JP2011045302A - Microorganism enzyme preparation and method for producing the same - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、酵素製剤として有用な、活性型カテコールオキシダーゼを含有する微生物組成物およびその製造方法に関する。また本発明はかかる微生物組成物を有効成分とする酵素製剤に関する。さらに本発明は、カテコールオキシダーゼを含有する微生物組成物を対象として、微生物組成物におけるカテコールオキシダーゼ活性を向上させる方法に関する。 The present invention relates to a microbial composition containing active catechol oxidase useful as an enzyme preparation and a method for producing the same. The present invention also relates to an enzyme preparation comprising such a microbial composition as an active ingredient. Furthermore, the present invention relates to a method for improving catechol oxidase activity in a microbial composition targeting a microbial composition containing catechol oxidase.
メラニンは、動物及び植物に広く存在する生体由来の黄色〜黒色の色素である。安全性が高く、且つ紫外線吸収機能、ラジカル捕獲機能、および酸化防止機能などの有用な機能を有することから、化粧品や食品等の添加剤として広く使用されている。 Melanin is a yellow to black pigment derived from living organisms widely present in animals and plants. Since it has high safety and has useful functions such as an ultraviolet absorption function, a radical scavenging function, and an antioxidant function, it is widely used as an additive for cosmetics and foods.
図１に示すように、生体内において、メラニンは、メラニン生成酵素であるチロシナーゼが、チロシン又は3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)アラニン（以下、単に「DOPA」ともいう）等の基質化合物の酸化反応を触媒することによって生成する。具体的には、メラニンは、チロシナーゼが上記基質化合物の酸化を触媒することによって生じるメラニン前駆体（ドーパクロム、5,6-ジヒドロキシインドール-2-カルボン酸、5,6-ジヒドロキシインドールなど）が、酸素の影響を受けて重合することにより生合成される。 As shown in FIG. 1, in vivo, melanin is a melanin-producing enzyme, tyrosinase, which is a substrate compound such as tyrosine or 3- (3,4-dihydroxyphenyl) alanine (hereinafter also simply referred to as “DOPA”). It is produced by catalyzing the oxidation reaction. Specifically, melanin is a melanin precursor (dopachrome, 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid, 5,6-dihydroxyindole, etc.) produced by tyrosinase catalyzing the oxidation of the above-mentioned substrate compound. It is biosynthesized by polymerizing under the influence of.
上記反応において中間体として生成するメラニン前駆体もまた染毛剤、特に空気酸化型染毛剤の色素成分として広く使用されている。これは、メラニン前駆体が、空気中の酸素により速やかに重合してメラニン色素に変換する性質を利用したものである。 Melanin precursors that are produced as intermediates in the above reaction are also widely used as dye components in hair dyes, particularly air oxidation hair dyes. This utilizes the property that a melanin precursor is rapidly polymerized by oxygen in the air and converted into a melanin pigment.
かかるメラニン前駆体及びメラニンの製造方法としては、化学合成反応による方法があるが、副反応による収率の低下、目的反応生成物の単離に要する時間的負担、反応溶剤の残留による安全性や環境への悪影響が懸念されるなどといった問題がある。一方、酵素反応によるメラニン前駆体及びメラニンの製造方法としては、例えば特許文献１に、チロシンやDOPA等の基質化合物を、カテコールオキシダーゼ活性を示す細胞を用いて酸化してメラニン前駆体に変換する方法が記載されており、かかる方法によれば、上記化学合成反応の場合に生じる問題がなく、比較的効率よくメラニン前駆体を生成することができる。 As a method for producing such melanin precursor and melanin, there is a method by a chemical synthesis reaction. However, a reduction in yield due to side reactions, a time burden required for isolation of a target reaction product, safety due to residual reaction solvent, There are problems such as concerns over adverse environmental impacts. On the other hand, as a method for producing a melanin precursor and melanin by an enzymatic reaction, for example, Patent Document 1 discloses a method in which a substrate compound such as tyrosine or DOPA is oxidized and converted into a melanin precursor using cells exhibiting catechol oxidase activity. According to such a method, there is no problem that occurs in the case of the chemical synthesis reaction, and a melanin precursor can be generated relatively efficiently.
しかしながら、かかる酵素反応、特に酵素を産生する微生物を用いてメラニン前駆体を工業的に製造するためには、酵素の反応性をより一層高める必要があり、高い酵素活性を有する微生物酵素製剤の開発が要望されている。 However, in order to industrially produce melanin precursors using such enzyme reactions, especially microorganisms that produce enzymes, it is necessary to further increase the reactivity of the enzymes, and the development of microbial enzyme preparations with high enzyme activity Is desired.
上記特許文献１に記載されているチロシナーゼ等の銅を補因子として含むカテコールオキシダーゼは、細胞内で不活性型のアポ酵素として生成されるため、これを酵素製剤として使用するためには、このアポ酵素を活性型のホロ酵素に変換する必要がある。かかる方法としては、まずアポ酵素に銅イオンを取り込ませ、次いで酸処理を施す方法が有効である（特許文献１、実施例３）。しかしながら、本発明者らの試験によると、後述する実験例１に示すように、上記特許文献１の実施例３に記載する手順に従って活性化処理しても、十分な活性化ができないことがわかった。 Since catechol oxidase containing copper as a cofactor such as tyrosinase described in Patent Document 1 is produced as an inactive apoenzyme in cells, in order to use it as an enzyme preparation, It is necessary to convert the enzyme into an active holoenzyme. As such a method, it is effective to first incorporate copper ions into the apoenzyme and then to perform acid treatment (Patent Document 1, Example 3). However, according to the tests by the present inventors, it is found that sufficient activation cannot be achieved even if the activation treatment is performed according to the procedure described in Example 3 of Patent Document 1 as shown in Experimental Example 1 described later. It was.
そこで本発明は、チロシナーゼ等のカテコールオキシダーゼを含有する微生物組成物を対象として、微生物組成物におけるカテコールオキシダーゼ活性を向上させるための方法を提供することを目的とする。また本発明は、メラニン前駆体およびメラニンの製造を効率的に製造するにあたって酵素製剤として有用な微生物組成物、特により多くの活性型カテコールオキシダーゼを含有することで高いカテコールオキシダーゼ活性を有する微生物組成物、およびその製造方法を提供することを目的とする。さらに本発明は、当該微生物組成物を有効成分とする酵素製剤を提供することを目的とする。 Therefore, an object of the present invention is to provide a method for improving catechol oxidase activity in a microbial composition targeting a microbial composition containing a catechol oxidase such as tyrosinase. The present invention also relates to a microbial composition useful as an enzyme preparation for efficiently producing a melanin precursor and melanin, particularly a microbial composition having a high catechol oxidase activity by containing more active catechol oxidase. And a method of manufacturing the same. Furthermore, this invention aims at providing the enzyme formulation which uses the said microorganisms composition as an active ingredient.
本発明者らは、上記目的を達成すべき鋭意検討を進めていたところ、カテコールオキシダーゼを産生する微生物、特にチロシナーゼを産生する酵母を、上記の特許文献１に記載する方法で活性化処理する前に、予め冷凍若しくは乾燥処理するか、或いは界面活性剤で処理する等の方法で細胞にダメージを与え、生存率を低下させておくことで、上記目的に適う、高いカテコールオキシダーゼ活性を有する微生物組成物が取得できることを見出した。特にこの効果は、活性化処理前に菌体生存率を０％に近づけておくほど高くなる傾向がある。 The inventors of the present invention have been diligently studying to achieve the above-mentioned object. As a result, the microorganisms producing catechol oxidase, particularly the yeast producing tyrosinase, are activated by the method described in Patent Document 1 above. In addition, a microorganism composition having high catechol oxidase activity suitable for the above-mentioned purpose by damaging the cells by a method such as freezing or drying in advance or treating with a surfactant to reduce the survival rate. I found that things can be acquired. In particular, this effect tends to increase as the bacterial cell survival rate approaches 0% before the activation treatment.
本発明はかかる知見に基づいて完成したものであり、下記の実施態様を包含するものである。 The present invention has been completed based on this finding, and includes the following embodiments.
（Ｉ）活性型カテコールオキシダーゼを含有する微生物組成物
（I-1）下記(1)および(2)の特徴を有する、活性型カテコールオキシダーゼを含有する微生物組成物：
（1）微生物の生存率が０〜９１％、
（2）カテコールオキシダーゼ活性が１.７ｋＵ/ｇ以上。
（I-2）カテコールオキシダーゼがチロシナーゼである、（I-1）記載の微生物組成物。
（I-4）微生物が酵母である、（I-1）または（I-2）に記載する微生物組成物。
(I) Microbial composition containing active catechol oxidase (I-1) Microbial composition containing active catechol oxidase having the following characteristics (1) and (2):
(1) The survival rate of microorganisms is 0 to 91%,
(2) The catechol oxidase activity is 1.7 kU / g or more.
(I-2) The microbial composition according to (I-1), wherein the catechol oxidase is tyrosinase.
(I-4) The microorganism composition according to (I-1) or (I-2), wherein the microorganism is yeast.
（II）酵素製剤
（II-1）（I-1）乃至（I-3）のいずれかに記載する微生物組成物を有効成分とする酵素製剤。
(II) Enzyme preparation (II-1 ) An enzyme preparation comprising the microbial composition described in any one of (I-1) to (I-3) as an active ingredient.
（III）微生物組成物の製造方法
（III-1）不活性型カテコールオキシダーゼを含有する微生物組成物を、細胞障害処理した後に、活性化処理を行うことを特徴とする、（I-1）乃至（I-3）のいずれかに記載する微生物組成物の製造方法。
（III-2）細胞障害処理が、冷凍処理、乾燥処理および界面活性剤処理からなる群から選択される少なくとも１つの処理である、（III-1）に記載する製造方法。
（III-3）上記界面活性剤が陽イオン系界面活性剤である（III-2）に記載する製造方法。
（III-4）上記陽イオン系界面活性剤が第４級アンモニウム塩である（III-3）に記載する製造方法。
（III-5）上記界面活性剤が陰イオン系界面活性剤である（III-2）に記載する製造方法。
（III-6）上記界面活性剤が非イオン性界面活性剤である（III-2）に記載する製造方法。
（III-7）活性化処理が、不活性型カテコールオキシダーゼを含有する微生物組成物を銅イオンと接触させる工程、および酸処理工程を有する処理である、（III-1）乃至（III-6）のいずれかに記載する製造方法。
(III) A method for producing a microbial composition (III-1) A microbial composition containing an inactive catechol oxidase is subjected to a cell damage treatment and then subjected to an activation treatment, (I-1) to (I-1) to (I-3) The manufacturing method of the microorganism composition in any one of.
(III-2) The production method according to (III-1), wherein the cell damage treatment is at least one treatment selected from the group consisting of a freezing treatment, a drying treatment, and a surfactant treatment.
(III-3) The production method according to (III-2), wherein the surfactant is a cationic surfactant.
(III-4) The production method according to (III-3), wherein the cationic surfactant is a quaternary ammonium salt.
(III-5) The production method according to (III-2), wherein the surfactant is an anionic surfactant.
(III-6) The production method according to (III-2), wherein the surfactant is a nonionic surfactant.
(III-7) (III-1) to (III-6), wherein the activation treatment is a treatment comprising a step of bringing a microorganism composition containing an inactive catechol oxidase into contact with copper ions, and an acid treatment step. The manufacturing method described in any one of.
（IV）微生物組成物のカテコールオキシダーゼ活性を向上させる方法
（IV-1）カテコールオキシダーゼを含有する微生物組成物を、細胞障害処理した後に、活性化処理を行うことを特徴とする、微生物組成物におけるカテコールオキシダーゼ活性を向上させる方法。
（IV-2）細胞障害処理が、冷凍処理、乾燥処理および界面活性剤処理からなる群から選択される少なくとも１つの処理である、（IV-1）に記載する方法。
（IV-3）上記界面活性剤処理に使用する界面活性剤が、陽イオン系界面活性剤である（IV-2）に記載する方法。
（IV-4）上記陽イオン系界面活性剤が第４級アンモニウム塩である（IV-3）に記載する方法。
（IV-5）活性化処理が、カテコールオキシダーゼを含有する微生物組成物を銅イオンと接触させる工程、および酸処理工程を有する処理である、（IV-1）乃至（IV-4）のいずれかに記載する方法。
(IV) A method for improving the catechol oxidase activity of a microbial composition (IV-1) In a microbial composition, wherein a microbial composition containing catechol oxidase is subjected to a cell damage treatment and then subjected to an activation treatment. A method for improving catechol oxidase activity.
(IV-2) The method according to (IV-1), wherein the cytotoxic treatment is at least one treatment selected from the group consisting of a freezing treatment, a drying treatment and a surfactant treatment.
