JP2011110134A - Light irradiation device - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、メラノーマや、メラニン等の色素を有する細胞を識別してアポトーシスさせるための光照射装置に関する。 The present invention relates to a light irradiation apparatus for identifying and causing apoptosis of cells having pigments such as melanoma and melanin.
医療分野において、メラノーマ（皮膚癌）の治療は、薬剤を用いて行うことが多い。例えば、レチノイド化合物を含有する薬剤のメラニン合成を抑制する効果により、対象細胞のアポトーシスを誘導し、メラノーマの治療を行う方法が提案されている（特許文献１参照）。また、メラノーマであるかどうかの判定は医師の経験に基づき、その色、コントラストから判断されている。 In the medical field, melanoma (skin cancer) is often treated with drugs. For example, a method for treating melanoma by inducing apoptosis of target cells by the effect of suppressing melanin synthesis of a drug containing a retinoid compound has been proposed (see Patent Document 1). The determination of whether or not the melanoma is based on the color and contrast based on the experience of the doctor.
しかしながら、効率良く識別するために、メラノーマを自動で識別できることが望まれている。 However, in order to identify efficiently, it is desired that melanoma can be automatically identified.
本発明は上記課題を解決するためになされたものであり、本発明に係る光照射装置は、色素を有する細胞の位置及び大きさを計測する手段と、色素を有する細胞の色素の吸収波長を含む可視光を照射する手段と、を備え、可視光を照射することにより色素を有する細胞をアポトーシスさせることを特徴とする。 The present invention has been made to solve the above problems, and the light irradiation apparatus according to the present invention includes means for measuring the position and size of a cell having a dye, and the absorption wavelength of the dye of the cell having the dye. And a means for irradiating visible light, and by irradiating visible light, cells having a dye are allowed to undergo apoptosis.
本発明によれば、メラノーマの識別を自動で行い、メラノーマに光を照射することでアポトーシスに誘導することが可能な光照射装置を提供することができる。 According to the present invention, it is possible to provide a light irradiation apparatus that can automatically identify melanoma and induce apoptosis by irradiating the melanoma with light.
以下、本発明に係る光照射装置について添付図面に示す実施の形態に基づいて説明する。図１は本発明の実施の形態に係る光照射装置１の構成を示す概要図、図２は、図１に示す光照射装置１の照射位置制御ユニット４を下から見た概要図である。 Hereinafter, a light irradiation apparatus according to the present invention will be described based on an embodiment shown in the accompanying drawings. FIG. 1 is a schematic view showing a configuration of a light irradiation apparatus 1 according to an embodiment of the present invention, and FIG. 2 is a schematic view of the irradiation position control unit 4 of the light irradiation apparatus 1 shown in FIG.
本発明の実施の形態に係る光照射装置１は、皮膚表面７に光を照射する処置用光源２と、ハーフミラー３と、照射位置制御ユニット４と、皮膚表面７のメラノーマなどの色素を有する細胞を含む黒色部８の位置及び大きさを計測する手段である撮影用光源５及びＣＣＤカメラ６とを備える。 The light irradiation apparatus 1 according to the embodiment of the present invention includes a treatment light source 2 that irradiates light on the skin surface 7, a half mirror 3, an irradiation position control unit 4, and a pigment such as melanoma on the skin surface 7. The light source 5 for imaging | photography and CCD camera 6 which are means to measure the position and magnitude | size of the black part 8 containing a cell are provided.
光を照射する処置用光源２は、メラニン等の色素を有する細胞の色素の吸収波長を含む可視光を照射する手段である。処置用光源２によって可視光を照射することにより、色素を有する細胞をアポトーシスさせる。 The treatment light source 2 for irradiating light is a means for irradiating visible light including an absorption wavelength of a pigment of a cell having a pigment such as melanin. By irradiating visible light with the treatment light source 2, the cells having the dye are allowed to undergo apoptosis.
