JP2010008054A - 多光子励起測定装置 - Google Patents

Abstract

【課題】高いレーザ技術や熟練を要することなく、取り扱いが容易な短パルス光源を用いて、試料に対して、よりピーク強度が高く、時間幅の短い光パルスを安定して照射でき、試料を容易に高精度で測定できる多光子励起測定装置を提供する。
【解決手段】光パルスを出射する短パルス光源2と、短パルス光源2から出射された光パルスを試料20に照射する照射光学系17,18,19と、光パルスの照射により試料20から発生する多光子励起にともなう信号光を検出する検出器24と、光ファイバ4の光強度依存の非線形効果を利用して、試料20に照射される光パルスのパルス幅を、短パルス光源2から出射される光パルスのパルス幅以下に短くし、かつ、試料20に照射される光パルスのスペクトル幅を、短パルス光源2から出射される光パルスのスペクトル幅より広くするように、パルス幅圧縮を行う光パルス圧縮手段4,13と、を有する。
【選択図】図１

Description

本発明は、ピーク光強度の高い短パルス光を試料に照射して、多光子吸収現象を用いて試料を測定する多光子励起測定装置に関するものである。

従来の多光子励起測定装置として、例えば、図６に示すような多光子励起顕微鏡システムが知られている（例えば、特許文献１参照）。この多光子励起顕微鏡システムにおいては、チタン・サファイアレーザを有する短パルスレーザ光源１０１から、パルス幅が約１００ｆｓで、空間分布がほぼ真円の光パルスＩを出射させ、この光パルスＩを、自由空間を伝播させてプレチャーピング・ユニット１０２に入射させている。

プレチャーピング・ユニット１０２は、４個の回折格子１２１，１２２，１２３，１２４を有しており、入射した光パルスＩは、先ず、回折格子１２１により光パルスＩの波長成分毎に、図６の紙面内で異なる角度方向に回折されて反射される。なお、図６の紙面垂直方向における回折格子１２１による光パルスＩの波長成分での反射の角度方向は、一定である。次に、光パルスＩは、回折格子１２２で同様に波長成分毎に回折されて反射される。この回折格子１２２で回折された後の光パルスＩの空間分布は、光パルスＩの伝播方向から見たとき、図６の紙面上下方向を長軸とする楕円となっている。その後、光パルスＩは、回折格子１２１，１２２と同様に、回折格子１２３，１２４で順次回折されて反射され、再びほぼ真円の空間分布となってプレチャーピング・ユニット１０２から出射される。

このように、プレチャーピング・ユニット１０２において、光パルスＩを４個の回折格子１２１，１２２，１２３，１２４で順次回折させることにより、光パルスＩの時間幅は、波長成分による伝播距離の違いにより、プレチャーピング・ユニット１０２の前後において、光パルスＩの波長成分の短波長成分が時間的に前方に、長波長側が後方に拡げられる。このような状態の光パルスは、一般にチャープパルスと呼ばれている。図６には、光パルスＩの概略の時間波形も、横軸を時間、縦軸を光強度として示している。

プレチャーピング・ユニット１０２から出射された光パルスＩは、自由空間を伝播して、結合素子１０３を経てシングルモード光ファイバ１０４に入射される。シングルモード光ファイバ１０４は、波長分散と呼ばれる波長での伝播速度の違いがあり、材料等で決まるゼロ分散波長を境に、正常分散領域と異常分散領域とに区別される。正常分散領域では、光の伝播速度は長波長の方が短波長よりも早く、異常分散領域ではその逆である。ここでは、シングルモード光ファイバ１０４は、光パルスＩの波長に対して正常分散する。したがって、短波長成分の方が時間的に進んでいる光パルスＩは、このシングルモード光ファイバ１０４を伝播することにより、時間的に後方であった長波長成分が前方であった短波長成分に追いつき、短パルスレーザ光源１０１から発振された時と近い時間波形となる。

シングルモード光ファイバ１０４を伝播した光パルスＩは、顕微鏡１０５へ入射される。顕微鏡１０５に入射された光パルスＩは、先ず、結合光学系１５１により光パルスＩの空間分布が拡大されて平行光化される。なお、結合光学系１５１における光パルスＩの集光点位置には、ピンホール１５２が配置され、これにより光パルスＩの雑光成分が除去される。その後、光パルスＩは、ダイクロイックミラー１５３で反射されて、結像光学系１５５により試料１５６に集光される。なお、試料１５６上の光パルスＩの集光点は、走査ユニット１５４により、結像光学系１５５の光軸と垂直な面内で走査される。

光パルスＩが試料１５６に照射されると、試料１５６内の色素あるいは蛍光物質は、多光子励起されて蛍光を発する。この試料１５６で発生した蛍光は、光パルスＩの入射方向と反対に伝播して、結像光学系１５５および走査ユニット１５４を経てダイクロイックミラー１５３に入射して、該ダイクロイックミラー１５３を透過する。そして、ダイクロイックミラー１５３を透過した蛍光は、検出用の結像光学系１５７によりピンホール１５８に結像された後、検出器１５９に入射して、信号として検出される。なお、ピンホール１５８は、試料１５６の光軸方向の分解能を高める機能を有している。このような多光子励起顕微鏡システムは、一般に、共焦点型レーザ走査多光子励起蛍光顕微鏡システムと呼ばれている。