(IV-3) The method described in (IV-2), wherein the surfactant used for the surfactant treatment is a cationic surfactant.
(IV-4) The method according to (IV-3), wherein the cationic surfactant is a quaternary ammonium salt.
(IV-5) Any of (IV-1) to (IV-4), wherein the activation treatment is a treatment comprising a step of bringing a microbial composition containing catechol oxidase into contact with copper ions and an acid treatment step The method described in.
（V）メラニン前駆体の製造方法
（V-1）（II-1）記載の酵素製剤の存在下で、3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)アラニン（DOPA)及びその類縁体からなる群より選ばれる少なくとも１種の基質化合物を酸化してメラニン前駆体に変換する酸化工程と、反応液からメラニン前駆体を回収する回収工程とを含むメラニン前駆体の製造方法。
(V) Production method of melanin precursor (V-1) in the presence of the enzyme preparation described in (II-1), from the group consisting of 3- (3,4-dihydroxyphenyl) alanine (DOPA) and its analogs A method for producing a melanin precursor, comprising an oxidation step of oxidizing at least one selected substrate compound to convert it into a melanin precursor, and a recovery step of recovering the melanin precursor from a reaction solution.
本発明の微生物組成物は、カテコールオキシダーゼが不活性型（アポ酵素）から活性型（ホロ酵素）へと高い割合で変換されているため、高いカテコールオキシダーゼ活性（触媒活性）を有している。このため、かかる微生物組成物を酵素製剤として用いることにより、例えば染毛剤の色素成分として有用なメラニン前駆体、及び食品や化粧料の添加剤として有用なメラニンを効率よく製造することができる。また、本発明の製造方法によれば、微生物が有する不活性型カテコールオキシダーゼ（アポ酵素）を活性型（ホロ酵素）へと効率よく変換することができるため、微生物酵素製剤として有用な活性型カテコールオキシダーゼを高い割合で含有する微生物組成物を製造取得することができる。 The microbial composition of the present invention has high catechol oxidase activity (catalytic activity) because catechol oxidase is converted from an inactive form (apoenzyme) to an active form (holoenzyme) at a high rate. For this reason, by using such a microbial composition as an enzyme preparation, for example, a melanin precursor useful as a pigment component of a hair dye and a melanin useful as an additive for foods and cosmetics can be efficiently produced. In addition, according to the production method of the present invention, an inactive catechol oxidase (apoenzyme) possessed by a microorganism can be efficiently converted into an active form (holoenzyme), and therefore, active catechol useful as a microbial enzyme preparation. A microbial composition containing a high proportion of oxidase can be produced and obtained.
さらに本発明の方法によれば、不活性型カテコールオキシダーゼ（アポ酵素）を活性型（ホロ酵素）へと効率よく変換することができるため、カテコールオキシダーゼを含有する微生物組成物のカテコールオキシダーゼ活性を向上させることができる。 Furthermore, according to the method of the present invention, inactive catechol oxidase (apoenzyme) can be efficiently converted into an active form (holoenzyme), so that the catechol oxidase activity of the microbial composition containing catechol oxidase is improved. Can be made.
（Ｉ）微生物組成物およびその製造方法
本発明の微生物組成物は、活性型カテコールオキシダーゼを含有する微生物の集合体であって、下記（1）および（2）の特徴を備えるものである：
（1）微生物の生存率が０〜９１％、
（2）カテコールオキシダーゼ活性が１．７ｋＵ/ｇ以上。
(I) Microbial Composition and Method for Producing the Same The microbial composition of the present invention is an aggregate of microorganisms containing active catechol oxidase, and has the following characteristics (1) and (2):
(1) The survival rate of microorganisms is 0 to 91%,
(2) The catechol oxidase activity is 1.7 kU / g or more.
なお、ここで微生物の生存率は、好ましくは０〜７０％、より好ましくは０〜６０％である。またカテコールオキシダーゼ活性は、好ましくは３ｋＵ/ｇ以上、より好ましくは５ｋＵ/ｇ以上である。 Here, the survival rate of the microorganism is preferably 0 to 70%, more preferably 0 to 60%. The catechol oxidase activity is preferably 3 kU / g or more, more preferably 5 kU / g or more.
ここで本発明が対象とするカテコールオキシダーゼは、銅を補因子として有する酵素である。すなわち、活性触媒中心に銅イオンが配位していないと十分なカテコールオキシダーゼ活性を示さず、銅イオンが配位することで完全なカテコールオキシダーゼ活性を示すようになる酵素である。本明細書では、前者の銅イオンが配位していない酵素を「不活性型カテコールオキシダーゼ」（アポ酵素）といい、後者の銅イオンが配位した酵素を「活性型カテコールオキシダーゼ」（ホロ酵素）と称する。 Here, the catechol oxidase targeted by the present invention is an enzyme having copper as a cofactor. That is, it is an enzyme that does not exhibit sufficient catechol oxidase activity when the copper ion is not coordinated to the active catalyst center, and exhibits complete catechol oxidase activity when the copper ion is coordinated. In the present specification, the enzyme to which the former copper ion is not coordinated is called “inactive catechol oxidase” (apoenzyme), and the enzyme to which the latter copper ion is coordinated is “active catechol oxidase” (holoenzyme). ).
かかるカテコールオキシダーゼ(EC1.10.3.1)としては、ジフェノールオキシダーゼ、o-ジフェノラーゼ、フェノラーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、チロシナーゼ等と称される酵素が含まれる。カテコールオキシダーゼとして、好ましくは、少なくともチロシナーゼ活性を有する酵素である。ここでカテコールオキシダーゼ活性とは、カテコールの酸化によるo-キノンの生成を触媒する活性をいう。 Such catechol oxidase (EC 1.10.3.1) includes enzymes called diphenol oxidase, o-diphenolase, phenolase, polyphenol oxidase, tyrosinase and the like. The catechol oxidase is preferably an enzyme having at least tyrosinase activity. Here, catechol oxidase activity refers to an activity that catalyzes the production of o-quinone by oxidation of catechol.
メラニンまたはメラニン前駆体を製造する場合において、カテコールオキシダーゼとして、より好ましくはチロシナーゼを挙げることができる。チロシナーゼは、L-DOPAに対して親和性が高いため、これを基質化合物とすることで、図１に示す反応経路を通じて天然型のメラニン前駆体を効率よく製造することができる。 In the case of producing melanin or melanin precursor, tyrosinase can be mentioned as catechol oxidase more preferably. Since tyrosinase has a high affinity for L-DOPA, a natural melanin precursor can be efficiently produced through the reaction pathway shown in FIG. 1 by using this as a substrate compound.
カテコールオキシダーゼは、どのような生物に由来する酵素であってもよい。発現効率が良く、かつ宿主細胞内で安定であることから、糸状菌に由来するカテコールオキシダーゼであることが好ましい。中でも、反応収率（基質に対する酸化生成物の比率）が高い酵素であることが好ましく、このような酵素を産生する糸状菌としては、アスペルギルス（Aspergillus）属、ニューロスポラ（Neurospora）属、リゾムコール（Rhizomucor）属、トリコデルマ（Trichoderma）属、及びペニシリウム（Penicillium）属等が挙げられる。中でも、熱に対して比較的安定であり、かつ安全性が確かめられている点で、アスペルギルス属糸状菌のチロシナーゼが好ましい。具体的には、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）のmelB遺伝子（特許第3903125号公報）、melD遺伝子（特許第4267318号公報）、又はmelO遺伝子（Molecular cloning and nucleotide sequence of the protyrosinase gene, melO, from Aspergillus oryzae and expression of the gene in yeast cells.Biochim Biophys Acta. 1995 Mar 14;1261(1):151-154）でコードされるチロシナーゼ、並びに当該チロシナーゼと実質的に同一である酵素を挙げることができる。 Catechol oxidase may be an enzyme derived from any organism. A catechol oxidase derived from a filamentous fungus is preferable because of its high expression efficiency and stability in the host cell. Among them, an enzyme having a high reaction yield (ratio of oxidation product to substrate) is preferable. As the filamentous fungus producing such an enzyme, Aspergillus genus, Neurospora genus, Rhizomucor ( Rhizomucor), Trichoderma, Penicillium and the like. Among them, tyrosinase of Aspergillus filamentous fungi is preferable because it is relatively stable against heat and has been confirmed to be safe. Specifically, the melB gene of Aspergillus oryzae (Patent No. 3903125), the melD gene (Patent No. 4267318), or the melO gene (Molecular cloning and nucleotide sequence of the protyrosinase gene, melO, from Examples include tyrosinase encoded by Aspergillus oryzae and expression of the gene in yeast cells. Biochim Biophys Acta. 1995 Mar 14; 1261 (1): 151-154), and an enzyme that is substantially identical to the tyrosinase. .
ここで上記遺伝子（melB遺伝子、melD遺伝子又はmelO遺伝子）でコードされるチロシナーゼと「実質的に同一」とは、これらの遺伝子のうちいずれか１つの遺伝子でコードされる酵素（melB、melD、melO）のアミノ酸配列と、アミノ酸配列として70％以上、更に好ましくは80％以上、最も好ましくは90％以上が同一のアミノ酸配列を有し、かつ少なくともチロシナーゼ活性を有していることをいう。このような酵素は、ドーパからドーパクロムへの反応収率が高く、効率的に酸化反応を行うことができる。 Here, "substantially identical" to the tyrosinase encoded by the above gene (melB gene, melD gene or melO gene) means an enzyme encoded by any one of these genes (melB, melD, melO) ) And 70% or more, more preferably 80% or more, and most preferably 90% or more as the amino acid sequence, and at least tyrosinase activity. Such an enzyme has a high reaction yield from dopa to dopachrome, and can efficiently oxidize.
本発明が対象とする微生物は、少なくとも上記カテコールオキシダーゼを産生し得るものであればよく、この限りにおいて特に制限されない。すなわち、本発明が対象とする微生物は、(a)本来的に上記酵素を産生し得る微生物であってもよいし、また(b)上記酵素を産生し得る能力が外来的に付与された微生物であってもよい。さらに(c)内在性または外来性の別を問わず、カテコールオキシダーゼ活性を高める処理をされた微生物であってもよい。好ましくは（b）または（c）の微生物である。 The microorganism targeted by the present invention is not particularly limited as long as it can produce at least the catechol oxidase. That is, the microorganism targeted by the present invention may be (a) a microorganism that can inherently produce the enzyme, or (b) a microorganism that is externally imparted with the ability to produce the enzyme. It may be. Further, (c) a microorganism that has been treated to enhance catechol oxidase activity, whether endogenous or exogenous. The microorganism (b) or (c) is preferred.
かかる微生物としては、大腸菌、酵母、および糸状菌等を挙げることができる。なかでも、安全で、さらに単細胞であり、かつ細胞の沈降速度が速いため、比較的低速回転の遠心分離で反応後の細胞を分離できる点で、酵母を用いることが好ましい。酵母の中でも、特に、菌体が堅牢であるために菌体由来のタンパク質の反応液中への流出が抑えられ、かつ遺伝子操作が容易である点で、サッカロミセス・セレビシェ（Saccharomyces cerevisiae)が好ましい。なお、本発明の微生物組成物は、好ましくは１種単独の微生物からなる集合体である。 Examples of such microorganisms include Escherichia coli, yeast, and filamentous fungi. Among them, it is preferable to use yeast because it is safe, is a single cell, and has a high sedimentation rate, so that the cells after reaction can be separated by centrifugation at a relatively low speed. Among yeasts, Saccharomyces cerevisiae is particularly preferable in that the bacterial cells are robust, so that the outflow of the protein derived from the bacterial cells into the reaction solution is suppressed and the genetic manipulation is easy. The microbial composition of the present invention is preferably an aggregate composed of one kind of microorganism.
(b)の微生物は、例えば、タンパク質の大量発現用に通常用いられているベクターにカテコールオキシダーゼをコードする遺伝子（カテコールオキシダーゼ遺伝子）をクローニングし、当該ベクターを宿主細胞に導入することによって調製することができ、斯くして上記遺伝子を宿主染色体に組み込むか、又はこれをプラスミド状態で有する微生物を取得することができる。 The microorganism (b) is prepared, for example, by cloning a gene encoding catechol oxidase (catechol oxidase gene) into a vector usually used for mass expression of proteins and introducing the vector into a host cell. Thus, it is possible to obtain a microorganism having the above gene integrated into the host chromosome or having it in a plasmid state.
