, 11 C及び18 Fのようなよう電子反β崩壊する核種を上げることが出来る。 Furthermore, as the labeling compound, 15 O, 13 N, 11 C and 18 F nuclei can be increased to electronic anti β decay such as. 治療に有効な化合物としては、当業者に公知の任意の薬剤、例えば、抗腫瘍剤及び細胞傷害性のβ線(Y-90など)などを放出する放射性核種を挙げることが出来る。 The active compounds in the treatment, known to those skilled in the art any agent, e.g., anti-tumor agents and cytotoxic β lines (Y-90, etc.), and the like emitting radionuclides.

従って、このようなコンジュゲートは画像診断用キットもしくは医薬組成物の有効成分と成り得る。 Accordingly, such conjugates can be an active ingredient of a diagnostic imaging kit or pharmaceutical composition. このような医薬組成物は公知の製剤学的方法により製剤化することが可能である。 Such pharmaceutical composition can be formulated using known pharmaceutical preparation methods. 例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、徐放剤などと適宜組み合わせて製剤化して投与することが考えられる。 For example, pharmacologically acceptable carriers or medium, specifically, sterilized water, physiological saline, vegetable oils, emulsifiers, suspending agents, surfactants, stabilizers, and formulated in combination as appropriate with such sustained-release agent it is conceivable to administration. 本発明の医薬組成物は、水溶液、錠剤、カプセル、トローチ、バッカル錠、エリキシル、懸濁液、シロップ、点鼻液、または吸入液などの形態であり得る。 The pharmaceutical compositions of the present invention, aqueous solutions, tablets, capsules, troches, buccal tablets, elixirs, suspensions, syrups, may be in the form of such nasal drops or inhalation solutions. 本発明化合物の含有率は、治療目的、投与経路、治療対象等に応じて、当業者が適宜決定することが出来る。 The content of the compounds of the invention, therapeutic objectives, the route of administration, depending on the therapeutic target, etc., those skilled in the art can be appropriately determined.

以下、実施例に基づき本発明を更に詳細に説明するが、これらの実施例は本発明の技術的範囲を何等限定するものではない。 Hereinafter, a more detailed explanation of the present invention based on examples, these examples are not intended to any way limit the scope of the present invention. 当業者であれば、本明細書の記載に基づき、本発明の技術的範囲を逸脱せずに、多くの変形及び修飾を実施することが可能である。 Those skilled in the art based on the description herein, without departing from the scope of the present invention, it is possible to implement many variations and modifications.

致死表現型の単離: Isolation of lethal phenotype:
致死表現系を持つ細胞を同定するための種々の方法が存在する。 Various methods for identifying cells with a lethal phenotype is present. 壊死(ネクローシス)細胞またはアポトーシス細胞において、細胞形態、または細胞透過性の変化、つまり細胞膜の「水泡化」が観察される。 In necrosis (necrotic) cells or apoptotic cells, cell morphology or cell permeability changes, that is, "blistering" of the cell membrane is observed. 種々の色素、染色および抗体が、そのような方法で利用可能であり、限定はしないで、ヨウ化プロピジウム、抗体Apo2.7およびカスパーゼ色素等が含まれる。 Various dyes, dyeing and antibodies, are available in such a way, without limitation, propidium iodide, antibodies Apo2.7 and caspase dyes.

トリパンブルーによる染色: Staining with trypan blue:
トリパンブルーは青色の色素である。 Trypan blue is a blue dye. 無傷の膜を持つ生細胞は、細胞間区画からトリパンブルーを排除するため、染色されない。 Viable cells with intact membranes, in order to exclude trypan blue from the cells between the compartments, not stained. 死細胞および瀕死細胞の細胞膜は透過性があるため、細胞質が青色に染色される。 Because cell membranes of dead and dying cells have a permeability, cytoplasm is stained blue.

ヨウ化プロピジウム染色: Propidium iodide staining:
ヨウ化プロピジウム(PI)は蛍光のDNA間在分子である。 Propidium iodide (PI) is the DNA between resident molecule fluorescence. 無傷の膜を持つ生細胞は、細胞間区画からPIを排除するため、非蛍光である。 Viable cells with intact membranes, in order to exclude PI from intracellular compartments, a non-fluorescent. 死細胞および瀕死細胞はPIに対して易感染性で、透過性あるため、蛍光である。 Dead and dying cells is compromised with respect to PI, because of transparency, is fluorescence. PI染色技法は壊死およびアポトーシス細胞に等しく利用される。 PI staining technique is equally available to necrosis and apoptotic cells.

アネキシンV: Annexin V:
アネキシンVは、ホスファチジルセリンなどの陰イオン性リン脂質部位に結合する。 Annexin V binds to anionic phospholipids sites such as phosphatidylserine. 生細胞の細胞膜は脂質二重層構造をとっており、細胞膜の内膜と外膜でリン脂質に偏りがあり、ホスファチジルセリンは通常内膜に局在している。 Cell membranes of live cells are taken a lipid bilayer structure, there is a bias in the phospholipid in the inner and outer membrane of the cell membrane, phosphatidylserine is localized to normal intima. 多くの細胞がアポトーシスを起こしている時、この脂質は細胞外膜上に転位し、露出する。 When many cells undergoing apoptosis, lipid translocates onto outer cell membrane, exposed. この転位により、外来より加えた蛍光共役アネキシンVが、脂質と相互作用することが可能となり、それによって、アポトーシスを起こしている細胞を標識することが可能である。 This dislocation, fluorescent conjugated annexin V was added from exogenous, it is possible to interact with the lipid, thereby it is possible to label cells undergoing apoptosis. そこで、蛍光共役アネキシンVに標識されない死細胞を分取することにより、壊死細胞を分離することが可能になる。 Therefore, by preparative dead cells that are not labeled with the fluorescent conjugate Annexin V, it is possible to separate the necrotic cells.

実施例1:壊死巣細胞モデル系の作製本発明の方法は、壊死巣を形成している細胞モデルとしてネクローシスを誘導した細胞を必要とする。 Example 1: process of making the present invention necrosis cell model systems require induced necrotic as a cell model that forms the necrosis cells. そこで、子宮頚がん細胞株のHeLa細胞にネクローシスを誘導し、壊死巣を形成する細胞モデル系を作製した。 Therefore, to induce necrotic HeLa cells of cervical cancer cell lines, to produce a cell model system for forming a necrotic foci. 一般的に、HeLa細胞は接着性細胞であり、2x10 5 〜1x10 6個の細胞を10cm 2シャーレ上で足場依存的に培養する。 Generally, HeLa cells are adherent cells, culturing 2x10 5 ~1x10 6 cells anchorage-dependent manner over 10 cm 2 dish. 通常培養では血清含有DMEM 培地(Dulbecco's modified Eagle medium) 10mlに、2x10 4 〜1x10 5個/mlの密度で、37℃, 5% CO 2存在下95%空気の気相、飽和湿度の条件で培養する。 In serum-containing DMEM medium (Dulbecco's modified Eagle medium) 10ml in normal culture at a density of 2x10 4 ~1x10 5 cells / ml, 37 ℃, 5% CO 2 the presence of 95% air gas phase of culture under the condition of saturation humidity to. HeLa細胞は増殖能が高く、栄養豊富な血清含有DMEM培地中では、2〜3日で10cm 2シャーレがコンフルエントになるまで増殖する。 HeLa cells are highly proliferative capacity, in a nutrient-rich serum-containing DMEM medium, 10 cm 2 dish to grow to confluence in 2-3 days. HeLa細胞は癌細胞株なのでシャーレがコンフルエント状態になっても接触阻害はかからず増殖可能であるが、過剰に増殖させるとすみやかに細胞死を起こす。 Although HeLa cells can grow without contracting the contact inhibition even when dish because of cancer cell lines became confluent state, promptly when the excessive proliferation cause cell death. 今回、HeLa細胞を1x10 7個/mlという高密度、さらにチューブ中で浮遊させる足場なしの状態で、チューブに蓋をした嫌気条件で培地交換せずに1週間〜2週間培養することにより、壊死巣に特徴的な低栄養、低酸素、高密度および足場非依存的な細胞の環境を再現した。 This time, a high density of 1x10 7 cells / ml of HeLa cells, further in the state of no scaffold is suspended in a tube, by culturing 1 to 2 weeks without medium change under anaerobic conditions was capped tube, necrosis characteristic malnutrition nest, hypoxia, reproduces the high density and anchorage-dependent cell environment.

1.1 HeLa細胞へのネクローシス誘導 1.1 necrosis induction into HeLa cells
HeLa細胞を10 cm 2シャーレで、100 units/ml ペニシリン・ストレプトマイシン(Gibco BRL)および10% FBS(JRH社)を添加したDMEM培地(Gibco BRL)中で通常培養した。 HeLa cells in 10 cm 2 dish, were usually cultured in 100 units / ml penicillin-streptomycin (Gibco BRL) and added with DMEM medium 10% FBS (JRH Co.) (Gibco BRL). 増殖したHeLa細胞をトリプシン・EDTA(Gibco BRL)で10cm 2シャーレから剥がし、氷冷したPBS(-)で2回洗浄し、1 x 10 7個の細胞を1.5 mlのチューブに移し、1mlの上記DMEM培地あるいは10% FBSを添加しないDMEM培地中で15日間培養した。 The proliferated HeLa cells detached from 10 cm 2 dish with trypsin · EDTA (Gibco BRL), ice-cold PBS (-) by washing twice, transferred to 1 x 10 7 cells in a 1.5 ml tube, 1 ml of the and cultured for 15 days in DMEM medium without the addition of DMEM medium or 10% FBS. 培地にはpH指示薬を添加し、細胞呼吸による酸素消費により酸素濃度の低下を3日目以降確認したが、蓋をしたまま培養を継続した。 Medium was added and pH indicator in has been confirmed a decrease in oxygen concentration 3 days after the oxygen consumption by the cellular respiration, the culture was continued while the lid.