図２に示すように、照射位置制御ユニット４は、例えば、筐体４ａと、可変の光透過窓４ｂと、光透過窓４ｂの大きさを調節する４枚の遮蔽用板４ｃを備える。遮蔽用板４ｃは、４つのモータ４ｄによって制御される。それぞれのモータ４ｄは、遮蔽用板４ｃの出し入れを行い、認識した照射対象である黒色部８の中心座標と面積から光透過窓４ｂの位置と外接四角形の大きさになるように制御する。ＣＣＤカメラ６によって撮影する時は、照射位置制御ユニット４の光透過窓４ｂは全開状態であり、ＣＣＤカメラ６で対象部位全体を撮影することができる。ＣＣＤカメラ６で得られた画像は、図示しない画像処理部で処理され、画像表示装置に表示される。 As shown in FIG. 2, the irradiation position control unit 4 includes, for example, a housing 4a, a variable light transmission window 4b, and four shielding plates 4c that adjust the size of the light transmission window 4b. The shielding plate 4c is controlled by four motors 4d. The respective motors 4d take in and out the shielding plate 4c, and control the position of the light transmission window 4b and the size of the circumscribed rectangle from the center coordinates and area of the recognized black portion 8 as the irradiation target. When photographing with the CCD camera 6, the light transmission window 4 b of the irradiation position control unit 4 is in a fully opened state, and the entire target region can be photographed with the CCD camera 6. An image obtained by the CCD camera 6 is processed by an image processing unit (not shown) and displayed on an image display device.
本発明の実施の形態に係る光照射装置１によるメラノーマの識別は、撮影のために撮影用光源５からの白色光を皮膚表面７に照射して対象部位の画像をＣＣＤカメラ６によって撮影し、メラニン色素により黒くなっている黒色部８と、それ以外の肌色の部分をその境界部のコントラストから判断する。撮影用光源５は、例えば白色ＬＥＤが用いられ、皮膚表面７に対して４５°の角度に配置されている。ＣＣＤカメラ６は、撮影用光源５から破線１０で示す照射光が皮膚表面７に当たって反射した拡散反射光１１を計測して、皮膚表面７の黒色部８の位置及び大きさを計測する。黒色部８は色素としてメラニンを含む。メラニンの種類は人種等によって異なり、例えば黒色系のユーメラニン、赤色系のフェオメラニンがあげられる。シミ等の色素沈着は主としてメラニンを含む。メラニン色素を産生するメラノサイトががん化したものがメラノーマであり、メラノーマもメラニンを含む。 Melanoma identification by the light irradiation device 1 according to the embodiment of the present invention is performed by irradiating the skin surface 7 with white light from the light source 5 for photographing and photographing an image of the target portion with the CCD camera 6. The black part 8 which is blackened by the melanin pigment and the other skin color part are judged from the contrast of the boundary part. For example, a white LED is used as the imaging light source 5 and is disposed at an angle of 45 ° with respect to the skin surface 7. The CCD camera 6 measures the position and size of the black portion 8 of the skin surface 7 by measuring the diffuse reflected light 11 reflected by the irradiation light indicated by the broken line 10 from the imaging light source 5 and hitting the skin surface 7. The black part 8 contains melanin as a pigment. The type of melanin varies depending on the race, and examples thereof include black eumelanin and red pheomelanin. Pigmentation such as spots mainly contain melanin. Melanoma is a cancerous melanocyte that produces melanin, and melanoma also contains melanin.
ＣＣＤカメラ６で得られた画像より、正常皮膚である肌色の部分と、色素を有する細胞を含む黒色部８を認識する。画像処理部において、黒色部８がシミ等の色素沈着であるか、それともメラノーマであるかを識別する。コントラストで判断するための閾値は、明らかにシミ等の色素沈着と判断できる部分を予め計測することで対象者の肌色を基準とした閾値を設定する。例えば、メラノーマ処置のためには、メラノーマと判断された領域に４００〜１２００ｎｍ、発光時間１ｍｓ、エネルギー０．３Ｊ／ｃｍ2の光を複数回照射する。この波長帯は可視光全てを含み、メラノーマの色素に吸収させることができる。また、エネルギーが弱いため組織破壊を起こすことなく、メラノーマのアポトーシスを誘導することができる。 From the image obtained by the CCD camera 6, a skin-colored portion which is normal skin and a black portion 8 including cells having pigment are recognized. In the image processing unit, it is identified whether the black portion 8 is a pigmentation such as a stain or a melanoma. The threshold for determining the contrast is set based on the skin color of the subject by measuring in advance a portion that can be clearly determined as pigmentation such as a stain. For example, for the treatment of melanoma, light having a wavelength of 400 to 1200 nm, a light emission time of 1 ms, and energy of 0.3 J / cm 2 is irradiated a plurality of times to a region determined to be melanoma. This wavelength band includes all visible light and can be absorbed by melanoma pigments. Moreover, since the energy is weak, apoptosis of melanoma can be induced without causing tissue destruction.
