JP2009514877A - Peptides as delivery vehicles for siRNA - base substrate RNA conjugates - Google Patents

Peptides as delivery vehicles for siRNA - base substrate RNA conjugates Download PDF

Info

Publication number
JP2009514877A
JP2009514877A JP2008539062A JP2008539062A JP2009514877A JP 2009514877 A JP2009514877 A JP 2009514877A JP 2008539062 A JP2008539062 A JP 2008539062A JP 2008539062 A JP2008539062 A JP 2008539062A JP 2009514877 A JP2009514877 A JP 2009514877A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
seq id
sirna
comprises
chain
composition
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2008539062A
Other languages
Japanese (ja)
Inventor
アーマディアン,モハマド
クイ,クンヤン
クウェイ,スティーブン,シー.
ジョンソン,ポール,ヒコック
チェン,ユーチン
チェン,リシャン
ヒューストン,マイケル,イー.,ジュニア
ファム,レナータ
メイヤー,サシャ,ジェイ.
Original Assignee
エムディーアールエヌエー,インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to US73366505P priority Critical
Priority to US82289606P priority
Application filed by エムディーアールエヌエー,インコーポレイテッド filed Critical エムディーアールエヌエー,インコーポレイテッド
Priority to PCT/US2006/042978 priority patent/WO2007056153A2/en
Publication of JP2009514877A publication Critical patent/JP2009514877A/en
Application status is Granted legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1136Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against growth factors, growth regulators, cytokines, lymphokines or hormones
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL, OR TOILET PURPOSES
    • A61K47/00Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1131Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10Type of nucleic acid
    • C12N2310/14Type of nucleic acid interfering N.A.
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30Chemical structure
    • C12N2310/35Nature of the modification
    • C12N2310/351Conjugate
    • C12N2310/3513Protein; Peptide
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00Applications; Uses
    • C12N2320/30Special therapeutic applications
    • C12N2320/32Special delivery means, e.g. tissue-specific

Abstract

二本鎖リボ核酸(dsRNA)分子及び約5乃至約40アミノ酸のペプチドを含む組成物を提供し、ここでdsRNA分子がペプチドと抱合している。 Providing a composition comprising a double-stranded ribonucleic acid (dsRNA) molecule and from about 5 to peptide of approximately 40 amino acids, wherein the dsRNA molecule is conjugated to the peptide. dsRNAの鎖は約25乃至約30塩基対の長さを有することができ、同じでも異なっていてもよい。 Strand of the dsRNA can have about 25 to a length of about 30 base pairs, it may be the same or different. 代替的に、siRNAは少なくとも3つの鎖(すなわち、少なくとも2つのセンス鎖及び1つのアンチセンス鎖、又は少なくとも2つのアンチセンス鎖及び1つのセンス鎖)を含むことができ、ここで少なくとも2つのセンス鎖又は少なくとも2つのアンチセンス鎖は少なくとも1ヌクレオチドのニック又はギャップによって分けられている。 Alternatively, siRNA is at least three chains (i.e., at least two of the sense strand and one of the antisense strand, or at least two of the antisense strand and one sense strand) that can comprise, where at least two sense chain or at least two of the antisense strand are separated by a nick or a gap of at least one nucleotide.
【選択図】図3 .Field

Description

本開示は、RNA干渉(RNAi)による疾患の治療全般に関する。 The present disclosure relates to treating general diseases by RNA interference (RNAi). さらに詳細には、本開示は、遺伝子発現に対するRNAiを媒介することができる低分子抑制核酸分子(siRNA)及びその変異体の標的送達に関する。 More particularly, the present disclosure, a low molecular suppression nucleic acid molecule capable of mediating RNAi on gene expression (siRNA) and to the targeted delivery of a variant thereof. 本明細書で述べるsiRNAは、1又は2個以上のペプチドと抱合することができ、ここで抱合されたペプチドはsiRNAの送達を促進し、安定性を向上し、及び/又は毒性を低下させる。 siRNA described herein may be conjugated to 1 or 2 or more peptides, wherein the conjugated peptide facilitates delivery of siRNA, and improve stability, and / or reduce toxicity.

動物及びヒト(植物)の内部へ核酸を送達することは、分子生物学及び臨床研究における重要な課題である。 Delivering a nucleic acid to the interior of animals and humans (plants) are an important problem in molecular biology and clinical studies. 具体的には、遺伝子治療、アンチセンス治療、及びRNA干渉(RNAi)治療の分野における最近の発展により、核酸を細胞内へ導入するためのより効率的な方法の開発が必要となってきた。 Specifically, gene therapy, antisense therapy, and recent developments in the field of RNA interference (RNAi) therapy, the nucleic acid has become necessary to develop a more efficient method for introducing into the cell.

現在までの人工的に核酸を細胞へ送達する最も一般的な方法では、カチオン性脂質、エレクトロポレーション、及びウィルス形質導入、並びに機械的又は生化学的膜破壊及び/又は膜貫通(例:界面活性剤、マイクロインジェクション、若しくはパーティクルガンを使用)を用いる数多くの方法を使用している。 The most common way to artificially deliver nucleic acids to cells to date, a cationic lipid, electroporation, and viral transduction, as well as mechanical or biochemical membrane disruption and / or transmembrane (e.g. surfactants active agent, using a number of methods of using the microinjection, or using a particle gun). これらの方法には種々の欠点がある。 These methods have various drawbacks. 例えば、カチオン性脂質は、インビトロでのDNA及び低分子干渉RNA(siRNA)の送達に最も頻繁に使用されるが、一般に毒性が強いため疾患の治療などのインビボでの用途には不適当である。 For example, cationic lipids, but are most often used for delivery of DNA and small interfering RNA in vitro (siRNA), are unsuitable for applications in general in vivo, such as therapeutic strong for disease toxicity . ウィルス形質導入では、送達媒体として用いた複製欠損ウィルスが野生型に戻って病原性となる可能性がある。 The virus transduction, replication-defective virus is used as the delivery vehicle may become pathogenic back to wild-type. エレクトロポレーションは、遺伝子導入効率が低いこと、及び細胞を損傷するという欠点があるため臨床応用は限られる。 Electroporation, the low efficiency of gene transfer, and clinical applications because of the disadvantage of damaging the cells is limited.

RNA干渉(RNAi)は、植物及び動物の細胞内において特定の遺伝子の発現を調整するための有望な技術として浮上してきており、従って、内在性遺伝子発現の調整による治療を受け入れることができる広範囲にわたる疾患及び障害を治療するための有用な治療法(ツール)を提供することが期待される。 RNA interference (RNAi) has emerged as a promising technique for modulating the expression of a particular gene in the cells of plants and animals, therefore, widespread capable of accepting treatment with adjustment of endogenous gene expression it is expected to provide useful therapies for the treatment of diseases and disorders of the (tool). RNA干渉とは、短鎖干渉RNA(siRNA)、通常は標的メッセンジャーRNA(mRNA)の一部分と相同的な配列であるdsRNA、が媒介する、動物内部での配列特異的な転写後ジーンサイレンシングのプロセスのことである。 The RNA interference, short interfering RNA (siRNA), typically dsRNA is part homologous sequences of the target be a messenger RNA (mRNA), mediated, sequence-specific post-transcriptional gene silencing in animals inside the process is of it. Fireら,Nature 391: 806, 1998及びHamiltonら,Science 286: 950−951, 1999を参照のこと。 Fire et al., Nature 391: 806, 1998 and Hamilton et al., Science 286: 950-951, see 1999. 植物内部でのこれに相当するプロセスは、一般に転写後ジーンサイレンシング又はRNAサイレンシングと呼ばれ、真菌類では「quelling」とも呼ばれる。 The process corresponding to this inside plants, commonly referred to as gene silencing or RNA silencing post-transcriptional, the fungi are also referred to as "quelling". 転写後ジーンサイレンシングのプロセスは、進化の過程で保存されてきた異質遺伝子の発現を防ぐために用いられる細胞の防御メカニズムであると考えられており、一般に様々な動植物に共有されている(Fireら,Trends Genet. 15: 358, 1999)。 Process gene silencing after the transfer is considered to be a defense mechanism of cell to be used to prevent the expression of foreign genes have been conserved during evolution, commonly shared by various animals and plants (Fire et al. , Trends Genet 15:. 358, 1999).

適切なdsRNAを細胞内へ導入することにより、内在性の同族mRNA(すなわち、導入されたdsRNAと実質的な配列同一性を共有するmRNA)が誘起される。 By introducing an appropriate dsRNA into cells, endogenous cognate mRNA (i.e., mRNA which share the introduced dsRNA substantial sequence identity) is induced. dsRNA二重鎖が標的ジーンサイレンシングを媒介するメカニズムは、二段階プロセスであると考えられる。 Mechanisms dsRNA duplexes to mediate target gene silencing is thought to be a two step process. まず、ダイザと呼ばれるリボヌクレアーゼIII酵素によってdsRNAが低分子干渉RNA(siRNA)に断片化(分解)される(Hamiltonら,上掲;Bersteinら,Nature 409: 363, 2001)。 First, fragmentation dsRNA by ribonuclease III enzyme referred to as pedestal small interfering RNA (siRNA) (decomposed) by (Hamilton et al., Supra; Berstein et al., Nature 409: 363, 2001). ダイザ活性から誘導された低分子干渉RNAは、通常約21乃至約23ヌクレオチドの長さで2塩基分の3'オーバハングを有する(Kimら,Nature Biotech. 23(2): 222, 2005)。 Small interfering RNA derived from the base active has two base portion of 3 'overhang length usually from about 21 to about 23 nucleotides (Kim et al., Nature Biotech 23 (2):. 222, 2005). 最近の研究から、より長いdsRNA(25乃至30ヌクレオチドの長さ)が同じ標的部位に対して、短いもの(21−mer)よりも高いジーンサイレンシング活性を持ち得ることが示唆されている(Kimら,Nature Biotech. 23(2): 222, 2005)。 Recent studies, for longer dsRNA (25 to 30 nucleotides in length) is the same target site, it has been suggested that may have a high gene silencing activity than shorter (21-mer) (Kim al, Nature Biotech 23 (2):. 222, 2005). さらに、21−merのRNAによるsiRNA媒介性ジーンサイレンシングに対して耐性を持つ特定の標的部位は、より長い27−merのsiRNA二重鎖によって効果的にジーンサイレンシングすることができる。 Furthermore, the particular target site resistant to siRNA-mediated gene silencing by RNA of 21-mer can be effectively gene silencing by siRNA duplexes longer 27-mer. このようなより長いsiRNA二重鎖の効力が高いのは、これらがダイザエンドヌクレアーゼの基質であるという事実に起因する(Kimら,Nature Biotech. 23(2): 222, 2005)。 Such longer efficacy of the siRNA duplex is high is given they are due to the fact that a substrate for the die. The endonuclease (Kim et al., Nature Biotech 23 (2):. 222, 2005). 従って治療薬という意味では、これらのより長いdsRNAは前駆体として働き、ダイザで処理されるとRISC複合体へ進入して標的ジーンサイレンシングのメディエータとして機能する。 Thus, in the sense that the therapeutic agent, these longer dsRNA acts as a precursor, which functions as a mediator of a target gene silencing enters into and processed by the base RISC complex.

二番目の段階では、RNA誘導サイレンシング複合体又は「RISC」と呼ばれる多成分ヌクレアーゼ複合体へsiRNAを取り込むことを含む。 In the second stage, comprises incorporating a siRNA to a multicomponent nuclease complex, called the RNA-induced silencing complex or "RISC". RISCは、そのsiRNA二重鎖のアンチセンス鎖への相補性によってmRNA基質を識別し、標的mRNAに結合してその破壊(開裂)を誘起することによって遺伝子発現のサイレンシングを引き起こす。 RISC is a mRNA substrate was identified by complementation of the antisense strand of the siRNA duplex, cause silencing of gene expression by inducing their destruction (cleavage) bound to the target mRNA. 標的RNAの開裂はsiRNA二重鎖のアンチセンス鎖に相補的な領域の中央部で発生する(Elbashirら,Genes Dev. 15: 188, 2001)。 Cleavage of the target RNA occurs in the middle of the region complementary to the antisense strand of the siRNA duplex (Elbashir et al, Genes Dev 15:. 188, 2001).

本技術分野では、特に既存の細胞送達技術が、効率の悪さ及び/又は送達試薬の高い毒性によって限界があるという事実に鑑みて、核酸、ペプチド、及びその他の薬理剤を細胞へ送達するためのより良いツール並びに方法が長年にわたって求められている。 In this art, in particular the existing cell delivery techniques, in view of the fact that the highly poor and / or delivery reagent efficiency toxicity is limited, nucleic acids, peptides, and for delivery to cells other pharmacological agents better tools and methods have been sought for many years. これに関連して、標的細胞の表現型又は疾患状態を変化させる方法で遺伝子発現の制御を媒介するために、細胞、組織、又は区画へ選択的に、無毒性送達媒体を用いて、活性状態及び持続的状態で効果量を送達するための改善された方法並びに製剤が必要とされている。 In this connection, in order to mediate regulation of gene expression by a method of changing the phenotype or disease state in a target cell, cells, tissues, or selectively to the compartment, by using a non-toxic delivery vehicles, active improved methods and formulations for delivery is required to effect amount and persistent state.

本開示は、とりわけ疾患の治療のための治療用プロドラッグ送達システムとしてのポリヌクレオチド送達促進ポリペプチド/ダイザ基質dsRNA抱合体を提供することにより、これらの及びその他の関連する要求に応えるものである。 The present disclosure, especially by providing a polynucleotide delivery / base substrate dsRNA conjugates as therapeutic prodrug delivery system for the treatment of diseases, in which addresses these and other related requirements . 前駆体siRNAは、ポリペプチドによって細胞内へ送達されるとダイザによって開裂されて送達ペプチドから遊離され、そしてそれによってsiRNAはRISC複合体へ進入して特定の遺伝子を転写後ジーンサイレンシングの標的とすることができる。 Precursor siRNA is released from the delivery peptide is cleaved by the pedestal when delivered into cells by a polypeptide, and thereby the siRNA and the target post-transcriptional gene silencing specific genes to enter the RISC complex can do. 本明細書で述べるペプチド−dsRNA抱合体は、内在性遺伝子発現の調整による治療を受け入れることができる広範囲にわたる疾患及び障害を治療するためのdsRNA治療前駆体の細胞内への送達を向上させる有望な新規の方法を提供する。 Peptide -dsRNA conjugates described herein, promising to improve the delivery into the cell of dsRNA therapy precursor for the treatment of diseases and disorders wide range capable of accepting treatment with adjustment of endogenous gene expression to provide a novel method. 本明細書で開示するポリヌクレオチド送達促進ポリペプチド/ダイザ基質dsRNA抱合体は、dsRNAの防御能力及び/又は予防能力をそのインビボでの寿命を延ばすことによって有利に向上する。 Polynucleotide delivery / base substrate dsRNA conjugates disclosed herein advantageously improved by extending the life of the dsRNA of the protective capacity and / or prevention ability its in vivo.

一つの態様において、本開示は、動物に対して1又は2種類以上の二本鎖リボ核酸(dsRNA)分子を投与するのに適した医薬組成物を含む組成物を提供し、この場合組成物は1又は2種類以上のdsRNA分子及び1又は2種類以上のペプチドを含み、各dsRNA分子は約25乃至約30の塩基対を具え、各ペプチドは約5乃至約40個のアミノ酸とアミノ酸配列KVLKQ(配列番号51)を具え、前記dsRNA分子は前記ペプチドと抱合している。 In one aspect, the present disclosure provides a composition comprising a pharmaceutical composition suitable for administration 1 or 2 or more double-stranded ribonucleic acid (dsRNA) molecules to an animal, in this case the composition comprises one or two or more dsRNA molecules and one or more types of peptides, each dsRNA molecule comprises about 25 to about 30 base pairs, each peptide is from about 5 to about 40 amino acids and amino acid sequence KVLKQ It comprises a (SEQ ID NO: 51), wherein the dsRNA molecule is conjugated to the peptide. ある様態の範囲内では、ペプチドのアミノ酸配列は、KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(配列番号33)、KKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(配列番号42)、VTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(配列番号43)、AQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(配列番号44)、KDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(配列番号45)、KKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(配列番号46)、KRSRKESYSVYVYKVLKQ(配列番号47)、RKESYSVYVYKVLKQ(配列番号41)、SYSVYVYKVLKQ(配列番号48)、VYVYKVLKQ(配列 Within certain aspects, the amino acid sequence of the peptide, KeijiesukeikeieibuitikeieikyuKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ (SEQ ID NO: 33), KKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ (SEQ ID NO: 42), VTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ (SEQ ID NO: 43), AQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ (SEQ ID NO: 44), KDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ (SEQ ID NO: 45), KKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ ( SEQ ID NO: 46), KRSRKESYSVYVYKVLKQ (SEQ ID NO: 47), RKESYSVYVYKVLKQ (SEQ ID NO: 41), SYSVYVYKVLKQ (SEQ ID NO: 48), VYVYKVLKQ (SEQ 号49)、YKVLKQ(配列番号50)、及びKVLKQ(配列番号51)からなる群より選択することができる。 Issue 49), YKVLKQ (SEQ ID NO: 50), and can be selected from the group consisting of KVLKQ (SEQ ID NO: 51).

他の様態では、dsRNAは2若しくは3個以上の塩基対を有する5'オーバハング又は2若しくは3個以上の塩基対を有する3'オーバハングを持ち、この場合オーバハングはセンス鎖及び/又はアンチセンス鎖の一方又は両方に存在することができる。 In another aspect, dsRNA has the overhang '3 has the overhang or 2 or 3 or more base pairs' to 5 having two or three or more base pairs, in this case overhang sense strand and / or antisense strand on one or both can be present. さらなる様態では、dsRNAはオーバハングを持たない。 In a further aspect, dsRNA has no overhang. さらなる様態では、dsRNAは約25塩基対乃至29塩基対の長さの鎖を持つ。 In a further aspect, dsRNA has about 25 base pairs to 29 base pairs in length chain. さらなる様態では、dsRNA分子はセンスRNA鎖及びアンチセンスRNA鎖を含み、ペプチドはアンチセンス鎖の5'末端で抱合されている。 In a further aspect, dsRNA molecules comprise a sense RNA strand and an antisense RNA strand, peptides are conjugated at the 5 'end of the antisense strand.

他の態様では、本開示は、動物に対して1又は2種類以上のsiRNA分子を投与するのに適した、医薬組成物を含む組成物を提供し、この場合組成物は1又は2種類以上のsiRNA分子及び1又は2種類以上のペプチドを具え、各siRNA分子は約25乃至約30の塩基対の二本鎖リボ核酸を具え、各ペプチドは約5乃至約40個のアミノ酸を具えてアミノ酸配列KVLKQ(配列番号51)を含み、ペプチドはdsRNA分子と抱合している。 In another aspect, the present disclosure is suitable for administering one or two or more siRNA molecules to an animal, to provide a composition comprising a pharmaceutical composition, in this case the composition is 1 or 2 or more comprising a siRNA molecule and one or two or more types of peptides, each siRNA molecule comprises about 25 to about 30 base pairs of double-stranded ribonucleic acid, the peptide comprises from about 5 to about 40 amino acids amino acids comprises the sequence KVLKQ (SEQ ID NO: 51), peptide is conjugated to the dsRNA molecule. 一つの様態では、ペプチドは動物の細胞と結合する分子と抱合している。 In one aspect, the peptide is conjugated to a molecule that binds to animal cells. 別の様態では、siRNA分子は、TNF−α遺伝子の一部分の配列と相同的である配列を含む。 In another aspect, siRNA molecules comprise a sequence and sequence that is homologous to a portion of the TNF-alpha gene.

さらに他の様態では、本開示は、siRNA分子及びこれらのsiRNAとポリペプチドとの抱合体を提供し、この場合、siRNAは本明細書においてA、B1、及びB2(A:B1B2)と称する三本鎖を具え、B1及びB2は、Aの非オーバーラップ領域と相補的で塩基対(bp)を形成する。 Three called: (B1B2 A) In still another aspect, the present disclosure provides a siRNA molecules and conjugates of these siRNA and polypeptides, in this case, siRNA in this specification A, B1, and B2 comprising a stranded, B1 and B2, form non-overlapping regions complementary base pairs of a and (bp). 従って、これらの様態の範囲内におけるsiRNA分子において、B1とAのアニーリングによって形成された二本鎖領域は、B2とAのアニーリングによって形成された二本鎖領域とは異なる。 Thus, the siRNA molecules within the scope of these aspects, the double-stranded region formed by the annealing of B1 and A is different from the double-stranded region formed by the annealing of B2 and A. A:B1二重鎖とA:B2二重鎖は、A:B1二重鎖とA:B2二重鎖の間に位置し、A、B1、及び/又はB2鎖の一方又は両方の3'末端における1又は2個以上のいずれの不対ヌクレオチドとも異なる少なくとも一つのA鎖中の不対ヌクレオチドによる「ギャップ」によって分けることができる。 A: B1 duplexes A: B2 duplex, A: B1 duplexes A: B2 positioned between the duplex, A, B1, and / or B2 3 of one or both strands' it can be separated by "gap" by which one or two or more of any of unpaired nucleotides in at least one of the a-chain also differs from the unpaired nucleotide at the end. 代替的に、A:B1二重鎖とA:B2二重鎖は「ニック」によって分けることができ、その場合A:B1二重鎖とA:B2二重鎖の間に位置するA鎖の不対ヌクレオチドが存在せず、唯一の不対ヌクレオチドが、もし存在する場合には、A、B1、及び/又はB2鎖の一方又は両方の3'末端に存在する。 Alternatively, A: B1 duplexes A: B2 duplex can be divided by a "nick", in which case A: B1 duplexes A: B2 of the A chain located between the double-stranded absent unpaired nucleotides, the only unpaired nucleotides, if if present, is present at the 3 'end of one or both of the a, B1, and / or B2 chain.

