JP2011008000A - 蛍光観察装置および蛍光観察方法 - Google Patents

Abstract

【課題】深さ方向に増殖や変位する標本を長時間にわたって安定して観察する。
【解決手段】励起光を発生する励起光源７と、該励起光源７からの励起光を標本Ａに照射し、標本Ａにおいて発生した蛍光を集光する対物レンズ８と、対物レンズ８と励起光源７との間において蛍光を分岐する光路分岐部９と、該光路分岐部９において分岐された蛍光を撮影して標本Ａの蛍光像を取得する撮像素子１５と、該撮像素子１５と光路分岐部９との間の対物レンズ８の瞳位置と光学的に共役な位置に配置された可変絞り１６とを備える蛍光観察装置１を提供する。
【選択図】図１

Description

本発明は、蛍光観察装置および蛍光観察方法に関するものである。

従来、対物レンズを介して標本に励起光を照射し、標本において発生した蛍光を対物レンズにより集光して観察する落射照明方式の蛍光顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照。）。この蛍光顕微鏡においては、複数の対物レンズを備え、レボルバーによって対物レンズを交換可能とすることで、開口数の異なる対物レンズを切り替えて配置することができるようになっている。

対物レンズの開口数を異ならせることで、被写界深度を変更し、空間分解能を調節することができるようになっている。また、レボルバーを使用することなく、対物レンズ自体に可変絞りを設けることで、当該可変絞りを調節して被写界深度を調節することができるものも知られている。

特開平６−３３７３５８号公報

しかしながら、対物レンズの交換あるいは対物レンズに設けた可変絞りの調節によって被写界深度を調節する従来の蛍光顕微鏡では、取得される蛍光像の被写界深度を調節することはできるものの、同じ対物レンズを介して標本に照射される励起光自体も絞られてしまうという不都合がある。

対物レンズに設けた絞りによって蛍光のみならず励起光も絞られてしまう場合には、被写界深度および励起光量という２つのパラメータが同時に変化することになるので、これらのパラメータがどの程度の割合で観察画像の変化に寄与しているのかを判断することが困難である。また、対物レンズの交換または対物レンズの可変絞りの調節時に対物レンズの位置が変動した場合、励起光の照射範囲が変化してしまうことになるので安定した観察を行うことができないという不都合がある。

本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、深さ方向に増殖や変位する標本を長時間にわたって安定して観察することができる蛍光観察装置および蛍光観察方法を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、励起光を発生する励起光源と、該励起光源からの励起光を標本に照射し、標本において発生した蛍光を集光する対物レンズと、該対物レンズと前記励起光源との間において蛍光を分岐する光路分岐部と、該光路分岐部において分岐された蛍光を撮影して標本の蛍光像を取得する撮像素子と、該撮像素子と前記光路分岐部との間の前記対物レンズの瞳位置と光学的に共役な位置に配置された可変絞りとを備える蛍光観察装置を提供する。

本発明によれば、励起光源から出射された励起光が対物レンズを介して標本に照射されることにより、標本内に存在する蛍光物質が励起されて蛍光が発生する。発生した蛍光は、対物レンズにより集光され、対物レンズと励起光源との間において光路分岐部により分岐される。光路分岐部により励起光源への光路とは別の光路に分岐された蛍光は、可変絞りを通過した後に撮像素子により撮影される。これにより、瞬時に広い視野範囲の蛍光画像が取得される。

この場合において、本発明によれば、瞬時に取得される広い視野範囲の蛍光画像の焦点深度を深くする場合には、光路分岐部と撮像素子との間に配置されている可変絞りを絞る。これにより、撮像素子に入射する蛍光の開口数を小さくすることができ、蛍光画像の焦点深度が深くなる。したがって、このようにすることで、瞬時に取得される広い視野範囲の蛍光画像には、標本の厚さ方向の広い範囲から発生する蛍光が撮影されるので、蛍光発生部位の所在を瞬時に確認することができる。

そして、この場合に、可変絞りが、光路分岐部と撮像素子との間に配置されているので、光路分岐部において別の光路から対物レンズに入射される励起光については、可変絞りの状態に関わらず、一定の光量の励起光を標本に照射することができる。その結果、標本に照射する励起光量を変化させることなく、厚さ方向に異なる範囲の標本の蛍光像を観察することができる。

上記発明においては、前記標本の状態に応じて前記可変絞りを調節する絞り制御部を備えていてもよい。
このようにすることで、標本の経時変化を観察する場合に、標本の状態が変化してもこれに応じて絞り制御部が可変絞りを調節し、標本の状態の変化に追従させて、被写界深度を調節することができる。例えば、標本が生細胞である場合に、標本が経時的に厚さ方向に移動したり、成長したりしても、可変絞りを調節して標本を逃すことなく観察することができる。