1.2 致死表現型の単離 1.2 lethal phenotype of isolation
1.2.1 トリパンブルーによる染色ネクローシスを誘導したHeLa細胞を遠心分離して回収し、氷冷したPBS(-)で2回洗浄した。 1.2.1 HeLa cells induced staining necrosis by trypan blue were collected by centrifugation, ice-cold PBS (-) in washed twice. 回収したHeLa細胞を氷冷したPBS(-)で約1 x 10 6個/ mlになるように懸濁し、1/10容量の0.4% トリパンブルー/PBSバッファー溶液(Gibco BRL)を加えて混和し、室温で3〜5分間インキュベーションした後、顕微鏡下で観察した。 Recovered HeLa cells were ice-cold PBS (-) in and suspended at about 1 x 10 6 cells / ml, added and mixed 1/10 volume of 0.4% trypan blue / PBS buffer solution (Gibco BRL) after incubation for 3-5 min at room temperature, and observed under a microscope. 無色の生細胞、青色に染色された死細胞および瀕死細胞数をそれぞれ計測した。 Colorless living cells, blue stained dead cells and dying cell numbers were counted, respectively.

上記の方法でネクローシスを誘導したHeLa細胞は、培養1日目後には、無血清DMEM培地で13.9%、血清添加DMEM培地で20.6%、培養2日目後には、無血清DMEM培地で79.5%、血清添加DMEM培地で68.5%、培養3日目後には、無血清DMEM培地で91.5%、血清添加DMEM培地で81.2%の細胞が青色に染色され死細胞であることが確認された。 HeLa cells induced necrosis in the above method, after 1 day of culture, 13.9% in serum-free DMEM medium, 20.6 percent in serum-containing DMEM medium, after 2 days of culture is 79.5% in the serum-free DMEM medium, 68.5% serum DMEM supplemented, after 3 days of culture, 91.5% in serum-free DMEM medium 81.2% of the cells in serum-containing DMEM medium were confirmed to be dead cells stained blue. その後、15日間培養したが、約90%の細胞集団が死細胞であることが確認された。 Thereafter, was cultured for 15 days, it was confirmed about 90% of the cell population is dead cells.

1.2.2 蛍光色素標識による死細胞の染色致死表現型を有する細胞には大別してネクローシスとアポトーシス(プログラム細胞死)が考えられる。 1.2.2 necrosis and apoptosis (programmed cell death) is considered roughly the cells with a staining lethal phenotype of fluorochrome-labeled by dead cells. 壊死巣ではネクローシス細胞がアポトーシス細胞よりも比重が大きいと考えられ、細胞死を区別するため、さらに細胞を蛍光色素で染色した。 Necrotic cells in necrotic foci considered specific gravity than larger apoptotic cells to distinguish cell death, further cells were stained with a fluorescent dye. ネクローシスを誘導したHeLa細胞を遠心分離して回収し、氷冷したPBS(-)で2回洗浄した。 HeLa cells induced necrosis were collected by centrifugation, ice-cold PBS (-) in washed twice. 回収した細胞にアネキシンV (Annexin-V-Fluos :終濃度20 μl/ml; Roche)およびヨウ化プロピジウム(PI):終濃度1μg/ml, 株式会社同仁化学研究所)を含む染色Hepesバッファー溶液(10 mM Hepes-NaOH (pH 7.4), 140 mM NaCl, 5mM CaCl 2 )100 μlを加えて室温で10〜15分間インキュベーションし、蛍光顕微鏡下(励起光;488 nm, 検出;515-565 nm)で観察した。 The recovered cells Annexin V (Annexin-V-Fluos: final concentration 20 μl / ml; Roche) and propidium iodide (PI): final concentration 1 [mu] g / ml, stained Hepes buffer solution containing Dojindo Laboratories) ( 10 mM Hepes-NaOH (pH 7.4 ), 140 mM NaCl, was added to 5mM CaCl 2) 100 μl and incubated for 10-15 minutes at room temperature, under a fluorescent microscope (excitation light; 488 nm, detected; at 515-565 nm) the observed. 一方、10 cm 2シャーレに培養したHeLa細胞を、1mM 過酸化水素を含む10%FCS含有DMEM培地に代えて1時間培養し、氷冷したPBS(-)で2回洗浄し、通常の10% FCS含有DMEM培地に戻して5時間培養し、アポトーシスを誘導した。 On the other hand, the HeLa cells cultured in 10 cm 2 dish, instead of 10% FCS-containing DMEM medium containing 1mM hydrogen peroxide and incubated for 1 hour, ice-cold PBS (-) by washing twice normal 10% and cultured for 5 hours to return to FCS-containing DMEM medium, to induce apoptosis. そのHeLa細胞を同様にAnnexin-V-Fluos およびPIで染色し、蛍光顕微鏡下で観察した。 The HeLa cells similarly stained with Annexin-V-Fluos and PI, and observed under a fluorescence microscope.

10% FCS添加DMEM培地で6日間培養してネクローシスを誘導したHeLa細胞は核がPIで染色された。 HeLa cells induced necrosis were cultured for 6 days in 10% FCS DMEM supplemented the nuclei were stained with PI. 一方、アポトーシスを誘導したHeLa細胞は、細胞膜付近がアネキシンVで強く染色され、一部の細胞は核もPIで染色された。 On the other hand, HeLa cells induced apoptosis, near the cell membrane was stained strongly with annexin V, a portion of the cell nucleus stained with PI. 通常培養から調製した生細胞はPIおよびアネキシンVのいずれにも染色されなかった。 Viable cells prepared from normal culture did not stain either PI and annexin V. この結果から上記の方法で作製された死細胞は、ネクローシス細胞であることが確認された。 Dead cells from these results produced by the above method, it was confirmed that the necrotic cells.

実施例2:壊死巣特異的マーカー分子の同定 Example 2: Identification of necrosis-specific marker molecules
2.1 細胞抽出液の調製 実施例1において10% FCS添加DMEM培地でネクローシスを誘導して1日目〜6日目のHeLa細胞および通常培養したHeLa細胞を回収し、氷冷したPBS(-)で2回洗浄した。 In - In 2.1 Preparation Example 1 of cell extract supplemented with 10% FCS HeLa cells by inducing necrosis 1 day to 6 days in DMEM medium and normal HeLa cells cultured were recovered and cooled with ice PBS () It was washed twice. 氷冷した500-1,000μlの可溶化バッファー(20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40)を加えて細胞を懸濁し、1.5 mlチューブに移した。 Ice 500-1,000μl solubilization buffer was cooled (20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40) was added to suspend the cells was transferred a 1.5 ml tube . チューブを4 ℃で30分間回転させながら細胞の可溶性画分を抽出し、15,000rpmで15分間遠心分離し、その上清を細胞抽出液とした。 While rotating 30 minutes the tubes at 4 ° C. to extract the soluble fraction of cells were centrifuged for 15 minutes at 15,000 rpm, and the supernatant was a cell extract. 回収した細胞抽出液を、2D-Clean up kit(80-6484-51, Amersham)を用い、そのプロトコールに従って精製し、適量のlysis buffer ( 30 mM Tris (pH 8.5), 7M Urea, 2M Thiourea, 4% CHAPS, 5mM 酢酸マグネシウム)に溶解し、遠心分離した後、その上清を細胞抽出精製液とした。 The recovered cell extracts, using a 2D-Clean up kit (80-6484-51, Amersham), and purified according to the protocol, an appropriate amount of lysis buffer (30 mM Tris (pH 8.5), 7M Urea, 2M Thiourea, 4 % CHAPS, was dissolved in 5mM magnesium acetate), it was centrifuged, and the supernatant was used as a cell extract purified solution.

2.2 タンパク質定量細胞抽出精製液に含まれるタンパク質をProtein Assay試薬( 500-0006, Bio-Rad )を用い、そのプロトコールに従ってBradford法に基づき定量した。 2.2 Protein Protein Assay reagent contained in the protein determination cell extract purified solution (500-0006, Bio-Rad) was used to quantify based on the Bradford method according to the protocol. 具体的には、細胞抽出精製液1μlに0.1 N HCl 1μlと精製水8μlを加えてサンプル溶液とした。 Specifically, to obtain a sample solution was added purified water 8μl with 0.1 N HCl 1 [mu] l in the cell extract purified solution 1 [mu] l. タンパク質標準液としてBSA溶液(23209, Thermo)を0.25-1 mg/mlに希釈し、その1μlにlysis buffer 1μlと0.1 N HCl 1μlを加えて全量を10μlとした。 Protein standard solution as BSA solution (23209, Thermo) was diluted to 0.25-1 mg / ml, was 10μl added to bring the total amount lysis buffer 1 [mu] l and 0.1 N HCl 1 [mu] l in the 1 [mu] l. 同様に精製水8μlにlysis buffer 1μlと0.1 N HCl 1μlを加えてブランク溶液とした。 And a blank solution by adding lysis buffer 1 [mu] l and 0.1 N HCl 1 [mu] l in the same manner as purified water 8 [mu] l. それぞれのサンプル溶液、標準溶液およびブランク溶液に、5倍希釈したProtein Assay試薬を200μlずつ加えてよく混和し、室温で5分間放置した。 Each sample solution, the standard solution and blank solution, the Protein Assay reagent diluted 5-fold and mixed well added in 200 [mu] l, and left at room temperature for 5 minutes. Protein Assay試薬を混和してから1時間以内に測定波長595 nmで吸光度を測定し、BSA標準溶液の吸光度から検量線を求め、細胞抽出精製液に含まれるタンパク質量を算出した。 Protein Assay Reagent by measuring the absorbance at a measurement wavelength 595 nm within one hour after mixing, and measuring a calibration curve from the absorbance BSA standard solution was calculated amount of protein contained in the cell extract purified solution.

