JP2010248096A - Trp-CONTAINING PEPTIDE - Google Patents
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Abstract
Description
この発明は、大豆蛋白質から調製された特定の機能を有するトリプトファン（Ｔｒｐ）含有ペプチドに関するものであって、新規なペプチドおよび蛋白質分解酵素（プロテアーゼ）によるペプチド調製技術に属するものである。
The present invention relates to a tryptophan (Trp) -containing peptide having a specific function prepared from soybean protein, and belongs to a peptide preparation technique using a novel peptide and a proteolytic enzyme (protease).
大豆は、植物性蛋白質の供給源として広く知られ、かつ広汎に利用されている。
この大豆蛋白質をより有効に利用するために、蛋白質を分離し、さらには、酵素により分解して、有用なアミノ酸やペプチドを得ることが幅広く行われてきている。
Soybean is widely known and widely used as a source of vegetable protein.
In order to use this soybean protein more effectively, it has been widely practiced to obtain a useful amino acid or peptide by separating the protein and further decomposing it with an enzyme.
例えば、特開２００５−１３９１５８号公報（特許文献１）においては、大豆醗酵物を蛋白質分解酵素で処理し、アンジオテンシン変換酵素阻害作用を有する、生体内での血圧降下作用を有し、毒性が極めて低い、新規なヘキサペプチドが得られたことが報告されている。 For example, in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2005-139158 (Patent Document 1), a soybean fermented product is treated with a proteolytic enzyme, has an angiotensin converting enzyme inhibitory action, has a blood pressure lowering action in vivo, and is extremely toxic. It has been reported that low and novel hexapeptides were obtained.
また、特開２００６−２２３１３８号公報（特許文献２）においては、全脂大豆の水溶液を、蛋白質分解酵素を用いて加水分解した後、セルロース系ろ過助剤を添加して不水溶性物質を分離除去することによって、苦みや大豆臭がなく、低分子のペプチドが多い組成物で、消化吸収能力の衰えた老人や、病人の栄養補給用飲料や、激しい運動後に適用される、スポーツドリンクに効果的に使用される組成物が得られることが報告されている。 In JP-A-2006-223138 (Patent Document 2), an aqueous solution of whole fat soybean is hydrolyzed using a proteolytic enzyme, and then a cellulose-based filter aid is added to separate a water-insoluble substance. By removing the composition, there is no bitterness or soy odor, and there are many low-molecular-weight peptides, and it is effective for nutritional drinks for elderly people with reduced digestion and absorption capacity, sick drinks, and sports drinks that are applied after intense exercise. It has been reported that a composition to be used can be obtained.
さらに、特開２００６−２６５１３９号公報（特許文献３）においては、大豆中の微量蛋白質である大豆ホエー蛋白質を基質にして、蛋白質分解酵素を用いて分解することによって得られた特定のトリペプチドが、アンジオテンシン変換酵素阻害作用を有し、血圧降下剤としての医薬や、血圧を降下させ、高血圧の予防や改善に適した特定保健用食品に用いられる、との報告がなされている。 Furthermore, in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2006-265139 (Patent Document 3), a specific tripeptide obtained by degrading using a protease, using soybean whey protein, which is a trace amount protein in soybean, as a substrate, It has been reported that it has an angiotensin converting enzyme inhibitory action, and is used as a medicine as a blood pressure lowering agent and a food for specified health use that lowers blood pressure and is suitable for prevention and improvement of hypertension.
このような大豆蛋白質の開発状況下において、本願の発明者等も、先に、大豆蛋白質の構造に示唆されて試験を行い、大豆蛋白質からグルタミンとグルタミン酸の豊富な水溶性の高分子量ポリペプチドを得ることに成功し、それらの取得方法について、国際公開番号ＷＯ２００５／００１１０６号公報（特許文献４）で報告した。
Under such development conditions of soy protein, the inventors of the present application previously conducted a test suggested by the structure of soy protein, and obtained a water-soluble high molecular weight polypeptide rich in glutamine and glutamic acid from soy protein. It succeeded in obtaining and reported the acquisition method in international publication number WO2005 / 001106 (patent document 4).
前記特許文献４において開示された、グルタミンとグルタミン酸の豊富な水溶性の高分子量ポリペプチドの取得方法は、大豆蛋白原料をプロテアーゼで処理し、疎水性アミノ酸の豊富な未分解の高分子画分を沈殿として除去し、残りの溶液（分解液）にエタノールを添加して、沈殿画分を得たのち、前記沈殿画分を乾燥するというものである。 The method for obtaining a water-soluble high-molecular-weight polypeptide rich in glutamine and glutamic acid disclosed in Patent Document 4 is obtained by treating a soy protein raw material with a protease to obtain an undegraded high-molecular fraction rich in hydrophobic amino acids. The precipitate is removed as a precipitate, ethanol is added to the remaining solution (decomposition solution) to obtain a precipitate fraction, and then the precipitate fraction is dried.
発明者等は、前記エタノール不溶解分が、グルタミンとグルタミン酸の豊富な水溶性の高分子量ポリペプチドから形成されていることを見出し、前記報告をなした。
その際、検討の対象から外された、エタノール溶解分に、低分子のペプチドなどで有益な成分が存在するのでないかと推定し、エタノール溶解分の成分を明らかにし、さらにはその有益性を明らかにすることを目的として研究を行った。
The inventors have found that the ethanol-insoluble matter is formed from a water-soluble high-molecular-weight polypeptide rich in glutamine and glutamic acid, and made the report.