特開平１１−２１８４９０号公報

図６に示したような多光子励起顕微鏡システムでは、試料内の色素あるいは蛍光物質が多光子励起される励起効率は、照射される光パルスのピーク強度の２乗に比例する。すなわち、同じ光パルスエネルギーであれば、より短時間のパルス幅であるほうが光パルスのピーク強度が高く、より強い蛍光を発生させることができる。

したがって、多光子励起を行う場合は、試料上で如何に高いピーク強度の光パルスを得るかが重要となる。しかも、特に生物試料の場合は、光照射による損傷を避けるために、小さいエネルギーの照射に抑える必要がある。そのためには、より時間幅の短い光パルスを試料に照射する必要がある。

しかしながら、光ファイバのような物質を光パルスが伝播すると、物質の持つ波長毎での伝播速度が異なる分散効果により、パルス幅が拡大し、分散方向の違いによるが、光パルスの時間軸で前方と後方とで波長が異なることになる。また、光ファイバのような物質には、非線形効果があるため、ピーク強度の非常に高い光パルスが入射すると、物質の非線形効果により光パルスの波長分布が変化する自己位相変調と呼ばれる現象によって、光パルスが崩れてしまうことになる。

このため、図６に示した従来の多光子励起顕微鏡システムでは、短パルスレーザ光源１０１と、光ファイバであるシングルモードファイバ１０４との間にプレチャーピング・ユニット１０２を挿入して、光パルスの時間幅を拡大することにより、ピーク強度を下げて自己位相変調の発生を抑制している。また、シングルモードファイバ１０４の分散が加わることを予測して、拡大した光パルスの再圧縮を行って、顕微鏡１０５にピーク強度の高い光パルスを入射させるようにしている。このため、短パルスレーザ光源１０１が出射する光パルスＩの時間幅（ｔ１）と、顕微鏡１０５内の試料１５６上での光パルスＩの時間幅（ｔ２）との関係は、ｔ１≦ｔ２となっている。ただし、ｔ１＝ｔ２は、理想状態での条件であり、殆どはｔ１＜ｔ２となっている。

このようなことから、従来の構成では、同一の光パルスエネルギーで見たとき、多光子励起の効率が高くなる、よりピーク強度が高く、時間幅が短い光パルスを得るには、短パルスレーザ光源自体から、より時間幅の短い光パルスを出射させる必要がある。

しかし、このような短パルスレーザ光源は、動作が非常に不安定であり、取り扱いには、高いレーザ技術や熟練を要する。このため、試料を高精度で測定することが困難になることが懸念される。

したがって、かかる点に鑑みてなされた本発明の目的は、高いレーザ技術や熟練を要することなく、取り扱いが容易な短パルス光源を用いて、試料に対して、よりピーク強度が高く、時間幅の短い光パルスを安定して照射でき、試料を容易に高精度で測定できる多光子励起測定装置を提供することにある。

上記目的を達成する請求項１に係る発明は、高強度の光パルスによる多光子吸収現象を用いて試料の測定を行う多光子励起測定装置であって、
光パルスを出射する短パルス光源と、
前記短パルス光源から出射された光パルスを試料に照射する照射光学系と、
前記光パルスの照射により前記試料から発生する多光子励起にともなう信号光を検出する検出器と、
前記短パルス光源と前記照射光学系との間に配置され、前記短パルス光源から出射された光パルスを伝播する光ファイバを含み、該光ファイバの光強度依存のスペクトル変化を及ぼす非線形効果を利用して、前記試料に照射される光パルスのパルス幅を、前記短パルス光源から出射される光パルスのパルス幅以下に短くし、かつ、前記試料に照射される光パルスのスペクトル幅を、前記短パルス光源から出射される光パルスのスペクトル幅より広くするように、パルス幅圧縮を行う光パルス圧縮手段と、
を有することを特徴とするものである。

請求項２に係る発明は、請求項１に記載の多光子励起測定装置において、
前記光パルス圧縮手段は、
前記光ファイバが、前記短パルス光源から出射される光パルスに対して、スペクトル幅を拡大するとともに、正の群速度分散を与えるシングルモード光ファイバからなり、
さらに、前記シングルモード光ファイバを伝播した光パルスに対して負の群速度分散を与える負の分散補償手段を有する、
ことを特徴とするものである。

請求項３に係る発明は、請求項２に記載の多光子励起測定装置において、
前記負の分散補償手段は、回折格子対、プリズム対、グリズム対のいずれかを有することを特徴とするものである。

請求項４に係る発明は、請求項１に記載の多光子励起測定装置において、
前記光パルス圧縮手段は、
前記光ファイバが、前記短パルス光源から出射される光パルスに対して、スペクトル幅を拡大するとともに、正の群速度分散を与えるシングルモード光ファイバからなり、
さらに、前記シングルモード光ファイバを伝播した光パルスに対して負の群速度分散を与える断面に中空体を有するシングルモード中空光ファイバを有する、
ことを特徴とするものである。

請求項５に係る発明は、請求項１に記載の多光子励起測定装置において、
前記光パルス圧縮手段は、
前記光ファイバが、前記短パルス光源から出射される光パルスに対して、スペクトル幅を拡大するとともに、負の群速度分散を与えるシングルモード光ファイバからなることを特徴とするものである。