典型的には、本開示のこれらの態様によるsiRNAは、合計で約15塩基対乃至約40塩基対を具え、より典型的には約18乃至約35塩基対であり、さらにより典型的には約20乃至30塩基対であり、最も典型的には21、22、23、24、25、26、27、28、又は29塩基対のいずれかである。 Typically, siRNA by these aspects of the present disclosure, comprises about 15 base pairs to about 40 base pairs in total, more typically from about 18 to about 35 base pairs, typically more than from about 20 to 30 base pairs, it is either most typically of 21,22,23,24,25,26,27,28, or 29 base pairs. siRNAは任意に、1ヌクレオチド乃至5ヌクレオチドの一本鎖3'オーバハングを具えていてもよい。 siRNA is optionally may comprise a single nucleotide to 5 single-stranded 3 'overhang of nucleotides. 最も典型的には、そのような一本鎖3'オーバハングは1、2、3、又は4ヌクレオチドである。 Most typically, such a single-stranded 3 'overhang 1,2,3, or 4 nucleotides.

従って、このような本開示の三本鎖siRNAはAセンス鎖又はAアンチセンス鎖のどちらかを具え、この場合A鎖の長さは約15ヌクレオチド乃至約50ヌクレオチドであり、より典型的にはA鎖の長さは約18ヌクレオチド乃至約40ヌクレオチドであり、さらにより典型的にはA鎖の長さは約20ヌクレオチド乃至約32ヌクレオチドであり、最も典型的にはA鎖の長さは21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、又は31ヌクレオチドである。 Thus, triple-stranded siRNA of such the disclosure comprises either A sense strand or A antisense strand, the length of this case A chain is about 15 nucleotides to about 50 nucleotides, more typically the length of the a-chain is about 18 nucleotides to about 40 nucleotides, even more typically the length of the a-chain is about 20 nucleotides to about 32 nucleotides, most typically the length of the a chain 21 , 22,23,24,25,26,27,28,29,30, or 31 is a nucleotide.

本開示の三本鎖siRNAはさらに、本明細書において例えばB1及びB2と称する2又は3本以上のB鎖を具え、この場合各B鎖は、同族であるA鎖の非オーバーラップ領域と相補的であり、第一のB鎖(B1)と第二のB鎖(B2)は、ニック又は1若しくは2個以上のヌクレオチドギャップで分けられる。 Triplex siRNA of the present disclosure further comprises two or three or more of the B chain, referred to herein for example, B1 and B2, the B-chain in this case, the complementary and non-overlapping regions of the A-chain is homologous a, the first B-chain and (B1) a second B-chain (B2) are separated by nick or one or two or more nucleotide gap. 同族A鎖がセンス鎖であるか又はアンチセンス鎖であるかに依存して、各B鎖はそれぞれアンチセンス鎖又はセンス鎖となる。 Cognate A strand depending on whether or antisense strand is the sense strand, each of the B chain is the antisense strand or sense strand. 本明細書で述べるB鎖(B1、B2等)は各々独立して、約1ヌクレオチド乃至約25ヌクレオチドの長さであり、より典型的には約4ヌクレオチド乃至約20ヌクレオチドの長さであり、さらにより典型的には約5ヌクレオチド乃至約16ヌクレオチドの長さであり、最も典型的には6、7、8、9、10、11、12、13、14、又は15ヌクレオチドの長さである。 B chains described herein (B1, B2, etc.) are each independently a length of about 1 nucleotide to about 25 nucleotides, more typically a length of about 4 nucleotides to about 20 nucleotides, and even more typically the length of about 5 nucleotides to about 16 nucleotides, most typically 6,7,8,9,10,11,12,13,14, or the length of 15 nucleotides .

厳密にどのような用途を意図しているかによって、第一のB鎖(B1)と第二のB鎖(B2)はニック又はギャップで分けることができる。 Depending on whether you are intended strictly any application, the first B-chain and (B1) a second B-chain (B2) can be divided by the nick or gap. B1とB2がギャップによって分けられる様態では、典型的にはギャップは約1ヌクレオチド乃至約25ヌクレオチドであり、より典型的にはギャップは約1ヌクレオチド乃至約15ヌクレオチドであり、さらにより典型的にはギャップは約1ヌクレオチド乃至約10ヌクレオチドであり、最も典型的にはギャップは1、2、3、4、5、6、7、8、又は9ヌクレオチドである。 The manner in which B1 and B2 are separated by a gap, typically the gap is about 1 nucleotide to about 25 nucleotides, gap and more typically from about 1 nucleotide to about 15 nucleotides, even more typically gap was about 1 nucleotide to about 10 nucleotides, and most typically gaps 1,2,3,4,5,6,7,8, or 9 nucleotides. B鎖は各々独立して、5'−ヒドロキシル(すなわち5'−OH)末端か、又は5'−リン酸(すなわち5'−PO )末端を有していてもよい。 B chain are each independently 5'-hydroxyl (i.e. 5'-OH) terminated or 5'-phosphate (i.e. 5'-PO 4) ends may have.

本開示の他の態様の範囲内において、ギャップ又はニックを有する1又は2種類以上の二重鎖siRNA分子を用いる方法、及びギャップ又はニックを有する1又は2種類以上の二重鎖siRNA分子を具える組成物が提供される。 Within other aspects of the present disclosure, one or two or more methods of using the double-stranded siRNA molecules, and one or two or more double-stranded siRNA molecule ingredients having a gap or nick with a gap or nick composition to obtain is provided.

ある様態の範囲内において、本明細書で開示される方法は、(a)siRNA媒介性ジーンサイレンシングのための標的遺伝子を選択するステップであって、ここで標的遺伝子が標的ウィルス遺伝子であるステップと、(b)標的ウィルス遺伝子のsiRNA媒介性ジーンサイレンシングのための適切なsiRNA分子を設計及び/又は合成するステップであって、ここでsiRNA分子がギャップ又はニックを有する二重鎖を含み、そのギャップ又はニックがセンス鎖又はアンチセンス鎖のどちらかに見られるステップと、(c)標的ウィルス遺伝子を発現する細胞へsiRNA分子を投与するステップであって、ここでsiRNAが対応する標的ウィルスのmRNAと特異的に結合することができ、それによって細胞中におけるその発現 Step Within certain aspects, the methods disclosed herein are target genes and selecting a, wherein the target gene is the target viral gene for (a) siRNA-mediated gene silencing If, it includes a step of designing and / or synthesis of suitable siRNA molecules, duplex with here siRNA molecule gap or nick for siRNA-mediated gene silencing (b) target viral genes, a step in which the gap or nick found in either the sense or antisense strand, of (c) a step of administering the siRNA molecule to a cell expressing the target viral gene, wherein the siRNA corresponding target viral can be mRNA specifically bind, its expression in whereby cells ベルを低下させるステップとを具える。 Comprising the step of lowering the bell.

代替的な様態の範囲内において、本明細書で開示される方法は、(a)siRNA媒介性ジーンサイレンシングのための標的遺伝子を選択するステップであって、ここで標的遺伝子が内在性遺伝子であり、内在性遺伝子が任意に、対応する野生型内在性遺伝子からの1又は2個以上の配列変異を含むステップと、(b)内在性標的遺伝子のsiRNA媒介性ジーンサイレンシングのためのギャップ又はニックを有する適切なsiRNA分子を設計及び/又は合成するステップであって、ここでsiRNA分子がギャップ又はニックを有する二重鎖を具え、そのギャップ又はニックがセンス鎖又はアンチセンス鎖のどちらかに見られるステップと、(c)内在性標的遺伝子を発現する細胞へsiRNA分子を投与するステップであって、ここで Within alternative aspects, the methods disclosed herein, (a) a step of selecting a target gene for siRNA-mediated gene silencing, wherein the target gene is an endogenous gene There, the endogenous gene is optional, the steps comprising one or two or more sequence variations from the corresponding wild-type endogenous gene, (b) the gap for siRNA-mediated gene silencing of an endogenous target gene or a step of designing and / or synthesis of suitable siRNA molecules having a nick, wherein comprises a duplex with a siRNA molecule gap or nick, either the gap or nick of the sense strand or antisense strand a step seen, the method comprising administering a siRNA molecule to cells expressing (c) endogenous target gene, wherein iRNAが対応する内在性標的mRNAと特異的に結合することができ、それによって細胞中におけるその発現レベルを低下させるステップとを具える。 iRNA is able to corresponding endogenous target mRNA specifically bind, thereby comprising the step of reducing the expression levels in cells.

本発明の方法が、ギャップ又はニックを有する二重鎖siRNAが標的とする可能なあらゆる遺伝子変異体のヌクレオチド配列に関する経験的知識を必要としているわけではないことは理解されるであろう。 The method of the present invention will duplex siRNA with a gap or nick that not in need of empirical knowledge about the nucleotide sequence of any gene variants possible to target is understood. 最初は、siRNAのヌクレオチド配列を標的遺伝子の保存領域から選択してもよい。 Initially, the nucleotide sequence of the siRNA may be selected from conserved regions of the target gene.

本明細書で開示される組成物及び方法は、ヒト免疫不全ウィルス(HIV)等のレトロウィルス、並びにヒト呼吸器多核体ウィルス、ヒトメタニューモウィルス、ヒトパラインフルエンザウィルス1型、ヒトパラインフルエンザウィルス2型、ヒトパラインフルエンザウィルス3型、ヒトパラインフルエンザウィルス4a型、ヒトパラインフルエンザウィルス4b型、A型インフルエンザウィルス、B型インフルエンザウィルス、ライノウィルス、及びC型インフルエンザウィルス等の呼吸器系ウィルスを含むがこれらに限定されない広範囲にわたる種類の標的ウィルスの力価を低下させるのに有用である。 Compositions and methods disclosed herein, human immunodeficiency virus (HIV) retrovirus such as, as well as human respiratory syncytial virus, human metapneumovirus virus, human parainfluenza virus type 1, human parainfluenza virus 2 type, human parainfluenza virus type 3, human parainfluenza virus 4a type, human parainfluenza virus 4b type, a-type influenza virus, B type influenza virus, rhinovirus, and including respiratory viruses such as influenza C virus is useful for reducing the titer of but not limited to extensive types of target viruses.

本開示の別の態様の範囲内において、動物の遺伝子の発現を阻害する方法が提供され、その方法は、医薬組成物を含む1又は2種類以上の二本鎖リボ核酸(dsRNA)分子の組成物を動物に投与するステップを具え、この場合医薬組成物はdsRNA及びペプチドを具え、各dsRNA分子は約25乃至約30塩基対であり、各ペプチドは約5乃至約40アミノ酸であって典型的にはアミノ酸配列KVLKQ(配列番号51)を含み、各dsRNA分子はペプチドと抱合している。 Within another aspect of the present disclosure, a method of inhibiting the expression of the animal gene is provided, the method comprising the composition of one or more of the double-stranded ribonucleic acid (dsRNA) molecule comprising a pharmaceutical composition comprising the step of administering an object to an animal, in this case the pharmaceutical composition comprising a dsRNA and peptides, each dsRNA molecule is from about 25 to about 30 base pairs, typically the peptide is from about 5 to about 40 amino acids to comprises the amino acid sequence KVLKQ (SEQ ID NO: 51), each dsRNA molecule is conjugated to the peptide.

配列番号1は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列KRRQRRRである。 SEQ ID NO: 1 is the amino acid sequence KRRQRRR of exemplary peptide suitable for generating siRNA- peptide conjugates described herein.
配列番号2は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列RQIKIWFQNRRMKWKKである。 SEQ ID NO: 2 is the amino acid sequence RQIKIWFQNRRMKWKK of exemplary peptide suitable for generating siRNA- peptide conjugates described herein.
配列番号3は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVDである。 SEQ ID NO: 3 is the amino acid sequence DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVD of exemplary peptide suitable for generating siRNA- peptide conjugates described herein.
配列番号4は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列AAVALLPAVLLALLAPである。 SEQ ID NO: 4 is the amino acid sequence AAVALLPAVLLALLAP of exemplary peptide suitable for generating siRNA- peptide conjugates described herein.
配列番号5は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列AAVLLPVLLPVLLAAPである。 SEQ ID NO: 5 is the amino acid sequence AAVLLPVLLPVLLAAP of exemplary peptide suitable for generating siRNA- peptide conjugates described herein.
配列番号6は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列VTVLALGALAGVGVGである。 SEQ ID NO: 6 is the amino acid sequence VTVLALGALAGVGVG of exemplary peptide suitable for generating siRNA- peptide conjugates described herein.
配列番号7は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列GALFLGWLGAAGSTMGAである。 SEQ ID NO: 7 is the amino acid sequence GALFLGWLGAAGSTMGA of exemplary peptide suitable for generating siRNA- peptide conjugates described herein.
配列番号8は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列MGLGLHLLVLAAALQGAである。 SEQ ID NO: 8 is the amino acid sequence MGLGLHLLVLAAALQGA of exemplary peptide suitable for generating siRNA- peptide conjugates described herein.
配列番号9は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列LGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAPである。 SEQ ID NO: 9 is the amino acid sequence LGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP of exemplary peptide suitable for generating siRNA- peptide conjugates described herein.
配列番号10は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列GWTLNSAGYLLKINLKALAALAKKILである。 SEQ ID NO: 10 is the amino acid sequence GWTLNSAGYLLKINLKALAALAKKIL of exemplary peptide suitable for generating siRNA- peptide conjugates described herein.
配列番号11は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列TPPKKKRKVEDPKKKKである。 SEQ ID NO: 11 is the amino acid sequence TPPKKKRKVEDPKKKK of exemplary peptide suitable for generating siRNA- peptide conjugates described herein.
配列番号12は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列RRRRRRRである。 SEQ ID NO: 12 is the amino acid sequence RRRRRRR of exemplary peptide suitable for generating siRNA- peptide conjugates described herein.
配列番号13は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列KLALKLALKALKAALKLAである。 SEQ ID NO: 13 is the amino acid sequence KLALKLALKALKAALKLA of exemplary peptide suitable for generating siRNA- peptide conjugates described herein.
配列番号14は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列GLFGAIAGFIENGWEGである。 SEQ ID NO: 14 is the amino acid sequence GLFGAIAGFIENGWEG of exemplary peptide suitable for generating siRNA- peptide conjugates described herein.
配列番号15は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列FFGAVIGTIALGVATAである。 SEQ ID NO: 15 is the amino acid sequence FFGAVIGTIALGVATA of exemplary peptide suitable for generating siRNA- peptide conjugates described herein.
配列番号16は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列FLGFLLGVGSAIASGVである。 SEQ ID NO: 16 is the amino acid sequence FLGFLLGVGSAIASGV of exemplary peptide suitable for generating siRNA- peptide conjugates described herein.
配列番号17は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列GVFVLGFLGFLATAGSである。 SEQ ID NO: 17 is the amino acid sequence GVFVLGFLGFLATAGS of exemplary peptide suitable for generating siRNA- peptide conjugates described herein.
配列番号18は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列GAAIGLAWIPYFGPAAである。 SEQ ID NO: 18 is the amino acid sequence GAAIGLAWIPYFGPAA of exemplary peptide suitable for generating siRNA- peptide conjugates described herein.
配列番号19は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列ACTCPYCKDSEGRGSGDPGKKKQHICHIQGCGKVYGKTSHLRAHLRWHTGERPFMCである。 SEQ ID NO: 19 is the amino acid sequence ACTCPYCKDSEGRGSGDPGKKKQHICHIQGCGKVYGKTSHLRAHLRWHTGERPFMC of exemplary peptide suitable for generating siRNA- peptide conjugates described herein.
配列番号20は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列ACTCPNCKDGEKRSGEQGKKKHVCHIPDCGKTFRKTSLLRAHVRLHTGERPFVCである。 SEQ ID NO: 20 is the amino acid sequence ACTCPNCKDGEKRSGEQGKKKHVCHIPDCGKTFRKTSLLRAHVRLHTGERPFVC of exemplary peptide suitable for generating siRNA- peptide conjugates described herein.
配列番号21は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列ACTCPNCKEGGGRGTNLGKKKQHICHIPGCGKVYGKTSHLRAHLRWHSGERPFVCである。 SEQ ID NO: 21 is the amino acid sequence ACTCPNCKEGGGRGTNLGKKKQHICHIPGCGKVYGKTSHLRAHLRWHSGERPFVC of exemplary peptide suitable for generating siRNA- peptide conjugates described herein.
配列番号22は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列ACSCPNCREGEGRGSNEPGKKKQHICHIEGCGKVYGKTSHLRAHLRWHTGERPFICである。 SEQ ID NO: 22 is the amino acid sequence ACSCPNCREGEGRGSNEPGKKKQHICHIEGCGKVYGKTSHLRAHLRWHTGERPFIC of exemplary peptide suitable for generating siRNA- peptide conjugates described herein.
配列番号23は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列RCTCPNCTNEMSGLPPIVGPDERGRKQHICHIPGCERLYGKASHLKTHLRWHTGERPFLCである。 SEQ ID NO: 23 is the amino acid sequence RCTCPNCTNEMSGLPPIVGPDERGRKQHICHIPGCERLYGKASHLKTHLRWHTGERPFLC of exemplary peptide suitable for generating siRNA- peptide conjugates described herein.
配列番号24は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列TCDCPNCQEAERLGPAGVHLRKKNIHSCHIPGCGKVYGKTSHLKAHLRWHTGERPFVCである。 SEQ ID NO: 24 is the amino acid sequence TCDCPNCQEAERLGPAGVHLRKKNIHSCHIPGCGKVYGKTSHLKAHLRWHTGERPFVC of exemplary peptide suitable for generating siRNA- peptide conjugates described herein.
配列番号25は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列RCTCPNCKAIKHGDRGSQHTHLCSVPGCGKTYKKTSHLRAHLRKHTGDRPFVCである。 SEQ ID NO: 25 is the amino acid sequence RCTCPNCKAIKHGDRGSQHTHLCSVPGCGKTYKKTSHLRAHLRKHTGDRPFVC of exemplary peptide suitable for generating siRNA- peptide conjugates described herein.
配列番号26は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列PQISLKKKIFFFIFSNFRGDGKSRIHICHLCNKTYGKTSHLRAHLRGHAGNKPFACである。 SEQ ID NO: 26 is the amino acid sequence PQISLKKKIFFFIFSNFRGDGKSRIHICHLCNKTYGKTSHLRAHLRGHAGNKPFAC of exemplary peptide suitable for generating siRNA- peptide conjugates described herein.
配列番号27は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列WWETWKPFQCRICMRNFSTRQARRNHRRRHRである。 SEQ ID NO: 27 is the amino acid sequence WWETWKPFQCRICMRNFSTRQARRNHRRRHR of exemplary peptide suitable for generating siRNA- peptide conjugates described herein.
配列番号28は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列GKINLKALAALAKKILである。 SEQ ID NO: 28 is the amino acid sequence GKINLKALAALAKKIL of exemplary peptide suitable for generating siRNA- peptide conjugates described herein.
配列番号29は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列RVIRVWFQNKRCKDKKである。 SEQ ID NO: 29 is the amino acid sequence RVIRVWFQNKRCKDKK of exemplary peptide suitable for generating siRNA- peptide conjugates described herein.
配列番号30は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列GRKKRRQRRRPPQGRKKRRQRRRPPQGRKKRRQRRRPPQである。 SEQ ID NO: 30 is the amino acid sequence GRKKRRQRRRPPQGRKKRRQRRRPPQGRKKRRQRRRPPQ of exemplary peptide suitable for generating siRNA- peptide conjugates described herein.
配列番号31は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列GEQIAQLIAGYIDIILKKKKSKである。 SEQ ID NO: 31 is the amino acid sequence GEQIAQLIAGYIDIILKKKKSK of exemplary peptide suitable for generating siRNA- peptide conjugates described herein.
配列番号33は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQである。 SEQ ID NO: 33 is the amino acid sequence KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ of exemplary peptide suitable for generating siRNA- peptide conjugates described herein.
配列番号35は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列5'−AUGGUGUGGGUGAGGAGCACAUGGGUG−3'である。 SEQ ID NO: 35 is a typical polynucleotide of a nucleotide sequence 5'-AUGGUGUGGGUGAGGAGCACAUGGGUG-3 suitable for generating siRNA- peptide conjugates described herein '.
配列番号36は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列5'−CCCAUGUGCUCCUCACCCACACCdAT−3'である。 SEQ ID NO: 36 is a typical polynucleotide of a nucleotide sequence 5'-CCCAUGUGCUCCUCACCCACACCdAT-3 suitable for generating siRNA- peptide conjugates described herein '.
配列番号37は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQである。 SEQ ID NO: 37 is the amino acid sequence KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ of exemplary peptide suitable for generating siRNA- peptide conjugates described herein.
配列番号41は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列RKESYSVYVYKVLKQである。 SEQ ID NO: 41 is the amino acid sequence RKESYSVYVYKVLKQ of exemplary peptide suitable for generating siRNA- peptide conjugates described herein.
配列番号42は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列KKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQである。 SEQ ID NO: 42 is the amino acid sequence KKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ of exemplary peptide suitable for generating siRNA- peptide conjugates described herein.
配列番号43は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列VTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQである。 SEQ ID NO: 43 is the amino acid sequence VTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ of exemplary peptide suitable for generating siRNA- peptide conjugates described herein.
配列番号44は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列AQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQである。 SEQ ID NO: 44 is the amino acid sequence AQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ of exemplary peptide suitable for generating siRNA- peptide conjugates described herein.
配列番号45は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列KDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQである。 SEQ ID NO: 45 is the amino acid sequence KDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ of exemplary peptide suitable for generating siRNA- peptide conjugates described herein.
配列番号46は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列KKRKRSRKESYSVYVYKVLKQである。 SEQ ID NO: 46 is the amino acid sequence KKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ of exemplary peptide suitable for generating siRNA- peptide conjugates described herein.
配列番号47は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列KRSRKESYSVYVYKVLKQである。 SEQ ID NO: 47 is the amino acid sequence KRSRKESYSVYVYKVLKQ of exemplary peptide suitable for generating siRNA- peptide conjugates described herein.
配列番号48は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列SYSVYVYKVLKQである。 SEQ ID NO: 48 is the amino acid sequence SYSVYVYKVLKQ of exemplary peptide suitable for generating siRNA- peptide conjugates described herein.
配列番号49は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列VYVYKVLKQである。 SEQ ID NO: 49 is the amino acid sequence VYVYKVLKQ of exemplary peptide suitable for generating siRNA- peptide conjugates described herein.
配列番号50は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列YKVLKQである。 SEQ ID NO: 50 is the amino acid sequence YKVLKQ of exemplary peptide suitable for generating siRNA- peptide conjugates described herein.
配列番号51は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列KVLKQである。 SEQ ID NO: 51 is the amino acid sequence KVLKQ of exemplary peptide suitable for generating siRNA- peptide conjugates described herein.
配列番号52は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列KGSKKAVTKAQKKEGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQである。 SEQ ID NO: 52 is the amino acid sequence KGSKKAVTKAQKKEGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ of exemplary peptide suitable for generating siRNA- peptide conjugates described herein.
配列番号53は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列5'−GCCUGUACCUCAUCUACUCUU−3'である。 SEQ ID NO: 53 is a typical polynucleotide of a nucleotide sequence 5'-GCCUGUACCUCAUCUACUCUU-3 suitable for generating siRNA- peptide conjugates described herein '.
配列番号54は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列3'−UUCGGACAUGGAGUAGAUGAG−5'である。 SEQ ID NO: 54 is an exemplary nucleotide sequence of the polynucleotide 3'-UUCGGACAUGGAGUAGAUGAG-5 'suitable for generating siRNA- peptide conjugates described herein.
配列番号55は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列5'−GCCUCUUCUCCUUCCUGAUCGUGdGdC−3'である。 SEQ ID NO: 55 is a typical polynucleotide of a nucleotide sequence 5'-GCCUCUUCUCCUUCCUGAUCGUGdGdC-3 suitable for generating siRNA- peptide conjugates described herein '.
配列番号56は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列3'−GUCGGAGAAGAGGAAGGACUAGCACCG−5'である。 SEQ ID NO: 56 is an exemplary nucleotide sequence of the polynucleotide 3'-GUCGGAGAAGAGGAAGGACUAGCACCG-5 'suitable for generating siRNA- peptide conjugates described herein.
配列番号57は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列5'−GCCUGCUGCACUUUGGAGUGAUCdGdG−3'である。 SEQ ID NO: 57 is a typical polynucleotide of a nucleotide sequence 5'-GCCUGCUGCACUUUGGAGUGAUCdGdG-3 suitable for generating siRNA- peptide conjugates described herein '.
配列番号58は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列3'−GACGGACGACGUGAAACCUCACUAGCC−5'である。 SEQ ID NO: 58 is an exemplary nucleotide sequence of the polynucleotide 3'-GACGGACGACGUGAAACCUCACUAGCC-5 'suitable for generating siRNA- peptide conjugates described herein.
配列番号59は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列5'−CCCAUGUGCUCCUCACCCACACCdAT−3'である。 SEQ ID NO: 59 is a typical polynucleotide of a nucleotide sequence 5'-CCCAUGUGCUCCUCACCCACACCdAT-3 suitable for generating siRNA- peptide conjugates described herein '.
配列番号60は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列3'−GUGGGUACACGAGGAGUGGGUGUGGUA−5'である。 SEQ ID NO: 60 is an exemplary nucleotide sequence of the polynucleotide 3'-GUGGGUACACGAGGAGUGGGUGUGGUA-5 'suitable for generating siRNA- peptide conjugates described herein.
配列番号61は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列5'−ACCUCAUCUACUCCCAGGUCCUCdTdT−3'である。 SEQ ID NO: 61 is a typical polynucleotide of a nucleotide sequence 5'-ACCUCAUCUACUCCCAGGUCCUCdTdT-3 suitable for generating siRNA- peptide conjugates described herein '.
配列番号62は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列3'−CAUGGAGUAGAUGAGGGUCCAGGAGAA−5'である。 SEQ ID NO: 62 is an exemplary nucleotide sequence of the polynucleotide 3'-CAUGGAGUAGAUGAGGGUCCAGGAGAA-5 'suitable for generating siRNA- peptide conjugates described herein.
配列番号63は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列5'−GCCUGUACCUCAUCUACUCCCAGGUCC−3'である。 SEQ ID NO: 63 is a typical polynucleotide of a nucleotide sequence 5'-GCCUGUACCUCAUCUACUCCCAGGUCC-3 suitable for generating siRNA- peptide conjugates described herein '.
配列番号64は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列5'−GGUCCUGGGAGUAGAUGAGGUACAGGCUU−3'である。 SEQ ID NO: 64 is a typical polynucleotide of a nucleotide sequence 5'-GGUCCUGGGAGUAGAUGAGGUACAGGCUU-3 suitable for generating siRNA- peptide conjugates described herein '.
配列番号65は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列5'−AGACAGCGACCAAAAGAAUUCGGdAdU−3'である。 SEQ ID NO: 65 is a typical polynucleotide of a nucleotide sequence 5'-AGACAGCGACCAAAAGAAUUCGGdAdU-3 suitable for generating siRNA- peptide conjugates described herein '.
配列番号66は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列5'−AUCCGAAUUCUUUUGGUCGCUGUCUdTdT−3'である。 SEQ ID NO: 66 is a typical polynucleotide of a nucleotide sequence 5'-AUCCGAAUUCUUUUGGUCGCUGUCUdTdT-3 suitable for generating siRNA- peptide conjugates described herein '.
配列番号67は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列5'−AUGAAGAUCUGUUCCACCAUUGAdAdG−3'である。 SEQ ID NO: 67 is a typical polynucleotide of a nucleotide sequence 5'-AUGAAGAUCUGUUCCACCAUUGAdAdG-3 suitable for generating siRNA- peptide conjugates described herein '.
配列番号68は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列5'−CUUCAAUGGUGGAACAGAUCUUCAUdTdT−3'である。 SEQ ID NO: 68 is a typical polynucleotide of a nucleotide sequence 5'-CUUCAAUGGUGGAACAGAUCUUCAUdTdT-3 suitable for generating siRNA- peptide conjugates described herein '.
配列番号69は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列5'−GAUCUGUUCCACCAUUGAAGAACdUdC−3'である。 SEQ ID NO: 69 is a typical polynucleotide of a nucleotide sequence 5'-GAUCUGUUCCACCAUUGAAGAACdUdC-3 suitable for generating siRNA- peptide conjugates described herein '.
配列番号70は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列5'−GAGUUCUUCAAUGGUGGAACAGAUCdTdT−3'である。 SEQ ID NO: 70 is a typical polynucleotide of a nucleotide sequence 5'-GAGUUCUUCAAUGGUGGAACAGAUCdTdT-3 suitable for generating siRNA- peptide conjugates described herein '.
配列番号71は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列5'−UUGAGGAGUGCCUGAUUAAUGAUdCdC−3'である。 SEQ ID NO: 71 is a typical polynucleotide of a nucleotide sequence 5'-UUGAGGAGUGCCUGAUUAAUGAUdCdC-3 suitable for generating siRNA- peptide conjugates described herein '.
配列番号72は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列5'−GGAUCAUUAAUCAGGCACUCCUCAAdTdT−3'である。 SEQ ID NO: 72 is a typical polynucleotide of a nucleotide sequence 5'-GGAUCAUUAAUCAGGCACUCCUCAAdTdT-3 suitable for generating siRNA- peptide conjugates described herein '.
配列番号73は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列5'−GGAUCUUAUUUCUUCGGAGACAAdTdG−3'である。 SEQ ID NO: 73 is a typical polynucleotide of a nucleotide sequence 5'-GGAUCUUAUUUCUUCGGAGACAAdTdG-3 suitable for generating siRNA- peptide conjugates described herein '.
配列番号74は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列5'−CAUUGUCUCCGAAGAAAUAAGAUCCdTdT−3'である。 SEQ ID NO: 74 is a typical polynucleotide of a nucleotide sequence 5'-CAUUGUCUCCGAAGAAAUAAGAUCCdTdT-3 suitable for generating siRNA- peptide conjugates described herein '.
配列番号75は、本明細書の表2に示すsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的な25塩基長のB鎖配列のヌクレオチド配列5'−GGAUCUUAUUUCUUCGGAGACAAUG−3'である。 SEQ ID NO: 75 is an exemplary 25 nucleotide sequence 5'-GGAUCUUAUUUCUUCGGAGACAAUG-3 base length B chain sequence 'suitable for generating siRNA- peptide conjugates shown in Table 2 herein.
配列番号76は、本明細書の表2に示すsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的な27塩基長のA鎖配列のヌクレオチド配列3'−TTCCUAGAAUAAAGAAGCCUCUGUUAC−5'である。 SEQ ID NO: 76 is an exemplary 27 nucleotide sequence 3'-TTCCUAGAAUAAAGAAGCCUCUGUUAC-5 bases long of A chain sequence 'suitable for generating siRNA- peptide conjugates shown in Table 2 herein.
配列番号77乃至132は、本明細書の表2に示すギャップ付きsiRNA−ペプチド抱合体を生成するための典型的なポリヌクレオチドのA鎖、B1鎖、及びB2鎖のヌクレオチド配列である。 SEQ ID NO 77 to 132, A-chain of a typical polynucleotide to produce gapped siRNA- peptide conjugates shown in Table 2 herein, is the nucleotide sequence of the B1 chain, and B2 chains.
配列番号34、38乃至40、133、及び166は、本明細書で述べるニック付きsiRNA−ペプチド抱合体を生成するための典型的なポリヌクレオチドのA鎖、B1鎖、及びB2鎖のヌクレオチド配列である。 SEQ ID NO: 34 and 38 to 40,133, and 166, A-chain of a typical polynucleotide to produce a nicked siRNA- peptide conjugates described herein, B1 chain, and B2 in the nucleotide sequence of the strand is there.