2.3 蛍光標識二次元ディファレンシャルゲル電気泳動(2D-DIGE)法を用いたプロテオミクス解析通常培養およびネクローシスを誘導して1〜6日目のHeLa細胞から調製した細胞抽出精製液25μgずつを、それぞれCy3(CyDye DIGE Fluor Cy3, GE Healthcare)およびCy5(CyDye DIGE Fluor Cy5, GE Heaithcare)で別々に標識し、10mM Lysine(SIGMA社)を加えて蛍光標識反応を停止した。 2.3 fluorescently labeled two-dimensional differential gel electrophoresis (2D-DIGE) method by cell extracts purified solution 25μg of Proteomics typically prepared from HeLa cells 1-6 days to induce the culture and necrosis with each Cy3 ( CyDye DIGE Fluor Cy3, GE Healthcare) and Cy5 (labeled separately with CyDye DIGE Fluor Cy5, GE Heaithcare), to stop the fluorescent labeling reaction by adding 10 mM Lysine (SIGMA Co.). Cy3およびCy5で標識したそれぞれのHeLa細胞抽出精製液を等量混合し、一次元電気泳動用サンプルバッファー (8M Urea, 2% CHAPS, 0.5% IPG Buffer(17-6004-40, GE), 0.002% ブロモチモールブルー溶液)を加えてよく混合し、15,000rpmで5分間遠心分離し、その上清をサンプル溶液とした。 Each HeLa cell extract purified solution labeled with Cy3 and Cy5 were mixed in equal amounts, one-dimensional electrophoresis sample buffer (8M Urea, 2% CHAPS, 0.5% IPG Buffer (17-6004-40, GE), 0.002% added thereto and mixed well bromothymol blue solution), and centrifuged for 5 minutes at 15,000 rpm, and the supernatant was the sample solution. そのサンプル溶液中でpH3-11のイオン勾配を有する24cmの一次元目専用ゲル(Immobiline DryStrip pH 3-11NL, 17-6003-77, GE Healthcare)を12時間膨潤し、一次元目専用等電点電気泳動システム装置(Ettan IPGphor 3 IEF System, GE Healthcare)を用いて段階的に電圧をあげながら細胞抽出精製液に含まれるタンパク質を等電点電気泳動で分離した。 The sample solution in pH3-11 of 24cm first dimension only gel with ion gradient (Immobiline DryStrip pH 3-11NL, 17-6003-77, GE Healthcare) for 12 hours swell, first dimension only isoelectric point electrophoresis system apparatus (Ettan IPGphor 3 IEF system, GE Healthcare) were separated by isoelectric focusing of proteins contained in the cell extract purified solution while stepwise raising the voltage used. 次に10% ポリアクリルアミドゲル(Acrylamide:17-1310-01, GE Healthcare)を用いた二次元目の電気泳動により、細胞内可溶化タンパク質をさらに分子量で分離した。 Then a 10% polyacrylamide gel (Acrylamide: 17-1310-01, GE Healthcare) by second dimensional electrophoresis using, separated by further molecular weight intracellular solubilized protein. 二次元電気泳動により分離した蛍光標識タンパク質はバリアブルイメージアナライザー(Typhoon TRIO+, GE Healthcare) で検出し、ゲルイメージは2D-DIGE専用解析ソフトDeCyder(GE Healthcare)を用いてスポットを解析し、それぞれの細胞内でのタンパク質発現を比較した。 Fluorescent-labeled proteins separated by two-dimensional electrophoresis variable image analyzer (Typhoon TRIO +, GE Healthcare) was detected in the gel image analyzes spot using 2D-DIGE dedicated analysis software DeCyder (GE Healthcare), each cell comparing protein expression in the inner.

ネクローシスを誘導したHeLa細胞内で発現している約3,000個のタンパク質スポットを解析した結果、ネクローシス誘導1日後には、通常培養のものと比較して発現が増加したタンパク質が0.6%, 減少したものが0.4% (図1A)、3日後には増加したものが1.1%、減少したものが3.4%みられた(図1B)。 Results of the analysis of approximately 3,000 protein spots that are expressed in HeLa cells induced necrosis, after necrosis induced one day, 0.6% protein expression relative to that of normal culture has increased, which has decreased There 0.4% (Fig. 1A), increased as 1.1% after 3 days, which was reduced was seen 3.4% (Fig. 1B). さらに、ネクローシスを誘導して6日後の細胞内可溶性画分のタンパク質の発現は、通常培養のそれと比較して、5.1%のタンパク質が増加し、2.9%が減少した(図1C)。 Furthermore, the expression of intracellular soluble fraction of proteins after 6 days to induce necrosis, as compared to that of normal culture, an increase of 5.1% protein, 2.9% decreased (Fig. 1C).

2.4 質量分析法によるタンパク質の同定ネクローシスを誘導したHeLa細胞で発現量の増加したタンパク質をMALD-TOF/MSで同定した。 The increased protein expression levels in HeLa cells induced the identification necrosis of proteins by 2.4 mass spectrometry were identified by MALD-TOF / MS. 具体的には、上記の二次元電気泳動後の10%ポリアクリルアミドゲルをトリス、6-アミノカプロン酸、メタノール系のバッファー溶液中で2mA/cm 2ゲル面積の定電流で90分間通電し、ゲル中のタンパク質を電気的にPVDF膜(ProBlott(登録商標), ABI社)に転写した。 Specifically, a 10% polyacrylamide gel after the above two-dimensional electrophoresis Tris, 6-aminocaproic acid, energized 90 minutes at a constant current of 2 mA / cm 2 gel area with a buffer solution of methanolic, gel electrically PVDF membrane protein (ProBlott (registered trademark), ABI, Inc.) and transferred to. PVDF膜上のタンパク質をクマシーブルー R-350(17-0518-01, GE Healthcare)で染色して可視化し、目的とするスポットを剃刀で切り出し、1fmolのリシリルエンドペプチダーゼ(125-05061, Wako)を加えて37℃で16時間消化し、その断片化ペプチドをNuTip A protein on the PVDF membrane with Coomassie blue R-350 (17-0518-01, GE Healthcare) and visualized by staining with, cut out a spot for the purpose with a razor, Li silyl endopeptidase of 1fmol (125-05061, Wako) was digested for 16 hours at 37 ° C. was added, NuTip the fragmented peptides (登録商標)ピペットチップ(Glygen Corp.)で精製し、MALD-TOF/MS(Voyager-DE TM PRO, AB SCIEX社)で解析した。 Purification (R) pipette tips (Glygen Corp.), and analyzed with MALD-TOF / MS (Voyager- DE TM PRO, AB SCIEX Inc.). 得られたフラグメントをタンパク質解析用データベースと比較して、該タンパクに関する情報を得た。 The resulting fragment was compared to a database for protein analysis to obtain information about the protein.

2.5 N末端アミノ酸の解析ネクローシスを誘導したHeLa細胞で発現量の増加したタンパク質のN末端アミノ酸を、エドマン分解により順次分解して一次構造決定した。 The N-terminal amino acids of increased protein expression level in 2.5 HeLa cells induced analysis necrosis of N-terminal amino acids were determined primary structure are sequentially decomposed by Edman degradation. 具体的には、上記の2.4で得られたタンパク質が転写されたPVDF膜をクマシーブルー R-350(GE)で染色し、目的とするスポットを剃刀で切り出し1.5 mlチューブに移した。 Specifically, stained PVDF membrane obtained proteins were transferred in 2.4 above with Coomassie Blue R-350 (GE), and transferred to cut 1.5 ml tube spot of interest with a razor. PVDF膜を少量のアセトニトリルで湿らせた後、1 ml のMilli-Q水を加えて激しく攪拌した後、Milli-Q水を除く洗浄操作を5回繰り返し、全自動タンパク質一次構造解析装置(PPSQ33A, 島津製作所)でアミノ酸配列を自動解析した。 After wetting the PVDF membrane with a small amount of acetonitrile, 1 ml of the mixture was stirred vigorously added Milli-Q water, Milli-Q water washing operation was repeated 5 times except full automatic protein primary structure analyzer (PPSQ33A, the amino acid sequences were automatically analyzed by Shimadzu Corporation).

その結果、壊死巣特異的マーカーとして同定されたタンパク質のうち、ペルオキシレドキシン4断片またはERp29断片について、以下に通り、N末端アミノ酸(9個)の一次配列を同定した。 As a result, among the proteins identified as necrosis-specific markers, for peroxiredoxin 4 fragment or ERp29 fragments, as hereinafter identified primary sequence of N-terminal amino acids (nine).
(1)ペルオキシレドキシン4:WETEERPRT (1) peroxiredoxin 4: WETEERPRT
(2)Erp29:LHTKGALPL (2) Erp29: LHTKGALPL

以上の結果に基づき、通常培養のHeLa細胞と比較して2倍以上の蛍光強度があり、ネクローシスを誘導したHeLa細胞内で経時的に増加してくるスポットの中から、本発明の壊死マーカーとして、以下の表1に示すように、9種類(群)の壊死巣特異的マーカータンパク質(限定分解および部分タンパク質を含む)を同定した。 Based on the above results, there is a fluorescence intensity of more than 2-fold compared to HeLa cells usually cultured, from among the spots come increased over time in HeLa cells induced necrosis, as markers of necrosis of the present invention as shown in Table 1 below were identified 9 necrosis-specific marker proteins of the type (s) (including partial hydrolysis and partial proteins). 尚、表1及び表2に掲載した群の中にはタンパク質が複数のGI(GenBank Identifier)番号を有するものがある。 Note that in the groups listed in Table 1 and Table 2 are those proteins having a plurality of GI (GenBank Identifier) ​​number. これは該タンパク質およびそのプレカーサーや変異型が、マススペクトルにおいて同様な結果を示すからである。 This means that said protein and its precursor or variant is because show similar results in the mass spectrum.

2.6 ウエスタンブロッティング法によるタンパク質の同定 質量分析法およびN末端アミノ酸分析により同定した表1に記載の壊死巣特異的マーカータンパク質のうち、市販抗体が入手可能な以下に示す5種類についてウエスタンブロッティング法で確認した。 2.6 Western blotting of the necrosis-specific marker proteins listed in Table 1 identified by the identification mass spectrometry and N-terminal amino acid analysis of the protein by, confirmed by Western blotting for five below commercial antibodies are available did. 具体的には、上記の2.4で得られたタンパク質が転写されたPVDF膜の非特異吸着をブロックエース(UK-B80, DSファーマ)を用いてブロッキングした後、PBS(-)で至適濃度(100〜2,000倍)に希釈した一次抗体を加え、静かに振とうしながら室温で1時間反応させた。 Specifically, after blocking with Block Ace non-specific adsorption of PVDF film obtained proteins were transferred in 2.4 above (UK-B80, DS Pharma), PBS (-) at the optimal concentration ( added primary antibody diluted in 100 to 2,000-fold), was at room temperature and reacted for 1 hour with gentle shaking. PBSTで3回洗浄後、ビオチン標識抗IgG抗体(BA-1400, VECTASTAINN社)を加え、静かに振とうしながら室温で30分間反応させた。 After washing three times with PBST, added biotin-labeled anti-IgG antibody (BA-1400, VECTASTAINN Co.), was gently shaking the reaction for 30 minutes at room temperature. PBSTで3回洗浄後、アビジンービオチン標識西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体溶液(VEC社)を加えて静かに振とうしながら室温で30分間反応させ、PBSTで3回洗浄した後、ペルオキシダーゼの基質である3, 3'-Diaminobenzidine(DAB;SK-4105, VEC社)溶液を加え、発色シグナルが観察されたところでPVDF膜をMilli-Q水に移して発色を停止させた。 After washing three times with PBST, and reacted for 30 minutes at room temperature with gentle shaking in addition avidin chromatography biotinylated horseradish peroxidase complex solution (VEC Co.), washed three times with PBST, a substrate for peroxidase 3, 3'-diaminobenzidine (DAB; SK-4105, VEC Co.) was added and the color development was transferred to PVDF membrane Milli-Q water was stopped when the color signal was observed. ネガティブコントロールとして、抗Bip抗体についてはそのブロッキングペプチド(#1084, Cell Signaling)、抗ペルオキシレドキシン4、抗カルレティクリン及び抗ERp57各抗体に対しては抗マウスIgGコントロール抗体、抗Erp29抗体に対しては抗ウサギIgGコントロール抗体を用いて同様にウエスタンブロッティングを行った。 As a negative control, for the anti-Bip antibody its blocking peptide (# 1084, Cell Signaling), anti peroxiredoxin 4, anti-calreticulin Clean and anti ERp57 anti-mouse IgG control antibody for each antibody against anti Erp29 antibody Western blotting was performed similarly using an anti-rabbit IgG control antibody Te.