At that time, it was estimated that there were beneficial components such as low-molecular-weight peptides in the ethanol-soluble components that were excluded from the study, and the components of ethanol-soluble components were clarified, and the benefits were also clarified. I did research with the aim of making it.
その結果、本願の発明者等は、前記エタノール溶解分が特定の生理活性を有すること、さらには、前記生理活性は、疎水性アミノ酸の豊富な、未分解の高分子画分を除去した大豆蛋白質のプロテアーゼ処理液、特にその分画物により奏されることを見出し、その分画物について検討を行い、この発明を完成させたものである。
As a result, the inventors of the present application have found that the ethanol-soluble fraction has a specific physiological activity, and further, the physiological activity is a soybean protein from which an undegraded polymer fraction rich in hydrophobic amino acids has been removed. The present invention has been completed by finding out that the protease treatment solution of the present invention, in particular, a fraction thereof, exhibits the fraction, and examines the fraction.
すなわち、この発明の請求項１に記載のＴｒｐ含有ペプチドは、
下記アミノ酸配列の、いずれかのアミノ酸配列を有すること
を特徴とするものである。
記
１） Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ
２） Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ
３） Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ
４） Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ
５） Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ
６） Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ
７） Ａｌａ−Ｔｒｐ
８） Ｖａｌ−Ｔｒｐ
９） Ｉｌｅ−Ｔｒｐ
10） Ｌｅｕ−Ｔｒｐ
11） Ｓｅｒ−Ｔｒｐ
12） Ｇｌｙ−Ｔｒｐ
13） Ｇｌｕ−Ｔｒｐ
14） Ｔｒｐ−Ｍｅｔ
15） Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ
16） Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ
That is, the Trp-containing peptide according to claim 1 of the present invention is
It has any one of the following amino acid sequences.
1) Thr-Trp-Asn-Pro-Asn
2) Trp-Gly-Pro
3) Trp-Gln-Glu
4) Trp-Asn-Pro-Asn
5) Trp-Asn-Leu
6) Asn-Trp-Leu
7) Ala-Trp
8) Val-Trp
9) Ile-Trp
10) Leu-Trp
11) Ser-Trp
12) Gly-Trp
13) Glu-Trp
14) Trp-Met
15) Ser-Trp-Leu
16) Trp-Thr-Tyr
また、この発明の請求項２に記載の発明は、
アンギオテンシンＩ変換酵素（ＡＣＥ）阻害活性を有し、
下記アミノ酸配列の、いずれかのアミノ酸配列を有すること
を特徴とするＴｒｐ含有ペプチドである。
記
１） Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ
２） Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ
３） Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ
４） Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ
５） Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ
６） Ａｌａ−Ｔｒｐ
７） Ｖａｌ−Ｔｒｐ
８） Ｉｌｅ−Ｔｒｐ
９） Ｌｅｕ−Ｔｒｐ
10） Ｓｅｒ−Ｔｒｐ
11） Ｇｌｙ−Ｔｒｐ
12） Ｇｌｕ−Ｔｒｐ
13） Ｔｒｐ−Ｍｅｔ
14） Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ
The invention according to claim 2 of the present invention is
Angiotensin I converting enzyme (ACE) inhibitory activity,
It is a Trp-containing peptide characterized by having any one of the following amino acid sequences.
1) Thr-Trp-Asn-Pro-Asn
2) Trp-Gly-Pro
3) Trp-Gln-Glu
4) Trp-Asn-Pro-Asn
5) Asn-Trp-Leu
6) Ala-Trp
7) Val-Trp
8) Ile-Trp
9) Leu-Trp
10) Ser-Trp
11) Gly-Trp
12) Glu-Trp
13) Trp-Met
14) Trp-Thr-Tyr
また、この発明の請求項３に記載発明は、
ヒト赤血球変形能低下抑制作用を有し、
下記アミノ酸配列の、いずれかのアミノ酸配列を有すること
を特徴とするＴｒｐ含有ペプチドである。
記
１） Ａｌａ−Ｔｒｐ
２） Ｖａｌ−Ｔｒｐ
３） Ｉｌｅ−Ｔｒｐ
４） Ｌｅｕ−Ｔｒｐ
５） Ｓｅｒ−Ｔｒｐ
６） Ｇｌｙ−Ｔｒｐ
The invention according to claim 3 of the present invention is
Has the effect of suppressing the degradation of human erythrocyte deformability,
It is a Trp-containing peptide characterized by having any one of the following amino acid sequences.
1) Ala-Trp
2) Val-Trp
3) Ile-Trp
4) Leu-Trp
5) Ser-Trp
6) Gly-Trp
また、この発明の請求項４に記載発明は、
請求項１〜３のいずれか１項に記載のＴｒｐ含有ペプチドにおいて、
前記Ｔｒｐ含有ペプチドは、
大豆蛋白原料をプロテアーゼで処理し、不溶の疎水性アミノ酸の豊富な未分解の高分子画分を除去した水溶液から調製されたこと
を特徴とするものである。
The invention according to claim 4 of the present invention is
The Trp-containing peptide according to any one of claims 1 to 3,
The Trp-containing peptide is
The soy protein raw material is prepared from an aqueous solution obtained by treating a soy protein raw material with a protease and removing an undegraded polymer fraction rich in insoluble hydrophobic amino acids.