請求項６に係る発明は、請求項１乃至５のいずれか一項に記載の多光子励起測定装置において、
前記短パルス光源から出射する光パルスのパルス幅はピコ秒であり、前記試料に照射する光パルスのパルス幅はフェムト秒であることを特徴とするものである。

請求項７に係る発明は、請求項１乃至６のいずれか一項に記載の多光子励起測定装置において、
前記短パルス光源は、出射する光パルスの繰返し周波数が可変であることを特徴とするものである。

請求項８に係る発明は、請求項１乃至７のいずれか一項に記載の多光子励起測定装置において、
前記短パルス光源は、利得スイッチ半導体レーザを有することを特徴とするものである。

請求項９に係る発明は、請求項１乃至７のいずれか一項に記載の多光子励起測定装置において、
前記短パルス光源は、能動モードロックファイバリングレーザを有することを特徴とするものである。

請求項１０に係る発明は、請求項１に記載の多光子励起測定装置において、
前記光パルス圧縮手段は、着脱自在であることを特徴とするものである。

請求項１１に係る発明は、請求項１乃至１０のいずれか一項に記載の多光子励起観測装置において、
前記多光子励起観測装置は、前記検出器が前記試料から発生する多光子励起にともなう蛍光を検出する多光子励起蛍光顕微鏡システムであることを特徴とするものである。

本発明では、短パルス光源と照射光学系との間に光ファイバを含む光パルス圧縮手段を配置し、光ファイバの光強度依存のスペクトル変化を及ぼす非線形効果を利用して、試料に照射される光パルスのパルス幅を、短パルス光源から出射される光パルスのパルス幅以下に短くし、かつ、試料に照射される光パルスのスペクトル幅を、短パルス光源から出射される光パルスのスペクトル幅より広くするように、パルス幅圧縮を行う。これにより、高いレーザ技術や熟練を要することなく、取り扱いが容易な短パルス光源を用いて、試料に対して、よりピーク強度が高く、時間幅の短い光パルスを安定して照射でき、試料を容易に高精度で測定することができる。

以下、本発明の実施の形態について、多光子励起レーザ走査型蛍光顕微鏡システムを例にとって、図を参照して説明する。

（第１実施の形態）
図１は、本発明の第１実施の形態に係る多光子励起レーザ走査型蛍光顕微鏡システムの要部の構成を示す図である。この多光子励起レーザ走査型蛍光顕微鏡システム１は、短パルス光源２と、レーザ走査型顕微鏡３と、シングルモード光ファイバ４とを有し、短パルス光源２から発振した光パルスを、シングルモード光ファイバ４によりレーザ走査型顕微鏡３に入射させて、試料２０に集光するようになっている。シングルモード光ファイバ４は、その一端部（入射端部）が、短パルス光源２に設けられた光ファイバコネクタ１０に光学的および機械的に着脱自在に接続され、他端部（出射端部）は、レーザ走査型顕微鏡３に設けられた光ファイバコネクタ１１に光学的および機械的に着脱自在に接続される。これにより、短パルス光源２およびレーザ走査型顕微鏡３は、シングルモード光ファイバ４を介して、自由なレイアウトで光学的に接続されるようになっている。

試料２０は、蛍光タンパクが発現した生細胞であり、試料２０に集光された光パルスは、蛍光タンパクでの多光子吸収により励起が行われて蛍光を発する。この蛍光の強度は、２光子励起の場合、励起光パルスの平均光パワーの２乗に比例し、光パルスの時間幅および繰返し周波数に反比例する。

図２は、図１に示した短パルス光源２の一例の要部構成を示す図である。この短パルス光源２は、電気パルス発生器５、半導体レーザ６、シングルモード光ファイバ７、ファイバ増幅器８，９および光ファイバコネクタ１０を有する。

電気パルス発生器５は、数百から数千ピコ秒幅の電気パルスを発生し、この電気パルスにより半導体レーザ６に電流を注入する。本実施の形態では、電気パルス発生器５から発生する電気パルスの繰返し周波数を、変更可能とする。ここでは、電気パルスの繰返し周波数を、１ＭＨｚから２００ＭＨｚ（パルス間隔で、５ｎｓから１μｓ）で変更可能とする。これにより短パルス光源２から出射させる光パルスの繰返し周波数を、容易かつ安定に可変することができる。

半導体レーザ６は、電気パルス発生器５からの電気パルスにより注入される電流によって利得が瞬間的に発生消滅する、いわゆる利得スイッチ動作し、これにより短波長から長波長へと時間的にチャープした数十ピコ秒幅の光パルスを発生する。半導体レーザ６は、例えば、面発光レーザ（ＶＣＳＥＬ）、量子井戸分布帰還型レーザダイオード（ＱＷＤＦＢＬＤ）、量子ドット分布帰還型レーザダイオード（ＱＤＤＦＢＬＤ）が使用可能であるが、本実施の形態ではＶＣＳＥＬを使用する。また、光パルスの波長は、試料２０の多光子励起に適した波長であれば良く、可視から近赤外、赤外光が使用可能であるが、ここでは近赤外の９８０ｎｍ帯とする。