上記（c）の微生物としては下記の微生物を挙げることができる：
(c-1) カテコールオキシダーゼ遺伝子を本来発現させているプロモーターよりも高活性のプロモーターの下でこの遺伝子を発現させている微生物。
(c-2) カテコールオキシダーゼ遺伝子を複数コピー有する微生物。
(c-3) カテコールオキシダーゼ遺伝子の変異体を有することにより高いカテコールオキシダーゼ活性を示す微生物。
Examples of the microorganism (c) include the following microorganisms:
(c-1) A microorganism that expresses this gene under a promoter that is more active than the promoter that originally expresses the catechol oxidase gene.
(c-2) A microorganism having a plurality of copies of the catechol oxidase gene.
(c-3) A microorganism exhibiting high catechol oxidase activity by having a mutant of the catechol oxidase gene.
(c-1)で使用される高活性のプロモーターとしては、制限されないが、例えば清酒酵母由来のSED1遺伝子プロモーター（特開2003-265177号公報）などを挙げることができる。 The highly active promoter used in (c-1) is not limited, and examples thereof include SED1 gene promoter derived from sake yeast (Japanese Patent Laid-Open No. 2003-265177).
(c-2)の微生物は、例えば、カテコールオキシダーゼ遺伝子を複数コピー保持する可能性のある２倍体以上の細胞にカテコールオキシダーゼ遺伝子を導入することによって調製することができる。また、例えばパン酵母等の実用酵母の中には、３倍体や４倍体の細胞も存在するため、これらも好適に使用できる。このようにして、微生物に導入するカテコールオキシダーゼ遺伝子のコピー数を多くすることにより、より高いカテコールオキシダーゼ活性を有する微生物とすることができる。 The microorganism (c-2) can be prepared, for example, by introducing the catechol oxidase gene into diploid or higher cells that may hold multiple copies of the catechol oxidase gene. Further, for example, there are triploid and tetraploid cells in practical yeasts such as baker's yeast, and these can be used preferably. Thus, by increasing the copy number of the catechol oxidase gene introduced into the microorganism, it is possible to obtain a microorganism having higher catechol oxidase activity.
(c-3)の微生物としては、カテコールオキシダーゼ遺伝子の変異により、カテコールオキシダーゼ活性が高くなった微生物、又はこのような変異カテコールオキシダーゼ遺伝子を導入した微生物を使用することができる。このようにして、天然型酵素より高い活性を示す変異型酵素とすることにより、高いカテコールオキシダーゼ活性を示す微生物とすることができる。 As the microorganism (c-3), a microorganism having increased catechol oxidase activity due to mutation of the catechol oxidase gene, or a microorganism into which such a mutated catechol oxidase gene has been introduced can be used. Thus, it can be set as the microorganisms which show high catechol oxidase activity by setting it as the variant enzyme which shows activity higher than a natural type enzyme.
＜細胞障害処理＞
本発明の微生物組成物は、不活性型カテコールオキシダーゼ、即ち補因子として銅を有しないアポ酵素型のカテコールオキシダーゼを含む微生物組成物に対して、細胞障害処理を施すことによって調製することができる。
<Cell damage treatment>
The microbial composition of the present invention can be prepared by subjecting an inactive catechol oxidase, that is, a microbial composition containing an apoenzyme catechol oxidase having no copper as a cofactor, to a cytotoxic treatment.
ここで細胞障害処理とは、微生物の細胞にダメージを与え、微生物の生存率を低下させるような処理を意味する。好ましくは微生物を死に至らしめるような処理である。 Here, the cell damage treatment means a treatment that damages the cells of the microorganism and lowers the survival rate of the microorganism. A treatment that causes the microorganisms to die is preferred.
かかる処理としては、制限はされないが、好ましくは、乾燥処理、および界面活性剤処理を例示することができる。また、冷凍処理であってもよい。 Such treatment is not limited, but preferably, a drying treatment and a surfactant treatment can be exemplified. Moreover, the freezing process may be sufficient.
ここで冷凍処理は、カテコールオキシダーゼ活性を損なわずに、対象とする微生物組成物を冷凍する処理であればよく、その限りにおいて冷凍方法や冷凍条件は特に制限されない。例えば、液体窒素による瞬間冷凍、ドライアイス等の冷凍材料を用いた冷凍方法、冷凍庫に収容して徐々に冷凍する方法、減圧条件下で凍結乾燥する方法などを制限なく挙げることができる。好ましくは微生物組成物を、冷凍庫等を用いて冷凍して、0℃以下、好ましくは−20〜−10℃の状態で、少なくとも1日以上保存する処理を挙げることができる。 Here, the freezing treatment may be any treatment that freezes the target microbial composition without impairing the catechol oxidase activity, and the freezing method and freezing conditions are not particularly limited as long as the freezing treatment is performed. For example, instant freezing with liquid nitrogen, a freezing method using a frozen material such as dry ice, a method of gradually freezing by storing in a freezer, a method of freeze-drying under reduced pressure conditions, and the like can be mentioned without limitation. Preferably, the microorganism composition can be frozen using a freezer or the like and stored at 0 ° C. or lower, preferably −20 to −10 ° C. for at least one day.
また乾燥処理としては、カテコールオキシダーゼ活性を損なわずに、対象とする微生物組成物を乾燥する処理であればよく、その限りにおいて乾燥方法やその条件は特に制限されない。例えば、天日乾燥、風乾、凍結乾燥、加熱乾燥、通風乾燥、スプレードライによる乾燥などを挙げることができる。好ましくは微生物組成物を30〜90℃の条件で、通風乾燥する方法を挙げることができる。この場合、制限はされないが、微生物中の含水量が少なくとも0-90％程度になるまで乾燥することが好ましい。 Moreover, as a drying process, what is necessary is just a process which dries the target microorganism composition, without impairing catechol oxidase activity, and a drying method and its conditions will not be restrict | limited especially as long as it is. Examples thereof include sun drying, air drying, freeze drying, heat drying, ventilation drying, and spray drying. Preferably, a method in which the microbial composition is air-dried under a condition of 30 to 90 ° C. can be mentioned. In this case, although not limited, it is preferable to dry until the water content in the microorganism becomes at least about 0-90%.
界面活性剤処理としては、酵素活性を損なわずに、対象とする微生物組成物の細胞に障害を与えるような化学物質を用いた処理であればよく、その限りにおいて処理方法やその条件は特に制限されない。微生物組成物の細胞に障害を与えるような化学物質としては、界面活性剤が挙げられる。界面活性剤としては、特に制限をされず、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤および両性界面活性剤を挙げることができる。好ましくは、陽イオン性界面活性剤である。 The surfactant treatment may be a treatment using a chemical substance that does not impair the enzyme activity and damages the cells of the target microbial composition, and the treatment method and its conditions are not particularly limited as long as the treatment is performed. Not. Surfactant is mentioned as a chemical substance which damages the cell of a microbial composition. The surfactant is not particularly limited, and examples thereof include an anionic surfactant, a cationic surfactant, a nonionic surfactant, and an amphoteric surfactant. Preferably, it is a cationic surfactant.
界面活性剤処理に用いる陽イオン系界面活性剤としては、特に制限されないが、 好ましくは第４級アンモニウム塩が挙げられる。第４級アンモニウム塩としては、特に制限をされないが、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、アルキルベンジルジメチルアンモニウムクロライド、アルキルジメチルエチルベンジルアンモニウムクロライド、アルキルジメチルメチルベンジルアンモニウムクロライド、ジデシルジメチルアンモニウムクロライド、デシルイソノニルジメチルアンモニウム塩、ジオクチルジメチルアンモニウムクロライド、ジデシルジメチルアンモニウムカーボネート、ジデシルメチルポリオキシエチレンアンモニウムプロピネートなどを挙げることができる。これらは１種単独で使用してもよいし、また２種以上を任意に組み合わせて使用してもよい。好ましくは、塩化ベンザルコニウム、ジデシルジメチルアンモニウム塩、ジオクチルジメチルアンモニウム塩、アルキルベンジルジメチルアンモニウムクロライドである。 The cationic surfactant used for the surfactant treatment is not particularly limited, but preferably includes a quaternary ammonium salt. The quaternary ammonium salt is not particularly limited, but benzalkonium chloride, benzethonium chloride, alkylbenzyldimethylammonium chloride, alkyldimethylethylbenzylammonium chloride, alkyldimethylmethylbenzylammonium chloride, didecyldimethylammonium chloride, decyliso-sodium. Nonyldimethylammonium salt, dioctyldimethylammonium chloride, didecyldimethylammonium carbonate, didecylmethylpolyoxyethyleneammonium propionate and the like can be mentioned. These may be used alone or in any combination of two or more. Preferred are benzalkonium chloride, didecyldimethylammonium salt, dioctyldimethylammonium salt, and alkylbenzyldimethylammonium chloride.
なお第４級アンモニウム塩の塩としては、制限をされないが、クロライド塩、炭酸塩、リン酸塩、ブロマイド塩などを挙げることができる。好ましくはクロライド塩である。 In addition, although it does not restrict | limit as a salt of a quaternary ammonium salt, A chloride salt, carbonate, a phosphate, a bromide salt etc. can be mentioned. A chloride salt is preferred.
界面活性剤処理に用いる陰イオン系界面活性剤としては、特に制限されないが、ラウリル硫酸ナトリウム、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、α−オレフィンスルホン酸ナトリウムなどが挙げられる。好ましくはラウリル硫酸ナトリウムである。 The anionic surfactant used for the surfactant treatment is not particularly limited, and examples thereof include sodium lauryl sulfate, linear sodium alkylbenzene sulfonate, and sodium α-olefin sulfonate. Sodium lauryl sulfate is preferred.
界面活性剤処理に用いる非イオン性界面活性剤としては、特に制限されないが、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタンモノステアレート、ソルビタントリステアレート、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノパルミテート、オクチルフェノールポリエチレングリコールエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ノニルフェノールエトキシレート、オクチルフェノールエトキシレートなどが挙げられる。好ましくはオクチルフェノールポリエチレングリコールエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートである。 The nonionic surfactant used for the surfactant treatment is not particularly limited, but glycerol fatty acid ester, sucrose fatty acid ester, sorbitan monostearate, sorbitan tristearate, sorbitan monolaurate, sorbitan monooleate, sorbitan Examples thereof include monopalmitate, octylphenol polyethylene glycol ether, polyoxyethylene sorbitan monolaurate, nonylphenol ethoxylate, and octylphenol ethoxylate. Preferred are octylphenol polyethylene glycol ether and polyoxyethylene sorbitan monolaurate.
界面活性剤処理に用いる両性イオン系界面活性剤としては、特に制限されないが、
ベタイン、ラウリルベタイン、塩化アルキルポリアミノエチルグリシンなどが挙げられる。
The zwitterionic surfactant used for the surfactant treatment is not particularly limited,
Examples include betaine, lauryl betaine, and alkylpolyaminoethylglycine chloride.
このような界面活性剤を用いた処理には、カテコールオキシダーゼ活性を損なうことなく、対象とする微生物組成物の細胞に障害を与える条件が採用される。例えば、界面活性剤として陽イオン系界面活性剤（好ましくは第４級アンモニウム塩）を用いる場合、0.01〜10重量％、好ましくは0.1〜3.0重量％の濃度で当該界面活性剤を含有する水に、対象とする微生物組成物を浸漬する方法を挙げることができる。この場合の水温としては制限されないが、好ましくは0〜70℃、より好ましくは10〜30℃、処理時間としては、制限されないが、好ましくは0.01〜12時間、より好ましくは1〜60分間を挙げることができる。 In the treatment using such a surfactant, conditions that damage the cells of the target microbial composition without impairing the catechol oxidase activity are employed. For example, when a cationic surfactant (preferably a quaternary ammonium salt) is used as the surfactant, it is contained in water containing the surfactant at a concentration of 0.01 to 10% by weight, preferably 0.1 to 3.0% by weight. And a method of immersing the target microbial composition. Although the water temperature in this case is not limited, it is preferably 0 to 70 ° C, more preferably 10 to 30 ° C, and the treatment time is not limited, but preferably 0.01 to 12 hours, more preferably 1 to 60 minutes. be able to.
また、微生物組成物溶液に直接界面活性剤を添加する方法も挙げられる。例えば、界面活性剤として陽イオン系界面活性剤（好ましくは第４級アンモニウム塩）を用いる場合、微生物組成物の溶液に0.01〜10重量％、好ましくは0.1〜3.0重量％の濃度で当該界面活性剤を添加して処理する方法を挙げることができる。この場合の水温としては制限されないが、好ましくは0〜50℃、より好ましくは10〜30℃、処理時間としては、制限されないが、好ましくは0.01〜12時間、より好ましくは0〜60分間を挙げることができる。 In addition, a method of directly adding a surfactant to the microbial composition solution is also included. For example, when a cationic surfactant (preferably a quaternary ammonium salt) is used as the surfactant, the surfactant is used at a concentration of 0.01 to 10% by weight, preferably 0.1 to 3.0% by weight in the solution of the microbial composition. The method of processing by adding an agent can be mentioned. Although the water temperature in this case is not limited, it is preferably 0 to 50 ° C., more preferably 10 to 30 ° C., and the treatment time is not limited, but preferably 0.01 to 12 hours, more preferably 0 to 60 minutes. be able to.