また、この発明の請求項５に記載の発明は、
請求項４に記載のＴｒｐ含有ペプチドにおいて、
前記プロテアーゼ処理は、
アルカリ域を保持しながら、基質特性の低いプロテアーゼで行う加水分解処理である
こと
を特徴とするものである。
The invention according to claim 5 of the present invention is
The Trp-containing peptide according to claim 4,
The protease treatment
It is characterized in that it is a hydrolysis treatment carried out with a protease having low substrate characteristics while maintaining an alkaline region.
また、この発明の請求項６に記載の発明は、
請求項４又は５に記載のＴｒｐ含有ペプチドにおいて、
前記未分解の高分子画分の沈殿除去は、
酸性ｐＨ調節及び／又はエタノールの添加により行われること
を特徴とするものである。
The invention according to claim 6 of the present invention provides
In the Trp-containing peptide according to claim 4 or 5,
Precipitation removal of the undegraded polymer fraction is
It is characterized by being carried out by adjusting the acidic pH and / or adding ethanol.
また、この発明の請求項７に記載の発明は、
請求項４〜６のいずれか１項に記載のＴｒｐ含有ペプチドにおいて、
前記Ｔｒｐ含有ペプチドは、
前記調製において、１％酢酸水溶液に不溶な物質が除去されていること
を特徴とするものである。
The invention according to claim 7 of the present invention provides
In the Trp-containing peptide according to any one of claims 4 to 6,
The Trp-containing peptide is
In the preparation, a substance insoluble in a 1% aqueous acetic acid solution is removed.
また、この発明の請求項８に記載の発明は、
請求項４〜７のいずれか１項に記載のＴｒｐ含有ペプチドにおいて、
前記Ｔｒｐ含有ペプチドは、
前記調製において、ゲル濾過および高速液体クロマトグラフィーによる精製が行なわれていること
を特徴とするものである。
The invention according to claim 8 of the present invention provides
In the Trp-containing peptide according to any one of claims 4 to 7,
The Trp-containing peptide is
In the preparation, purification by gel filtration and high performance liquid chromatography is performed.
この発明にかかるＴｒｐ含有ペプチドは、酸化ストレスによる赤血球変形能の低下の防止、高血圧の予防や改善に適したものであって、血圧降下剤としての医薬や、血圧を降下させ、高血圧の予防や改善に適した特定保健用食品や健康食品の素材として有効なものである。
また、医薬の原料として、有効に利用されることができるものである。
The Trp-containing peptide according to the present invention is suitable for prevention of reduction in erythrocyte deformability due to oxidative stress, prevention and improvement of hypertension, and a drug as a blood pressure lowering agent, lowering blood pressure, It is effective as a food for specified health foods and health foods suitable for improvement.
Further, it can be effectively used as a raw material for pharmaceuticals.
また、この発明のＴｒｐ含有ペプチドは、粉末状態でも、水又はエタノール溶液としても使用することができる。
したがって、前記のような効果を発現させるために、健康食品や医薬として利用する際に、効率的に、また効果的に活用することを可能とするものである。
In addition, the Trp-containing peptide of the present invention can be used in a powder state or as a water or ethanol solution.
Therefore, in order to express the above effects, it can be used efficiently and effectively when used as a health food or a medicine.
以上のように、この発明のＴｒｐ含有ペプチドによれば、大豆をさらに有効に活用することができるという優れた効果を奏するのである。
As described above, according to the Trp-containing peptide of the present invention, there is an excellent effect that soybeans can be more effectively utilized.
この発明の特定構造のＴｒｐ含有ペプチドは、大豆蛋白原料をプロテアーゼで処理し、不溶の疎水性アミノ酸の豊富な、未分解の高分子画分を除去した水溶液から調製されるものである。
プロテアーゼ処理は、アルカリ域を保持しながら、基質特性の低いプロテアーゼで加水分解することが好ましい。
また、未分解高分子画分の除去は、水溶液のアルカリ状態を維持しながら行うことが好ましい。
The Trp-containing peptide having a specific structure according to the present invention is prepared from an aqueous solution obtained by treating a soy protein raw material with a protease and removing an undegraded polymer fraction rich in insoluble hydrophobic amino acids.
In the protease treatment, it is preferable to hydrolyze with a protease having low substrate characteristics while maintaining an alkaline region.
The removal of the undegraded polymer fraction is preferably performed while maintaining the alkaline state of the aqueous solution.
水溶液としては、特許文献４で報告したように、グルタミンとグルタミン酸の豊富な水溶性の高分子量ポリペプチドを取得するために、エタノールを添加して、それらを不溶解物として取得した後の水溶液とすることもできる。
それにより、グルタミンとグルタミン酸の豊富な高分子量ポリペプチドと、Ｔｒｐ含有ペプチドが分離取得できるため好ましい方法である。
As an aqueous solution, as reported in Patent Document 4, in order to obtain a water-soluble high molecular weight polypeptide rich in glutamine and glutamic acid, ethanol is added, and the aqueous solution after obtaining them as an insoluble matter You can also
This is a preferable method because a high molecular weight polypeptide rich in glutamine and glutamic acid and a Trp-containing peptide can be separated and obtained.
この発明に用いる大豆蛋白原料としては、分離大豆蛋白質や脱脂豆乳が好ましいが、脱脂大豆でも用いることができる。
しかしながら、脱脂大豆の場合は、蛋白質以外の成分を多量に含むため、プロテアーゼによる分解度が悪い。
また、プロテアーゼによる酵素処理は、大豆蛋白原料に水を加えて攪拌し、ｐＨをアルカリ領域に調節した後、プロテアーゼを加えることにより行う。
その際、蛋白質は、完全に溶解させる必要はなく（分解中に溶解する）、加える水の量は、蛋白原料の５〜２０倍、好ましくは９〜１０倍がよい。
As the soy protein raw material used in the present invention, isolated soy protein and defatted soy milk are preferable, but defatted soybean can also be used.