メラノーマを認識する方法について、より具体的に説明する。 A method for recognizing melanoma will be described more specifically.
最初に、色素沈着と断定できる部位をＣＣＤカメラ６によって撮影する。得られた画像を処理し、肌色部と黒色部８のコントラスト（濃淡変化率＝ｋ）を計測する。濃淡変化率ｋは色素沈着の場合はゆるやかになっている。このデータを記憶させる。次に、黒色部８を撮影する。同様に肌色部と黒色部８の濃淡変化率Ｍを求める。メラノーマは肌色部とのコントラストが色素沈着よりも高いことは臨床上知られている。予め設定した閾値調整パラメータαを使い、Ｍ＞α×ｋ（αは、１以上の数値。メラニン識別のための閾値調整パラメータであり、医師が任意に設定できる。）かどうかを判断する。この条件を満たす場合には、メラノーマと判断する。また、メラノーマ中心座標と外接四角形を画像処理による計算で求めておく。 First, a part that can be determined as pigmentation is photographed by the CCD camera 6. The obtained image is processed, and the contrast (shading change rate = k) between the skin color part and the black part 8 is measured. The shade change rate k is gentle in the case of pigmentation. This data is stored. Next, the black portion 8 is photographed. Similarly, the density change rate M of the skin color portion and the black portion 8 is obtained. It is clinically known that melanoma has a higher contrast with skin color than pigmentation. A threshold adjustment parameter α set in advance is used to determine whether M> α × k (α is a numerical value of 1 or more. This is a threshold adjustment parameter for melanin identification and can be arbitrarily set by a doctor). If this condition is met, it is determined as a melanoma. Further, the melanoma center coordinates and the circumscribed rectangle are obtained by calculation by image processing.
黒色部８がメラノーマと判断された場合には、黒色部８の面積と位置を画像処理で求める。黒色部８の位置情報に基づいて照射位置制御ユニット４が移動し、黒色部８の面積から発光部前面の絞りを調節する。照射する面積は、メラニンを含む黒色部８とその周囲に存在するメラニン生成細胞（エイメラノティックメラノサイト）に照射するために、黒色部８の面積よりもやや大きな面積とする。 When the black portion 8 is determined to be a melanoma, the area and position of the black portion 8 are obtained by image processing. The irradiation position control unit 4 moves based on the position information of the black portion 8 and adjusts the diaphragm on the front surface of the light emitting portion from the area of the black portion 8. The area to be irradiated is set to be slightly larger than the area of the black portion 8 in order to irradiate the black portion 8 including melanin and the melanin producing cells (emelanotic melanocytes) existing around the black portion 8.
メラノーマであるかどうかを判断するために皮膚表面７を撮影する際は、照射位置制御ユニット４の光透過窓４ｂは全開状態である。黒色部８及びその周囲に光照射する際には、その位置情報及び大きさ等により適宜調節する。 When photographing the skin surface 7 in order to determine whether or not it is a melanoma, the light transmission window 4b of the irradiation position control unit 4 is fully opened. When the black portion 8 and its surroundings are irradiated with light, the black portion 8 and its surroundings are appropriately adjusted depending on the position information and size.