以上説明する細胞障害処理を行うことにより、対象とする微生物組成物は細胞にダメージを受け、生存率が８０％以下にまで低下する。実験例１に示すように、かかる生存率は低ければ低いほどよく、好ましくは７０％以下、より好ましくは５５％以下、さらに好ましくは５％以下、特に好ましくは０％である。かかる細胞障害処理で得られる微生物組成物の生存率によって、その後の活性化処理の効果が異なってくる。このため、微生物酵素製剤の原料として常に均質した活性を有する微生物組成物を取得するという目的からは、かかる細胞障害処理で得られる微生物組成物の生存率は一定に、好ましくは１％未満、より好ましくは０％になるように調整することが好ましい。 By performing the cell damage treatment described above, the target microorganism composition is damaged by the cells, and the survival rate is reduced to 80% or less. As shown in Experimental Example 1, the lower the survival rate, the better. Preferably, it is 70% or less, more preferably 55% or less, still more preferably 5% or less, and particularly preferably 0%. The effect of the subsequent activation treatment varies depending on the survival rate of the microbial composition obtained by the cell damage treatment. For this reason, for the purpose of obtaining a microbial composition that always has a homogeneous activity as a raw material for microbial enzyme preparations, the survival rate of the microbial composition obtained by such cell damage treatment is constant, preferably less than 1%, more It is preferable to adjust so that it may become 0% preferably.
＜活性化処理＞
本発明の微生物組成物は、上記細胞障害処理の後、活性化処理を施すことによって調製される。
<Activation processing>
The microbial composition of the present invention is prepared by performing an activation treatment after the cell damage treatment.
ここで活性化処理とは、微生物組成物中に含まれるカテコールオキシダーゼの活性を向上させるための処理をいい、例えば後述する（a）〜（c）の処理を挙げることができる。 Here, the activation treatment refers to treatment for improving the activity of catechol oxidase contained in the microbial composition, and examples thereof include treatments (a) to (c) described later.
（a）微生物組成物を、銅イオンを含む溶液に接触させる処理
前述するように、銅を補因子とするカテコールオキシダーゼ、好ましくはチロシナーゼが活性を示すためには、触媒活性中心に２価銅イオンが配位することが必要である。特に形質転換等の遺伝子操作によりカテコールオキシダーゼの発現量を向上させた微生物においては、酵素の活性触媒中心に２価銅イオンが配位しておらず（不活性型カテコールオキシダーゼ）、十分なカテコールオキシダーゼ活性が得られない場合がある。このため、かかる不活性型カテコールオキシダーゼを有する微生物を、予め２価銅イオンで処理することにより、カテコールオキシダーゼの触媒活性中心に２価銅イオンを配位させることが好ましい。すなわち、上記（a）の処理は、微生物組成物中に含まれる不活性型カテコールオキシダーゼ、即ち活性触媒中心に２価銅イオンが配位していないアポ酵素型のカテコールオキシダーゼに２価銅イオンを配位させる処理である。
(A) Treatment of contacting the microbial composition with a solution containing copper ions As described above, in order for catechol oxidase having copper as a cofactor, preferably tyrosinase to exhibit activity, a divalent copper ion is present at the catalytic activity center. Need to coordinate. In particular, in microorganisms in which the expression level of catechol oxidase is improved by genetic manipulation such as transformation, divalent copper ions are not coordinated to the active catalytic center of the enzyme (inactive catechol oxidase), and sufficient catechol oxidase Activity may not be obtained. For this reason, it is preferable to coordinate a divalent copper ion to the catalytic activity center of catechol oxidase by previously treating the microorganism having such an inactive catechol oxidase with a divalent copper ion. That is, in the treatment (a), inactive catechol oxidase contained in the microbial composition, that is, apoenzyme-type catechol oxidase in which divalent copper ions are not coordinated to the active catalyst center, divalent copper ions are added. It is a process to coordinate.
かかる処理としては、具体的には、不活性型カテコールオキシダーゼを有する微生物組成物を、0.001〜100mM程度、好ましくは0.1〜2mM程度の硫酸銅を含む水溶液に入れ、0〜70℃程度、好ましくは10〜40℃程度の温度条件下で、0.01〜12時間、好ましくは0.1〜1時間程度静置する方法を挙げることができる。なお、上記硫酸銅に代えて、塩化銅を用いることもできる。 As such treatment, specifically, a microorganism composition having an inactive catechol oxidase is placed in an aqueous solution containing about 0.001 to 100 mM, preferably about 0.1 to 2 mM copper sulfate, and about 0 to 70 ° C., preferably An example is a method of allowing to stand at a temperature of about 10 to 40 ° C. for 0.01 to 12 hours, preferably about 0.1 to 1 hour. In addition, it can replace with the said copper sulfate and can also use copper chloride.
また、微生物組成物の溶液に直接銅イオンを加えてもよい。 Moreover, you may add a copper ion directly to the solution of microbial composition.
（b）微生物組成物を酸性溶液で処理する
カテコールオキシダーゼの中でもチロシナーゼ、特にアスペルギルス・オリゼ由来のチロシナーゼは、ｐＨ２〜４程度の酸性溶液で処理することにより、成熟化し、活性化する。従って、微生物として、チロシナーゼ、特にアスペルギルス・オリゼ由来のチロシナーゼを有する微生物を用いる場合は、かかる酸処理を行うことで、酵素を成熟化させ、活性化させることが好ましい。
(B) Treating a microorganism composition with an acidic solution Among catechol oxidases, tyrosinase, particularly tyrosinase derived from Aspergillus oryzae, is matured and activated by treating with an acidic solution having a pH of about 2 to 4. Therefore, when using a microorganism having tyrosinase, in particular, tyrosinase derived from Aspergillus oryzae, it is preferable to mature and activate the enzyme by performing such acid treatment.
かかる処理としては、例えば、カテコールオキシダーゼを有する微生物組成物を20〜200mM程度、好ましくは50〜100mM程度の酢酸ナトリウム緩衝溶液（pH2〜4、好ましくはpH3）に懸濁し、0〜40℃程度、好ましくは10〜30℃で、0.01〜12時間程度、好ましくは0.5〜１時間程度静置する方法を挙げることができる。 As such treatment, for example, a microbial composition having catechol oxidase is suspended in a sodium acetate buffer solution (pH 2 to 4, preferably pH 3) of about 20 to 200 mM, preferably about 50 to 100 mM, and about 0 to 40 ° C., A method of leaving still at 10 to 30 ° C. for about 0.01 to 12 hours, preferably about 0.5 to 1 hour can be mentioned.
また、微生物組成物の溶液に直接酸を加えて酸処理を行ってもよい。かかる処理としては、微生物組成物の溶液に硫酸を添加し、pＨを2〜4程度、好ましくはpＨから2.8〜3.2、さらに好ましくはpＨ3に調整し、0〜40℃程度、好ましくは10〜30℃程度の温度条件で、0.01〜12時間程度、好ましくは0.5〜１時間程度静置する方法を挙げることができる。なお、上記硫酸に代えて、塩酸、硝酸、リン酸、酢酸、乳酸などを用いることもできる。 Alternatively, acid treatment may be performed by directly adding an acid to the solution of the microbial composition. As such treatment, sulfuric acid is added to the solution of the microbial composition, and the pH is adjusted to about 2 to 4, preferably from pH to 2.8 to 3.2, more preferably to pH 3 and about 0 to 40 ° C., preferably 10 to 30 There can be mentioned a method of standing at a temperature of about 0 ° C. for about 0.01 to 12 hours, preferably about 0.5 to 1 hour. Note that hydrochloric acid, nitric acid, phosphoric acid, acetic acid, lactic acid, or the like can be used instead of the sulfuric acid.
（c）微生物組成物をプロテアーゼで処理する
また、カテコールオキシダーゼは、トリプシン等の特定のペプチド結合を選択的に切断するエンドペプチダーゼのようなプロテアーゼで処理することによっても活性化することができる。これは、プロテアーゼ処理することにより、酵素のＮ末端及び／又はＣ末端側の配列が取り除かれることによる。従って、カテコールオキシダーゼを有する微生物をプロテアーゼで処理することで、カテコールオキシダーゼ活性を向上させることが好ましい。
(C) Treating Microbial Composition with Protease Catechol oxidase can also be activated by treating with a protease such as endopeptidase that selectively cleaves specific peptide bonds such as trypsin. This is because the N-terminal and / or C-terminal sequences of the enzyme are removed by protease treatment. Therefore, it is preferable to improve the catechol oxidase activity by treating a microorganism having catechol oxidase with a protease.
これらの（a）〜（c）の活性化処理のうち、好ましくは（a）および（b）である。これらの活性化処理は１つの処理を単独で行ってもよいし、また２種以上の処理を任意に組み合わせて行うこともできる。例えば、カテコールオキシダーゼの中でもチロシナーゼ、特にアスペルギルス・オリゼ由来のチロシナーゼを有する微生物組成物を用いる場合は、（a）の銅イオン処理に（b）の酸処理を併用することが好ましい。 Among these activation processes (a) to (c), (a) and (b) are preferred. These activation treatments may be performed alone or in any combination of two or more treatments. For example, among catechol oxidases, when using a microbial composition having tyrosinase, particularly tyrosinase derived from Aspergillus oryzae, it is preferable to use (b) acid treatment in combination with (a) copper ion treatment.
斯くして調製される本発明の微生物組成物は、微生物全体に占める生存微生物の割合（微生物の生存率）が、前述するように９１％以下であることを特徴とする。好ましくは７０％以下、より好ましくは６０％以下、さらに好ましくは５％以下、特に好ましくは０％である。 The microbial composition of the present invention thus prepared is characterized in that the proportion of viable microorganisms in the whole microorganisms (microbe survival rate) is 91% or less as described above. Preferably it is 70% or less, More preferably, it is 60% or less, More preferably, it is 5% or less, Most preferably, it is 0%.
なお、ここで微生物の生存率は、例えば微生物が酵母の場合は、メチレンブルー染色法を用いて測定することができる（「清酒醸造技術」1979年3月30日、p.169、財団法人日本醸造協会発行）。これは、酵母の死滅細胞はメチレンブルーによって青く染色することを利用したものである。具体的には、酵母組成物を0.01％のメチレンブルー溶液を加えて懸濁し、次いで顕微鏡下で酵母細胞のメチレンブルー染色率を求め、その値から酵母の生存率（％）を算出することができる。 Here, the survival rate of microorganisms can be measured using, for example, a methylene blue staining method when the microorganism is yeast (“Sake Brewing Technology”, March 30, 1979, p.169, Nippon Brewing Co., Ltd.). Issued by the association). This utilizes the fact that yeast dead cells are stained blue with methylene blue. Specifically, the yeast composition is suspended by adding a 0.01% methylene blue solution, and then the methylene blue staining rate of the yeast cells is determined under a microscope, and the survival rate (%) of the yeast can be calculated from the value.
また、細胞障害処理後の微生物組成物の溶液を適宜希釈し、あらかじめ顕微鏡にて菌数を数えておき、この溶液を平板培地に塗布し、30〜37℃で24〜72時間培養し、生育したコロニー数を数えて、細胞障害処理前後の生存率の変化を測定してもよい。 In addition, the solution of the microbial composition after cell injury treatment is appropriately diluted, the number of bacteria is counted in advance with a microscope, this solution is applied to a plate medium, cultured at 30 to 37 ° C. for 24 to 72 hours, and grown. The number of colonies obtained may be counted and the change in the survival rate before and after the cell damage treatment may be measured.
また、細胞障害処理前後の微生物組成物の溶液を適宜希釈して平板培地に塗布し、30〜37℃で24〜72時間培養し、生育したコロニー数を数えて細胞障害処理前後の生存率の変化を測定してもよい。 In addition, the solution of the microbial composition before and after the cell damage treatment is appropriately diluted and applied to a plate medium, cultured at 30 to 37 ° C. for 24 to 72 hours, and the number of grown colonies is counted to determine the survival rate before and after the cell damage treatment. Changes may be measured.
また本発明の微生物組成物は、微生物組成物１ｇあたりのカテコールオキシダーゼ活性が１.７ｋＵ以上であることを特徴とする。好ましくは３〜１５ｋＵ／ｇ、より好ましくは５〜１５ｋＵ／ｇである。 The microbial composition of the present invention is characterized in that the catechol oxidase activity per 1 g of the microbial composition is 1.7 kU or more. Preferably it is 3-15 kU / g, More preferably, it is 5-15 kU / g.
