JP2010513462A - VII, and Factor VIIa composition - Google Patents

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アンデルセン,キム・ビルブール
イエルゲンセン,トマス
ドルストルプ,イエルン
マーラー,ハンス−クリステイアン
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バイエル・ヘルスケア・エルエルシー
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Abstract

本発明は、第VII因子もしくは第VIIa因子ポリペプチドまたはそのポリペプチドバリアントおよび緩衝剤としてヒスチジンを含んでなる安定化組成物に関する。 The present invention relates to stabilized compositions comprising histidine as Factor VII or Factor VIIa polypeptide or a polypeptide variant thereof and a buffer.
【選択図】なし .BACKGROUND

Description

[関連出願へのクロスリファレンス] [CROSS-REFERENCE TO RELATED APPLICATIONS
本願は、2006年12月20日に出願された米国仮特許出願第60/870,948号への優先権およびその利益を請求し、その開示は全ての目的のためにその全部が引用することにより本明細書に組み込まれる。 It present application claims priority to and the benefit of the U.S. Provisional Patent Application No. 60 / 870,948, filed Dec. 20, 2006, the disclosure of which is in its entirety for all purposes reference which is incorporated herein by.

本発明は、第VII因子もしくは第VIIa因子ポリペプチドまたはそのポリペプチドバリアントの貯蔵安定性組成物に関する。 The present invention relates to a Factor VII or storage stability composition Factor VIIa polypeptide or a polypeptide variant thereof.

血液凝固カスケードにおける重要な血液凝固タンパク質、第VII因子(FVII)は、肝臓において合成されそして50キロダルトン(kDa)の分子量を有する一本鎖糖タンパク質として血液中に分泌されるビタミンK依存性血漿タンパク質である。 Important blood clotting protein in the blood coagulation cascade, Factor VII (FVII), is synthesized in the liver and fifty kilodalton (kDa) vitamin K-dependent plasma as a single chain glycoprotein with a molecular weight is secreted into the blood of it is a protein. FVIIチモーゲンは、単一部位R152−I153でのタンパク質分解切断により活性型第VIIa因子(FVIIa)に転化され、単一のジスルフィド架橋により連結された2本鎖をもたらす。 FVII zymogen, by proteolytic cleavage at a single site R152-I153 is converted into an active form Factor VIIa (FVIIa), resulting in two chains linked by a single disulfide bridge. 組換ヒトFVIIaは、NovoSeven (R)の名称でNovo Nordiskから市販されており、そして出血エピソードの処置に、例えば血友病もしくは外傷において使用され、血液凝固/凝血を促進する。 Recombinant human FVIIa is commercially available from Novo Nordisk under the name NovoSeven (R), and for the treatment of bleeding episodes, are used, for example, hemophilia or trauma, promote blood clotting / coagulation. ヒトFVIIもしくはFVIIaの組換えで製造されたバリアントもまた、報告されている。 Variants produced by recombinant human FVII or FVIIa also been reported.

NovoSeven (R)は、使用前に再構成されなければならない凍結乾燥したFVIIa製品である。 NovoSeven (R) is a FVIIa product lyophilized must be reconstituted prior to use. NovoSeven (R)のバイアル(1.2mg)は、1.2mgの組換えヒトFVIIa(rhFVIIa)、5.84mgのNaCl、2.94mgのCaCl ,2H O、2.64mgのグリシルグリシン、0.14mgのポリソルベート80および60.0mgのマンニトールを含有し;それは2.0mlの注射用水によりpH5.5に再構成される。 Vials NovoSeven (R) (1.2mg) is recombinant human FVIIa (rhFVIIa) of 1.2 mg, NaCl of 5.84mg, CaCl 2 of 2.94mg, 2H 2 O, 2.64mg of glycylglycine, polysorbate 80 and 60.0mg mannitol 0.14 mg; it is reconstructed to pH5.5 by water for injection 2.0 ml. 再構成されると、該タンパク質は使用のために2〜8℃で24時間安定である。 Upon reconstitution, the protein is stable for 24 hours at 2 to 8 ° C. for use.

使いやすさのために液体形態でFVII/FVIIaのような治療用タンパク質を提供できることは一般に好都合であるが、乾燥形態とは対照的に液体形態のタンパク質の減少した安定性のために、そのようなタンパク質は、十分な長期貯蔵安定性を得るために乾燥形態、例えば凍結乾燥(lyophilized)(凍結乾燥(freeze−dried))形態で提供されることが多い。 Is a generally convenient to be able to provide a therapeutic protein, such as FVII / FVIIa in liquid form for ease of use, the dry form due to the reduced stability of a protein in contrast liquid form, such a protein, dry form in order to obtain sufficient long-term storage stability, for example, freeze-dried (lyophilized) (lyophilized (freeze-dried)) is often provided in the form. 貯蔵中のタンパク質の不安定性は、変性もしくは凝集の結果としての物理的不安定性、および加水分解、アミド分解もしくは酸化の結果としての化学的不安定性を包含する様々な原因を有し得る。 Protein instability during storage, physical instability as a result of denaturation or aggregation, and hydrolysis may have a variety of causes including chemical instability as a result of deamidation or oxidation. この化学的および/もしくは物理的分解の結果には、FVII活性のかなりの喪失だけでなく、タンパク質凝集体の存在に起因する免疫原性反応も包含することができる。 The chemical and / or a result of physical degradation, as well as significant loss of FVII activity, immunogenic response due to the presence of protein aggregates can also be included. さらに、自己タンパク質分解ドメインを有するタンパク質およびペプチドは、液体投与形態物における貯蔵の際に自己消化する傾向があるので、これらによって特別な課題が提示される。 Moreover, proteins and peptides with autoproteolytic domain, there is a tendency to self-digestion during storage in a liquid dosage form, a special problem is presented by these.

FVII/FVIIaタンパク質の凍結乾燥製剤は、例えば特許文献1、特許文献2、特許文献3および特許文献4に記述される。 Lyophilized formulation of FVII / FVIIa protein, for example, Patent Documents 1 and 2, are described in Patent Documents 3 and 4. FVII/FVIIaの様々な組成物もしくは製剤が既知であるが、まだ改善の余地がある。 Various compositions or formulations of FVII / FVIIa but is known, there is still room for improvement.

WO 01/12653 WO 01/12653 WO 03/092731 WO 03/092731 WO 2004/000347 WO 2004/000347 WO 2005/058283 WO 2005/058283

[発明の要約] [Summary of the Invention]
1つの態様において、本発明は、再構成組成物におけるヒスチジンの濃度が少なくとも約5ミリモル(mM)である、第VII因子もしくは第VIIa因子ポリペプチド(例えば、rhFVIIもしくはrhFVIIa)および緩衝剤としてヒスチジンを含んでなる、水での再構成に適当な凍結乾燥組成物を提供する。 In one aspect, the present invention, the concentration of histidine in the reconstituted composition is at least about 5 millimolar (mM), Factor VII or Factor VIIa polypeptide (e.g., rhFVII or rhFVIIa) histidine and as a buffering agent Naru comprise, providing a suitable lyophilized composition for reconstitution with water. 組成物は、賦形剤もしくは担体を含んでなることができる。 The composition may comprise an excipient or carrier. ある態様において、組成物は、再構成組成物におけるヒスチジンの濃度が少なくとも約5mMである、製薬学的に許容しうる賦形剤もしくは担体および第VII因子もしくは第VIIa因子ポリペプチドおよび緩衝剤としてヒスチジンを含んでなる製薬学的組成物である。 In some embodiments, the composition, the concentration of histidine in the reconstituted composition is at least about 5 mM, pharmaceutically acceptable excipients or carriers and the Factor VII or histidine as the Factor VIIa polypeptide and a buffering agent They comprise a pharmaceutical composition.

別の態様において、本発明は、再構成組成物におけるヒスチジンの濃度が少なくとも約5mMである、第VII因子もしくは第VIIa因子ポリペプチドバリアント(例えば、本明細書に記述されるような凝固活性を有するFVIIもしくはFVIIaポリペプチドバリアント)および緩衝剤としてヒスチジンを含んでなる、水での再構成に適した凍結乾燥組成物を提供する。 In another aspect, the present invention, the concentration of histidine in the reconstituted composition has at least about a 5 mM, Factor VII or Factor VIIa polypeptide variants (e.g., clotting activity as described herein comprising histidine as FVII or FVIIa polypeptide variant) and buffering agents, to provide a lyophilized composition suitable for reconstitution with water. 組成物は、賦形剤もしくは担体を含んでなることができる。 The composition may comprise an excipient or carrier. ある態様において、そのような組成物は、再構成組成物におけるヒスチジンの濃度が少なくとも約5mMである、製薬学的に許容しうる賦形剤もしくは担体および第VII因子もしくは第VIIa因子ポリペプチドバリアント(例えば、本明細書に記述されるような凝固活性を有するFVIIもしくはFVIIaポリペプチドバリアント)および緩衝剤としてヒスチジンを含んでなる製薬学的組成物である。 In certain embodiments, such compositions, the concentration of histidine in the reconstituted composition is at least about 5 mM, pharmaceutically acceptable excipients or carriers and the Factor VII or Factor VIIa polypeptide variants ( for example, a FVII or FVIIa polypeptide variant) and pharmaceutical compositions comprising histidine as a buffering agent having clotting activity as described herein.

別の態様において、本発明は、第VII因子もしくは第VIIa因子ポリペプチド(例えば、rhFVIIもしくはrhFVIIa)を含んでなる貯蔵安定性組成物を製造する方法を提供し、該方法は、ヒスチジン緩衝剤および水と第VII因子もしくは第VIIa因子ポリペプチドの混合物を準備して少なくとも5mMのヒスチジン濃度を有する水性組成物をもたらすこと、および得られる水性組成物を凍結乾燥に供して凍結乾燥組成物をもたらすことを含んでなる。 In another aspect, the present invention is Factor VII or Factor VIIa polypeptide (e.g., rhFVII or rhFVIIa) provides a method for producing comprising a storage stable composition, the method comprising histidine buffer and bringing an aqueous composition having a histidine concentration of at least 5mM preparing a mixture of water and factor VII or factor VIIa polypeptide, and the resulting aqueous composition to result in freeze-dried composition is subjected to freeze-drying comprising a. 組成物は、賦形剤もしくは担体を含んでなることができる。 The composition may comprise an excipient or carrier. ある態様において、そのような組成物は製薬学的に許容しうる賦形剤もしくは担体を含んでなる製薬学的組成物である。 In certain embodiments, such compositions are pharmaceutical compositions comprising a pharmaceutically acceptable excipient or carrier.

別の態様において、本発明は、第VII因子もしくは第VIIa因子ポリペプチドバリアント(例えば、本明細書に記述されるような凝固活性を有するFVIIもしくはFVIIaポリペプチドバリアント)を含んでなる貯蔵安定性組成物を製造する方法を提供し、該方法は、ヒスチジン緩衝剤および水と第VII因子もしくは第VIIa因子ポリペプチドバリアントの混合物を準備して少なくとも5mMのヒスチジン濃度を有する水性組成物をもたらすこと、および得られる水性組成物を凍結乾燥に供して凍結乾燥組成物をもたらすことを含んでなる。 In another aspect, the present invention is Factor VII or Factor VIIa polypeptide variants (e.g., FVII or FVIIa polypeptide variant having clotting activity as described herein) storage stable composition comprising to provide a method of manufacturing an object, the method comprising bringing an aqueous composition having a histidine concentration of at least 5mM preparing a mixture of histidine buffer and water and factor VII or factor VIIa polypeptide variants, and obtained by subjecting the aqueous composition to lyophilization comprising bringing lyophilized composition. 組成物は、賦形剤もしくは担体を含んでなることができる。 The composition may comprise an excipient or carrier. ある態様において、そのような組成物は製薬学的に許容しうる賦形剤もしくは担体を含んでなる製薬学的組成物である。 In certain embodiments, such compositions are pharmaceutical compositions comprising a pharmaceutically acceptable excipient or carrier.

別の態様において、本発明は、組成物が水で再構成されている、FVIIもしくはFVIIaポリペプチド(例えば、rhFVIIもしくはrhFVIIa)またはFVIIもしくはFVIIaポリペプチドバリアント(例えば、本明細書に記述されるような凝固活性を有するFVIIもしくはFVIIaポリペプチドバリアント)を含んでなる本発明の組成物の治療的に有効な量を処置もしくは予防を必要とする患者に投与することを含んでなる、FVIIもしくはFVIIaポリペプチドまたはFVIIもしくはFVIIaポリペプチドバリアントの投与により処置できる症状を処置するかもしくは予防する方法を提供する。 In another aspect, the invention composition is reconstituted with water, FVII or FVIIa polypeptide (e.g., rhFVII or rhFVIIa) or FVII or FVIIa polypeptide variant (e.g., as described herein comprising administering a therapeutically effective amount of a composition of the invention comprising a FVII or FVIIa polypeptide variant) having a Do clotting activity to a patient in need of such treatment or prevention, FVII or FVIIa polypeptide It provides a method of or preventing treating a condition treatable by administration of a peptide or FVII or FVIIa polypeptide variant.

別の態様において、本発明は、賦形剤もしくは担体および哺乳類における血餅形成を増加するために有効な量の活性を有するFVIIもしくはFVIIaポリペプチド(例えば、rhFVIIもしくはrhFVIIa)またはFVIIもしくはFVIIaポリペプチドバリアントを含んでなる本発明の組成物を哺乳類に投与することを含んでなる、増加した血餅形成が望ましい疾患もしくは症状を有する哺乳類における血餅形成を増加する方法を提供する。 In another aspect, the present invention is, FVII or FVIIa polypeptide having an effective amount of active to increase clot formation in excipients or carriers and mammals (e.g., rhFVII or rhFVIIa) or FVII or FVIIa polypeptide the compositions of the present invention comprising a variant comprising administering to a mammal provides a method of increasing clot formation in a mammal having an increased clot formation is desirable disease or condition.

本発明のさらなる態様は、以下に記述される。 A further aspect of the present invention will be described below.

同じ温度で貯蔵した液体形態の同じ組成物および対照として−80℃で貯蔵した同一の凍結乾燥組成物と比較した40℃で28日間貯蔵後の本発明の組成物の、本明細書に記述される「第X因子活性化アッセイ」を用いて決定される、FVIIa活性(U/mg)を示す(T0、T7、T14、T21、T28=それぞれ、0、7、14、21および28日で行われた分析)。 Of the composition of the same freeze-dried composition with the present invention after 28 days of storage at 40 ° C. in comparison stored at the same compositions and -80 ° C. As a control in liquid form stored at the same temperature, as described herein that is determined using the "factor X activation assay", FVIIa shows the activity (U / mg) (T0, T7, T14, T21, T28 = line in each 0, 7, 14, 21 and 28 days We analysis). 同じ温度で貯蔵した液体形態の同じ組成物および対照として−80℃で貯蔵した同一の凍結乾燥組成物と比較した40℃で28日間貯蔵後の本発明の組成物における、SEC−HPLCにより決定される、凝集タンパク質の量(ダイマーおよびポリマーパーセントにおける)を示す。 In the composition of the same composition and control as the same of the present invention after the freeze-dried composition for 28 days at 40 ° C. as compared to storage stored at -80 ° C. in liquid form stored at the same temperature, as determined by SEC-HPLC that indicates the amount of aggregated protein (in dimers and polymers percent). 同じ温度で貯蔵した液体形態の同じ組成物および対照として−80℃で貯蔵した同一の凍結乾燥組成物と比較した40℃で28日間貯蔵後の本発明の組成物における、RP−HPLCにより決定される、酸化タンパク質のパーセンテージを示す。 In the composition of the same composition and control as the same of the present invention after the freeze-dried composition for 28 days at 40 ° C. as compared to storage stored at -80 ° C. in liquid form stored at the same temperature, as determined by RP-HPLC that shows the percentage of oxidized protein. 同じ温度で貯蔵した液体形態の同じ組成物および対照として−80℃で貯蔵した同一の凍結乾燥組成物と比較した40℃で28日間貯蔵後の本発明の組成物における、RP−HPLCにより決定される、重鎖分解のパーセンテージを示す。 In the composition of the same composition and control as the same of the present invention after the freeze-dried composition for 28 days at 40 ° C. as compared to storage stored at -80 ° C. in liquid form stored at the same temperature, as determined by RP-HPLC that shows the percentage of heavy chain degradation. 異なる温度で1年までの間貯蔵後の本発明の組成物における、本明細書に記述されるPACTアッセイにより決定される、相対効能を示す。 In the compositions of the present invention after between storage up to one year at different temperatures is determined by the PACT assays described herein, it indicates the relative efficacy. 異なる温度で1年までの間貯蔵後の本発明の組成物における、SEC−HPLCにより決定される、凝集タンパク質の量(ダイマーおよびポリマーパーセントにおける)を示す。 In the compositions of the present invention after between storage up to one year at different temperatures, as determined by SEC-HPLC, it shows the amount of aggregated protein (in dimers and polymers percent). −80℃で貯蔵した同じ組成物に対する5℃、25℃および40℃の温度で1年までの間貯蔵後の本発明の組成物における、RP−HPLCにより決定される、重鎖分解度を示す。 5 ° C. for the same composition stored at -80 ° C., in the compositions of the present invention after between storage up to one year at a temperature of 25 ° C. and 40 ° C., as determined by RP-HPLC, indicating a heavy chain degradation degree . 異なる温度で1年までの間貯蔵後の本発明の組成物における、下記の通り決定される、オスモル濃度を示す。 In the compositions of the invention after storage for up to one year at different temperatures, it is determined as follows, shows the osmolarity. −80℃で貯蔵した同じ組成物に対する5℃、25℃および40℃の温度で1年までの間貯蔵後の本発明の組成物における、下記の通り決定される、酸化度を示す。 5 ° C. for the same composition stored at -80 ° C., in the compositions of the invention after storage for up to 1 year at a temperature of 25 ° C. and 40 ° C., is determined as follows, showing the degree of oxidation.

[発明の詳細な記述] DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
本発明は、第VIIもしくは第VIIa因子ポリペプチド(例えば、rhFVIIもしくはrhFVIIaポリペプチド)または第VIIもしくは第VIIa因子ポリペプチドバリアント(例えば、本明細書に記述されるような凝固活性を有する組換えFVIIもしくはFVIIaポリペプチドバリアント)の安定化組成物もしくは製剤、特に貯蔵安定性凍結乾燥組成物もしくは製剤、そして1つの態様において、室温で貯蔵安定性である組成物もしくは製剤を提供する。 The present invention VII, or Factor VIIa polypeptide (e.g., rhFVII or rhFVIIa polypeptide) or VII, or Factor VIIa polypeptide variants (e.g., recombinant FVII having clotting activity as described herein or FVIIa polypeptide variant) of the stabilized compositions or formulations, in particular the storage stability lyophilized compositions or formulations, and in one aspect, provides a composition or formulation is storage-stable at room temperature.

本発明は、第VII因子もしくは第VIIa因子ポリペプチド(例えば、組換えhFVIIもしくはhFVIIaポリペプチド)または第VIIもしくは第VIIa因子ポリペプチドバリアント(例えば、本明細書に記述されるような凝固活性を有する組換えFVIIもしくはFVIIaポリペプチドバリアント)およびヒスチジン、グリシン、アルギニン、クエン酸塩、酢酸塩、コハク酸塩およびリン酸塩、ならびにその塩から選択される緩衝剤を含んでなる、水もしくは別の液体での再構成に適当な、製薬学的組成物もしくは製剤を包含する、凍結乾燥組成物もしくは製剤に関する。 The present invention is Factor VII or Factor VIIa polypeptide (e.g., recombinant hFVII or hFVIIa polypeptide) having or VII, or Factor VIIa polypeptide variants (e.g., clotting activity as described herein recombinant FVII or FVIIa polypeptide variant) and histidine, glycine, arginine, citrate, acetate, comprising succinate and phosphate, and a buffering agent selected from a salt water or another liquid suitable for reconstitution with, includes a pharmaceutical composition or formulations, lyophilized compositions or formulations. 好ましい態様において、緩衝剤はアミノ酸、特にヒスチジンである。 In a preferred embodiment, the buffering agent is an amino acid, in particular histidine.

1つの態様において、本発明は、再構成組成物もしくは製剤におけるヒスチジンの濃度が少なくとも約5mMである、第VII因子もしくは第VIIa因子ポリペプチド(例えば、組換えhFVIIもしくはhFVIIaポリペプチド)または第VIIもしくは第VIIa因子ポリペプチドバリアント(例えば、本明細書に記述される組換えhFVIIもしくはhFVIIaポリペプチドバリアント)および緩衝剤としてヒスチジンを含んでなる、水もしくは他の媒質での再構成に適当な凍結乾燥製薬学的組成物もしくは製剤を提供する。 In one aspect, the present invention, the concentration of histidine in the reconstituted composition or formulation is at least about 5 mM, Factor VII or Factor VIIa polypeptide (e.g., recombinant hFVII or hFVIIa polypeptide) or VII, or factor VIIa polypeptide variants (e.g., the specification recombinant hFVII or hFVIIa polypeptide variant are described) comprising histidine and as a buffering agent, a suitable lyophilized pharmaceutical for reconstitution with water or other medium It provides biological compositions or formulations. さらに詳細に以下に記述されるように、組成物は典型的には張性調整剤(tonicity modifying agent)、カルシウムのような2価の陽イオン、界面活性剤、酸化防止剤および/もしくは防腐剤のような1つもしくはそれ以上の追加成分を含む。 As described in further detail below, the compositions are typically tonicity adjusting agents (tonicity modifying agent), 2-valent cations, surfactants, antioxidants and / or preservatives, such as calcium comprising one or more additional ingredients such as.