次に、メラノーマに処置用光源２からキセノンフラッシュ光を照射する。キセノンフラッシュ管は円柱状の形状をしており、全周囲に発光する。このため、処置用光源２には反射傘２ａ配置し、反射傘２ａで反射方向を制御し、発光面である程度均一な配光分布となるような光学系を使用する。照射光１２は、ハーフミラー３によって照射方向を調節し、照射位置に対して適切な光量分布を有するように光学設計する。キセノンフラッシュ光による照射は、メラノーマ細胞のアポトーシスという効果を出すために、５０〜１００回行うことが望ましい。 Next, the melanoma is irradiated with xenon flash light from the treatment light source 2. The xenon flash tube has a cylindrical shape and emits light all around. For this reason, the treatment light source 2 is provided with a reflector 2a, the reflection direction is controlled by the reflector 2a, and an optical system is used that has a somewhat uniform light distribution on the light emitting surface. The irradiation light 12 is optically designed so as to have an appropriate light amount distribution with respect to the irradiation position by adjusting the irradiation direction by the half mirror 3. Irradiation with xenon flash light is desirably performed 50 to 100 times in order to produce an effect of apoptosis of melanoma cells.
このように、本発明の実施の形態に係る光照射装置１を肌に照射することにより、メラノーマの識別を自動で行い、その部位に光を照射することで、メラノーマ等の色素を有する細胞のみをアポトーシスに誘導することが可能となる。 In this way, by irradiating the skin with the light irradiation device 1 according to the embodiment of the present invention, the melanoma is automatically identified, and only the cells having a pigment such as melanoma are irradiated with the light. Can be induced in apoptosis.
以下、実施例により本発明の実施の形態に係る光照射装置について更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。 Hereinafter, although the light irradiation apparatus which concerns on embodiment of this invention is demonstrated more concretely according to an Example, the scope of the present invention is not limited to these.
本発明の実施の形態に係る光照射装置によるメラノーマ細胞のアポトーシス効果を確認するために、次に説明する評価試験を行なった。 In order to confirm the apoptotic effect of the melanoma cells by the light irradiation apparatus according to the embodiment of the present invention, the following evaluation test was performed.
＜Ｂ１６メラノーマ細胞の播種＞
１．Ｂ１６メラノーマ株細胞（理化学研究所バイオリソースセンター）の培養は、FBS（BioWest社）を10％含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、WAKO社）を用い、９０ｃｍシャーレ（TPP社）に播種し、３７℃、９５％空気と５％ＣＯ2の気相下のＣＯ2インキュベーター（エスペック社）で行った。十分コンフルエントになるまで培養した（約４日間）後、実験に供した。実験には継代２〜３代目の細胞を用いた。培地をアスピレーターで除き、カルシウム・マグネシウム不含リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（−））を加え、培地を取り除いた。
２．ＰＢＳ（−）を除き、もう一度ＰＢＳ（−）を加えた。
３．３分程度、ＣＯ2インキュベーターに静置した。
４．細胞解離剤（ACCUMAX、Innovative Cell Technologies, Inc.）によって細胞を解離し、（４℃、３００×ｇ、５ｍｉｎ）で遠心した。
５．細胞数を血球計算盤でカウントした。
６．９６ウェルプレート（TPP社）に１ウェルあたり８×１０3細胞（１００ｍｌ／ｗｅｌｌ）を播種した。
７．乾燥を防ぐために、細胞を播種していないウェルにはＰＢＳ（−）を入れた。
８．３７℃のＣＯ2インキュベーターで１日培養した。
<B16 melanoma cell seeding>
1. B16 melanoma cell line (RIKEN BioResource Center) was cultured in a 90 cm Petri dish (TPP) using Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM, WAKO) containing 10% FBS (BioWest) at 37 ° C. In a CO 2 incubator (Espec Corp.) under a gas phase of 95% air and 5% CO 2 . After culturing until fully confluent (about 4 days), it was subjected to the experiment. Cells from passage 2 to 3 were used for the experiment. The medium was removed with an aspirator, calcium / magnesium-free phosphate buffered saline (PBS (−)) was added, and the medium was removed.
2. PBS (-) was removed and PBS (-) was added once more.
3.3 It was allowed to stand in a CO 2 incubator for about 3 minutes.
4). Cells were dissociated with a cell dissociator (ACCUMAX, Innovative Cell Technologies, Inc.) and centrifuged at (4 ° C., 300 × g, 5 min).