本開示は、短鎖干渉核酸(siNA)又はその前駆体がポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドと組み合わせて用いられると、ヒトなどの哺乳類にインビボで投与された時に送達を促進し、安定性を向上し、及び/又は毒性を低下させるという観察に基づいている。 The present disclosure, the short interfering nucleic acid (siNA) or a precursor thereof in combination with a polynucleotide delivery, to facilitate delivery when administered in vivo to mammals, such as humans, to improve stability It is based on the observation that, and / or reduce toxicity. 従って、本明細書で開示されるポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドは、とりわけsiNAを含むポリヌクレオチド及びその前駆体の細胞内送達又は取り込みを促進させる能力によって選択された天然の又は人工のポリペプチドあってよい。 Accordingly, polynucleotide delivery-enhancing polypeptides disclosed herein, especially when there polynucleotides and natural or artificial polypeptide selected by a precursor of intracellular delivery or ability to facilitate uptake containing siNA good.

本発明のsiNA及び組成物は、1又は2種類以上のポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドと混合、複合体化、又は抱合されて、標的細胞とsiNA単独(すなわち送達促進ポリペプチドなしのsiNA)との接触による送達と比べてsiNAの細胞内送達を促進する組成物を形成することができる。 siNA and compositions of the present invention, one or two or more types mixed with polynucleotide delivery, complexation, or are conjugated, (i.e. delivery-enhancing polypeptides without siNA) target cells and siNA alone and of compared with delivery by the contact can be formed of a composition for promoting the intracellular delivery of siNA.

ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドの選択及び設計 Polynucleotide delivery selection and design
本発明の特定の様態では、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドは、ヒストンタンパク質、又はそのポリペプチド若しくはペプチド断片、誘導体、類似体、若しくは抱合体である。 In certain aspects of the present invention, polynucleotide delivery-enhancing polypeptides, histone proteins, or polypeptides or peptide fragments, derivatives, analogs, or a conjugate. これらの様態の範囲内において、siNAは、例えばヒストンH1、ヒストンH2A、ヒストンH2B、ヒストンH3、若しくはヒストンH4などの1種類以上のヒストン、又は典型的にはもとのヒストンタンパク質の少なくとも5乃至10個若しくは10乃至20個の連続する残基であるヒストンタンパク質の部分配列を少なくとも含む、それらの1種類以上のポリペプチド断片若しくは誘導体などといった1種類以上の完全長型ヒストンタンパク質、又はヒストンタンパク質の部分配列に少なくとも一部対応するポリペプチドと混合、複合体化、又は抱合している。 Within these aspects, siNA, for example histone H1, histone H2A, histone H2B, histone H3, or one or more histones, such as histone H4, or typically at least 5 to 10 of the original histone proteins, the at least a partial sequence of the histone proteins are pieces or 10 to 20 contiguous residues, portions thereof of one or more polypeptide fragments or derivatives such as such as one or more full-length type histone proteins or histone proteins mixing at least a portion corresponding polypeptide sequence, complexation, or are conjugated.

より詳細な様態では、siRNA/ヒストン混合物、複合体、又は抱合体は実質的に両親媒性化合物を含まない。 In a more detailed aspect, siRNA / histone mixture, complex or conjugate is substantially free of amphiphilic compounds. 他の詳細な様態では、ヒストンタンパク質又はポリペプチドと混合、複合体化、または抱合されたsiNAは、例えば30又は29個以下のヌクレオチドを有する二本鎖RNAなどの二本鎖RNAを具え、短鎖干渉RNA(siRNA)である。 In other detailed aspects, combined with histone protein or polypeptide, complexed, or conjugated siNA can comprise a double-stranded RNA such as double-stranded RNA having, for example, 30 or 29 nucleotides or less, the short it is an interfering RNA (siRNA). 典型的な様態では、ヒストンポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドは、本明細書において以下で述べるPN73と称するポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドによって例示されるように、ヒストンH2Bの断片を具える。 In a typical manner, histone polynucleotide delivery-enhancing polypeptides, as exemplified by the polynucleotide delivery called PN73 described herein below, it comprises a fragment of histone H2B. さらに追加的な詳細な様態では、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドはペグ化することにより、特にインビボ投与という面において安定性及び/又は有効性を向上させることができる。 In yet additional detailed aspects, polynucleotide delivery-enhancing polypeptides by pegylation, can be particularly improved stability and / or efficacy in terms of in vivo administration.

本発明の追加的な様態の範囲内において、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドは、両親媒性アミノ酸配列を具えるように選択又は合理的に設計される。 Within additional aspects of the present invention, polynucleotide delivery-enhancing polypeptide is selected or rationally designed to comprise an amphipathic amino acid sequence. 例えば、有用なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドとしては、帯電した配列ドメイン若しくはモチーフを形成する複数の帯電したアミノ酸残基と連結して両親媒性ペプチドを生成する、疎水性配列ドメイン若しくはモチーフを形成する複数の非極性又は疎水性アミノ酸残基を具えるものを選択することができる。 For example, useful polynucleotide delivery, in conjunction with a plurality of charged amino acid residues that form a charged sequence domain or motif produces an amphipathic peptide, to form a hydrophobic sequence domain or motif it can be selected which comprises a plurality of non-polar or hydrophobic amino acid residues.

他の様態では、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドは、タンパク質導入ドメイン又はモチーフ、及び膜融合ペプチドドメイン又はモチーフを含むように選択される。 In another aspect, polynucleotide delivery-enhancing polypeptides are selected to comprise a protein transduction domain or motif, and a fusogenic peptide domain or motif. タンパク質導入ドメインは、細胞膜内へ挿入することができ、好ましくは細胞膜を通過することができるペプチド配列である。 Protein transduction domain may be inserted into the cell membrane, the peptide sequence preferably can pass through the cell membrane. 膜融合ペプチドは、例えば細胞膜又はエンドソームを取り囲む膜などの脂質膜を不安定化するペプチドであり、この働きは低pHにおいて促進される。 Membrane fusion peptide, for example, a peptide which destabilize lipid membranes, such as a membrane surrounding the cell membrane or endosome, this work is promoted at low pH. 典型的な膜融合ドメイン又はモチーフは、例えば線維芽細胞増殖因子4(FGF−4)などの広範囲にわたる種々のウィルス融合タンパク質及びその他のタンパク質に見られる。 Typical membrane fusion domain or motif, for example, found in fibroblast growth factor 4 (FGF-4) A variety of viral fusion proteins and other proteins over a wide range of such.

本発明のポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドを合理的に設計するために、核酸の細胞膜を通しての細胞内への進入を促進するモチーフとして、タンパク質導入ドメインが用いられる。 To rationally design polynucleotide delivery-enhancing polypeptides of the present invention, as the motif to facilitate entry into the cell through the cell membrane of a nucleic acid, a protein transduction domain is used. ある様態では、輸送された核酸はエンドソーム内に封入されることになる。 In one embodiment the transport nucleic acids will be encapsulated within the endosome. エンドソーム内部はpHが低いため、膜融合ペプチドモチーフがエンドソームの膜を不安定化させる結果となる。 Since the endosome interior pH is low, resulting in membrane fusion peptide motif destabilizing the membrane of endosomes. エンドソームの膜の不安定化及び分解により、siNAが細胞質内へ放出され、siNAはそこでRISC複合体と会合して標的mRNAへ向かうことができる。 The destabilization and degradation of the endosome membrane, siNA is released into the cytoplasm, siNA can be directed in association with where RISC complex to the target mRNA.

本発明のポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドへ任意に取り込まれるタンパク質導入ドメインの例としては、 Examples of protein transduction domains to be incorporated into any the polynucleotide delivery-enhancing polypeptides of the invention,
1. 1. TATタンパク質導入ドメイン(PTD)(配列番号1)KRRQRRR; TAT protein transduction domain (PTD) (SEQ ID NO: 1) KRRQRRR;
2. 2. ペネトラチン(penetratin)PTD(配列番号2)RQIKIWFQNRRMKWKK; Penetratin (penetratin) PTD (SEQ ID NO: 2) RQIKIWFQNRRMKWKK;
3. 3. VP22 PTD(配列番号3)DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVD; VP22 PTD (SEQ ID NO: 3) DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVD;
4. 4. カポジFGFシグナル配列(配列番号4)AAVALLPAVLLALLAP;及び(配列番号5)AAVLLPVLLPVLLAAP; Kaposi FGF signal sequence (SEQ ID NO: 4) AAVALLPAVLLALLAP; and (SEQ ID NO: 5) AAVLLPVLLPVLLAAP;
5. 5. ヒトβ3インテグリンシグナル配列(配列番号6)VTVLALGALAGVGVG; Human β3 integrin signal sequence (SEQ ID NO: 6) VTVLALGALAGVGVG;
6. 6. gp41融合配列(配列番号7)GALFLGWLGAAGSTMGA; gp41 fusion sequence (SEQ ID NO: 7) GALFLGWLGAAGSTMGA;
7. 7. カイマンクロコディルス(caiman crocodylus)のIg(v)軽鎖(配列番号8)MGLGLHLLVLAAALQGA; Caiman crocodile dill scan (caiman crocodylus) of Ig (v) light chain (SEQ ID NO: 8) MGLGLHLLVLAAALQGA;
8. 8. hCT−誘導性ペプチド(配列番号9)LGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP; hCT- inducing peptide (SEQ ID NO: 9) LGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP;
9. 9. トランスポータン(配列番号10)GWTLNSAGYLLKINLKALAALAKKIL; Transportan (SEQ ID NO: 10) GWTLNSAGYLLKINLKALAALAKKIL;
10. 10. ロリゴマ(loligomer)(配列番号11)TPPKKKRKVEDPKKKK; Rorigoma (loligomer) (SEQ ID NO: 11) TPPKKKRKVEDPKKKK;
11. 11. アルギニンペプチド(配列番号12)RRRRRRR;並びに12. Arginine peptide (SEQ ID NO: 12) RRRRRRR; and 12. 両親媒性モデルペプチド(配列番号13)KLALKLALKALKAALKLA; Amphiphilic model peptide (SEQ ID NO: 13) KLALKLALKALKAALKLA;
が挙げられる。 And the like.

本発明のポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドへ任意に取り込まれるウィルス融合ペプチド膜融合ドメインの例としては、 Examples of viral fusion peptides fusogenic domains incorporated into any the polynucleotide delivery-enhancing polypeptides of the invention,
1. 1. インフルエンザHA2(配列番号14)GLFGAIAGFIENGWEG; Influenza HA2 (SEQ ID NO: 14) GLFGAIAGFIENGWEG;
2. 2. センダイF1(配列番号15)FFGAVIGTIALGVATA; Sendai F1 (SEQ ID NO: 15) FFGAVIGTIALGVATA;
3. 3. 呼吸器系シンチウムウィルスF1(配列番号16)FLGFLLGVGSAIASGV; Respiratory shea Nchiumu virus F1 (SEQ ID NO: 16) FLGFLLGVGSAIASGV;
4. 4. HIV gp41(配列番号17)GVFVLGFLGFLATAGS;及び5. HIV gp41 (SEQ ID NO: 17) GVFVLGFLGFLATAGS; and 5. エボラGP2(配列番号18)GAAIGLAWIPYFGPAA; Ebola GP2 (SEQ ID NO: 18) GAAIGLAWIPYFGPAA;
が挙げられる。 And the like. 本発明のさらに追加的な様態の範囲内では、本発明の方法及び組成物の範囲内において、ポリペプチド−siNA複合体形成を促進、及び/若しくはsiNAの送達を促進するDNA結合ドメイン又はモチーフが取り込まれたポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドが提供される。 Within yet an additional aspect of the present invention, within the scope of the methods and compositions of the present invention, facilitate polypeptide -siNA complex formation, and / or a DNA binding domain or motif to facilitate delivery of siNA incorporated polynucleotide delivery-enhancing polypeptides are provided. ここで言うDNA結合ドメインの典型例としては、以下の表1に示すDNA結合性制御タンパク質及びその他のタンパク質で述べるように、様々な「ジンクフィンガー」ドメインが挙げられる(例えば、Simpsonら,J. Biol. Chem. 278: 28011-28018, 2003を参照)。 Typical examples of DNA-binding domain here, as discussed below DNA binding regulatory proteins are shown in Table 1 and other proteins include various "zinc finger" domain (e.g., Simpson et al., J. .. Biol Chem 278: 28011-28018, see 2003).