本発明の別の態様は、ヒスチジン緩衝剤および水、ならびに場合により下記のような追加成分と第VII因子もしくは第VIIa因子ポリペプチド(例えば、組換えhFVIIもしくはhFVIIaポリペプチド)またはそのポリペプチドバリアントの混合物を準備して少なくとも5mMのヒスチジン濃度を有する水性組成物をもたらすこと、および得られる水性組成物を凍結乾燥に供して凍結乾燥組成物をもたらすことを含んでなる、第VII因子もしくは第VIIa因子ポリペプチド(例えば、組換えhFVIIもしくはhFVIIaポリペプチド)またはそのポリペプチドバリアントを含んでなる貯蔵安定性組成物を製造する方法に関する。 Another aspect of the invention, histidine buffer, and water, and optionally additional ingredients and Factor VII or Factor VIIa polypeptide as described below (e.g., recombinant hFVII or hFVIIa polypeptide) or the polypeptide variant bringing the mixture to prepare an aqueous composition having a histidine concentration of at least 5 mM, and the resulting aqueous composition comprising to bring lyophilized composition was subjected to freeze-drying, factor VII or factor VIIa polypeptides (e.g., recombinant hFVII or hFVIIa polypeptide) relates to a process for preparing or storage stability composition comprising the polypeptide variant.

本発明のさらなる態様には、本発明の再構成組成物の治療的に有効な量を処置もしくは予防を必要とする患者に投与することを含んでなる、第VIIもしくは第VIIa因子ポリペプチド(例えば、組換えhFVIIもしくはhFVIIa)またはFVIIもしくはFVIIaポリペプチドバリアント(例えば、以下にさらに記述されるような凝固活性を有する組換えFVIIもしくはFVIIaポリペプチドバリアント)の投与により処置できる症状を処置するかもしくは予防する方法、ならびに第VIIもしくは第VIIa因子ポリペプチドまたはFVIIもしくはFVIIaポリペプチドバリアントの投与により処置できる症状を処置するかもしくは予防するための薬剤の製剤のための本発明の組成物の使用が包含される。 To a further aspect of the present invention, comprising administering to a patient in need of treatment or prevention a therapeutically effective amount of a reconstituted composition of the present invention, VII, or Factor VIIa polypeptide (e.g. , recombinant hFVII or hFVIIa) or FVII or FVIIa polypeptide variant (e.g., further treat or preventing a condition treatable by administration of recombinant FVII or FVIIa polypeptide variant) having clotting activity as described below the method, as well as use of the VII or composition of the present invention for the factor VIIa polypeptide or FVII or drug formulations for treating or preventing a condition treatable by administration of FVIIa polypeptide variant is included to that.

定義 Definition
以下の記述および請求項において、以下の定義が適用される: In the following description and claims, the following definitions apply:
「FVII」もしくは「FVIIポリペプチド」という用語は、一般に、一本鎖形態で提供されるFVII分子をさす。 The term "FVII" or "FVII polypeptide" generally refers to FVII molecule provided in single-stranded form.

「FVIIa」もしくは「FVIIaポリペプチド」という用語は、一本鎖形態のR152とI153の間のペプチド結合が切断されている、その活性化二本鎖形態で提供されるFVIIaポリペプチド分子をさす。 The term "FVIIa" or "FVIIa polypeptide" refers to a FVIIa polypeptide molecules provided that the peptide bond is cleaved, the activated two-chain form between R152 and I153 of the single-stranded form.

「rFVII」および「rFVIIa」という用語は、それぞれ、組換え技術により製造される、それぞれ、FVIIおよびFVIIa分子をさす。 The term "rFVII" and "rFVIIa", respectively, is produced by recombinant techniques, respectively, refer to FVII and FVIIa molecules. これらは野生型ヒト配列を有することができ、もしくはヒト配列のバリアントであることができる。 It may be able to have a wild-type human sequence, or a variant of human sequences.

「hFVII」および「hFVIIa」という用語は、それぞれ、野生型ヒトFVIIおよびFVIIaをさす。 The term "hFVII" and "hFVIIa", respectively, refers to a wild-type human FVII and FVIIa. ヒトFVII/FVIIaタンパク質のポリペプチド配列は周知であり、そして例えばUS4,784,950にそして受託番号P08709でSwiss−Protに開示され;それはまた配列番号:1として以下に再生される。 Polypeptide sequence of human FVII / FVIIa protein are well known and are disclosed in Swiss-Prot in and Accession No. P08709 for example US4,784,950; it also SEQ ID NO: is reproduced below as 1. 「rhFVII」および「rhFVIIa」という用語は、それぞれ、組換え技術によって製造される、それぞれ、ヒトFVIIおよびヒトFVIIa分子をさす。 The term "rhFVII" and "rhFVIIa", respectively, are produced by recombinant techniques, respectively, refer to human FVII and human FVIIa molecule.

「FVII/FVIIa」という用語は、FVIIもしくはFVIIaを意味する。 The term "FVII / FVIIa" refers to a FVII or FVIIa.

「親」FVIIもしくはFVIIa分子は、それからFVIIもしくはFVIIaバリアントが例えばアミノ酸置換、挿入もしくは欠失によって得られるFVIIもしくはFVIIa分子を示すものとする。 "Parent" FVII or FVIIa molecules, which then FVII or FVIIa variant example amino acid substitutions, as indicating the FVII or FVIIa molecule obtained by insertion or deletion. 親FVIIもしくはFVIIaポリペプチドは任意のFVIIもしくはFVIIaポリペプチドであり、従って、任意の起源、例えば非ヒト哺乳類起源に由来することができるが、親ポリペプチドはhFVIIもしくはhFVIIaであることが多い。 Parent FVII or FVIIa polypeptide is any FVII or FVIIa polypeptide, and thus, any origin and may be derived from for example a non-human mammalian origin, the parent polypeptide is often hFVII or hFVIIa.

ポリペプチド「バリアント」は、その親ポリペプチドと1個もしくはそれ以上のアミノ酸残基において、通常は1〜15個のアミノ酸残基において(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14もしくは15個のアミノ酸残基において)、例えば1〜12個のアミノ酸残基、1〜10個のアミノ酸残基において、例えば1〜8、1〜6、1〜5、1〜4、1〜3もしくは1〜2個のアミノ酸残基において異なるポリペプチドであり、ここで、親ポリペプチドとポリペプチドバリアントとの間の違いは、例えばアミノ酸置換、挿入および/もしくは欠失である。 A polypeptide "variant", in the parent polypeptide and one or more amino acid residues, usually at 1 to 15 amino acid residues (e.g., 1,2,3,4,5,6,7 in 8,9,10,11,12,13,14 or 15 amino acid residues), for example 1-12 amino acid residues, in 1-10 amino acid residues, for example 1~8,1 in ~6,1~5,1~4,1~3 or 1-2 amino acid residues are different polypeptides, wherein the difference between the parent polypeptide and polypeptide variants, for example, amino acid substitutions , it is the insertion and / or deletions.

「ポリペプチド配列」は、文脈により、アミノ酸のポリマー(タンパク質、ポリペプチドなど)もしくはアミノ酸ポリマーを表す文字列である。 "Polypeptide sequence", as the context requires a character string representing a polymer (a protein, polypeptide, etc.) or amino acid polymer of amino acids. 遺伝暗号の縮重を考慮して、特定のポリペプチド配列をコードする1つもしくはそれ以上の核酸、またはその相補的な核酸をポリペプチド配列から決定することができる。 Taking into account the degeneracy of the genetic code, it can be determined one or more nucleic acids encoding a particular polypeptide sequence, or a complementary nucleic acid from the polypeptide sequence.

アミノ酸位置を同定するために使用する用語は、以下のとおり説明される:G124は、位置124がヒトFVIIのアミノ酸配列においてグリシン残基により占められることを示す。 The terminology used for identifying amino acid positions is illustrated as follows: G124 indicates that position 124 is occupied by a glycine residue in the amino acid sequence of human FVII. G124Rは、位置124のグリシン残基がアルギニン残基で置換されていることを示す。 G124R indicates that the glycine residue of position 124 has been substituted with an arginine residue. 代替置換は、「/」で示される。 Alternative substitutions are indicated with a "/". 多数の置換は、「+」で示され、例えばK143N+N145S/Tは、アスパラギン残基での位置143におけるリシン残基の置換およびセリンもしくはトレオニン残基での位置145におけるアスパラギン残基の置換を含んでなるアミノ酸配列を意味する。 Numerous substitutions are indicated with a "+", e.g. K143N + N145S / T is includes a substitution of an asparagine residue at position 145 in the replacement and serine or threonine residue of a lysine residue at position 143 of the asparagine residue It means an amino acid sequence consisting. さらなるアミノ酸残基の挿入、例えばG124の後のアラニン残基の挿入は、G124GAにより示される。 Insertion of additional amino acid residues, for example insertion of an alanine residue after G124 is indicated by G124GA.

一般に、本発明の組成物の本明細書における説明は、再構成組成物における、すなわち、水性の液体、典型的には注射用滅菌水の適量に本発明の凍結乾燥組成物を溶解することにより調製される水性組成物における様々な成分の量をさす。 In general, the description herein is of the composition of the present invention, in the reconstituted composition, i.e., an aqueous liquid, typically is prepared by dissolving the freeze-dried composition of the present invention in an appropriate amount of sterile water for injection It refers to the amount of the various components in that the aqueous composition. 再構成後の組成物における水の量は、凍結乾燥前の元の組成物における水の量に対応することが多い。 The amount of water in the composition after reconstitution, often corresponding to the amount of water in the original composition prior to lyophilization. 従って、本発明の組成物における様々な成分の量は、あるいはまた、凍結乾燥前の同じ成分の量であると考えることができ、すなわち、本記述および請求項において定義される組成物は、あるいはまた、示される成分量、濃度もしくはpH値を有する水性組成物の凍結乾燥から調製されているかもしくはそれにより得ることができると特徴付けることができる。 Accordingly, amounts of the various components in the composition of the invention or, alternatively, can be considered to be the amount of the same component prior to lyophilization, i.e., the composition defined in the present description and claims, or, Moreover, quantities of ingredients indicated can be characterized can get to or by it being prepared from the freeze drying of aqueous compositions having a concentration or pH value.

本発明の組成物および方法 Compositions and methods of the present invention
1つの態様において、本発明は少なくとも1つのFVIIもしくはFVIIaポリペプチド(例えば、組換えhFVIIもしくはhFVIIa)および/または本明細書に記述される少なくとも1つのFVIIもしくはFVIIaポリペプチドバリアント(例えば、本明細書に記述される凝固活性を有するFVIIもしくはFVIIaポリペプチドバリアント)の新規組成物もしくは製剤を提供する。 In one aspect, the present invention is at least one FVII or FVIIa polypeptide (e.g., recombinant hFVII or hFVIIa) and / or at least one FVII or FVIIa polypeptide variant described herein (e.g., the specification provides novel compositions or formulations of the FVII or FVIIa polypeptide variant) having clotting activities described. あるそのような組成物もしくは製剤は、FVIIもしくはFVIIaポリペプチドまたはFVIIもしくはFVIIaポリペプチドバリアントへの任意の実質的な損傷(例えば、タンパク質分解もしくは他の分解、または凝集または変性、ここで、分解、凝集もしくは変性は、例えば減少した効能もしくは免疫原性の危険性のために治療的使用に不適当な組成物をもたらす)を被ることなしに長期貯蔵の間(例えば少なくとも約3ヶ月、例えば少なくとも約6ヶ月、少なくとも約1年、少なくとも約18ヶ月、少なくとも約2年の期間にわたって)安定である。 Such compositions or formulations there is any substantial damage to the FVII or FVIIa polypeptide or FVII or FVIIa polypeptide variant (e.g., proteolytic or other degradation, or aggregation or denaturation, wherein the decomposition, aggregation or denaturation, for example reduced efficacy or therapeutic during long-term storage without incurring bring improper composition) for use (e.g., at least about 3 months for immunogenicity risk, such as at least about 6 months, at least about 1 year, at least about 18 months, a) stable over a period of at least about 2 years.

本発明によれば、組換え第VIIもしくは第VIIa因子ポリペプチド(例えば、組換えhFVIIもしくはhFVIIaポリペプチド)または組換えFVIIもしくはFVIIaポリペプチドバリアントは、好ましくは少なくとも約5mMの濃度で(ここで、該濃度は再構成組成物に基づく)、緩衝剤としてヒスチジンを含有しそして典型的には張性調整剤、カルシウムもしくは別の2価の陽イオン、界面活性剤、酸化防止剤または防腐剤のような1つもしくはそれ以上の追加成分とともに凍結乾燥組成物において調合される。 According to the present invention, recombinant VII, or Factor VIIa polypeptide (e.g., recombinant hFVII or hFVIIa polypeptide) or recombinant FVII or FVIIa polypeptide variant, preferably at a concentration of at least about 5 mM (here, concentration is based on the reconstituted composition), containing histidine as a buffering agent and typically tonicity adjusting agents, calcium or another divalent cation, a surfactant, as antioxidants or preservatives It is formulated in the lyophilized composition with one or more additional ingredients such. 好ましくは、組成物はその活性型のFVII/FVIIaポリペプチドまたはFVII/FVIIaポリペプチドバリアント、例えば、それぞれ、組換えヒト第VIIa因子もしくは組換えFVIIaポリペプチドバリアントを含有する。 Preferably, the composition FVII / FVIIa polypeptide or FVII / FVIIa polypeptide variant of its active form, for example, respectively, containing the recombinant human Factor VIIa or Recombinant FVIIa polypeptide variant.

緩衝剤 Buffer
本発明によれば、組換えFVIIもしくはFVIIaポリペプチド(例えば、組換えhFVIIもしくはhFVIIaポリペプチド)または本明細書に記述される組換えFVIIもしくはFVIIaポリペプチドバリアントの組成物もしくは製剤は、緩衝剤としてヒスチジンを含有する凍結乾燥組成物に基づいて提供され、特にここで、再構成組成物は少なくとも約5mM、好ましくは少なくとも約10mMの、そして好ましくは約10mMより大きい濃度で、例えば約100mMまでの濃度でヒスチジンを含んでなる。 According to the present invention, a recombinant FVII or FVIIa polypeptide (e.g., recombinant hFVII or hFVIIa polypeptide) compositions or formulations or recombinant FVII or FVIIa polypeptide variant described herein, as a buffer provided on the basis of the lyophilized composition containing histidine, especially where the concentration of the reconstituted composition is at least about 5 mM, preferably at least about 10mM, and preferably at about 10mM concentrations greater than, for example, up to about 100mM in comprising histidine. 再構成組成物におけるヒスチジンの濃度は典型的には約50mMまで、例えば約40mMまで、例えば約30mMもしくは25mMまでであり、そして一般に少なくとも約10mM、しばしば少なくとも約12mM、例えば少なくとも約15mMである。 The concentration of histidine in the reconstituted composition is typically up to about 50 mM, such as up to about 40 mM, for example about up to 30mM or 25 mM, and typically at least about 10 mM, often at least about 12 mM, such as at least about 15 mM. 1つの態様において、ヒスチジン緩衝剤は約12〜50mM、例えば約12〜40mM、例えば約12〜30mM、例えば約15〜25mMの範囲の濃度で再構成組成物において存在することができる。 In one embodiment, can be present in the histidine buffer is about 12~50MM, for example about 12~40MM, for example about 12~30MM, for example reconstituted composition in a concentration ranging from about 15 to 25 mm. ヒスチジンバッファーは、好ましくは、pHを調整する場合にナトリウムイオンの添加を避けるために、ヒスチジン塩基およびヒスチジン塩、例えばヒスチジン−HCl、ヒスチジン硫酸塩もしくはヒスチジン−アルギニンを混合することにより調製される。 Histidine buffer, preferably, to avoid the addition of sodium ions in the case of adjusting the pH, histidine base and histidine salts, for example histidine-HCl, histidine sulfate or histidine - is prepared by mixing arginine. あるいはまた、所望の値にpHを調整するためにヒスチジンに酸もしくは塩基を加えることができる。 Alternatively, it is possible to add acid or base to histidine to adjust the pH to the desired value.

本発明の組成物のpHは、好ましくは、患者への投与の際の苦痛もしくは不快感を最小限に抑えるように、すなわち、極めて中性のpH値を選択し、そして例えばFVIIもしくはFVIIaポリペプチドまたはそのポリペプチドバリアントの安定性へのpHの影響を考慮に入れることにより選択される。 pH of the compositions of the present invention is preferably so as to minimize pain or discomfort upon administration to a patient, i.e., to select a very neutral pH value, and for example, FVII or FVIIa polypeptide or it is selected by taking into account the effect of pH on the stability of the polypeptide variant. pHは一般に約2.5〜約9.0の範囲である。 pH is typically about 2.5 to about 9.0 range. 適当なpH範囲は例えば約2.5〜約4.0、例えば約3.0もしくは3.5;約4.0〜約8.0、例えば約5.0〜約7.0、例えば約5.5、6.0もしくは6.5;または約5.0〜約9.0、例えば約6.0〜約8.0、例えば約6.0、6.5、7.0もしくは7.5であることができる。 Suitable pH ranges for example from about 2.5 to about 4.0, such as about 3.0 or 3.5; about 4.0 to about 8.0, such as from about 5.0 to about 7.0, for example about 5 .5,6.0 or 6.5; or from about 5.0 to about 9.0, such as from about 6.0 to about 8.0, for example about 6.0,6.5,7.0 or 7.5 it can be. 好ましい態様において、pHは約5.5〜約7.0、典型的には約6.0〜約7.0、例えば約6.2〜約6.8、例えば約6.4〜6.6の範囲、例えば約6.5である。 In a preferred embodiment, pH is from about 5.5 to about 7.0, typically from about 6.0 to about 7.0, such as from about 6.2 to about 6.8, such as about 6.4-6.6 range, such as about 6.5.

追加成分 Additional components
FVIIもしくはFVIIaポリペプチドおよび/またはFVIIもしくはFVIIaポリペプチドバリアントならびに緩衝剤に加えて、本発明の組成物は張性調整剤、カルシウムのような2価の陽イオン、界面活性剤、酸化防止剤および/もしくは防腐剤のような1つもしくはそれ以上の追加の賦形剤もしくは担体を含むことができる。 In addition to the FVII or FVIIa polypeptide, and / or FVII or FVIIa polypeptide variant and buffer, the composition of the invention tonicity adjusting agents, divalent cations, detergents such as calcium, antioxidants and / or it may include one or more additional excipients or carriers, such as preservatives. 本発明の製薬学的組成物は、FVIIもしくはFVIIaポリペプチドおよび/またはFVIIもしくはFVIIaポリペプチドバリアントならびに緩衝剤に加えて、張性調整剤、カルシウムのような2価の陽イオン、界面活性剤、酸化防止剤および/もしくは防腐剤のような1つもしくはそれ以上の追加の製薬学的に許容しうる賦形剤もしくは担体を含むことができる。 The pharmaceutical compositions of the present invention, in addition to the FVII or FVIIa polypeptide, and / or FVII or FVIIa polypeptide variant and buffer, tonicity agent, a divalent cation, a surfactant, such as calcium, It may include one or more additional pharmaceutically acceptable excipients or carriers such as antioxidants and / or preservatives. 等張化剤もしくは張性調整剤は、等張性を保証するかもしくはそうでなければ液体組成物の張性を所望のレベルに調整するために加えられ、そしてグリセロール、エリトリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトールもしくはマンニトールのような多価糖アルコール、好ましくは3価以上の糖アルコール、ショ糖もしくはトレハロースのような糖、またはグリシンもしくはアルギニンのようなアミノ酸が包含される。 Tonicity agents or tonicity modifying agents, if not to or otherwise to ensure isotonicity tonicity of the liquid composition is added to adjust to a desired level, and glycerol, erythritol, arabitol, xylitol, polyhydric sugar alcohols such as sorbitol or mannitol, preferably trihydric or higher sugar alcohols, sugars such as sucrose or trehalose, or amino acids such as glycine or arginine, and the like. また、張性調整剤としての使用に適当であるのは、例えば塩化物を対イオンとする、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩もしくはマグネシウム塩のような中性塩、例えば塩化ナトリウムである。 Further, the suitable for use as a tonicity adjusting agent, such as a counter ion chloride, sodium salts, neutral salts such as potassium, calcium or magnesium salts, such as sodium chloride. 2つもしくはそれ以上の張性調整剤の混合物もまた用いることができる。 Mixtures of two or more tonicity adjusting agents may also be used. 1つの態様において、張性調整剤は糖、好ましくはショ糖もしくはトレハロース、より好ましくはトレハロースである。 In one embodiment, the tonicity adjusting agent is a sugar, preferably sucrose or trehalose, and more preferably trehalose. 張性調整剤が糖アルコールもしくは糖である場合、再構成組成物における張性調整剤の濃度は典型的には約50mM〜約1000mM、例えば約100mM〜約500mM、例えば、約150mM〜約300mM、例えば約200mM〜約250mMである。 If tonicity adjusting agent is a sugar alcohol or sugar, the concentration of the tonicity modifying agent in the reconstituted composition is typically from about 50mM~ about 1000 mM, such as from about 100mM~ about 500 mM, e.g., from about 150mM~ about 300 mM, for example, about 200mM~ about 250mM. 張性調整剤が塩もしくはアミノ酸のようなイオン化合物である場合、イオン化合物の量は、糖アルコールもしくは糖についての上記の範囲に対応するイオン強度をもたらすように適応される。 If tonicity adjusting agent is an ionic compound such as salts or amino acids, the amount of ionic compound is adapted to provide an ionic strength corresponding to the range of above about sugar alcohol or sugar.

ある場合において、例えば中性塩の使用により与えられる、組成物における高いイオン強度、例えば少なくとも約250mM、少なくとも300mMもしくは少なくとも400mM、例えば約500mMまでもしくは約1000mMまでを有することは好都合であり得る。 In some cases, for example, it is given by the use of a neutral salt, a high ionic strength in the composition, such as at least about 250 mM, is may be advantageous to have at least to 300mM, or at least 400 mM, for example, or about 1000mM to about 500 mM. FVIIのそのような高イオン強度組成物は、WO 2004/112828に記述される。 Such high ionic strength compositions FVII is described in WO 2004/112828.