5. The number of cells was counted with a hemocytometer.
6. A 96-well plate (TPP) was seeded with 8 × 10 3 cells (100 ml / well) per well.
7). In order to prevent drying, PBS (-) was added to wells not seeded with cells.
8. The cells were cultured for one day in a 37 ° C. CO 2 incubator.
＜照射＞
１．後述する照射装置を用いて照射をする前に、ウェル内の培地を取り除き、カルシウム・マグネシウム不含リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（＋））で洗浄した。
２．洗浄した後に再びＰＢＳ（＋）を加えた。
３．クリーンベンチ内でディッシュの下から照射を行なった。照射装置は、４００〜１２００ｎｍの波長の光を、半値幅が６００μｓのパルスとして付与する光源を用い、発光時間１ｍｓとし、光源から付与された光のパルスを、出射面から５ｍｍの距離に０．３Ｊ／ｃｍ2のエネルギー強度で分布させる設定とした。照射は、１００％の光量で１回光を照射した例、１００％の光量で５０回光を照射した例、２５％の光量で１回光を照射した例、２５％の光量で５０回光を照射した例の４種類を設定し、それぞれ３連で行った。
４．照射後、ＰＢＳ（＋）を除き、培地を添加した。
５．照射しないウェル（ネガティブコントロール）についても、照射した他のウェルと同様にＰＢＳ（＋）で洗浄した後、ＰＢＳ（＋）を加えて照射時間と同じ時間放置し、その後培地に置き換えた。
６．３７℃のＣＯ2インキュベーターで２日間培養した。
<Irradiation>
1. Prior to irradiation using the irradiation apparatus described later, the medium in the well was removed and washed with calcium / magnesium-free phosphate buffered saline (PBS (+)).
2. After washing, PBS (+) was added again.
3. Irradiation was performed from under the dish in a clean bench. The irradiation apparatus uses a light source that applies light having a wavelength of 400 to 1200 nm as a pulse having a half width of 600 μs, has a light emission time of 1 ms, and applies a pulse of light applied from the light source to a distance of 0.5 mm from the emission surface. The distribution was set at an energy intensity of 3 J / cm 2 . Irradiation is an example in which light is irradiated once with a light amount of 100%, an example in which light is irradiated 50 times with a light amount of 100%, an example in which light is irradiated once with a light amount of 25%, and light 50 times with a light amount of 25%. Four types of examples of irradiation were set, and each was performed in triplicate.
4). After irradiation, PBS (+) was removed and medium was added.
5. Wells that were not irradiated (negative control) were washed with PBS (+) in the same manner as other irradiated wells, then PBS (+) was added and left for the same time as the irradiation time, and then replaced with the medium.
6. Cultured in a CO 2 incubator at 37 ° C. for 2 days.
＜ 細胞生存度測定（ＷＳＴ−１測定）＞
１．１０ｕｌのＷＳＴ−１試薬（同人化学研究所）を各ウェルに入れた。
２．３７℃のＣＯ2インキュベーターに４時間静置した。
３．４５０ｎｍの吸光度をプレートリーダー（Bio-Rad社）で測定した。
<Cell viability measurement (WST-1 measurement)>
1.10 ul of WST-1 reagent (Doujin Chemical Laboratory) was placed in each well.
2. Placed in a 37 ° C. CO 2 incubator for 4 hours.
3. Absorbance at 450 nm was measured with a plate reader (Bio-Rad).
図３に、メラノーマ細胞に光を照射した後の吸光度を測定した結果を示す。図３において、各例について吸光度の測定結果（ｎ＝３）の平均値と標準偏差で表わした。図３に示すように、３Ａで表す１００％の光量で１回光を照射した例、３Ｃで表す２５％の光量で１回光を照射した例、３Ｄで表す２５％の光量で５０回光を照射した例では、３Ｅで表すネガティブコントロールと比較して吸光度に大きな差異が見られなかった。これに対し、３Ｂで表す１００％の光量で５０回光を照射した例では、３Ｅで表すネガティブコントロールと比較して吸光度が小さかった。 In FIG. 3, the result of having measured the light absorbency after irradiating light to a melanoma cell is shown. In FIG. 3, the average value and standard deviation of the absorbance measurement results (n = 3) are shown for each example. As shown in FIG. 3, an example in which light is irradiated once with a light amount of 100% represented by 3A, an example in which light is irradiated once by a light amount of 25% represented by 3C, and a light having 50 times light by 25% light amount represented by 3D In the case of irradiation, no significant difference was observed in absorbance compared to the negative control represented by 3E. On the other hand, in the example in which light was irradiated 50 times with a light amount of 100% represented by 3B, the absorbance was smaller than that of the negative control represented by 3E.