However, in the case of defatted soybean, since it contains a large amount of components other than protein, the degree of degradation by protease is poor.
The enzyme treatment with protease is performed by adding water to the soy protein raw material and stirring to adjust the pH to the alkaline region, and then adding protease.
At this time, the protein does not need to be completely dissolved (dissolved during decomposition), and the amount of water added is 5 to 20 times, preferably 9 to 10 times that of the protein raw material.
この発明に用いるプロテアーゼとしては、アルカリ側に最適ｐＨを持ち、高温で安定であって、ほとんどのペプチド結合を分解できる、基質特異性の低いプロテアーゼが好ましい。
具体的には、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｓｕｂｕｔｉｌｉｓ）由来の、アルカリプロテアーゼであるビオブラーゼなどを用いることができる。
The protease used in the present invention is preferably a protease having an optimum pH on the alkali side, stable at high temperatures, and capable of degrading most peptide bonds and having low substrate specificity.
Specifically, bioburase that is an alkaline protease derived from Bacillus Subtilis can be used.
大豆蛋白原料をプロテアーゼで処理する際には、プロテアーゼ処理を、アルカリ域を保持しながら、基質特異性の低いプロテアーゼで加水分解することが好ましい。
通常、大豆蛋白をアルカリ域で酵素分解すると、加水分解が進むにつれてｐＨが低下し微酸性域に移行してしまう。
しかしながら、この発明においては、アルカリ域を保ちながら酵素分解することによって、疎水性アミノ酸の豊富な未分解の高分子画分の除去が容易に行なわれ、目的のＴｒｐ含有ペプチドを得ることが出来る。
なお、微酸性域に移行したままで酵素分解を続けると、アミノ酸にまで加水分解され、この発明の目的を達成することが困難となる。
When the soy protein raw material is treated with a protease, it is preferable that the protease treatment is hydrolyzed with a protease having a low substrate specificity while maintaining an alkaline region.
Usually, when soy protein is enzymatically decomposed in an alkaline region, the pH decreases as the hydrolysis proceeds and shifts to a slightly acidic region.
However, in the present invention, the enzymatic decomposition is carried out while maintaining the alkaline region, whereby the undegraded polymer fraction rich in hydrophobic amino acids is easily removed, and the target Trp-containing peptide can be obtained.
In addition, if enzymatic degradation is continued while shifting to the slightly acidic region, it will be hydrolyzed to amino acids and it will be difficult to achieve the object of the present invention.
かかるアルカリ域としては、ｐＨ７．５〜１０、好ましくはｐＨ８〜９．５、より好ましくはｐＨ８．５〜９．０が適当である。
このｐＨ調節には、苛性ソーダ溶液などのアルカリ金属水酸化物を用いることもできるが、アンモニア溶液（例えば５％水溶液）などの有機アルカリを用いることができる。
例えば、アンモニア溶液を用いると、高濃度を使用できるので緩衝能が大きく、ｐＨ調節の頻度が少なくて済むことに加え、分解後の減圧濃縮によって分解液から容易に除去でき、中和による塩の生成を避けることができる。
The alkali range is suitably pH 7.5 to 10, preferably pH 8 to 9.5, more preferably pH 8.5 to 9.0.
For this pH adjustment, an alkali metal hydroxide such as a caustic soda solution can be used, but an organic alkali such as an ammonia solution (for example, 5% aqueous solution) can be used.
For example, when using an ammonia solution, a high concentration can be used, so the buffering capacity is large and the frequency of pH adjustment is low. Generation can be avoided.
プロテアーゼ分解の温度は、分解過程における雑菌による汚染を避けるため、高い方が望ましい。
例えば、ビオブラーゼの場合、ｐＨ９で安定である温度４５〜５５℃を用いることが好適である。
分解時間としては、分解によるｐＨの低下が無くなるまで行うことが好ましい。
大豆蛋白原料に対して１／１００重量の酵素を用いた場合、１５〜２０時間とすることができる。
A higher protease decomposition temperature is desirable in order to avoid contamination by various bacteria during the decomposition process.
For example, in the case of biobrase, it is preferable to use a temperature of 45 to 55 ° C. that is stable at pH 9.
The decomposition time is preferably carried out until there is no decrease in pH due to decomposition.
When 1/100 weight enzyme is used with respect to the soy protein raw material, it can be set to 15 to 20 hours.
この酵素分解によって、大部分の蛋白質が、小さいペプチドにまで分解される。
しかしながら、大豆蛋白質中に存在する疎水性アミノ酸に富む固い高次構造部分は、分解され難く、分子量の大きいポリペプチドとして残存する。
したがって、目的とする分子量の小さいペプチドと、分別することができる。
すなわち、疎水性アミノ酸の豊富な未分解の高分子画分を沈殿として除去することができる。
この未分解高分子画分の沈殿除去は、前記したように、酸性ｐＨ調節、さらにはエタノールの添加によって、より確実に行うことができる。
また、グルタミンとグルタミン酸の豊富な高分子量ポリペプチドと、Ｔｒｐ含有ペプチドが分離取得できるため、好ましい方法である。
By this enzymatic degradation, most proteins are broken down into small peptides.