凍結乾燥保護剤(Lyoprotectant)および/もしくは凍結保護剤は、それぞれ、水分除去および凍結中に生じる応力からタンパク質を保護するために本発明の組成物に含むことができる。 Lyoprotectant (Lyoprotectant) and / or cryoprotectants, respectively, may be included in the compositions of the present invention to protect the proteins from stress generated during water removal and freezing. 凍結保護剤はまた、凍結乾燥の後の貯蔵中にその凍結乾燥形態のタンパク質を保護する働きをすることもできる。 Cryoprotectants may also serve to protect the protein of the lyophilized form during storage after the lyophilization. さらに、ある凍結保護剤はまた凍結乾燥保護剤として働くこともでき、そして張性調整剤として組成物に含むことができる糖アルコールもしくは糖のようなある成分は、凍結乾燥保護剤および/もしくは凍結保護剤としてさらに働くことができる。 Furthermore, there cryoprotectants also can serve as a lyoprotectant, and components that as a sugar alcohol or sugar which may be included in the composition as a tonicity adjusting agent, lyoprotectant and / or freeze it can further serve as a protective agent.

凍結乾燥保護剤は例えば糖、例えばショ糖もしくはトレハロースのような二糖、またはヒスチジン、アルギニンおよび/もしくはグリシンのようなアミノ酸であることができる。 Lyoprotectant can be, for example, sugars, for example disaccharides, such as sucrose or trehalose, or histidine, amino acids such as arginine and / or glycine. 凍結保護剤は例えば糖、特にショ糖もしくはトレハロースのような二糖、またはグリセロール、エリトリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトールもしくはマンニトールのような糖アルコール、またはヒスチジン、アルギニンもしくはグリシンのようなアミノ酸であることができる。 Cryoprotectants such as sugars, in particular disaccharides such as sucrose or trehalose, or glycerol, erythritol, arabitol, xylitol, sugar alcohols such as sorbitol or mannitol or histidine, be an amino acid such as arginine or glycine, it can. 好ましい態様において、ショ糖もしくはトレハロースのような糖、特にトレハロースが凍結乾燥保護剤/凍結保護剤としてそして張性調整剤として用いられる。 In a preferred embodiment, sugars such as sucrose or trehalose, particularly trehalose is used as and tonicity adjusting agent as lyoprotectant / cryoprotectant. この場合、糖の総量は張性調整剤を扱う段落において上記に示したとおりである。 In this case, the total amount of sugar is as shown above in paragraph dealing with tonicity adjusting agent.

本発明の組成物は、組成物を安定化するのに役立つように、典型的には塩化カルシウムのようなカルシウム塩もしくは塩化マグネシウムのようなマグネシウム塩、例えば塩化カルシウムの形態の、2価の陽イオンを含有することが多い。 The compositions of the present invention is to help to stabilize the composition, typically in the form of a magnesium salt, e.g., calcium chloride, such as calcium or magnesium chloride, such as calcium chloride, a divalent cation often contain the ion. 再構成組成物におけるカルシウムイオンもしくは他の2価の陽イオンの濃度は、通常は約1mM〜約40mM、例えば約2mM〜約30mM、例えば約2mM〜約20mM、例えば約5mM〜約15mM、例えば約10mMである。 The concentration of calcium ions or other divalent cations in the reconstituted composition is usually from about 1mM~ about 40 mM, such as from about 2mM~ about 30 mM, such as from about 2mM~ about 20 mM, such as from about 5mM~ about 15 mM, such as about is 10mM.

界面活性剤もしくは洗剤、特に非イオン性界面活性剤は、ポリペプチドの可溶化を助けるためにならびに表面誘起(攪拌もしくは凍結)凝集からポリペプチドを保護する(それはまた剪断表面応力にさらされた際のタンパク質の変性および凝集の危険性も減らす)ために存在することができる。 Surfactants or detergents, particularly non-ionic surfactants are solubilized in and surface induced (stirring or freezing) to help the polypeptide protects the polypeptide against aggregation (when it is also exposed to shear surface stresses also reduce the risk of denaturation and aggregation of the protein) may be present for. 適当な非イオン性界面活性剤には、例えば、ポリソルベート(ポリオキシエチレンソルビタンエステル、例えばポリソルベート20(Tween (R) −20)、ポリソルベート80(Tween (R) −80)など)、ポリオキサマー(ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロックコポリマー、例えばポロキサマー184、ポロキサマー188など)およびプルロニック(Pluronic) (R)ポリオールが包含される。 Suitable non-ionic surfactants, such as polysorbate (polyoxyethylene sorbitan esters, for example polysorbate 20 (Tween (R) -20) , such as polysorbate 80 (Tween (R) -80) ), poloxamers (polyoxy propylene - polyoxyethylene block copolymers, for example poloxamers 184, etc. poloxamer 188) is and Pluronic (Pluronic) (R) polyols and the like. 好ましい非イオン性界面活性剤の例は、ポリソルベート20(Tween (R) −20)である。 Examples of preferred non-ionic surfactant is polysorbate 20 (Tween (R) -20) . 界面活性剤は、典型的には約0.001%(w/v)〜約0.5%、例えば約0.001%〜約0.05%、例えば約0.005%〜約0.025%、例えば約0.01%もしくは約0.02%の濃度で再構成組成物において存在する。 Surfactant is typically about 0.001% in (w / v) to about 0.5%, for example from about 0.001% to about 0.05%, for example from about 0.005% to about 0.025 % are present in the reconstituted composition, for example a concentration of about 0.01% or about 0.02%.

さらに、組成物は酸化防止剤、例えばアスコルビン酸、メチオニン、ベンジルアルコールもしくはビタミンE;充填剤もしくは増量剤、例えば澱粉;またはキレート剤、例えばEDTAのような様々な賦形剤を含んでなることができる。 Furthermore, the composition antioxidants, such as ascorbic acid, methionine, benzyl alcohol or vitamin E; fillers or extenders, such as starches; or chelating agents, may for example, comprise various excipients such as EDTA it can. 好ましい態様において、酸化防止剤はメチオニンである。 In a preferred embodiment, the antioxidant is methionine. 再構成組成物における酸化防止剤の濃度は、典型的には約1mM〜約40mM、例えば約2mM〜約30mM、例えば約5mM〜約20mM、例えば約10mMである。 The concentration of antioxidants in the reconstituted composition is typically from about 1mM~ about 40 mM, such as from about 2mM~ about 30 mM, such as from about 5mM~ about 20 mM, such as about 10 mM.

防腐剤は微生物増殖を遅らせるために加えることができ、そして典型的には例えば約0.1%〜2%(w/v)の量で加えられる。 Preservatives may be added to retard microbial growth, and are typically added in an amount of, for example, about 0.1% ~2% (w / v). 本発明での使用に適当な防腐剤にはフェノール、ベンジルアルコール、メタ−クレゾール、オルト−クレゾール、パラ−クレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ハロゲン化ベンザルコニウム(例えば、塩化、臭化もしくはヨウ化ベンザルコニウム)、塩化ヘキサメトニウム、メチルもしくはプロピルパラベンのようなアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノールおよび3−ペンタノールが包含される。 Suitable preservatives for use in the present invention phenol, benzyl alcohol, meta - cresol, ortho - cresol, p - cresol, methyl paraben, propyl paraben, octadecyl dimethyl benzyl ammonium chloride, benzalkonium halides (e.g., chloride, bromide or iodide benzalkonium), hexamethonium chloride, alkyl parabens such as methyl or propyl paraben, catechol, resorcinol, cyclohexanol and 3-pentanol and the like.

好ましい態様において、本発明の組成物はヒスチジン、トレハロース、塩化カルシウム、Tween (R) −20およびメチオニンを含んでなる。 In a preferred embodiment, the compositions of the present invention comprise histidine, trehalose, calcium chloride, and Tween (R) -20 and methionine. より好ましくは、その再構成形態の本発明のこの態様の組成物は約6.0〜約7.0のpHを有し、そして約10mM〜約30mMのヒスチジン、例えば約15〜約25mMのヒスチジン、約150mM〜約300mMのトレハロース、約2mM〜約20mMの塩化カルシウム、約0.001%〜約0.05%(w/v)のTween (R) −20および約5mM〜約30mMのメチオニンを含んでなる。 More preferably, the composition of this aspect of the present invention of reconstructed form has a pH of about 6.0 to about 7.0, and about 10mM~ about 30mM histidine, for example from about 15 to about 25mM histidine , about 150mM~ about 300mM trehalose, calcium chloride about 2mM~ about 20 mM, the Tween (R) -20 and about 5mM~ about 30mM methionine from about 0.001% to about 0.05% (w / v) including comprising at.

さらなる態様において、組成物はグリシルグリシンを含有しない。 In a further embodiment, the composition contains no glycylglycine.

水分含量 Moisture content
FVIIもしくはFVIIaポリペプチド(例えば、組換えhFVIIもしくはhFVIIaポリペプチド)または本明細書に記述される組換えFVIIもしくはFVIIaポリペプチドバリアントは、液体形態で貯蔵される場合よりも乾燥形態で貯蔵される場合により安定であることが見出されているので、本発明の組成物は長期貯蔵用の乾燥形態で提供されることは上記の説明から明らかである。 FVII or FVIIa polypeptide (e.g., recombinant hFVII or hFVIIa polypeptide) or recombinant FVII or FVIIa polypeptide variant described herein, when stored in dry form than when stored in liquid form since it has been found to be stable, the compositions of the present invention, it is apparent from the above description provided in dry form for long-term storage. 任意の凍結乾燥サイクルの成功の重要な決定要因は、凍結乾燥生成物に残存するのが見出される残留水の量であることは当該技術分野において既知である。 An important determinant of the success of any freeze drying cycle, it is known in the art is the amount of residual water is found to remain in lyophilized product. 従って、本発明の組成物の分水量(もしくは「水分含量」)は3%(w/w)以下、好ましくは2%以下、例えば約1%以下であるべきである。 Thus, diversion of the compositions of the present invention (or "moisture content") is 3% (w / w) or less, preferably 2% or less, should for example about 1% or less. 凍結乾燥した製薬学的組成物の含水量の決定方法は、当該技術分野において周知である;例えばWO 2003/092731を参照。 Method for determining the moisture content of the freeze-dried pharmaceutical composition are well known in the art; see for example WO 2003/092731. 周知の技術の一例はカール・フィッシャー滴定であり、それはサンプル中の微量の水を決定するために電量もしくは容量滴定を用いる。 An example of a known technique is the Karl Fischer titration, it uses coulometric or volumetric titration to determine the trace amounts of water in the sample.

安定性 Stability
本発明の組成物は、約2〜8℃の温度で、そして好ましくは約20〜25℃、すなわち「室温」のようなより高い温度で貯蔵することができる例えば使い捨てもしくはマルチ用途(multi−use)バイアル、プレフィルドシリンジ、アンプルまたはカートリッジにおける長期貯蔵に適していると考えられる。 The compositions of the present invention is about at 2 to 8 ° C. temperature, and preferably about 20-25 ° C., or "room temperature" than can be stored at a high temperature, for example a disposable or multi-use (multi-use, such as ) vial, pre-filled syringe, is considered to be suitable for long-term storage in ampoules or cartridges. 「長期貯蔵」および「貯蔵安定性」という用語は、組成物が、ポリペプチドへの任意の実質的な損傷(例えば、タンパク質分解もしくは他の分解、または凝集または変性、ここで、分解、凝集もしくは変性は、例えば減少した効能もしくは免疫原性の危険性のために治療的使用に不適当な組成物をもたらす)を被ることなしに、既定温度、例えば2〜8℃、例えば約5℃で、そしてより好ましくは20〜25℃で、長期間、典型的には少なくとも約3ヶ月、好ましくは少なくとも約6ヶ月、より好ましくは少なくとも約1年、例えば少なくとも約18ヶ月、例えば約2年までの期間にわたって貯蔵できることをさす。 The term "long-term storage" and "storage stability" means that the composition, any substantial damage to the polypeptide (e.g., proteolytic or other degradation, or aggregation or denaturation, wherein decomposition, aggregation or modified, for example without therapeutic result in improper composition for use) that suffer because of reduced efficacy or immunogenicity risk, at predetermined temperature, for example 2 to 8 ° C., for example about 5 ° C., and more preferably at 20-25 ° C., a long period of time, at least about 3 months typically preferably at least about 6 months, more preferably at least about 1 year, such as at least about 18 months, for example, a period of up to about 2 years It refers to capable of storing over. タンパク質の貯蔵安定性は、例えば、同じ貯蔵条件に供された対照組成物と比較するかまたは貯蔵に供されていないかもしくは例えば約−80℃での低温貯蔵に供されている同じ組成物と比較した場合の活性に関して測定することができる。 Storage stability of a protein, for example, the same composition that has been subjected to cold storage in the test has been control composition as compared to or subjected which do not result to or for example about -80 ° C. to the storage in the same storage conditions it can be measured in terms of activity as compared. 測定される活性は、例えばアミド分解活性もしくは凝固活性、例えば以下の材料および方法の節に記述される「第X因子活性化アッセイ」もしくは「PACTアッセイ」により決定されるような活性であることができる。 The measured activity, for example amidolytic activity or coagulation activity, to be active as determined by the "Factor X activation assay" or "PACT assay" is described, for example, the section the following materials and methods it can. FVIIもしくはFVIIaポリペプチドまたはFVIIもしくはFVIIaポリペプチドバリアントのアミド分解もしくは凝固活性を決定するための適当なアッセイならびに他のFVII/FVIIaアッセイは当該技術分野において既知であり、そして例えばWO 01/58935およびWO Suitable assays and other FVII / FVIIa assay to determine the FVII or FVIIa polypeptide or FVII or FVIIa polypeptide variant of the amidolytic or clotting activity are known in the art, and include, for example WO 01/58935 and WO
03/093465に記述される。 03/093465 is described. また、以下の材料および方法の節に記述される「全血アッセイ」および「凝固活性を測定する方法」も参照。 See also "method of measuring the clotting activity" The following materials and "Whole Blood Assay" as described in the methods section and.

貯蔵安定性は、あるいはまたもしくはさらに、例えばサイズ排除クロマトグラフィー、分析超遠心または他の直交もしくは補足法を用いて、当該技術分野において既知である方法により凝集体形成のレベルに関して測定することができる。 Storage stability, alternatively or additionally, can be measured, for example, size exclusion chromatography, analyzed by ultracentrifugation or other orthogonal or complementary method, with respect to the level of aggregate formed by methods known in the art . 従って、本発明の組成物の改善された貯蔵安定性は、物理的安定性、例えば減少した凝集体形成、および/または化学的安定性、例えば減少した分解もしくは減少した酸化を含んでなるものとする。 Therefore, improved storage stability of the compositions of the present invention, physical stability, for example decreased aggregate formation, and / or those which comprise chemical stability, for example reduced degradation or decreased oxidation and to.

好ましい態様において、本発明の貯蔵安定性組成物は「熱安定性」であり、組成物が約20℃の周囲温度で貯蔵される場合に、そして好ましくは約25℃の温度で貯蔵される場合に上記に概説したような安定性特性を有することを意味する。 In a preferred embodiment, when the storage stability the compositions of the present invention are "thermostable", when the composition is stored at ambient temperature of about 20 ° C., and is preferably stored at a temperature of about 25 ° C. It means having a stability characteristic as outlined above. 従って、FVIIもしくはFVIIaポリペプチドまたはそのポリペプチドバリアントを含んでなる本発明の組成物は、好ましくは、少なくとも約3ヶ月、好ましくは少なくとも約6ヶ月、より好ましくは少なくとも約1年、例えば少なくとも約18ヶ月、例えば約2年までの期間にわたる貯蔵の際に、20℃の温度で、そして好ましくは25℃で安定なものである。 Thus, the compositions of the present invention comprising a FVII or FVIIa polypeptide or polypeptide variant, preferably at least about 3 months, preferably at least about 6 months, more preferably at least about 1 year, such as at least about 18 months, during storage over a period of up to for example about two years, at a temperature of 20 ° C., and preferably at stable at 25 ° C..

本発明の組成物は、例えば上記に説明したような、定義された条件(温度および時間)下での貯蔵後に以下の基準の1つもしくはそれ以上をそれが満たす場合に「安定である」と見なすことができる。 The compositions of the present invention, for example, as described above, "stable" if it meets one or more of the following criteria after storage under defined conditions (temperature and time) it can be considered. 安定性の評価のために、試験する貯蔵組成物は、時間0での(すなわち、貯蔵期間の開始時の)同じ組成物もしくは−80℃で同じ時間の長さにわたって凍結乾燥形態で貯蔵されている同じ組成物のいずれかであることができる対照と比較される。 For the evaluation of stability, storage composition to be tested, at time 0 (i.e., at the beginning of the storage period) is stored in a lyophilized form of the same composition or -80 ° C. over a length of the same time often contrasted with that can be either of the same composition are. 対照組成物は、典型的には、−80℃で貯蔵した凍結乾燥組成物である。 The control composition is typically a lyophilized composition was stored at -80 ° C..
・例えば本明細書に記述される「第X因子活性化アッセイ」もしくは「PACTアッセイ」を用いて決定される、生物活性:少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは少なくとも95%、例えば少なくとも98%の対照と比較した生物活性。 • For example, as described herein, "Factor X activation assay" or a "PACT assay" is determined using bioactive: at least 80%, preferably at least 85%, more preferably at least 90%, even more preferably at least 95%, for example biological activity compared to at least 98% of the control.
・例えば下記のようなSEC−HPLCを用いて決定される、凝集度:3%以下(絶対的に)、好ましくは2.5%以下、より好ましくは2%以下、さらにより好ましくは1.5%以下、例えば1%以下の対照と比較した凝集の増加。 - for example, determined using SEC-HPLC as described below, cohesion: (absolutely) 3% or less, preferably 2.5% or less, more preferably 2% or less, still more preferably 1.5 % or less, the increase in aggregation compared for example, 1% or less of the control.
・例えば下記のようなRP−HPLCにより決定されるような、酸化:酸化は、対照の酸化度と比較して5%以下(絶対的に)、好ましくは3%以下、より好ましくは2%以下、そして最も好ましくはわずか1%以下しか増加すべきではない。 • For example, as determined by RP-HPLC as described below, oxidation: Oxidation is (absolutely) 5% or less as compared with the oxidation degree of the control, preferably 3% or less, more preferably 2% or less , and most preferably it should not be increased little less than 1%.
・例えば下記のようなRP−HPLCにより決定されるような、重鎖分解は、対照の重鎖分解度と比較して5%以下(絶対的に)、好ましくは3%以下、より好ましくは2%以下、最も好ましくはわずか1%以下しか増加すべきではない。 • For example, as determined by RP-HPLC as described below, the heavy chain degradation (absolutely) 5% or less as compared to the heavy chain degradation degree of the control, preferably 3% or less, more preferably 2 % or less, and most preferably should not be increased little less than 1%.

凍結乾燥組成物は、例えば、使用直前の溶媒での再構成用に使い捨てもしくは再使用バイアル、プレフィルドシリンジ、アンプルまたはカートリッジにおいて包装することができる。 Lyophilized composition, for example, can be packaged for reconstitution with solvent just prior to use disposable or reusable vials, prefilled syringes, in ampoules or cartridges. 溶媒は典型的には滅菌水であるが、場合により凍結乾燥組成物において他に存在することができる1つもしくはそれ以上の成分、例えば張性調整剤、非イオン性界面活性剤、酸化防止剤もしくは防腐剤を含んでもよい。 The solvent is typically one or more components can is present in the other in the lyophilized composition optionally, but sterile water, for example, tonicity adjusting agents, non-ionic surfactants, antioxidants or it may contain a preservative. 投与を容易にするために、本発明の凍結乾燥組成物はあるいはまたプレフィルド2コンパートメントシリンジにおいて包装することができ、ここで、コンパートメントの一方はFVIIもしくはFVIIaポリペプチドまたはそのポリペプチドバリアントを含んでなる凍結乾燥組成物を含有し、そしてもう一方のコンパートメントは溶媒、典型的には滅菌水を含有し、従って、FVIIもしくはFVIIaポリペプチドまたはそのポリペプチドバリアントを含んでなる乾燥組成物を投与の直前に適量の水と迅速にそして容易に混合することを可能にする。 For ease of administration, the freeze-dried composition of the present invention may alternatively be packaged in pre-filled two-compartment syringe, comprising wherein one compartment contains the FVII or FVIIa polypeptide or polypeptide variant containing freeze-dried composition, and the other compartment solvents, typically containing sterile water, therefore, a dry composition comprising a FVII or FVIIa polypeptide or polypeptide variant just prior to administration It makes it possible to mix quickly and easily with an appropriate amount of water. 本発明の組成物の再構成に使用する水は、製薬産業においてこの目的のために一般に用いられるタイプの滅菌水、例えば注射用滅菌水(WFI)、点眼用溶解液、緩衝用水もしくは食塩水である。 Water used for reconstitution of the composition of the present invention, generally the type used in sterile water for this purpose in the pharmaceutical industry, for example sterile water for injection (WFI), ophthalmic solution, in buffered water or saline is there. FVIIもしくはFVIIaポリペプチドまたはそのポリペプチドバリアントの量に対する再構成に使用する水の量は、凍結乾燥前の元の組成物における水の量に対応することが多いが必ずしもそうではない。 The amount of FVII or FVIIa polypeptide or water used for reconstitution to the amount of the polypeptide variant are often corresponds to the amount of water in the original composition prior to lyophilization not necessarily so. 下記のように、本発明の再構成組成物におけるポリペプチドもしくはポリペプチドバリアントの濃度は典型的には約0.01〜10mg/ml、より典型的には0.1〜5mg/ml、例えば約0.2〜2mg/ml、典型的には約0.4〜1.5mg/ml、例えば約0.5〜1.0mg/mlの範囲である。 As described below, the concentration of the polypeptide or polypeptide variant in the reconstituted compositions of the present invention is typically from about 0.01 to 10 mg / ml, more typically 0.1 to 5 mg / ml, such as about 0.2-2 mg / ml, typically about 0.4~1.5mg / ml, such as from about 0.5 to 1.0 mg / ml. 所望に応じて、FVIIもしくはFVIIaポリペプチドまたはそのポリペプチドバリアントを濃縮する手段として凍結乾燥を用いることができ、その場合、再構成組成物における水の量は、凍結乾燥前の元の組成物における量より少ない。 If desired, it is possible to use a freeze-dried as a means of concentrating the FVII or FVIIa polypeptide or polypeptide variant, in its case, the amount of water in the reconstituted composition is lyophilized prior to the original composition less than the amount.