１００％の光量で１回光を照射した例、及び１００％の光量で５０回光を照射した例について、照射後の細胞を顕微鏡で観察した。顕微鏡観察は、Nikon DIAPHOT倒立顕微鏡の4倍の対物レンズで観察を行った。図４に観察結果を示す。図４（ａ）は１００％の光量で１回光を照射した後を示している。４Ａで示す細胞は密度が高く、吸光度も２．３９８であった。これに対し、１００％の光量で５０回光を照射した図４（ｂ）〜（ｄ）では、４Ｂ、４Ｃ、４Ｄで示す細胞の密度が低くなっていた。また、吸光度は０．５９０、０．３０５、１．８４１であった。このことから、５０回光を照射したことにより、メラノーマ細胞が死んでいることがわかった。 About the example which irradiated light once with the light quantity of 100%, and the example irradiated with light 50 times with the light quantity of 100%, the cell after irradiation was observed with the microscope. The microscope was observed with an objective lens 4 times that of the Nikon DIAPHOT inverted microscope. FIG. 4 shows the observation results. FIG. 4A shows a state after light is irradiated once with a light amount of 100%. The cell indicated by 4A had a high density and an absorbance of 2.398. In contrast, in FIGS. 4B to 4D in which light was irradiated 50 times with a light amount of 100%, the density of cells indicated by 4B, 4C, and 4D was low. Moreover, the light absorbency was 0.590, 0.305, and 1.841. From this, it was found that melanoma cells were dead after 50 times of light irradiation.
このように、１００％の光量で５０回光を照射した場合には、メラノーマ細胞がアポトーシスしている可能性があった。 Thus, when light was irradiated 50 times with a light amount of 100%, there was a possibility that melanoma cells were apoptotic.
以上、本実施の形態について説明したが、上記実施の形態の開示の一部をなす論述及び図面はこの発明を限定するものであると理解するべきではない。この開示から当業者には様々な代替実施の形態、実施例及び運用技術が明らかとなろう。 Although the present embodiment has been described above, it should not be understood that the description and the drawings, which form part of the disclosure of the above embodiment, limit the present invention. From this disclosure, various alternative embodiments, examples and operational techniques will be apparent to those skilled in the art.
１…光照射装置
２…処置用光源
２ａ…反射傘
３…ハーフミラー
４…照射位置制御ユニット
４ａ…筐体
４ｂ…光透過窓
４ｃ…遮蔽用板
４ｄ…モータ
５…撮影用光源
６…ＣＣＤカメラ
７…皮膚表面
８…黒色部
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 ... Light irradiation apparatus 2 ... Treatment light source 2a ... Reflector 3 ... Half mirror 4 ... Irradiation position control unit 4a ... Case 4b ... Light transmission window 4c ... Shielding plate 4d ... Motor 5 ... Imaging light source 6 ... CCD camera 7… Skin surface 8… Black part
Claims (4)
前記色素を有する細胞の色素の吸収波長を含む可視光を照射する手段と、を備え、
前記可視光を照射することにより前記色素を有する細胞をアポトーシスさせることを特徴とする光照射装置。 Means for measuring the location and size of cells with pigments;
A means for irradiating visible light including the absorption wavelength of the dye of the cell having the dye,
A light irradiation apparatus characterized by causing apoptosis of cells having the dye by irradiating the visible light.
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| JP2018068924A (en) * | 2016-11-04 | 2018-05-10 | サンエレクトロニクス株式会社 | Electronic warm moxibustion unit |
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