JP2010078379A - Method of activating antigen - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、抗原賦活化方法に関する。より詳しくは、病理学などの分野において、ルーチンに処理された組織又は細胞のホルマリン固定、パラフィン包埋された標本を用いて、組織又は細胞に存在する特定の抗原について免疫組織化学染色を行う場合における抗原物質の抗原性を回復する方法に関する。 The present invention relates to an antigen activation method. More specifically, in the field of pathology or the like, when immunohistochemical staining is performed for a specific antigen present in a tissue or cell using a formalin-fixed, paraffin-embedded specimen of a tissue or cell that is routinely processed The present invention relates to a method for recovering the antigenicity of an antigenic substance.
免疫組織化学(Immunohistochemistry; IHC)は、発現したタンパク質を認識する抗体を用いて、特定のタンパク質などを個々の症例において解析する方法であり、パラフィンブロック切片や凍結切片で解析が可能である。免疫組織化学染色は、病理学的に広く用いられる染色法であり、組織又は細胞に存在する特定の抗原を認識する抗体を用いて可視化し、その局在を光学顕微鏡あるいは電子顕微鏡下で観察するために考案された染色法である。 Immunohistochemistry (IHC) is a method for analyzing specific proteins in individual cases using an antibody that recognizes the expressed protein, and can be analyzed with paraffin block sections or frozen sections. Immunohistochemical staining is a staining method widely used pathologically, visualized by using an antibody that recognizes a specific antigen present in a tissue or cell, and observed under an optical microscope or an electron microscope. This is a staining method devised for this purpose.
組織や細胞の構造の観察や、組織内の生体高分子(タンパク質、多糖、mRNAなど)の分布を調べるためには、固定処理した試料を用いる必要がある。固定は、(1)組織内の物質を速やかに不動化し、生体に近い状態を保つ、(2)自己分解や腐敗を防ぎ、死後変化を最小にする、(3)再現性のある組織像を得る、(4)目的とする構造にコントラストを与える、などの目的のために行う。病理組織などの光学顕微鏡レベルでの評価のためには10%ホルマリン溶液が標準的な固定液であり、組織内で酵素活性や抗原を検出する酵素組織化学や免疫組織化学では、酵素活性や抗原性を保存する固定法が要求される。 In order to observe the structure of tissues and cells and to examine the distribution of biopolymers (proteins, polysaccharides, mRNA, etc.) in tissues, it is necessary to use fixed samples. Fixation (1) Immediately immobilize the substance in the tissue and keep it close to the living body, (2) Prevent autolysis and decay, minimize post-mortem changes, (3) Reproducible tissue image For the purpose of obtaining (4) providing contrast to the target structure. A 10% formalin solution is a standard fixative for evaluation at the level of light microscope such as pathological tissue. In enzyme histochemistry or immunohistochemistry for detecting enzyme activity or antigen in tissue, enzyme activity or antigen A fixation method that preserves sex is required.
固定には化学固定と物理固定がある。化学固定では細胞、組織内の高分子物質を架橋することによって不動化する。なお、固定剤としては、ホルムアルデヒド、グルタールアルデヒド、四酸化オスミウムなどがある。ホルムアルデヒドやグルタールアルデヒドは主としてタンパク質を固定する。ホルムアルデヒドは、大きな組織片にも速やかに浸透する。物理固定には、(1)煮沸やマイクロウェーブ照射による変性(熱凝固)、(2)エタノールやアセトンなど有機溶媒による沈殿、(3)酢酸やトリクロロ酢酸などによる変性、沈殿、(4)凍結、などがある。凍結したものは、凍結中又は融解後に固定する必要がある。このような化学固定や物理固定処理により、目的タンパク質は著しく変性を受け、免疫組織化学での検出の不安定性や検出不能の結果に至る。 There are chemical fixation and physical fixation. In chemical fixation, it is immobilized by crosslinking macromolecular substances in cells and tissues. Examples of the fixing agent include formaldehyde, glutaraldehyde, and osmium tetroxide. Formaldehyde and glutaraldehyde mainly fix proteins. Formaldehyde penetrates quickly into large tissue pieces. For physical fixation, (1) denaturation by boiling or microwave irradiation (thermal coagulation), (2) precipitation with an organic solvent such as ethanol or acetone, (3) denaturation or precipitation with acetic acid or trichloroacetic acid, (4) freezing, and so on. The frozen product must be fixed during freezing or after thawing. By such chemical fixation or physical fixation treatment, the target protein is significantly denatured, leading to instability of detection by immunohistochemistry and undetectable results.
抗原賦活化には主として、ペプシン、トリプシンなどのタンパク質分解酵素処理や、加熱処理がある。タンパク質分解酵素処理では、タンパク質の一部が消化、抽出され、抗体が抗原に接触しやすくなるが、抗原性の劇的な賦活化は期待できないことが多い。また、メチル無水マレイン酸(Citraconic anhydride)を用いた抗原賦活化方法について報告がある(特許文献1)。 Antigen activation mainly includes treatment with proteolytic enzymes such as pepsin and trypsin, and heat treatment. In proteolytic enzyme treatment, a part of the protein is digested and extracted, and the antibody easily comes into contact with the antigen. However, dramatic activation of antigenicity cannot often be expected. In addition, there is a report on an antigen activation method using methyl maleic anhydride (Citraconic anhydride) (Patent Document 1).
加熱処理ではホルムアルデヒドによるタンパク質の架橋が切断されるとともに、タンパク質や核酸の一部が抽出される。加熱処理法により検出可能となった抗原は非常に多い。加熱処理による抗原賦活化は、加熱処理によりタンパク質の高次構造を形成している疎水結合、水素結合、イオン結合が乖離して高次構造が変化し、続いて自然冷却などの緩慢冷却によりペプチド鎖が再フォールディングされ、抗原性が賦活化されると考えられる。ペプチド鎖の再フォールディングのために、自然冷却などの緩慢冷却処理も加熱処理に伴う抗原賦活化の重要な因子であると考えられている(非特許文献1)。緩慢冷却処理を伴う加熱処理では、再フォールディングに適合する抗原賦活化液を選択する必要がある。加熱処理液(抗原賦活化液)には、10mMクエン酸緩衝液(pH 6.0)や1mM ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA)液(pH 8.0)などが多く使用されている。
本発明は、パラフィン包埋後の標本について、組織又は細胞に存在する目的抗原物質を認識する抗体(一次抗体)を用いて免疫組織化学染色を行う場合に、短時間かつ効果的に目的抗原物質の抗原賦活化を行う方法を提供することを課題とする。 In the present invention, when immunohistochemical staining is performed on a specimen after embedding in paraffin using an antibody (primary antibody) that recognizes the target antigenic substance present in the tissue or cells, the target antigenic substance is effectively used in a short time. It is an object of the present invention to provide a method for antigen activation.
本発明者らは上記課題を解決するために、鋭意検討を重ねた結果、加熱処理後の緩慢冷却工程及び緩衝液による洗浄工程の省略により、抗原性が維持され、さらに抗原賦活化作用が増強されることを見出し、本発明を完成した。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have maintained antigenicity by omitting the slow cooling step after the heat treatment and the washing step with the buffer solution, and further enhanced the antigen activation effect. As a result, the present invention has been completed.