また、上記発明においては、前記絞り制御部が、前記撮像素子により取得した蛍光像を処理してボケ成分量を算出し、算出されたボケ成分量に基づいて前記可変絞りを調節することにしてもよい。
このようにすることで、標本が対物レンズの光軸方向に移動することによって、ボケ成分量が増大した場合に、絞り制御部がボケ成分量を算出してボケ成分量が少なくなる方向に可変絞りを調節することにより、標本の移動に追従して、長期間にわたり安定した観察を行うことができる。

また、上記発明においては、観察時間を計数するタイマーを備え、前記絞り制御部が、前記タイマーにより計数された前記観察時間に基づいて前記可変絞りを調節してもよい。
このようにすることで、標本の経時変化がある程度予測できる場合、例えば、時間経過とともに変化する標本の厚さの変化の仕方が予めわかっている場合には、タイマーにより計数された観察時間に応じて可変絞りを調節することにより、標本を逃すことなく観察することができる。

また、上記発明においては、前記絞り制御部が、前記可変絞りの開口量を前記観察時間の関数として記憶し、前記タイマーにより計数された前記観察時間を用いて前記関数により前記可変絞りの開口量を算出してもよい。
このようにすることで、標本の経時変化がある関数に従って起こる場合には、タイマーにより計数された観察時間を使用して、記憶している関数により算出される開口量に可変絞りを調節することにより、標本を逃すことなく観察することができる。

また、上記発明においては、前記撮像素子により取得した蛍光像の明るさを検出する蛍光量検出部と、該蛍光量検出部により検出された蛍光像の明るさに基づいて前記撮像素子の感度を調節する感度調節部とを備えていてもよい。
このようにすることで、可変絞りの調節によって撮影される蛍光量が低下した場合においても、感度調節部により撮像素子の感度を上げることで、取得される蛍光画像の明るさを維持することができる。

また、本発明は、対物レンズを介して標本に励起光を照射する励起光照射ステップと、前記標本において発生し前記対物レンズにより集光し、集光された前記蛍光の絞り量を、前記励起光の光路から分岐した後の前記対物レンズの瞳位置と光学的に共役な位置において調節する絞り調節ステップと、該絞り調節ステップにおいて絞り量が調節された蛍光を撮影して標本の蛍光像を取得する撮像ステップとを含む蛍光観察方法を提供する。

本発明によれば、深さ方向に増殖や変位する標本を長時間にわたって安定して観察することができるという効果を奏する。

本発明の一実施形態に係る蛍光観察装置を示す全体構成図である。 図１の蛍光観察装置の制御部を示す機能ブロック図である。 図１の蛍光観察装置を用いた蛍光観察方法を示すフローチャートである。 図３の蛍光観察方法において、蛍光画像のボケ成分量に基づいて可変絞りを調節する方法を説明するフローチャートである。 図１の蛍光観察装置により観察される標本の状態の経時的な変化を示す図であって、（ａ）の状態から（ｂ）の状態へ時間が経過するに従って深さ方向に増殖した標本を示す図である。 図２の制御部の変形例を示す機能ブロック図である。 図２の制御部の他の変形例を示す機能ブロック図である。

本発明の一実施形態に係る蛍光観察装置１および蛍光観察方法について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る蛍光観察装置１は、図１に示されるように、装置本体２と、ＣＣＤ観察部３と、制御部４と、モニタ５とを備えている。

装置本体２は、標本Ａを載置するステージ６と、該ステージ６上に載置された標本Ａに対して照射する励起光を発生する励起光源７と、該励起光源７からの励起光を集光して標本Ａに照射する一方、標本Ａにおいて発生した蛍光を集光する対物レンズ８と、該対物レンズ８により集光された蛍光を励起光の光路から分岐するダイクロイックミラー９とを備えている。

励起光源７は、例えば、白色光を発生する水銀ランプ光源１０と、該水銀ランプ光源１０から発せられた白色光から、例えば、蛍光指示薬あるいは発現させた蛍光タンパク質の励起波長の励起光のみを通過する励起フィルタ１１とを備えている。
ダイクロイックミラー９は、励起フィルタ１１を通過した励起光を反射し、蛍光を透過させる波長特性を有している。

ＣＣＤ観察部３は、装置本体２のダイクロイックミラー９によって分岐された蛍光を集光するリレーレンズ１２，１３と、該リレーレンズ１２，１３によって集光された蛍光を集光する結像レンズ１４と、該結像レンズ１４によって集光された蛍光を撮影するＣＣＤ（撮像素子）１５とを備えている。
また、ＣＣＤ観察部３は、リレーレンズ１２，１３とＣＣＤ１５との間に、リレーレンズ１２，１３によってリレーされた対物レンズ８の瞳位置と光学的に共役な位置に配置された可変絞り１６を備えている。