半導体レーザ６から発生した光パルスは、シングルモード光ファイバ７に入射させる。シングルモード光ファイバ７は、入射した光パルスを、正の群速度分散（ＧＶＤ）により長波長側を短波長側より早く伝播してチャープを補正し、これにより数ピコ秒幅のトランスフォームリミット（ＴＬ）な光パルスに変換する。このため、シングルモード光ファイバ７の長さは、単位長さ当たりの群速度分散量と、補正する光パルスのチャープ量とに基づいて設定する。本実施の形態では、このシングルモード光ファイバ７の長さを、約１ｋｍに設定している。

なお、ＴＬな光パルスの時間幅と、その波長の拡がり幅（光スペクトル幅）との積には、最小な値があり、より短い時間幅の光パルスを得るためには、より広い光スペクトル幅が必要となる。本実施の形態では、半導体レーザ６としてＶＣＳＥＬを使用しており、その発振波長の光スペクトル幅は１ｎｍ程度であるので、ＴＬな光パルスの時間幅は、３ｐｓから５ｐｓ程度となる。

シングルモード光ファイバ７を伝播した光パルスは、２つのファイバ増幅器８，９で順次増幅する。ファイバ増幅器８，９は、ファイバレーザまたは半導体レーザで励起され、被励起媒質として、Ｎｄ，Ｙｂ，Ｔｍ，Ｅｒがドープされたシングルクラッドまたはダブルクラッドの光ファイバ、あるいは断面に空隙がある光ファイバを用いる。ここでは、被励起媒質としてＹｂがドープされたシングルクラッド光ファイバを用い、波長９４０ｎｍの半導体レーザを用いて励起して、Ｙｂドープの光ファイバに９８０ｎｍ帯の増幅利得を発生させる。これら２つのファイバ増幅器８，９により、シングルモード光ファイバ７を伝播した光パルスを、平均光強度（平均出力）が数十ｍＷから数Ｗの光パルスに増幅して、光ファイバコネクタ１０を経て短パルス光源２から出力する。

光ファイバコネクタ１０は、ＳＣ型、ＦＣ型、ＳＴ型、ＭＵ型、ＬＣ型の各種コネクタが使用可能であるが、本実施の形態では、ＦＣ型を用いる。

本実施の形態において、短パルス光源２から発生する光パルスは、その平均光強度である平均出力（光パルスエネルギー×繰返し周波数）がほぼ一定であり、パルス幅（光パルスの時間幅）も繰返し周波数でほぼ一定である。したがって、パルス幅が一定で、平均出力も一定であれば、繰返し周波数が低くなると、光パルス当たりのエネルギーは大きくなり、ピーク光強度は高くなる。すなわち、光パルスのピーク光強度は、繰返し周波数に対して反比例の関係となっている。

なお、短パルス光源２内は、全て光ファイバで接続するとともに、適宜、偏波保持光ファイバを用いて、偏波による動作の不安定を抑制する。また、反射光による半導体レーザ５やファイバ増幅器８，９の損傷を防止するため、適宜、光アイソレータを挿入するとともに、最適な光スペクトル波形を得るため、適宜、光フィルタを挿入する。

図１において、短パルス光源２から発振した光パルスは、光ファイバコネクタ１０を介してシングルモード光ファイバ４に入射させる。シングルモード光ファイバ４は、例えば長さ数十ｍとし、波長９８０ｎｍ帯では正常分散する。

シングルモード光ファイバ４に入射した光パルスは、シングルモード光ファイバ４内で、自身の高いピーク光強度による非線形（光学）効果である自己位相変調（ＳＰＭ）によりチャープが生じて、光パルス幅は変わらずに光スペクトルが拡大され、同時に、正の群速度分散（ＧＶＤ）により長波長から短波長に時間的にチャープされて、光パルス幅が数ピコ秒から数十ピコ秒に拡大されて、シングルモード光ファイバ４から出射する。ここで、光パルスに対して、光強度依存のスペクトル変化を及ぼす非線形（光学）効果は、光カー効果や誘導ラマン散乱などである。

このシングルモード光ファイバ４から出射される光パルスは、短パルス光源２に設けられた光ファイバコネクタ１０と同様の、例えばＦＣ型の光ファイバコネクタ１１を介して、レーザ走査型顕微鏡３内に導入される。

レーザ走査型顕微鏡３は、光ファイバコネクタ１１の他、コリメートレンズ２６、ミラー１２、負の分散補償手段１３、折り返しミラー１４、ミラー１５、２次元走査手段１６、瞳投影レンズ１７、結像レンズ１８、対物レンズ１９、ダイクロイックミラー２１、集光レンズ２３、および、検出器２４を有している。

レーザ走査型顕微鏡３内に導入された光パルスは、自由空間系に出力され、コリメートレンズ２６によりほぼ平行光とされた後、ミラー１２で反射されて負の分散補償手段１３に入射する。負の分散補償手段１３は、２枚の回折格子３１，３２と、折り返しミラー３３とにより小型に構成できる。この負の分散補償手段１３に入射した光パルスは、先ず、回折格子３１で回折されて、波長成分毎に異なる角度で出射し、次に、回折格子３２で回折されて平行光化される。この状態では、光パルスの空間分布は、入射時の円形状から楕円形状となっている。その後、光パルスは、折り返しミラー３３で回折格子３１，３２の溝と平行な方向に、入射高さと異なる高さで入射光と平行に折り返され、再び２枚の回折格子３２，３１で順次回折される。これにより、光パルスは、空間分布が元の円形状となって、負の分散補償手段１３から出射し、折り返しミラー１４で反射されて、元の光路に戻る。