ポリペプチド Polypeptide
本発明に従って調合することができるポリペプチドには、特に組換えヒトFVIIもしくはFVIIaポリペプチド(そのポリペプチド配列は、配列番号:1に示される)ならびにその組換えFVIIもしくはFVIIaポリペプチドバリアント(例えば、配列番号:1に示されるヒトFVIIもしくはFVIIaポリペプチドのポリペプチドバリアント)が包含され、本明細書に詳細に記述されるもの、そして好ましくは活性型を包含する。 To a polypeptide can be formulated in accordance with the present invention, (its polypeptide sequence, SEQ ID NO: shown are 1) especially recombinant human FVII or FVIIa polypeptide and the recombinant FVII or FVIIa polypeptide variant (e.g., SEQ ID NO: including human FVII or FVIIa polypeptide of the polypeptide variant shown in 1) is included, as is described in detail herein, and preferably the active form. 興味のあるFVIIもしくはFVIIaポリペプチドバリアントには、例えば、WO 01/58935、WO 03/093465、WO 2004/029091、WO 2004/111242、WO 99/20767、WO 00/66753、WO 88/10295、WO 92/15686、WO 02/29025、WO 01/70763、WO 01/83725、WO 02/02764、WO 02/22776、WO 02/38162、WO 02/077218、WO 03/027147、WO 03/037932、WO 2004/000366、WO 2004/029090およびWO 2004/108763に記述されるものが包含される。 The FVII or FVIIa polypeptide variant of interest, for example, WO 01/58935, WO 03/093465, WO 2004/029091, WO 2004/111242, WO 99/20767, WO 00/66753, WO 88/10295, WO 92/15686, WO 02/29025, WO 01/70763, WO 01/83725, WO 02/02764, WO 02/22776, WO 02/38162, WO 02/077218, WO 03/027147, WO 03/037932, WO 2004 / 000,366, those described WO 2004/029090 and WO 2004/108763 are included.

FVIIもしくはFVIIaポリペプチドバリアントは、例えば、野生型ヒトFVII(配列番号:1)のアミノ酸配列と1〜15個のアミノ酸残基において(例えば、1〜15個以下のアミノ酸残基において)、典型的には1〜12もしくは1〜10個のアミノ酸残基において、例えば1〜9、1〜8、1〜7、1〜6、1〜5、1〜4、1〜3もしくは1〜2個のアミノ酸残基または1個のアミノ酸残基において異なるポリペプチドバリアントをもたらす、配列番号:1に示される野生型ヒトFVIIもしくはFVIIaポリペプチド配列と比較して1個もしくはそれ以上のアミノ酸置換、挿入および/もしくは欠失を含むことができ、ここで、配列番号:1に示される野生型FVII/FVIIa配列とのアミノ酸配列の違い(1つも FVII or FVIIa polypeptide variant, e.g., a wild-type human FVII (SEQ ID NO: 1) in the amino acid sequence 1-15 amino acid residues (e.g., in 1-15 amino acid residues or less), typically in 1-12 or 1-10 amino acid residues, for example 1~9,1~8,1~7,1~6,1~5,1~4,1~3 or 1-2 result in a different polypeptide variant at amino acid residue, or one amino acid residue, SEQ ID NO: one or more amino acid substitutions compared to the wild-type human FVII or FVIIa polypeptide sequence shown in 1, insertion and / or it can comprise a deletion, wherein SEQ ID NO: differences in the amino acid sequence of the wild-type FVII / FVIIa sequence shown in 1 (one also くは複数)は、典型的には1個もしくはそれ以上のアミノ酸置換である。 Ku is a plural number) is typically one or more amino acid substitutions. そのようなアミノ酸置換は、例えば、N−グリコシル化部位(例えば、インビボで(例えば、グリコシル化哺乳類細胞におけるポリペプチドの製造によって)もしくはインビトログリコシル化(すなわち、場合により架橋剤を用いて、ポリペプチドバリアントの結合基に炭水化物分子を共有結合することを通常は伴うインビトロで行われる合成的グリコシル化)によりグリコシル化することができるN−グリコシル化部位)を包含する1個もしくはそれ以上のグリコシル化部位を導入するか、またはポリペプチドに1個もしくはそれ以上のPEG化部位を導入する目的で、そして/あるいは例えば凝固活性を改善するためのG1aドメイン(hFVIIaのアミノ酸残基1〜45)における1個もしくはそれ以上のアミノ酸置換によって、野 Such amino acid substitutions, for example, N- glycosylation site (e.g., in vivo (e.g., glycosylated by the production of polypeptides in mammalian cells) or in vitro glycosylation (i.e., with a crosslinking agent, optionally, polypeptides one or more glycosylation sites include N- glycosylation sites) that can be glycosylated by synthetic glycosylation normally is carried out in vitro with) covalently binding carbohydrate molecules to the binding group variants one of either introducing or polypeptide to one or in more interest to introduce PEG sites, and / or, for example G1a domain to improve the coagulation activity (amino acid residues of hFVIIa 1 to 45) or thereby more amino acid substitutions, field 型ポリペプチドの凝固活性を改善するかもしくはそうでなければ改変するために行うことができる。 It can be carried out in order to modify if not whether or otherwise to improve the clotting activity of the type polypeptide. FVIIもしくはFVIIaポリペプチドバリアントは、典型的に凝固活性を有する。 FVII or FVIIa polypeptide variant typically have a clotting activity. 凝固活性は、本明細書に記述される凝固アッセイの1つもしくは当該技術分野において既知である多数の凝固アッセイの1つを用いて測定することができる。 Clotting activity can be measured using one of a number of coagulation assays known in one or the art of coagulation assays described herein. 凝固活性を有する典型的なFVIIもしくはFVIIaポリペプチドバリアントは以下に説明され、そしてWO 01/58935、WO 03/093465、WO 2004/029091およびWO 2004/111242にさらに詳細に記述される。 Typical FVII or FVIIa polypeptide variant having clotting activity are described below and are WO 01/58935, WO 03/093465, WO 2004/029091 and WO 2004/111242 further detail description. あるいはまた、FVIIもしくはFVIIaポリペプチドバリアントが抗凝固剤として働くように設計される場合、本発明の組成物は減少した凝固活性を有するFVIIもしくはFVIIaポリペプチドバリアントを含んでなることができる。 Alternatively, if it is designed to FVII or FVIIa polypeptide variant acts as an anticoagulant, the compositions of the present invention can comprise a FVII or FVIIa polypeptide variant having reduced clotting activity.

本発明の組成物における使用に適当な好ましいFVIIもしくはFVIIaポリペプチドバリアントは、G1aドメイン(ヒトFVIIもしくはFVIIaの残基1〜45)における少なくとも1つの改変および/もしくは非ポリペプチド部分の結合部位を導入する少なくとも1つのアミノ酸改変を含む。 Suitable preferred FVII or FVIIa polypeptide variant for use in the compositions of the present invention, introducing the binding site of the at least one modified and / or non-polypeptide moiety in G1a domain (residues of the human FVII or FVIIa 1 to 45) to at least one amino acid modification. 非ポリペプチド部分には、例えば糖部分もしくは非ポリペプチドポリマー、例えばポリエチレングリコール(PEG)ポリマーが包含される。 The non-polypeptide moiety, for example, a sugar moiety or a non-polypeptide polymer, such as polyethylene glycol (PEG) polymers are included. そのような改変の限定されない例は、以下に提供される。 Non-limiting examples of such modifications are provided below.

G1aドメインの改変:1つの態様において、本発明は15個以下のアミノ酸残基(例えば12個以下、10、8、7、6、5、4、3、2、1個のアミノ酸残基)において配列番号:1におけるhFVIIもしくはhFVIIaのポリペプチド配列と異なるポリペプチド配列を含んでなる凝固活性を有する組換えFVIIもしくはFVIIaポリペプチドバリアントを提供し、該ポリペプチドバリアントはG1aドメインにおける少なくとも1つのアミノ酸改変、特にG1aドメインにおける該改変のない同様のポリペプチドと比較して増加したリン脂質膜結合親和性をもたらす少なくとも1つの改変を有する。 Modification of G1a domain: In one aspect, the present invention is 15 amino acid residues or less (e.g., 12 or less, 10,8,7,6,5,4,3,2,1 amino acid residues) in SEQ ID NO: 1 provides a recombinant FVII or FVIIa polypeptide variant having clotting activity comprising a polypeptide sequence that differs from the hFVII or hFVIIa polypeptide sequence in the polypeptide variant at least one amino acid modification in the G1a domain , having at least one modification in particular results in said alteration without similar polypeptides increased compared to phospholipid membrane binding affinity at G1a domain. G1aドメインにおけるそのような改変は、例えばWO 99/20767、WO 00/66753およびWO 03/093465に開示され、そして配列番号:1に対して位置10、11、28、32、33および34の1つもしくはそれ以上における改変を含む。 Such modifications in G1a domain, for example, is disclosed in WO 99/20767, WO 00/66753 and WO 03/093465, and SEQ ID NO: 1 positions 10,11,28,32,33 and 34 with respect to 1 One or including alterations in more. バリアントにおけるアミノ酸位置は、典型的に、配列番号:1のアミノ酸位置に従って番号を付けられる。 Amino acid positions in the variant is typically SEQ ID NO: are numbered according to the amino acid position 1. 好ましくは、バリアントは少なくとも位置10もしくは32、好ましくは両方における改変を含む。 Preferably, the variant comprises modifications in both at least position 10 or 32, preferably. 従って、バリアントは位置10におけるグルタミン、グルタミン酸、アスパラギン酸もしくはアスパラギン残基、好ましくはグルタミン残基の置換;および/または位置32におけるグルタミン酸もしくはアスパラギン酸残基、好ましくはグルタミン酸の置換を含むことができる。 Thus, variant glutamine at position 10, glutamic acid, aspartic acid or asparagine residue, preferably a substituted a glutamine residue; glutamic acid or aspartic acid residue in and / or position 32 may preferably comprise a substitution of glutamic acid. 好ましくは、バリアントは位置10および32の両方での置換、より好ましくは置換P10Q+K32Eを含む。 Preferably, variant substitutions at both positions 10 and 32, more preferably substituted P10Q + K32E.

別の態様において、本発明は、配列番号:1におけるhFVIIもしくはhFVIIaのポリペプチド配列と15個以下のアミノ酸残基(例えば12個以下、10、8、7、6、5、4、3、2、1個のアミノ酸残基)において異なるポリペプチド配列を含んでなる凝固活性を有する組換えFVIIもしくはFVIIaポリペプチドバリアントを提供し、該ポリペプチドバリアントは、配列番号:1のアミノ酸位置10、11、28、32、33、34および/もしくは36における1個もしくはそれ以上のアミノ酸少なくとも1個のアミノ酸置換を有し、ここで、バリアントにおけるアミノ酸位置は配列番号:1に従って番号が付けられる。 In another aspect, the present invention is SEQ ID NO: hFVII or hFVIIa polypeptide sequence and 15 amino acid residues or less in 1 (for example, 12 or less, 10,8,7,6,5,4,3,2 provides a recombinant FVII or FVIIa polypeptide variant having one comprising a different polypeptide sequence at amino acid residues) of the clotting activity, the polypeptide variant, SEQ ID NO: 1 amino acid positions 10, 11, have one or more amino acids at least one amino acid substitution at 28,32,33,34 and / or 36, wherein the amino acid positions in the variant SEQ ID NO: are numbered according to 1.

別の態様において、凝固活性を有するFVIIもしくはFVIIaポリペプチドバリアントは、配列番号:1の位置28でグルタミン酸もしくはフェニルアラニン残基のアミノ酸置換;または位置33における疎水性アミノ酸残基の置換を含み、置換は配列番号:1のD33I、D33L、D33M、D33V、D33F、D33YおよびD33Wよりなる群、特にD33Fから選択される。 In another embodiment, FVII or FVIIa polypeptide variant having clotting activity, SEQ ID NO: amino acid substitution glutamic acid or phenylalanine residue at position 1 28; include substitution of a hydrophobic amino acid residue at or position 33, substitution SEQ ID NO: 1 of D33I, D33L, D33M, D33V, D33F, D33Y and the group consisting of D33W, in particular selected from D33F.

別の態様において、凝固活性を有するFVIIもしくはFVIIaポリペプチドバリアントは、配列番号:1の位置34における負に荷電した残基のアミノ酸置換、すなわちA34EもしくはA34D、好ましくはA34Eを含む。 In another embodiment, FVII or FVIIa polypeptide variant having clotting activity, SEQ ID NO: negative amino acid substitutions of charged residues at position 1 34, i.e. A34E or A34D, preferably including A34E. あるいはまた、バリアントは配列番号:1の位置34における置換により導入される疎水性アミノ酸残基を含むことができる。 Alternatively, variant SEQ ID NO: may contain hydrophobic amino acid residues to be introduced by substitution in position 1 34. この場合、配列番号:1の位置34に導入される疎水性アミノ酸残基はI、L、M、V、F、YおよびWよりなる群から選択することができる。 In this case, SEQ ID NO: hydrophobic amino acid residues introduced into position 1 34 may be selected I, L, M, V, F, from the group consisting of Y and W. この位置における好ましい置換には、A34EおよびA34Lが包含される。 Preferred substituents at this position, A34E and A34L are included.

別の態様において、凝固活性を有するFVIIもしくはFVIIaポリペプチドバリアントは、配列番号:1の位置36におけるアミノ酸置換を含む。 In another embodiment, FVII or FVIIa polypeptide variant having clotting activity, SEQ ID NO: comprises the amino acid substitution at position 36 of 1. 好ましくは、位置36における置換により導入されるアミノ酸残基は負に荷電したアミノ酸残基、すなわちR36EもしくはR36D、特にR36Eである。 Preferably, amino acid residue amino acid residue to be introduced negatively charged by substitution in position 36, i.e. R36E or R36D, in particular R36E.

別の態様において、凝固活性を有するFVIIもしくはFVIIaポリペプチドバリアントは、配列番号:1の位置38におけるアミノ酸置換、特に位置38における置換より導入される負に荷電したアミノ酸残基、すなわちK38EもしくはK38D、特にK38Eを含む。 In another embodiment, FVII or FVIIa polypeptide variant having clotting activity, SEQ ID NO: amino acid substitution at one of positions 38, negatively charged amino acid residue to be introduced from the substitution in particular position 38, i.e. K38E or K38D, including in particular K38E.

別の態様において、FVIIもしくはFVIIaポリペプチドバリアントは、配列番号:1の位置3と4の間に少なくとも1個の(典型的には1個の)アミノ酸残基の挿入を含む。 In another embodiment, FVII or FVIIa polypeptide variant, SEQ ID NO: (typically one) at least one between the 1 position 3 and 4 comprising the insertion of amino acid residues. 挿入されるアミノ酸残基は、好ましくは疎水性アミノ酸残基である。 Amino acid residues to be inserted are preferably hydrophobic amino acid residue. 典型的な挿入は、配列番号:1の位置3のアミノ酸残基(アラニン)と位置4のアミノ酸残基(フェニルアラニン)との間にチロシン残基の導入を含んでなり、この挿入はA3AYと表される。 Typical insertion, SEQ ID NO: Tables and A3AY comprise becomes, the insertion introduction of tyrosine residues between the amino acid residues of one of the position 3 (alanine) and the position 4 amino acid residue (phenylalanine) It is.

G1aドメインに多数の置換を有するそのようなFVIIもしくはFVIIaポリペプチドバリアントの具体例には:配列番号:1に対してP10Q+K32E;P10Q+K32E+A34E;P10Q+K32E+R36E;P10Q+K32E+K38E;P10Q+K32E+A34E+R36E;P10Q+K32E+R36E+K38E;P10Q+K32E+A34E+K38E;P10Q+K32E+A34E+R36E+K38E;P10Q+K32E+A34L;P10Q+K32E+A34L+R36E;P10Q+K32E+A34L+K38E;およびP10Q+K32E+A34L+R36E+K38Eが包含される。 The numerous examples of such FVII or FVIIa polypeptide variant having a substitution at G1a domain: SEQ ID NO: P10Q + K32E against 1; P10Q + K32E + A34E; P10Q + K32E + R36E; P10Q + K32E + K38E; P10Q + K32E + A34E + R36E; P10Q + K32E + R36E + K38E; P10Q + K32E + A34E + K38E; P10Q + K32E + A34E + R36E + K38E; P10Q + K32E + A34L; P10Q + K32E + A34L + R36E; P10Q + K32E + A34L + K38E; and P10Q + K32E + A34L + R36E + K38E and the like. バリアントにおけるアミノ酸位置は、配列番号:1に従って番号が付けられる。 Amino acid positions in the variant of SEQ ID NO: are numbered according to 1. 多数のそのようなバリアントは凝固活性を有する。 Many such variants having coagulant activity. 凝固活性は、本明細書に記述される凝固アッセイの1つもしくは当該技術分野において既知である多数の凝固アッセイの1つを用いて測定することができる。 Clotting activity can be measured using one of a number of coagulation assays known in one or the art of coagulation assays described herein.

グリコシル化部位の導入:別の態様において、本発明の組成物において使用する、凝固活性を有するものを包含する、FVIIもしくはFVIIaポリペプチドバリアントは、野生型配列(配列番号:1)を有するhFVIIもしくはhFVIIaと比較してN−グリコシル化部位(例えばインビボN−グリコシル化部位を包含する)を導入する1つもしくはそれ以上のアミノ酸改変、典型的にはアミノ酸置換を含んでなるポリペプチド配列を含んでなる。 The introduction of glycosylation sites: In another aspect, used in the compositions of the present invention include those having a coagulation activity, FVII or FVIIa polypeptide variant, wild-type sequence (SEQ ID NO: 1) hFVII or having hFVIIa as compared to N- glycosylation site (e.g., including in vivo N- glycosylation sites) one or more amino acid modifications introduced, typically comprises a polypeptide sequence comprising amino acid substitutions Become. N−グリコシル化部位は配列N−X−S/T/Cを有し、ここで、Xはプロリンを除く任意のアミノ酸残基であり、Nはアスパラギンであり、そしてS/T/Cはセリン、トレオニンもしくはシステインのいずれか、好ましくはセリンもしくはトレオニン、そして最も好ましくはトレオニンである。 N- glycosylation site has the sequence N-X-S / T / C, wherein, X is any amino acid residue except proline, N is asparagine and S / T / C is serine , either threonine or cysteine, preferably serine or threonine, and most preferably threonine. 従って、例えばインビボN−グリコシル化を包含するN−グリコシル化のための結合部位は、バリアント配列において必要なN−X−S/T/Cトリプレットを得るために1もしくは2個のアミノ酸残基のアミノ酸改変、典型的にはアミノ酸置換により導入することができる。 Thus, for example, binding sites for N- glycosylation including vivo N- glycosylation, one or two amino acid residues in order to obtain the N-X-S / T / C triplet required in variant array amino acid modification, typically may be introduced by amino acid substitution.

hFVIIもしくはhFVIIaポリペプチド配列(配列番号:1)に対して1個もしくはそれ以上の導入されたN−グリコシル化部位を有するFVIIもしくはFVIIaポリペプチドバリアントは、天然hFVII/hFVIIa配列(配列番号:1)に対して1〜5個の追加のN−グリコシル化部位、例えば1〜4もしくは1〜3個の追加のN−グリコシル化部位、例えば1、2もしくは3個の追加のN−グリコシル化部位を含んでなることができる。 hFVII or hFVIIa polypeptide sequence (SEQ ID NO: 1) one or FVII or FVIIa polypeptide variant having more of the introduced N- glycosylation sites for the natural hFVII / hFVIIa sequence (SEQ ID NO: 1) 1-5 additional N- glycosylation sites for, e.g., 1-4 or 1-3 additional N- glycosylation sites, e.g., 1, 2 or three additional N- glycosylation sites it can become comprise. 1つの特定の態様において、FVIIもしくはFVIIaポリペプチドバリアントは、天然hFVII/hFVIIa配列に対して1〜5個の追加のインビボN−グリコシル化部位、例えば1〜4もしくは1〜3個の追加のインビボN−グリコシル化部位、例えば1、2もしくは3個の追加のインビボN−グリコシル化部位を含んでなることができる。 In one particular embodiment, FVII or FVIIa polypeptide variant, 1-5 additional in vivo N- glycosylation sites to a native hFVII / hFVIIa sequence, for example, 1-4 or 1-3 additional vivo N- glycosylation sites, may for example comprise 1, 2 or 3 additional vivo N- glycosylation site. ヒトFVIIもしくはFVIIaは、位置N145、N322、S52およびS60で4個の天然に存在するグリコシル化部位を有し、ここで、S52およびS60はO−グリコシル化部位であり、そしてN145およびN322はN−グリコシル化部位である。 Human FVII or FVIIa, the position N145, N322, in S52 and S60 have the glycosylation sites present in four natural, wherein, S52 and step S60 are O- glycosylation sites, and N145 and N322 are N - it is a glycosylation site. 1個もしくはそれ以上のN−グリコシル化部位への糖部分の結合は、インビトロで(例えば、場合により架橋剤を用いて、典型的にはポリペプチドバリアントの結合基に炭水化物分子を共有結合することを伴う、インビトロで行われる既知の合成的グリコシル化技術により)もしくはインビボグリコシル化ができる宿主細胞(例えば、酵母、真菌もしくは哺乳類細胞のような真核細胞)におけるポリペプチドバリアントの発現により行うことができる。 Binding of the sugar moiety to one or more of the N- glycosylation sites, in vitro (e.g., using a crosslinking agent optionally, typically covalently binding a carbohydrate molecule to the binding groups of the polypeptide variant to the the associated, known synthetic by glycosylation techniques) or host cell capable in vivo glycosylation performed in vitro (e.g., yeasts, be performed by expression of the polypeptide variant in a eukaryotic cell), such as fungi or mammalian cells it can. 典型的な哺乳類細胞には、COS細胞、CHO細胞(例えば、CHO−I細胞)、BHK細胞、HEK細胞などが包含される。 Exemplary mammalian cells, COS cells, CHO cells (e.g., CHO-I cells), BHK cells, HEK cells are encompassed.