However, a hard higher-order structure portion rich in hydrophobic amino acids present in soy protein is hardly decomposed and remains as a polypeptide having a large molecular weight.
Therefore, it can be separated from the target peptide having a low molecular weight.
That is, an undegraded polymer fraction rich in hydrophobic amino acids can be removed as a precipitate.
As described above, the precipitation removal of the undegraded polymer fraction can be more reliably performed by adjusting the acidic pH and further adding ethanol.
Moreover, since a high molecular weight polypeptide rich in glutamine and glutamic acid and a Trp-containing peptide can be separated and obtained, this is a preferred method.
未分解の疎水性高分子ポリペプチドを、沈殿させる酸性ｐＨ調節は、大豆蛋白の等電点近傍にすることが好ましく、例えば、ｐＨ３．５〜５．５、好ましくはｐＨ４．０〜５．０が適当である。
沈殿の程度は、用いる蛋白原料（例えば、分離大豆蛋白、濃縮大豆蛋白、豆乳、脱脂大豆など）により異なる。
大豆蛋白の割合が低くなるほど沈殿度が悪くなるため、この場合は、さらにエタノール添加して除去することが好ましい。
The acidic pH adjustment for precipitating the undegraded hydrophobic polymer polypeptide is preferably in the vicinity of the isoelectric point of soybean protein, for example, pH 3.5 to 5.5, preferably pH 4.0 to 5.0. Is appropriate.
The degree of precipitation varies depending on the protein raw material used (for example, isolated soybean protein, concentrated soybean protein, soy milk, defatted soybean, etc.).
Since the lower the ratio of soy protein, the lower the degree of precipitation. In this case, it is preferable to add and remove ethanol.
エタノール添加により沈殿物と溶液を分別する場合、未分解の疎水性高分子ポリペプチドを沈殿させるエタノール濃度は、ｐＨによって異なる。
中性の場合は、酸性の場合より高いエタノール濃度を必要とする。
中和した分解液にエタノールを加える場合、５０％エタノール濃度までの低い濃度で殆ど沈殿するので、エタノールの濃度は５０％以下とすることができる。
大豆蛋白の割合が高い分離大豆蛋白を用いる場合で、かつ等電点付近であれば、アルコールは殆ど必要としない。
等電点以外でも、大豆蛋白の割合の高い分離大豆蛋白を用いる場合、エタノール濃度は２０％〜５０％で、未分解の疎水性高分子ポリペプチドを沈殿させることができる。
When the precipitate and the solution are separated by adding ethanol, the ethanol concentration for precipitating the undegraded hydrophobic polymer polypeptide varies depending on the pH.
The neutral case requires a higher ethanol concentration than the acidic case.
When ethanol is added to the neutralized decomposition solution, it almost precipitates at a low concentration up to 50% ethanol concentration, so that the ethanol concentration can be 50% or less.
Alcohol is scarcely required when isolated soy protein having a high proportion of soy protein is used and near the isoelectric point.
In addition to the isoelectric point, when isolated soybean protein having a high proportion of soybean protein is used, the ethanol concentration is 20% to 50%, and undegraded hydrophobic polymer polypeptide can be precipitated.
未分解の疎水性高分子ポリペプチドを除去した溶液に、さらにエタノールを加えると、高Ｇｌｘ含有ポリペプチドを沈殿させ、グルタミンとグルタミン酸の豊富な高分子量ポリペプチドとＴｒｐ含有ペプチド組成物が分離取得できる。
その際、Ｔｒｐ含有ペプチドのみを目的とする場合には、工程の増加とエタノールの量の増加によるポリペプチドの純度が低下するため好ましい方法ではない。
When ethanol is further added to the solution from which the undegraded hydrophobic polymer polypeptide has been removed, a high Glx-containing polypeptide is precipitated, and a high molecular weight polypeptide rich in glutamine and glutamic acid and a Trp-containing peptide composition can be obtained separately. .
At that time, when only the Trp-containing peptide is intended, it is not a preferable method because the purity of the polypeptide decreases due to the increase in the number of steps and the amount of ethanol.
このようにして得られたＴｒｐ含有ペプチド組成物は、ゲルろ過及び高速液体クロマトグラム（ＨＰＬＣ）で精製され、Ｔｒｐ含有ペプチドが取得される。
ゲルろ過剤としては、Ｂｉｏ ＧｅｌＰ−１０やＰ−２などを用いることができる。
The Trp-containing peptide composition thus obtained is purified by gel filtration and high performance liquid chromatogram (HPLC) to obtain a Trp-containing peptide.
Bio GelP-10, P-2, etc. can be used as a gel filtration agent.
＜ペプチドの調製１＞
分離大豆蛋白質（ＳＰＩ；不二製油（株）製「フジプローＲ」）３００ｇに、脱イオン水を加えて３ｌとし、ホモジネートしたのち、５％アンモニア溶液でpＨ９に調節した。
それに、ビオプラーゼ６ｇを加え、攪拌しながら恒温槽中、温度５０℃で２０時間、pＨを調節しながらインキュベートした。
得られたpＨ８．３６の分解液を、遠心分離（８０００ｒｐｍ×１０分）して得られた上清を、減圧濃縮後凍結乾燥して、ペプチド組成物２４１ｇを得た。
<Preparation of peptide 1>
Deionized water was added to 300 g of isolated soy protein (SPI; “Fujipro R” manufactured by Fuji Oil Co., Ltd.) to make 3 l, homogenized, and adjusted to pH 9 with 5% ammonia solution.