使用した一次抗体: The primary antibodies used were:
(1)ペルオキシレドキシン4:Peroxiredoxin 4 antibody [7A1], ab 16943, Abcam (スポット番号1) (1) Peroxiredoxin 4: Peroxiredoxin 4 antibody [7A1], ab 16943, Abcam (spot No. 1)
(2)ERp29:ERp29 antibody, ab40982, Abcam (スポット番号2) (2) ERp29: ERp29 antibody, ab40982, Abcam (spot number 2)
(3)カルレティクリン:Calreticulin mouse mAb, ab54922, Abcam (スポット番号5) (3) calreticulin CLEAN: Calreticulin mouse mAb, ab54922, Abcam (spot number 5)
(4)Bip:Bip(C50B12) Rabbit mAb, #3177, Cell Signaling (スポット番号6) (4) Bip: Bip (C50B12) Rabbit mAb, # 3177, Cell Signaling (spot number 6)
(5)ERp57:Monoclonal Anti-ERp57 (TO-2), E5031, SIGMA (スポット番号9) (5) ERp57: Monoclonal Anti-ERp57 (TO-2), E5031, SIGMA (spot number 9)

ウエスタンブロッティング法により、MSおよびN末端アミノ酸分析により同定された9つのスポットのうち5つのスポットは、それぞれペルオキシレドキシン4、ERp29、カルレティクリン、Bip、ERp57と確認された。 Western blotting, five spots of the nine spots identified by MS and N-terminal amino acid analysis, respectively peroxiredoxin 4, ERp29, calreticulin clinker was determined to Bip, ERp57.

実施例3:モノクローナル抗体の作製 Example 3: Preparation of monoclonal antibody
3.1免疫動物の感作および細胞融合壊死巣特異的マーカーとして同定されたタンパク質のうち、ペルオキシレドキシン4断片またはERp29断片については、実施例2で同定したN末端アミノ酸配列を基にして、各々の配列を認識するマウスモノクローナル抗体を作製した。 3.1 Of the proteins identified as sensitization and cell fusion necrosis specific markers of immunized animals, for the peroxiredoxin 4 fragment or ERp29 fragment, based on the N-terminal amino acid sequence identified in Example 2, each of the to prepare a mouse monoclonal antibody which recognizes the sequence.

ペルオキシレドキシン4断片またはERp29断片の上記N末端9アミノ酸残基と、そのC末端にキャリア高分子(KLH)との結合のためシステイン残基を加えた10残基のペプチドを常法に従って約10mgずつ化学合成し、HPLCを用いて精製し、それら精製ペプチドを抗原ペプチドとした。 Peroxiredoxin 4 fragment or the above N-terminal 9 amino acid residues of ERp29 fragment, about 10mg usual manner a peptide 10 residues plus a cysteine ​​residue for conjugation with a carrier macromolecule (KLH) at its C-terminus by chemically synthesized and purified using HPLC, and their purified peptide antigen peptide. その抗原ペプチドを常法に従ってKLHに架橋し、フロイント完全アジュバント(RM606-1、株式会社三菱化学ヤトロン)と等量で混和してエマルジョン化したものを免疫原とし、メスのマウス一群2匹ずつにそれぞれ50μgずつ投与した。 Crosslinked to KLH the antigen peptide by a conventional method, Freund's complete adjuvant (RM606-1, Mitsubishi Chemical Yatoron) those emulsified by mixing with an equal volume Shun Hara, one by mouse group 2 female It was administered by 50μg respectively. 免疫感作はそれらの免疫原を2日おきに3回、マウスのフットパッド(foot pad)に皮下投与して10日間感作する短期免疫と、1週間おきに3回皮下投与して3週間感作する長期免疫を行った。 Immunized three times their immunogenicity every two days, and short-term immunity to 10 days sensitization subcutaneously administered to the mice of the foot pad (foot pad), 3 weeks and 3 times subcutaneously administered every other week It was long-term immunity to sensitize. 短期免疫では、免疫開始から10日目にマウスの肥大したリンパ節をいくつか摘出し、その内部のリンパ球とミエローマ細胞P3U1との細胞融合を行なった。 In short immunization were excised several mice enlarged lymph nodes on day 10 from immunization was initiated, were performed cell fusion between the inside of the lymphocytes with myeloma cells P3U1. 長期免疫では、免疫開始から21日目に短期免疫と同様にマウスリンパ節を摘出し、その内部のリンパ球とミエローマ細胞P3U1との細胞融合を行なった。 The long-term immunity, like the short-term immunization 21 days after immunization was initiated were excised mouse lymph nodes was performed cell fusion between the inside of the lymphocytes with myeloma cells P3U1.

その結果、ペルオキシレドキシン4断片あるいはERp29断片の抗原ペプチドにKLHを架橋したそれぞれの免疫原を、短期あるいは長期免疫したマウス2匹ずつから調製したリンパ球と、ミエローマ細胞株P3U1との細胞融合から、いずれも約800ウエルでコロニーが形成した。 As a result, each of the immunogens obtained by crosslinking KLH antigen peptides of peroxiredoxin 4 fragment or ERp29 fragment, and lymphocytes prepared from each 2 mice were short or long term immune from cell fusion with myeloma cell line P3U1 both colonies were formed at approximately 800 wells.

3.2 ELISA法によるハイブリドーマのスクリーニング細胞融合後のハイブリドーマは96穴プレートで培養し、通常のHAT培地により選別した。 3.2 Hybridoma After screening cell fusion of hybridomas by ELISA were cultured in 96-well plates, were screened by conventional HAT medium. コロニー形成がみられたウエルの培養上清について、免疫原の抗原ペプチドに結合する抗体を含むかどうか、ELISA法によってスクリーニングした。 The culture supernatants of wells in which colony formation was observed, whether comprising an antibody that binds to the antigen peptide immunogens were screened by ELISA method. ペルオキシレドキシン4断片のN末端ペプチド+システイン(WETEERPRTC)またはERp29断片N末端ペプチド+システイン(LHTKGALPLC)、あるいは新たに化学合成してHPLCで精製したぺルオキシレドキシン4断片のN末端8残基ペプチド(WETEERPR)またはERp29断片N末端8残基ペプチド(LHTKGALP)を200 μg/mlの濃度になるようにPBS(-)で希釈し、その50 μlずつを96穴イムノプレート(Maxisorp, Nunc社)に分注した。 N-terminal 8 residues of peroxiredoxin 4 fragments of the N-terminal peptide + cysteine ​​(WETEERPRTC) or ERp29 fragments N-terminal peptide + cysteine ​​(LHTKGALPLC), or chemically synthesized de novo to peroxycarboxylic TOLEDO connexin 4 fragment was purified by HPLC peptide (WETEERPR) or ERp29 fragments N-terminal 8-residue peptide so that the (LHTKGALP) to a concentration of 200 μg / ml PBS (-) was diluted with, one by the 50 [mu] l 96-well immunoplates (Maxisorp, Nunc Co.) It was dispensed two minutes. 4℃で一晩静置して合成ペプチドをプレートに固定し、PBS(-)で2回洗浄し、ブロックエース(DSファーム)を加えて室温で1時間ブロッキングした後、0.1% Triton-X 100含有PBS(-)(PBST)で2回洗浄した。 4 ° C. and allowed to stand overnight to secure the synthetic peptide to the plate, PBS (-) by washing twice, after 1 hour at room temperature by adding Block Ace (DS farm), 0.1% Triton-X 100 PBS (-) containing washed twice with (PBST). コロニー形成ウエルの培養上清100 μlを加えて室温で1時間インキュベーションした後、PBSTで2回洗浄し、ビオチン標識抗マウスIgG抗体(BA-1400, VEC社)と室温で30分間反応させ、PBSTで3回洗浄した。 After 1 hour incubation at room temperature was added a culture supernatant 100 [mu] l of colonization wells were washed twice with PBST, biotinylated anti-mouse IgG antibody (BA-1400, VEC Co.) and allowed to react for 30 minutes at room temperature, PBST washed in 3 times. さらに、アビジン-ビオチン標識ペルオキシダーゼ複合体溶液(Mouse IgG ABC kit, VECTASTAIN社)と室温で30分間反応させ、PBSTで3回洗浄した後、ペルオキシダーゼの基質である2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS; SK-4500, VEC社)溶液を加えて室温で発色するまでインキュベーションし、マイクロプレートリーダーを用いて、測定波長405 nmの吸光度を測定して各クローンにより生じる吸光度シグナルを評価した。 Further, avidin - biotin-labeled peroxidase complex solution (Mouse IgG ABC kit, VECTASTAIN Co.) and allowed to react for 30 minutes at room temperature, washed 3 times with PBST, 2,2'-Azino-bis (3 a substrate for peroxidase -ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS; SK-4500, VEC Co.) solution was added and incubated until color development at room temperature, using a microplate reader, measuring the absorbance of the measured 405 nm wavelength by each clone It was evaluated and the absorbance signal generated. タイターの高いウエルを選択して、限界希釈法によりモノクローナル抗体産生ハイブリドーマをクローニングした。 Select high titer wells were cloned monoclonal antibody-producing hybridoma by limiting dilution.