この表は、C−x(2,4)−C−x(12)−H−x(3)−H(配列番号32)のモチーフパターンで表される二本鎖DNA結合性の保存ジンクフィンガーモチーフを示しており、それ自体を用いて本発明にかかる追加的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドを選択して設計することができる。 * This table, C-x (2,4) -C -x (12) -H-x (3) -H double-stranded DNA binding conserved zinc represented by the motif pattern (SEQ ID NO: 32) shows a finger motif, it may be designed to select additional polynucleotide delivery according to the present invention with themselves.
**表1に示す配列、Sp1、Sp2、Sp3、Sp4、DrosBtd、DrosSp、CeT22C8.5、及びY4pB1A. ** sequence shown in Table 1, Sp1, Sp2, Sp3, Sp4, DrosBtd, DrosSp, CeT22C8.5, and Y4pB1A. 4は、本明細書ではそれぞれ配列番号19、20、21、22、23、24、25、及び26と定める。 4 is defined herein SEQ ID NO: 19,20,21,22,23,24,25, and 26.

本発明のポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドを構築するのに有用なDNA結合ドメインの他の選択肢としては、例えばHIV Tatタンパク質配列の一部分が挙げられる(以下の実施例参照)。 Other options of useful DNA binding domains for constructing polynucleotide delivery-enhancing polypeptides of the invention include a portion, e.g. HIV Tat protein sequences (see Examples below).

本明細書において以下に述べる本発明の典型的な様態の範囲内において、前述の構造要素、ドメイン、又はモチーフのいずれかをsiNAの対象細胞への送達の促進を媒介するのに効果的な単一のポリペプチドと組み合わせることによって、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドを合理的に設計し構築することができる。 In the typical manner the scope of the present invention described herein below, effective single in mediating structural elements described above, domain, or any of the motifs to promote delivery of siNA to target cells by combining the first polypeptide, and rationally design polynucleotide delivery can be constructed. 例えば、TATポリペプチドのタンパク質導入ドメインを、HA2と呼ばれるインフルエンザウィルスの赤血球凝集素タンパク質のN末端側の20個のアミノ酸と融合することにより、本発明の典型的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチド構成が得られた。 For example, the protein transduction domain of the TAT polypeptide, by fusing 20 amino acids of the N-terminal side of the hemagglutinin protein of influenza virus, called HA2, typical polynucleotide delivery configuration of the present invention obtained. 様々なその他のポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドが本開示で提供され、このことは本発明の発想が、siNAの送達を促進するのに効果的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドの様々な集団の作製及び使用に広く適用されることを明らかに示している。 Are provided in this disclosure various other polynucleotide delivery, the idea of ​​this is invention, prepared and various populations of effective polynucleotide delivery to facilitate delivery of siNA clearly it shows that it is widely applied to use.

本発明の範囲内のさらに追加的な典型的ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドは、以下に示すペプチド、WWETWKPFQCRICMRNFSTRQARRNHRRRHR(配列番号27);GKINLKALAALAKKIL(配列番号28);RVIRVWFQNKRCKDKK(配列番号29);GRKKRRQRRRPPQGRKKRRQRRRPPQGRKKRRQRRRPPQ(配列番号30);GEQIAQLIAGYIDIILKKKKSK(配列番号31);Poly Lys−Trp,4:1,分子量 20,000−50,000;及びPoly Orn−Trp,4:1,分子量 20,000−50,000より選択することができる。 Further additional exemplary polynucleotide delivery-enhancing polypeptides within the scope of the present invention, a peptide described below, DaburyudaburyuitidaburyukeiPFQCRICMRNFSTRQARRNHRRRHR (SEQ ID NO: 27); GKINLKALAALAKKIL (SEQ ID NO: 28); RVIRVWFQNKRCKDKK (SEQ ID NO: 29); GRKKRRQRRRPPQGRKKRRQRRRPPQGRKKRRQRRRPPQ (SEQ ID NO: 30); GEQIAQLIAGYIDIILKKKKSK (SEQ ID NO: 31); Poly Lys-Trp, 4: 1, molecular weight 20,000-50,000; and Poly Orn-Trp, 4: 1, be selected from the molecular weight 20,000-50,000 can. 本発明の組成物及び方法の範囲内で有用な追加的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドは、メリチンタンパク質配列のすべて又は一部を含む。 Compositions and useful additional polynucleotide delivery within the methods of this invention include all or part of the melittin protein sequence.

さらに他の典型的ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドは以下の例で示される。 Still other exemplary polynucleotide delivery-enhancing polypeptides are shown in the following example. これらのペプチドのいずれか一つ若しくは組み合わせを選択又は組み合わせて、本発明の方法及び組成物の範囲内でsiNAの細胞内送達を誘起又は促進するのに効果的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチド試薬を得ることができる。 Selecting one or a combination of these peptides or in combination, effective polynucleotide delivery reagent to induce or promote the intracellular delivery of the siNA within the methods and compositions of the present invention it is possible to obtain.

ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチド、siRNA、及び脂質を含む組成物 Polynucleotide delivery, a composition comprising siRNA, and lipids
より詳細な態様では、1又は2種類以上のsiRNA及びポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドを具える混合物、複合体、及び/又は抱合体を、任意にLIPOFECTIN(登録商標)などのカチオン性脂質と組み合わせてもよい(例:混合又は複合体化)。 In a more detailed aspect, one or a mixture comprising two or more siRNA and polynucleotide delivery, complex, and / or the conjugate, optionally in combination with a cationic lipid, such as LIPOFECTIN (registered trademark) which may (e.g. mixing or complexation). この点で、siRNA単独と複合体化又は抱合されたポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドは、RNAiによるジーンサイレンシングを媒介するのに十分なsiNAの送達をもたらすということが、予想外なことに本発明において開示される。 In this regard, siRNA alone and complexed or conjugated polynucleotide delivery-enhancing polypeptides, the present invention in that leads to the delivery of sufficient siNA to mediate gene silencing by RNAi is, unexpectedly It disclosed in. 本発明ではさらに、siRNA/ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチド複合体又は抱合体は、リポフェクティンなどのカチオン性脂質と混合又は複合体化されると、siNA送達及びジーンサイレンシングを媒介する活性がより高くなることも開示される。 The present invention further, siRNA / polynucleotide delivery complex or conjugate, when mixed or complexed with cationic lipids such as Ripofekutin, activity mediating siNA delivery and gene silencing is higher it is also disclosed that.

ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチド、siRNA、及び脂質を具えたこれらの組成物を作製するためには、まずsiRNA及びペプチドを細胞培地などの適切な媒体中で互いに混合し、その後カチオン性脂質を混合物へ添加してsiRNA/送達ペプチド/カチオン性脂質組成物を形成することができる。 Polynucleotide delivery, siRNA, and for making these compositions comprising a lipid, first siRNA and peptide were mixed together in a suitable medium, such as cell culture media, the subsequent cationic lipid mixture added to it to form a siRNA / delivery peptide / cationic lipid composition. 任意に、ペプチドとカチオン性脂質をまず細胞培地などの適切な媒体中で互いに混合し、その後siRNAを添加してsiRNA/送達ペプチド/カチオン性脂質組成物を形成することもできる。 Optionally, mixed together in a suitable medium, such as first cell culture medium with the peptides cationic lipids may be subsequently the siRNA was added to form a siRNA / delivery peptide / cationic lipid composition.

本発明のこれらの態様の範囲内において有用なカチオン性脂質の例としては、N−[1−(2,3−ジオレオイルオキシ)プロピル]−N,N,N−トリメチルアンモニウムクロライド、1,2−ビス(オレオイルオキシ)−3−3−(トリメチルアンモニウム)プロパン、1,2−ジミリスチルオキシプロピル−3−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロマイド、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイド、2,3−ジオレイルオキシ−N−[2−(スペルミンカルボキシアミド)エチル]−N,N−ジメチル−1−プロパナミニウムトリフルオロアセテート、1,3−ジオレオイルオキシ−2−(6−カルボキシスペルミル)−プロピルアミド、5−カルボキシスペルミルグリシンジオクタデシルアミド、テトラメチルテト Examples of useful cationic lipids within the scope of these aspects of the invention, N- [1- (2,3- dioleoyloxy) propyl] -N, N, N-trimethylammonium chloride, 1, 2- bis (oleoyloxy) -3-3- (trimethylammonium) propane, 1,2-dimyristyloxypropyl-3-dimethyl-hydroxyethyl ammonium bromide, dimethyl dioctadecyl ammonium bromide, 2,3-dioleyloxy - N- [2- (spermine carboxamido) ethyl] -N, N-dimethyl-1-propanaminium trifluoroacetate, 1,3-dioleoyloxy-2- (6-carboxyfluorescein spelling mil) - propyl amide, 5-carboxyfluorescein dioctadecylamide, tetramethyl Tet パルミトイルスペルミン、テトラメチルテトラオレイルスペルミン、テトラメチルテトララウリルスペルミン、テトラメチルテトラミリスチルスペルミン、及びテトラメチルジオレイルスペルミンが挙げられる。 Palmitoyl spermine, tetramethyl oleyl spermine, tetramethyl lauryl spermine, tetramethyl myristyl spermine, and tetramethyl dioleyl spermine like. DOTMA(N−[1−(2,3−ジオレオイルオキシ)プロピル]−N,N,N−トリメチルアンモニウムクロライド)、DOTAP(1,2−ビス(オレオイルオキシ)−3,3−(トリメチルアンモニウム)プロパン)、DMRIE(1,2−ジミリスチルオキシプロピル−3−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロマイド)、又はDDAB(ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイド)。 DOTMA (N- [1- (2,3- dioleoyloxy) propyl] -N, N, N- trimethylammonium chloride), DOTAP (1,2-bis (oleoyloxy) -3,3- (trimethyl ammonium) propane), DMRIE (1,2-dimyristyloxypropyl-3-dimethyl-hydroxyethyl ammonium bromide), or DDAB (dimethyl dioctadecyl ammonium bromide). 多価カチオン性脂質としては、リポスペルミンが含まれ、具体的にはDOSPA(2,3−ジオレイルオキシ−N−[2−(スペルミンカルボキシアミド)エチル]−N,N−ジメチル−1−プロパナミニウムトリフルオロアセテート)及びDOSPER(1,3−ジオレオイルオキシ−2−(6−カルボキシスペルミル)−プロピルアミド)、並びにTMTPS(テトラメチルテトラパルミトイルスペルミン)、TMTOS(テトラメチルテトラオレイルスペルミン)、TMTLS(テトラメチルテトララウリルスペルミン)、TMTMS(テトラメチルテトラミリスチルスペルミン)、TMDOS(テトラメチルジオレイルスペルミン)、及びDOGS(ジオクタデシル−アミドグリシルスペルミン)(TRANSFECTAM)(登録 The polyvalent cationic lipids, contains lipospermine, specifically DOSPA (2,3-dioleyloxy-N-[2-(spermine carboxamido) ethyl] -N, N-dimethyl-1-pro Pana mini ium trifluoroacetate) and DOSPER (1,3-dioleoyloxy-2- (6-carboxyfluorescein spelling mil) - propyl amide), as well as TMTPS (tetramethyl palmitoyl spermine), TMTOS (tetramethyl oleyl spermine) , TMTLS (tetramethyl lauryl spermine), TMTMS (tetramethyl myristyl spermine), TMDOS (tetramethyl dioleyl spermine), and DOGS (dioctadecyl - glycylspermine spermine) (TRANSFECTAM) (registration 標)を含むがこれらに限定されないジ及びテトラアルキルテトラメチルスペルミンを含む。 Including preparation) containing di- and tetraalkyl tetramethyl spermine without limitation. その他の有用なカチオン性脂質は、例えば米国特許公報第6,733,777号、米国特許公報第6,376,248号、米国特許公報第5,736,392号、米国特許公報第5,686,958号、米国特許公報第5,334,761号、及び米国特許公報第5,459,127号に記載されている。 Other useful cationic lipids, for example, U.S. Pat. No. 6,733,777, U.S. Pat. No. 6,376,248, U.S. Pat. No. 5,736,392, U.S. Patent No. 5,686 It is described in 958, U.S. Patent No. 5,334,761, and U.S. Patent Publication No. 5,459,127.

カチオン性脂質は、任意に非カチオン性脂質、特に、例えばDOPE(ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン)、DPhPE(ジフィタノイルホスファチジルエタノールアミン)、又はコレステロールなどの中性脂質と組み合わされる。 Cationic lipids, optionally non-cationic lipids, especially, for example DOPE (dioleoylphosphatidylethanolamine), DPhPE (di Fi data noil phosphatidylethanolamine), or combined with a neutral lipid such as cholesterol. DOSPAとDOPEの3:1(w/w)混合物又はDOTMAとDOPEの1:1(w/w)混合物(LIPOFECTIN(登録商標)、Invitrogen社)よりなるカチオン性脂質組成物は、一般に本発明の組成物をトランスフェクトするのに有用である。 DOSPA and DOPE in 3: 1 (w / w) mixture or of DOTMA and DOPE 1: 1 (w / w) mixture (LIPOFECTIN (registered trademark), Invitrogen Corp.) Cationic lipid composition comprising generally the present invention the composition is useful for transfection. 高等真核細胞系の十分なトランスフェクションを誘起する組成物がトランスフェクション組成物として好ましい。 Composition for inducing a sufficient transfection of higher eukaryotic cell systems are preferred as a transfection composition.

短鎖干渉核酸(siNA)の選択、設計、及び合成 Selection of short interfering nucleic acid (siNA), design, and synthesis
典型的な様態では、本開示は、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドと混合し、複合体化し、又は抱合した短鎖干渉核酸(siNA)、短鎖干渉RNA(siRNA)、二本鎖RNA(dsRNA)、マイクロRNA(mRNA)、又は短鎖ヘアピンRNA(shRNA)などの低分子核酸分子を具える組成物を特徴とする。 In a typical embodiment, the present disclosure is mixed with polynucleotide delivery, complexed, or conjugated short interfering nucleic acid (siNA), short interfering RNA (siRNA), double-stranded RNA (dsRNA) features a composition comprising a low molecular nucleic acid molecule, such as a micro RNA (mRNA), or short hairpin RNA (shRNA).

本明細書で用いる「短鎖干渉核酸」、「siNA」、「短鎖干渉RNA」、「siRNA」、「短鎖干渉核酸分子」、「短鎖干渉オリゴヌクレオチド分子」、又は「化学修飾短鎖干渉核酸分子」の各用語は、例えば配列特異的にRNA干渉「RNAi」又はジーンサイレンシングを媒介することによって、遺伝子発現又はウィルス複製を阻害又は下方制御可能な核酸分子を意味する。 As used herein, "short interfering nucleic acid", "siNA", "short interfering RNA", "siRNA", "short interfering nucleic acid molecule", "short interfering oligonucleotide molecule", or "chemically-modified short the terms interfering nucleic acid molecule ", for example, in a sequence-specific manner by mediating RNA interference" RNAi "or gene silencing refers to inhibition or downregulation nucleic acid molecule of gene expression or viral replication. 典型的な様態の範囲内において、siNAは自己相補的なセンス鎖及びアンチセンス鎖を具える二本鎖ポリヌクレオチド分子であって、この場合、アンチセンス領域が、発現を下方制御する標的核酸分子内のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列又はその一部を具え、センス領域が、標的核酸の配列又はその一部に対応する(すなわち実質的に同一の配列である)ヌクレオチド配列を具える。 In a typical range of aspects, siNA is a double-stranded polynucleotide molecule comprising self-complementary sense and antisense strands, in this case, the target nucleic acid molecule antisense region, downregulates expression comprises a complementary nucleotide sequence or a portion thereof with the nucleotide sequence of inner sense region corresponds to the sequence or a portion thereof of the target nucleic acid (i.e., sequences substantially identical) comprises a nucleotide sequence.

「siNA」は、例えば短鎖二本鎖核酸であるsiRNA(又は任意に、長鎖のその前駆体)などの低分子干渉核酸を意味し、標的細胞内において容認できないような毒性はない。 "SiNA", for example (or in any length precursor thereof strand) siRNA are short double-stranded nucleic acid means a small interfering nucleic acid, such as, but not toxic as unacceptable in the target cell. 本発明の範囲内で有用なsiNAの長さは、ある様態においては約21乃至23bpの長さで最適化される。 The length of useful siNA within the scope of the present invention, in certain aspects is optimized in length from about 21 to 23 bp. しかし、siRNAを含む有用なsiNAの長さには特に制限はない。 However, there is no particular limitation on the length of the useful siNA including siRNA. 例えばsiNAはまず、標的細胞内に生存して、標的細胞への送達と同時に又はその後にジーンサイレンシングを引き起こす最終的な形又はプロセッシングを受けた形のsiNAとは十分に異なる前駆体の形で細胞へ導入することができる。 For example the siNA First, survived into target cells, in the form of delivery simultaneously with or subsequent to gene silencing cause final shape or sufficiently different precursors and siNA form that received processing of the target cell it can be introduced into a cell. siNAの前駆体は、例えば送達と同時に又はその後にプロセッシング、分解、変性、又は開裂に付される前駆体配列要素を含むことで、細胞内でジーンサイレンシングを媒介する活性を有するsiNAを生成することができる。 Precursor siNA, for example delivered simultaneously or after processing, decomposition, denaturation, or by including a precursor sequence elements that are subjected to cleavage, generating siNA that are active in mediating gene silencing in cells be able to. 従って、ある様態において、本発明の範囲内の有用なsiNAの前駆体の長さは例えば約100乃至200塩基対、50乃至100塩基対、又は約50塩基対未満であって、これによって標的細胞内において活性なプロセッシングを受けたsiNAが生成される。 Thus, in some aspects, the length is for example about 100 to 200 base pairs useful siNA precursors within the scope of the present invention, be less than 50 to 100 base pairs, or about 50 base pairs, whereby the target cell It is siNA who received active processing are generated in the inner. 他の様態においては、有用なsiNA又はsiNA前駆体の長さは、約10乃至49bp、15乃至35bp、又は約21乃至30bpである。 In another aspect, the length of the useful siNA or siNA precursor, from about 10 to 49 bp, 15 to 35 bp, or about 21 to 30 bp.

本開示の典型的なsiNA分子は化学的に合成される。 Exemplary siNA molecule of the disclosure are chemically synthesized. オリゴヌクレオチドは、例えばCaruthersら,Methods in Enzymology 211: 3−19, 1992; Thompsonら、国際公開公報WO99/54459、Wincottら,Nucleic Acids Res. Oligonucleotides, e.g. Caruthers et al, Methods in Enzymology 211: 3-19, 1992; Thompson et al., International Publication WO99 / ​​54459, Wincott et al., Nucleic Acids Res. 23: 2677−2684, 1995; Wincottら,Methods Mol. 23: 2677-2684, 1995; Wincott et al., Methods Mol. Bio. Bio. 74: 59, 1997; Brennanら,Biotechnol. 74: 59, 1997; Brennan et al., Biotechnol. Bioeng. Bioeng. 61: 33−45, 1998; 及びBrennan、米国特許公報第6001311号に記載の本技術分野で公知のプロトコルを用いて合成される。 61: 33-45, 1998; and Brennan, are synthesized using protocols known in the art as described in U.S. Patent No. 6,001,311. 化学的修飾が可能な本発明のsiNA分子の合成は、(a)siNA分子の二つの相補鎖を合成するステップ、及び(b)二本鎖siNA分子を得るのに適した条件下でこの二つの相補鎖をアニーリングするステップを具える。 Synthesis of siNA molecules of the present invention capable of chemical modification, the two-under conditions suitable for obtaining step, and (b) the double-stranded siNA molecule to synthesize the two complementary strands of (a) the siNA molecule comprising the step of annealing the One of the complementary strand. 別の様態では、siNA分子の二つの相補鎖は、固相オリゴヌクレオチド合成によって合成される。 In another aspect, two complementary strands of the siNA molecule is synthesized by solid phase oligonucleotide synthesis. さらに別の様態では、siNA分子の二つの相補鎖は、固相タンデムオリゴヌクレオチド合成によって合成される。 In yet another aspect, two complementary strands of the siNA molecule is synthesized by solid phase tandem oligonucleotide synthesis.

オリゴヌクレオチド(例:特定の修飾オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドのリボヌクレオチドを含まない部分)は、例えばCaruthersら,Methods in Enzymology 211: 3−19, 1992; Thompsonら、国際公開公報WO99/54459、Wincottら,Nucleic Acids Res. Oligonucleotides (e.g. the portion does not include a specific modified oligonucleotides or oligonucleotide ribonucleotides), for example Caruthers et al, Methods in Enzymology 211: 3-19, 1992; Thompson et al., International Publication WO99 / ​​54 459, Wincott et al. , Nucleic Acids Res. 23: 2677−2684, 1995; Wincottら,Methods Mol. 23: 2677-2684, 1995; Wincott et al., Methods Mol. Bio. Bio. 74: 59, 1997; Brennanら,Biotechnol. 74: 59, 1997; Brennan et al., Biotechnol. Bioeng. Bioeng. 61: 33−45, 1998; 及びBrennan、米国特許公報第6001311号に記載の本技術分野で公知のプロトコルを用いて合成される。 61: 33-45, 1998; and Brennan, are synthesized using protocols known in the art as described in U.S. Patent No. 6,001,311. 本発明の特定のsiNA分子を含むRNAの合成は、例えばUsmanら,J. Synthesis of RNA, including certain siNA molecules of the invention, for example Usman et al., J. Am. Am. Chem. Chem. Soc. Soc. 109: 7845, 1987; Scaringeら,Nucleic Acids Res. 109: 7845, 1987; Scaringe et al., Nucleic Acids Res. 18: 5433, 1990; Wincottら, Nucleic Acids Res. 18: 5433, 1990; Wincott et al., Nucleic Acids Res. 23 2677−2684: 1995; 及びWincottら, Methods Mol. 23 2677-2684: 1995; and Wincott et al., Methods Mol. Bio. Bio. 74: 59, 1997、に記載の一般的手順に従う。 74: 59, 1997, following the general procedure described in.