6 g of biopolase was added thereto, and the mixture was incubated in a thermostatic bath with stirring at a temperature of 50 ° C. for 20 hours while adjusting the pH.
The supernatant obtained by centrifuging the obtained decomposition solution of pH 8.36 (8000 rpm × 10 minutes) was concentrated under reduced pressure and lyophilized to obtain 241 g of a peptide composition.
＜ペプチド組成物の分画・精製＞
上記で得られたペプチド組成物２ｇに、１％酢酸１０ｍｌを加えて溶解したのち、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ×１０分）して得られた上清を、Ｂｉｏ Ｇｅｌ Ｐ−１０カラム（３×３７ｃｍ）に供し、１％酢酸水溶液で展開し、分画した。
その際の、ゲルろ過パターンを図１に示す。
<Fractionation and purification of peptide composition>
To 2 g of the peptide composition obtained above, 10 ml of 1% acetic acid was added and dissolved, and then the supernatant obtained by centrifugation (10,000 rpm × 10 minutes) was added to a Bio Gel P-10 column (3 × 37 cm), developed with a 1% aqueous acetic acid solution, and fractionated.
The gel filtration pattern in that case is shown in FIG.
このゲルろ過パターンにおいて、その溶出位置と吸光度曲線から、管数２２０〜２９７の領域に、Ｔｒｐ含有ペプチドが溶出していると推測した。
そこで、この領域を画分１（管数２２０〜２６０）と、画分２（管数２６１〜２９７）の２つに分画し、それらを、さらにＢｉｏＧｅｌ Ｐ−２カラム（１．５×７０ｃｍ）に供し、１％酢酸水溶液で展開し、分画した。
その際の、ゲルろ過パターンを図２に示す。
In this gel filtration pattern, it was estimated from the elution position and absorbance curve that the Trp-containing peptide was eluted in the region of 220 to 297 tubes.
Therefore, this region was fractionated into two, fraction 1 (tube number 220-260) and fraction 2 (tube number 261-297), and these were further divided into BioGel P-2 columns (1.5 × 70 cm). ), Developed with 1% aqueous acetic acid, and fractionated.
The gel filtration pattern in that case is shown in FIG.
前記画分１及び画分２を再分画して得られた、画分１−４〜１−７及び２−４、２−５について、ＨＰＬＣによる分離を行った。
そのチャートと、分離したピーク成分の紫外吸収スペクトルを、併せて図３〜図５に示す。
Fractions 1-4 to 1-7 and fractions 2-4 and 2-5 obtained by re-fractionating fraction 1 and fraction 2 were separated by HPLC.
The chart and the ultraviolet absorption spectrum of the separated peak component are shown in FIGS.
＜ペプチドの同定＞
精製したペプチドのアミノ酸配列を、アプライドバイオシステム（ＡＢＩ）社製のプロティンシークエンサー４７７Ａ型を用いて決定した結果は、下記表１の通りであった。
また、１−６ｄのペプチド（Ｌｅｕ−Ｔｒｐ）のプロティンシークエンサーのデータは、表２に示される通りで、他のペプチドのデータも同様なものであった。
<Identification of peptide>
The results of determining the amino acid sequence of the purified peptide using a protein sequencer 477A type manufactured by Applied Biosystems (ABI) are shown in Table 1 below.
Moreover, the data of the protein sequencer of 1-6d peptide (Leu-Trp) is as shown in Table 2, and the data of other peptides were also the same.
＜ペプチド画分及び精製ペプチドの特性評価＞
上記精製で得られた８種のＴｒｐ含有（ジ）ペプチドについて、以下に示した方法で、赤血球変形能低下抑制作用を測定し、その結果を図６に示す。
図から明らかなように、Ｔｒｐ含有（ジ）ペプチドの赤血球変形能低下抑制作用は、ペプチドの構造によって異なり、ＩＷとＬＷが強い抑制作用を有することが分かった。
<Characteristic evaluation of peptide fraction and purified peptide>
The eight Trp-containing (di) peptides obtained by the above purification were measured for their erythrocyte deformability reduction-inhibiting action by the method shown below, and the results are shown in FIG.
As is clear from the figure, it was found that the Trp-containing (di) peptide suppresses the decrease in erythrocyte deformability depending on the peptide structure, and that IW and LW have a strong suppressive effect.
５０ｎｍｏｌ／ｍｌの濃度の精製Ｔｒｐ含有ペプチドを用い、以下に示した方法で、ＡＣＥ阻害活性を調べた結果、表２に示すように、阻害度は、ペプチドによって大きく異なった。
阻害度の高い８種について、阻害活性（ＩＣ５０）を測定した結果、ＩＷ、ＶＷ、ＬＷは特に強いＡＣＥ阻害活性を有することが分かった。
As a result of examining the ACE inhibitory activity using the purified Trp-containing peptide at a concentration of 50 nmol / ml by the method shown below, as shown in Table 2, the degree of inhibition varied greatly depending on the peptide.
As a result of measuring the inhibitory activity (IC 50 ) of 8 species having a high degree of inhibition, it was found that IW, VW and LW have particularly strong ACE inhibitory activity.