制御部４は、ＣＣＤ観察部３のＣＣＤ１５および可変絞り１６に接続されている。制御部４は、図２に示されるように、ＣＣＤ１５により取得された画像信号を受けて蛍光画像を生成する画像生成部１７と、該画像生成部１７により生成された蛍光画像を処理してボケ成分量を算出するコントラスト検出部１８と、該コントラスト検出部１８により検出されたボケ成分量に基づいて可変絞り１６を調節する絞り調節部１９とを備えている。また、制御部４は、ＣＣＤ１５により取得され画像生成部１７により生成された蛍光画像を記録する記録部２０を備えている。

このように構成された本実施形態に係る蛍光観察装置１を用いた蛍光観察方法について以下に説明する。
本実施形態に係る蛍光観察装置１を用いて標本の蛍光観察を行うには、図３に示されるように、励起光源７を構成する水銀ランプ光源１０を作動させて白色光を発生させ、励起フィルタ１１を透過した励起光をダイクロイックミラー９によって反射させて対物レンズ８を介してステージ６上の標本Ａに面照明する（励起光照射ステップＳ１）。

励起光が照射されると、標本Ａ内に存在している蛍光薬剤あるいは発現させた蛍光タンパク質が励起され、蛍光が発生する。標本Ａにおいて発生した蛍光は全方位に発せられるため、対物レンズ８の全開口数を満たして対物レンズ８に入射する。対物レンズ８に入射した蛍光は、対物レンズ８によって集光され、ダイクロイックミラー９を透過してＣＣＤ観察部３に入射する。

ＣＣＤ観察部３へ入射した蛍光は、リレーレンズ１２，１３を透過して可変絞り１６に入射する。可変絞り１６は対物レンズ８の瞳位置と光学的に共役な位置に配置されているので、可変絞り１６を絞ることによって、ＣＣＤ１５への入射開口数が制限される（絞り調節ステップＳ２）。可変絞り１６を通過した蛍光は結像レンズ１４によって集光される。これにより、ＣＣＤ１５の撮像面に、標本Ａの蛍光像が投影され、画像信号が取得される（撮像ステップＳ３）。この場合において、ＣＣＤ１５へ入射する蛍光の入射開口数により、蛍光像の焦点深度（被写界深度）が決定される。ＣＣＤ１５は撮像面に入射した光の強度に応じた画像信号を制御部４に送る。

制御部４においては、図４に示されるように、ＣＣＤ１５から送られてきた画像信号に基づいて画像生成部１７において蛍光画像が生成され（ステップＳ１０）、コントラスト検出部１８によって蛍光画像が処理されてボケ成分量が算出される（ステップＳ１１）。そして、制御部４においては、このボケ成分量が所定の閾値以下であるか否かが判定される（ステップＳ１２）。

ボケ成分量が閾値を超えて発生した場合には、可変絞り１６を絞ることによって入射開口数を制限し、焦点深度を深くする（ステップＳ１３）。これにより、標本Ａの深さ方向に広い範囲にわたって合焦されるので、ボケ成分量を低下させてコントラストを一定に維持することができる。一方、ボケ成分量が閾値以下である場合には、この画像を記憶部２０に記憶する（ステップＳ１４）。そして、いずれの場合においても、所定の時間間隔をあけた後（ステップＳ１５）に、ステップＳ１０〜Ｓ１４を繰り返す。

例えば、標本Ａが生細胞である場合に、図５に示されるように、観察時間の経過とともに標本Ａが深さ方向へ増殖したり成長したり、あるいは、移動したりする場合があり、このような場合に、焦点深度を調節することによって、標本Ａへの合焦状態を維持して高いコントラストで標本Ａを安定して観察し続けることができる。

この場合において、本実施形態に係る蛍光観察装置１および蛍光観察方法によれば、可変絞り１６がダイクロイックミラー９とＣＣＤ１５との間に配置されているので、可変絞り１６の開口量を調節して焦点深度を変化させても、励起光源７からの励起光については変動させずに済むという利点がある。すなわち、励起光源７からの励起光の照射条件については変動させることなく、焦点深度のみを自由に変更することができる。