ここでカテコールオキシダーゼ活性は、カテコールオキシダーゼの種類に応じて適切な基質化合物を用いることで測定することができる。 Here, the catechol oxidase activity can be measured by using an appropriate substrate compound according to the type of catechol oxidase.
例えば、カテコールオキシダーゼがカテコールオキシダーゼ活性を有する酵素である場合、カテコールオキシダーゼ活性の測定は、基質化合物としてカテコールを用いて、微生物組成物を反応させて、ベンゾキノンの生成を測定することで実施することができる。 For example, when catechol oxidase is an enzyme having catechol oxidase activity, the measurement of catechol oxidase activity can be carried out by measuring the production of benzoquinone by reacting a microbial composition with catechol as a substrate compound. it can.
また、カテコールオキシダーゼがチロシナーゼ活性を有する酵素である場合、カテコールオキシダーゼ活性の測定は、基質化合物としてL-POPAを用いて微生物組成物を反応させて、得られる反応液の475nmにおける吸光度を測定することにより実施することができる。この場合の微生物組成物のカテコールオキシダーゼ活性（チロシナーゼ活性）は、具体的には、微生物組成物と0.8μmolのL-DOPAを含む溶液（１Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH6.0））1mLを、30℃で５分間反応させた場合の475nmにおける吸光度を測定することで実施することができる。この場合、吸光度を１増加させる活性が１Ｕとなる。微生物組成物のカテコールオキシダーゼ活性（Ｕ/ｇ）は、微生物組成物について上記方法で得られる活性（Ｕ）を、反応に用いた微生物の重量（ｇ）で除することによって算出することができる。 When catechol oxidase is an enzyme having tyrosinase activity, catechol oxidase activity is measured by reacting a microbial composition with L-POPA as a substrate compound and measuring the absorbance at 475 nm of the resulting reaction solution. Can be implemented. Specifically, the catechol oxidase activity (tyrosinase activity) of the microbial composition in this case is 1 mL of a solution (1M sodium phosphate buffer (pH 6.0)) containing the microbial composition and 0.8 μmol of L-DOPA. This can be carried out by measuring the absorbance at 475 nm when reacted at 30 ° C. for 5 minutes. In this case, the activity to increase the absorbance by 1 is 1U. The catechol oxidase activity (U / g) of the microbial composition can be calculated by dividing the activity (U) obtained by the above method for the microbial composition by the weight (g) of the microorganism used in the reaction.
（II）酵素製剤
前述する本発明の微生物組成物は、そのままの状態で酵素製剤とすることができる。この場合、微生物組成物の形態は、特に制限されず、例えば、水等の極性溶媒またはこれらの混合液に懸濁させた状態であってもよいし、冷凍状態でもよい。また乾燥固体状態に調製したものであってもよいし、粉末状態でもよい。また、担体結合法、包括法、架橋法、光架橋法等の公知の方法で、任意の担体に固定化させた状態のものであってもよい。
(II) Enzyme preparation The microorganism composition of the present invention described above can be used as an enzyme preparation as it is. In this case, the form of the microbial composition is not particularly limited, and may be, for example, a state suspended in a polar solvent such as water or a mixture thereof, or a frozen state. Moreover, what was prepared in the dry solid state may be sufficient and a powder state may be sufficient. Further, it may be in a state of being immobilized on an arbitrary carrier by a known method such as a carrier binding method, a comprehensive method, a crosslinking method, or a photocrosslinking method.
本発明の酵素製剤は、前述する本発明の微生物組成物を有効成分とするものであればよく、微生物組成物だけからなるものであってもよいが、酵素の安定性向上、金属イオン除去の目的で、エチレンジアミン四酢酸、またはその塩、水和物等の化合物などを配合してなるものであってもよい。 The enzyme preparation of the present invention only needs to contain the above-described microbial composition of the present invention as an active ingredient, and may consist of only the microbial composition. For the purpose, compounds such as ethylenediaminetetraacetic acid or a salt or hydrate thereof may be blended.
本発明の酵素製剤は、そのカテコールオキシダーゼ活性、好ましくはチロシナーゼ活性に基づいて、L-DOPA又はその誘導体を基質化合物として、メラニンまたはメラニン前駆体を製造するために好適に使用される。 The enzyme preparation of the present invention is suitably used for producing melanin or a melanin precursor using L-DOPA or a derivative thereof as a substrate compound based on its catechol oxidase activity, preferably tyrosinase activity.
ここで基質化合物としてのL-DOPA又はその誘導体の具体例としては、 (2)Ｄ体又はＬ体のドーパ〔DOPA；3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)アラニン〕、(3)ドーパミン（Dopamine；3,4-ジヒドロキシフェネチルアミン）、(4)チロシンの低級(Ｃ1-4)アルキルエステル、(5)DOPAの低級(Ｃ1-4)アルキルエステル、(6)N-アルコキシ（例；アセトキシ）化又はN-アルキル（例；エチル）化されたDOPA等が挙げられ、これらの異性体であってもよい。中でも、天然型メラニン前駆体が得られる点で、L-DOPAが好ましい。これらL-DOPA又はその誘導体は、いずれかを１種単独で、又は２種以上を組み合わせて用いることができる。 Specific examples of L-DOPA or a derivative thereof as a substrate compound include: (2) D-form or L-form dopa [DOPA; 3- (3,4-dihydroxyphenyl) alanine], (3) Dopamine (Dopamine) 3,4-dihydroxyphenethylamine), (4) tyrosine lower (C1-4) alkyl ester, (5) DOPA lower (C1-4) alkyl ester, (6) N-alkoxy (eg, acetoxy) or Examples thereof include DOPA converted to N-alkyl (eg, ethyl), and these isomers may be used. Among these, L-DOPA is preferable because a natural melanin precursor can be obtained. Any of these L-DOPAs or derivatives thereof can be used alone or in combination of two or more.
また上記でいうメラニン前駆体とは、L-DOPA又はその誘導体から製造され、かつ空気中の酸素ですみやかに酸化重合しメラニンを形成する物質であり、具体例としては、5,6-ジヒドロキシインドリン、5,6-ジヒドロキシインドリン-2-カルボン酸等のインドリン誘導体、5,6-ジヒドロキシインドール、5,6-ジヒドロキシインドール-2-カルボン酸等のインドール誘導体などを示す。DOPAはその酸化重合速度が遅いため、本発明にいうメラニン前駆体に含まない。また、チロシンからの酸化反応中間体として、ドーパクロム、インドールキノン等が存在するが、これらは短期間しか安定でなく長期間（例えば１ヶ月）の安定性を有しないため、商品としては利用できない。従って、これらも本発明にいうメラニン前駆体には含まない。更に、メラニン前駆体は、必ずしもモノマーに限られるものではなく、二量体以上のオリゴマーも含まれる。 The melanin precursor mentioned above is a substance that is produced from L-DOPA or a derivative thereof, and is oxidatively polymerized with oxygen in the air to form melanin. Specific examples include 5,6-dihydroxyindoline. , Indoline derivatives such as 5,6-dihydroxyindoline-2-carboxylic acid, and indole derivatives such as 5,6-dihydroxyindole and 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid. DOPA is not included in the melanin precursor referred to in the present invention because of its slow oxidative polymerization rate. In addition, dopachrome, indolequinone, and the like exist as intermediates for oxidation reaction from tyrosine, but these are stable only for a short period and have long-term stability (for example, 1 month), and thus cannot be used as commercial products. Therefore, these are not included in the melanin precursor referred to in the present invention. Furthermore, the melanin precursor is not necessarily limited to a monomer, and includes oligomers of dimers or higher.
（III）微生物組成物のカテコールオキシダーゼ活性を向上させる方法
本発明はまた微生物組成物におけるカテコールオキシダーゼの活性を向上させる方法を提供する。
(III) Method for Improving Catechol Oxidase Activity of Microbial Composition The present invention also provides a method for improving the activity of catechol oxidase in a microbial composition.
当該方法は、カテコールオキシダーゼを含有する微生物組成物を、細胞障害処理した後に、活性化処理を行うことによって実施することができる。 The method can be carried out by subjecting a microbial composition containing catechol oxidase to a cell damage treatment followed by an activation treatment.
ここで「カテコールオキシダーゼ」、および「カテコールオキシダーゼを含有する微生物組成物」の意味およびその調製方法は、（Ｉ）で説明した通りである。また、「細胞障害処理」および「活性化処理」の意味およびその方法についても、前述（Ｉ）の通りである。 Here, the meaning of “catechol oxidase” and “microbial composition containing catechol oxidase” and the preparation method thereof are as described in (I). Further, the meanings and methods of “cytotoxic treatment” and “activation treatment” are as described in (I) above.
斯くして、細胞障害処理した後、活性化処理されてなる微生物組成物は、細胞障害処理することなく活性化処理されてなる微生物組成物と比べて、生存率は低下するものの高いカテコールオキシダーゼ活性を有している。具体的には、実験例１に示すように、細胞障害処理することなく活性化処理したチロシナーゼ含有微生物組成物（比較例）は、生存率が96％、チロシナーゼ活性が0.4kU/gであったのに対して、細胞障害処理した後、活性化処理した微生物組成物（実施例１〜３）は、生存率が0〜91％と低下するものの、チロシナーゼ活性は1.7〜11.1kU/gと、4〜30倍もチロシナーゼ活性が向上することが確認された。 Thus, the microbial composition obtained after the cell damage treatment is activated, but has a higher catechol oxidase activity although the survival rate is lower than the microorganism composition activated without the cell damage treatment. have. Specifically, as shown in Experimental Example 1, the tyrosinase-containing microbial composition (comparative example) activated without cell damage treatment had a survival rate of 96% and a tyrosinase activity of 0.4 kU / g. In contrast, the microbial compositions (Examples 1 to 3) that were activated after the cell damage treatment had a survival rate of 0 to 91%, but the tyrosinase activity was 1.7 to 11.1 kU / g, It was confirmed that the tyrosinase activity was improved 4 to 30 times.
かかる方法によれば、高いカテコールオキシダーゼ活性を有する微生物組成物を調製することができ、例えばメラニンやメラニン前駆体の製造に有用な、酵素活性の高い微生物酵素剤として提供することができる。 According to this method, a microbial composition having high catechol oxidase activity can be prepared, and for example, it can be provided as a microbial enzyme agent having high enzyme activity useful for the production of melanin and melanin precursor.
（IV）酵素製剤を用いたメラニン前駆体の製造方法
本発明はまた（II）で説明する本発明の酵素製剤を用いてメラニン前駆体を製造する方法を提供する。当該方法は、少なくとも下記の２工程を含む方法によって実施することができる。
(IV) Method for Producing Melanin Precursor Using Enzyme Preparation The present invention also provides a method for producing a melanin precursor using the enzyme preparation of the present invention described in (II). This method can be performed by a method including at least the following two steps.
(a)酸化反応工程
本発明の酵素製剤の存在下で、3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)アラニン（DOPA)及びその類縁体からなる群より選ばれる少なくとも１種の基質化合物を酸化してメラニン前駆体に変換する工程、
(b)回収工程
(a)で得られた反応液からメラニン前駆体を回収する工程。
(a) Oxidation reaction step In the presence of the enzyme preparation of the present invention, at least one substrate compound selected from the group consisting of 3- (3,4-dihydroxyphenyl) alanine (DOPA) and its analogs is oxidized. Converting to a melanin precursor,
(b) Recovery process
A step of recovering the melanin precursor from the reaction solution obtained in (a).
＜基質化合物＞
(a)工程において、基質化合物としては、前述するようにDOPA及びDOPA類縁体からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物を使用する。DOPA及びDOPA類縁体は、L体又はD体のいずれであってもよい。DOPA類縁体としては、ドーパミン（Dopamine）や、DOPAメチルエステル、DOPAエチルエステルおよびα−メチルDOPA等が挙げられ、これらの異性体であってもよい。中でも、天然型メラニン前駆体が得られる点で、L-DOPAを用いることが好ましく、酵素に対する親和性の点でもL-DOPAを用いることが好ましい。なお、基質化合物は１種を単独で使用してもよいし、２種以上を任意に組み合わせて用いてもよい。
<Substrate compound>
In the step (a), as the substrate compound, as described above, at least one compound selected from the group consisting of DOPA and DOPA analogs is used. DOPA and DOPA analogs may be either L-form or D-form. Examples of DOPA analogs include dopamine, DOPA methyl ester, DOPA ethyl ester and α-methyl DOPA, and these isomers may be used. Among these, L-DOPA is preferably used from the viewpoint of obtaining a natural melanin precursor, and L-DOPA is also preferably used from the viewpoint of affinity for the enzyme. In addition, a substrate compound may be used individually by 1 type, and may be used in combination of 2 or more types arbitrarily.