本発明のある様態において、上述のように、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドを用いて、大きなsiNAの核酸前駆体を含む従来のsiNAよりも大きな核酸分子の送達を促進する。 In aspects of the present invention, as described above, by using the polynucleotide delivery, to facilitate delivery of conventional larger nucleic acid molecules than siNA containing a large siNA nucleic acid precursors. 例えば、本発明の方法及び組成物を、所望のsiNAの「前駆体」である大きな核酸の送達を促進するために用いることができ、この場合前駆体のアミノ酸が標的細胞への送達の前、間、若しくは後に開裂又はプロセッシングされて標的細胞内での遺伝子発現を調節する活性siNAを形成することができる。 For example, the methods and compositions of the present invention, can be used to facilitate delivery of larger nucleic acids that are "precursors" of desired siNA, before amino acids in this case the precursor delivery to target cells, during, cleavage or after or can be processed to form an active siNA for modulating gene expression in a target cell. 例えば、siNA前駆体ポリヌクレオチドとしては、自己相補的なセンス領域及びアンチセンス領域を具える2又は3個以上のループ構造並びにステムを有する環状一本鎖ポリヌクレオチドを選択することができ、この場合アンチセンス領域は、標的核酸分子内のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列又はその一部を具え、センス領域は、標的核酸の配列又はその一部に対応するヌクレオチド配列を有し、そしてこの環状ポリヌクレオチドがインビボ又はインビトロでプロセッシングを受けることでRNAiを媒介可能な活性siNA分子を生成することができる。 For example, the siNA precursor polynucleotide may be selected two or three or more loop structures and a circular single-stranded polynucleotide having a stem comprising self-complementary sense and antisense regions, in this case antisense region comprises a complementary nucleotide sequence or a portion thereof and a nucleotide sequence in a target nucleic acid molecule, the sense region having nucleotide sequence corresponding to the sequence or a portion thereof of the target nucleic acid, and the cyclic poly nucleotides can generate mediate possible activity siNA molecules of RNAi by receiving processed in vivo or in vitro.

哺乳類細胞内では、30塩基対を超える長さのdsRNAが、通常はインターフェロンによって誘起されるdsRNA依存性キナーゼPKR及び2'−5'−オリゴアデニレートシンテターゼの活性化を行うことができる。 Within a mammalian cell, 30 the length of the dsRNA of greater than base pairs, usually it is possible to perform activation of dsRNA-dependent kinase PKR and 2'-5'-oligoadenylate synthetase induced by interferon. 活性化されたPKRは、翻訳因子である真核生物翻訳開始因子2α(eIF2α)をリン酸化することで一般翻訳を阻害し、一方2'−5'−オリゴアデニレートシンテターゼは、RNaseLの活性化による非特異的なmRNAの分解を引き起こす。 Activated PKR can translate eukaryotic translation initiation factor 2α, which is a factor (eIF2alpha) inhibits general translation by phosphorylation, whereas 2'-5'-oligoadenylate synthetase, RNase L activity cause degradation of non-specific mRNA by reduction. 本発明のsiNAは、通常30塩基対未満、最も一般的には約17乃至19塩基対、19乃至21塩基対、又は21乃至23塩基対というその小さいサイズ(特に前駆体でない形において)のため、インターフェロン応答の活性化を起こさない。 siNA of the invention is usually less than 30 base pairs, and most typically from about 17 to 19 base pairs, 19 to 21 base pairs, or 21 to because of its small size of 23 base pairs (in the form not particularly precursor) , it does not cause the activation of the interferon response.

長鎖dsRNAの非特異的効果とは対照的に、siRNAは哺乳類系で選択的なジーンサイレンシングを媒介することができる。 In contrast to the non-specific effects of long-chain dsRNA, siRNA can mediate selective gene silencing in the mammalian system. 短鎖ループ及び19乃至27塩基対のステムを有するヘアピンRNAも、その二本鎖ステムの配列と相同的な遺伝子の発現を選択的にサイレンシングする。 Hairpin RNA having a short loop and 19 to 27 base pairs stem also selectively silence sequences homologous to gene expression of the double-stranded stem. 哺乳類細胞は短鎖ヘアピンRNAをsiRNAへ変換して、選択的ジーンサイレンシングを媒介することができる。 Mammalian cells convert short hairpin RNA into of siRNA, and thus can mediate selective gene silencing.

RISCは、siRNA二重鎖のアンチセンス鎖に対して相補的な配列を有する一本鎖RNAの開裂を媒介する。 RISC mediates cleavage of single stranded RNA having sequence complementary to the antisense strand of the siRNA duplex. 標的RNAの開裂は、siRNA二重鎖のアンチセンス鎖に対して相補的な領域の中央部で発生する。 Cleavage of the target RNA occurs in the middle of the region complementary with respect to the antisense strand of the siRNA duplex. 21ヌクレオチドのsiRNA二重鎖は、2ヌクレオチドの3'末端オーバハングを含む場合に最も活性が高いことが研究によって示されている。 21 siRNA duplexes of nucleotides that most active when containing two nucleotide 3'-terminal overhang is shown by the studies. さらに、siRNAの一方又は両方の鎖を2'−デオキシ(2'−H)ヌクレオチド又は2'−O−メチルヌクレオチドで完全に置換するとRNAi活性が著しく低下するが、siRNAの3'末端オーバハングのヌクレオチドをデオキシヌクレオチド(2'−H)で置換することは許容されることが報告されている。 Further, although when completely replaced by one or both strands of siRNA 2'-deoxy (2'-H) nucleotides or 2'-O- methyl nucleotides RNAi activity significantly reduced, siRNA 3 'end overhang nucleotides be replaced by a deoxy nucleotides (2'-H) has been reported to be tolerated.

2ヌクレオチドの3'末端オーバハングを有する21−merのsiRNA二重鎖の3'末端オーバハングセグメントをデオキシリボヌクレオチドで置換しても、RNAi活性への悪影響が生じないことが研究によって示されている。 Be replaced with terminal overhang segments 3 'siRNA duplexes of 21-mer with terminal overhang' 2 nucleotide 3 deoxyribonucleotides, that does not cause adverse effect on RNAi activity is indicated by studies. siRNAの各末端では4ヌクレオチドまではデオキシリボヌクレオチドによる置換が十分に許容されることが報告されているが、完全にデオキシリボヌクレオチドで置換してしまうとRNAi活性を喪失する。 While up to 4 nucleotides on each end of the siRNA have been reported that substitution with deoxyribonucleotides are well tolerated, completely loses the RNAi activity will be replaced by deoxyribonucleotides.

本発明のある様態では、dsRNAは2若しくは3bp以上の5'末端オーバハング又は2若しくは3bp以上の3'末端オーバハングを持ち、オーバハングはセンス鎖又はアンチセンス鎖のいずれかに存在していてもよい。 In aspects of the present invention, dsRNA has two or 3bp more 5 'end overhang or 2 or 3bp more 3' end overhang, the overhang may be present in either the sense or antisense strand. ある様態では、dsRNAは、オーバハングを有しない。 In one aspect, dsRNA has no overhang. ある様態では、dsRNAは27bp乃至29bpの長さを有する。 In one aspect, dsRNA has a length of 27bp to 29 bp. ある様態では、dsRNA分子はセンスRNA鎖及びアンチセンスRNA鎖を含み、ペプチドはアンチセンス鎖の5'末端で抱合される。 In one aspect, dsRNA molecules comprise a sense RNA strand and an antisense RNA strand, peptide is conjugated at the 5 'end of the antisense strand.

代替的に、siNAは、単一の又は複数のsiNAをコードし、標的細胞内でそれらを発現させるポリヌクレオチドベクタによって発現された単一の又は複数の転写産物として送達することができる。 Alternatively, siNA encodes a single or a plurality of siNA, can be delivered as single or multiple transcription products expressed by a polynucleotide vector expressing them in the target cell. このような様態においては、標的細胞内で発現されるsiRNAの最終転写産物の二本鎖部分の長さは、例えば15乃至49bp、15乃至35bp、又は約21乃至30bpであってよい。 In such manner, the length of the double-stranded portion of a final transcription product of the siRNA to be expressed within the target cell, for example 15 to 49 bp, 15 to 35 bp, or about 21 to may be 30 bp. 典型的な様態の範囲内において、2つの鎖が対合しているsiNAの二本鎖部分は、完全に対合したヌクレオチドセグメントに限定されず、ミスマッチ(対応するヌクレオチドが相補的でない)、バルジ(一方の鎖上の対応する相補的ヌクレオチドが欠失)、又はオーバハングなどによって対合していない部分を含んでよい。 In a typical range of aspect, double-stranded portion of the siNA that two strands are paired are not limited to completely paired nucleotide segments, mismatch (the corresponding nucleotides are not complementary), bulge (corresponding complementary nucleotide on one strand deletions), or may comprise a portion unpaired the like overhang. 非対合部分は、siNA形成に干渉しない程度含まれていてよい。 Non pairing moiety, may be included so as not to interfere with siNA formation. より詳細な様態において、「バルジ」は1乃至2個の非対合ヌクレオチドを具えることができ、2つの鎖が対合しているsiNAの二本鎖領域は、約1乃至7個又は約1乃至5個のバルジを含むことができる。 In more detailed aspects, "bulge" can comprise one or two unpaired nucleotides, double-stranded region of the siNA that two strands are paired are about 1 to 7, or about 1 may include five bulges. さらに、siNAの二本鎖領域に含まれる「ミスマッチ」部分は、約1乃至7個又は約1乃至5個存在することができる。 Furthermore, "mismatch" portions contained in the double-stranded region of the siNA can be present from about 1 to 7, or from about 1 to 5. ミスマッチで最も多いのは、ヌクレオチドの一つがグアニンで他方がウラシルの場合である。 The most common is the mismatch, one nucleotide is when the other guanine is uracil. このようなミスマッチは、例えばセンスRNAをコードする対応するDNA内のCからT、GからA、又はそれらの組み合わせという変異に起因するであろうが、他の要因も考えられる。 Such mismatch may be, for example C to T in the corresponding DNA encoding a sense RNA, A from G, or it will be caused by mutations that their combinations are considered other factors. さらに、本発明において、2つの鎖が対合しているsiNAの二本鎖領域は、定められたおおよその数の範囲内で、バルジ部分とミスマッチ部分の両方を含むことができる。 Further, in the present invention, the double-stranded region of the siNA that two strands are paired are in the approximate range of several defined, may contain both bulge portions and mismatched parts.

本発明のsiNAの末端構造は、siNAが標的遺伝子の発現を阻害する活性を保持する限りにおいて、平滑末端又は粘着末端(オーバハング)であってよい。 The terminal structure of the siNA of the invention, as long as they retain the activity of siNA to inhibit expression of the target gene may be blunt or cohesive ends (overhang). 粘着末端(オーバハング)構造は、他の研究者による報告のように、3'末端オーバハングのみに限定されない。 Sticky end (overhang) structure, as reported by other researchers, not limited only to the 3 'end overhang. それどころか、RNAiによるなど、ジーンサイレンシング効果を誘起する能力がある限りにおいて、5'末端オーバハング構造も含まれる場合がある。 Rather, such as by RNAi, as long as the ability to induce gene silencing effect, in some cases 5 'end overhang structure are also included. さらに、オーバハング部のヌクレオチド数は報告されている限界である2個又は3個に限定されず、siNAのジーンサイレンシング活性を損なわない限りにおいて、ヌクレオチド数はいくつであってもよい。 Furthermore, the number of nucleotides overhang is not limited to two or three is the limit that has been reported, so long as it does not impair gene silencing activity of the siNA, number of nucleotides may be any number. 例えば、オーバハング部は約1乃至約8個のヌクレオチドを具え、より多くの場合において約2乃至4個のヌクレオチドを具えてよい。 For example, the overhang portion comprises from about 1 to about 8 nucleotides, it may comprise more about 2 to 4 nucleotides in the case.

粘着末端(オーバハング)構造を有するsiNAの長さは、対合する二重鎖部分及び各末端のオーバハング部の長さとして表すことができる。 The length of the siNA having sticky ends (overhang) structure can be represented as a double-stranded portion and the length of the overhang at each end that mate. 例えば、2bpの3'末端アンチセンスオーバハングを有する25/27−merのsiNA二重鎖は、25−merのセンス鎖及び27−merのアンチセンス鎖を持ち、ここで対合部の長さは25bpである。 For example, siNA duplex 25/27-mer having a 3 'terminal antisense overhang of 2bp has a antisense strand of the sense strand and 27-mer of 25-mer, wherein the length of the mating portion it is 25bp.

さらに、オーバハング配列は標的遺伝子に対する特異性は低くてよいため、標的遺伝子配列に対して相補的(アンチセンス鎖)でなくても同一(センス鎖)でなくてもよい。 Moreover, since it and specificity are low relative to overhang sequences target genes may not be identical (sense strand) may not complementary to the target gene sequence (antisense strand). さらに、siNAは、標的遺伝子に対してジーンサイレンシング効果を保持することができる限りにおいて、例えば一方の末端のオーバハング部中に低分子量構造(例えばtRNA、rRNA、若しくはウィルスRNAなどの自然RNA分子又は人工RNA分子)を含んでよい。 Furthermore, siNA, to the extent that can hold a gene silencing effect on the target gene, such as low molecular weight structure in the overhang of one end (e.g. tRNA, or natural RNA molecule such as rRNA, or viral RNA artificial RNA molecule) may contain.

siNAの末端構造は、二本鎖核酸の一方の末端部が、例えばリンカRNAなどのリンカ核酸によって繋がっているステム−ループ構造であってよい。 Terminal structure of the siNA, one end portion of the double-stranded nucleic acid, for example the stem are connected by the linker nucleic acid, such as a linker RNA - may be a loop structure. 二本鎖領域(ステム−ループ部分)の長さは、例えば15乃至49bp、多くの場合15乃至35bp、そしてより一般的には約21乃至30bpであってよい。 Duplex region - the length of (stem-loop portion), for example, 15 to 49 bp, often 15 to 35 bp, and may be more generally from about 21 to 30 bp. 代替的に、標的細胞内で発現されるsiNAの最終転写産物である二本鎖領域の長さは、例えば約15乃至49bp、15乃至35p、又は約21乃至30bpであってよい。 Alternatively, the length of the double-stranded region that is a final transcription product of the siNA to be expressed within the target cell, for example from about 15 to 49 bp, 15 to 35p, or from about 21 to may be 30 bp. リンカセグメントを用いる場合、ステム部の対合を妨げない限りにおいてリンカの長さに特に制限はない。 When using a linker segment, there is no particular limitation on the length of the linker as long as they do not interfere with the pairing of the stem portion. 例えば、ステム部の安定な対合とこのステム部をコードするDNA間の組換えの抑制のために、リンカ部はクローバー型のtRNA構造を取ってもよい。 For example, for the recombination suppression between DNA encoding the stem portion in a stable pairing of the stem portion, the linker portion may take tRNA structure cloverleaf. たとえリンカがステム部の対合を妨げるような長さであったとしても、例えば前駆体RNAが成熟RNAへプロセッシングされる間にイントロンが除去され、それによってステム部の対合が可能となるようにイントロンを含むリンカ部を構築することは可能である。 Even if the linker was long that prevent pairing of the stem portion, for example a precursor RNA introns are removed while being processed into mature RNA, thereby to pairing of the stem portion is possible it is possible to construct a linker portion comprising an intron. ステム−ループsiRNAの場合、ループ構造を持たない側のRNA端部(ヘッド又はテール)が低分子量RNAを有してよい。 Stem - For loop siRNA, RNA end portion on the side having no loop structure (head or tail) may have a low molecular weight RNA. 上述のように、こういった低分子量RNAは、tRNA、rRNA、若しくはウィルスRNAなどの自然RNA分子、又は人工RNA分子を含んでよい As described above, the low molecular weight RNA went do this, tRNA, may contain rRNA, or natural RNA molecule such as viral RNA, or an artificial RNA molecule

siNAは、標的核酸分子内のヌクレオチド配列又はその一部分と相補的なヌクレオチド配列を有する一本鎖ポリヌクレオチドを具えることもでき(例えば、そのようなsiNA分子が、標的核酸配列又はその一部分に対応するヌクレオチド配列のsiNA分子内での存在を必要としない場合)、この場合一本鎖ポリヌクレオチドは、5'リン酸エステル(例えば、Martinezら,Cell. 110: 563−574, 2002; Schwarzら,Molecular Cell 10: 537−568, 2002、を参照)又は5',3'リン酸ジエステルなどの末端リン酸基をさらに具えることもできる。 The siNA can comprise a single stranded polynucleotide having a nucleotide sequence or complementary nucleotide sequence and a portion thereof in a target nucleic acid molecule can also be (e.g., such siNA molecule, target nucleic acid sequence or corresponding to a portion thereof If that does not require the presence within the siNA molecule of nucleotide sequence) of single-stranded polynucleotide this case, 5 'phosphate ester (e.g., Martinez et al., Cell 110:. 563-574, 2002; Schwarz et al., Molecular Cell 10: 537-568, 2002, a reference) or 5 ', 3' may further comprise a terminal phosphate group, such as phosphoric acid diester.

本明細書で用いるsiNA分子という用語は、天然のRNA又はDNAのみを含む分子に限定されず、化学修飾されたヌクレオチド及び非ヌクレオチドも包含する。 The term siNA molecule as used herein is not limited to molecules containing only naturally occurring RNA or DNA, and chemically-modified nucleotides and non-nucleotides encompass.

ある様態において、本発明の短鎖干渉核酸分子は2'−ヒドロキシ(2'−OH)を含むヌクレオチドが欠失している。 In one aspect, short interfering nucleic acid molecule of the present invention is a nucleotide comprising 2'-hydroxy of (2'-OH) are deleted. ある様態において、短鎖干渉核酸はRNAiを媒介するのに2'−ヒドロキシ基を有するヌクレオチドは存在する必要がなく、従って本発明の短鎖干渉核酸分子は、任意にリボヌクレオチド(例:2'−OH基を持つヌクレオチド)をまったく含まなくてもよい。 In one aspect, short interfering nucleic acid is a nucleotide having a 2'-hydroxy group for mediating RNAi need not be present, thus short interfering nucleic acid molecule of the present invention optionally ribonucleotides (e.g. 2 ' nucleotides) with the -OH group may not be included at all. しかし、RNAiを媒介するためにsiNA分子内にリボヌクレオチドが存在する必要がないそのようなsiNA分子は、2'−OH基を有する1又は2個以上のヌクレオチドを含む、抱合した一個若しくは複数個のリンカ、又はその他の抱合若しくは会合した基、部位、若しくは鎖を有してよい。 However, such a siNA molecule ribonucleotide need not be present in the siNA molecule to mediate RNAi comprises one or two or more nucleotides having a 2'-OH group, one or a plurality conjugated linker, or other conjugated or associated with the group may have sites, or a chain. 任意にsiNA分子は、ヌクレオチド部位の約5、10、20、30、40、又は50%にリボヌクレオチドを具えていてもよい。 Optionally siNA molecule may comprise about 5,10,20,30,40, or 50% ribonucleotide nucleotide sites.

本明細書で用いるsiNAという用語は、例えば、短鎖干渉RNA(siRNA)、二本鎖RNA(dsRNA)、マイクロRNA(mRNA)、短鎖ヘアピンRNA(shRNA)、短鎖干渉オリゴヌクレオチド、短鎖干渉核酸、短鎖干渉修飾オリゴヌクレオチド、化学修飾siRNA、及び転写後ジーンサイレンシングRNA(ptgsRNA)など、配列特異的RNAiを媒介することができる核酸分子を示すのに用いられるその他の用語と同義であることを意図している。 The term siNA used herein, for example, short interfering RNA (siRNA), double-stranded RNA (dsRNA), micro RNA (mRNA), short hairpin RNA (shRNA), short interfering oligonucleotide, short interfering nucleic acid, short interfering modified oligonucleotide, chemically-modified siRNA, and such post-transcriptional gene silencing RNA (ptgsRNA), in other terms synonymous used to indicate a nucleic acid molecule capable of mediating sequence specific RNAi and it is intended to be.

他の様態では、本発明の範囲内で用いるsiNA分子は個別のセンス及びアンチセンス配列若しくは領域を含むことができ、この場合センス領域とアンチセンス領域はヌクレオチド若しくは非ヌクレオチドリンカ分子によって共有結合されているか、又は代替的にイオン性相互作用、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、及び/若しくはスタッキング相互作用により非共有結合されている。 In another aspect, siNA molecules used within the scope of the present invention may comprise separate sense and antisense sequences or regions, in this case the sense and antisense regions are covalently linked by nucleotide or non-nucleotide linker molecule dolphins, or alternatively ionic interactions, hydrogen bonding, van der Waals interactions, are non-covalently bonded by hydrophobic interaction, and / or stacking interactions.

「アンチセンスRNA」とは、標的遺伝子mRNAと相補的な配列を有するRNA鎖であって、標的遺伝子mRNAと結合することによってRNAiを誘起すると考えられるRNA鎖をいう。 "Antisense RNA" refers to an RNA strand having a sequence complementary to a target gene mRNA, it refers to an RNA strand that is thought to induce RNAi by binding to a target gene mRNA. 「センスRNA」は、アンチセンスRNAと相補的な配列を有し、その相補的アンチセンスRNAとアニーリングすることでsiRNAを形成する。 "Sense RNA" has a sequence complementary to the antisense RNA, to form a siRNA by annealing to its complementary antisense RNA. このようなアンチセンスRNA及びセンスRNAは、従来からRNA合成装置によって合成されている。 Such antisense RNA and sense RNA is synthesized by the RNA synthesizer conventionally.