すなわち、本発明は以下よりなる。
1.パラフィン包埋後の標本についての免疫組織化学染色のための目的抗原物質の賦活化方法において、70〜130℃での加熱処理後、緩慢冷却処理及び緩衝液による洗浄処理を行わないことを特徴とする目的抗原物質の賦活化方法。
2.加熱処理後、過酸化水素水処理、過酸化水素・アルコール処理、アルコール処理、還元剤処理、キレート剤処理、界面活性剤処理もしくは緩衝液処理による急速冷却処理を行うことを特徴とする前項1に記載の目的抗原物質の賦活化方法。
3.過酸化水素・アルコール処理が、過酸化水素・メタノール処理である前項2に記載の目的抗原物質の賦活化方法。
4.前項1〜3の何れかに記載の賦活化方法と、タンパク質分解酵素処理を組み合わせて行うことを特徴とする目的抗原物質の賦活化方法。
5.前項1〜4の何れかに記載の賦活化方法と、還元剤処理を組み合わせて行うことを特徴とする目的抗原物質の賦活化方法。
6.前項1〜5の何れかに記載の賦活化方法と、界面活性剤処理を組み合わせて行うことを特徴とする目的抗原物質の賦活化方法。
7.前項1〜6の何れかに記載の賦活化方法により処理したパラフィン包埋後の標本を、免疫組織化学染色により分析することを特徴とする組織又は細胞の分析方法。
That is, this invention consists of the following.
1. In the method for activating a target antigenic substance for immunohistochemical staining of a specimen after embedding in paraffin, it is characterized by not performing a slow cooling treatment and a washing treatment with a buffer solution after a heat treatment at 70 to 130 ° C. A method for activating a target antigenic substance.
2. In the preceding item 1, characterized in that after the heat treatment, hydrogen peroxide treatment, hydrogen peroxide / alcohol treatment, alcohol treatment, reducing agent treatment, chelating agent treatment, surfactant treatment or buffer solution treatment is performed for rapid cooling treatment. The activation method of the target antigen substance as described.
3. 3. The method for activating a target antigenic substance according to item 2 above, wherein the hydrogen peroxide / alcohol treatment is hydrogen peroxide / methanol treatment.
4). 4. An activation method for a target antigenic substance, comprising performing the activation method according to any one of items 1 to 3 in combination with a proteolytic enzyme treatment.
5). 5. A method for activating a target antigenic substance, comprising performing the activation method according to any one of items 1 to 4 in combination with a reducing agent treatment.
6). 6. An activation method of a target antigenic substance, which is performed by combining the activation method according to any one of 1 to 5 above and a surfactant treatment.
7). 7. A tissue or cell analysis method, characterized in that a paraffin-embedded specimen treated by the activation method according to any one of items 1 to 6 is analyzed by immunohistochemical staining.
本発明の目的抗原物質の賦活化方法によると、加熱処理後の緩慢冷却工程及び緩衝液による洗浄工程を省略することができる。これにより、抗原賦活化工程に要する時間が、約45分間短縮でき、さらに抗原タンパク質の染色感度も上昇させることができる。 According to the activation method of the target antigenic substance of the present invention, the slow cooling step after the heat treatment and the washing step with the buffer solution can be omitted. As a result, the time required for the antigen activation step can be shortened by about 45 minutes, and the antigen protein staining sensitivity can be increased.
本発明において、パラフィン包埋標本の作製方法は、自体公知の方法を適用することができる。組織や細胞の固定には化学固定と物理固定がある。化学固定に用いられる固定剤としては、ホルムアルデヒド(ホルマリン)、グルタールアルデヒド、四酸化オスミウムなどが挙げられる。ホルムアルデヒドやグルタールアルデヒドは主としてタンパク質を固定する。ホルムアルデヒドは大きな組織片にも速やかに浸透する。物理固定には、(1)煮沸やマイクロウェーブ照射による変性(熱固定)、(2)エタノールやアセトンなど有機溶媒による沈殿、(3)酢酸やトリクロロ酢酸などによる変性、沈殿、(4)凍結などが挙げられる。 In the present invention, a method known per se can be applied as a method for preparing a paraffin-embedded specimen. There are two types of tissue and cell fixation: chemical fixation and physical fixation. Examples of the fixing agent used for chemical fixation include formaldehyde (formalin), glutaraldehyde, osmium tetroxide and the like. Formaldehyde and glutaraldehyde mainly fix proteins. Formaldehyde penetrates quickly into large pieces of tissue. For physical fixation, (1) denaturation by boiling or microwave irradiation (thermal fixation), (2) precipitation with an organic solvent such as ethanol or acetone, (3) denaturation or precipitation with acetic acid or trichloroacetic acid, (4) freezing, etc. Is mentioned.
固定後に、組織や細胞などの検体の性質に応じて、さらに脱脂操作や脱灰操作を行うことができる。例えば、乳腺、皮下組織、骨髄などの、検体に脂肪成分の多い組織のパラフィン包埋に際しては、固定後にアセトン、クロロホルム、メタノール・クロロホルム混合液(1:1もしくは1:2)などで処理することにより脱脂操作を行うことができる。また、骨、歯、石灰化した病巣、結石を含む腎臓や胆嚢などの、検体に石灰が含まれる場合は、そのまま包埋したのでは薄切が困難である。包埋に先立って、石灰化組織からミクロトームで薄切を容易にするためにあらかじめ石灰を除去する脱灰操作を行うことができる。一般には、硝酸、ギ酸、三塩化酢酸などの酸類により処理する方法が挙げられる。 After fixation, a degreasing operation or a deashing operation can be further performed according to the properties of the specimen such as tissue or cells. For example, when embedding paraffin in tissues with a large amount of fat components such as mammary gland, subcutaneous tissue, bone marrow, etc., after fixation, treat with acetone, chloroform, methanol / chloroform mixture (1: 1 or 1: 2), etc. The degreasing operation can be performed. Also, if the specimen contains lime, such as bones, teeth, calcified lesions, kidneys or gallbladder containing stones, it is difficult to slice the specimen. Prior to embedding, a decalcification operation can be performed to remove lime in advance in order to facilitate slicing with a microtome from the calcified tissue. In general, a method of treating with acids such as nitric acid, formic acid, and trichloroacetic acid can be mentioned.
次に、脱水のために通常エタノールを用いる。急に濃度の濃いエタノールに入れると組織の強い収縮と硬化が起きるので、例えば70%→80%→90%→100%のように低濃度のエタノールから高濃度のエタノールに移して処理することができる。さらに、検体にパラフィンを浸透させるために、例えばキシレンを用いて処理することができる。まず、1:1キシレン・パラフィン混合液に浸し、次にパラフィン液に検体を浸すことができる。 Next, ethanol is usually used for dehydration. If the tissue is suddenly put into a concentrated ethanol, strong tissue shrinkage and hardening occurs. For example, 70% → 80% → 90% → 100%. it can. Furthermore, in order to infiltrate the paraffin into the specimen, it can be treated with, for example, xylene. First, the specimen can be immersed in a 1: 1 xylene / paraffin mixture, and then the specimen can be immersed in the paraffin liquid.
以上の処理した検体を型に入れ、溶かしたパラフィンを注ぎ固め、パラフィン包埋し、パラフィン包埋標本を作製することができる。パラフィンの処理温度は、パラフィンの種類、検体、目的に応じて適宜選択することができる。パラフィンで包埋した検体を、顕微鏡下で組織を観察する場合に、厚い組織片を薄く切り、透過光線を充分通す必要がある。上記の如く、固定、脱水、包埋の操作を加えて一定の硬さを与えた後に組織片などの検体を例えばミクロトームを用いて薄く切ることができる。 The above-treated specimen can be put into a mold, and melted paraffin can be poured and solidified and embedded in paraffin to prepare a paraffin-embedded specimen. The processing temperature of paraffin can be appropriately selected according to the type of paraffin, specimen, and purpose. When observing a tissue embedded in paraffin under a microscope, it is necessary to cut a thick tissue piece thinly and allow a transmitted light to pass through sufficiently. As described above, a specimen such as a tissue piece can be cut into thin pieces using, for example, a microtome after applying fixation, dehydration, and embedding operations to give a certain hardness.
上述のパラフィン包埋組織の薄切切片を、例えばキシレンで脱パラフィン処理した後、免疫組織化学染色のため、目的抗原を認識する抗体で抗原抗体反応をさせる。 The above sliced slice of paraffin-embedded tissue is deparaffinized with, for example, xylene, and then subjected to an antigen-antibody reaction with an antibody that recognizes the target antigen for immunohistochemical staining.