アミノ酸置換(1個もしくは複数)により導入されるN−グリコシル化部位(例えばインビボN−グリコシル化部位)をもたらす置換の具体例には、A51N、G58N、T106N、K109N、G124N、K143N+N145T、A175T、I205S、I205T、V253N、T267N、T267N+S269T、S314N+K316S、S314N+K316T、R315N+V317S、R315N+V317T、K316N+G318S、K316N+G318T、G318NおよびD334Nよりなる群から選択されるアミノ酸置換が包含され、ここで、バリアントにおけるアミノ酸位置は配列番号:1における位置に従って番号が付けられる。 Specific examples of substitutions leading amino acid substitutions (one or more) is introduced by N- glycosylation site (e.g., in vivo N- glycosylation sites), A51N, G58N, T106N, K109N, G124N, K143N + N145T, A175T, I205S , I205T, V253N, T267N, T267N + S269T, S314N + K316S, S314N + K316T, R315N + V317S, R315N + V317T, K316N + G318S, K316N + G318T, an amino acid substitution selected from the group consisting of G318N and D334N are included, wherein the amino acid positions in the variant SEQ ID NO: in 1 It is numbered according to the position. 好ましいアミノ酸置換には、T106N、I205TおよびV253Nの1つもしくはそれ以上が包含される。 Preferred amino acid substitutions, T106N, one of I205T and V253N or is more encompassed.

1つの態様において、1個のみのN−グリコシル化部位(例えばインビボN−グリコシル化部位)がアミノ酸置換により導入されている。 In one embodiment, one only of N- glycosylation site (e.g., in vivo N- glycosylation sites) have been introduced by amino acid substitution. 別の態様において、2個もしくはそれ以上のN−グリコシル化部位(例えばインビボN−グリコシル化部位)がアミノ酸置換により導入されている。 In another embodiment, two or more N- glycosylation sites (e.g. in vivo N- glycosylation sites) have been introduced by amino acid substitution. 2個のN−グリコシル化部位をもたらす好ましいアミノ酸置換には、T106N+A175T、T106N+I205T、T106N+V253N、T106N+T267N+S269T、A175T+I205T、A175T+V253N、A175T+T267N+S269T、I205T+V253N、I205T+T267N+S269TおよびV253N+T267N+S269Tよりなる群から、より好ましくはT106N+I205T、T106N+V253NおよびI205T+V253Nよりなる群から選択されるアミノ酸置換が包含され、ここで、バリアントにおけるアミノ酸位置は配列番号:1における位置に従って番号が付けられる。 Preferred amino acid substitutions leading to two N- glycosylation sites, T106N + A175T, from T106N + I205T, T106N + V253N, T106N + T267N + S269T, A175T + I205T, A175T + V253N, A175T + T267N + S269T, I205T + V253N, the group consisting of I205T + T267N + S269T and V253N + T267N + S269T, more preferably T106N + I205T, consisting T106N + V253N and I205T + V253N amino acid substitutions selected from the group is included, wherein the amino acid positions in the variant SEQ ID NO: are numbered according to the position of 1.

さらなる態様において、3個もしくはそれ以上のN−グリコシル化部位(例えばインビボN−グリコシル化部位)が置換により導入されている。 In a further embodiment, three or more N- glycosylation sites (e.g. in vivo N- glycosylation sites) have been introduced by substitution. 3個のN−グリコシル化部位をもたらす好ましい置換の例には、I205T+V253N+T267N+S269TおよびT106N+I205T+V253Nよりなる群から選択される置換が包含され、ここで、バリアントにおけるアミノ酸位置は配列番号:1における位置に従って番号が付けられる。 Preferred examples of substitutions resulting three N- glycosylation sites are included the substitution selected from the group consisting of I205T + V253N + T267N + S269T and T106N + I205T + V253N, wherein the amino acid positions in the variant SEQ ID NO: numbered according to their position in one It is.

G1aドメインにおける改変および導入されたN−グリコシル化部位を有するポリペプチドバリアント:さらなる態様において、本発明の組成物は、上記のそれぞれの節に記述されるようなG1aドメインにおける少なくとも1つの改変および少なくとも1個の導入されたN−グリコシル化部位(例えばインビボN−グリコシル化部位)を有するポリペプチド配列を含んでなる凝固活性を有するFVIIもしくはFVIIaポリペプチドバリアントを含んでなることができる。 G1a polypeptide variant with altered and introduced N- glycosylation sites in domain: In a further embodiment, the compositions of the present invention, at least one modification, and at least in G1a domain as described in each section above it can comprise a FVII or FVIIa polypeptide variant having one of the introduced N- glycosylation site (e.g., in vivo N- glycosylation sites) comprising a polypeptide sequence having clotting activity.

G1aドメインにおける多数の置換および少なくとも1個の導入されたN−グリコシル化部位を含んでなる凝固活性を有する「組み合わされた」FVIIもしくはFVIIaポリペプチドバリアントの具体例には:P10Q+K32E+T106N;P10Q+K32E+A34E+T106N;P10Q+K32E+R36E+T106N;P10Q+K32E+A34E+R36E+T106N;P10Q+K32E+I205T;P10Q+K32E+A34E+I205T;P10Q+K32E+R36E+I205T;P10Q+K32E+A34E+R36E+I205T;P10Q+K32E+V253N;P10Q+K32E+A34E+V253N;P10Q+K32E+R36E+V253N;P10Q+K32E+A The specific examples of a number of substituents and at least one "combined" having comprising at clotting activity introduced N- glycosylation sites FVII or FVIIa polypeptide variant in G1a domain: P10Q + K32E + T106N; P10Q + K32E + A34E + T106N; P10Q + K32E + R36E + T106N; P10Q + K32E + A34E + R36E + T106N; P10Q + K32E + I205T; P10Q + K32E + A34E + I205T; P10Q + K32E + R36E + I205T; P10Q + K32E + A34E + R36E + I205T; P10Q + K32E + V253N; P10Q + K32E + A34E + V253N; P10Q + K32E + R36E + V253N; P10Q + K32E + A 4E+R36E+V253N;P10Q+K32E+T 4E + R36E + V253N; P10Q + K32E + T
106N+I205T;P10Q+K32E+A34E+T106N+I205T;P10Q+K32E+R36E+T106N+I205T;P10Q+K32E+A34E+R36E+T106N+I205T;P10Q+K32E+T106N+V253N;P10Q+K32E+A34E+T106N+V253N;P10Q+K32E+R36E+T106N+V253N;P10Q+K32E+A34E+R36E+T106N+V253N;P10Q+K32E+I205T+V253N;P10Q+K32E+A34E+I205T+V253N;P10Q+K32E+R36E+I205T+V253N;P10Q+K32E+A34E+R36E+I205T+V253N;P10Q+K32E+T106N+I205 106N + I205T; P10Q + K32E + A34E + T106N + I205T; P10Q + K32E + R36E + T106N + I205T; P10Q + K32E + A34E + R36E + T106N + I205T; P10Q + K32E + T106N + V253N; P10Q + K32E + A34E + T106N + V253N; P10Q + K32E + R36E + T106N + V253N; P10Q + K32E + A34E + R36E + T106N + V253N; P10Q + K32E + I205T + V253N; P10Q + K32E + A34E + I205T + V253N; P10Q + K32E + R36E + I205T + V253N; P10Q + K32E + A34E + R36E + I205T + V253N; P10Q + K32E + T106N + I205 +V253N;P10Q+K32E+A34E+T106N+I205T+V253N;P10Q+K32E+R36E+T106N+I205T+V253N;P10Q+K32E+A34E+R36E+T106N+I205T+V253N;P10Q+K32E+A34L+T106N;P10Q+K32E+A34L+I205T;P10Q+K32E+A34L+V253N;P10Q+K32E+A34L+T106N+I205T;P10Q+K32E+A34L+T106N+V253N;P10Q+K32E+A34L+I205T+V253N;P10Q+K32E+A34L+T106N+I205T+V253N;P10Q+K32E+A34L+R36E+T106N;P10Q+K32E+A34L+R36 + V253N; P10Q + K32E + A34E + T106N + I205T + V253N; P10Q + K32E + R36E + T106N + I205T + V253N; P10Q + K32E + A34E + R36E + T106N + I205T + V253N; P10Q + K32E + A34L + T106N; P10Q + K32E + A34L + I205T; P10Q + K32E + A34L + V253N; P10Q + K32E + A34L + T106N + I205T; P10Q + K32E + A34L + T106N + V253N; P10Q + K32E + A34L + I205T + V253N; P10Q + K32E + A34L + T106N + I205T + V253N; P10Q + K32E + A34L + R36E + T106N; P10Q + K32E + A34L + R36 +I205T;Pl0Q+K32E+A34L+R36E+V253N;P10Q+K32E+A34L+R36E+T106N+I205T;P10Q+K32E+A34L+R36E+T106N+V253N;P10Q+K32E+A34L+R36E+I205T+V253N;およびP10Q+K32E+A34L+R36E+T106N+I205T+V253Nが包含され;ここで、バリアントにおけるアミノ酸位置は配列番号:1における位置に従って番号が付けられる。 + I205T; Pl0Q + K32E + A34L + R36E + V253N; P10Q + K32E + A34L + R36E + T106N + I205T; P10Q + K32E + A34L + R36E + T106N + V253N; P10Q + K32E + A34L + R36E + I205T + V253N; and P10Q + K32E + A34L + R36E + T106N + I205T + V253N is included; wherein amino acid positions in the variant of SEQ ID NO: are numbered according to the position of 1.

組織因子結合部位における改変を有するポリペプチドバリアント:別の態様において、本発明の組成物は、L39、I42、S43、K62、L65、F71、E82およびF275よりなる群から選択される配列番号:1における少なくとも1つのアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を有するポリペプチド配列を含んでなる凝固活性を有するFVIIもしくはFVIIaポリペプチドバリアントを含んでなることができ、ここで、バリアントにおけるアミノ酸位置は配列番号:1における位置に従って番号が付けられる。 In another embodiment, the compositions of the present invention, L39, I42, S43, K62, L65, F71, SEQ ID NO selected from the E82 and the group consisting of F275:: polypeptide variants with modifications in the tissue factor binding site 1 at least one can comprise a FVII or FVIIa polypeptide variant having become clotting activity comprises a polypeptide sequence having an amino acid substitution at amino acid position, wherein the amino acid positions in the variant SEQ ID NO at: position in 1 They are numbered in accordance with. FVII/FVIIa分子の組織因子(TF)結合部位におけるこれらのアミノ酸置換は、hFVII/hFVIIaと比較して改善された凝固活性をもたらす。 These amino acid substitutions in the tissue factor (TF) binding sites of the FVII / FVIIa molecule results in clotting activity that is improved compared to hFVII / hFVIIa. TF結合部位中のこれらのアミノ酸位置における好ましい置換には以下のもの:L39E、L39QもしくはL39H;I42R;S43Q;K62EもしくはK62R;L65QもしくはL65S;F71D、F71E、F71N、F71QもしくはF71Y;E82QもしくはE82N;F275Hが包含され、ここで、バリアントにおけるアミノ酸位置は配列番号:1における位置に従って番号が付けられる。 TF binding sites in the Preferred substitutions at these amino acid positions as follows: L39E, L39Q or L39H; I42R; S43Q; K62E or K62R; L65Q or L65S; F71D, F71E, F71N, F71Q or F71Y; E82Q or E82N; F275H are included, wherein the amino acid positions in the variant SEQ ID NO: are numbered according to the position of 1. この態様のFVIIもしくはFVIIaポリペプチドバリアントは、例えば、配列番号:1におけるこれらのアミノ酸置換の1、2もしくは3つを含んでなることができる。 FVII or FVIIa polypeptide variant of this embodiment, for example, SEQ ID NO: may be comprised of one, two or three of these amino acid substitutions in 1. 好ましい置換にはS43Q、K62E、L65QおよびF71Yの1つもしくはそれ以上、特にS43Q、K62EおよびL65Qの1つもしくはそれ以上が包含され、ここで、バリアントにおけるアミノ酸位置は配列番号:1における位置に従って番号が付けられる。 Preferred for substitutions S43Q, K62E, L65Q and F71Y 1 one or more, especially S43Q, encompassed the K62E and L65Q 1 one or more, wherein the amino acid positions in the variant SEQ ID NO: ID according to the position of 1 It is attached. TF結合部位における改変を有するこのタイプのバリアントについてのさらなる情報は、WO 2004/029091に見出されることができる。 Further information about this type of variants with modifications in the TF binding site can be found in WO 2004/029091. TF結合部位におけるこれらの置換は、所望に応じて、本明細書において他の所で記述される他のタイプの改変、例えば上記のようなG1aドメインにおける改変(例えば、アミノ酸置換、挿入もしくは欠失)、少なくとも1個のN−グリコシル化部位(例えばインビボN−グリコシル化部位)の導入および/もしくは下記のようなPEGポリマーとの連結の1つもしくはそれ以上と組み合わせることができることが理解される。 These substitutions in TF binding sites can, if desired, other types of modifications described elsewhere herein, for example modifications in G1a domain as described above (e.g., amino acid substitutions, insertions or deletions ), it is understood that can be combined with at least one N- glycosylation site (e.g., in vivo N- glycosylation sites) of introduction and / or one or more connection between the PEG polymer as described below.

導入されたPEG化部位を有するポリペプチドバリアント:さらなる態様において、本発明の組成物は、リシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、ヒスチジン残基およびチロシン残基よりなる群、好ましくはシステインもしくはリシン残基から選択される結合基に連結された少なくとも1個のポリマー分子、特にポリエチレングリコール(PEG)もしくは他のポリアルキレンオキシドを有するFVIIもしくはFVIIaポリペプチドバリアントを含んでなることができる。 Introduced polypeptide variant having PEG sites: In a further embodiment, the compositions of the present invention, a lysine residue, a cysteine ​​residue, aspartic acid, glutamic acid residues, the group consisting of histidine and tyrosine residues it preferably comprise a FVII or FVIIa polypeptide variant having at least one polymer molecule, especially polyethylene glycol (PEG) or other polyalkylene oxides, which are linked to the binding group selected from the cysteine ​​or lysine residue can.

様々なポリペプチドをポリエチレングリコール部分と連結する方法(「PEG化」)は、当該技術分野において既知である。 Method of connecting a polyethylene glycol moiety various polypeptide ( "PEG reduction") are known in the art. 例えば、WO 01/58935は、PEG化のための少なくとも1個の導入されたそして/もしくは除かれた結合部位、例えば、場合によりPEG化が所望されない位置における1個もしくはそれ以上のリシン残基の除去と組み合わせて、1個もしくはそれ以上の導入されたリシン残基、または1個もしくはそれ以上の導入されたシステイン残基(この場合、場合により1個もしくはそれ以上のシステイン残基の除去と組み合わせて)を有するようにhFVIIもしくはhFVIIa配列(配列番号:1)に対して改変されているFVIIもしくはFVIIaポリペプチドバリアントにPEG部分を結合することができる方法を記述する。 For example, WO 01/58935 comprises at least one introduced and / or removed the binding sites for the PEG reduction, for example by the one or more lysine residue at a position PEG reduction is not desired in combination with removal, one or more of the introduced lysine residue or one or if more introduced cysteine ​​residues (this optionally one or removal and the combination of more cysteine ​​residues, hFVII or hFVIIa arranged to have a Te) (SEQ ID NO: describes a method capable of attaching a PEG moiety to the FVII or FVIIa polypeptide variant has been modified with respect to 1). PEG化に関するさらなる情報は、例えば、PEGポリマーに連結されたFVIIaのようなビタミンK依存性ポリペプチド、例えば野生型ヒトFVIIもしくはFVIIaおよび置換P10QおよびK32Eを有するFVIIもしくはFVIIaのバリアントを開示するWO 02/02764に、そしてN末端でPEG化されたタンパク質を製造する方法を記述するWO 96/11953に、そしてNektar Advanced PEGylation Catalog 2005−2006,“Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation”(Nektar Additional information regarding PEG can, for example, WO 02 disclosed vitamin K-dependent polypeptide, such as FVIIa linked to a PEG polymer, the FVII or FVIIa variants having, for example, wild-type human FVII or FVIIa and substituted P10Q and K32E / a 02764, and to describe WO 96/11953 a method for producing a PEG of proteins at the N-terminus, and Nektar Advanced PEGylation Catalog 2005-2006, "Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation" (Nektar
Therapeutics)に見出されることができる。 Can be found in the Therapeutics). 本発明の組成物における使用のためのFVIIもしくはFVIIaポリペプチドバリアントはまた、1個もしくはそれ以上のPEGポリマーの結合に加えて、例えば増加したリン脂質膜結合親和性および/もしくは増加した組織因子非依存性活性を与えるために、そして/または1個もしくはそれ以上の導入されたN−グリコシル化部位(例えば、導入されたインビボN−グリコシル化部位)を与えるために本明細書において他に記述されるアミノ酸改変の1つもしくはそれ以上を含むこともできることが理解される。 FVII or FVIIa polypeptide variant for use in the compositions of the present invention also one or more in addition to the binding of the PEG polymer, for example increased phospholipid membrane binding affinity and / or increased tissue factor- to impart dependent activity, and / or one or more of the introduced N- glycosylation site (e.g., introduced in vivo N- glycosylation sites) otherwise described herein to give that is also able to be understood to include amino acid one or more modifications.

他の改変:さらなる態様において、本発明の組成物における使用のためのバリアントは、場合により上記の改変の1つもしくはそれ以上に加えて、位置74、77および116よりなる群から選択される位置における少なくとも1個のさらなるアミノ酸置換、特にP74S、E77Aおよび/もしくはE116Dを含んでなることができ、ここで、バリアントにおけるアミノ酸位置は配列番号:1における位置に従って番号が付けられる。 Other modifications: Position In a further embodiment, variants for use in the compositions of the present invention, optionally in addition to one or more of the above modifications, selected from the group consisting of positions 74, 77 and 116 at least one additional amino acid substitution at, in particular P74S, can comprise E77A and / or E116D, wherein the amino acid positions in the variant SEQ ID NO: are numbered according to the position of 1. なおさらなる態様において、FVIIもしくはFVIIaポリペプチドバリアントは、ポリペプチドの固有の活性を増加することが既知である1つもしくはそれ以上の突然変異を含んでなるポリペプチド配列を含んでなることができる、例えばWO 02/22776に記述されるもの。 In still further embodiments, FVII or FVIIa polypeptide variant may be to increase the intrinsic activity of the polypeptide comprising a polypeptide sequence comprising one or more mutations are known, such as those described in WO 02/22776. 例えば、バリアンントは、157、158、296、298、305、334、336、337および374よりなる群から選択される配列番号:1のアミノ酸位置における少なくとも1つのアミノ酸改変(例えば置換)を含んでなることができ、ここで、バリアントにおけるアミノ酸位置は配列番号:1における位置に従って番号が付けられる。 For example, Barian'nto SEQ ID NO selected from the group consisting of 157,158,296,298,305,334,336,337 and 374: comprising at least one amino acid modification at one amino acid position (e.g., substitution) it can, wherein the amino acid positions in the variant SEQ ID NO: are numbered according to the position of 1. そのような置換の例には、V158D、E296D、M298Q、L305VおよびK337Aの1つもしくはそれ以上が包含される。 Examples of such substituents, V158D, E296D, M298Q, one or more L305V and K337A are included.

組換えFVII/FVIIaポリペプチド(例えば、hFVIIもしくはhFVIIa)または本明細書に記述されるその任意の組換えFVIIもしくはFVIIaポリペプチドバリアントは任意の適当な生物により、例えば哺乳類、酵母もしくは細菌細胞、真核細胞が好ましいが、より好ましくはインビボグリコシル化ができる宿主細胞、特にCHO細胞、HEK細胞もしくはBHK細胞のような哺乳類細胞において製造することができる。 Recombinant FVII / FVIIa polypeptide (e.g., hFVII or hFVIIa) or any recombinant FVII or FVIIa polypeptide variant described herein by any suitable organism, such as a mammalian, yeast or bacterial cells, true preferably eukaryotic cells, but more preferably can be produced in mammalian cells such as host cells, in particular CHO cells, HEK cells or BHK cells that can in vivo glycosylation.
例えば哺乳類細胞を用いる組換えFVII/FVIIaポリペプチドならびにそのポリペプチドバリアントの製造方法は、組換えポリペプチドのその後の精製および単離の方法がそうであるように、当該技術分野において周知である。 For example a manufacturing method of recombinant FVII / FVIIa polypeptide and the polypeptide variant using mammalian cells, as a method for subsequent purification and isolation of the recombinant polypeptide is so well known in the art. 例えば、WO 01/58935、WO 03/093465およびWO 2005/002615を参照。 See, for example, WO 01/58935, WO 03/093465 and WO 2005/002615.

本発明の組成物(再構成後)におけるFVIIもしくはFVIIaポリペプチドまたはFVIIもしくはFVIIaポリペプチドバリアントの濃度は異なることができ、そして約0.001〜100mg/ml、例えば約0.01〜10mg/ml、典型的には約0.1〜5mg/ml、例えば約0.2〜2mg/ml、例えば約0.4〜1.5mg/ml、例えば約0.5〜1.0mg/mlの範囲である。 The concentration of the FVII or FVIIa polypeptide or FVII or FVIIa polypeptide variant in the composition (after reconstitution) of the present invention may vary, and about 0.001 to 100 mg / ml, for example from about 0.01 to 10 mg / ml , typically about 0.1 to 5 mg / ml, for example about 0.2-2 mg / ml, for example about 0.4~1.5mg / ml, for example in the range of about 0.5 to 1.0 mg / ml is there. 例えば、濃度は水での再構成後のNovoSeven (R)のものと同様であることができ、それは約0.6mg/mlであるか、もしくは約1.0mg/mlのようにわずかに高い。 For example, the concentration may be similar to that of after reconstitution with water NovoSeven (R), which are either about 0.6 mg / ml, or slightly higher such as about 1.0 mg / ml. 凝固活性を有する組換えFVIIもしくはFVIIaポリペプチドバリアントについて、ポリペプチドの濃度はある場合においてわずかに低い、例えば約0.1〜0.5mg/ml、例えば約0.2〜0.4mg/mlであることができる。 For recombinant FVII or FVIIa polypeptide variant having clotting activity, slightly lower when the concentration of the polypeptide is, for example, about 0.1-0.5 mg / ml, such as about 0.2 - 0.4 mg / ml it can be there.