＜酸化反応＞
(a)工程において、酸化反応は、上記基質化合物を水に溶解した状態で行ってもよいし、また水に完全に溶解させることなく非溶解状態で行ってもよい。
<Oxidation reaction>
In the step (a), the oxidation reaction may be performed in a state in which the substrate compound is dissolved in water, or may be performed in an insoluble state without being completely dissolved in water.
酸化反応開始時の基質化合物の濃度は、溶解及び非溶解にかかわらず、通常10〜60 mM程度、好ましくは15〜40 mM程度である。当該濃度は、溶解及び非溶解状態にかかわらず、基質化合物の含有量を意味する。 The concentration of the substrate compound at the start of the oxidation reaction is usually about 10 to 60 mM, preferably about 15 to 40 mM, regardless of dissolution or non-dissolution. The concentration means the content of the substrate compound regardless of the dissolved and undissolved state.
また反応液のpHは、前述する酵素製剤が基質化合物の酸化反応を触媒できる範囲であればよく、特に限定されない。通常pH4〜9程度であり、好ましくはpH5〜7程度である。余りに低pHであると基質化合物の酸化が進行せず、逆に余りに高pHであると生成したメラニン前駆体が蓄積せずに重合してしまうが、上記範囲であれば、メラニン前駆体の重合を抑えて反応液中に効率よくメラニン前駆体を蓄積させることができる。 The pH of the reaction solution is not particularly limited as long as the enzyme preparation described above can catalyze the oxidation reaction of the substrate compound. The pH is usually about 4 to 9, and preferably about pH 5 to 7. If the pH is too low, the oxidation of the substrate compound will not proceed. Conversely, if the pH is too high, the generated melanin precursor will polymerize without accumulating, but if it is in the above range, polymerization of the melanin precursor will occur. The melanin precursor can be efficiently accumulated in the reaction solution while suppressing the above.
反応液のpHは、緩衝液を用いることにより上記範囲に維持することもできるが、塩濃度が高いとメラニン前駆体の重合によるメラニンの生成(メラニン化)が促進される場合がある。このため、KOH、NaOHのような強アルカリ及びH2SO4のような強酸を少量添加することにより、反応液中のpHを上記範囲に調整しコントロールすることが好ましい。 The pH of the reaction solution can be maintained in the above range by using a buffer solution. However, when the salt concentration is high, the formation of melanin (melanization) by polymerization of the melanin precursor may be promoted. For this reason, it is preferable to adjust and control the pH in the reaction solution within the above range by adding a small amount of a strong alkali such as KOH or NaOH and a strong acid such as H 2 SO 4 .
反応液中の酵素製剤の配合量は、1molのL-DOPAを基質化合物とした場合の酸化活性が、5×105U/mol以上となる範囲内で、少なければ少ないほど良い。尚、酵素製剤の活性は、酵素製剤と0.8μmolのDOPAを含む溶液１mLを30℃で５分間反応させた場合の475nmにおける吸光度を光路長1 cmあたり１増加させる活性を１Uとして計算される。反応液への酵素製剤の投入量は、通常反応液の体積に対して20容量％以下が好ましく、10容量％以下がより好ましい。上記の範囲内であれば、反応後の菌体分離を容易に行えることにより、メラニン前駆体の収率を高くすることができる。 The blending amount of the enzyme preparation in the reaction solution is preferably as small as possible so that the oxidation activity when 1 mol of L-DOPA is used as a substrate compound is 5 × 10 5 U / mol or more. The activity of the enzyme preparation is calculated with 1 U as the activity to increase the absorbance at 475 nm by 1 per 1 cm of optical path length when 1 mL of a solution containing the enzyme preparation and 0.8 μmol of DOPA is reacted at 30 ° C. for 5 minutes. The input amount of the enzyme preparation into the reaction solution is usually preferably 20% by volume or less, more preferably 10% by volume or less, relative to the volume of the reaction solution. If it is in said range, the yield of a melanin precursor can be made high because the bacterial cell separation after reaction can be performed easily.
反応温度は、酵素製剤が基質化合物の酸化反応を触媒できる範囲であればよく、特に限定されないが、通常15〜35℃程度に調整することが好ましく、20〜30℃程度に調整することがより好ましい。上記範囲内であれば、十分に酸化反応が進行するとともに、酵素が失活し難く、またメラニン化が進行し難い。 The reaction temperature is not particularly limited as long as the enzyme preparation can catalyze the oxidation reaction of the substrate compound, but it is usually preferably adjusted to about 15 to 35 ° C, more preferably about 20 to 30 ° C. preferable. Within the above range, the oxidation reaction proceeds sufficiently, the enzyme is hardly deactivated, and melanization is difficult to proceed.
反応開始直後は、酸化反応に大量の酸素が必要であるため、大量に通気することが好ましい。但し、攪拌速度が速すぎると微生物が損傷するため、反応液中の酸素濃度を監視し、酸素濃度が低下しなくなれば通気量および攪拌速度を減少することが好ましい。反応液中の酸素濃度は0.1〜8 ppm程度に調整することが好ましく、1〜2 ppm程度に調整することがより好ましい。通気や撹拌により反応液中に大量の泡が生じる場合は、シリコーン樹脂のような消泡剤を添加してもよい。また、密閉容器で反応を行うことにより、発泡を防ぐこともできる。 Immediately after the start of the reaction, a large amount of oxygen is required for the oxidation reaction. However, if the stirring speed is too high, microorganisms are damaged. Therefore, it is preferable to monitor the oxygen concentration in the reaction solution and reduce the aeration rate and stirring speed if the oxygen concentration does not decrease. The oxygen concentration in the reaction solution is preferably adjusted to about 0.1 to 8 ppm, more preferably about 1 to 2 ppm. When a large amount of foam is generated in the reaction solution by aeration or stirring, an antifoaming agent such as a silicone resin may be added. Moreover, foaming can be prevented by carrying out the reaction in a sealed container.
反応は、バッチ式又は連続式の何れであってもよい。未反応の基質化合物と生成物を分離できる点でバッチ式が好ましい。バッチ式の場合の反応時間は、通常10分〜2時間程度とするのが好ましく、30分〜1時間程度とするのがより好ましい。余りに長時間反応させると生成したメラニン前駆体の重合反応（メラニン化）が進行してしまうためメラニン前駆体の収率が低下するが、上記程度の反応時間であれば、基質化合物を十分メラニン前駆体に変換できるとともに、メラニン化を最小限に抑えることができる。 The reaction may be either batch type or continuous type. The batch method is preferable in that an unreacted substrate compound and a product can be separated. In the case of a batch system, the reaction time is usually preferably about 10 minutes to 2 hours, more preferably about 30 minutes to 1 hour. If the reaction is carried out for too long, the polymerization reaction (melanization) of the produced melanin proceeds and the yield of the melanin precursor is reduced. However, if the reaction time is as described above, the substrate compound is sufficiently converted into the melanin precursor. It can be converted into the body and melanization can be minimized.
＜メラニン前駆体の回収＞
斯くして調製されたメラニン前駆体を含む反応液（メラニン前駆体含有溶液）には、メラニン前駆体のほかに、使用した酵素又は微生物、更には通気及び撹拌により細胞が破損して生じたタンパク質又は細胞から流出したタンパク質や、メラニン前駆体が重合したメラニンも含まれる。従って、必要に応じて、反応液からメラニン前駆体以外の成分を除去してもよい。例えば酵素や微生物細胞の除去は、限外ろ過等のろ過、遠心分離等の手段により行うことができる。また、タンパク質やメラニンの除去は、限外ろ過、ゲルろ過クロマトグラフィー等の手段により行うことができる。
<Recovery of melanin precursor>
In addition to the melanin precursor, the reaction solution containing the melanin precursor thus prepared (melanin precursor-containing solution) includes the enzyme or microorganism used, and also proteins produced by cell damage due to aeration and agitation. Or the protein which flowed out from the cell and the melanin which the melanin precursor superposed | polymerized are also contained. Therefore, you may remove components other than a melanin precursor from a reaction liquid as needed. For example, the removal of enzymes and microbial cells can be carried out by means such as filtration such as ultrafiltration and centrifugation. Moreover, protein and melanin can be removed by means such as ultrafiltration and gel filtration chromatography.
なお、調製されたメラニン前駆体は、必要に応じてさらに、(i)ｐＨ調整処理、(ii)水溶性有機溶媒の添加、(iii)無機塩の添加、(iv)緩衝液による処理、(v)酸化防止剤の添加等の処理を行ってもよい。かかる処理を行うことで、メラニン前駆体溶液中の5,6-ジヒドロキシインドール及び5,6-ジヒドロキシインドール-2-カルボン酸のいずれかの濃度を高めることができる。これらの処理は、２種以上を組み合わせて用いてもよく、特に上記(i)ｐＨ調整時に(ii)〜(v)のいずれか１以上を組み合わせると、より効率的に5,6-ジヒドロキシインドール及び5,6-ジヒドロキシインドール-2-カルボン酸の濃度を高めることができる。 In addition, the prepared melanin precursor is further subjected to (i) pH adjustment treatment, (ii) addition of water-soluble organic solvent, (iii) addition of inorganic salt, (iv) treatment with buffer, v) Treatment such as addition of an antioxidant may be performed. By performing such treatment, the concentration of any of 5,6-dihydroxyindole and 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid in the melanin precursor solution can be increased. These treatments may be used in combination of two or more, and in particular, when any one or more of (ii) to (v) is combined during the pH adjustment (i) above, 5,6-dihydroxyindole is more efficient. And the concentration of 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid can be increased.
また、メラニン前駆体含有溶液は、さらに必要に応じて、逆浸透膜濃縮、減圧濃縮、スプレードライ、凍結乾燥等の公知の方法で水分を除去するか又は乾燥することで、濃縮状態または乾燥状態（乾燥粉末）に調製することもできる。また、メラニン前駆体含有溶液にそのまま、または濃縮後、防腐を目的としてエタノール等の低級アルコールを添加することもできる。 In addition, the melanin precursor-containing solution is further concentrated or dried by removing moisture or drying by a known method such as reverse osmosis membrane concentration, vacuum concentration, spray drying, freeze drying, etc. (Dry powder) can also be prepared. Further, a lower alcohol such as ethanol can be added to the melanin precursor-containing solution as it is or after concentration for the purpose of preserving.
なお、この場合、エタノールの濃度が高いほど、高い防腐効果が得られる反面、メラニン前駆体含有溶液中に含まれ得る無機塩類の溶解度が低下し、低温保管時の不溶物析出の可能性が高まる。これを考慮すると、好ましいエタノール濃度は１８〜２２重量％である。この範囲でエタノールを含むことによって不溶物の析出防止と防腐効果を同時に満たすことができる。より好ましくは１９〜２１重量％、最も好ましくは２０重量％程度である。なお、当該メラニン前駆体含有溶液には、本発明の効果が妨げられない限りにおいて、水およびエタノール以外の極性溶媒が含まれていてよい。かかる極性溶媒としては、例えばメタノール、プロパノール、ブタノール、ヘキサノール等の炭素数１〜６の低級アルコール、およびアセトン等を挙げることができる。 In this case, the higher the concentration of ethanol, the higher the antiseptic effect is obtained, but the solubility of inorganic salts that can be contained in the melanin precursor-containing solution decreases, and the possibility of insoluble matter precipitation during low-temperature storage increases. . Considering this, the preferable ethanol concentration is 18 to 22% by weight. By containing ethanol in this range, it is possible to satisfy both the prevention of precipitation of insoluble materials and the antiseptic effect at the same time. More preferably, it is 19 to 21% by weight, and most preferably about 20% by weight. The melanin precursor-containing solution may contain a polar solvent other than water and ethanol as long as the effects of the present invention are not hindered. Examples of the polar solvent include lower alcohols having 1 to 6 carbon atoms such as methanol, propanol, butanol, and hexanol, and acetone.
メラニン前駆体含有溶液は、制限されないが、それに含まれるメラニン前駆体（好ましくは、5,6-ジヒドロキシインドール）の濃度が、好ましくは０.８〜１.２重量％、より好ましくは０.９〜１.１重量％、さらに好ましくは１重量％程度になるように調整されることが好ましい。かかる5,6-ジヒドロキシインドールの含有量は、HPLC分析法で、5,6-ジヒドロキシインドール標準品を用いて、絶対検量線法により測定（定量）することができる。 The melanin precursor-containing solution is not limited, but the concentration of the melanin precursor (preferably 5,6-dihydroxyindole) contained therein is preferably 0.8 to 1.2% by weight, more preferably 0.9. It is preferably adjusted to be about -1.1 wt%, more preferably about 1 wt%. The content of 5,6-dihydroxyindole can be measured (quantitatively) by an absolute calibration curve method using a 5,6-dihydroxyindole standard product by HPLC analysis.