本明細書で用いる「RNAi構築物(RNAi construct)」という用語は、低分子干渉RNA(siRNA)、ヘアピンRNA、及びインビボで開裂してsiRNAを形成することができるその他のRNA種を含む、本明細書を通して用いられる一般名称である。 The term "RNAi construct (RNAi construct)" as used herein, includes small interfering RNA (siRNA), hairpin RNA, and other RNA species which can form a cleaved siRNA in vivo, herein it is a generic term used throughout book. 本明細書におけるRNAi構築物は、細胞中でdsRNA若しくはヘアピンRNAを形成する転写物、及び/又はsiRNAをインビボで生成することができる転写物を生じさせることが可能な発現ベクタ(RNAi発現ベクタとも言う)も含む。 RNAi constructs herein also referred to as expression vectors (RNAi expression vector capable of producing transcripts that transcript, and / or the siRNA can be generated in vivo to form a dsRNA or hairpin RNA in the cell ) also be included. 任意に、siRNAはsiRNAの一本鎖又は二本鎖を含む。 Optionally, siRNA comprises a single-stranded or double-stranded siRNA.

siHybrid分子は、siRNAと同様の機能を有する二本鎖核酸である。 siHybrid molecule is a double-stranded nucleic acid having the same functions as siRNA. 二本鎖RNA分子と違い、siHybridはRNA鎖及びDNA鎖から構成される。 Unlike double-stranded RNA molecule, siHybrid is comprised of an RNA strand and a DNA strand. アンチセンス鎖が標的mRNAと結合する鎖であることから、RNA鎖がアンチセンス鎖であることが好ましい。 Since the antisense strand is a strand that binds to the target mRNA, it is preferable RNA strand is the antisense strand. DNA鎖とRNA鎖のハイブリダイゼーションによって生じたsiHybridは、ハイブリダイズされた相補的部分、及び好ましくは少なくとも一つの3'末端オーバハングを有する。 siHybrid generated by hybridization of a DNA strand and an RNA strand, hybridized complementary portion and preferably at least one of the 3 'end overhang.

本発明の範囲内で使用するsiNAは、二つの別々のオリゴヌクレオチドから構築することができ、ここでこのうち一方はセンス鎖でもう一方はアンチセンス鎖であって、この場合アンチセンス鎖とセンス鎖は自己相補的(すなわち、各鎖が他方の鎖のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を具える;アンチセンス鎖及びセンス鎖が二重鎖又は二本鎖構造を形成し、ここで、例えばその二本鎖領域が約19塩基対である場合など)である。 siNA used within the scope of the present invention can be constructed from two separate oligonucleotides, where these one is a the other is the antisense strand in the sense strand, in this case the antisense strand and sense strand self-complementary (i.e., each strand comprises a nucleotide sequence complementary to a nucleotide sequence of the other strand; antisense strand and sense strand form a duplex or double stranded structure, where, for example, If the double-stranded region that is about 19 base pairs, or the like). アンチセンス鎖は標的核酸分子のヌクレオチド配列又はその一部分と相補的なヌクレオチド配列を具えることができ、センス鎖は標的核酸配列又はその一部分に対応するヌクレオチド配列を具えることができる。 The antisense strand may comprise a nucleotide sequence or complementary nucleotide sequence and its portion of the target nucleic acid molecule, the sense strand may comprise a nucleotide sequence corresponding to the target nucleic acid sequence or a portion thereof. 代替的に、siNAは単一のオリゴヌクレオチドから構築することもでき、この場合、siNAの自己相補的なセンス領域とアンチセンス領域は核酸系又は非核酸系リンカによって結合される。 Alternatively, the siNA can also be constructed from a single oligonucleotide, where the self-complementary sense and antisense regions of the siNA are linked by nucleic acid based or non-nucleic acid-based linker.

追加的な様態の範囲内において、本発明の方法及び組成物にかかる細胞内送達のためのsiNAは、自己相補的センス及びアンチセンス領域を有し、二重鎖、非対称二重鎖、ヘアピン、又は非対称ヘアピン二次構造を有するポリヌクレオチドであってよく、この場合アンチセンス領域は個々の標的核酸分子内のヌクレオチド配列又はその一部分と相補的なヌクレオチド配列を具え、センス領域は標的核酸配列又はその一部分に対応するヌクレオチド配列を具える。 Within additional aspects, siNA for intracellular delivery according to the methods and compositions of the present invention has a self-complementary sense and antisense regions, duplex, asymmetric duplex, hairpin, or may be a polynucleotide with an asymmetric hairpin secondary structure, in this case the antisense region comprises a nucleotide sequence or complementary nucleotide sequence and a portion thereof in the individual target nucleic acid molecule, the sense region the target nucleic acid sequence or a comprising a nucleotide sequence corresponding to a portion.

さらなる様態の範囲内において、本開示は、1又は2種類以上のポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドと混合、複合体化、又は抱合された三本鎖siNA及びその組成物を提供する。 Within a further aspect, the present disclosure provides one or mixed with two or more polynucleotide delivery, complexation, or conjugated triplex siNA and compositions thereof. ここで述べるsiNA分子はA、B1、及びB2(A:B1B2)の3つの鎖を具え、この場合B1鎖及びB2鎖は同族のA鎖の非オーバーラップ領域と相補的でありこの非オーバーラップ領域と塩基対(bp)を形成し、B1鎖は対応するB2鎖とニック又はギャップで分けられる。 Here described siNA molecules A, B1, and B2 (A: B1B2) comprises three strands of this case B1 chain and B2 chain is complementary to non-overlapping regions of the cognate of the A-chain the non-overlapping to form a region and base pair (bp), B1 chain is divided by the corresponding B2 strand nicks or gaps. ここで述べるsiRNA分子は、結果的に標的メッセンジャーRNA(mRNA)の発現を調整するRNA干渉の連続過程を誘起することができる。 Here siRNA molecules described can eventually induce a continuous process of RNA interference modulating the expression of target messenger RNA (mRNA).

本明細書で述べるsiNA分子は、例えばA、B1、及びB2(A:B1B2)等の3又は4個以上の鎖を具え、この場合B1及びB2は、Aの非オーバーラップ領域と相補的でありこの非オーバーラップ領域と塩基対(bp)を形成し、B1とAのアニーリングによって形成された二本鎖領域は、B2とAのアニーリングによって形成された二本鎖領域と異なっており、互いにオーバーラップもしておらず、そしてA:B1二重鎖とA:B2二重鎖は、A:B1二重鎖とA:B2二重鎖の間に位置し、A、B1、及び/若しくはB2鎖の一方又は両方の3'末端にある1若しくは2個以上のいずれの不対合ヌクレオチドとも異なる少なくとも一つのA鎖の不対合ヌクレオチドによる「ギャップ」で分けられる。 siNA molecules described herein, for example A, B1, and B2 (A: B1B2) comprises three or four or more strands of such, this case B1 and B2 are complementary to a non-overlapping regions of A There is formed the non-overlapping region and base pair (bp), the double-stranded region formed by the annealing of B1 and a is different from the double-stranded region formed by the annealing of B2 and a, together overlap even to not not, and a: B1 duplexes a: B2 duplex, a: B1 duplexes a: located B2 between duplexes, a, B1, and / or B2 even with one or two or more of any unpaired nucleotide at the 3 'end of one or both strands are separated by "gap" by unpaired nucleotides differ by at least one of the a-chain.

代替的に、本開示で述べるsiNA分子は、例えばA、B1、及びB2(A:B1B2)等の3又は4個以上の鎖を含み、この場合B1及びB2は、Aの非オーバーラップ領域と相補的でありこの非オーバーラップ領域と塩基対(bp)を形成し、B1とAのアニーリングによって形成された二本鎖領域は、B2とAのアニーリングによって形成された二本鎖領域と異なっており、互いにオーバーラップもしておらず、そしてA:B1二重鎖とA:B2二重鎖は、A:B1二重鎖とA:B2二重鎖の間の「ニック」で分けられる。 Alternatively, siNA molecules described in this disclosure, for example A, B1, and B2 (A: B1B2) comprises 3 or 4 or more chains of such, this case B1 and B2, the non-overlapping regions of A a complementary formation of the non-overlapping region and base pair (bp), the double-stranded region formed by the annealing of B1 and a, unlike double-stranded region formed by the annealing of B2 and a cage, it does not also overlap each other, and a: B1 duplex and the a: B2 duplex, a: B1 duplex and the a: divided by "nick" between the B2 duplex.

一つの様態では、A:B1B2は、合計で約14塩基対乃至約40塩基対を含む。 In one aspect, A: B1B2 contains about 14 base pairs to about 40 base pairs in total. この様態では、Aがセンス鎖であり、B1B2がアンチセンス鎖である。 In this aspect, A is the sense strand, B1B2 is an antisense strand. Aは15乃至50ヌクレオチドの長さであり、B1及びB2はそれぞれ独立して1乃至20ヌクレオチドの長さであり、B1とB2を合わせた長さは約8ヌクレオチド乃至約40ヌクレオチドである。 A is the length of 15 to 50 nucleotides, B1 and B2 is the length of each independently 1 to 20 nucleotides, the combined length of B1 and B2 is about 8 nucleotides to about 40 nucleotides.

別の様態では、A:B1B2は、合計で約16塩基対乃至約40塩基対を含む。 In another aspect, A: B1B2 contains about 16 base pairs to about 40 base pairs in total. この様態では、Aがセンス鎖であり、B1B2がアンチセンス鎖である。 In this aspect, A is the sense strand, B1B2 is an antisense strand. Aは20乃至40ヌクレオチドの長さであり、B1及びB2はそれぞれ独立して1乃至15ヌクレオチドの長さであり、B1とB2を合わせた長さは約10ヌクレオチド乃至約30ヌクレオチドである。 A is the length of 20 to 40 nucleotides, B1 and B2 is the length of each independently 1 to 15 nucleotides, the combined length of B1 and B2 is about 10 nucleotides to about 30 nucleotides.

別の様態では、A:B1B2は、合計で約14塩基対乃至約40塩基対を含む。 In another aspect, A: B1B2 contains about 14 base pairs to about 40 base pairs in total. この様態では、Aがアンチセンス鎖であり、B1B2がセンス鎖である。 In this aspect, A is the antisense strand, B1B2 is the sense strand. Aは15乃至50ヌクレオチドの長さであり、B1及びB2はそれぞれ独立して1乃至20ヌクレオチドの長さであり、B1とB2を合わせた長さは約8ヌクレオチド乃至約40ヌクレオチドである。 A is the length of 15 to 50 nucleotides, B1 and B2 is the length of each independently 1 to 20 nucleotides, the combined length of B1 and B2 is about 8 nucleotides to about 40 nucleotides.

別の様態では、A:B1B2は、合計で約16塩基対乃至約40塩基対を含む。 In another aspect, A: B1B2 contains about 16 base pairs to about 40 base pairs in total. この様態では、Aがアンチセンス鎖であり、B1B2がセンス鎖である。 In this aspect, A is the antisense strand, B1B2 is the sense strand. Aは20乃至40ヌクレオチドの長さであり、B1及びB2はそれぞれ独立して1乃至15ヌクレオチドの長さであり、B1とB2を合わせた長さは約10ヌクレオチド乃至約30ヌクレオチドである。 A is the length of 20 to 40 nucleotides, B1 and B2 is the length of each independently 1 to 15 nucleotides, the combined length of B1 and B2 is about 10 nucleotides to about 30 nucleotides.

上述のように、本明細書で開示する三本鎖siRNAは、典型的には合計で約15塩基対乃至約40塩基対を具え、より典型的には約18乃至約35塩基対であり、さらにより典型的には約20乃至30塩基対であり、最も典型的には21、22、23、24、25、26、27、28、又は29塩基対のいずれかである。 As described above, the three-stranded siRNA disclosed herein, typically from about 15 base pairs to about 40 base pairs in total comprising the, more typically from about 18 to about 35 base pairs, and even more typically from about 20 to 30 base pairs, it is one of the most typically 21,22,23,24,25,26,27,28, or 29 base pairs. 特定の様態の範囲内では、siRNAは任意に、1ヌクレオチド乃至5ヌクレオチドの一本鎖3'末端オーバハングを含んでもよい。 Within certain aspects, siRNA is optionally may include one nucleotide to 5 single-stranded 3 'end overhang nucleotides. 最も典型的には、そのような一本鎖3' 末端オーバハングは1、2、3、又は4ヌクレオチドである。 Most typically, such a single-stranded 3 'end overhang 1,2,3, or 4 nucleotides.

そのようなsiRNAはAセンス鎖又はAアンチセンス鎖のどちらかを含み、この場合A鎖の長さは約15ヌクレオチド乃至約50ヌクレオチドであり、より典型的にはA鎖の長さは約18ヌクレオチド乃至約40ヌクレオチドであり、さらにより典型的にはA鎖の長さは約20ヌクレオチド乃至約32ヌクレオチドであり、最も典型的にはA鎖の長さは21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、又は31ヌクレオチドである。 Comprising either of such siRNA is A sense strand or A antisense strand, in this case the length of the A-chain is about 15 nucleotides to about 50 nucleotides, more typically the length of the A-chain of about 18 are nucleotides to about 40 nucleotides, even more typically the length of the a-chain of about 20 nucleotides to about 32 nucleotides, and most typically the length of the a chains 21, 22 , 26,27,28,29,30, or 31 is a nucleotide.

本開示のsiRNAはさらに、本明細書において例えばB1及びB2と称する2又は3個以上のB鎖を含み、この場合各B鎖は、同族のA鎖の非オーバーラップ領域と相補的であり、第一のB鎖(B1)と第二のB鎖(B2)はニック又は1若しくは2個以上のヌクレオチドギャップによって分けられる。 siRNA of the present disclosure further includes two or three or more of the B chain, referred to herein for example, B1 and B2, the B-chain in this case is complementary to the non-overlapping regions of the cognate of the A-chain, the first B-chain and (B1) a second B-chain (B2) is divided by nick or one or two or more nucleotide gap. 同族A鎖がセンス鎖であるか又はアンチセンス鎖であるかによって、各B鎖はそれぞれアンチセンス鎖又はセンス鎖となる。 Depending cognate A chain is or antisense strand is the sense strand, each B-chain, respectively the antisense strand or sense strand. 本明細書で述べるB鎖(B1、B2など)は各々独立して、約1ヌクレオチド乃至約25ヌクレオチドの長さであり、より典型的には約4ヌクレオチド乃至約20ヌクレオチドの長さであり、さらにより典型的には約5ヌクレオチド乃至約16ヌクレオチドの長さであり、最も典型的には6、7、8、9、10、11、12、13、14、又は15ヌクレオチドの長さである。 B chains described herein (B1, B2, etc.) are each independently a length of about 1 nucleotide to about 25 nucleotides, more typically a length of about 4 nucleotides to about 20 nucleotides, and even more typically the length of about 5 nucleotides to about 16 nucleotides, most typically 6,7,8,9,10,11,12,13,14, or the length of 15 nucleotides .

合成された後、A鎖、B1鎖、及びB2鎖はアニーリングによってsiRNA分子を形成する。 After being synthesized, A chain, B1 chain, and B2 chains form a siRNA molecule by annealing. アニーリング反応を決定するのは相補性である。 It is complementary to determine the annealing reaction. 第一のB鎖(B1)と第二のB鎖(B2)はニック又はギャップで分けることができる。 The first B-chain (B1) and the second B-chain (B2) can be divided by the nick or gap. 従って、B鎖上に同族のヌクレオチドが存在しないA鎖上のヌクレオチドは不対合状態を維持し、siRNA分子のギャップとなる。 Thus, nucleotide on the A chain on the B chain is not cognate nucleotide exist maintains an unpaired state, the gap of the siRNA molecule. ギャップのサイズは、B1鎖とB2鎖の間に位置するA鎖内の不対合ヌクレオチドの数に依存することになる。 The size of the gap will depend on the number of unpaired nucleotides in the A chain located between the B1 chain and B2 chains. B1鎖とB2鎖の間の領域内にあるA鎖上に不対合であるヌクレオチドが存在しない形でA鎖がB1鎖及びB2鎖と塩基対を形成した場合にニックが形成される。 Nick is formed when the B1 chain and B2 chains A chain in a way that there is no nucleotide which is unpaired in the A chain which is in the region between the formed the B1 chain and B2 chains base pair.

B1とB2がギャップで分けられる様態では、ギャップは典型的には約1乃至約25ヌクレオチドであり、より典型的にはギャップは約1乃至約15ヌクレオチドであり、さらにより典型的にはギャップは約1乃至約10ヌクレオチドであり、最も典型的にはギャップは1、2、3、4、5、6、7、8、又は9ヌクレオチドである。 The manner in which B1 and B2 are separated by a gap, the gap is typically about 1 to about 25 nucleotides, more typically the gap is from about 1 to about 15 nucleotides, typically gaps in even more from about 1 to about 10 nucleotides, and most typically gaps 1,2,3,4,5,6,7,8, or 9 nucleotides.

B鎖は各々独立して、5'−ヒドロキシル(すなわち5'−OH)末端か、又は5'−リン酸(すなわち5'−PO )末端であってよい。 B chain are each independently 5'-hydroxyl (i.e. 5'-OH) terminated or 5'-phosphate (i.e. 5'-PO 4) may be a terminal. 通常、合成RNA分子は3'−ヒドロキシル末端及び5'−ヒドロキシル末端を含む。 Usually, the synthetic RNA molecule comprises a 3'-hydroxyl terminus and the 5'-hydroxyl terminus. 従って、第一のB鎖の3'−OHは、第二のB鎖の5'−OHに直接隣接して並置される場合がある。 Thus, 3'-OH of the first B-chain may be juxtaposed directly adjacent to 5'-OH of the second B-chain. ある様態では、第一のB鎖の3'−OHが第二のB鎖の5'−PO に直接隣接して並置されるように、5'末端が5'−PO を有する第二のB鎖を用いることが好ましい。 In one aspect, as 3'-OH of the first B-chain are juxtaposed directly adjacent to 5'-PO 4 of the second B-chain, the 5 'end has 5'-PO 4 two it is preferable to use the B-chain. そのような場合、本技術分野でよく知られておりすぐに利用可能な方法でRNAキナーゼの触媒活性を利用して一本鎖(ss)RNA分子へPO 基を付加することにより、B鎖の5'末端にリン酸を付加することができる。 In such a case, by adding a well-known single-stranded by using the catalytic activity of RNA kinases are readily available methods (ss) PO 4 group to RNA molecules in the art, B-chain it can be the 5 'end of the addition of phosphoric acid. キナーゼ反応を行った後、B鎖が5'B1pB23'と配向されるようにA鎖、B1鎖、及びB2鎖は互いにアニーリングされる。 After the kinase reaction, A-chain as B chains are oriented with 5'B1pB23 ', B1 chain, and B2 chains are annealed to each other.

以下のsiRNA分子は、本明細書において上述の1若しくは2種類以上のポリペプチドと適切に抱合することができる、ギャップ又はニックを有するsiRNA分子の特定の制限されない典型的な様態を表す。 The following siRNA molecules can be appropriately conjugated with one or two or more polypeptides described herein above, it represents a typical manner which is not specific restriction of siRNA molecules with gaps or nicks.

i ギャップ付き二重鎖siRNA分子 with i gap double-stranded siRNA molecule
本明細書で述べる特定の典型的なギャップ付き二重鎖siRNA分子は、25−merのセンスB鎖配列5'−GGAUCUUAUUUCUUCGGAGACAAUG−3'(配列番号75)及び27−merのアンチセンスA鎖配列3'−TTCCUAGAAUAAAGAAGCCUCUGUUAC−5'(配列番号76)に基づいている。 Certain exemplary duplex siRNA molecule gapped described herein, sense B chain sequence of 25-mer 5'-GGAUCUUAUUUCUUCGGAGACAAUG-3 '(SEQ ID NO: 75) and antisense chain A sequence of 27-mer 3 It is based on the '-TTCCUAGAAUAAAGAAGCCUCUGUUAC-5' (SEQ ID NO: 76). 代替的な典型的なギャップ付き二重鎖siRNA分子は、25−merのアンチセンスB鎖配列5'−GGAUCUUAUUUCUUCGGAGACAAUG−3'(配列番号75)及び27−merのセンスA鎖配列3'−TTCCUAGAAUAAAGAAGCCUCUGUUAC−5'(配列番号76)に基づいている。 SiRNA duplex molecule with an alternative exemplary gap, antisense B chain sequence 5'-GGAUCUUAUUUCUUCGGAGACAAUG-3 of 25-mer '(SEQ ID NO: 75) and sense the A chain sequence 3'-TTCCUAGAAUAAAGAAGCCUCUGUUAC- of 27-mer 5 'it is based on (SEQ ID NO: 76).

このような典型的なsiNA分子は、A、B1、及びB2(A:B1B2)の3つの鎖を持ち、この場合B1及びB2は、Aの非オーバーラップ領域と相補的でありこの非オーバーラップ領域と塩基対(bp)を形成し、B1とAのアニーリングによって形成された二本鎖領域は、B2とAのアニーリングによって形成された二本鎖領域と異なっており、そしてA:B1二重鎖とA:B2二重鎖は、A:B1二重鎖とA:B2二重鎖の間に位置し、A、B1、及び/又はB2鎖の一方又は両方の3'末端にある1又は2個以上のいずれの不対合ヌクレオチドとも異なる1又は2個以上のA鎖の不対ヌクレオチドによる「ギャップ」で分けられる。 Such exemplary siNA molecule, A, B1, and B2 (A: B1B2) has three strands of this case B1 and B2 are complementary and non-overlapping regions of A the non-overlapping to form a region and base pair (bp), the double-stranded region formed by the annealing of B1 and a is different from the double-stranded region formed by the annealing of B2 and a, and a: B1 double chain and a: B2 duplex, a: B1 duplexes a: B2 positioned between the duplex, a, B1, and / or one or the 3 'end of one or both of the B2 chain also two or more of any unpaired nucleotides divided by "gap" with different 1 or 2 or more of the a-chain of unpaired nucleotides.