さらなる態様 A further aspect
さらなる態様において、本発明は、ヒスチジン緩衝剤および水とFVIIもしくはFVIIaポリペプチドまたはそのポリペプチドバリアントの混合物を準備して少なくとも5mMのヒスチジン濃度を有しそして場合により張性調整剤、カルシウムもしくは別の2価の陽イオン、界面活性剤、酸化防止剤または防腐剤の1つもしくはそれ以上のような他の成分を有する水性組成物をもたらすこと、および得られる水性組成物を凍結乾燥に供して例えば本明細書において他の所で記述されるような凍結乾燥組成物をもたらすことを含んでなる、FVIIもしくはFVIIaポリペプチドまたはそのポリペプチドバリアントを含んでなる貯蔵安定性組成物を製造する方法に関する。 In a further aspect, the present invention is a histidine buffer and a mixture of water and FVII or FVIIa polypeptide or polypeptide variant by preparing a histidine concentration of at least 5mM and optionally a tonicity adjusting agent, calcium or another divalent cation, a surfactant, and subjected to bring the aqueous composition with one or more other ingredients such as antioxidants or preservatives, and the resulting aqueous composition to lyophilization example comprising to bring lyophilized composition as described elsewhere herein, relates to a method for producing a FVII or FVIIa polypeptide or storage stability composition comprising the polypeptide variant. このタイプの凍結乾燥タンパク質組成物は、「凍結乾燥ケーキ」と呼ばれることが多い。 This type of freeze-dried protein composition is often referred to as "lyophilized cake". FVIIもしくはFVIIaポリペプチドまたはそのポリペプチドバリアントの組成物を安定させるためにこの方法において使用する緩衝剤および任意の他の追加成分の性質および量は上記のとおりであることが理解される。 FVII or FVIIa polypeptide or the nature and amount of buffer and any other additional ingredients used in this method in order to stabilize the composition of the polypeptide variant is understood to be as described above. バイアルもしくはプレフィルド2コンパートメントシリンジのような別のタイプの容器への調合された薬剤物質の充填および凍結乾燥方法は、凍結乾燥されるタンパク質の量ならびに凍結乾燥が行われる容器のタイプにより決まる。 Filling and freeze-drying method different types of formulated drug substance to the container such as a vial or prefilled 2 compartment syringe is determined by the type of container volume and freeze-drying is carried out of the protein is lyophilized. タンパク質もしくはポリペプチド組成物もしくは製剤および凍結乾燥に適当な方法は文献に記述され、そして当業者に既知である。 Suitable methods to a protein or polypeptide composition or formulation and lyophilization are described in the literature and are known to those skilled in the art.

なおさらなる態様において、本発明は、FVIIもしくはFVIIaポリペプチドまたは本明細書に記述されるようなFVIIもしくはFVIIaポリペプチドバリアントを含んでなる本発明の再構成組成物の治療的に有効な量を処置もしくは予防を必要とする哺乳類に投与することを含んでなる、FVIIもしくはFVIIaポリペプチドまたはFVIIもしくはFVIIaポリペプチドバリアントの投与により処置できる哺乳類(例えば、非ヒト霊長類、ヒト、マウス、サルなど)における症状を治療的にもしくは予防的に処置するかもしくは予防する方法、ならびにFVIIもしくはFVIIaまたはそのポリペプチドバリアントの投与により処置できる哺乳類における症状を処置するかもしくは予防するための薬剤の製造のためのF In a still further aspect, the present invention provides treatment a therapeutically effective amount of a reconstituted composition of the invention comprising a FVII or FVIIa polypeptide variant as described in FVII or FVIIa polypeptide herein or or comprising administering to a mammal in need thereof, in a mammal that can be treated by administration of FVII or FVIIa polypeptide or FVII or FVIIa polypeptide variant (e.g., nonhuman primate, human, murine, monkey, etc.) how to or preventing the symptoms therapeutically or prophylactically treat, as well as FVII or FVIIa or F for the manufacture of a medicament for treating or preventing a condition in a mammal that can be treated by administration of the polypeptide variant IIもしくはFVIIaポリペプチドまたは本明細書に記述されるようなFVIIもしくはFVIIaポリペプチドバリアントを含んでなる本発明の組成物の使用に関する。 The use of II or FVIIa polypeptide or composition of the FVII or FVIIa polypeptide variant as described herein comprising at present invention.

FVIIもしくはFVIIaまたはそのポリペプチドバリアントの投与により(そして/またはその組成物により)哺乳類において予防的にもしくは治療的に処置できる症状には、例えば血液因子欠乏症、特に血友病AもしくはB、ならびに外傷(鈍的および穿通性外傷の両方)と関連する出血、脳内出血(ICH)、外傷性脳損傷(TBI)、熱傷、静脈瘤出血、胃腸出血、外科的出血、移植(例えば、組織移植もしくは臓器移植)、フィブリン溶解処置、抗凝固処置、分娩後出血、ウイルス誘発性出血、フォンヴィルブラント病および血小板減少症が包含されるがこれらに限定されるものではない。 FVII or FVIIa or (and / or its by composition) conditions that may prophylactically or therapeutically treat in mammals by administration of the polypeptide variant, e.g., blood factor deficiencies, in particular hemophilia A or B, as well as trauma (blunt and penetrating both trauma) and associated bleeding, intracerebral hemorrhage (ICH), traumatic brain injury (TBI), burns, variceal bleeding, gastrointestinal bleeding, surgical bleeding, implantation (e.g., tissue transplantation or organ transplantation), fibrinolytic treatment, anticoagulant treatment, postpartum bleeding, virus-induced bleeding, although von Willebrand's disease and thrombocytopenia encompassed not limited thereto. FVIIもしくはFVIIaまたはFVIIもしくはFVIIaポリペプチドバリアントの投与により処置することができる症状に関するさらなる情報についてはWO 2006/114105を参照。 See WO 2006/114105 for further information about the conditions that may be treated by administration of FVII or FVIIa or FVII or FVIIa polypeptide variant.

本発明はまた、哺乳類における血餅形成を増加するために有効な量の少なくとも1つのFVIIもしくはFVIIaポリペプチドまたは少なくとも1つのFVIIもしくはFVIIaポリペプチドバリアントを含んでなる本発明の組成物を増加した血餅形成を必要とする哺乳類に投与することを含んでなる、増加した血餅形成が望ましい疾患もしくは症状を有する哺乳類における血餅形成を増加する方法も提供する。 The present invention also includes blood increased composition of the present invention comprising at least one FVII or FVIIa polypeptide or at least one FVII or FVIIa polypeptide variant in an amount effective to increase clot formation in a mammal comprising administering to a mammal in need of cake formation also provides a method of increasing clot formation in a mammal having an increased clot formation is desirable disease or condition. 増加した血餅形成が望ましい疾患もしくは症状には、血友病AもしくはBのような血友病、ならびに外傷(鈍的および穿通性外傷の両方)と関連する出血、脳内出血(ICH)、外傷性脳損傷(TBI)、熱傷、静脈瘤出血、胃腸出血、外科的出血、移植(例えば、組織移植もしくは臓器移植)、フィブリン溶解処置、抗凝固処置、分娩後出血、ウイルス誘発性出血、フォンヴィルブラント病および血小板減少症が包含されるがこれらに限定されるものではない。 It increased the disease or condition clot formation is desirable and, hemophilia, such as hemophilia A or B, as well as bleeding associated with trauma (both blunt and penetrating trauma), intracerebral hemorrhage (ICH), trauma sexual brain injury (TBI), burns, variceal bleeding, gastrointestinal bleeding, surgical bleeding, implantation (e.g., tissue transplantation or organ transplantation), fibrinolytic treatment, anticoagulant treatment, postpartum hemorrhage, viral-induced bleeding, von Ville While Brandt's disease and thrombocytopenia are included but not limited thereto. FVIIもしくはFVIIaまたはFVIIもしくはFVIIaポリペプチドバリアントの投与により増加した血餅形成が促進され得る疾患および症状に関するさらなる情報についてはWO 2006/114105を参照。 See WO 2006/114105 for FVII or FVIIa or FVII or FVIIa further information on diseases and conditions increased clot formation can be facilitated by administration of a polypeptide variant.

本発明の組成物は、単回もしくは頻回注射(ボーラスもしくは注入)として哺乳類に投与することができ、そして例えば非経口、例えば皮下、筋肉内もしくは静脈内投与することができる。 The compositions of the present invention, as single or multiple injections (bolus or infusion) can be administered to a mammal, and for example parenteral, for example subcutaneous, can be administered intramuscularly or intravenously. 典型的には、本発明の組成物は哺乳類に静脈内投与される。 Typically, the compositions of the present invention is intravenously administered to a mammal. ポリペプチドの投薬量は、例えば処置される症状および患者の体重により決まるが、rhFVIIa(NovoSeven (R) )に使用される投薬量と同様であることが多く、例えば約20〜約300μg/kg、典型的には約25〜約150μg/kg、例えば約40〜約120μg/kgである。 The dosage of the polypeptide, for example, determined by the weight of the symptoms and the patient being treated, often is the same as the dosages used in rhFVIIa (NovoSeven (R)), for example from about 20 to about 300 [mu] g / kg, typically from about 25 to about 150 [mu] g / kg, for example about 40 to about 120 [mu] g / kg.

本発明は、本発明の組成物を説明する以下の限定されない実施例によりさらに記述される。 The present invention is further described by the following non-limiting examples illustrate the compositions of the present invention.

材料および方法組換えFVIIaポリペプチドバリアントの製造 以下の実施例において使用する組換え第VIIa因子ポリペプチドバリアントは、組換えhFVIIaのバリアントであった。 Recombinant Factor VIIa polypeptide variant used in the following examples the production of materials and methods Recombinant FVIIa polypeptide variant was variant of recombinant hFVIIa. このポリペプチドバリアントは、配列番号:1に示される野性型ヒトFVIIaのポリペプチド配列と比較して置換P10Q+K32E+A34E+R36E+T106N+V253Nを含んでなった。 The polypeptide variant, SEQ ID NO: comprise substitutions P10Q + K32E + A34E + R36E + T106N + V253N compared to the polypeptide sequence of wild-type human FVIIa shown in 1. 凝固活性を有するこのFVIIaポリペプチドバリアントは、実質的にWO 2004/111242に記載の通りCHO−K1細胞において製造され、そして実質的にWO 2006/074664に記載の通り精製された。 The FVIIa polypeptide variant having clotting activity is produced in as CHO-K1 cells according to substantially WO 2004/111242, and purified as described in substantially WO 2006/074664.

FVII組成物もしくは製剤の製造 上記に概説した通り製造した凍結薬剤物質を融解し、滅菌濾過し、そして実施例1および3において以下に示される凍結乾燥パラメーターを用いて凍結乾燥した。 Thaw frozen drug substance prepared as outlined in the above FVII compositions or formulations, sterile filtered, and lyophilized using a freeze-drying parameters shown below in Examples 1 and 3. タンパク質(ポリペプチド)もしくは賦形剤濃度についての調整は行わなかった。 Protein adjustment for (polypeptide) or excipient concentration was not carried out.

吸光度 タンパク質(ポリペプチド)濃度およびタンパク質回収パーセントは、A 280で吸光度を測定することにより決定した。 Absorbance protein (polypeptide) concentration and protein recovery percentage was determined by measuring absorbance at A 280. 組成物もしくは製剤は、吸光度を測定する前に微量遠心した。 Compositions or formulations were microfuge before measuring absorbance. 分析は、96ウェル石英プレートを用いて二重反復(150μl/ウェル)で行った。 Analysis was performed in duplicate using 96-well quartz plate (150 [mu] l / well). 各組成物もしくは製剤のそれぞれのバッファーは、読み取りのブランクに使用した。 Each buffer of each composition or formulation was used to read the blank. 補正mg/ml計算は、1.2の消衰係数に基づいた。 Correction mg / ml calculations were based on the extinction coefficient of 1.2.

pH測定 pHの読み取りは、Corning pHメーター440を用いて較正後に行った。 Reading of pH measurement pH was performed after calibration using a Corning pH meter 440.

再構成時間 凍結乾燥組成物もしくは製剤を下記のように滅菌水において再構成した:バイアルを45℃の角度で傾け、そして水をガラスに滴下した。 The reconstitution time lyophilized compositions or formulations were reconstituted in sterile water as follows: tilting at an angle of the vial 45 ° C., and water was added dropwise to a glass. タイマーを開始し、そしてバイアルを回転させ、そして完全に溶解しているか視覚的に調べた。 Start the timer and rotate the vial and completely dissolved is either visually examined. 再構成が目視検査により認められるとタイマーを止めた。 To stop the timer and re-configuration is recognized by visual inspection.

オスモル濃度 3つの基準(100、290および1000mmol/kg)を用いて較正しそしてクリーンテスト(clean test)で試験したVapro (R)浸透圧計をオスモル濃度を決定するために使用した。 The calibrated and Vapro tested clean test (clean test) (R) Osmometer with osmolarity three criteria (100,290 and 1000 mmol / kg) was used to determine the osmolality. 組成物もしくは製剤を測定するために以下の基準を用いた:100±2、290±3、1000+5および10未満のクリーンテストレベル。 Composition or using the following criteria in order to measure the formulation: 100 ± 2,290 ± 3,1000 + 5 and clean test level of less than 10. 試験するために、溶質を含まないペーパーディスク上に10μlのサンプルを置いた。 To test, put 10μl of the sample on a paper disk that does not contain the solute. 周囲チャンバー温度と密閉空間内の露点温度との差を測定するために細線熱電対湿度計を使用した。 Using thin wire thermocouple hygrometer to measure the difference between the dew point temperature of the ambient chamber temperature and the sealed space. これらの温度間の差は露点温度降下であり、それは溶液蒸気圧の関数である。 The difference between these temperatures is the dew point temperature drop, which is a function of the solution vapor pressure. サンプルの読み取り中に、装置が較正を維持していることを保証するために全ての3つのサンプルについて290スタンダード(290 standard)を測定した。 Reading the sample device was measured 290 Standard (290 standard) for all three samples to ensure that it maintains the calibration.

凝集度 凝集度は、50mMホウ酸、500mM NaCl pH8.5においてAmersham Bioscience(Cat.#17−1571−01)からのSuperdex TM 200 HR 10/300カラムを使用してSEC−HPLCを用いて決定した。 Cohesion cohesion, 50 mM boric acid, were using Superdex TM 200 HR 10/300 column from the 500mM NaCl pH8.5 Amersham Bioscience (Cat. # 17-1571-01) was determined using SEC-HPLC . 凝集パーセントは、全タンパク質ピーク面積と比較した高分子型の相対ピーク面積として計算される。 Aggregation percentage is calculated as the relative peak areas of the polymer compared to the total protein peak areas. 全回収パーセント(%TRc)は、t のピーク面積の合計をその後の時間点のピーク面積の合計で割ることにより計算される。 Total recovery percentage (% TRc) is calculated by dividing the sum of the peak areas of t 0 the sum of the subsequent peak area time points.

重鎖分解および酸化 重鎖分解および酸化は、Phenomenex Jupiter TM C5、2.0x250mm、300A、5ミクロンカラムを用いた逆相HPLC(RP−HPLC)の結果の分析により決定された。 Heavy chain degradation and oxidation heavy chain degradation and oxidation, Phenomenex Jupiter TM C5,2.0x250mm, was determined by analysis of 300A, 5 micron column reverse phase HPLC using a (RP-HPLC) results. ジスルフィド結合を切断するためにFVIIaポリペプチドバリアントサンプルを還元剤(ジチオスレイトール)で処理しそして75℃に10分間加熱した。 The FVIIa polypeptide variant samples to break the disulfide bonds is treated with a reducing agent (dithiothreitol) and heated to 75 ° C. 10 min. その結果として、以下の成分の相対的存在を単離しそして定量するために、両方ともトリフルオロ酢酸で酸性化した水およびアセトニトリルの直線勾配におけるRP−HPLC分離を用いることが可能であった: As a result, in order to isolate and quantify the relative abundance of the following ingredients, they were both able to use the RP-HPLC separation in a linear gradient of acidified water and acetonitrile with trifluoroacetic acid:
・FVIIaポリペプチドバリアントの軽鎖 ・FVIIaポリペプチドバリアントの重鎖 ・FVIIaポリペプチドバリアントの4つの重鎖分解産物 ・FVIIaポリペプチドバリアントの重鎖の3つの酸化形態 ・一本鎖FVIIポリペプチドバリアント、および ・des−Gla FVIIaポリペプチドバリアント。 · FVIIa polypeptide variant light chain-FVIIa polypeptide heavy chain-FVIIa polypeptide four heavy chain degradation products, FVIIa polypeptide heavy chains of three oxide forms, single-chain FVII polypeptide variant variant variant variant, and · des-Gla FVIIa polypeptide variant.

生物活性(第X因子活性化アッセイ) Biological activity (Factor X activation assay)
実施例2および3の生物活性(効能)は、リン脂質依存性(組織因子非依存性)第X因子活性化アッセイを用いて決定された。 Examples 2 and 3 of the biological activity (potency) is the phospholipid-dependent (tissue factor independent) was determined using the factor X activation assay. このアッセイは、Nelsestuen et al. This assay, Nelsestuen et al. ,J Biol Chem,2001;276:39825−39831における39826頁に詳細に記述されている。 , J Biol Chem, 2001; 276: is described in detail on pages 39826 in 39825-39831. 簡潔に言えば、アッセイするFVIIaポリペプチドもしくはFVIIaポリペプチドバリアントをBSAを含有するTrisバッファーにおいてリン脂質源(好ましくは、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルセリンの組み合わせ)および再脂質化第X因子と混合する。 Briefly, the phospholipid source in Tris buffer containing the FVIIa polypeptide or FVIIa polypeptide variant to assay BSA (preferably phosphatidylcholine and combinations phosphatidylserine) is mixed with and re-lipidation factor X. 特定のインキュベーション時間後に過剰のEDTAの添加により反応を止める。 The reaction is stopped by addition of excess EDTA after a certain incubation time. 次に、第Xa因子の濃度を発色性基質(S−2765、Chromogenix)の添加後に405nmでの吸光度変化から測定する。 Is then measured from absorbance change at 405nm the concentration of factor Xa after addition of chromogenic substrate (S-2765, Chromogenix). バックグラウンドの補正後にFVIIaポリペプチドもしくはFVIIaポリペプチドバリアントの組織因子非依存性活性を10分後の吸光度変化として決定する。 After correction for background to determine the tissue factor independent activity of FVIIa polypeptide or FVIIa polypeptide variant as absorbance change after 10 minutes. U/mg単位のFVIIaポリペプチドもしくはFVIIaポリペプチドバリアントの比活性は、同じサンプル上で、U/ml単位で表される第X因子活性化アッセイの結果をmg/ml単位で表されるA 280吸光度測定の結果で割ることにより見出されることができる。 The specific activity of the FVIIa polypeptide or FVIIa polypeptide variant of the U / mg units in the same sample on, A 280 represented the results of the factor X activation assay expressed in U / ml units mg / ml Unit it can be found by dividing the result of absorbance measurement.

生物活性(PACTアッセイ) Biological activity (PACT assays)
実施例4におけるサンプルの活性を決定するためにリン脂質活性化凝固時間(PACT)アッセイを用いた。 Using phospholipid activated clotting time (PACT) assay to determine the activity of the sample in Example 4. PACTアッセイは改変された「活性化部分トロンボプラスチン時間」(APTT)アッセイであるが、通常のAPTTアッセイは凝固の接触経路(contact pathway)(内因系経路としても知られている)をモニターするが、PACTアッセイにおいて、一つにはAPTTアッセイにおいて用いられるカオリンもしくは他のケイ酸塩をリン脂質で置換することにより、接触経路は阻害され、従って、接触経路による第Xa因子への第X因子の転化を妨げる。 PACT Although assay is modified "activated partial thromboplastin time" (APTT) assay, although normal APTT assay to monitor the solidification of the contact path (contact pathway) (also known as intrinsic pathway), in PACT assays, by in part be replaced with phospholipids kaolin or other silicate used in the APTT assay, the contact path is inhibited, therefore, the conversion of factor X to factor Xa by contact path the hamper. 結果として、トロンビン形成、従って、PACTアッセイにおける凝固時間は、FVIIaポリペプチドもしくはFVIIaポリペプチドバリアントとリン脂質との間の相互作用により決まる。 As a result, thrombin formation, thus, the coagulation time in PACT assays, determined by the interaction between FVIIa polypeptide or FVIIa polypeptide variant and phospholipid.