免疫組織化学染色は、目的抗原物質に対する抗体を用いてその局在を可視化する方法である。抗体は、目的抗原物質、つまり目的タンパク質のごく一部のペプチドをエピトープとして認識するので、タンパク質に本来備わっている、又は固定処理により形成されたS-S結合は、抗体の認識には不利な構造となりうる。免疫組織化学染色の際、固定された組織や細胞に存在する目的タンパク質を生体の状態に戻すのではなく、抗体が作製されたときに認識される直線的なペプチドの状態に近づけることにより、目的抗原物質の抗原性を回復することができる。 Immunohistochemical staining is a method of visualizing the localization using an antibody against a target antigen substance. Since an antibody recognizes a target antigenic substance, that is, a small part of a peptide of a target protein as an epitope, the SS bond inherent in the protein or formed by immobilization is disadvantageous for antibody recognition. Can be a structure. In immunohistochemical staining, the target protein present in fixed tissues and cells is not returned to the state of the living body, but is brought closer to the state of a linear peptide recognized when the antibody is produced. The antigenicity of the antigenic substance can be restored.
本発明の目的抗原物質の賦活化方法では、加熱処理による抗原賦活化処理を行うことが必要である。本発明において、加熱処理は70〜130℃の範囲で行うことができ、好ましくは70〜125℃の範囲で行うことができ、さらに好ましくは95〜121℃の範囲で行うことができる。加熱処理時間は、5〜120分程度行うことができ、好ましくは5〜90分程度行うことができ、より好ましくは約10〜60分程度とすることができる。 In the activation method of the target antigenic substance of the present invention, it is necessary to perform an antigen activation treatment by heat treatment. In this invention, heat processing can be performed in the range of 70-130 degreeC, Preferably it can carry out in the range of 70-125 degreeC, More preferably, it can carry out in the range of 95-121 degreeC. The heat treatment time can be performed for about 5 to 120 minutes, preferably about 5 to 90 minutes, and more preferably about 10 to 60 minutes.
ここで、加熱処理工程で用いられる溶液は、特に限定されないが、例えば10mMクエン酸緩衝液(pH 6.0, 7.0)、1mM EDTA液(pH 8.0)、10mM EDTA液(pH 8.0)、Tris-EDTA液(pH9.0)、10mM Tris(pH 10.0)、100mMホウ酸(pH 7.0)、PBS(Phosphate Buffered Saline:リン酸緩衝液)、TBS(Tris-Buffered Saline: トリス緩衝液)、生理的食塩水、蒸留水等を用いることができる。 Here, the solution used in the heat treatment step is not particularly limited. For example, 10 mM citrate buffer (pH 6.0, 7.0), 1 mM EDTA solution (pH 8.0), 10 mM EDTA solution (pH 8.0), Tris-EDTA solution (pH 9.0), 10 mM Tris (pH 10.0), 100 mM boric acid (pH 7.0), PBS (Phosphate Buffered Saline: phosphate buffer), TBS (Tris-Buffered Saline: Tris buffer), physiological saline, Distilled water or the like can be used.
本発明は、加熱処理後の試料を緩慢冷却、洗浄する工程を省略するものである。従来の脱パラフィン処理後の加熱処理による抗原賦活化方法は、以下のように、緩慢冷却、洗浄工程を必要としていた。抗原賦活化後の緩慢冷却工程で、ペプチドやタンパク質等の再フォールディングが行われることが考えられ、そのために加熱処理に用いられる抗原賦活化処理液は、ペプチドやタンパク質に応じて、再フォールディングに合った緩衝液を選択することが必要であった。本明細書において、緩慢冷却とは、70〜130℃の加熱処理後、30分以上かけて室温または室温以下の温度に徐々に冷却していくことをいい、自然冷却や機器のプログラム等により設定されて行われる緩慢な冷却が含まれる。ここで、自然冷却とは、加熱処理後にそのまま室温に放置し、室温にて徐々に自然に冷却させていくことをいい、プログラム等により設定されて行われる緩慢冷却の場合は、プログラムの温度設定により徐々に冷却させつつ、同時に洗浄工程等が組み合わされている場合がある。 In the present invention, the step of slowly cooling and washing the sample after the heat treatment is omitted. The conventional antigen activation method by heat treatment after deparaffinization treatment requires slow cooling and washing steps as follows. It is conceivable that refolding of peptides and proteins is performed in the slow cooling step after antigen activation, so the antigen activation treatment solution used for heat treatment is suitable for refolding depending on the peptides and proteins. It was necessary to select a buffer. In this specification, slow cooling refers to gradually cooling to room temperature or below room temperature over 30 minutes after heat treatment at 70 to 130 ° C., and is set by natural cooling, equipment programs, etc. Slow cooling done is included. Here, natural cooling means that the heat treatment is left as it is at room temperature, and is allowed to cool gradually gradually at room temperature. In the case of slow cooling that is set by a program or the like, the temperature setting of the program is set. In some cases, a cooling process and the like are combined at the same time while gradually cooling.
加熱処理による抗原賦活化工程では、通常は以下の1)〜3)の工程が行われる。
1)加熱処理工程
2)緩慢冷却工程(約30分〜1時間以上)
3)緩衝液、例えばPBSによる洗浄(約5分×3)
In the antigen activation step by heat treatment, the following steps 1) to 3) are usually performed.
1) Heat treatment process 2) Slow cooling process (about 30 minutes to 1 hour or more)
3) Washing with a buffer solution such as PBS (about 5 minutes × 3)
従来では、上記1)〜3)の工程の後、過酸化水素水処理もしくは、過酸化水素・アルコール(H2O2・アルコール)処理を行い、その後一次抗体及び二次抗体処理を行い、発色させて検出していたのに対し、本発明の抗原賦活化方法では、上記工程のうち、1)の加熱処理後に、加熱処理後の試料を緩慢冷却、洗浄する工程を省略して、過酸化水素水処理、H2O2・アルコール処理、アルコール処理、還元剤処理、キレート剤処理、界面活性剤処理もしくは緩衝液処理による急速冷却処理を行い、そのまま、又は引き続き過酸化水素処理を行い、その後一次抗体及び二次抗体処理を行い、発色させて検出することができる。ここで、急速冷却とは、加熱処理後の高温状態(70〜100℃)から急速に低温状態に冷却することをいう。急速冷却処理に用いるこれらの処理液は、4〜40℃で処理することができ、好ましくは10〜37℃とすることができる。 Conventionally, after the steps 1) to 3), hydrogen peroxide treatment or hydrogen peroxide / alcohol (H 2 O 2 / alcohol) treatment is performed, followed by primary antibody and secondary antibody treatment, and color development. On the other hand, in the antigen activation method of the present invention, after the heat treatment in 1), the step of slowly cooling and washing the sample after the heat treatment is omitted in the above-described steps, and the peroxidation is performed. Hydrogen water treatment, H 2 O 2 / alcohol treatment, alcohol treatment, reducing agent treatment, chelating agent treatment, surfactant treatment or rapid cooling treatment by buffer solution treatment, as it is, or subsequently hydrogen peroxide treatment, The primary antibody and secondary antibody treatment can be performed and color can be detected. Here, rapid cooling refers to rapid cooling from a high temperature state (70 to 100 ° C.) after heat treatment to a low temperature state. These treatment solutions used for the rapid cooling treatment can be treated at 4 to 40 ° C, preferably 10 to 37 ° C.