負の分散補償手段１３は、光パルスに対して負の群速度分散を与えるものであり、この負の群速度分散により先の光パルスのチャープが補償されるとともに、光スペクトル幅が拡大しているので、短パルス光源２から出力された数ピコ秒幅の光パルスから、数百フェムト秒の光パルスに、安定かつ効率よく圧縮される。ここでは、短パルス光源２から発振される３ｐｓから５ｐｓのパルス幅の光パルスを、２００ｆｓから３００ｆｓに圧縮する。なお、負の群速度分散手段は、上記のように反射型の回折格子３１，３２を用いて構成する場合に限らず、透過型の回折格子やプリズム、グリズムを用いて、同様に、小型で、安定かつ効率よくパルス圧縮するように構成することができる。また、図１では、負の分散補償手段１３をレーザ走査型顕微鏡３の内部に配置しているが、レーザ走査型顕微鏡３と別体として構成して、レーザ走査型顕微鏡３から分離または密接して配置してもよい。

負の分散補償手段１３を経た光パルスは、ミラー１５で反射されて、２次元走査手段１６に入射し、ここで光軸からの伝播角度が走査される。２次元走査手段１６は、例えば互いに直交する２本の軸線回りに揺動可能な２枚のガルバノミラーを近接配置した、いわゆる近接ガルバノミラーで構成する。

２次元走査手段１６を経た光パルスは、瞳投影レンズ１７により集光されて中間像として結像された後、結像レンズ１８により平行光とされ、ダイクロイックミラー２１を透過して、対物レンズ１９により試料２１に集光される。これにより、試料２１の被測定対象（例えば、蛍光タンパク）が多光子励起されて、試料２１から多光子励起による蛍光が発せられる。したがって、本実施の形態では、瞳投影レンズ１７、結像レンズ１８および対物レンズ１９を含んで照射光学系を構成している。また、シングルモード光ファイバ４と、負の分散補償手段１３とにより、光パルス圧縮手段を構成している。

試料２１から発せられた蛍光は、対物レンズ１９を経てダイクロイックミラー２１に入射する。この蛍光は、試料２１に集光させる光パルスの波長とは異なるので、ダイクロイックミラー２１で反射され、集光レンズ２３により検出器２４に集光されて、電気信号に変換される。

本実施の形態では、短パルス光源２から発生する光パルスの平均出力を、光パルスの繰返し周波数に対してほぼ一定としている。したがって、シングルモード光ファイバ４での非線形効果によるＳＰＭと正のＧＶＤ、および、負の分散補償手段１３による非線形パルス圧縮作用による、パルス幅の圧縮によって、光パルスが高ピーク強度化されるのに加え、光パルスの繰返し周波数を低くすることにより、さらに高ピーク強度とすることができる。したがって、先に説明したように、多光子励起による蛍光強度は、励起光パルスの平均光パワーの２乗に比例し、光パルスの時間幅と繰返し周波数に反比例するので、光パルスの繰返し周波数を変更することにより、試料２１が生細胞である場合に、生細胞の損傷に強く影響を与える平均照射エネルギー（平均光強度）を変えずに、蛍光強度を高くすることが可能となる。

このように、本実施の形態では、短パルス光源２とレーザ走査型顕微鏡３とを光学的に接続するシングルモード光ファイバ４による非線形効果での光スペクトル幅の拡大と、正の群速度分散によるチャープとを利用し、このシングルモード光ファイバ４を伝播した光パルスの時間幅を、２枚の回折格子３１，３２を有する負の分散補償手段１３で圧縮して、光パルスのピーク光強度を高くする。したがって、短パルス光源２は、取扱いが容易で安定に動作するピコ秒幅の光パルスを発生するように構成することができ、この短パルス光源２を用いて、高い蛍光強度が得られるピーク光強度で、フェムト秒幅の光パルスでの試料２１の多光子励起が可能となる。また、短パルス光源２に繰返し周波数が可変の利得スイッチ動作の半導体レーザを用いたので、繰返し周波数を低くすることによって、より高い蛍光強度を得ることが可能となる。さらに、短パルス光源２とレーザ走査型顕微鏡３との間を、着脱可能なシングルモード光ファイバ４で接続したので、装置配置の自由度が高まり、かつ煩雑な自由空間系の調整が不要となり、使い勝手を向上することができる。

なお、本実施の形態において、負の分散補償手段１３は、入射光パルスのチャープ量を補償するのみならず、その後の光路に配置されているレンズ等の透過光学部品における正の群速度分散量を補償するように、負の群速度分散量を調整することも可能である。