PACTアッセイは、人工凝固活性化因子としてリン脂質小胞を用いて再石灰化クエン酸ヒトFVII欠乏血漿の組織因子非依存性FVIIa誘導性もしくはFVIIaバリアント誘導性凝固を測定する。 PACT assays, the tissue factor independent FVIIa induced or FVIIa variant induced coagulation of remineralization citric acid human FVII deficient plasma is measured using a phospholipid vesicles as artificial coagulation activator. 簡潔に言えば、一定量の均質化したリン脂質小胞(ホスファチジルセリン:ホスファチジルコリン:ホスファチジルエタノールアミン(20:40:40の比率);8ミリリットル(ml)の血漿当たり320マイクロリットル(μl)の5mMの超音波処理したPS:PC:PEリン脂質小胞)をクエン酸ヒトFVII欠乏血漿に加える。 Briefly, a fixed amount of homogenized phospholipid vesicles (phosphatidylserine: phosphatidylcholine: ratio of phosphatidyl ethanolamine (20:40:40); 8 ml of (plasma per 320 microliter ml) ([mu] l) 5 mM PS was sonicated: PC: adding PE phospholipid vesicles) citrate human FVII deficient plasma. 次に、サンプルを加え(例えば、0.625nM〜10nMの間のFVIIaポリペプチド濃度、もしくはFVIIaポリペプチドバリアント濃度を用いて)、そしてカルシウムイオン(100μlの血漿に50μlのカルシウムバッファー(19.2mMのHEPES、144mMのNaCl、pH7.35、40mMのCaCl 、57.6ミリグラム/ミリリットル[mg/ml]のBSAを含有する))の添加により凝固反応を開始する。 Then, the sample was added (e.g., FVIIa polypeptide concentration between 0.625NM~10nM, or using a FVIIa polypeptide variant concentration) and calcium ions (in the plasma 100μl calcium 50μl buffer (of 19.2mM HEPES, NaCl of 144 mM, CaCl 2 of PH7.35,40MM, containing BSA 57.6 mg / ml [mg / ml]) by adding) to initiate clotting reaction. 凝固をリアルタイムで325ナノメートル(nm)で分光光度法でモニターする。 Solidifying the monitored spectrophotometrically at 325 nm in real time (nm). 凝固時間は、カルシウムイオンの添加による反応の開始から325nmでの吸光度により決定した場合の血餅検出までの経過時間である。 Clotting time is the time elapsed from the start of the reaction by the addition of calcium ions to the clot detection as determined by absorbance at 325 nm. 対照基準を1.00の効能とみなし、そしてサンプルの効能は、同じPACT値を得るために必要とされる基準の量と比較してサンプルの相対量を測定することによりこの基準に対して決定される。 Regarded reference standard and efficacy of 1.00, and a sample of efficacy, determined relative to this standard by compared to the amount of criteria required to obtain the same PACT value measures the relative amounts of sample It is.

全血アッセイ FVIIaおよびそのFVIIaポリペプチドバリアントの凝固活性を1段階アッセイにおいて測定し、そして凝固時間をThrombotrack IV凝固計(Medinor)上で記録した。 Whole Blood Assay FVIIa and clotting activity of the FVIIa polypeptide variant measured in one-stage assays and the clotting times were recorded on a Thrombotrack IV coagulometer (Medinor). 100μlのFVIIaもしくはFVIIaポリペプチドバリアントを10mMのグリシルグリシン、50mMのNaCl、37.5mMのCaCl 、pH7.35を含有するバッファーにおいて希釈し、そして反応カップに移した。 100μl of FVIIa or FVIIa polypeptide variant of 10mM glycylglycine, 50 mM of NaCl, CaCl 2 of 37.5 mM, then diluted in buffer containing pH 7.35, and transferred to the reaction cup. 抗凝固剤として10%の0.13Mクエン酸3ナトリウムを含有する50μlの血液の添加により凝固反応を開始した。 Clotting was initiated reaction by the addition of 50μl of blood containing 10% 0.13M trisodium citrate as anticoagulant. データは、ExcelもしくはPRISMソフトウェアを用いて分析した。 Data were analyzed using Excel or PRISM software. 凝固活性は、血餅形成を得るために必要な時間を反映する。 Clotting activity reflects the time needed to obtain clot formation. 従って、より少ない凝固時間は、より高い凝固活性に対応する。 Accordingly, fewer clotting time corresponds to a higher clotting activity.

凝固活性を測定する方法 FVIIaもしくはFVIIaポリペプチドバリアントの凝固活性は、本質的にWO92/15686に記述されるように標準的な1段階凝固アッセイを用いて測定される。 Clotting activity methods FVIIa or FVIIa polypeptide variant measuring the clotting activity is measured using a standard one-stage clotting assay as described essentially WO92 / 15686. 簡潔に言えば、試験するサンプルを50mM Tris(pH7.5)、0.1%BSAにおいて希釈し、そして100μlを100μlのFVII欠乏血漿および10mMのCa ++を含有する200μlのトロンボプラスチンCとインキュベーションする。 Briefly, the sample to be tested 50 mM Tris (pH 7.5), diluted in 0.1% BSA, and the to thromboplastin C and incubation 200μl containing FVII deficient plasma and 10mM of Ca ++ of 100 [mu] l 100 [mu] l. 凝固時間を測定し、そして連続希釈でクエン酸正常ヒト血漿のプールを用いる標準曲線と比較する。 The coagulation time was measured, and compared with serial dilutions and standard curve using citrate normal human plasma pool.

抗凝固活性を測定する方法 不活性FVII/FVIIaポリペプチドもしくはそのバリアントの抗凝固活性は、上記(凝固活性を測定する方法)の1段階凝固アッセイを用いて測定することができ、ここで、不活性コンジュゲートは限られた量の再脂質化組織因子に関して野生型FVIIと競合する。 Anticoagulant activity of anticoagulant method activity measuring the inactive FVII / FVIIa polypeptide or its variants can be measured using a one-stage clotting assay described above (Method of measuring the clotting activity), where not active conjugate competes with wild-type FVII respect relipidated tissue factor a limited amount. アッセイは、本質的に参考文献として本明細書に組み込まれるWO 92/15686、実施例IIIに記載の通り行われる。 Assay, WO 92/15686 which are essentially incorporated herein by reference, are carried out as described in Example III. 野生型FVIIの凝固時間を延長する不活性コンジュゲートの能力を記録し、そして抗凝固活性の尺度とみなす。 Record the ability of inert conjugate to prolong the clotting time of wild-type FVII, and regarded as a measure of anticoagulant activity.

Mettler Toledo DO305乾燥オーブンを有するMettler Toledo DL36 KF電量計を用いてカール・フィッシャー分析により水分含量について凍結乾燥ケーキを分析した。 It was analyzed lyophilized cake for water content by Karl Fischer analysis using Mettler Toledo DL36 KF coulometer with Mettler Toledo DO305 drying oven.

本実施例において、緩衝剤としてのヒスチジン、コハク酸塩および酢酸塩の適性を比較した。 In the present example was compared histidine as a buffering agent, the suitability of succinate and acetate. 以下の表における「No.」という用語は、組成物もしくは製剤に与えられた識別番号をさす。 The term "No." in the following table refers to the identification number given to the composition or formulation. 試験した組成物もしくは製剤は、下記のとおりであった: Tested compositions or formulations were as follows:

水性組成物もしくは製剤の透析後に、0.5mg/mlのFVIIもしくはFVIIaポリペプチドバリアントを含有する、1mlの各組成物もしくは製剤を3mlの凍結乾燥バイアルに入れ(各製剤について20バイアル)、そして以下のパラメーターに従って凍結乾燥した。 After dialysis of the aqueous compositions or formulations, containing FVII or FVIIa polypeptide variant of 0.5 mg / ml, each composition or formulation of 1ml placed in lyophilization vials 3 ml (20 vials for each formulation), and the following and freeze-dried in accordance with the parameters.

二次乾燥後に、全てのバイアルを600mTorrで窒素でバックフィルし(backfilled)、そして栓をした(13mm Westストッパー)。 After the secondary drying, all of the vial was backfilled with nitrogen at 600mTorr (backfilled), and a plug (13mm West stopper). 凍結乾燥組成物もしくは製剤を40℃で貯蔵し、そして0、7、14および28日で、 Lyophilized compositions or formulations were stored at 40 ° C., and 0, 7, 14 and 28 days,
吸光度(A 280 、タンパク質回収%の決定用)、pH、再構成時間およびオスモル濃度を包含する様々な分析に供した。 Absorbance (A 280, for the determination of protein recovery%), pH, and subjected to various analyzes including reconstitution time and osmolality. さらに、凝集度をSEC−HPLCを用いて決定し;重鎖分解および酸化をRP−HPLCにより決定し;そして効能を第X因子活性化アッセイを用いて決定した。 Furthermore, the degree of aggregation determined using SEC-HPLC; was determined using the factor X activation assay a and efficacy; determine the heavy chain degradation and oxidation by RP-HPLC.

結果 2つのコハク酸塩組成物もしくは製剤を除いて、組成物もしくは製剤は全て、40℃で28日までの後に許容しうるタンパク質回収(A 280 )およびオスモル濃度を示した。 Results except for two succinate compositions or formulations, all compositions or formulations showed protein recovery (A 280) and osmolality acceptable after 28 days at 40 ° C.. しかしながら、14日後に試験した場合、コハク酸塩組成物もしくは製剤は、他の組成物もしくは製剤と比較して非常に低いA 280およびオスモル濃度を有した。 However, when tested after 14 days, succinate composition or formulation had a very low A 280 and osmolality as compared with other compositions or formulations. これは、コハク酸カルシウムの沈殿に起因すると考えられる。 This is believed to be due to precipitation of calcium succinate.

コハク酸塩もしくはヒスチジンで緩衝化した組成物もしくは製剤は、28日までの間許容しうるpH安定性を示し、一方、酢酸塩で緩衝化した組成物もしくは製剤のpHは不安定であり、開始から比較的大きいpH増加を示した。 Compositions or formulations buffered with succinate or histidine, a pH stability acceptable for up to 28 days, whereas, pH of compositions or formulations buffered with acetate is unstable, starting showed relatively large pH increased from.

凍結乾燥組成物もしくは製剤は全て、40℃で28日までの間貯蔵した場合に30秒以内に容易に再構成することができた。 All lyophilized compositions or formulations could be easily reconstituted within 30 seconds when stored for up to 28 days at 40 ° C..

上記の結果を考慮して、ヒスチジンは緩衝剤として酢酸ナトリウムもしくはコハク酸ナトリウムのいずれかよりも有益であると結論付けられた。 In view of the above results, histidine was concluded to be beneficial than either sodium acetate or sodium succinate as a buffer. ヒスチジン組成物もしくは製剤の凝集度は全ての3つのpH値5.5、6.0および6.5で許容できるが、ヒスチジン組成物もしくは製剤のSEC−HPLC結果は、pHが増加するにつれてわずかに減少した凝集があることを示した。 Cohesion histidine compositions or formulations can be acceptable in all three pH values ​​5.5, 6.0 and 6.5 but, SEC-HPLC results of histidine composition or formulation is slightly as the pH is increased It showed that there is a reduced cohesion. ヒスチジン組成物もしくは製剤は、SEC−HPLC(凝集)、RP−HPLC(重鎖分解および酸化)および第X因子活性化アッセイ(効能)により評価した場合にpH6.5で安定であることが見出された。 Histidine compositions or formulations, SEC-HPLC (aggregate), RP-HPLC (heavy chain degradation and oxidation) and Heading to be stable at pH6.5 as assessed by factor X activation assay (potency) It has been. 従って、pH6.5のヒスチジンがさらなる実験のための緩衝剤として選択された。 Thus, histidine pH6.5 was selected as the buffer for further experiments.

バッファーとして酢酸ナトリウムもしくはヒスチジンのいずれかを含有する組成物もしくは製剤について、上記のものと同一であるが張性調整剤としてトレハロースの代わりにショ糖を含有する(ショ糖の量は、それぞれの組成物もしくは製剤について上記の表に示されるトレハロースの量と同じである)組成物もしくは製剤もまた試験した。 For compositions or formulations containing either the sodium acetate or histidine as a buffer, which are identical to those described above containing sucrose in place of trehalose as tonicity adjusting agents (sucrose in an amount of each composition objects or the same as the amount of trehalose as shown in the table above for formulation) compositions or formulations were also tested. ショ糖を含有する組成物もしくは製剤の結果は、トレハロースを含有するものに匹敵した。 Results of compositions or formulations containing sucrose were comparable to those containing trehalose. しかしながら、ショ糖の存在下での酸化生成物の形成の任意の潜在的な増加した危険性を減らすために、トレハロースがその後の実験における張性調整剤として選択された。 However, in order to reduce any potential increased risk of formation of oxidation products in the presence of sucrose, trehalose has been selected as the tonicity adjusting agent in the subsequent experiments.

実施例1における上記の通り以下の水性組成物もしくは製剤を製造しそして凍結乾燥に供した。 To produce the following aqueous composition or formulation as in Example 1 and subjected to lyophilization. 組成物もしくは製剤の各々は、0.6mg/mlのFVIIもしくはFVIIaポリペプチドバリアントを含有し、そして6.5のpHを有した。 Each of the compositions or formulations may contain FVII or FVIIa polypeptide variant of 0.6 mg / ml, and had a pH of 6.5. 以下の表における「No.」という用語は、組成物もしくは製剤に与えられた識別番号をさす。 The term "No." in the following table refers to the identification number given to the composition or formulation.

実施例1における上記の通りバイアルを40℃で28日間貯蔵しそして0、14および28日で分析した。 Was analyzed in the street vial in Example 1 were stored for 28 days at 40 ° C. and 0, 14 and 28 days. 比較目的のために、液体形態の同じ組成物もしくは製剤を40℃で21日間貯蔵し、そして0、7および21日で分析した。 For comparison purposes, the same compositions or liquid form preparations were stored for 21 days at 40 ° C., and analyzed at 0, 7 and 21 days. 比活性(U/mg)もまた凍結乾燥組成物もしくは製剤については0、14および28日で、そして液体組成物もしくは製剤については0、7および21日で決定した。 The specific activity (U / mg) are also lyophilized compositions or formulations at 0, 14 and 28, and for liquid compositions or formulations was determined in 0, 7 and 21 days. さらに、各液体組成物もしくは製剤の2つのバイアルを凍結融解分析用に−80℃で凍結した。 Furthermore, it is frozen at -80 ° C. Two vials of each liquid composition or formulation for freeze-thaw analysis.

結果 凍結乾燥バイアルにおける凍結乾燥ケーキの外観は、組成物もしくは製剤No. Appearance of lyophilized cake in a result lyophilized vials, the composition or formulation No. 10を除いて組成物もしくは製剤間で均一であった。 It was uniform across composition or formulation with the exception of 10. 凍結乾燥組成物もしくは製剤は全て、40℃で28日間貯蔵した後に約30秒もしくはそれ未満以内に容易に再構成することができた。 Lyophilized compositions or formulations All could be easily reconstituted within about 30 seconds or less after storage at 40 ° C. 28 days.

40℃で28日間のインキュベーション後の凍結乾燥組成物もしくは製剤は、21日間同じ温度で貯蔵した液体組成物もしくは製剤より低い凝集度および高い回収を有した。 Lyophilized compositions or formulations after incubation for 28 days at 40 ° C. had a low degree of aggregation and high recovery than the liquid compositions or formulations stored at the same temperature for 21 days. 液体組成物もしくは製剤の凍結融解応力処理は、タンパク質に影響を与えないように思われた。 Freeze-thaw stress treatment of the liquid composition or formulation did not appear to affect the protein. 10mMのCaCl を含有する液体組成物もしくは製剤は、2mMのみのCaCl を含有する匹敵する組成物もしくは製剤より7日および21日後に低い凝集度を有することが見出された。 Liquid compositions or formulations containing CaCl 2 of 10mM has been found to have a 7 days and 21 days after lower cohesion than compositions or formulations comparable containing CaCl 2 in 2mM only. 予想されるように、SE−HPLCにより分析した場合の総合的データは、凍結乾燥組成物もしくは製剤が液体組成物もしくは製剤より安定であることを示す。 As expected, the overall data when analyzed by SE-HPLC show that lyophilized compositions or formulations are more stable than the liquid compositions or formulations.

凍結乾燥組成物もしくは製剤は、0日と比較して14および28日で酸化の1%未満の増加を有し、メチオニンを含有する組成物もしくは製剤は、メチオニンなしの組成物もしくは製剤と比較して酸化のわずかに低い増加(0.2〜0.5%)を示した。 Lyophilized compositions or formulations may have an increased less than 1% of the oxide at 14 and 28 days compared to day 0, compositions or formulations containing methionine, compared to compositions or formulations without methionine exhibited slightly lower increase in oxide (0.2 to 0.5%) Te.

Tween (R) −20の異なる量の効果は、液体もしくは凍結乾燥組成物もしくは製剤のいずれにおいても見られなかった。 Effect of Tween (R) -20 different amounts, was also seen in either liquid or lyophilized compositions or formulations. しかしながら、わずかに高い量のTween (R) −20(例えば、0.005%よりむしろ0.01%)もしくは他の界面活性剤は、凍結乾燥の前の濾過もしくは他の精製工程後に界面活性剤が組成物もしくは製剤に存在することを保証するために好都合であり得る。 However, slightly higher amounts of Tween (R) -20 (e.g., 0.01% rather than 0.005%) or other surfactants, before lyophilization filtration or other purification steps after surfactant there may be advantageous to ensure that present in the composition or formulation.

凍結乾燥組成物もしくは製剤の水分含量を0および28日で測定した。 The moisture content of the lyophilized compositions or formulations were measured at 0 and 28 days. 28日での1つの組成物もしくは製剤(No.7)を除いて、0日および28日の両方での水分含量は3%未満であり、そして多くの場合において2%未満であった。 Except one composition or formulation at 28 days (No.7), the moisture content in both the 0 and 28 days is less than 3%, and less than 2% in many cases. 0〜28日の間の各組成物もしくは製剤の水分含量の違いは、製剤No. Differences in moisture content of the composition or formulation between 0 to 28 days, the formulation No. 7を除いて、1%未満であった。 7 except, was less than 1%.

40℃で貯蔵した液体組成物もしくは製剤について、比活性は急速に減少し、平均して7日後に初期値の半分を少し上回るまで(54%)そして21日後に約18%まで下がった。 The pooled liquid compositions or formulations at 40 ° C., the specific activity decreased rapidly, 7 days after the average to just over half of the initial value (54%) and drops to about 18% after 21 days. 対照的に、40℃で14もしくは28日間貯蔵した凍結乾燥組成物もしくは製剤の比活性は0日で決定された活性のものに近く、平均して14日で測定した場合に82%そして28日で90%のままであった。 In contrast, close to that of the determined activity in lyophilized compositions or the specific activity of the preparation at day 0 and stored 14 or 28 days at 40 ° C., 82% when measured at an average of 14 days and 28 days in it remained at 90%. 最も有望な組成物もしくは製剤(No.9)は、40℃で28日後に初期比活性の98.7%を有した。 The most promising compositions or formulations (No.9) had 98.7% of the initial specific activity after 28 days at 40 ° C.. 10mM CaCl を含有する液体組成物もしくは製剤の比活性は、2mMのみのCaCl を含有する液体組成物もしくは製剤のものより高かったが、これは凍結乾燥組成物もしくは製剤については当てはまらなかった。 The specific activity of the liquid compositions or formulations containing 10 mM CaCl 2, the liquid composition containing CaCl 2 in 2mM only or was higher than that of the formulation, which was not the case for lyophilized compositions or formulations.

FVIIもしくはFVIIaポリペプチドバリアント(0.62mgのバリアント/ml溶媒の濃度で366mgのポリペプチドバリアント)を含んでなる基本組成物もしくは製剤を20mMのヒスチジン、pH6.5、230mMのトレハロース、10mMのCaCl 、10mMのメチオニンおよび0.005%のTween−20 (R)において製造した。 FVII or FVIIa polypeptide variant (0.62 mg variant / ml at a concentration of solvent 366mg of polypeptide variant) comprising the basic composition or the formulation of 20mM histidine, trehalose PH6.5,230MM, 10 mM of CaCl 2 , prepared in 10mM methionine and 0.005% Tween-20 (R). 実施例2の組成物もしくは製剤No. Compositions or formulations of Example 2 No. 8に対応する組成物もしくは製剤は、185.5mlの基本FVII/FVIIaバリアント組成物もしくは製剤に2.783mlの1%重量/容積(w/v)のストック溶液のTween−20 (R)を加えそして0.2マイクロメーター(μm)膜を通して濾過することにより製造し、35個の20ml凍結乾燥バイアル(Mueller & Mueller)用に十分であった。 The composition or formulation corresponding to 8, adding a basic 185.5ml FVII / FVIIa variant composition or formulation to 1% by weight / volume of 2.783ml (w / v) stock solution of Tween-20 (R) and then by filtered through a 0.2 micrometer ([mu] m) film, was sufficient for 35 pieces of 20ml lyophilized vials (Mueller & Mueller). 残りの基本組成物もしくは製剤、249.5mlは、1248μlの1%(w/v)Tween−20 (R)ストック溶を加えることにより実施例2の組成物もしくは製剤No. The remaining basic composition or formulation, 249.5Ml is, 1% (w / v) compositions of Tween-20 (R) Example 2 by adding the stock solvent or formulation of 1248Myueru No. 10に対応するように調合した。 It was formulated so as to correspond to the 10. これは、49個の同様の20ml凍結乾燥バイアル用に十分であった。 This was sufficient for 49 pieces of similar 20ml lyophilized vials. 凍結乾燥を以下のパラメーターに従って行った: The freeze-drying was carried out according to the following parameters:

二次乾燥後に、全てのバイアルを600mTorrで窒素でバックフィルし、そして栓をした(20mm Daikyoストッパー)。 After the secondary drying, all of the vial was backfilled with nitrogen at 600mTorr, and a plug (20mm Daikyo stopper). これらの組成物もしくは製剤を40℃もしくは−80℃(−80℃=対照組成物もしくは対象製剤)のいずれかで貯蔵し、そして次に5.0mlの水で再構成し、そして実施例1および2における上記の通り14および28日後に分析した。 Stored at any of these compositions or formulations 40 ° C. or -80 ℃ (-80 ℃ = control composition or the subject formulations), and then reconstituted in water 5.0 ml, and Examples 1 and It was analyzed after as 14 and 28 days of the in 2. さらに、40℃で液体形態で貯蔵した同一の組成物もしくは製剤を0、7および21日で比較目的のために分析した。 Further analyzed for comparison purposes the same compositions or formulations which were stored in liquid form at 40 ° C. at 0, 7 and 21 days. 40℃で28日間貯蔵した本発明の凍結乾燥組成物もしくは製剤は: Lyophilized compositions or formulations of the present invention was stored for 28 days at 40 ° C.:
・ケーキ外観 ・水分含量:0日でそして28日後に2%未満 ・再構成時間:13〜20秒(sec) Cake appearance, water content: 0 days in and 28 days less than 2%, reconstitution time after: 13-20 seconds (sec)
・pH安定性 ・酸化 ・生物活性:両方の凍結乾燥組成物もしくは製剤は、40℃で14もしくは28日後にそれらの完全な初期比活性を維持した。 · PH stability, oxidative and biological activity: both lyophilized compositions or formulations of maintained their full initial specific activity after 14 or 28 days at 40 ° C..
・凝集体レベル:40℃で28日間貯蔵した両方の組成物もしくは製剤の凝集体レベルは、初期レベルとそして−80℃で40日間貯蔵した同じ組成物もしくは製剤のレベルと非常に類似し、優れた安定性を示した。 · Aggregate level: aggregate level of the composition or formulation of both storage for 28 days at 40 ° C. is very similar to the initial level and then the same compositions or formulations stored at -80 ° C. 40 days levels, excellent It was showed stability.
を包含する全ての試験したパラメーターにおいてよく機能することが見出された。 To function well in all tested parameters include been found.