パラフィン包埋組織の薄切切片を脱パラフィン処理した後の試料について、上記2)の緩慢冷却工程、3)の洗浄工程を省略し、加熱処理工程の直後に過酸化水素水処理、H2O2・アルコール処理、還元剤処理、キレート剤処理、界面活性剤処理もしくは緩衝液処理による急速冷却処理を行うことにより、抗原性が回復・賦活化した状態で固定されていると考えられる。 For the sample after the deparaffinization of the sliced section of the paraffin-embedded tissue, the slow cooling step of 2) and the washing step of 3) are omitted, and the hydrogen peroxide treatment, H 2 O is performed immediately after the heat treatment step. 2. It is considered that antigenicity is fixed in a recovered and activated state by performing rapid cooling treatment by alcohol treatment, reducing agent treatment, chelating agent treatment, surfactant treatment or buffer solution treatment.
上記1)の加熱処理後の試料を急速冷却処理する場合に、H2O2・アルコールもしくはアルコールを用いる場合の、アルコールは特に限定されないが、使用の簡便さ及び費用の観点から、メタノールを用いるのが最も効果的である。還元剤を用いる場合は、シュウ酸、クエン酸、システイン、アスコルビン酸、ヨウ化カリウム、ヨウ化水素酸、金属水酸化物から選択されるいずれかを用いることができ、キレート剤を用いる場合は、クエン酸、グルコン酸、ヘプトグルコン酸、EDTAに代表されるアミノカルボン酸系キレート剤、ホスホン酸系キレート剤、キレート金属塩から選択されるいずれかを用いることができる。界面活性剤としては、ポリオキシエチレン(9)オクチルフェニルエーテル (NP-40, IgepalCA630)、ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウレート (Tween20)、ポリオキシエチレン(10)オクチルフェニルエーテル (Triton-X-100)、ポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレン縮合物 (Pluronic F68)などの非イオン系界面活性剤、3-(1-ピリジニオ)-1-プロパンスルホン酸 (NDSB 201)などの両性界面活性剤、ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) などの陰イオン性界面活性剤、Cetyltrimethylammonium Bromide (CTAB) などの陽イオン性界面活性剤から選択されるいずれかを用いることができる。緩衝液で処理する場合は、加熱処理工程で使用する緩衝液と同様のものを用いることができ、例えばPBS(リン酸緩衝液)もしくはTBS(トリス緩衝液)を用いることができる。緩衝液には、上記還元剤やキレート剤、界面活性剤を混入してもよい。 In the case of using the H 2 O 2 .alcohol or alcohol when the sample after the heat treatment of 1) is rapidly cooled, the alcohol is not particularly limited, but methanol is used from the viewpoint of ease of use and cost. Is the most effective. When using a reducing agent, any one selected from oxalic acid, citric acid, cysteine, ascorbic acid, potassium iodide, hydroiodic acid, and metal hydroxide can be used. When using a chelating agent, Any one selected from citric acid, gluconic acid, heptogluconic acid, aminocarboxylic acid chelating agents represented by EDTA, phosphonic acid chelating agents, and chelating metal salts can be used. Surfactants include polyoxyethylene (9) octylphenyl ether (NP-40, Igepal CA630), polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate (Tween20), polyoxyethylene (10) octylphenyl ether (Triton-X -100), nonionic surfactants such as polyoxyethylene-polyoxypropylene condensate (Pluronic F68), amphoteric surfactants such as 3- (1-pyridinio) -1-propanesulfonic acid (NDSB 201), Any one selected from an anionic surfactant such as sodium dodecyl sulfate (SDS) and a cationic surfactant such as Cetyltrimethylammonium Bromide (CTAB) can be used. When processing with a buffer solution, the thing similar to the buffer solution used at a heat processing process can be used, for example, PBS (phosphate buffer solution) or TBS (Tris buffer solution) can be used. The buffer may contain the above reducing agent, chelating agent, and surfactant.
従来の免疫染色の工程において、H2O2が用いられるのは、試料中に含まれる内因性のペルオキシダーゼを不活化し、ジアミノベンチジン(DAB)によるペルオキシダーゼ基質の発色の際のバックグラウンドを抑制するためである。従来法では、内因性ペルオキシダーゼの不活化処理のために、過酸化水素水処理もしくは、H2O2・メタノール処理を行い、その後さらにPBSなどの緩衝液で洗浄(約5分×3)を行う。本賦活化法は、内因性ペルオキシダーゼ不活化処理と、抗原性が賦活化した状態での固定処理を同時に行う。このことにより、発色感度の増強作用が得られるのと同時に時間短縮をはかることができる。この場合において、ペルオキシダーゼ基質の発色により免疫組織化学染色する場合は、内因性ペルオキシダーゼ不活化処理が染色工程内に必ず含まれるため、単純に上記2)の緩慢冷却工程、3)の洗浄工程をスキップすることで、抗原性が賦活化した状態での固定処理が実現される。一方、ペルオキシダーゼ基質の発色によらない場合において、染色工程内に含まれない過酸化水素水処理、H2O2・アルコール処理、アルコール処理、還元剤処理、キレート剤処理、界面活性剤処理もしくは緩衝液処理による急速冷却処理工程を、上記1)の加熱処理工程後にあえて行うことで、抗原性が賦活化した状態での固定処理をすることができ、発色感度の増強と染色時間の短縮をはかることができる。ペルオキシダーゼ基質の発色により免疫組織化学染色する場合は、過酸化水素水処理もしくは、H2O2・アルコール処理を約15分程度行うことができ、免疫組織化学染色がペルオキシダーゼ基質の発色によらない場合は、過酸化水素水処理、H2O2・アルコール処理、アルコール処理、還元剤処理、キレート剤処理、界面活性剤処理もしくは緩衝液処理による急速冷却処理を1〜15分程度とすることができる。 In the conventional immunostaining process, H 2 O 2 is used to inactivate the endogenous peroxidase contained in the sample and to suppress the background when the peroxidase substrate is colored by diaminobenzidine (DAB). It is to do. In the conventional method, in order to inactivate endogenous peroxidase, a hydrogen peroxide solution treatment or a H 2 O 2 / methanol treatment is performed, followed by further washing with a buffer solution such as PBS (about 5 minutes × 3). . In this activation method, endogenous peroxidase inactivation treatment and fixation treatment in a state where antigenicity is activated are simultaneously performed. As a result, the color development sensitivity can be enhanced and the time can be shortened at the same time. In this case, when immunohistochemical staining is performed by color development of the peroxidase substrate, the endogenous peroxidase inactivation treatment is always included in the staining step, so the above-described 2) slow cooling step and 3) washing step are simply skipped. By doing so, the fixing process in a state where antigenicity is activated is realized. On the other hand, in cases where the coloration of the peroxidase substrate is not used, hydrogen peroxide treatment, H 2 O 2 / alcohol treatment, alcohol treatment, reducing agent treatment, chelating agent treatment, surfactant treatment or buffer not included in the staining process By performing the rapid cooling treatment step by liquid treatment after the heat treatment step of 1) above, it is possible to carry out a fixing treatment in a state in which antigenicity is activated, thereby enhancing the coloring sensitivity and shortening the staining time. be able to. When immunohistochemical staining is performed by coloring the peroxidase substrate, treatment with hydrogen peroxide solution or H 2 O 2 / alcohol can be performed for about 15 minutes. Can be rapidly cooled by hydrogen peroxide treatment, H 2 O 2 / alcohol treatment, alcohol treatment, reducing agent treatment, chelating agent treatment, surfactant treatment or buffer solution treatment for about 1 to 15 minutes. .
本発明の目的抗原物質の賦活化処理は、目的抗原物質に対する抗体を適用する前であればよく、特に限定されないが、薄切切片を作製した後に処理するのが望ましい。具体的には、薄切切片をプレパラート上に配置し、脱パラフィン処理した後であってもよい。 The activation treatment of the target antigen substance of the present invention is not particularly limited as long as it is before application of the antibody against the target antigen substance, but it is desirable to perform the process after preparing a sliced slice. Specifically, it may be after the sliced slice is placed on a slide and deparaffinized.