（第２実施の形態）
図３は、本発明の第２実施の形態に係る多光子励起レーザ走査型蛍光顕微鏡システムの要部の構成を示す図である。この多光子励起レーザ走査型蛍光顕微鏡システム１は、図１に示した第１実施の形態の構成において、負の分散補償手段１３に代えて、シングルモード光ファイバ４とレーザ走査型顕微鏡３との間に、断面に中空体を有するシングルモード中空光ファイバ４１を結合して設け、シングルモード光ファイバ４から出射された光パルスを、シングルモード中空光ファイバ４１、コリメートレンズ２６およびミラー１５を経て２次元走査手段１６に入射させるようにしたものである。すなわち、本実施の形態は、光パルス圧縮手段を、シングルモード光ファイバ４と、シングルモード中空光ファイバ４１とにより構成したもので、その他の構成および動作は、第１実施の形態と同様であるので、同一作用をなす素子には同一参照符号を付して説明を省略する。

シングルモード中空光ファイバ４１は、例えば長さ数ｍで、波長９８０ｎｍ帯では異常分散する。このシングルモード中空光ファイバ４１は、その入射端部を、図示しないが、例えばレンズを有する中継用の光ファイバコネクタを介してシングルモード光ファイバ４の出射端部と光学的および機械的に着脱自在に結合し、出射端部は、レーザ走査型顕微鏡３に設けられた光ファイバコネクタ１１に光学的および機械的に着脱自在に結合する。

本実施の形態において、シングルモード光ファイバ４に入射された光パルスは、上述したように、シングルモード光ファイバ４内におけるＳＰＭ効果と正のＧＶＤ効果の相互作用により、長波長から短波長にチャープ（ブルーシフトチャープ）されて、出射される。したがって、シングルモード光ファイバ４から出射される光パルスの時間幅およびスペクトル幅は、入射光パルスと比較して、図３に模式的に示すように、それぞれ拡大され、例えば、時間幅は数ピコ秒から数十ピコ秒に、スペクトル幅は５ｎｍから１０ｎｍ程度になる。

シングルモード光ファイバ４から出射された光パルスは、シングルモード中空光ファイバ４１を伝播することにより、該シングルモード中空光ファイバ４１内における負のＧＶＤ効果により、ブルーシフトチャープが補償される。このシングルモード中空光ファイバ４１は、光信号に対して、光カー効果や誘導ラマン散乱などの非線形光学効果を与えない。したがって、シングルモード中空光ファイバ４１の入射端と出射端とにおける光パルスを比較すると、図３に模式的に示すように、光スペクトル幅は、ほぼ同等であるが、光パルス幅は、約３００ｆｓに圧縮され、光パルスのピーク光強度は高くなる。

このように、本実施の形態では、第１実施の形態の構成において、負の分散補償手段１３に代えてシングルモード中空光ファイバ４１を用いて、シングルモード光ファイバ４から出射された光パルスのスペクトル幅は変えずに、時間幅を約３００ｆｓに圧縮するようにしたので、第１実施の形態と同様の効果が得られる他、第１実施の形態よりも簡単に構成することができる。

（第３実施の形態）
図４は、本発明の第３実施の形態に係る多光子励起レーザ走査型蛍光顕微鏡システムの要部の構成を示す図である。この多光子励起レーザ走査型蛍光顕微鏡システム１は、図３に示した第２実施の形態の構成において、シングルモード光ファイバ４およびシングルモード中空光ファイバ４１を、使用波長帯で異常分散するシングルモード光ファイバ４２に置き換えたものである。すなわち、本実施の形態は、光パルス圧縮手段を、シングルモード光ファイバ４２により構成したもので、その他の構成および動作は、第１実施の形態と同様であるので、同一作用をなす素子には同一参照符号を付して説明を省略する。

シングルモード光ファイバ４２は、長さ数十ｍから数百ｍ程度で、かつファイバの長手方向に異常分散値が減少するもの、例えば、出射端における異常分散値が、入射端における異常分散値の十分の一から二十分の一程度のものを用いる。

本実施の形態では、短パルス光源２から出射された光パルスを、波長９８０ｎｍ帯で異常分散するシングルモード光ファイバ４２を伝播させることにより、該シングルモード光ファイバ４２によるＳＰＭ効果と負のＧＶＤ効果との相互作用によるパルス圧縮効果を利用して、上記実施の形態と同様に、スペクトル幅が５ｎｍから１０ｎｍ程度に拡大され、時間幅が約３００ｆｓに圧縮されたほぼＴＬの光パルスを得る。このようなパルス圧縮方法は、ソリトン断熱圧縮法として知られている（例えば、G.P.Agrawal,Nonlinear Fiber Optics,2^nd Ed.,Academic Press.参照）。なお、図４には、シングルモード光ファイバ４２の入射端、中間部および出射端における光パルスの時間幅とスペクトル幅とを模式的に示している。

このように、本実施の形態では、第２実施の形態の構成において、シングルモード光ファイバ４およびシングルモード中空光ファイバ４１を、使用波長帯で異常分散するシングルモード光ファイバ４２に置き換えて、同様の時間幅およびスペクトル幅を有し、ピーク光強度の高い光パルスを得るようにしたので、第２実施の形態と同様の効果が得られる他、第２実施の形態よりも簡単に構成することができる。

なお、本発明は、上記実施の形態にのみ限定されるものではなく、幾多の変形または変更が可能である。例えば、上記実施の形態では、短パルス光源２を、利得スイッチ半導体レーザ６を用いて構成したが、ピコ秒やフェムト秒の光パルスを発生可能な各種固体レーザ（例えば、チタン・サファイアレーザ等）やファイバレーザ等を用いて構成することもできる。