またメラニン前駆体含有溶液は、塩化物イオン濃度が300ppm以下になるように調整することが好ましい。塩化物イオン濃度を300ppm以下にすることで、これを金属製の容器に収納した場合でも金属を腐食させる危険性を低下させることができる。好ましくは100ppm以下、より好ましくは20〜60ppmである。当該塩化物イオン濃度は、HPLC分析法により測定することができる。 The melanin precursor-containing solution is preferably adjusted so that the chloride ion concentration is 300 ppm or less. By setting the chloride ion concentration to 300 ppm or less, the risk of corroding the metal can be reduced even when it is housed in a metal container. Preferably it is 100 ppm or less, More preferably, it is 20-60 ppm. The chloride ion concentration can be measured by HPLC analysis.
以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例、比較例および実験例等を挙げる。しかし、本発明はこれら実施例等になんら限定されるものではない。 Examples, comparative examples, and experimental examples will be given below to describe the present invention in more detail. However, the present invention is not limited to these examples.
調製例 カテコールオキシダーゼ産生微生物（melB産生酵母）の調製
カテコールオキシダーゼとしてチロシナーゼ（melB）、微生物として酵母（Saccharomyces cerevisiae）を用いて、カテコールオキシダーゼ産生微生物を調製した。なお、チロシナーゼ（melB）は麹菌Aspergillus oryzaeから単離された酵素である（特許第3903125号公報）。そのアミノ酸配列、並びにそれをコードするmelB遺伝子のクローニング方法およびその塩基配列も、上記特許第3903125号公報に記載されている。
Preparation example Preparation of catechol oxidase-producing microorganism (melB-producing yeast) A catechol oxidase-producing microorganism was prepared using tyrosinase (melB) as the catechol oxidase and yeast (Saccharomyces cerevisiae) as the microorganism. Tyrosinase (melB) is an enzyme isolated from Aspergillus oryzae (Japanese Patent No. 3903125). The amino acid sequence, the method for cloning the melB gene encoding it, and its base sequence are also described in the above-mentioned Japanese Patent No. 3903125.
（1）チロシナーゼ遺伝子（melB遺伝子）のクローニング
特許第3903125号公報の記載に従って、麹菌Aspergillus oryzaeからmelB遺伝子をクローニングした。具体的には、麹菌「Aspergillus oryzae OSI-1013」株（受託番号FERM P-16528、平成9年11月20日に日本国茨城県つくば市東1-1-1 つくばセンター 中央第6に住所を有する独立行政法人産業技術総合研究所・特許生物寄託センター（旧：工業技術院生命工学工業技術研究所・特許微生物寄託センター）に寄託）を蒸米に接種し、製麹した麹を1.5g秤量し、液体窒素中で完全に破砕した。日本ジーン社製ISOGENを用いて、これから240μgの全RNAを抽出した。120μgの全RNAからタカラバイオ株式会社製Oligotex-dT30<Super>を用いて、１μgのmRNAを精製した。このmRNAを、Clontech社製SMART cDNA Library Construction KitによりcDNAライブラリーを作成し、PCRによりmelB cDNAのみを増幅した。得られたPCR産物はアガロースゲル電気泳動で、目的の約1.8Kbpのバンドのみが増幅されていることを確認した。また、塩基配列解析の結果、正常にイントロン配列が取り除かれていることも確認した。なお、特許第3903125号公報の配列番号２に記載されているmelB遺伝子の塩基配列のうち、1〜1436番目の塩基配列はプロモーター領域、3636〜4174番目の塩基配列はターミネーター領域に相当し、1437〜3635番目の塩基配列は、melB cDNAに相当するコーティング領域に相当する。
(1) Cloning of tyrosinase gene (melB gene) The melB gene was cloned from Aspergillus oryzae as described in Japanese Patent No. 3903125. Specifically, the Aspergillus oryzae OSI-1013 strain (Accession number FERM P-16528, on November 20, 1997 1-1-1 Higashi Tsukuba City, Ibaraki, Japan Tsukuba Center Central 6th address Incorporated to the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center (formerly deposited at the Biotechnology Institute of Industrial Technology, Patent Microorganism Deposit Center), weighed 1.5g of the koji rice cake, Completely crushed in liquid nitrogen. 240 μg of total RNA was extracted from this using ISOGEN manufactured by Nippon Gene. 1 μg of mRNA was purified from 120 μg of total RNA using Oligotex-dT30 <Super> manufactured by Takara Bio Inc. From this mRNA, a cDNA library was prepared by SMART cDNA Library Construction Kit manufactured by Clontech, and only melB cDNA was amplified by PCR. The obtained PCR product was confirmed by agarose gel electrophoresis to amplify only the target band of about 1.8 Kbp. As a result of the base sequence analysis, it was also confirmed that the intron sequence was normally removed. Of the nucleotide sequence of the melB gene described in SEQ ID NO: 2 of Japanese Patent No. 3903125, the nucleotide sequence of 1 to 1436 corresponds to the promoter region, and the nucleotide sequence of 3636 to 4174 corresponds to the terminator region. The -3635th base sequence corresponds to the coating region corresponding to melB cDNA.
（2）酵母への組み込み
上記（1）で得られたmelB cDNAを、酵母Saccharomyces cerevisiae用発現ベクター（特開2003-265177号公報）に発現可能な状態で接続した。具体的には、特開2003-265177号公報の記載に準じて、SED1プロモーターとADH１ターミネーターを持つ上記発現ベクターのプロモーター直下のSmaI部位に、上記（a）で取得したmelB cDNAを挿入した。URA3マーカー内部に存在するStuI部位で切断することにより得られるmelB cDNAを含む断片を導入用カセットとして精製した。
(2) Integration into yeast The melB cDNA obtained in (1) above was ligated into an expression vector for yeast Saccharomyces cerevisiae (Japanese Patent Laid-Open No. 2003-265177) in a state where it can be expressed. Specifically, the melB cDNA obtained in (a) above was inserted into the SmaI site immediately below the promoter of the expression vector having the SED1 promoter and the ADH1 terminator according to the description in JP-A-2003-265177. A fragment containing melB cDNA obtained by cutting at the StuI site present inside the URA3 marker was purified as an introduction cassette.
これを定法に従って、酵母（Saccharomyces cerevisiae）に導入し、melB産生酵母を調製した。なお、酵母は、清酒の醸造に用いられる実用酵母・協会９号由来のウラシル要求性株については、日本醸造教会から入手できる清酒の醸造に用いられる実用酵母・協会９号の５−フルオロオロチジン酸耐性を利用した公知の陽性選択方法により取得することができる。 This was introduced into yeast (Saccharomyces cerevisiae) according to a standard method to prepare melB-producing yeast. In addition, about the uracil requirement strain | stump | stock derived from the practical yeast and association No. 9 used for sake brewing, the yeast is the use of the yeast and association No. 9 5-fluoroorotidine of the practical yeast used for sake brewing available from the Japan Brewing Church It can be obtained by a known positive selection method using acid resistance.
比較例 melB産生酵母のチロシナーゼ活性化
調製例に記載する方法で得られたmelB産生酵母（組換え酵母）を常法により培養し、遠心分離によって菌体を回収し、次いで蒸留水で洗浄した。次いで、菌体（湿重量約100mg）に0.1mMの硫酸銅を含む水溶液１mLを加え、40℃で20分間保持した。その後、遠心分離により菌体を回収し、これに50mMの酢酸緩衝液（NaOAc-HCl）（pH3.0）１mLに懸濁し、室温で10分間静置した。その後、遠心分離により菌体を回収し、過剰な銅イオンを除去するため20mMのEDTA溶液（KOHを使用してpH5に調整）で洗浄し、遠心分離して菌体を回収した。
Comparative Example Melol-producing yeast (recombinant yeast) obtained by the method described in the preparation example of tyrosinase activation of melB-producing yeast was cultured by a conventional method, and the cells were collected by centrifugation and then washed with distilled water. Next, 1 mL of an aqueous solution containing 0.1 mM copper sulfate was added to the cells (wet weight of about 100 mg), and the mixture was kept at 40 ° C. for 20 minutes. Thereafter, the cells were collected by centrifugation, suspended in 1 mL of 50 mM acetate buffer (NaOAc-HCl) (pH 3.0), and allowed to stand at room temperature for 10 minutes. Thereafter, the cells were collected by centrifugation, washed with a 20 mM EDTA solution (adjusted to pH 5 using KOH) to remove excess copper ions, and centrifuged to collect the cells.
斯くして活性化処理された菌体を水1mLに懸濁し、実験例１の菌体生存率およびチロシナーゼ活性の測定に供した。 The cells thus activated were suspended in 1 mL of water and subjected to the measurement of the cell viability and tyrosinase activity in Experimental Example 1.
実施例１ melB産生酵母の冷凍処理およびチロシナーゼ活性化
調製例に記載する方法で得られたmelB産生酵母（組換え酵母）を常法により培養し、遠心分離によって菌体を回収し、次いで蒸留水で洗浄した。次いで、菌体（湿重量約100mg）を−20℃冷凍庫内で冷凍し４ヶ月間保存した。
Example 1 Freezing treatment of melB-producing yeast and activation of tyrosinase The melB-producing yeast (recombinant yeast) obtained by the method described in the preparation example was cultured by a conventional method, and the cells were collected by centrifugation, and then distilled water Washed with. Next, the cells (wet weight of about 100 mg) were frozen in a −20 ° C. freezer and stored for 4 months.
冷凍保存後、室温に戻すことにより解凍した菌体（湿重量約100mg）を用いて、比較例と同様に活性化処理を行った。具体的には上記菌体に0.1mMの硫酸銅を含む水溶液１mLを加え、40℃で20分間保持した。次いで、遠心分離により菌体を回収し、これに50mMの酢酸緩衝液（NaOAc-HCl）（pH3.0）１mLに懸濁し、室温で10分間静置した。その後、遠心分離により菌体を回収し、20mMのEDTA溶液（KOHを使用してpH5に調整）で洗浄し、遠心分離して菌体を回収した。 After cryopreservation, activation treatment was performed in the same manner as in the comparative example, using cells that had been thawed by returning to room temperature (wet weight of about 100 mg). Specifically, 1 mL of an aqueous solution containing 0.1 mM copper sulfate was added to the cells, and the cells were kept at 40 ° C. for 20 minutes. Subsequently, the cells were collected by centrifugation, suspended in 1 mL of 50 mM acetate buffer (NaOAc-HCl) (pH 3.0), and allowed to stand at room temperature for 10 minutes. Thereafter, the cells were collected by centrifugation, washed with a 20 mM EDTA solution (adjusted to pH 5 using KOH), and centrifuged to collect the cells.
斯くして活性化処理された菌体を水1mLに懸濁し、実験例１における菌体生存率およびチロシナーゼ活性の測定に供した。 The cells thus activated were suspended in 1 mL of water and used for the measurement of cell viability and tyrosinase activity in Experimental Example 1.
実施例２ melB産生酵母の乾燥処理およびチロシナーゼ活性化
調製例に記載する方法で得られたmelB産生酵母（組換え酵母）を常法により培養し、遠心分離によって菌体を回収し、次いで蒸留水で洗浄した。次いで、菌体（湿重量約100mg）をシャーレに薄く広げ、60℃の通風乾燥機に入れ、3時間通風することにより乾燥させた。
Example 2 Dry treatment of melB-producing yeast and tyrosinase activation Preparation The melB-producing yeast (recombinant yeast) obtained by the method described in the preparation example was cultured by a conventional method, and the cells were collected by centrifugation, and then distilled water Washed with. Next, the cells (wet weight of about 100 mg) were spread thinly on a petri dish, put in a ventilation dryer at 60 ° C., and dried by ventilation for 3 hours.
斯くして乾燥した菌体を用いて、比較例と同様に活性化処理を行った。具体的には菌体を0.1mMの硫酸銅を含む水溶液１mLを加え、40℃で20分間保持した。次いで、遠心分離により菌体を回収し、これに50mMの酢酸緩衝液（NaOAc-HCl）（pH3.0）１mLに懸濁し、室温で10分間静置した。その後、遠心分離により菌体を回収し、20mMのEDTA溶液（KOHを使用してpH5に調整）で洗浄し、遠心分離して菌体を回収した。 Thus, the activation process was performed like the comparative example using the dried microbial cell. Specifically, 1 mL of an aqueous solution containing 0.1 mM copper sulfate was added to the cells and maintained at 40 ° C. for 20 minutes. Subsequently, the cells were collected by centrifugation, suspended in 1 mL of 50 mM acetate buffer (NaOAc-HCl) (pH 3.0), and allowed to stand at room temperature for 10 minutes. Thereafter, the cells were collected by centrifugation, washed with a 20 mM EDTA solution (adjusted to pH 5 using KOH), and centrifuged to collect the cells.