本発明の抗原賦活化方法は、自体公知、又は今後開発される新たな抗原賦活化方法とともに組み合わせて処理してもよい。具体的には、タンパク質分解酵素処理、還元剤処理や界面活性剤処理などと組み合わせることができる。組み合わせる抗原賦活化処理は、本発明の加熱処理の前後であってもよいし、加熱処理と同時であってもよく、いずれの工程で組み合わせてもよい。 The antigen activation method of the present invention may be processed in combination with a new antigen activation method known per se or developed in the future. Specifically, it can be combined with proteolytic enzyme treatment, reducing agent treatment, surfactant treatment and the like. The antigen activation treatment to be combined may be performed before or after the heat treatment of the present invention, may be performed simultaneously with the heat treatment, or may be combined in any step.
タンパク質分解酵素処理を組み合わせる場合、タンパク質分解酵素は、免疫賦活化法に使用可能な酵素であればよく、特に限定されないが、例えばペプシンやトリプシンなどの自体公知の酵素を使用することができる。 When proteolytic enzyme treatment is combined, the proteolytic enzyme is not particularly limited as long as it is an enzyme that can be used in the immunostimulation method. For example, per se known enzymes such as pepsin and trypsin can be used.
還元剤処理を組み合わせる場合、還元剤は、免疫賦活化法に使用可能な還元剤であればよく、特に限定されないが、例えばタンパク質中のS−S結合を切断可能なものであればよい。具体的にはメルカプト系還元剤、芳香族チオール系還元剤、有機リン酸化合物及び/又はピルビン酸アミド系還元剤が挙げられる。メルカプト系還元剤としては、メルカプトエタノールが挙げられ、さらに具体的には2-メルカプトエタノール及び/又は2-メルカプトエタノールアミンなどが挙げられる。芳香族チオール系還元剤としては、ジチオスレイトール(Dithiothreitol, DTT)が挙げられ、有機リン酸化合物としてはTCEP(Tris[2-carboxyethyl]phosphine)が挙げられる。さらに、チオグリコール酸及びその塩類、システイン及びその塩類、亜硫酸塩などの還元剤に、アンモニア、モノエタノールアミン、炭酸水素アンモニウム、水酸化ナトリウムなどのアルカリ剤を併用して用いてもよい。 In the case of combining the reducing agent treatment, the reducing agent is not particularly limited as long as it is a reducing agent that can be used in the immunostimulation method. For example, any reducing agent may be used as long as it can cleave the SS bond in the protein. Specific examples include mercapto-based reducing agents, aromatic thiol-based reducing agents, organophosphate compounds, and / or pyruvate amide-based reducing agents. Examples of the mercapto-based reducing agent include mercaptoethanol, and more specifically, 2-mercaptoethanol and / or 2-mercaptoethanolamine. Examples of the aromatic thiol-based reducing agent include dithiothreitol (DTT), and examples of the organic phosphate compound include TCEP (Tris [2-carboxyethyl] phosphine). Further, an alkaline agent such as ammonia, monoethanolamine, ammonium hydrogen carbonate, sodium hydroxide or the like may be used in combination with a reducing agent such as thioglycolic acid and salts thereof, cysteine and salts thereof, and sulfite.
界面活性剤処理を組み合わせる場合、免疫賦活化法に使用可能な界面活性剤処理であればよく、特に限定されないが、例えば加熱処理液中に界面活性剤を混入する手法が知られている。界面活性剤は、非イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤のほか、陰イオン性界面活性剤であってもよい。具体的には、ポリオキシエチレン(9)オクチルフェニルエーテル (NP-40, IgepalCA630)、ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウレート (Tween20)、 ポリオキシエチレン(10)オクチルフェニルエーテル (Triton-X-100)、ポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレン縮合物 (Pluronic F68)、3-(1-ピリジニオ)-1-プロパンスルホン酸 (NDSB 201)などを加熱処理溶液に加え、処理することができる。 In the case of combining the surfactant treatment, any surfactant treatment that can be used in the immunostimulation method may be used, and is not particularly limited. For example, a technique of mixing a surfactant in a heat treatment solution is known. The surfactant may be a nonionic surfactant, an amphoteric surfactant, or an anionic surfactant. Specifically, polyoxyethylene (9) octylphenyl ether (NP-40, Igepal CA630), polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate (Tween20), polyoxyethylene (10) octylphenyl ether (Triton-X- 100), polyoxyethylene-polyoxypropylene condensate (Pluronic F68), 3- (1-pyridinio) -1-propanesulfonic acid (NDSB 201) and the like can be added to the heat treatment solution for treatment.
上記目的抗原物質の賦活化処理後に、目的抗原物質に対して、目的抗原物質を認識する抗体(一次抗体)を作用させ、抗原抗体反応をさせる。一次抗体は、目的抗原物質に応じて用いることができ、自体公知の一次抗体、特に既に市販されている抗体などを使用することができる。さらに、一次抗体を認識可能であり、標識された二次抗体を用いて抗原抗体反応させ標識を検出することにより、目的抗原物質を検出することができる。 After the activation process of the target antigen substance, an antibody that recognizes the target antigen substance (primary antibody) is allowed to act on the target antigen substance to cause an antigen-antibody reaction. The primary antibody can be used according to the target antigenic substance, and a primary antibody known per se, particularly an antibody already on the market, can be used. Furthermore, the primary antibody can be recognized, and the target antigenic substance can be detected by detecting the label by causing an antigen-antibody reaction using the labeled secondary antibody.
本発明は、上記賦活化方法により処理したパラフィン包埋後の標本を免疫組織化学染色により分析する組織又は細胞の分析方法にも及ぶ。 The present invention also extends to a tissue or cell analysis method for analyzing a paraffin-embedded specimen treated by the above activation method by immunohistochemical staining.
以下に本発明の実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではなく、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲内で種々の応用が可能である。 Examples of the present invention will be described below in more detail, but the present invention is not limited to these, and various applications are possible without departing from the technical idea of the present invention. It is.
(実施例1)乳癌組織におけるCyclinD1の免疫組織化学染色
1)乳癌組織について、一般的な手法に従ってパラフィン包埋による標本を作製し、ミクロトームを用いて薄切切片を作製した。
2)作製した薄切切片について、キシレン100%-5分、100%-5分、100%-5分、メタノール100%-5分、100%-5分、100%-5分で処理し、脱パラフィン操作行った。その後、流水で5分間洗浄し、前処理試料を得た。
(Example 1) Immunohistochemical staining of Cyclin D1 in breast cancer tissue 1) For breast cancer tissue, a specimen prepared by paraffin embedding was prepared according to a general method, and a thin slice was prepared using a microtome.
2) About the prepared sliced sections, treated with xylene 100% -5 minutes, 100% -5 minutes, 100% -5 minutes, methanol 100% -5 minutes, 100% -5 minutes, 100% -5 minutes, Deparaffinization operation was performed. Thereafter, the sample was washed with running water for 5 minutes to obtain a pretreated sample.
3)加熱による抗原賦活化処理
上記により得た前処理試料について、加熱処理を行った。加熱処理は、前記前処理試料(スライドガラス)を、10mMクエン酸緩衝液(pH 7.0)+界面活性剤(IgepalCA630)0.5%(v/v)溶液の入ったバット中に浸し、121℃で15分間オートクレーブを行った。
3) Antigen activation treatment by heating The pretreated sample obtained above was subjected to a heat treatment. In the heat treatment, the pretreated sample (slide glass) was immersed in a vat containing 10 mM citrate buffer (pH 7.0) + surfactant (IgepalCA630) 0.5% (v / v) solution at 121 ° C. And autoclaving for 15 minutes.