図５は、能動モードロックファイバリングレーザを用いる短パルス光源２の概略構成図である。この短パルス光源２は、能動モードロックファイバリングレーザ５０と、図２に示した、ファイバ増幅器８，９および光ファイバコネクタ１０とを有する。能動モードロックファイバリングレーザ５０は、分岐カプラ５１、利得部５２、バンドパスフィルタ５３、アイソレータ５６および分散補償手段５７を有し、これら光学部品の間はシングルモード光ファイバ５４によりリング状に接続する。さらに、能動モードロックファイバリングレーザ５０は、利得部５２に接続された信号発生器５５を有する。

利得部５２は、希土類添加ファイバにより成る利得媒質とＬＮ（ＬｉＮｂＯ_３）変調器より成る強度変調器とから構成する。ここで、希土類添加ファイバは、Ｙｂが添加されたシングルモード光ファイバである。この希土類添加ファイバには、図示しないＷＤＭ（波長分割多重）カプラを接続し、このＷＤＭカプラの合波側には、図示しない励起用光源である半導体レーザを光学的に接続する。ここでは、半導体レーザは、波長９１５ｎｍの光を連続発振するレーザであり、この半導体レーザからの光が、ＷＤＭカプラによりＹｂ添加ファイバに吸収されることにより、９８０ｎｍ帯の利得が発生するように構成する。

分岐カプラ５１は、入射した光を設定した比率により分岐するものであり、シングルモード光ファイバ５４に分岐する比率が反射率に相当し、ファイバ増幅器８への分岐比率が透過率に相当する。

分散補償手段５７は、負の分散量を持ち、シングルモード光ファイバ５４および利得部５２の利得媒質が有する正の分散を相殺して、能動モードロックファイバリングレーザ５０のリング部分全体としてゼロ分散状態となるようにして、波長により周回速度が異ならないようにする。

アイソレータ５６は、一方向にのみ光を伝播させる。本実施の形態では、図５において時計方向、すなわち、分散補償手段５７からの光をバンドパスフィルタ５３の方向にのみ伝播させ、その逆方向の光は透過させない。

バンドパスフィルタ５３は特定の波長帯域にのみ透過特性を持つものであり、これにより広帯域な波長帯である自然放出光を透過させるとともに、これと異なる波長の光により発振が生じることを抑止する。

信号発生器５５は、利得部５２の強度変調器に接続されて、利得部５２の時間的な透過特性を変調する。

上記構成において、利得部５２から発した自然放出光は、シングルモード光ファイバ５４を介して、分岐カプラ５１、分散補償手段５７、アイソレータ５６、バンドパスフィルタ５３の順に伝播し、再び利得部５２のＹｂ添加ファイバに到達して増幅される。この自然放出光は、利得部５２の利得が、分岐カプラ５１の透過率とその他損失との合計を上回って、リング状の経路の伝播過程を繰り返して増幅されるとレーザ発振して、レーザ光が分岐カプラ５１からファイバ増幅器８に出射される。

ここで、利得部５２の利得発生の時間幅およびタイミングを、利得発生時に自然放出光がシングルモード光ファイバ５４で接続されたリング状の経路を周回して、再び利得部５２に到達する時間間隔に一致するように、図示しない強度変調器に接続された信号発生器５５の信号発生周波数を設定すれば、モードロック状態が達成される。この場合、分岐カプラ５１からファイバ増幅器８に出射するレーザ光は、信号発生器５５の信号発生周波数と同じ繰返し周波数を有するパルス光となる。

さらに、上記リング状の経路の周回を繰り返すことによって、能動モードロックファイバリングレーザ５０から発振するレーザ光の光パルスの時間幅を数ピコ秒の短パルス光とすることが可能となる。また、このモードロック状態は、シングルモード光ファイバ５４で接続されたリング状の経路内に１個の光パルスが存在する場合を基本状態とし、２個以上の光パルスが存在するようにもできる。これは、信号発生器５５の周波数を、基本状態の整数倍に設定することにより可能となる。これにより、光パルスの繰返し周波数を、基本状態における光パルスの周波数の整数倍に調整することができる。

このようにして、能動モードロックファイバリングレーザ５０から出射した短パルス光は、２つのファイバ増幅器８、９で数十ｍＷから数Ｗの平均光強度（平均出力）に増幅され、短パルス光源２から出力される。

図５に示した構成の短パルス光源２によれば、能動モードロックファイバリングレーザ５０の強度変調器に印加する変調電気信号の繰返し時間間隔を変更するだけで、短パルス光源２から出射させる光パルスの繰返し周波数を、容易かつ安定に瞬時に制御することが可能となる。なお、図５において、利得部５２は、利得媒質である希土類添加ファイバと強度変調器との組合せに限らず、例えば、利得媒質と変調手段を兼ねる半導体光増幅器とを使用して構成することもできる。

さらに、本発明に係る多光子励起測定装置は、上記実施の形態で説明した生細胞を測定する多光子励起レーザ走査型蛍光顕微鏡システムに限らず、特に深部観察時や強散乱体観察時に、試料の光パルス照射による熱損傷を避けたい顕微鏡システムに有効に適用することができるが、半導体材料など他の試料を多光子励起（非線形励起）して測定する測定装置にも適用可能である。