ペルオキシレドキシン4断片を免疫したマウスから得たハイブリドーマ培養上清の一次スクリーニングの結果、ペルオキシレドキシン4断片のN末端ペプチド(9アミノ酸残基)にシステインを付加した抗原ペプチドを認識し、KLHを認識しない抗体産生ウエルは短期免疫で2個、長期免疫で33個得られた。 Results of the primary screening of hybridoma culture supernatants peroxiredoxin 4 fragments from immunized mice recognize antigenic peptides obtained by adding a cysteine ​​to the N-terminal peptide of peroxiredoxin 4 fragment (9 amino acid residues), the KLH antibody-producing wells not recognize two short-term immunity was obtained 33 long-term immunity. 同定したペルオキシレドキシン4断片のN末端は通常の限定分解で切断される部位とは異なっていたため、このN末端配列を認識する抗体は壊死巣特異的であり、さらに認識部位を限定するため、2種類のN末端をマスクしたネガティブスクリーニング用ペプチド((Ac)WETEERPRTC, GAVQGWETEERPRTC)を常法に従って化学合成してHPLCで精製し、KLHと架橋したものを96穴プレートに固定してELISA法により二次スクリーニングを行った。 For N-terminal of the identified Peroxiredoxin 4 fragment was different from the site cleaved in the usual limited digestion, antibodies that recognize the N-terminal sequence is necrosis-specific, in order to further limit the recognition site, two N-terminal a masked negative screening peptide ((Ac) WETEERPRTC, GAVQGWETEERPRTC) was chemically synthesized and purified by HPLC according to a conventional method, and two by securing those crosslinked with KLH in 96 well plates ELISA method the next screening was carried out. その結果、同定したN末端(WETEERPRTC)を認識し、2種類のKLHに架橋したネガティブスクリーニング用ペプチド((Ac)WETEERPRTC-KLH、 GAVQGWETEERPRTC-KLH)及びKLHを認識しない抗体産生ウエルが、一次スクリーニングで選択された中から、短期免疫で1個、長期免疫で31個得られた。 As a result, recognizing the identified N-terminal (WETEERPRTC), 2 types of cross-linked negative screening for peptides KLH ((Ac) WETEERPRTC-KLH, GAVQGWETEERPRTC-KLH) and antibody production wells that do not recognize KLH is the primary screening from selected, one short-term immunity was obtained 31 long-term immunity. その中で更に、N末端8アミノ酸残基を認識する抗体産生ウエルは長期免疫で3個得られたが、短期免疫では得られなかった。 Further in which, although antibody production well recognizes the N-terminal 8 amino acid residues obtained three long-term immunity, it was not obtained in the short-term immunity. そこで長期免疫マウスのハイブリドーマから、N末端8アミノ酸残基を認識する抗体産生3ウエルを含め、タイターが高かったウエルを5個選択して限外希釈法によりクローニングし、抗ペルオキシレドキシン4特異的モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを5クローンを取得した。 So from the hybridoma of long immunized mice, including antibody production 3 well recognizes the N-terminal 8 amino acid residues, the well titer was higher five selected and cloned by limiting dilution method, anti peroxiredoxin 4 specific the monoclonal antibody-producing hybridomas were obtained five clones.

又、ERp29断片を免疫したマウスのハイブリドーマ上清の一次スクリーニングの結果、ERp29断片のN末端ペプチド(9アミノ酸残基)にシステインを付加した抗原ペプチドを認識し、KLHを認識しない抗体産生ウエルは短期免疫で39個、長期免疫で21個得られた。 Moreover, the results of the primary screening of hybridoma supernatants of mice immunized ERp29 fragment, recognize antigenic peptides obtained by adding cysteine ​​to ERp29 fragment of N-terminal peptide (9 amino acid residues), antibody production wells that do not recognize KLH short-term 39 immunized, obtained 21 long-term immunity. その中で、N末端8アミノ酸残基を認識する抗体産生ウエルは短期免疫で7個、長期免疫で5個得られ、その中からタイターの高いウエルを、短期免疫から2個、長期免疫から3個選択して限外希釈法によりクローニングし、抗ERp29断片特異的モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを5クローン取得した。 Among them, seven in the N-terminal 8 antibody-producing wells which recognizes amino acids residues short immunity obtained five long-term immunity, a high titer wells among them, two short-term immunization, long-term immunity 3 pieces selected and cloned by limiting dilution method, and the anti ERp29 fragment specific monoclonal antibody-producing hybridoma was five clones acquired.

上記のクローンの代表的なクローンとして、壊死マーカーであるヒトペルオキシレドキシン4(PRDX4)断片に対するマウスモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ(名称:YKP4 C8505 FCS(+))及び壊死マーカーであるヒトErp29断片に対するマウスモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ(名称:YKERp C6707 FCS(+))を千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8、独立行政法人製品評価機構特許微生物寄託センターに、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づき寄託した。 Representative clones of the above clones, human peroxiredoxin 4 (PRDX4) producing mouse monoclonal antibody against a fragment hybridomas that are markers of necrosis: for (name YKP4 C8505 FCS (+)) and human Erp29 fragment is necrotic marker hybridoma producing a mouse monoclonal antibody (name: YKERp C6707 FCS (+)), Chiba Prefecture Kisarazu Kazusa legs bowed in 2-5-8, the National Institute of product evaluation mechanism, Patent microorganisms Depositary Center, the deposit of microorganisms for the Purposes of Patent procedure It was deposited under the Budapest Treaty on the International Recognition of the. 同センターから、夫々、受領番号NITE ABP-1062及び受領番号NITE ABP-1063(受領日:2011年1月20日)として寄託されたことが確認された。 From the center, respectively, receipt number NITE ABP-1062 and receipt number NITE ABP-1063 (receipt date: January 20, 2011) that it has been deposited was confirmed as.

実施例4:モノクローナル抗体および市販抗体による壊死巣およびその周辺組織の免疫染色 Example 4: Monoclonal Antibodies and necrosis with a commercial antibody nest and its surrounding tissue immunostaining
4.1 組織免疫染色法ヒト乳がん組織の癌部と非癌部(N=5)およびヒト肺がん組織の癌部と非癌部(N=5)の組織切片を用いて、壊死巣特異的マーカータンパク質を認識する抗体を評価した。 4.1 using tissue sections of the cancerous part and noncancerous tissue immunostaining human breast cancer tissue (N = 5) and cancer portion and a non-cancerous portion of the human lung cancer tissues (N = 5), the necrosis-specific marker proteins It was evaluated antibodies that recognize. 乳がん患者および肺がん患者由来組織サンプルのパラフィン包埋切片は(株)医学生物学研究所から入手した。 Paraffin-embedded sections of breast cancer patients and lung cancer patient-derived tissue samples were obtained from (Ltd.) Medical and Biological Research Institute. 各組織のパラフィン包埋切片は、キシレンおよびエタノールを用いて常法に従って脱パラフィンし、組織切片をPBS(-)で3回洗浄し、10mM クエン酸バッファー(pH 6.0)で抗原を賦活化し、0.3% H 2 O 2中30分間静置して内在性のペルオキシダーゼを失活させた後、ウマ血清で非特異吸着をブロッキングした。 Paraffin-embedded sections of each tissue, deparaffinized in a conventional manner with xylene and ethanol, the tissue sections were PBS (-) was washed 3 times with, and activation of antigen in 10mM citrate buffer (pH 6.0), 0.3 % after H 2 O 2 for 30 minutes to stand and to inactivate endogenous peroxidase was blocked non-specific adsorption in horse serum. 壊死巣マーカーに対する抗体(ペルオキシレドキシン4断片のN末端ペプチドおよびERp29断片のN末端ペプチドを認識するモノクローナル抗体(実施例3で最終的に得られた、夫々、5クローンの中の一つ)、及び実施例2に記載の5種類の市販抗体)をそれぞれPBS(-)で至適濃度(250〜1,000倍)に希釈して、ブロッキング後の組織切片と室温でそれぞれ1時間反応させた後、PBS(-)で3回洗浄し、ビオチン標識抗IgG抗体(BA-1400, VEC社)と室温で30分反応させた。 Antibodies against necrosis markers (finally obtained in Peroxiredoxin 4 fragments N-terminal peptide and ERp29 fragments N-terminal peptide monoclonal antibody recognizing in (Example 3, one of each, 5 clones), and example 2 to 5 kinds of commercially available antibodies) each described with PBS (-) was diluted to the optimal concentration (250 to 1,000 times), after each reacted at tissue sections at room temperature after the blocking, PBS (-) were washed three times with biotin-labeled anti-IgG antibody (BA-1400, VEC Co.) and reacted for 30 minutes at room temperature. 組織切片をPBS(-)で3回洗浄した後、アビジンービオチン標識西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体(VEC社)と室温で30分間反応させ、PBS(-)で3回洗浄した後、ペルオキシダーゼの基質である3, 3'-Diaminobenzidine(DAB;SK-4105, VEC)溶液を加え、室温で約2分間インキュベーションして組織を免疫染色した。 Tissue sections PBS (-) was washed 3 times with avidin chromatography biotinylated horseradish peroxidase complex (VEC Co.) and allowed to react for 30 minutes at room temperature, PBS (-) After washing three times, with peroxidase substrate there 3, 3'-diaminobenzidine (DAB; SK-4105, VEC) was added, and immunostained tissue was incubated for about 2 minutes at room temperature. 発色した組織切片を蒸留水につけて反応を停止させた後、ヘマトキシリン液で対比染色を行い、非水性封入剤(MGK-S、松浪硝子工)で封入した後、顕微鏡下で組織を観察した。 The reaction with the chromogenic tissue sections in distilled water to stop performs counterstained with hematoxylin solution, was sealed in a non-aqueous mounting medium (MGK-S, Matsunami Glass Engineering), were observed tissue under a microscope.