これらの様態の特定の態様の範囲内では、A:B1B2は合計で約14乃至約24の塩基対からなり、この場合A鎖(センス)は約19ヌクレオチド乃至約27ヌクレオチドであり、B1(アンチセンス)鎖及びB2(アンチセンス)鎖は各々独立して約1ヌクレオチド乃至約18ヌクレオチドであり、B1とB2を合わせた長さは約13ヌクレオチド乃至約23ヌクレオチドである。 Within certain aspects of these aspects, A: B1B2 consists of about 14 to about 24 base pairs in total, in this case A strand (sense) is about 19 nucleotides to about 27 nucleotides, B1 (anti sense) strand and B2 (antisense) strand is about 1 nucleotide to about 18 nucleotides each, independently, the combined length of B1 and B2 is about 13 nucleotides to about 23 nucleotides.

これらの様態の他の態様の範囲内では、A:B1B2は合計で約16乃至約22の塩基対からなり、この場合A鎖(センス)は約19ヌクレオチド乃至約23ヌクレオチドであり、B1(アンチセンス)鎖及びB2(アンチセンス)鎖は各々独立して約1ヌクレオチド乃至約15ヌクレオチドであり、B1とB2を合わせた長さは約13ヌクレオチド乃至約23ヌクレオチドである。 Within other aspects of these aspects, A: B1B2 consists of about 16 to about 22 base pairs in total, in this case A strand (sense) is about 19 nucleotides to about 23 nucleotides, B1 (anti sense) strand and B2 (antisense) strand is about 1 nucleotide to about 15 nucleotides each independently, the combined length of B1 and B2 is about 13 nucleotides to about 23 nucleotides.

これらの様態のさらなる態様の範囲内では、A:B1B2は合計で約14乃至約24の塩基対からなり、この場合A鎖(アンチセンス)は約14ヌクレオチド乃至約27ヌクレオチドであり、B1(センス)鎖及びB2(センス)鎖は各々独立して約1ヌクレオチド乃至約18ヌクレオチドであり、B1とB2を合わせた長さは約18ヌクレオチド乃至約24ヌクレオチドである。 Within further aspects of these aspects, A: B1B2 consists of about 14 to about 24 base pairs in total, in this case A chain (antisense) is about 14 nucleotides to about 27 nucleotides, B1 (sense ) chains and B2 (sense) strand is about 1 nucleotide to about 18 nucleotides each, independently, the combined length of B1 and B2 is about 18 nucleotides to about 24 nucleotides.

これらの様態のさらなる他の態様の範囲内では、A:B1B2は合計で約14乃至約22の塩基対からなり、この場合A鎖(アンチセンス)は約16ヌクレオチド乃至約22ヌクレオチドであり、B1(センス)鎖及びB2(センス)鎖は各々独立して約1ヌクレオチド乃至約15ヌクレオチドであり、B1とB2を合わせた長さは約18ヌクレオチド乃至約22ヌクレオチドである。 Within yet other aspects of these aspects, A: B1B2 consists of about 14 to about 22 base pairs in total, in this case A chain (antisense) is about 16 nucleotides to about 22 nucleotides, B1 (sense) strand and B2 (sense) strand is about 1 nucleotide to about 15 nucleotides each independently, the combined length of B1 and B2 is about 18 nucleotides to about 22 nucleotides.

これらの様態による代表的なsiRNAを表2に示す。 Representative siRNA by these aspects are shown in Table 2.

A鎖、B1鎖、及びB2鎖の厳密なヌクレオチド配列は様々であり得るが、ただし、siRNA分子は連続する塩基対の二つのストレッチを含み、各々の連続する塩基対のストレッチは、単一のアンチセンスA鎖又は単一のセンスA鎖内の1若しくは2個以上の不対合塩基に対応する少なくともヌクレオチド1個分のギャップで分けられている、ということは認識されるであろう。 A chain, B1 chain, and B2 exact nucleotide sequence of the strand is can vary, however, siRNA molecule comprises two stretch of base pairs consecutive, each successive base pairs stretch, single are separated by antisense a strand or single at least nucleotides 1 pieces of the gap corresponding to one or two or more unpaired bases in the sense a chain, it will be appreciated that.

ii ニック付き二重鎖siRNA分子 with ii nick double-stranded siRNA molecule
以下に示す配列中の「p」は、5'リン酸がB2鎖に結合したRNA鎖内のニックを表す。 The "p" in the sequence shown in the 5 'phosphate represents a nick in the RNA chain linked to the B2 chain. 以下に示す配列中の「 」は、B2鎖に結合した5'リン酸のないRNA鎖内のニックを表す。 In the sequence shown below "*" denotes a nick in the free RNA strand of 5 'phosphate bound to B2 chain. 「p」及び「 」はニックの位置も示す。 "P" and "*" indicates the position of the nick. すべての場合において、A鎖は無処置(ニックなし)であり、A鎖上に見られる隙間はsiRNA分子の正しい配列アラインメント(配列相同性による)を保持するためのものである。 In all cases, the A chain is intact (no nicks), the gap found on the A chain is used to hold the correct sequence alignment (by sequence homology) of the siRNA molecule. 以下に示す配列中の「T(太字イタリック体)」は、その位置にリボチミジン(rT)分子が存在することを示す。 The "T (bold italics)" in the sequence shown in shows that there is ribothymidines (rT) molecules on their position. 以下に示す配列中の「T(太字体)」は、その位置にデオキシリボチミジン(dT)分子が存在することを示す。 The following sequence shown in "T (bold)" indicates that there is deoxyribothymidine (dT) molecules on their position. 連続鎖、つまりギャップもニックもない鎖には下線を付してある。 Continuous chain, i.e. gap to be no chain nick are underlined.
1. 1. コントロールdsRNA Control dsRNA
2.5'リン酸を持たないニック付きセンス鎖 2.5 'nicked sense strand do not have a phosphorus acid
3.5'リン酸を持つニック付きセンス鎖 3.5 'nicked sense strand with a phosphoric acid
4. 4. 二本鎖ともにrT分子で完全修飾した、5'リン酸を持つニック付きセンス鎖 Both duplexes were fully modified with rT molecules, nicked sense strand with a 5 'phosphate
5. 5. 二本鎖ともにrT分子で完全修飾した、5'リン酸を持たないニック付きセンス鎖 Both duplexes were fully modified with rT molecule sense strand with a nick that does not have a 5 'phosphate
6. 6. アンチセンス鎖をrT分子で完全修飾し、センス鎖は未修飾(コントロール)の、5'リン酸を持たないニック付きアンチセンス鎖 The antisense strand was fully modified with rT molecule sense strand of unmodified (control), 5 'nicked antisense strand that does not have a phosphate
7. 7. アンチセンス鎖をrT分子で完全修飾し、センス鎖は未修飾(コントロール)の、5'リン酸を持つニック付きアンチセンス鎖 The antisense strand was fully modified with rT molecule sense strand unmodified (control), 5 'nicked antisense strand with phosphoric acid
8. 8. ID:NickedS−WT:ニック付きセンス鎖を持つ二重鎖 ID: NickedS-WT: double chain with a nicked sense strand
9. 9. ID:NickedS−WT:ニック付きセンス鎖を持つ二重鎖;B2は5'末端をリン酸エステル化 ID: NickedS-WT: duplex with nicked sense strand; B2 is phosphorylated 5 'end
10. 10. ID:NickedS−RT:ニック付きセンス鎖を持つ二重鎖;rTにより完全修飾 The fully qualified by rT; duplexes with a nicked sense strand: ID: NickedS-RT
11. 11. ID:NickedS−RT:ニック付きセンス鎖を持つ二重鎖;B2は5'末端をリン酸エステル化;rTにより完全修飾 ID: NickedS-RT: duplex with nicked sense strand; B2 is a 5 'terminal phosphorylated; fully modified by rT
12. 12. ID:NickedA−RT:ニック付きアンチセンス鎖を持つ二重鎖;rTにより完全修飾 The fully qualified by rT; double strand with a nick with the antisense strand: ID: NickedA-RT
13. 13. ID:NickedA−RT:ニック付きアンチセンス鎖を持つ二重鎖;B2は5'末端をリン酸エステル化;rTにより完全修飾 ID: NickedA-RT: duplex with nicked antisense strand; B2 is a 5 'terminal phosphorylated; fully modified by rT

iii リンカによって閉じられたギャップ又はニックを有する二重鎖siRNA分子 duplex siRNA molecules having closed gaps or nicked by iii linker
別の様態では、本開示にかかるギャップ又はニックを有する二重鎖siRNA分子は、リンカ分子を用いて「閉じる」ことができる。 In another aspect, double-stranded siRNA molecule having such gaps or nicks in this disclosure may use a linker molecule "close". 得られた分子は非常により安定となる、すなわちより高いT を有して宿主細胞内での分解に対する耐性が高まるはずである。 The resulting molecule is stable by a very, i.e. should increase resistance to degradation in the host cell is a higher T m.

本開示にかかるそのようなリンカの例としては、例えば脱塩基ヌクレオチド、脱塩基プロパンジオール等の脱塩基リンカ、及び多くの低分子C6型リンカが挙げられるが、これらに限定されない。 Examples of such linker according to the present disclosure, for example, abasic nucleotide, abasic linker such as abasic propanediol, and include many low molecular C6 type linker, but are not limited to.

非ヌクレオチドリンカは、脱塩基ヌクレオチド、ポリエーテル、ポリアミン、ポリアミド、ペプチド、炭水化物、脂質、ポリ炭化水素、又はその他のポリマ化合物(例:2乃至100個のエチレングリコール単位を有するポリエチレングリコール等)から構成されていてよい。 Non-nucleotide linker, an abasic nucleotide, polyether, polyamine, polyamide, peptide, carbohydrate, lipid, polyhydrocarbon, or other polymeric compounds: composed (Examples 2 to polyethylene glycol having 100 ethylene glycol units) it may have been. 具体例としては、Seela及びKaiser,Nucleic Acids Res. Specific examples, Seela and Kaiser, Nucleic Acids Res. 18: 6353, 1990、及びNucleic Acids Res. 18: 6353, 1990, and Nucleic Acids Res. 15: 3113, 1987; Cload及びSchepartz,J. 15: 3113, 1987; Cload and Schepartz, J. Am. Am. Chem. Chem. Soc. Soc. 113: 6324, 1991; Richardson及びSchepartz,J. 113: 6324, 1991; Richardson and Schepartz, J. Am. Am. Chem. Chem. Soc. Soc. 113: 5109, 1991; Maら,Nucleic Acids Res. 113: 5109, 1991; Ma et al., Nucleic Acids Res. 21: 2585, 1993、及びBiochemistry, 32: 1751, 1993; Durandら,Nucleic Acids Res. 21: 2585, 1993, and Biochemistry, 32: 1751, 1993; Durand et al., Nucleic Acids Res. 18: 6353, 1990; McCurdyら,Nucleosides&Nucleotides, 10: 287, 1991; Jschkeら,Tetrahedron Lett. 18: 6353, 1990; McCurdy et al., Nucleosides & Nucleotides, 10: 287, 1991; Jschke et al., Tetrahedron Lett. 34: 301, 1993; Onoら,Biochemistry, 30: 9914, 1991; Arnoldら、国際公開公報WO89/02439、Usmanら、国際公開公報WO95/06731、Dudyczら、国際公開公報WO95/11910、並びにFerentz及びVerdine,J. 34: 301, 1993; Ono et al., Biochemistry, 30: 9914, 1991; Arnold et al., International Publication WO89 / 02439, Usman et al., International Publication WO95 / 06731, Dudycz et al, International Publication WO95 / 11910, and Ferentz and Verdine, J. Am. Am. Chem. Chem. Soc. Soc. 113: 4000, 1991、に記載のものが挙げられる。 113: 4000, 1991, include those described in. 「非ヌクレオチドリンカ」はさらに、糖及び/又はリン酸エステル置換基を含む1又は2個以上のヌクレオチド単位の代わりに核酸鎖に取り込まれることができ、残った塩基に酵素活性を示させる基又は化合物を意味する。 "Non-nucleotide linker" may further be incorporated into a nucleic acid strand in place of one or two or more nucleotide units, including sugars and / or phosphate ester substituents, groups to exhibit enzymatic activity in the remaining base or It refers to a compound. この基又は化合物は、例えば糖のC1の位置にアデノシン、グアニン、シトシン、ウラシル、又はチミン等の一般的に認知されたヌクレオチド塩基を含まない点において、脱塩基型となり得る。 The group or compound, such as adenosine in C1 position of the sugar, guanine, cytosine, uracil, or in that it does not contain a commonly recognized nucleotide base thymine or the like, may be abasic type.

このリンカの存在が、RISC活性を著しく阻害することがあってはならない。 The presence of the linker, it shall not be possible to significantly inhibit RISC activity. 本開示のリンカを含むギャップ又はニックを有する二重鎖siRNA分子の投与の結果、対応するリンカを含まないギャップ又はニックを有する二重鎖siRNA分子を用いた場合に見られるRNA干渉と実質的に同じRNA干渉のレベルとなることが好ましい。 Result of administration of a double stranded siRNA molecule with a gap or nick containing linker of the present disclosure, corresponding seen RNA interference substantially when using the double-stranded siRNA molecules with gaps or nicks not including the linker it is preferred that the level of the same RNA interference. 本開示のリンカを含むギャップ又はニックを有する二重鎖siRNA分子の投与の結果、対応するリンカを含まないギャップ又はニックを有する二重鎖siRNA分子を用いた場合に見られるRNA干渉よりも高いRNA干渉レベルとなることが最も好ましい。 Result of administration of a double stranded siRNA molecule with a gap or nick containing linker of the present disclosure, higher than RNA interference seen with duplex siRNA molecules with gaps or nick free of the corresponding linker RNA it is most preferred that the level of interference.

低分子抑制核酸(siNA)の化学修飾 Chemical modification of small molecules inhibiting nucleic acid (siNA)
限定されない例において、核酸分子中に化学修飾ヌクレオチドを導入することは、外部から送達された天然RNA分子に固有のインビボでの安定性及び生体利用度の潜在的な限界を克服する強力なツールとなる。 In a non-limiting example, the introduction of chemically modified nucleotides into nucleic acid molecule, a powerful tool in overcoming potential limitations of stability and bioavailability in specific vivo natural RNA molecule delivered externally Become. 例えば、化学修飾核酸分子は血清中の半減期が長くなる傾向にあるため、化学修飾核酸分子を用いることで、ある治療効果のための特定の核酸分子の投与量を抑えることが可能となる。 For example, chemically modified nucleic acid molecules because of a tendency that the half-life in serum is prolonged, the use of chemically-modified nucleic acid molecules, it is possible to suppress the dose of a particular nucleic acid molecule for a certain therapeutic effect. さらに、特定の化学修飾によって、特定の細胞若しくは組織を標的にすること、及び/又は核酸分子の細胞取り込みを高めることにより核酸分子の生体利用度を向上させることができる。 Furthermore, certain chemical modifications can improve the bioavailability of nucleic acid molecules by enhancing the specific cell or tissue to be targeted, and / or nucleic acid molecules cellular uptake. 従って、化学修飾核酸分子の活性が、例えば全RNA核酸分子等の天然の核酸分子と比較して低下したとしても、分子の安定性及び/又は送達が向上したことにより、修飾核酸分子全体としての活性は天然の核酸分子よりも高めることができる。 Thus, the activity of the chemically modified nucleic acid molecules, for example, even if reduced compared to a naturally occurring nucleic acid molecule of total RNA nucleic acid molecule, such as, by stability and / or delivery of the molecule is enhanced, modified nucleic acid molecule as a whole activity can be made higher than naturally occurring nucleic acid molecule. 天然の未修飾siNAとは異なり、化学修飾siNAはヒトのインターフェロン活性を活性化する可能性を最小限に抑えることもできる。 Unlike native unmodified siNA, chemically-modified siNA can also minimize the possibility of activating interferon activity in humans.

本明細書で述べるsiNA分子については、本発明のsiNA分子のアンチセンス領域は、該アンチセンス領域の3'末端にヌクレオチド間ホスホロチオエート結合を有することができる。 For siNA molecules described herein, the antisense region of a siNA molecule of the invention can have a phosphorothioate internucleotide linkages at the 3'-end of said antisense region. 本明細書で述べるsiNA分子のいずれの様態においても、アンチセンス領域は、該アンチセンス領域の5'末端に約1乃至約5個のヌクレオチド間ホスホロチオエート結合を具えることができる。 In any aspect of siNA molecules described herein, the antisense region can comprise about 1 to about 5 nucleotides phosphorothioate internucleotide linkages at the 5 'end of the antisense region. 本明細書で述べるsiNA分子のいずれの様態においても、本発明のsiNA分子の3'末端ヌクレオチドオーバハングは、核酸の糖、塩基、若しくはバックボーンが化学修飾されたリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドを具えることができる。 In any aspect of siNA molecules described herein, the 3 'terminal nucleotide overhang of siNA molecule of the invention, nucleic acid sugar, base, or backbone may comprise a chemically modified ribonucleotides or deoxyribonucleotides it can. 本明細書で述べるsiNA分子のいずれの様態においても、3'末端ヌクレオチドオーバハングは、1又は2個以上のユニバーサル塩基リボヌクレオチドを具えることができる。 In any aspect of siNA molecules described herein, the 3 'terminal nucleotide overhang may comprise one or two or more universal base ribonucleotides. 本明細書で述べるsiNA分子のいずれの様態においても、3'末端ヌクレオチドオーバハングは、1又は2個以上の非環式ヌクレオチドを具えることができる。 In any aspect of siNA molecules described herein, the 3 'terminal nucleotide overhang may comprise one or two or more acyclic nucleotides.

例えば、限定されない例において、本発明は、約1、2、3、4、5、6、7、8個又は9個以上のヌクレオチド間ホスホロチオエート結合を一方のsiNA鎖に有する化学修飾短鎖干渉核酸(siNA)を特徴とする。 For example, in non-limiting example, the present invention is about 1,2,3,4,5,6,7,8 amino or chemically modified short interfering nucleic acid having nine or more phosphorothioate internucleotide linkages in one siNA strand and wherein the (siNA). さらに別の様態では、本発明は、約1、2、3、4、5、6、7、8個又は9個以上のヌクレオチド間ホスホロチオエート結合を、独立して両方のsiNA鎖に有する化学修飾短鎖干渉核酸(siNA)を特徴とする。 In yet another aspect, the present invention is about 1,2,3,4,5,6,7,8 or 9 or more phosphorothioate internucleotide linkages, chemically modified short having independently both siNA strands interfering nucleic acid of (siNA), wherein. ヌクレオチド間ホスホロチオエート結合は、例えばセンス鎖、アンチセンス鎖、又はその両方のようにsiNA二重鎖の一方又は両方のオリゴヌクレオチド鎖に存在することができる。 Phosphorothioate internucleotide linkages can be present, for example the sense strand, antisense strand, or in one or both oligonucleotide strands of the siNA duplex as both. 本発明のsiNA分子は、センス鎖、アンチセンス鎖、又はその両方の3'末端、5'末端、又は3'末端と5'末端の両方に、1又は2個以上のヌクレオチド間ホスホロチオエート結合を具えることができる。 siNA molecules of the present invention, sense strand, antisense strand, or 3 'end, 5' of both ends, or 3 'end and 5' at both ends, one or two or more nucleotides between the ingredients phosphorothioate linkages it can be obtained. 例えば、本発明の典型的なsiNA分子は、約1乃至約5個又は6個以上(例:約1、2、3、4、5個、又は6個以上)の連続するヌクレオチド間ホスホロチオエート結合を、センス鎖、アンチセンス鎖、又はその両方の5'末端に具えることができる。 For example, typical siNA molecule is about 1 to about 5 or 6 or more of the invention (e.g. 2, 3, 4, 5, or from 6 or more pieces) consecutive phosphorothioate internucleotide linkages of , it may comprise a sense strand, antisense strand, or the 5 'end of both. 別の限定されない例では、本発明の典型的なsiNA分子は1又は2個以上(例:約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個又は11個以上)のヌクレオチド間ピリミジンホスホロチオエート結合を、センス鎖、アンチセンス鎖、又はその両方に有することができる。 In another non-limiting example, an exemplary siNA molecule of the invention is one or two or more (e.g. 8, 9, 10, one or 11 or more) the nucleotide between pyrimidine phosphorothioate linkage, may have sense strand, antisense strand, or both. さらに別の限定されない例では、本発明の典型的なsiNA分子は1又は2個以上(例:約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個又11個以上)のヌクレオチド間プリンホスホロチオエート結合を、センス鎖、アンチセンス鎖、又はその両方に具えることができる。 And will not be yet another limiting example, exemplary siNA molecule one or two or more (of the present invention: 8, 9, 10, or also 11 or more the nucleotide between purine phosphorothioate bond), may comprise a sense strand, antisense strand, or both.

siNA分子は環状核酸分子から構成することができ、この場合、siNAの長さは約38乃至約70(例:約38、40、45、50、55、60、65、又は70)ヌクレオチドであって、約18乃至約23(例:約18、19、20、21、22、又は23)塩基対を有し、この場合、環状オリゴヌクレオチドは約19塩基対及び2つのループを有するダンベル型構造を形成する。 siNA molecules can be composed of a circular nucleic acid molecule, in this case, the length of the siNA is about 38 to about 70: there in (eg about 38,40,45,50,55,60,65, or 70) nucleotides Te, from about 18 to about 23 (e.g. about 18,19,20,21,22, or 23) has a base pair, in this case, circular oligonucleotide is dumbbell has about 19 base pairs and two loop structures to form.