4)緩慢冷却工程の有無による分類
その後、a)自然冷却による緩慢冷却工程30分及びリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を用いた各々5分ずつ3回の洗浄工程あり、又はb)緩慢冷却工程及び洗浄なし、の各試料に分類した。
4) Classification according to the presence or absence of a slow cooling step. After that, there are a) 30 minutes of slow cooling step by natural cooling and 3 washing steps of 5 minutes each using phosphate buffered saline (PBS), or b) slow cooling. Each sample was classified into a process and no washing.
5)H2O2・メタノール処理
上記a)又はb)の各試料を、内因性ペルオキシダーゼの抑制操作のために、3% H2O2(30% H2O2 15mL+メタノール135mL)150mLを含むバット中に15分間静置した。再度、PBSを用いて各々5分ずつ3回洗浄した。洗浄処置後、組織が乾かないよう注意して、ティッシュペーパーで周囲のPBSをよく拭った。
5) H 2 O 2 / methanol treatment Each sample of a) or b) above contains 150 mL of 3% H 2 O 2 (15 mL of 30% H 2 O 2 +135 mL of methanol) for the suppression of endogenous peroxidase. It was left in the bat for 15 minutes. Again, it was washed 3 times with PBS for 5 minutes each. After the washing treatment, care was taken not to dry the tissue, and the surrounding PBS was thoroughly wiped with tissue paper.
6)免疫組織化学染色
免疫組織化学染色用キット(UltraTech HRP Streptavidin-Biotin Detection System(Beckman Coulter社))に含まれるブロッキング液を上記試料に滴下し、室温で10分間静置した。その後、ブロッキング剤を除き、一次抗体を試料に加えた。抗CyclinD1マウスモノクローナル抗体(Dako社、クローン:DCS−6、40倍希釈)を用い、抗体溶液100μLずつを試料にかけ、室温で60分間静置した。
6) Immunohistochemical staining A blocking solution contained in an immunohistochemical staining kit (UltraTech HRP Streptavidin-Biotin Detection System (Beckman Coulter)) was dropped onto the sample and allowed to stand at room temperature for 10 minutes. Thereafter, the blocking agent was removed and the primary antibody was added to the sample. Using an anti-Cyclin D1 mouse monoclonal antibody (Dako, clone: DCS-6, 40-fold dilution), 100 μL of the antibody solution was applied to the sample and allowed to stand at room temperature for 60 minutes.
その後、PBSを用いて各々5分ずつ3回洗浄し、上記免疫組織化学染色用キットに含まれるビオチン標識二次抗体を加えて室温で10分間静置した。PBSを用いて各々5分ずつ3回洗浄し、酵素標識ストレプトアビジン液を加えて室温で10分間静置した。PBSを用いて各々5分ずつ3回洗浄し、ジアミノベンチジン(DAB)発色液を加えて室温で1〜5分間で発色を確認した。PBSにて発色停止後、流水で5分間洗浄し、ヘマトキシリンを用いて20秒間染色を行った。50℃で1分間発色し、流水で1分間洗浄、脱水透徹(メタノール100%-5分、100%-5分、100%-5分、キシレン100%-5分、100%-5分、100%-5分)し、封入した。 Thereafter, the plate was washed three times for 5 minutes each with PBS, the biotin-labeled secondary antibody contained in the kit for immunohistochemical staining was added, and allowed to stand at room temperature for 10 minutes. The plate was washed 3 times for 5 minutes each with PBS, added with enzyme-labeled streptavidin solution and allowed to stand at room temperature for 10 minutes. The plate was washed 3 times for 5 minutes each with PBS, and diaminobenzidine (DAB) coloring solution was added to confirm color development at room temperature for 1 to 5 minutes. After color development was stopped with PBS, the plate was washed with running water for 5 minutes and stained with hematoxylin for 20 seconds. Colored at 50 ° C for 1 minute, washed with running water for 1 minute, dehydrated (100% -5 minutes, 100% -5 minutes, 100% -5 minutes, xylene 100% -5 minutes, 100% -5 minutes, 100% % -5 minutes) and enclosed.
組織は、光学顕微鏡により観察した。その結果を図1に示した。 The tissue was observed with an optical microscope. The results are shown in FIG.
(実施例2)マントル細胞リンパ腫のリンパ節組織におけるbcl-6の免疫組織化学染色
マントル細胞リンパ腫のリンパ節組織について、a)緩慢冷却工程及び洗浄工程あり、又はb)緩慢冷却工程及び洗浄なし、の各試料に分類し、処理を行った。
(Example 2) Immunohistochemical staining of bcl-6 in lymph node tissue of mantle cell lymphoma For the lymph node tissue of mantle cell lymphoma, a) with slow cooling step and washing step, or b) slow cooling step and without washing, Each sample was classified and processed.
a)に関しては、実施例1と同様に1)の操作を行った後、自動染色機(ベンタナXTシステム ベンチマーク、ベンタナ社製)を用いて、実施例1の2)〜6)に該当する操作を自動で行い、免疫組織化学染色を行った。各処理は、以下の手順で行った。加熱処理は、1mM EDTA液(pH 8.5)を用いて、95℃38分+100℃64分行ったのち、自動染色機内のプラグラムによる緩慢冷却・洗浄工程→過酸化水素(H2O2)水処理→洗浄→ブロッキング→一次抗体→ストレプトアビジン、ビオチンブロック→洗浄→二次抗体→ストレプトアビジン結合HRP(Horseradish peroxidase)→DAB発色→ヘマトキシリン染色を自動で行った。 Regarding a), after performing the operation of 1) in the same manner as in Example 1, using an automatic dyeing machine (Ventana XT system benchmark, manufactured by Ventana), operations corresponding to 2) to 6) of Example 1 Was performed automatically and immunohistochemical staining was performed. Each treatment was performed according to the following procedure. The heat treatment is carried out using 1 mM EDTA solution (pH 8.5) at 95 ° C. for 38 minutes + 100 ° C. for 64 minutes, followed by a slow cooling / washing process by a program in an automatic dyeing machine → hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) water treatment ->Washing->Blocking-> Primary antibody-> Streptavidin, biotin block->Wash-> Secondary antibody-> Streptavidin-binding HRP (Horseradish peroxidase)-> DAB color development-> Hematoxylin staining was automatically performed.
b)に関しては、実施例1と同様に1)〜2)の操作を行って前処理試料を得、同様に3)の加熱処理、5)H2O2・メタノール処理、及び6)免疫組織化学染色を行い、封入した。 With regard to b), pretreatment samples were obtained by performing the operations 1) to 2) in the same manner as in Example 1, and 3) heat treatment, 5) H 2 O 2 / methanol treatment, and 6) immune tissue. Chemical staining was performed and encapsulated.
a)及びb)について、免疫組織化学染色のための一次抗体に、抗bcl-6マウスモノクローナル抗体(Dako社、クローン:PG−B6p、20倍希釈)を用いた。
組織の観察は、実施例1と同手法により行った。その結果を、図2に示した。
For a) and b), an anti-bcl-6 mouse monoclonal antibody (Dako, clone: PG-B6p, diluted 20-fold) was used as the primary antibody for immunohistochemical staining.
The structure was observed by the same method as in Example 1. The results are shown in FIG.
(実施例3)乳癌組織におけるAndrogen Receptor(AR)の免疫組織化学染色
乳癌組織について、a)緩慢冷却工程及び洗浄工程あり、又はb)緩慢冷却工程及び洗浄なし、の各試料に分類し、処理を行った。
a)に関しては、実施例2と同様に、1)の操作を行った後、自動染色機(ベンタナHXシステム・ディスカバリー/XT)を用いて染色した。b)に関しては、実施例1と同様に1)〜2)の操作を行い、前処理試料を得、同様に3)の加熱処理、5)H2O2・メタノール処理、及び6)免疫組織化学染色を行い、封入した。
Example 3 Androgen Receptor (AR) Immunohistochemical Staining in Breast Cancer Tissue Breast cancer tissue is classified into a) a slow cooling step and a washing step, or b) a slow cooling step and no washing, and processed. Went.