組織免疫染色の結果を図2に示す。 The results of tissue immunostaining shown in Fig. ペルオキシレドキシン4断片のN末端ペプチド、またはERp29断片のN末端ペプチドを認識するモノクローナル抗体を用いて、ヒト乳がん組織の癌部と非癌部(N=5)およびヒト肺がん組織の癌部と非癌部(N=5)をそれぞれ免疫染色した結果、ヒト乳がん組織およびヒト肺がん組織の壊死巣、あるいはその周辺部の組織に於いて強い染色が認められたが(図2A-a,c,および図2B-a,c)、ヒト乳がんおよび肺がんの非癌部組織は染色されないかまたは染色されても弱かった(図2A-b,d,及び図2B-b,d)。 Using peroxiredoxin 4 fragments N-terminal peptide or ERp29 fragment monoclonal antibody recognizing the N-terminal peptide, the cancer part and noncancerous human breast tissue (N = 5) and human lung tissue cancerous part and the non cancer unit (N = 5) the results of each immunostaining, necrosis of human breast cancer tissues and human lung tissue, or a strong staining was observed at the tissue of its periphery (FIG. 2A-a, c, and Figure 2B-a, c), noncancerous tissue of human breast and lung cancer was weaker be or stained unstained (Figure 2A-b, d, and FIG. 2B-b, d). また、実施例2に記載の5種類の市販抗体(一次抗体)を用いて同様にヒト組織免疫染色した結果、それらの抗体はヒト乳がん組織およびヒト肺がん組織の壊死巣、あるいはその周辺部の組織に於いて強い染色が認められたが、ヒト非癌部では染色されないかまたは染色されても弱い同様の結果が得られた(図2C-図2G)。 Also, five types of commercially available antibodies (primary antibody) result of human tissue immunostaining in a similar manner using the described in Example 2, necrosis of the antibodies are human breast cancer tissues and human lung tissue, or tissue of the peripheral portion a strong staining was observed at the human in noncancerous weak similar results are or stained unstained were obtained (Figure 2C- Figure 2G).

実施例5:モノクローナル抗体の精製ハイブリドーマ(YKP4 C8505 FCS(+)及びYKERp C6707 FCS(+))の各培養上清から、夫々、抗ヒトPRDX4モノクローナル抗体及び抗ヒトErp29モノクローナル抗体をプロテインAカラムで精製した。 Example 5: Monoclonal antibody purification hybridomas (YKP4 C8505 FCS (+) and YKERp C6707 FCS (+)) on each culture supernatant, respectively, the anti-human PRDX4 monoclonal antibody and anti-human Erp29 monoclonal antibody purified on a protein A column did. 即ち、PBS(-)で平衡化したHiTrapAカラム(GE Healthcare社)1mlに培養上清を50ml添加し、PBS(-) 5mlでカラムを洗浄した後、0.17 Mの(pH2.3)緩衝液でカラムから溶出した。 That, PBS (-) equilibrated HiTrapA column (GE Healthcare Inc.) 1 ml culture supernatant was added 50ml with, PBS (-) After washing the column with 5 ml, of 0.17 M (pH 2.3) with buffer It was eluted from the column. 溶出画分は280nmの吸光度でモニタリングしながら1mlずつ分取し、吸光度の高い画分をブラッドフォード法(Protein Assay, Bio-Rad社)で測定して夫々の精製モノクローナル抗体を得た。 The eluted fraction was collected by 1ml while monitoring by absorbance at 280nm was measured with high absorbance fractions Bradford method (Protein Assay, Bio-Rad Co.) to obtain a respective purified monoclonal antibody.

実施例6:モノクローナル抗体のアイソタイプの決定 実施例5で精製した2種類のモノクローナル抗体のアイソタイプをマウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット(MMT1, Serotec社) で確認した。 Example 6: confirmed in monoclonal antibody two purified in determining Example 5 isotypes of monoclonal antibody isotype to mouse monoclonal antibody isotyping kit (MMT1, Serotec Inc.). マニュアルに準じ、精製したモノクローナル抗体150μlを反応チューブに添加して室温で30秒反応させた。 According to the manual, and reacted for 30 seconds at room temperature by the addition of purified monoclonal antibody 150μl to the reaction tubes. 反応液をボルテックスミキサーでよく混和した後、アイソタイピングストリップを反応チューブに入れてアイソタイプを判定した。 After thorough mixing the reaction liquid vortex mixer, to determine the isotype of the isotyping strip placed in a reaction tube. その結果、抗ヒトPRDX4モノクローナル抗体及び抗ヒトErp29モノクローナル抗体のアイソタイプは夫々、IgG1/κ及びIgG2a/κであった。 Consequently, the isotype of the anti-human PRDX4 monoclonal antibody and anti-human Erp29 monoclonal antibodies each was IgG1 / kappa and IgG2a / kappa.

実施例7:抗体の評価 実施例5で得られた精製モノクローナル抗体の親和定数及び解離定数をBIACore システム(Biacore AB Corporation:現在は GEヘルスケア・ジャパン株式会社が供給する)を用いて、表面プラズモン共鳴現象(SPR)を測定することにより得た。 Example 7: Antibody Evaluation Example BIACore system affinity and dissociation constants of the purified monoclonal antibody obtained in 5 (Biacore AB Corporation: Currently GE Healthcare Japan supplied by Ltd.) using a surface plasmon It was obtained by measuring the resonance (SPR). すなわち、抗原となるビオチン化ペプチドを合成して得て、それをHBバッファーで1mg/mlに希釈して作製したペプチド溶液100μlをセンサチップSAにBIACore システムの機器使用マニュアルに従って固定した。 That is, obtained by synthesizing biotinylated peptide of an antigen, which was fixed to the peptide solution 100μl which was prepared by diluting the 1mg / ml in the sensor chip SA in HB buffer according apparatuses using manual BIACore system. 精製したモノクローナル抗体を0.25μg/ml 〜80 μg/mlの濃度範囲で2倍希釈系列を作製し、そのうち45μlをBIACoreシステム(流速30μl/min)に添加してBIACore システムの機器使用マニュアルに従って抗原となるペプチドに対する結合量を測定した。 The purified monoclonal antibody to produce a 2-fold dilution series with a concentration range of 0.25μg / ml ~80 μg / ml, and antigen according to equipment used manual BIACore system of which the addition of 45μl to BIACore system (flow rate 30 [mu] l / min) binding amount was measured with respect to become peptides. その結果、抗ヒトPRDX4モノクローナル抗体の親和定数及び解離定数として1.26 x 10 8及び7.9 x 10 -9を得た(図3)。 As a result, to obtain a 1.26 x 10 8 and 7.9 x 10 -9 as affinity and dissociation constants of anti-human PRDX4 monoclonal antibody (Figure 3).

実施例8:放射線標識モノクローナル抗体を用いる担癌マウスの癌部の検出1)抗ヒトPRDX4モノクローナル抗体及び抗ヒトErp29モノクローナル抗体のIn-111標識 0.05M borate buffer pH8.5に溶解した各IgG抗体と0.05M borate buffer pH8.5に溶解したN-[(R)-2-amino-3-p-isothiocyanato-phenyl]propyl]-trans -(S,S)-cyclohexane-1,2-diamine-pentaacetic acid(DTPA)を、分子量比で1対2.5の割合で混合し、37度で16時間反応させた。 Example 8: and each IgG antibody dissolved in In-111-labeled 0.05 M borate buffer pH 8.5 of radiolabeled monoclonal antibody detection of cancer of the tumor-bearing mice with 1) an anti-human PRDX4 monoclonal antibody and anti-human Erp29 monoclonal antibodies N was dissolved in 0.05M borate buffer pH8.5 - [(R) -2-amino-3-p-isothiocyanato-phenyl] propyl] -trans - (S, S) -cyclohexane-1,2-diamine-pentaacetic acid the (DTPA), were mixed at a ratio of 1 to 2.5 at a molecular weight ratio, and reacted at 37 ° for 16 hours. 塩化インジウム([In-111]Cl 3 )を等量の1M acetate buffer pH6.0と混合し、室温で5分間静置した後、等量の上記DTPAとIgGの反応物を混合し、室温で30分静置した。 Indium chloride ([In-111] Cl 3 ) were mixed with an equal volume of 1M Acetate buffer pH 6.0, allowed to stand at room temperature for 5 minutes, and mixing the reactants in equivalent amounts of the DTPA and IgG, at room temperature It was allowed to stand for 30 minutes. セルロースアセテート電気泳動により、[In-111]DTPA-IgGと[In-111]DTPAに分離し、IgGに結合したDTPAの数を求めた。 The cellulose acetate electrophoresis to separate the [In-111] DTPA-IgG and [In-111] DTPA, was determined the number of DTPA bound to IgG. 上記DTPAとIgGの反応物をSephadex G50担体にアプライし、未結合のDTPAを取り除き、DTPA-IgGを精製した。 The reaction of the DTPA and IgG was applied to a Sephadex G50 carrier, removing unbound DTPA, it was purified DTPA-IgG. この精製DTPA-IgGを上述の方法により、In-111標識し、Sephadex G50担体により、未反応のIn-111を除去した[In-111]DTPA-IgGを使用し、以下の実験を実施した。 This of purified DTPA-IgG aforementioned method, and In-111 labeled by Sephadex G50 carrier, use the [In-111] DTPA-IgG removing the In-111 unreacted, the following experiments were conducted. 図4は、セルロースアセテート電気泳動により精製前と精製後のDTPA-IgGの泳動後のオートラジオグラフィーの写真を示す。 Figure 4 shows a photograph of autoradiography after electrophoresis of DTPA-IgG after purification before and purified by cellulose acetate electrophoresis.