比活性、凝集体形成、酸化および重鎖分解についての40℃で貯蔵した本発明の凍結乾燥組成物もしくは製剤の分析の結果は、40℃で貯蔵した液体組成物もしくは製剤ならびに−80℃で貯蔵した同じ凍結乾燥組成物もしくは製剤について得られる結果と比較して0.01%Tween (R) −20を含有する本発明の上記の組成物もしくは製剤について図1〜4に示される。 Specific activity, aggregate formation, oxidation and lyophilized compositions or results of analysis of the formulations of the present invention stored at 40 ° C. for the heavy chain degradation, stored in liquid composition was stored at 40 ° C. or formulation and -80 ° C. the above compositions or formulations of the present invention containing 0.01% Tween (R) -20 are shown in Figures 1-4 as compared to the results obtained for the same freeze-dried composition or formulations. これらの図は、本発明の凍結乾燥組成物もしくは製剤が40℃で28日の貯蔵後に十分に安定であり、−80℃で貯蔵した対照組成物もしくは製剤と同程度に優れた比活性、凝集体形成、酸化および重鎖分解のレベルを示すことを表す。 These figures, after storage of the freeze-dried composition or formulation 28 days at 40 ° C. of the present invention are sufficiently stable, they pooled control composition or formulation comparable to good specific activity -80 ° C., coagulation Atsumaritai formation indicates that indicate the level of oxidation and heavy chain degradation. 対照的に、液体組成物もしくは製剤は、40℃で21日後に活性のかなりの喪失ならびに凝集体形成、酸化および重鎖分解の増加を示す。 In contrast, the liquid composition or formulation is a substantial loss as well as aggregate formation activity after 21 days at 40 ° C., indicating an increase in oxidation and heavy chain degradation.

他の実施例において使用する同じFVIIもしくはFVIIaポリペプチドバリアントおよび実施例3のものに対応する組成物もしくは製剤および実施例2の組成物もしくは製剤No. Other compositions corresponding to those of the same FVII or FVIIa polypeptide variant and Example 3 used in the examples or formulation and the composition of Example 2 or Formulation No. 8(20mMのヒスチジン、10mMのCaCl 、230mMのトレハロース、10mMのメチオニン、0.01%のTween (R) 20、pH6.5)を用いて4つの異なる温度で長期安定性研究を行った。 8 (20 mM histidine, 10 mM of CaCl 2, 230 mM trehalose, 10 mM methionine, 0.01% Tween (R) 20, pH6.5) was long-term stability studies at four different temperatures using. 安定性研究は、−80℃、5℃、25℃および40℃の公称温度で貯蔵した凍結乾燥薬剤生成物に行った。 Stability studies, -80 ℃, 5 ℃, went to lyophilized drug product was stored at a nominal temperature of 25 ° C. and 40 ° C.. 全ての充填バイアルを直立位置で貯蔵し、そして研究中遮光した。 All filling vials were stored in an upright position, and protected from light during the study. サンプルを以下の時間点で再構成しそして分析した:15日、37日、88日、191日、268日および365日。 Samples were reconstituted with the following time points and analyzed: 15 days, 37 days, 88 days, 191 days, 268 days and 365 days. 25℃および40℃で貯蔵したサンプルは、再構成および分析の約2週前に輸送用に(for transport)5℃に冷却した。 Samples stored at 25 ° C. and 40 ° C. were cooled to (for transport) 5 ℃ for shipment in about 2 weeks prior to reconstruction and analysis. これらのサンプルについて、サンプルを5℃に冷却した時点を用いる(37、88および191日の代わりにそれぞれ28日、66日および175日)。 These samples, using the time when the sample was cooled to 5 ℃ (37,88 and 191 days, respectively 28 days instead of 66 days and 175 days). 5℃および−80℃で貯蔵したサンプルのみ最初の半年後に分析した。 Only samples stored at 5 ° C. and -80 ° C. were analyzed after the first six months.

上記のように決定された、相対効能(PACTアッセイ)、凝集タンパク質の量(ダイマーおよびポリマーパーセント)、重鎖分解(−80℃サンプルに対する)、オスモル濃度、および酸化(−80℃サンプルに対する)のデータは、それぞれ、図5、6、7、8および9に示される。 Was determined as described above, the relative potency (PACT assays), the amount of aggregated protein (dimer and polymer percent), (against -80 ° C. Samples) heavy chain degradation, osmolality, and oxidation of (for -80 ° C. Samples) data are respectively shown in FIGS. 5, 6, 7, 8 and 9. これらの図の各々において、点線は各図の平均値の上および下の2つの標準偏差を示し、一方、点線の間の横線は測定の全ての平均を表す。 In each of these figures, the dotted line represents two standard deviations above and below the mean value of each figure, while the horizontal line between the dotted lines represent all of the average measurements. 相対効能(図5)の決定について、各データ点は3つのサンプルの平均を表す。 For determination of the relative potency (FIG. 5), each data point represents the average of three samples. 図6〜9について、各データ点は単一のサンプルをアッセイした結果である。 For 6-9, each data point is the result of assaying a single sample.

全体で、図5〜9に提供されるデータは、FVIIaバリアントが、本発明の組成物において貯蔵される場合に、研究の全期間にわたって、すなわち1年までの間試験した温度で安定であることを示す。 In total, that the data is provided in Figure 5 to 9, FVIIa variant, when stored in the compositions of the present invention, for the entire duration of the study, that is, stable at temperatures tested for up to one year It is shown. これは、図5に示されるようなバリアントの活性にならびに図6、7、8および9に示されるような化学的および物理的安定性に当てはまる。 This applies to the chemical and physical stability, as shown in activity and Figures 6, 7, 8 and 9 of the variant shown in FIG. 興味深いことに、25℃および40℃の比較的高い温度でさえ、FVIIaバリアントはこの組成物において非常に安定であるように思われ、これは、本発明の組成物が周囲温度でのFVIIaの長期貯蔵に適していることを示唆する。 Interestingly, even at relatively high temperatures of 25 ° C. and 40 ° C., FVIIa variant appeared to be very stable in this composition, this is long-term composition of FVIIa at ambient temperature of the present invention suggests that suitable for storage. 1年までの間貯蔵したサンプルについて、5℃で貯蔵した組成物と−80℃で貯蔵したものとの間で有意な差は認められなかった。 For samples stored for up to 1 year, significant differences between those stored in the compositions and -80 ° C. was stored at 5 ° C. was observed. 従って、本実施例の結果は、本発明の組成物が広範囲の温度条件下でFVIIaに長期貯蔵安定性を与えることを示す。 Thus, the results of this example, the FVIIa at temperatures composition extensive of the present invention is shown to give long-term storage stability.

前述の発明は明確さおよび理解の目的のために多少詳細に記述されているが、本発明の真の範囲からそれることなしに形態および詳細の様々な変更を行うことができることは、本開示の読み取りから当業者に明らかである。 Although above the invention has been some detail described for purposes of clarity and understanding, you can make various changes in form and detail without departing from the true scope of the present invention, the present disclosure from reading the apparent to those skilled in the art. 本明細書に記述される実施例および態様は説明目的のためだけであることそしてそれを踏まえた様々な改変もしくは変更が当業者に示唆されそして本願の精神および範囲ならびに添付の請求項の範囲内に包含されることが理解される。 Examples and embodiments described herein are within the scope of it and that various modifications or changes in light thereof will be suggested to one skilled in the art and the present spirit and scope, as well as the appended claims is for illustrative purposes only it is encompassed in. 本願に引用される全ての公開、特許、特許出願および/もしくは他の文書は、各個々の公開、特許、特許出願および/もしくは文書が全ての目的のためにその全部が引用することにより本明細書に組み込まれることが個々に示される場合と同じ程度に全ての目的のためにそれらの全部が引用することにより本明細書に組み込まれる。 All publications cited in this application, patent, patent application, and / or other documents, each individual publication, patent, hereby by patent application and / or documents its entirety for all purposes reference be incorporated in the book are all in their entirety for purposes to the same extent as if set forth individually herein incorporated by reference.

Claims (38)

  1. 再構成組成物におけるヒスチジンの濃度が少なくとも約5mMである、第VII因子もしくは第VIIa因子ポリペプチドおよび緩衝剤としてヒスチジンを含んでなる、水での再構成に適した凍結乾燥した製薬学的組成物。 The concentration of histidine in the reconstituted composition is at least about 5 mM, comprising histidine as a Factor VII or Factor VIIa polypeptide and buffering agents, pharmaceutical lyophilized composition suitable for reconstitution with water .
  2. 再構成組成物におけるヒスチジンの濃度が少なくとも約10mMである請求項1の組成物。 The composition of claim 1 the concentration of histidine in the reconstituted composition is at least about 10 mM.
  3. 再構成組成物におけるヒスチジンの濃度が約12mM〜約50mM、例えば約12mM〜約40mM、例えば約15mM〜約25mMである請求項1の組成物。 The concentration of histidine from about 12mM~ about 50mM in the reconstituted composition, for example from about 12mM~ about 40 mM, the composition of claim 1 such as from about 15mM~ about 25 mM.
  4. 張性調整剤をさらに含んでなる前記請求項のいずれかの組成物。 The composition of any of the preceding claims further comprising a tonicity adjusting agent.
  5. 張性調整剤がグリセロール、エリトリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトールもしくはマンニトールのような多価糖アルコール;ショ糖もしくはトレハロースのような糖;グリシンのようなアミノ酸;およびナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩もしくはマグネシウム塩のような中性塩よりなる群から選択される請求項4の組成物。 Tonicity adjusting agent glycerol, erythritol, arabitol, xylitol, a polyhydric sugar alcohols such as sorbitol or mannitol; and sodium salt, potassium salt, calcium salt or magnesium; amino acids such as glycine; sugars such as sucrose or trehalose the composition of claim 4 which is selected from the group consisting of neutral salts, such as salts.
  6. 張性調整剤がトレハロースである請求項5の組成物。 The composition of claim 5 tonicity adjusting agent is trehalose.
  7. 再構成組成物における張性調整剤の濃度が約50mM〜約1000mM、例えば約100mM〜約500mM、例えば約150mM〜約300mMである請求項4〜6のいずれかの組成物。 Tonicity adjusting agent concentration is about 50mM~ about 1000mM in the reconstituted composition, for example from about 100mM~ about 500 mM, The composition of any of claims 4-6 for example, about 150mM~ about 300 mM.
  8. カルシウムもしくはマグネシウム塩をさらに含んでなる前記請求項のいずれかの組成物。 The composition of any of the preceding claims further comprising a calcium or magnesium salt.
  9. 塩化カルシウムを含んでなる請求項8の組成物。 The composition of claim 8 comprising calcium chloride.
  10. 再構成組成物におけるカルシウムもしくはマグネシウム塩の濃度が約1mM〜約40mM、例えば約2mM〜約30mM、例えば約5mM〜約20mMである請求項8もしくは9の組成物。 Concentration of about 1mM~ about 40mM calcium or magnesium salt in the reconstituted composition, for example from about 2mM~ about 30 mM, the composition of claim 8 or 9, for example from about 5mM~ about 20 mM.
  11. 酸化防止剤をさらに含んでなる前記請求項のいずれかの組成物。 The composition of any of the preceding claims, further comprising an antioxidant.
  12. 酸化防止剤がアスコルビン酸、メチオニン、ベンジルアルコールおよびビタミンEよりなる群から選択される請求項11の組成物。 The composition of claim 11, antioxidant ascorbic acid, methionine, is selected from the group consisting of benzyl alcohol and vitamin E.
  13. 酸化防止剤がメチオニンである請求項12の組成物。 The composition of claim 12 antioxidant is methionine.
  14. 再構成組成物における酸化防止剤の濃度が約1mM〜約40mM、例えば約2mM〜約30mM、例えば約5mM〜約20mMである請求項11〜13のいずれかの請求項の組成物。 Concentration of about 1mM~ about 40mM antioxidants in the reconstituted composition, for example from about 2mM~ about 30 mM, such as any of the compositions of claims 11 to 13 is about 5mM~ about 20 mM.
  15. 界面活性剤をさらに含んでなる前記請求項のいずれかの組成物。 The composition of any of the preceding claims, further comprising a surfactant.
  16. 界面活性剤が非イオン性界面活性剤である請求項15の組成物。 The composition of claim 15 surfactant is a nonionic surfactant.
  17. 非イオン性界面活性剤がポリソルベート、ポリオキサマーおよびプルロニック(R)ポリオールよりなる群から選択される請求項16の組成物。 The composition of claim 16 wherein the nonionic surfactant is polysorbate is selected from poloxamers and Pluronic (R) consisting of a polyol group.
  18. 非イオン性界面活性剤がTween (R) −20、Tween (R) −80もしくは別のポリソルベートである請求項17の組成物。 Nonionic surfactant Tween (R) -20, Tween ( R) -80 or another composition of claim 17 which is a polysorbate.
  19. 再構成組成物における非イオン性界面活性剤の濃度が約0.001%(w/v)〜約0.5%、例えば約0.001%〜約0.05%である請求項16〜18のいずれかの組成物。 Claim concentration of the nonionic surfactant in the reconstituted composition is about 0.001% (w / v) to about 0.5%, for example about 0.001% to about 0.05% 16-18 the composition of any of.
  20. 再構成組成物のpHが約5.0〜約7.0である前記請求項のいずれかの組成物。 The composition of any of claims pH of the reconstituted composition is about 5.0 to about 7.0.
  21. 再構成組成物のpHが約5.5、約6.0もしくは約6.5である請求項20の組成物。 The composition of claim 20 pH of the reconstituted composition is about 5.5, about 6.0 or about 6.5.
  22. 再構成組成物のpHが約6.0〜約7.0、例えば約6.2〜約6.8、例えば約6.4〜6.6である請求項20の組成物。 pH of about 6.0 to about 7.0 of the reconstituted composition, The composition of claim 20 for example from about 6.2 to about 6.8, such as about 6.4-6.6.
  23. 再構成組成物におけるFVIIもしくはFVIIaポリペプチドの濃度が約0.1〜5mg/ml、例えば約0.2〜2mg/ml、典型的には約0.4〜1.5mg/ml、例えば約0.5〜1.0mg/mlである前記請求項のいずれかの組成物。 FVII or FVIIa concentration of polypeptide from about 0.1 to 5 mg / ml in the reconstituted composition, such as from about 0.2-2 mg / ml, typically about 0.4~1.5mg / ml, for example from about 0 the composition of any of the preceding claims is .5~1.0mg / ml.
  24. ポリペプチドが組換えヒトFVIIaもしくはそのバリアントである前記請求項のいずれかの組成物。 The composition of any of claims polypeptide is recombinant human FVIIa or variants thereof.
  25. 再構成した形態の組成物が約6.0〜約7.0のpHを有し、そして約10mM〜約30mMのヒスチジン、約150mM〜約300mMのトレハロース、約2mM〜約20mMの塩化カルシウム、約0.001%〜約0.05%(w/v)のTween (R) −20および約5mM〜約30mMのメチオニンを含んでなる請求項1の組成物。 Has a pH composition of about 6.0 to about 7.0 of the reconstituted form, and about 10mM~ about 30mM histidine, about 150mM~ about 300mM trehalose, about 2mM~ about 20mM calcium chloride, about 0.001% to about 0.05% (w / v) of Tween (R) -20 and about 5mM~ comprising about 30mM methionine composition of claim 1.
  26. 組成物がグリシルグリシンを含有しない前記請求項のいずれかの組成物。 The composition of any of claims the composition does not contain glycylglycine.
  27. 水分含量が3%(w/w)以下である前記請求項のいずれかの組成物。 Moisture content 3% (w / w) or less is the composition of any of claims.
  28. −80℃で同じ期間にわたって貯蔵した同一の凍結乾燥対照組成物と比較して2〜8℃で6ヶ月間貯蔵後に分析した場合に以下の特性: The following properties when analyzed after to 6 months of storage at 2 to 8 ° C. compared to the same freeze-dried control composition was stored over the same period at -80 ° C.:
    a)対照組成物の生物活性の少なくとも80%である本明細書に記載の「第X因子活性化アッセイ」を用いて決定される生物活性、 a) a control composition of the biological activity of described herein is at least 80% "Factor X activation assay" biological activity determined using,
    b)対照組成物の凝集度より3%以下高いSEC−HPLCを用いて決定した場合の凝集度、 b) degree of aggregation as determined using a 3% higher SEC-HPLC than cohesion of the control composition,
    c)対照組成物の酸化度より5%以下大きいRP−HPLCを用いて決定される酸化度、および d)対照組成物の重鎖分解度より5%以下大きいRP−HPLCを用いて決定される重鎖分解度の1つもしくはそれ以上を示す前期請求項のいずれかの組成物。 It is determined using the degree of oxidation to be determined using a 5% larger RP-HPLC than oxidation degree of c) a control composition, and d) the RP-HPLC than 5% larger heavy chain degradation of the control composition the composition of any of the previous term claim showing one or more of heavy chain degradation degree.
  29. −80℃で同じ期間にわたって貯蔵した同一の凍結乾燥対照組成物と比較して2〜8℃で1年間貯蔵後に分析した場合に該特性の1つもしくはそれ以上を示す請求項28の組成物。 The composition of claim 28 which exhibits one or more of the characteristic when analyzed after to storage for one year at 2 to 8 ° C. compared to the same freeze-dried control composition was stored over the same period at -80 ° C..
  30. −80℃で同じ期間にわたって貯蔵した同一の凍結乾燥対照組成物と比較して2〜8℃ Compared to the same freeze-dried control composition was stored over the same period at -80 ° C. 2 to 8 ° C.
    で1年間貯蔵後に分析した場合に該特性の全てを示す請求項28の組成物。 In composition of claim 28 which shows all the characteristic when analyzed after storage for one year.
  31. −80℃で同じ期間にわたって貯蔵した同一の凍結乾燥対照組成物と比較して20℃で6ヶ月間貯蔵後に分析した場合に該特性の1つもしくはそれ以上を示す請求項28の組成物。 The composition of claim 28 which exhibits one or more of the characteristic when analyzed after to 6 months of storage at 20 ° C. compared to the same freeze-dried control composition was stored over the same period at -80 ° C..
  32. −80℃で同じ期間にわたって貯蔵した同一の凍結乾燥対照組成物と比較して20℃で6ヶ月間貯蔵後に分析した場合に該特性の全てを示す請求項28の組成物。 The composition of claim 28 which shows all the characteristic when analyzed after to 6 months of storage at 20 ° C. compared to the same freeze-dried control composition was stored over the same period at -80 ° C..
  33. ヒスチジン緩衝剤および水と第VII因子もしくは第VIIa因子ポリペプチドの混合物を準備して少なくとも5mMのヒスチジン濃度を有する水性組成物をもたらすこと、および得られる水性組成物を凍結乾燥に供して凍結乾燥組成物をもたらすことを含んでなる、第VII因子もしくは第VIIa因子ポリペプチドを含んでなる貯蔵安定性組成物の製造方法。 Bringing histidine buffer and a mixture of water and Factor VII or Factor VIIa polypeptide by preparing an aqueous composition having a histidine concentration of at least 5 mM, and the resulting aqueous composition was subjected to lyophilization lyophilization composition by comprising to bring things, manufacturing method of storage-stable compositions comprising factor VII or factor VIIa polypeptide.
  34. 水性組成物が凍結乾燥の前に張性調整剤、カルシウムもしくはマグネシウム塩、非イオン性界面活性剤、酸化防止剤および防腐剤から選択されるの1つもしくはそれ以上の成分をさらに含んでなる請求項33の方法。 Tonicity adjusting agent before aqueous composition of a freeze-dried, calcium or magnesium salts, non-ionic surfactant, further comprise one or more components being selected from antioxidants and preservatives claims the method of claim 33.
  35. 組成物が水で再構成されている、請求項1〜32のいずれかに記載の組成物の治療的に有効な量を処置もしくは予防を必要とする患者に投与することを含んでなる、第VIIa因子の投与により処置できる症状の処置もしくは予防方法。 Composition is reconstituted with water, comprising administering a therapeutically effective amount of a composition according to any one of claims 1 to 32 to a patient in need of such treatment or prevention, the treatment or prevention of conditions which can be treated by administration of factor VIIa.
  36. 第VIIa因子の投与により処置できる症状を処置するかもしくは予防するための薬剤の製造のための請求項1〜32のいずれかに記載の組成物の使用。 Use of a composition according to any one of claims 1 to 32 for the manufacture of a medicament for treating or preventing a condition treatable by administration of Factor VIIa.
  37. 哺乳類における血餅形成を増加するために有効な量の請求項1の組成物を哺乳類に投与することを含んでなる、増加した血餅形成が望ましい疾患もしくは症状を有する哺乳類における血餅形成の増加方法。 Increase in clot formation in a mammal with effective the composition of claim 1 in an amount comprising administering to a mammal, increased clot formation is desirable disease or condition to increase clot formation in a mammal Method.
  38. FVIIもしくはFVIIaポリペプチドまたはFVIIもしくはFVIIaポリペプチドバリアントが凝固活性を有する請求項1の組成物。 FVII or FVIIa polypeptide or FVII or FVIIa polypeptide variant composition of claim 1 having clotting activity.
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