＜特性評価方法＞
−ＡＣＥ阻害活性測定方法（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ変法）−
ＡＣＥ（シグマ社製、酵素番号ＥＣ３．４．１５．１）と、合成基質ヒプリル−ヒスチジル−ロイシン（ペプチド研究所製）を用い、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎの測定法を改良した山本等の方法に準じて測定した。
すなわち、生成した馬尿酸を酢酸エチルにて抽出し２２５ｎｍの吸光度で測定した。
被検液での吸光度をＥｓ、被検液の代わりに緩衝液を加えた時の値をＥｃ、予め反応停止液を加えて反応させた時の値をＥｂとして、次式から阻害率を求めた。
阻害率（％）＝（Ｅｃ−Ｅｓ）／（Ｅｃ−Ｅｂ）×１００
ＡＣＥ阻害剤の阻害活性ＩＣ５０値は、ＡＣＥの酵素活性を５０％（阻害率）阻害するために必要な試料の濃度（Ｍ）で示した。
<Characteristic evaluation method>
-ACE inhibitory activity measurement method (Lieberman modified method)-
Using ACE (manufactured by Sigma, enzyme number EC 3.4.15.1) and synthetic substrate hipryl-histidyl-leucine (manufactured by Peptide Institute), measurement was performed according to the method of Yamamoto et al., Which improved the measurement method of Lieberman. .
That is, the produced hippuric acid was extracted with ethyl acetate and measured by absorbance at 225 nm.
The inhibition rate is calculated from the following equation, where Es is the absorbance in the test solution, Ec is the value when the buffer solution is added instead of the test solution, and Eb is the value when the reaction stop solution is added and reacted in advance. It was.
Inhibition rate (%) = (Ec−Es) / (Ec−Eb) × 100
The inhibitory activity IC 50 value of the ACE inhibitor was expressed as the concentration (M) of the sample required to inhibit the enzyme activity of ACE by 50% (inhibition rate).
−赤血球変形能低下抑制作用測定法−
３．８％クエン酸ソーダ溶液を含む、採血管に採血した血液を２５００ｒｐｍ×１０分遠心分離して赤血球を沈殿させた後、洗浄し、ＨＥＰＥＳを加え、６．０％赤血球浮遊液を調製した。
この６．０％赤血球浮遊液にＨＥＰＥＳを加え、温度３７．０℃で予備インキュベートしたのち、ＡＡＰＨ溶液（酸化ストレス物質）、ＡＡＰＨ溶液と測定試料をそれぞれ添加し、温度３７．０℃で４５分インキュベートした。
その後、測定するまで氷冷し、測定は、温度２５．０℃で７分、再度インキュベートしてから行った。
なお、赤血球変形能は、従来の定量性と再現性に難点のある微細孔（ｎｕｃｌｅｉｐｏｒｅ）フィルターを用いた方法に代わるものとして、発明者が開発したフィルター特性が顕著に改善された、ニッケルメッシュ（ｎｉｃｋｅｌｍｅｓｈ）フィルターを用いる方法で測定した。
-Measurement method of erythrocyte deformability reduction-
Blood collected in a blood collection tube containing 3.8% sodium citrate solution was centrifuged at 2500 rpm × 10 minutes to precipitate red blood cells, washed, and then added with HEPES to prepare a 6.0% red blood cell suspension. .
After adding HEPES to this 6.0% erythrocyte suspension and pre-incubating at a temperature of 37.0 ° C., an AAPH solution (oxidative stress substance), an AAPH solution and a measurement sample were added, respectively, and the temperature was 37.0 ° C. for 45 minutes. Incubated.
Then, it cooled on ice until it measured, and the measurement was performed after incubating again for 7 minutes at the temperature of 25.0 degreeC.
In addition, erythrocyte deformability is a nickel mesh (notably improved in filter characteristics developed by the inventor as an alternative to the conventional method using a micropore filter having difficulty in quantitative and reproducibility. The measurement was performed by a method using a nickel mesh) filter.
この発明のＴｒｐ含有ペプチドは、前記のような優れた特性を有し、粉末ないし水、酢酸またはエタノールの無毒の溶媒溶液として供給可能な抗酸化性成分であって、大豆から容易に得られることができるため、健康食品産業や医薬業界で広く利用される可能性の高いものである。
（配列表）
(Sequence Listing)
Claims (8)
を特徴とするＴｒｐ含有ペプチド。
記
１） Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ
２） Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ
３） Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ
４） Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ
５） Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ
６） Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ
７） Ａｌａ−Ｔｒｐ
８） Ｖａｌ−Ｔｒｐ
９） Ｉｌｅ−Ｔｒｐ
10） Ｌｅｕ−Ｔｒｐ
11） Ｓｅｒ−Ｔｒｐ
12） Ｇｌｙ−Ｔｒｐ
13） Ｇｌｕ−Ｔｒｐ
14） Ｔｒｐ−Ｍｅｔ
15） Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ
16） Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ A Trp-containing peptide having any one of the following amino acid sequences:
1) Thr-Trp-Asn-Pro-Asn
2) Trp-Gly-Pro
3) Trp-Gln-Glu
4) Trp-Asn-Pro-Asn
5) Trp-Asn-Leu
6) Asn-Trp-Leu
7) Ala-Trp
8) Val-Trp
9) Ile-Trp
10) Leu-Trp
11) Ser-Trp
12) Gly-Trp
13) Glu-Trp
14) Trp-Met
15) Ser-Trp-Leu
16) Trp-Thr-Tyr
下記アミノ酸配列の、いずれかのアミノ酸配列を有すること
を特徴とするＴｒｐ含有ペプチド。
記
１） Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ
２） Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ
３） Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ
４） Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ
５） Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ
６） Ａｌａ−Ｔｒｐ
７） Ｖａｌ−Ｔｒｐ
８） Ｉｌｅ−Ｔｒｐ
９） Ｌｅｕ−Ｔｒｐ
10） Ｓｅｒ−Ｔｒｐ
11） Ｇｌｙ−Ｔｒｐ
12） Ｇｌｕ−Ｔｒｐ
13） Ｔｒｐ−Ｍｅｔ
14） Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ Angiotensin I converting enzyme (ACE) inhibitory activity,
A Trp-containing peptide having any one of the following amino acid sequences:
1) Thr-Trp-Asn-Pro-Asn
2) Trp-Gly-Pro
3) Trp-Gln-Glu
4) Trp-Asn-Pro-Asn
5) Asn-Trp-Leu
6) Ala-Trp
7) Val-Trp
8) Ile-Trp
9) Leu-Trp
10) Ser-Trp
11) Gly-Trp
12) Glu-Trp
13) Trp-Met
14) Trp-Thr-Tyr
下記アミノ酸配列の、いずれかのアミノ酸配列を有すること
を特徴とするＴｒｐ含有ペプチド。
記
１） Ａｌａ−Ｔｒｐ
２） Ｖａｌ−Ｔｒｐ
３） Ｉｌｅ−Ｔｒｐ
４） Ｌｅｕ−Ｔｒｐ
５） Ｓｅｒ−Ｔｒｐ
６） Ｇｌｙ−Ｔｒｐ Has the effect of suppressing the degradation of human erythrocyte deformability,
A Trp-containing peptide having any one of the following amino acid sequences:
1) Ala-Trp
2) Val-Trp
3) Ile-Trp
4) Leu-Trp
5) Ser-Trp
6) Gly-Trp
大豆蛋白原料をプロテアーゼで処理し、不溶の疎水性アミノ酸の豊富な未分解の高分子画分を除去した水溶液から調製されたこと
を特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のＴｒｐ含有ペプチド。 The Trp-containing peptide is
The soy protein raw material is prepared from an aqueous solution obtained by treating a soy protein raw material with a protease and removing an undegraded polymer fraction rich in insoluble hydrophobic amino acids. Trp-containing peptide.
アルカリ域を保持しながら、基質特性の低いプロテアーゼで行う加水分解処理である
こと
を特徴とする請求項４に記載のＴｒｐ含有ペプチド。 The protease treatment
5. The Trp-containing peptide according to claim 4, wherein the Trp-containing peptide is a hydrolysis treatment performed with a protease having low substrate characteristics while maintaining an alkaline region.
酸性ｐＨ調節及び／又はエタノールの添加により行われること
を特徴とする請求項４又は５に記載のＴｒｐ含有ペプチド。 Precipitation removal of the undegraded polymer fraction is
The Trp-containing peptide according to claim 4 or 5, which is carried out by adjusting acidic pH and / or adding ethanol.
前記調製において、１％酢酸水溶液に不溶な物質が除去されていること
を特徴とする請求項４〜６のいずれか１項に記載のＴｒｐ含有ペプチド。 The Trp-containing peptide is
The Trp-containing peptide according to any one of claims 4 to 6, wherein in the preparation, a substance insoluble in 1% aqueous acetic acid solution is removed.
前記調製において、ゲル濾過および高速液体クロマトグラフィーによる精製が行なわれていること
を特徴とする請求項４〜７のいずれか１項に記載のＴｒｐ含有ペプチド。 The Trp-containing peptide is
The Trp-containing peptide according to any one of claims 4 to 7, wherein in the preparation, purification by gel filtration and high performance liquid chromatography is performed.
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Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH07188282A (en) * | 1991-04-19 | 1995-07-25 | Suetsuna Yoko | Novel tripeptide, its production and hypotensor containing the same as an active ingredient |
| JP2002053595A (en) * | 2000-08-14 | 2002-02-19 | Abo Kenji | Material inhibiting angiotensin converting enzyme and method for producing the same |
| WO2002055546A1 (en) * | 2001-01-16 | 2002-07-18 | Ajinomoto Co.,Inc. | Angiotensin converting enzyme inhibitors |
| WO2004104027A1 (en) * | 2003-05-21 | 2004-12-02 | Fuji Oil Company, Limited | Composition containing angiotensin converting enzyme inhibitory peptide |
| JP2009040696A (en) * | 2007-08-07 | 2009-02-26 | Kikkoman Corp | New angiotensin converting enzyme-inhibiting peptide |
-
2009
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Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH07188282A (en) * | 1991-04-19 | 1995-07-25 | Suetsuna Yoko | Novel tripeptide, its production and hypotensor containing the same as an active ingredient |
| JP2002053595A (en) * | 2000-08-14 | 2002-02-19 | Abo Kenji | Material inhibiting angiotensin converting enzyme and method for producing the same |
| WO2002055546A1 (en) * | 2001-01-16 | 2002-07-18 | Ajinomoto Co.,Inc. | Angiotensin converting enzyme inhibitors |
| WO2004104027A1 (en) * | 2003-05-21 | 2004-12-02 | Fuji Oil Company, Limited | Composition containing angiotensin converting enzyme inhibitory peptide |
| JP2009040696A (en) * | 2007-08-07 | 2009-02-26 | Kikkoman Corp | New angiotensin converting enzyme-inhibiting peptide |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| JPN6013059615; 日本農芸化学会２００８年度西日本支部大会講演要旨集（２００８）ｐ．４４（Ｄ１０ｐ） * |
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