2)In-111標識モノクローナル抗体とHeLa生細胞との反応 5x10 5と5x10 6のHeLa細胞を1% BSA/PBAに懸濁し、[In-111]DTPA-IgGを加え、氷中で1時間インキュベートし、PBSで洗浄し、HeLa細胞に結合した放射活性をガンマカウンターで測定した。 2) In-111-labeled monoclonal antibody reactive 5x10 5 and 5x10 6 HeLa cells with HeLa cells were suspended in 1% BSA / PBA, [In -111] DTPA-IgG was added, incubated for 1 hour on ice , washed with PBS, and the radioactivity bound to HeLa cells in a gamma counter. その結果、標識した抗ヒトPRDX4モノクローナル抗体及び抗ヒトErp29モノクローナル抗体は、生きたHeLa細胞には結合しないことが明らかとなった。 As a result, it labeled anti-human PRDX4 monoclonal antibody and anti-human Erp29 monoclonal antibodies to live HeLa cells revealed that do not bind. 図5には、左が5x10 5のHeLa細胞に、右が5x10 6のHeLa細胞に夫々のIn-111標識モノクローナル抗体(Pで示す)を接触させて結合させた特異的結合率を示す。 5 shows, in HeLa cells left 5x10 5, showing a right-specific binding ratio was bound by contacting the respective In-111-labeled monoclonal antibody (indicated by P) into HeLa cells 5x10 6. IgG2a、E、IgG1はそれぞれ他の抗体を使用した陰性コントロールを示す。 IgG2a, E, IgG1 each represent a negative control using other antibodies. PRDX4及びErp29は細胞内蛋白質であることからHeLa細胞に結合しないことは合理的であり、次に示す担癌動物を用いた試験を進める上での一つの根拠となった。 The PRDX4 and Erp29 not to bind to HeLa cells since an intracellular protein is reasonable, became one of the basis for in advancing tests using tumor-bearing animals following.

3)In-111標識モノクローナル抗体を用いた担癌マウスに於けるイメージング HeLa細胞をBALB/c-nu/nuマウスの皮下に移植し腫瘍を形成させた。 3) In-111 was labeled monoclonal antibodies in imaging HeLa cells tumor-bearing mice using to form an implanted tumor subcutaneously into BALB / c-nu / nu mice. 50μCiの各[In-111]DTPA-IgG(未標識IgGによりタンパク量を12μgに調整)を尾静脈から投与し、投与後1、2、3、4日にレントゲンとガンマ線撮像を実施した。 The (adjusted to 12μg protein amount by unlabeled IgG) was administered from the tail vein each [In-111] DTPA-IgG of 50 .mu.Ci, were carried out X-ray and gamma ray imaging to 1, 2, 3, 4 days after administration. 時間とともに腫瘍の一部に[In-111]DTPA-IgGが集積することが明らかとなった。 Some tumors [In-111] DTPA-IgG was found to integration over time. 図6は、吸入麻酔をしてテープで固定して撮影した、担癌マウスのレントゲン像(左)とガンマ線撮像(右)を示す。 Figure 6 shows shot with taped to the inhalation anesthesia, X-ray image of the tumor-bearing mice (left) and gamma ray imaging (right). 図6では、左から1日目、2日目、3日目、4日目の各々レントゲン像(左)とガンマ線撮像(右)が並んでいる。 6, 1 day after the left, 2 days, 3 days, are lined up each X-ray image of the fourth day (left) and gamma ray imaging (right). 図6の1から4日目の担癌マウスのレントゲン写真(左)では、充分に大きくなったヒト癌が右側の臀部付近に瘤状に写っている。 In radiographs bearing mice (left) 1 from day 4 of FIG. 6, sufficiently large since human cancer is reflected in the bump-like in the vicinity of the right side of the hip. また、ガンマ線撮像(マウス像右)では、ヌードマウスの腫瘍に明瞭な、特に2目から4日目でより明瞭な標識抗ペルオキシレドキシン4(PRDX4)抗体の集積が認められた。 Furthermore, the gamma-ray imaging (mouse image right), clear the tumor in nude mice, clearer labeled anti Peroxiredoxin 4 (PRDX4) accumulation of the antibody was observed in 4 days in particular 2 stitches.

4)In-111標識モノクローナル抗体の集積部位の確認 4) In-111 confirm integration site of the labeled monoclonal antibody
[In-111]DTPA-IgG投与4日目の撮像終了後に、腫瘍を摘出し、凍結標本を複数作製し、作製した複数の標本のうち隣接標本でオートラジオグラフィーとヘマトキシリン・エオシン染色(HE染色)を実施した。 [In-111] after the end of imaging of DTPA-IgG administered 4 day tumors excised and frozen specimens were more prepared, autoradiography and hematoxylin-eosin stained with adjacent samples of the plurality of specimens were prepared (HE staining ) were carried out. 図7では、腫瘍の切片が、左からオートラジオグラフィー、HE染色、その2つの重ね合わせが並べてある。 In Figure 7, sections of tumor, autoradiography from the left, HE staining, the two superposition are arranged. 腫瘍切片のHE染色では、中央付近の壊死部は青色に乏しく弱いが赤色がかった色に、外側の正常な癌組織部位と中央を取り巻く壊死巣周辺部位は赤みがかった青色に染まっていた。 In HE staining of tumor sections, necrosis of the vicinity of the center is weak poor blue color reddish, necrosis near the site surrounding the normal cancerous tissue site and the center of the outer was stained blue to reddish. 図7に示される様に、摘出した腫瘍(大きさ:PRDX4で約13.6mm X 18.3mm、ERp29で約13.5mm X 16.5mm)の中央の壊死部を取り巻く壊死巣周辺部位に[In-111]DTPA-IgGが選択的に集積することが明らかとなった。 As shown in FIG. 7, excised tumors: the necrosis surrounding site surrounding the necrotic portion of the central (size PRDX4 approximately 13.6 mm X 18.3 mm, about 13.5 mm X 16.5 mm in ERp29) [In-111] DTPA-IgG was revealed that selectively accumulated. すなわち、オートラジオグラフィーとHE染色の写真を重ね合わせると、中央付近の壊死巣を取り巻く壊死巣周辺部位にIn-111標識モノクローナル抗体の集積が認められると判断された。 That is, when superimposing the photograph of autoradiographic and HE staining, accumulation of In-111 labeled monoclonal antibody is determined to be observed in necrosis surrounding site surrounding necrotic foci in the vicinity of the center.

5)In-111標識モノクローナル抗体が集積する壊死巣周辺部の細胞の形態 摘出した腫瘍の病理より、核が残っている壊死細胞に[In-111]DTPA-IgGが集積し、核が脱落した壊死細胞には集積しないことが明らかとなった。 5) from the In-111 labeled monoclonal antibodies of the tumors form removal of necrotic foci periphery of cells integrated pathology, necrosis cells remaining nuclei and accumulation [In-111] DTPA-IgG, nuclei were lost the necrotic cells revealed that not integrated. このことは、壊死して時間があまり経過していない細胞及びその近傍に壊死マーカータンパク質が残存していることを示しているものと思われる。 This cellular and necrosis marker protein near that time and necrosis not very lapse is believed to indicate that remaining. すなわち、図8では、中央付近の壊死部では細胞の形態がくずれて核が認められないこと、また壊死部周辺部では細胞の核が認められるが正常な癌細胞と形態が異なること、腫瘍の外側付近の周辺部は核と細胞質が明確であり正常な癌細胞の形態であることがわかる。 That is, in FIG. 8, it is necrosis near the center not observed nuclei break which form cells, Although the cells of the nucleus is observed that normal cancerous cells and forms differ in necrosis periphery, tumor periphery near the outer seen that are in the form of nucleus and cytoplasm is clear normal cancer cells. 図中の顕微鏡写真の中のバーは100ミクロンメーターを示す。 Bar in micrograph in the figure indicate a 100 micron meters.

本発明の壊死マーカー、例えば、タンパク質又はその断片に対応する抗体あるいは抗体を用いることによって、該抗体が認識する壊死巣又はその原因となる病態の進行状況を簡便、迅速に測定できる新規な測定キットを提供することが可能となる。 Necrosis markers of the present invention, for example, proteins or by using antibodies or antibody corresponding to a fragment thereof, conveniently the progress of the condition the antibody is necrosis or cause recognize a novel assay kit to quickly measure it is possible to provide a. このような壊死巣としては、各種固形癌、心筋梗塞又は脳梗塞の壊死巣(組織)のみならず、壊死後性肝硬変、壊死性膵炎、壊死性筋膜炎等の壊死巣、更に、動脈硬化性壊疽、糖尿病性壊疽あるいは閉塞性壊疽における壊死巣も対象となる。 Such necrosis, various solid tumors, not only necrosis of myocardial infarction or cerebral infarction (tissue), necrosis after cirrhosis, necrotizing pancreatitis, necrotic foci such as necrotizing fasciitis, further, arteriosclerosis sex gangrene, necrosis in diabetic gangrene or obstructive gangrene also of interest.

その結果、各種癌マーカーなどに比較して病巣の壊死という観点からより広範な疾病の分野で使用が出来る検出キットやそれら疾病の壊死部位をターゲットとする治療薬開発が可能となる。 As a result, development of therapeutic drugs for the detection kit or necrotic site of their diseases used in the field of broader disease compared like various cancer markers terms of necrosis lesions can target it becomes possible. 例えば、低分子抗体など人工抗体を作製して、従来の高分子である抗体を使用することによって、通常の抗体を使用した場合には高分子であるが故に細胞内に導入することが難しかったのに対して、低分子であるが故により導入し易くやすくなり、更に、このような各種低分子抗体は、組織移行性が高いと考えられ、画像診断用キットもしくは医薬組成物の有効成分として有用である。 For example, to prepare a artificial antibodies and low-molecular antibody, by using an antibody which is a conventional polymer, in the case of the use of conventional antibodies it is difficult to introduce into a cell because it is a high molecular whereas, more likely liable to introduce more because it is a small molecule, further, such various low molecular antibody, as an active ingredient of tissue migration is considered to be high, the image diagnostic kit or pharmaceutical composition it is useful.