斯くして活性化処理された菌体を水1mLに懸濁し、実験例１における菌体生存率およびチロシナーゼ活性の測定に供した。 The cells thus activated were suspended in 1 mL of water and used for the measurement of cell viability and tyrosinase activity in Experimental Example 1.
実施例３ melB産生酵母の界面活性剤処理およびチロシナーゼ活性化
調製例に記載する方法で得られたmelB産生酵母（組換え酵母）を常法により培養し、遠心分離によって菌体を回収し、次いで蒸留水で洗浄した。次いで、菌体（湿重量約100mg）を、表１に記載する各種濃度（0.1、0.4、0.8および2.0重量％）に調製した界面活性剤（塩化ベンザルコニウム）の水溶液（15℃）に、0.5時間浸漬した。
Example 3 Surfactant treatment of melB-producing yeast and tyrosinase activation The melB-producing yeast (recombinant yeast) obtained by the method described in the preparation example was cultured by a conventional method, and the cells were collected by centrifugation, Washed with distilled water. Next, the microbial cells (wet weight of about 100 mg) were added to an aqueous solution (15 ° C.) of a surfactant (benzalkonium chloride) prepared in various concentrations (0.1, 0.4, 0.8 and 2.0 wt%) described in Table 1. Soaked for 0.5 hours.
浸漬後、遠心分離によって菌体を回収し、次いで蒸留水で洗浄した菌体（湿重量約100mg）を用いて、比較例と同様に活性化処理を行った。具体的には菌体を0.1mMの硫酸銅を含む水溶液１mLを加え、40℃で20分間保持した。次いで、遠心分離により菌体を回収し、これに50mMの酢酸緩衝液（NaOAc-HCl）（pH3.0）１mLに懸濁し、室温で10分間静置した。その後、遠心分離により菌体を回収し、20mMのEDTA溶液（KOHを使用してpH5に調整）で洗浄し、遠心分離して菌体を回収した。 After immersion, the cells were collected by centrifugation, and then activated using the cells washed with distilled water (wet weight of about 100 mg) in the same manner as in the comparative example. Specifically, 1 mL of an aqueous solution containing 0.1 mM copper sulfate was added to the cells and maintained at 40 ° C. for 20 minutes. Subsequently, the cells were collected by centrifugation, suspended in 1 mL of 50 mM acetate buffer (NaOAc-HCl) (pH 3.0), and allowed to stand at room temperature for 10 minutes. Thereafter, the cells were collected by centrifugation, washed with a 20 mM EDTA solution (adjusted to pH 5 using KOH), and centrifuged to collect the cells.
斯くして活性化処理された菌体を水1mLに懸濁し、実験例１における菌体生存率およびチロシナーゼ活性の測定に供した。 The cells thus activated were suspended in 1 mL of water and used for the measurement of cell viability and tyrosinase activity in Experimental Example 1.
実験例１
比較例および実施例１〜３でそれぞれ調製した活性化処理菌体について、菌体の生存率（％）および菌体のチロシナーゼ活性を測定した。
Experimental example 1
For the activated cells prepared in Comparative Example and Examples 1 to 3, the survival rate (%) of the cells and the tyrosinase activity of the cells were measured.
（1）菌体の生存率（％）の測定
酵母の死滅細胞はメチレンブルーによって青く染色する。そこでメチレンブルー染色法を用いて（「清酒醸造技術」1979年3月30日、p.169、財団法人日本醸造協会発行）、顕微鏡下で酵母細胞のメチレンブルー染色率を求め、それから酵母細胞全体に占める生菌の割合（酵母生存率）（％）を算出した。メチレンブルーによる菌体の染色は、細胞障害処理後の溶液を100倍希釈し、希釈溶液100μLと0.01％メチレンブルー溶液900μLを懸濁し、5分以内に顕微鏡で観察することで行った。
(1) Measurement of the survival rate (%) of bacterial cells Dead yeast cells are stained blue with methylene blue. Therefore, using the methylene blue staining method ("Sake Brewing Technology", March 30, 1979, p.169, published by the Japan Brewing Association), the methylene blue staining rate of yeast cells was determined under a microscope, and then occupied by the whole yeast cells The ratio of viable bacteria (yeast survival rate) (%) was calculated. Staining of the cells with methylene blue was performed by diluting the solution after cell damage treatment 100 times, suspending 100 μL of the diluted solution and 900 μL of 0.01% methylene blue solution, and observing with a microscope within 5 minutes.
（2）菌体のチロシナーゼ活性の測定
菌体のチロシナーゼ活性の測定は、基質としてL-DOPAを用いて、次のようにして行った。
(2) Measurement of tyrosinase activity of bacterial cells The measurement of tyrosinase activity of bacterial cells was performed as follows using L-DOPA as a substrate.
（i）菌体の一部を水に懸濁し、その0.1mLに30℃の10mM L-DOPA（0.005Ｎの塩酸に溶解）0.8mL及び１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（pH6.0）0.1mLを添加し（合計1mL）、30℃で５分間反応させる。 (I) Suspend part of the cells in water and add 0.1 mL of 30 mL of 10 mM L-DOPA (dissolved in 0.005 N hydrochloric acid) and 0.1 mL of 1 M sodium phosphate buffer (pH 6.0) to 0.1 mL. Add (1 mL total) and react at 30 ° C. for 5 minutes.
（ii）次いで、15,000rpmで30秒間遠心分離を行うことにより菌体を取り除き、上清の475nmにおける吸光度を測定する。なお、このとき、菌体量は、反応後の反応液の475nmにおける吸光度が0.1〜0.3に収まるように調整する。 (Ii) Next, the cells are removed by centrifugation at 15,000 rpm for 30 seconds, and the absorbance of the supernatant at 475 nm is measured. At this time, the amount of bacterial cells is adjusted so that the absorbance at 475 nm of the reaction solution after the reaction falls within 0.1 to 0.3.
なお、チロシナーゼ活性１Uは、0.8μmolのL-DOPAを含む溶液1mLを30℃で５分間反応させた場合の475nmにおける吸光度を1増加させる活性を意味する。菌体のチロシナーゼ活性（kU/ g）は、下式に示すように、反応液（菌体除去後の上清）のチロシナーゼ活性（kU）を、反応に用いた菌体の重量（g）で除して算出した。 Tyrosinase activity 1U means an activity to increase the absorbance at 475 nm by 1 when 1 mL of a solution containing 0.8 μmol of L-DOPA is reacted at 30 ° C. for 5 minutes. As shown in the following formula, the tyrosinase activity (kU / g) of the microbial cell is the tyrosinase activity (kU) of the reaction solution (supernatant after microbial cell removal) by the weight (g) of the microbial cell used in the reaction. Divided by the calculation.
（3）結果
実施例１〜３で調製した菌体、および比較例で調製した菌体について測定した生存率（％）とチロシナーゼ活性（1kU/g）を表１に示す。
(3) Results Table 1 shows the survival rate (%) and tyrosinase activity (1 kU / g) measured for the cells prepared in Examples 1 to 3 and the cells prepared in Comparative Examples.
この結果から、melB産生酵母に、銅処理および酸処理を用いたチロシナーゼ活性処理を施す前に、細胞障害処理として、冷凍処理（実施例１）、乾燥処理（実施例２）または界面活性剤（塩化ベンザルコニウム）処理（実施例３）を行うことにより、酵素を効率的に活性化させることが分かる。その活性化と、細胞障害処理による菌体生存率との間には、ほぼ負の相関関係があり、細胞障害処理によって細胞がダメージを受け菌体生存率が低下するほど、その後の活性化処理によってチロシナーゼが効率的に活性化されることが判明した。 From this result, before subjecting melB-producing yeast to tyrosinase activity treatment using copper treatment and acid treatment, as cell damage treatment, freezing treatment (Example 1), drying treatment (Example 2) or surfactant ( It turns out that an enzyme is activated efficiently by performing a benzalkonium chloride treatment (Example 3). There is an almost negative correlation between the activation and the cell viability due to the cell damage treatment. The more the cell damage is caused by the cell damage treatment, the more the cell viability decreases, and the subsequent activation treatment Was found to efficiently activate tyrosinase.
また、実施例３の結果からわかるように、0.4％以上の界面活性剤の使用で菌体生存率が０％になり、それ以上の濃度の殺菌剤を使用しても、得られる菌体のチロシナーゼ活性は同じでチロシナーゼ活性は向上しなかった。このことから、活性化処理によるチロシナーゼ活性の向上に影響するのは、細胞障害処理の種類よりも、むしろ細胞障害処理による菌体生存率の低下（菌体全体に占める死菌の割合の増加）であると考えられた。 In addition, as can be seen from the results of Example 3, the survival rate of the bacterial cells becomes 0% by using 0.4% or more of the surfactant, and even if a higher concentration of the fungicide is used, The tyrosinase activity was the same and the tyrosinase activity was not improved. From this, the improvement in tyrosinase activity due to the activation treatment affects the decrease in the cell viability due to the cell damage treatment rather than the type of cell damage treatment (increase in the proportion of dead bacteria in the whole cell) It was thought that.
実験例２
実験例１で、塩化ベンザルコニウムを用いた界面活性剤処理が、活性化処理の前処理として有効であることが判明したので、ここでは実施例３で使用した塩化ベンザルコニウム0.1〜2重量％に代えて、表２に示す種々の第４級アンモニウム塩（0.5重量％）を用いて、実施例３に記載する方法で活性化処理菌体を調製し、実験例１と同様にして菌体の生存率（％）と菌体のチロシナーゼ活性（kU/g）を測定した。結果を表２に示す。
Experimental example 2
In Experimental Example 1, it was proved that the surfactant treatment using benzalkonium chloride was effective as a pretreatment for the activation treatment, so here, benzalkonium chloride used in Example 3 0.1 to 2 wt. In the same manner as in Experimental Example 1, bacterial cells were prepared by the method described in Example 3 using various quaternary ammonium salts (0.5% by weight) shown in Table 2 instead of%. Body viability (%) and tyrosinase activity (kU / g) of the cells were measured. The results are shown in Table 2.
この結果より、塩化ベンザルコニウム同様に、細胞障害性のある陽イオン系界面活性剤（第４級アンモニウム塩）を用いた前処理により、その後の活性化処理によって、チロシナーゼが効率的に活性化されることが判明した。 As a result, as with benzalkonium chloride, tyrosinase is efficiently activated by pretreatment using a cationic surfactant (quaternary ammonium salt) having cytotoxicity and subsequent activation treatment. Turned out to be.
実験例３
実験例２で、陽イオン系界面活性剤（第４級アンモニウム塩）を用いた界面活性剤処理が、活性化処理の前処理として有効であることが判明したので、ここでは実施例３で使用した塩化ベンザルコニウム0.1〜2重量％に代えて、表３に示す種々の界面活性剤（0.3重量％）をアルカリ性条件下で用いて、実施例３に記載する方法で活性化処理菌体を調製し、実験例１と同様にして菌体の生存率（％）と菌体のチロシナーゼ活性（kU/g）を測定した。
Experimental example 3
In Experimental Example 2, it was found that the surfactant treatment using a cationic surfactant (quaternary ammonium salt) was effective as a pretreatment for the activation treatment. In place of 0.1 to 2% by weight of benzalkonium chloride, the various cells (0.3% by weight) shown in Table 3 were used under alkaline conditions, and the activated cells were treated by the method described in Example 3. The cell viability (%) and the cell tyrosinase activity (kU / g) were measured in the same manner as in Experimental Example 1.
結果を表３に示す。 The results are shown in Table 3.
これらの結果から、カテコールオキシダーゼ含有微生物組成物について、活性化処理に先だって、冷凍処理、乾燥処理および界面活性剤処理など、菌体を死に至らしめるような細胞障害性を与える処理を行うことで、その後の活性化処理により、カテコールオキシダーゼが効率的に活性化されることが確認された。 From these results, the catechol oxidase-containing microorganism composition is subjected to a treatment that gives cytotoxicity such as a freezing treatment, a drying treatment, and a surfactant treatment, which causes cell death, prior to the activation treatment, It was confirmed that catechol oxidase is efficiently activated by the subsequent activation treatment.
Claims (12)
（１）微生物の生存率が０〜９１％、
（２）カテコールオキシダーゼ活性が１.７ｋＵ/ｇ以上。 Microbial composition containing active catechol oxidase having the following characteristics:
(1) The survival rate of microorganisms is 0 to 91%,
(2) Catechol oxidase activity is 1.7 kU / g or more.
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