本発明の第１実施の形態に係る多光子励起レーザ走査型蛍光顕微鏡システムの要部の構成を示す図である。 図１に示した短パルス光源の一例の要部構成を示す図である。 本発明の第２実施の形態に係る多光子励起レーザ走査型蛍光顕微鏡システムの要部の構成を示す図である。 本発明の第３実施の形態に係る多光子励起レーザ走査型蛍光顕微鏡システムの要部の構成を示す図である。 第１実施の形態乃至第３実施の形態で使用可能な短パルス光源の他の例を示すの概略構成図である。 従来の多光子励起顕微鏡システムの構成を示す図である。

符号の説明

１ 多光子励起レーザ走査型蛍光顕微鏡システム
２ 短パルス光源
３ レーザ走査型顕微鏡
４ シングルモード光ファイバ
５ 電気パルス発生器
６ 半導体レーザ
７ シングルモード光ファイバ
８，９ ファイバ増幅器
１０，１１ 光ファイバコネクタ
１２ ミラー
１３ 負の分散補償手段
１４ 折り返しミラー
１５ ミラー
１６ ２次元走査手段
１７ 瞳投影レンズ
１８ 結像レンズ
１９ 対物レンズ
２０ 試料
２１ ダイクロイックミラー
２３ 集光レンズ
２４ 検出器
２６ コリメートレンズ
３１，３２ 回折格子
３３ 折り返しミラー
４１ シングルモード中空光ファイバ
４２ シングルモード光ファイバ
５０ 能動モードロックファイバリングレーザ
５１ 分岐カプラ
５２ 利得部
５３ バンドパスフィルタ
５４ シングルモード光ファイバ
５５ 信号発生器
５６ アイソレータ
５７ 分散補償手段

Claims (11)

1. 高強度の光パルスによる多光子吸収現象を用いて試料の測定を行う多光子励起測定装置であって、
   光パルスを出射する短パルス光源と、
   前記短パルス光源から出射された光パルスを試料に照射する照射光学系と、
   前記光パルスの照射により前記試料から発生する多光子励起にともなう信号光を検出する検出器と、
   前記短パルス光源と前記照射光学系との間に配置され、前記短パルス光源から出射された光パルスを伝播する光ファイバを含み、該光ファイバの光強度依存のスペクトル変化を及ぼす非線形効果を利用して、前記試料に照射される光パルスのパルス幅を、前記短パルス光源から出射される光パルスのパルス幅以下に短くし、かつ、前記試料に照射される光パルスのスペクトル幅を、前記短パルス光源から出射される光パルスのスペクトル幅より広くするように、パルス幅圧縮を行う光パルス圧縮手段と、
   を有することを特徴とする多光子励起測定装置。
2. 前記光パルス圧縮手段は、
   前記光ファイバが、前記短パルス光源から出射される光パルスに対して、スペクトル幅を拡大するとともに、正の群速度分散を与えるシングルモード光ファイバからなり、
   さらに、前記シングルモード光ファイバを伝播した光パルスに対して負の群速度分散を与える負の分散補償手段を有する、
   ことを特徴とする請求項１に記載の多光子励起測定装置。
3. 前記負の分散補償手段は、回折格子対、プリズム対、グリズム対のいずれかを有することを特徴とする請求項２に記載の多光子励起測定装置。
4. 前記光パルス圧縮手段は、
   前記光ファイバが、前記短パルス光源から出射される光パルスに対して、スペクトル幅を拡大するとともに、正の群速度分散を与えるシングルモード光ファイバからなり、
   さらに、前記シングルモード光ファイバを伝播した光パルスに対して負の群速度分散を与える断面に中空体を有するシングルモード中空光ファイバを有する、
   ことを特徴とする請求項１に記載の多光子励起測定装置。
5. 前記光パルス圧縮手段は、
   前記光ファイバが、前記短パルス光源から出射される光パルスに対して、スペクトル幅を拡大するとともに、負の群速度分散を与えるシングルモード光ファイバからなることを特徴とする請求項１に記載の多光子励起測定装置。
6. 前記短パルス光源から出射する光パルスのパルス幅はピコ秒であり、前記試料に照射する光パルスのパルス幅はフェムト秒であることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか一項に記載の多光子励起測定装置。
7. 前記短パルス光源は、出射する光パルスの繰返し周波数が可変であることを特徴とする請求項１乃至６のいずれか一項に記載の多光子励起測定装置。
8. 前記短パルス光源は、利得スイッチ半導体レーザを有することを特徴とする請求項１乃至７のいずれか一項に記載の多光子励起測定装置。
9. 前記短パルス光源は、能動モードロックファイバリングレーザを有することを特徴とする請求項１乃至７のいずれか一項に記載の多光子励起測定装置。
10. 前記光パルス圧縮手段は、着脱自在であることを特徴とする請求項１に記載の多光子励起測定装置。
11. 前記多光子励起観測装置は、前記検出器が前記試料から発生する多光子励起にともなう蛍光を検出する多光子励起蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする請求項１乃至１０のいずれか一項に記載の多光子励起観測装置。

Images