Claims (14)

  1. 以下の9つの群に含まれるいずれか一つのアミノ酸配列をコードする遺伝子の発現産物又は該発現産物に対する自己抗体から成る、壊死マーカー: Consisting autoantibodies against expression products or expression product of the gene encoding one of the amino acid sequences either contained in the following nine groups, necrosis markers:
    (1)配列番号1で示されるアミノ酸配列、又は、該アミノ酸配列において一個又は数個のアミノ酸が置換、欠失及び/又は挿入されたアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、該アミノ酸配列とタンパク質としての同一の機能、活性、又は性質を示すアミノ酸配列; (1) amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, or, having one or several amino acids are substituted, deleted and / or inserted amino acid sequence or the amino acid sequence and 90% homology in the amino acid sequence an amino acid sequence, the same function as the amino acid sequence and protein, amino acid sequence shown activity or properties;
    (2)配列番号2〜4のいずれかで示されるアミノ酸配列、又は、各アミノ酸配列において一個又は数個のアミノ酸が置換、欠失及び/又は挿入されたアミノ酸配列若しくは各アミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、各アミノ酸配列とタンパク質としての同一の機能、活性、又は性質を示すアミノ酸配列; (2) the amino acid sequence as shown in any of SEQ ID NO: 2-4, or, one or several amino acids in the amino acid sequence substitutions, deletions and / or insertions in the amino acid sequence or the amino acid sequence at least 90% an amino acid sequence having a homology, identical function as the amino acid sequence and protein, activity or the amino acid sequence indicate the nature;
    (3)配列番号5〜9のいずれかで示されるアミノ酸配列、又は、各アミノ酸配列において一個又は数個のアミノ酸が置換、欠失及び/又は挿入されたアミノ酸配列若しくは各アミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、各アミノ酸配列とタンパク質としての同一の機能、活性、又は性質を示すアミノ酸配列; (3) amino acid sequence shown in any of SEQ ID NO: 5-9, or, one or several amino acids in the amino acid sequence substitutions, deletions and / or insertions in the amino acid sequence or the amino acid sequence at least 90% an amino acid sequence having a homology, identical function as the amino acid sequence and protein, activity or the amino acid sequence indicate the nature;
    (4)配列番号10〜15のいずれかで示されるアミノ酸配列、又は、各アミノ酸配列において一個又は数個のアミノ酸が置換、欠失及び/又は挿入されたアミノ酸配列若しくは各アミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、各アミノ酸配列とタンパク質としての同一の機能、活性、又は性質を示すアミノ酸配列; (4) the amino acid sequence as shown in any of SEQ ID NO: 10-15, or one or several amino acids in the amino acid sequence substitutions, deletions and / or insertions in the amino acid sequence or the amino acid sequence at least 90% an amino acid sequence having a homology, identical function as the amino acid sequence and protein, activity or the amino acid sequence indicate the nature;
    (5)配列番号16〜18のいずれかで示されるアミノ酸配列、又は、各アミノ酸配列において一個又は数個のアミノ酸が置換、欠失及び/又は挿入されたアミノ酸配列若しくは各アミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、各アミノ酸配列とタンパク質としての同一の機能、活性、又は性質を示すアミノ酸配列; (5) the amino acid sequence as shown in any of SEQ ID NO: 16-18, or one or several amino acids in the amino acid sequence substitutions, deletions and / or insertions in the amino acid sequence or the amino acid sequence at least 90% an amino acid sequence having a homology, identical function as the amino acid sequence and protein, activity or the amino acid sequence indicate the nature;
    (6)配列番号19〜22のいずれかで示されるアミノ酸配列、又は、各アミノ酸配列において一個又は数個のアミノ酸が置換、欠失及び/又は挿入されたアミノ酸配列若しくは各アミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、各アミノ酸配列とタンパク質としての同一の機能、活性、又は性質を示すアミノ酸配列; (6) the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NO: 19-22, or one or several amino acids in the amino acid sequence substitutions, deletions and / or insertions in the amino acid sequence or the amino acid sequence at least 90% an amino acid sequence having a homology, identical function as the amino acid sequence and protein, activity or the amino acid sequence indicate the nature;
    (7)配列番号23〜26のいずれかで示されるアミノ酸配列、又は、各アミノ酸配列において一個又は数個のアミノ酸が置換、欠失及び/又は挿入されたアミノ酸配列若しくは各アミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、各アミノ酸配列とタンパク質としての同一の機能、活性、又は性質を示すアミノ酸配列; (7) amino acid sequence shown in any of SEQ ID NO: 23-26, or one or several amino acids in the amino acid sequence substitutions, deletions and / or insertions in the amino acid sequence or the amino acid sequence at least 90% an amino acid sequence having a homology, identical function as the amino acid sequence and protein, activity or the amino acid sequence indicate the nature;
    (8)配列番号27〜29のいずれかで示されるアミノ酸配列、又は、各アミノ酸配列において一個又は数個のアミノ酸が置換、欠失及び/又は挿入されたアミノ酸配列若しくは各アミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、各アミノ酸配列とタンパク質としての同一の機能、活性、又は性質を示すアミノ酸配列; (8) the amino acid sequence as shown in any of SEQ ID NO: 27-29, or one or several amino acids in the amino acid sequence substitutions, deletions and / or insertions in the amino acid sequence or the amino acid sequence at least 90% an amino acid sequence having a homology, identical function as the amino acid sequence and protein, activity or the amino acid sequence indicate the nature;
    (9)配列番号30〜35のいずれかで示されるアミノ酸配列、又は、各アミノ酸配列において一個又は数個のアミノ酸が置換、欠失及び/又は挿入されたアミノ酸配列若しくは各アミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、各アミノ酸配列とタンパク質としての同一の機能、活性、又は性質を示すアミノ酸配列。 (9) the amino acid sequence as shown in any of SEQ ID NO: 30-35, or one or several amino acids in the amino acid sequence substitutions, deletions and / or insertions in the amino acid sequence or the amino acid sequence at least 90% an amino acid sequence having a homology, identical function as the amino acid sequence and protein, activity or amino acid sequence that indicates the nature.
  2. 遺伝子の発現産物が、該遺伝子のmRNA,cDNA,若しくは、それらの部分塩基配列を含む核酸分子、又は、該遺伝子がコードするタンパク質又はその部分ポリペプチドである、請求項1記載の壊死マーカー。 Expression products of gene, mRNA of the gene, cDNA, or nucleic acid molecules including their partial nucleotide sequence, or a protein or its partial polypeptide gene encodes, necrosis marker according to claim 1, wherein.
  3. 配列番号1、又は、配列番号2〜4のいずれか一つで示されるアミノ酸配列を有するタンパク質の部分ポリペプチドから成る、請求項1又は2記載の壊死マーカー。 SEQ ID NO: 1, or consists of partial polypeptide of a protein having an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NO: 2-4, Claim 1 or 2 necrosis markers described.
  4. 請求項1ないし3のいずれか一項に記載の壊死マーカーから選択された一つ又はそれらの任意の組み合わせから成る壊死マーカーの量を測定することにより、壊死巣を検出する方法。 By measuring the amount of necrosis markers consisting of one or any combination thereof selected from necrosis marker according to any one of claims 1 to 3, a method of detecting a necrosis.
  5. (1)試料中に含まれる請求項1ないし3のいずれか一項に記載の壊死マーカーから選択された一つ又はそれらの任意の組み合わせから成る壊死マーカーの濃度を測定し、その測定値が正常レベルよりも上昇していることを指標として壊死巣を検出する、請求項4記載の方法。 (1) the concentration of the necrosis marker consisting of one or any combination thereof selected from necrosis marker according to any one of claims 1 to 3 contained in a sample is measured, the measured value is normally detecting the necrosis as an indication that it is higher than the level, the method of claim 4.
  6. 配列番号1〜35のいずれか一つで示されるアミノ酸配列を有するタンパク質又はその部分ポリペプチドに対する抗体を用いて、該タンパク質又はその部分ポリペプチドの量を測定することを特徴とする、請求項4又は5記載の方法。 Using an antibody against the protein or its partial polypeptide having the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NO: 1-35, and measuring the amount of the protein or its partial polypeptide of claim 4 or 5 method described.
  7. 各遺伝子の発現産物であるタンパク質又はその部分ポリペプチドを抗原として用いて、該発現産物に対する自己抗体から成る壊死マーカーの量を測定する、請求項4又は5記載の方法。 The protein or its partial polypeptide is an expression product of each gene is used as an antigen, determining the amount of necrosis markers consisting of autoantibodies to the expression product, according to claim 4 or 5 method described.
  8. 試料として全血又は血清を使用する、請求項4ないし7のいずれか一項に記載の方法。 Using whole blood or serum as a sample, the method according to any one of claims 4 to 7.
  9. 壊死巣が、各種固形癌、心筋梗塞、脳梗塞、壊死後性肝硬変 (postnecrotic cirrhosis)、壊死性膵炎 (necrotizing pancreatitis)、壊死性筋膜炎 (necrotizing fasciitis)、動脈硬化性壊疽、糖尿病性壊疽、又は、閉塞性壊疽に関連することを特徴とする、請求項4ないし8のいずれか一項に記載の方法。 Necrotic foci, various solid tumors, myocardial infarction, cerebral infarction, necrosis after cirrhosis (postnecrotic cirrhosis), necrotizing pancreatitis (necrotizing pancreatitis), necrotizing fasciitis (necrotizing fasciitis), atherosclerotic gangrene, diabetic gangrene, or, characterized in that associated with obstructive gangrene a method according to any one of claims 4 to 8.
  10. 請求項4ないし8のいずれか一項に記載の方法に用いる検出キットであって、請求項1ないし3のいずれか一項に記載の壊死マーカーと特異的に反応する化合物を含む該キット。 A detection kit used in the method according to any one of claims 4 to 8, the kit comprising a necrosis marker specifically reactive compound according to any one of claims 1 to 3.
  11. 特異的に反応する化合物が抗体である、請求項10記載のキット。 Is specifically compound reactive antibody, claim 10 kit according.
  12. 請求項1ないし4のいずれか一項に記載の壊死マーカーと特異的に反応する化合物と標識化合物又は治療に有効な化合物から成る、画像診断用又は治療用コンジュゲート。 Consisting claims 1 to necrosis markers specifically reactive compound according to any one of 4 and a labeled compound or a compound effective in the treatment, imaging or therapeutic conjugate.
  13. 請求項12に記載のコンジュゲートを活性成分として含む、画像診断用キット又は医薬組成物。 To claim 12 comprising a conjugate according as active ingredient, image diagnostic kit or pharmaceutical composition.
  14. 疾患に関連する壊死を検出する壊死マーカーを同定する方法であって、ヒト細胞を低栄養、低酸素、高密度および足場非依存的な条件下の培養で誘導して得られる壊死細胞が発現するタンパク質と、通常の培養条件で培養した同細胞が発現するタンパク質とを比較して、該壊死細胞においてより高濃度で存在するタンパク質あるいはその断片を該壊死マーカー選択することを特徴とした前記方法。 A method of identifying a necrosis marker for detecting a necrosis associated with a disease, a human cell malnutrition, hypoxia, necrosis cells obtained by inducing a high density and scaffold-independent conditions culture expressing and protein, by comparing the protein the cells cultured to express under normal culture conditions, the method characterized by 該壊 death marker selecting proteins or fragments thereof present in higher concentration in 該壊 dead cells.
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