また、本実施形態に係る蛍光観察装置１および蛍光観察方法によれば、ダイクロイックミラー９とＣＣＤ１５との間に配置された可変絞り１６によって焦点深度を調節するので、焦点深度の調節にあたって、励起光の照射状態を変化させずに済むという利点がある。すなわち、対物レンズ８の切り替えや、対物レンズ８に設けた可変絞りの調節等を行わないので、励起光源７から標本Ａに至る光路上に配置された光学系を変動させずに済む。したがって、絞り調節の際の振動や位置ずれの発生を未然に防止することができる。

なお、本実施形態においては、蛍光画像を処理してボケ成分量を算出し、これに基づいてコントラストが所定の閾値以下に低下しないようにコントラストの安定を図ることとしたが、これに代えて、図６に示されるように、制御部４に観察時間を計数するタイマー２１を接続し、制御部４が、タイマー２１により計数された観察時間に応じて可変絞り１６の開口量を調節することにしてもよい。

制御部４は、絞り調節部１９が、計数された観察時間の経過とともに可変絞り１６の開口量を小さくしていくことにより、焦点深度を深くしていくことができる。その結果、観察時間の経過とともに標本Ａが深さ方向へ増殖したり成長したり、あるいは、移動したりしても、標本Ａへの合焦状態を維持して高いコントラストで標本Ａを安定して観察し続けることができる。

この場合に、観察時間に応じて変化させる可変絞り１６の開口量の変化のさせ方については、観察時間に比例して変化させてもよいし、予め生細胞の成長が予測できる場合には、所定の関数に従って変化させてもよい。

また、可変絞り１６を制御して焦点深度を調節する場合に、図７に示されるように、可変絞り１６の開口量に応じてＣＣＤ１５により取得される蛍光画像の明るさが変化するので、制御部４の絞り調節部（蛍光量検出部）１９から出力される信号によって、可変絞り１６の開口量に応じてＣＣＤ１５のゲインを調節することにしてもよい。このようにすることで、可変絞り１６の開口量にかかわらず、一定の明るさの蛍光画像による観察を行うことができる。

また、本実施形態においては、撮像素子としてＣＣＤ１５を採用したが、これに限定されるものではなく、ＣＭＯＳその他の任意の撮像素子を採用してもよい。
また、ボケ成分量に基づく可変絞り１６の制御および観察時間に基づく可変絞り１６の制御を同時に行うことにしてもよい。

Ａ 標本
Ｓ１ 励起光照射ステップ
Ｓ２ 絞り調節ステップ
Ｓ３ 撮像ステップ
１ 蛍光観察装置
７ 励起光源
８ 対物レンズ
９ ダイクロイックミラー（光路分岐部）
１５ ＣＣＤ（撮像素子）
１６ 可変絞り
１９ 絞り調節部（蛍光量検出部）
２１ タイマー

Claims (7)

1. 励起光を発生する励起光源と、
   該励起光源からの励起光を標本に照射し、標本において発生した蛍光を集光する対物レンズと、
   該対物レンズと前記励起光源との間において蛍光を分岐する光路分岐部と、
   該光路分岐部において分岐された蛍光を撮影して標本の蛍光像を取得する撮像素子と、
   該撮像素子と前記光路分岐部との間の前記対物レンズの瞳位置と光学的に共役な位置に配置された可変絞りとを備える蛍光観察装置。
2. 前記標本の状態に応じて前記可変絞りを調節する絞り調節部を備える請求項１に記載の蛍光観察装置。
3. 前記絞り調節部が、前記撮像素子により取得した蛍光像を処理してボケ成分量を算出し、算出されたボケ成分量に基づいて前記可変絞りを調節する請求項２に記載の蛍光観察装置。
4. 観察時間を計数するタイマーを備え、
   前記絞り調節部が、前記タイマーにより計数された前記観察時間に基づいて前記可変絞りを調節する請求項２に記載の蛍光観察装置。
5. 前記絞り調節部が、前記可変絞りの開口量を前記観察時間の関数として記憶し、前記タイマーにより計数された前記観察時間を用いて前記関数により前記可変絞りの開口量を算出する請求項４に記載の蛍光観察装置。
6. 前記撮像素子により取得した蛍光像の明るさを検出する蛍光量検出部と、
   該蛍光量検出部により検出された蛍光像の明るさに基づいて前記撮像素子の感度を調節する感度調節部とを備える請求項１から請求項５のいずれかに記載の蛍光観察装置。
7. 対物レンズを介して標本に励起光を照射する励起光照射ステップと、
   前記標本において発生し前記対物レンズにより集光し、集光された前記蛍光の絞り量を、前記励起光の光路から分岐した後の前記対物レンズの瞳位置と光学的に共役な位置において調節する絞り調節ステップと、
   該絞り調節ステップにおいて絞り量が調節された蛍光を撮影して標本の蛍光像を取得する撮像ステップとを含む蛍光観察方法。

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