Regarding a), in the same manner as in Example 2, after performing the operation of 1), staining was performed using an automatic dyeing machine (Ventana HX System Discovery / XT). Regarding b), do the same way 1) to 2) as in Example 1 to obtain a pre-treated sample, as well as 3) heat treatment, 5) H 2 O 2 · methanol treatment, and 6) Immunohistochemistry Chemical staining was performed and encapsulated.
a)及びb)について、免疫組織化学染色のための一次抗体に、抗ARマウスモノクローナル抗体(Dako社、クローン:AR441、50倍希釈)を用いた。
組織の観察は、実施例1と同手法により行った。その結果を、図3に示した。
For a) and b), an anti-AR mouse monoclonal antibody (Dako, clone: AR441, 50-fold dilution) was used as the primary antibody for immunohistochemical staining.
The structure was observed by the same method as in Example 1. The results are shown in FIG.
(実施例4)乳癌組織におけるCyclinD1の免疫組織化学染色
乳癌組織について、a)自然冷却による緩慢冷却工程及び洗浄工程あり、又はb)緩慢冷却工程及び洗浄工程なし、の各試料に分類し、処理を行った。
実施例1と同様に1)〜2)の操作を行い、前処理試料を得、同様に3)の加熱処理、4)a)緩慢冷却工程及び洗浄工程あり、又はb)緩慢冷却工程及び洗浄工程なし、の各試料に分類し、処理した。5)H2O2水処理には、上記a)又はb)の各試料を、内因性ペルオキシダーゼの抑制操作のために、3% H2O2水(30% H2O2 15mL+蒸留水135mL)150mLを含むバット中に15分間静置した。再度、PBSを用いて各々5分ずつ3回洗浄した。さらに6)免疫組織化学染色を行い、封入した。
(Example 4) Immunohistochemical staining of CyclinD1 in breast cancer tissue For breast cancer tissue, the samples were classified into a) a slow cooling step and a washing step by natural cooling, or b) a slow cooling step and no washing step, and processed. Went.
1) to 2) are performed in the same manner as in Example 1 to obtain a pretreated sample, and similarly 3) heat treatment, 4) a) slow cooling step and washing step, or b) slow cooling step and washing. Each sample was classified and processed without processing. 5) For H 2 O 2 water treatment, each sample of a) or b) above was treated with 3% H 2 O 2 water (15 mL of 30% H 2 O 2 +135 mL of distilled water) for the operation of suppressing endogenous peroxidase. ) It was allowed to stand for 15 minutes in a vat containing 150 mL. Again, it was washed 3 times with PBS for 5 minutes each. Furthermore, 6) immunohistochemical staining was performed and encapsulated.
a)及びb)について、免疫組織化学染色のための一次抗体に、抗CyclinD1マウスモノクローナル抗体(Dako社、クローン:DCS−6、40倍希釈)を用いた。 組織の観察は、実施例1と同手法により行った。その結果を、図4に示した。 For a) and b), an anti-Cyclin D1 mouse monoclonal antibody (Dako, clone: DCS-6, 40-fold dilution) was used as the primary antibody for immunohistochemical staining. The structure was observed by the same method as in Example 1. The results are shown in FIG.
(実施例5)乳癌組織におけるCyclinD1の免疫組織化学染色
乳癌組織について、a)自然冷却による緩慢冷却工程及び洗浄工程あり、b)緩慢冷却工程及び洗浄工程なし、加熱処理後5%(w/v)シュウ酸水による急速冷却処理、およびc)緩慢冷却工程及び洗浄工程なし、加熱処理後10mM EDTA(pH 8)による急速冷却処理、の各試料に分類し、処理を行った。
(Example 5) Immunohistochemical staining of Cyclin D1 in breast cancer tissue For breast cancer tissue, a) with slow cooling step and washing step by natural cooling, b) without slow cooling step and washing step, 5% after heat treatment (w / v The samples were classified into the following samples: a) rapid cooling treatment with oxalic acid water, and c) no slow cooling step and washing step, and after the heat treatment, rapid cooling treatment with 10 mM EDTA (pH 8).
実施例1と同様に1)〜2)の操作を行い、前処理試料を得、同様に3)の加熱処理、4)a)緩慢冷却工程及び洗浄工程あり、b)緩慢冷却工程及び洗浄工程なし、加熱処理後5%(w/v)シュウ酸水による急速冷却処理1分間、およびc)緩慢冷却工程及び洗浄工程なし、加熱処理後10mM EDTA(pH 8)による急速冷却処理1分間、の各試料に分類し、処理した。5)H2O2・メタノール処理には、上記a)、b)又はc)の各試料を、内因性ペルオキシダーゼの抑制操作のために、3% H2O2メタノール(30% H2O2 15mL+メタノール135mL)150mLを含むバット中に15分間静置した。再度、PBSを用いて各々5分ずつ3回洗浄した。さらに6)免疫組織化学染色を行い、封入した。 1) to 2) are performed in the same manner as in Example 1 to obtain a pretreated sample, and similarly 3) heat treatment, 4) a) a slow cooling step and a washing step, b) a slow cooling step and a washing step. None, rapid cooling treatment with 5% (w / v) oxalic acid water for 1 minute after heat treatment, and c) no slow cooling step and washing step, rapid cooling treatment with 10 mM EDTA (pH 8) for 1 minute after heat treatment Each sample was classified and processed. 5) For the H 2 O 2 · methanol treatment, each sample of a), b) or c) above was treated with 3% H 2 O 2 methanol (30% H 2 O 2 ) for endogenous peroxidase suppression. It was allowed to stand for 15 minutes in a vat containing 150 mL of 15 mL + 135 mL methanol. Again, it was washed 3 times with PBS for 5 minutes each. Furthermore, 6) immunohistochemical staining was performed and encapsulated.
a)、b)及びc)について、免疫組織化学染色のための一次抗体に、抗CyclinD1マウスモノクローナル抗体(Dako社、クローン:DCS−6、40倍希釈)を用いた。 組織の観察は、実施例1と同手法により行った。その結果を、図5に示した。 For a), b) and c), anti-Cyclin D1 mouse monoclonal antibody (Dako, clone: DCS-6, 40-fold dilution) was used as the primary antibody for immunohistochemical staining. The structure was observed by the same method as in Example 1. The results are shown in FIG.
(実施例6)乳癌組織におけるARの免疫組織化学染色
乳癌組織について、a)自然冷却による緩慢冷却工程及び洗浄工程あり、b)緩慢冷却工程及び洗浄工程なし、c)緩慢冷却工程及び洗浄工程なし、加熱処理後0.05%(w/v)シュウ酸・0.1%(v/v)Tween20−Tris-Buffered Saline(TBS)による急速冷却処理、d)緩慢冷却工程及び洗浄工程なし、加熱処理後0.1%(v/v)Tween20−TBSによる急速冷却処理、e)緩慢冷却工程及び洗浄工程なし、加熱処理後0.05%(w/v)シュウ酸−PBSによる急速冷却処理、f)緩慢冷却工程及び洗浄工程なし、加熱処理後0.05%(w/v)EDTA・0.1%(v/v)Tween20−TBSによる急速冷却処理、g)緩慢冷却工程及び洗浄工程なし、加熱処理後0.05%(w/v)EDTA−PBSによる急速冷却処理、h)緩慢冷却工程及び洗浄工程なし、加熱処理後10mM EDTA(pH 8)による急速冷却処理、i)緩慢冷却工程及び洗浄工程なし、加熱処理後0.1%(v/v)Tween20-Tris-EDTA(pH 9)による急速冷却処理、j)緩慢冷却工程及び洗浄工程なし、加熱処理後PBSによる急速冷却処理、k)緩慢冷却工程及び洗浄工程なし、加熱処理後5%(w/v)スキムミルク(森永乳業株式会社)による急速冷却処理、又はl)緩慢冷却工程及び洗浄工程なし、加熱処理後水道水による急速冷却処理、の各試料に分類し、処理を行った。
(Example 6) Immunohistochemical staining of AR in breast cancer tissue For breast cancer tissue, a) slow cooling step and washing step by natural cooling, b) slow cooling step and no washing step, c) slow cooling step and no washing step After heat treatment, 0.05% (w / v) oxalic acid, 0.1% (v / v) Tween20-Tris-Buffered Saline (TBS) rapid cooling treatment, d) Without slow cooling and washing steps, heating After treatment, rapid cooling treatment with 0.1% (v / v) Tween20-TBS, e) Without slow cooling step and washing step, after heat treatment, 0.05% (w / v) rapid cooling treatment with oxalic acid-PBS, f) No slow cooling and washing steps, after heat treatment 0.05% (w / v) EDTA / 0.1% (v / v) Tween20-TBS rapid cooling treatment, g) No slow cooling and washing steps , Rapid cooling treatment with 0.05% (w / v) EDTA-PBS after heat treatment, ) No slow cooling step and washing step, after heat treatment, rapid cooling treatment with 10 mM EDTA (pH 8), i) No slow cooling step and washing step, after heat treatment, 0.1% (v / v) Tween20-Tris-EDTA (Rapid cooling treatment with pH 9) j) No slow cooling step and washing step, after heat treatment with PBS, rapid cooling treatment with PBS, k) No slow cooling step and washing step, 5% (w / v) skim milk after heat treatment ( Morinaga Milk Industry Co., Ltd.) was classified into each sample of rapid cooling treatment, or l) no slow cooling step and washing step, and rapid cooling treatment with tap water after heat treatment.
実施例1と同様に1)〜2)の操作を行い、前処理試料を得、同様に3)の加熱処理、4)a)緩慢冷却工程及び洗浄工程あり、b)緩慢冷却工程及び洗浄工程なし、c)緩慢冷却工程及び洗浄工程なし、加熱処理後0.05%(w/v)シュウ酸・0.1%(v/v)Tween20−TBSによる急速冷却処理1分、d)緩慢冷却工程及び洗浄工程なし、加熱処理後0.1%(v/v)Tween20−TBSによる急速冷却処理1分、e)緩慢冷却工程及び洗浄工程なし、加熱処理後0.05%(w/v)シュウ酸−PBSによる急速冷却処理1分、f)緩慢冷却工程及び洗浄工程なし、加熱処理後0.05%(w/v)EDTA・0.1%(v/v)Tween20−TBSによる急速冷却処理1分、g)緩慢冷却工程及び洗浄工程なし、加熱処理後0.05%(w/v)EDTA−PBSによる急速冷却処理1分、h)緩慢冷却工程及び洗浄工程なし、加熱処理後10mM EDTA(pH 8)による急速冷却処理1分、i)緩慢冷却工程及び洗浄工程なし、加熱処理後0.1%(v/v)Tween20-Tris-EDTA(pH 9)による急速冷却処理1分、j)緩慢冷却工程及び洗浄工程なし、加熱処理後PBSによる急速冷却処理1分、k)緩慢冷却工程及び洗浄工程なし、加熱処理後5%(w/v)スキムミルクによる急速冷却処理1分、又はl)緩慢冷却工程及び洗浄工程なし、加熱処理後水道水による急速冷却処理1分、の各試料に分類し、処理した。5)H2O2・メタノール処理には、上記a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、i)、j)、k)又はl)の各試料を、内因性ペルオキシダーゼの抑制操作のために、3% H2O2メタノール(30% H2O2 15mL+メタノール135mL)150mLを含むバット中に15分間静置した。再度、PBSを用いて各々5分ずつ3回洗浄した。さらに6)免疫組織化学染色を行い、封入した。 1) to 2) are performed in the same manner as in Example 1 to obtain a pretreated sample, and similarly 3) heat treatment, 4) a) a slow cooling step and a washing step, b) a slow cooling step and a washing step. None, c) No slow cooling and washing steps, after heat treatment 0.05% (w / v) oxalic acid 0.1% (v / v) Tween20-TBS rapid cooling treatment for 1 minute, d) slow cooling No process and washing step, 0.1% after heat treatment (v / v) 1 minute rapid cooling with Tween20-TBS, e) No slow cooling step and washing step, 0.05% after heat treatment (w / v) Rapid cooling treatment with oxalic acid-PBS for 1 minute, f) No slow cooling step and washing step, after heat treatment, 0.05% (w / v) EDTA / 0.1% (v / v) Tween20-TBS rapid cooling Treatment 1 min, g) No slow cooling and washing steps, after heat treatment 0.05% (w / v) EDTA-PBS rapid cooling 1 min h) Without slow cooling and washing steps, after heat treatment, 1 minute rapid cooling with 10 mM EDTA (pH 8) i) Without slow cooling and washing steps, after heat treatment 0.1% (v / v) Tween20- Rapid cooling treatment with Tris-EDTA (pH 9) for 1 minute, j) No slow cooling step and washing step, rapid cooling treatment with PBS after heat treatment for 1 minute, k) No slow cooling step and washing step, 5% after heating treatment (w / v) Rapid cooling treatment with skim milk for 1 minute, or l) No slow cooling step and washing step, and rapid cooling treatment with tap water after heat treatment for 1 minute. 5) For H 2 O 2 / methanol treatment, each of the above a), b), c), d), e), f), g), h), i), j), k) or l) The sample was placed in a vat containing 150 mL of 3% H 2 O 2 methanol (15 mL of 30% H 2 O 2 +135 mL of methanol) for 15 minutes for endogenous peroxidase suppression. Again, it was washed 3 times with PBS for 5 minutes each. Furthermore, 6) immunohistochemical staining was performed and encapsulated.
a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、i)、j)、k)又はl)について、免疫組織化学染色のための一次抗体に、抗ARマウスモノクローナル抗体(Dako社、クローン:AR441、50倍希釈)を用いた。
組織の観察は、実施例1と同手法により行った。a)、b)又はc)の結果を、図6に示した。
Anti-AR for primary antibody for immunohistochemical staining for a), b), c), d), e), f), g), h), i), j), k) or l) A mouse monoclonal antibody (Dako, clone: AR441, 50-fold dilution) was used.
The structure was observed by the same method as in Example 1. The results of a), b) or c) are shown in FIG.
以上詳述したように、本発明の目的抗原物質の賦活化方法によると、加熱処理後の緩慢冷却工程及び緩衝液による洗浄工程を省略することができる。これにより、抗原賦活化工程に要する時間が、約45分間短縮でき、さらに抗原タンパク質の染色感度も上昇させることができる。本方法により、組織又は細胞の病理学的分析のための標本作製の自動装置において、機械を単純化することができる。また、手動の場合には、標本作製に要する時間の短縮により、効率的に免疫組織化学染色による検査を遂行することができる。従って、より効果的な免疫組織化学染色を行うことができ、組織又は細胞の病理学的分析を正確に行うことができる。さらに、本発明の免疫賦活化方法は、病理学的分析機関や医療の基礎的研究分野において利用することができる。 As described above in detail, according to the method for activating the target antigenic substance of the present invention, the slow cooling step after the heat treatment and the washing step with the buffer solution can be omitted. As a result, the time required for the antigen activation step can be shortened by about 45 minutes, and the staining sensitivity of the antigen protein can be increased. This method allows the machine to be simplified in an automated device for specimen preparation for the pathological analysis of tissue or cells. In the case of manual operation, examination by immunohistochemical staining can be efficiently performed by shortening the time required for specimen preparation. Therefore, more effective immunohistochemical staining can be performed, and pathological analysis of tissues or cells can be performed accurately. Furthermore, the immunostimulation method of the present invention can be used in pathological analysis institutions and medical basic research fields.
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