環状siNA分子は二つのループモチーフを含み、この場合、siNA分子の一方又は両方のループ部は生分解性である。 Circular siNA molecule comprises two loop motifs, in this case, the loop portions of one or both siNA molecule is biodegradable. 例えば、本発明の環状siNA分子は、siNA分子のループ部のインビボでの分解によって、約2個のヌクレオチドを含む3'末端ヌクレオチドオーバハング等の3'末端オーバハングを有する二本鎖siNA分子を生成することができるように設計される。 For example, a circular siNA molecule of the invention, the degradation in vivo of the loop portion of the siNA molecule, to produce a double-stranded siNA molecule having terminal overhang 3 'terminal nucleotide overhang such as' 3 comprising about 2 nucleotides it is designed to be capable.

siNA分子内に存在し、siNA分子のアンチセンス鎖にあることが好ましいが、任意にセンス鎖、及び/又はアンチセンス鎖とセンス鎖の両方にあってもよい修飾ヌクレオチドは、天然のリボヌクレオチドに類似の性質又は特性を有する修飾ヌクレオチドを具える。 Present in the siNA molecule, but is preferably in the antisense strand of the siNA molecule, optionally in the sense strand, and / or antisense strand and the sense strand may modified nucleotides even in both the natural ribonucleotide comprising a modified nucleotide having similar characteristics or properties. 例えば、本発明はノーザンコンフォメーション(例:ノーザン擬回転周期(Northern pseudorotation cycle)、例えばSaenger著、「Principles of Nucleic Acid Structure」、Springer− Verlag編集、1984年を参照)を持つ修飾ヌクレオチドを含むsiNA分子を特徴とする。 For example, the present invention is Northern conformation (e.g. Northern pseudo rotation period (Northern pseudorotation cycle), for example Saenger al., "Principles of Nucleic Acid Structure", Springer- Verlag edit, see 1984) siNA containing modified nucleotides having and wherein the molecule. 従って、本発明のsiNA分子内に存在し、本発明のsiNA分子のアンチセンス鎖にあることが好ましいが、任意にセンス鎖、及び/又はアンチセンス鎖とセンス鎖の両方にあってもよい化学修飾ヌクレオチドは、ヌクレアーゼ分解に対する耐性を有し、同時にRNAiを媒介する能力も保持する。 Thus, present in the siNA molecules of the present invention, it is preferably in the antisense strand of the siNA molecules of the present invention, optionally in the sense strand, and / or the antisense strand and sense strand both there may be chemical modified nucleotides, resistant to nuclease degradation, also retain the ability to mediate RNAi simultaneously. ノーザン立体配置を持つヌクレオチドの限定されない例としては、架橋型核酸(locked nucleic acid;LNA)ヌクレオチド(例:2'−O,4'−C−メチレン−(D−リボフラノシル)ヌクレオチド)、2'−メトキシエトキシ(MOE)ヌクレオチド、2'−メチルチオエチル、2'−デオキシ−2'−フルオロヌクレオチド、2'−デオキシ−2'−クロロヌクレオチド、2'−アジドヌクレオチド、及び2'−O−メチルヌクレオチドが挙げられる。 Non-limiting examples of nucleotides having a northern configuration, cross-linked nucleic acid (locked nucleic acid; LNA) nucleotides (eg: 2'-O, 4'-C- methylene - (D-ribofuranosyl) nucleotides), 2' methoxyethoxy (MOE) nucleotides, 2'-methylthioethyl, 2'-deoxy-2'-fluoro nucleotides, 2'-deoxy-2'-chloro nucleotides, 2'-azido nucleotides, and 2'-O- methyl nucleotides and the like.

二本鎖siNA分子のセンス鎖は、逆位デオキシ塩基部位(inverted deoxybasic moiety)などの末端キャップ部位をセンス鎖の3'末端、5'末端、又は3'末端と5'末端の両方に有してもよい。 Sense strand of a double stranded siNA molecule may have a terminal cap site, such as inverted deoxy abasic site (inverted deoxybasic moiety) 3 'end, 5' of the sense strand ends, or 3 to both 'and 5' ends it may be.

限定されない抱合体の例としては、2003年4月30日に出願されたVargeeseら、米国特許出願番号10/427160に記載の抱合体及びリガンドが挙げられ、図面を含むこの出願の全文は参照することで本明細書に組み入れられる。 Examples of non-limiting conjugate, Vargeese et al., Filed Apr. 30, 2003, include conjugates and ligands described in U.S. Patent Application No. 10/427160, the full text of this application, including the drawings to refer which is incorporated herein by. 別の様態では、抱合体は、生分解性リンカによって化学修飾siNA分子と共有結合している。 In another aspect, the conjugate is covalently attached to the chemically-modified siNA molecule by biodegradable linker. 一つの様態では、抱合体分子は化学修飾siNA分子のセンス鎖、アンチセンス鎖のいずれか、又はその両方の3'末端に結合している。 In one aspect, the conjugate molecule is attached the sense strand of the chemically-modified siNA molecules, any of the antisense strand, or the 3 'end of both. 別の様態では、抱合体分子は化学修飾siNA分子のセンス鎖、アンチセンス鎖のいずれか、又はその両方の5'末端に結合している。 In another aspect, the conjugate molecule is attached the sense strand of the chemically-modified siNA molecules, any of the antisense strand, or the 5 'end of both. さらに別の様態では、抱合体分子は、化学修飾siNA分子のセンス鎖、アンチセンス鎖のいずれか、若しくはその両方の3'末端及び5'末端の両方、又はこれらのいずれかの組み合わせに結合している。 In yet another aspect, the conjugate molecule is the sense strand of the chemically-modified siNA molecules, any of the antisense strand, or attached to both the 3 'and 5' ends of both or any combination thereof, ing. 一つの様態では、本発明の抱合体分子は、細胞等の生体系への化学修飾siNA分子の送達を促進する分子を具える。 In one aspect, the conjugate molecules of the invention comprises a molecule that facilitates delivery of a chemically-modified siNA molecule into a biological system such as a cell. 別の様態では、化学修飾siNA分子と結合する抱合体分子は、ポリエチレングリコール、ヒト血清アルブミン、又は細胞取り込みを媒介できる細胞受容体のリガンドである。 In another aspect, the conjugate molecule attached to the chemically-modified siNA molecule is a ligand of polyethylene glycol, a cellular receptor that can mediate human serum albumin, or cellular uptake. 本発明で意図する、化学修飾siNA分子と結合可能な抱合体分子の具体例は、Vargeeseら、2003年7月10日公開の米国特許公開公報US2003/0130186及び2004年6月10日公開の米国特許公開公報US2004/0110296に記載されている。 Contemplated in the present invention, examples of chemically-modified siNA molecule capable of binding conjugate molecules, Vargeese et al., US published June 10, 2003, published July 10 US Patent Publication US2003 / 0130186 and 2004 It is described in patent publication US2004 / 0,110,296. 用いられる抱合体の種類及び本発明のsiNA分子の抱合の度合いを評価することによって、siNAがRNAi活性を媒介する能力を同時に保持した状態でのsiNA構築物の薬物動態特性、生体利用度、及び/又は安定性の向上を調べることができる。 By evaluating the degree of conjugation of siNA molecules of the conjugates of the type and the invention used, the pharmacokinetic properties of the siNA construct in a state in which siNA is held at the same time the ability to mediate RNAi activity, bioavailability, and / or it is possible to examine the improvement in stability. 従って、当業者は、種々の抱合体で修飾されたsiNA構築物をスクリーニングすることにより、例えば本技術分野で一般的に知られる動物モデルにおいて、siNA抱合複合体の性質がRNAiを媒介する能力を保持した状態で向上されたかどうかを調べることができる。 Thus, those skilled in the art, retention by screening siNA constructs that are modified with various conjugates, for example in an animal model commonly known in the art, the nature of the siNA conjugate complex the ability to mediate RNAi You can check whether it has been improved in a state.

siNAはさらに、siNAのセンス領域とsiNAのアンチセンス領域を連結する、ヌクレオチドリンカ、非ヌクレオチドリンカ、又はヌクレオチド/非ヌクレオチド混在リンカを具えることができる。 siNA further linking the sense and antisense regions of the siNA of the siNA, nucleotide linker, may comprise a non-nucleotide linker, or nucleotide / non-nucleotide mix linker. 一つの様態では、ヌクレオチドリンカの長さは>2ヌクレオチドであり、例えば3、4、5、6、7、8、9、又は10ヌクレオチドであってよい。 In one aspect, the length of a nucleotide linker> is 2 nucleotides, such 3,4, 5,6, 7,8, 9, or from 10 nucleotides. 別の様態では、ヌクレオチドリンカは核酸アプタマであってよい。 In another aspect, the nucleotide linker can be a nucleic acid aptamer. 本明細書で用いる「アプタマ」又は「核酸アプタマ」とは、標的分子に特異的に結合する核酸分子を意味し、この場合、核酸分子は、自然環境下で標的分子によって認識される配列を含む配列を具える。 The used herein, "aptamer" or "nucleic acid aptamer" means a nucleic acid molecule that binds specifically to a target molecule, in this case, the nucleic acid molecule comprises a sequence recognized by the target molecule in the natural environment comprising the array. 代替的に、アプタマは、標的分子が核酸と自然には結合しない場合に標的分子と結合する核酸分子であってよい。 Alternatively, aptamers can be a nucleic acid molecule that binds to a target molecule when the target molecule does not naturally associated with the nucleic acid. 標的分子は対象であるいかなる分子であってもよい。 The target molecule may be any molecule of interest. 例えば、アプタマを用いてタンパク質のリガンド結合性ドメインと結合させ、それによって天然のリガンドとタンパク質との相互作用を防ぐことができる。 For example, by binding the ligand binding domain of a protein with aptamer, thereby preventing interaction of the naturally occurring ligand with the protein. これは限定されない例であり、当業者であれば、本技術分野で一般的に知られる技術を用いて他の様態を容易に作り出せることが認識されるであろう(例えば、Goldら,Annu. Rev. Biochem. 64: 763, 1995; Brody及びGold,J. Biotechnol. 74: 5, 2000; Sun,Curr. Opin. Mol. Ther. 2: 100, 2000; Kusser,J. Biotechnol. 74: 27, 2000; Hermann及びPatel,Science 287: 820, 2000; 及びJayasena,Clinical Chemistry 45: 1628, 1999、を参照)。 This is a non-limiting example, those skilled in the art, using techniques commonly known in the art it will be recognized that able to produce easily another aspect (e.g., Gold et al., Annu. Rev. Biochem 64:. 763, 1995; Brody and Gold, J Biotechnol 74:.. 5, 2000; Sun, Curr Opin Mol Ther 2:...... 100, 2000; Kusser, J Biotechnol 74: 27, 2000; Hermann and Patel, Science 287: 820, 2000; and Jayasena, Clinical Chemistry 45: 1628, 1999 see).

非ヌクレオチドリンカは、脱塩基ヌクレオチド、ポリエーテル、ポリアミン、ポリアミド、ペプチド、炭水化物、脂質、ポリ炭化水素、又はその他のポリマ化合物(例:2乃至100個のエチレングリコール単位を有するポリエチレングリコール等)から構成されていてよい。 Non-nucleotide linker, an abasic nucleotide, polyether, polyamine, polyamide, peptide, carbohydrate, lipid, polyhydrocarbon, or other polymeric compounds: composed (Examples 2 to polyethylene glycol having 100 ethylene glycol units) it may have been. 具体例としては、Seela及びKaiser,Nucleic Acids Res. Specific examples, Seela and Kaiser, Nucleic Acids Res. 18: 6353, 1990、及びNucleic Acids Res. 18: 6353, 1990, and Nucleic Acids Res. 15: 3113, 1987; Cload及びSchepartz,J. 15: 3113, 1987; Cload and Schepartz, J. Am. Am. Chem. Chem. Soc. Soc. 113: 6324, 1991; Richardson及びSchepartz,J. 113: 6324, 1991; Richardson and Schepartz, J. Am. Am. Chem. Chem. Soc. Soc. 113: 5109, 1991; Maら,Nucleic Acids Res. 113: 5109, 1991; Ma et al., Nucleic Acids Res. 21: 2585, 1993、及びBiochemistry, 32: 1751, 1993; Durandら,Nucleic Acids Res. 21: 2585, 1993, and Biochemistry, 32: 1751, 1993; Durand et al., Nucleic Acids Res. 18: 6353, 1990; McCurdyら,Nucleosides&Nucleotides, 10: 287, 1991; Jschkeら,Tetrahedron Lett. 18: 6353, 1990; McCurdy et al., Nucleosides & Nucleotides, 10: 287, 1991; Jschke et al., Tetrahedron Lett. 34: 301, 1993; Onoら,Biochemistry, 30: 9914, 1991; Arnoldら、国際公開公報WO89/02439、Usmanら、国際公開公報WO95/06731、Dudyczら、国際公開公報WO95/11910、並びにFerentz及びVerdine,J. 34: 301, 1993; Ono et al., Biochemistry, 30: 9914, 1991; Arnold et al., International Publication WO89 / 02439, Usman et al., International Publication WO95 / 06731, Dudycz et al, International Publication WO95 / 11910, and Ferentz and Verdine, J. Am. Am. Chem. Chem. Soc. Soc. 113: 4000, 1991、に記載のものが挙げられる。 113: 4000, 1991, include those described in. 「非ヌクレオチドリンカ」はさらに、糖及び/又はリン酸エステル置換基を含む1又は2個以上のヌクレオチド単位の代わりに核酸鎖に取り込まれることができ、残った塩基に酵素活性を示させる基又は化合物を意味する。 "Non-nucleotide linker" may further be incorporated into a nucleic acid strand in place of one or two or more nucleotide units, including sugars and / or phosphate ester substituents, groups to exhibit enzymatic activity in the remaining base or It refers to a compound. この基又は化合物は、例えば糖のC1の位置にアデノシン、グアニン、シトシン、ウラシル、又はチミン等の一般的に認知されたヌクレオチド塩基を含まない点において、脱塩基型となり得る。 The group or compound, such as adenosine in C1 position of the sugar, guanine, cytosine, uracil, or in that it does not contain a commonly recognized nucleotide base thymine or the like, may be abasic type.

ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチド/siNA抱合体を具える組成物の投与 Administration of a composition comprising a polynucleotide delivery / siNA conjugate
本開示の送達促進ポリペプチド/siNA抱合体を用いて、本明細書で述べる若しくは本技術分野で知られる疾患又は状態を治療することができる。 With delivery-enhancing polypeptide / siNA conjugate of the present disclosure, it is possible to treat a disease or condition known in or the art described herein. 特定の疾患又は状態を治療するために、本発明の送達促進ポリペプチド/siNA抱合体を、個別に若しくは一つ以上の化合物と組み合わせて、治療に適した条件下で患者に投与するか又は当業者にとって明らかな他の適切な細胞へ投与するかができる。 To treat a particular disease or condition, the delivery-enhancing polypeptide / siNA conjugate of the present invention, in combination with individually or one or more compounds, or those administered to a patient under conditions suitable for the treatment It can either be administered to clear other suitable cells for art.

例えば、本明細書で述べる送達促進ポリペプチド/siNA抱合体は、他の公知の治療法及び/又は治療薬と組み合わせて用いることにより、広範囲にわたる種々の状態、特にウィルス感染を治療することができる。 For example, the delivery-enhancing polypeptide / siNA conjugates described herein, by using it in combination with other known therapies and / or therapeutic agents, it is possible to treat various conditions, particularly viral infections extensive . 本発明の送達促進ポリペプチド/siNA抱合体と容易に組み合わせることのできる他の治療薬の限定されない例としては、例えば、酵素核酸分子、アロステリック核酸分子、アンチセンス、デコイ、又はアプタマ核酸分子、モノクローナル抗体等の抗体、低分子、並びに金属、塩、及びイオンを含む他の有機及び/又は無機化合物が挙げられる。 Other non-limiting examples of therapeutic agents that can be combined and easily delivered enhancing polypeptide / siNA conjugates of the invention are, for example, enzymatic nucleic acid molecules, allosteric nucleic acid molecules, antisense, decoy, or aptamer nucleic acid molecules, monoclonal antibodies, such as antibodies, small molecules, and metal salts, and include other organic and / or inorganic compounds containing ions.

従って、本開示は、1又は2種類以上の送達促進ポリペプチド/siNA抱合体を、安定剤やバッファ等の許容される担体中に含む組成物について述べる。 Accordingly, the present disclosure, one or two or more delivery-enhancing polypeptide / siNA conjugate describes a composition comprising a acceptable carrier, such as a stabilizer or a buffer. 送達促進ポリペプチド/siNA抱合体は、治療に適した組成物を形成する安定剤やバッファ等を含んだ又は含まない状態で、いかなる標準的な方法によって患者に投与してもよい。 Delivery-enhancing polypeptide / siNA conjugate, in a state free inclusive or a stabilizer, a buffer, or the like to form a composition suitable for treatment may be administered to a patient by any standard method. リポソーム送達メカニズムの使用を所望する場合は、リポソームを形成する標準的なプロトコルに従うことができる。 If it is desired to use a liposome delivery mechanism may follow standard protocols for formation of liposomes. 本発明の組成物は、経口投与のために錠剤、カプセル、若しくはエリキシール剤として、直腸内投与のために坐薬として、及び注射投与のために無菌溶液若しくは懸濁液として、本技術分野で公知の他の化合物を含んで、又は含まないで製剤し、使用することもできる。 The compositions of the present invention are tablets for oral administration, capsules, or as an elixir, as a suppository for rectal administration, and as a sterile solution or suspension for injection administration, known in the art contain other compounds, or be formulated without including, it may also be used. 送達促進ポリペプチド/siNA抱合体製剤は、例えば塩酸、臭素酸、酢酸、及びベンゼンスルホン酸の塩といった酸付加塩等の上述の化合物の塩を含む。 Delivery-enhancing polypeptide / siNA conjugate formulations include for example hydrochloric, hydrobromic, acetic acid, and the salts of the aforementioned compounds, such as hydrochloric acid addition salt such as benzenesulfonic acid.

医薬組成物又は製剤とは、例えば全身投与等、細胞又はヒト等の患者に対する投与に適した形の組成物又は製剤のことである。 The pharmaceutical composition or formulation, e.g. systemic administration or the like, is that the form of compositions or formulations suitable for administration to a patient, such as a cell or a human. 適切な形は、用途、又は例えば経口、経皮、若しくは注射等の進入経路に一部依存する。 Suitable forms, applications, or, for example orally, depends in part on the route of entry transdermal, or injection. そのような形は、組成物又は製剤が標的細胞(すなわち、負に帯電した核酸を送達させたい細胞)へ到達することを妨げてはならない。 Such forms should not prevent the composition or the formulation to reach the target cells (i.e., cells that want to deliver a negatively charged nucleic acid). 例えば、血流中に注入される医薬組成物は溶解性であるべきである。 For example, pharmaceutical compositions injected into the blood stream should be soluble. 他の要因は本技術分野で公知であり、毒性及び組成物又は製剤がその効果を発揮することを妨げる形等の考慮が含まれる。 Other factors are known in the art and include considerations such as in the form preclude the toxicity and composition or formulation from exerting its effect.

個々のレポータ遺伝子発現構築物は、1又は2種類以上の送達促進ポリペプチド/siNA抱合体と共トランスフェクトすることができる。 Individual reporter gene expression construct may be co-transfected with one or two or more delivery-enhancing polypeptide / siNA conjugate. 特定の送達促進ポリペプチド/siNA抱合体が、意図する各遺伝子変異体の発現レベルを低下させる能力は、修飾siNAをトランスフェクトした細胞としない細胞のレポータ遺伝子活性を測定して比較することによって測定することができる。 Determined by the particular delivery-enhancing polypeptide / siNA conjugates, the ability to reduce the expression level of each gene variants contemplated, measuring and comparing the reporter gene activity of the cell that does not modified siNA transfected cells can do.

核酸分子を送達する方法は、例えばAkhtarら,Trends Cell Bio. Method of delivering a nucleic acid molecule, for example Akhtar et al, Trends Cell Bio. 2: 139, 1992; Akhtar編、「Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics」、1995年; Maurerら,Mol. 2: 139, 1992; Akhtar, ed., "Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics", 1995; Maurer et al., Mol. Membr. Membr. Biol. Biol. 16: 129−140, 1999; Hofland及びHuang,Handbook Exp. 16: 129-140, 1999; Hofland and Huang, Handbook Exp. Pharmacol. Pharmacol. 137: 165−192, 1999; 及びLeeら,ACS Symp. 137: 165-192, 1999; and Lee et al., ACS Symp. Ser. Ser. 752: 184−192, 2000、に記載されている。 752: 184-192, have been described in 2000,. Sullivanら、国際公開公報WO94/02595には、酵素核酸分子の送達の一般的方法がさらに記載されている。 Sullivan et al., International Publication WO94 / 94/02595, the general method of delivery of enzymatic nucleic acid molecules are further described. これらのプロトコルは、実質的にいかなる核酸分子の送達に対しても利用することができる。 These protocols may also be utilized for the delivery of virtually any nucleic acid molecule.

本明細書で述べる「全身投与」という用語は、インビボでの血流中の薬物の全身吸収又は全身蓄積、及びそれに続く全身への分配を含むことを意図したものである。 The term "systemic administration" referred to herein is intended to include the distribution of in vivo systemic absorption or systemic drug accumulation in the blood stream, and systemic subsequent. 全身吸収をもたらす投与経路としては、静脈内、皮下、腹腔内、吸入、経口、肺内、及び筋肉内が挙げられるがこれらに限定されない。 Administration routes which lead to systemic absorption, intravenous, subcutaneous, intraperitoneal, inhalation, oral, intrapulmonary, and intramuscular but are not limited thereto. これらの各投与経路により、例えば核酸等の所望の負に帯電したポリマが、到達可能な患部組織へ曝露される。 These each route of administration, the polymer is charged to a desired negative example nucleic acids, etc., they are exposed to accessible diseased tissue. 薬物の循環中への進入速度は、分子量又はサイズに依存することが示されている。 The rate of entry into the circulation of the drug has been shown to be dependent on the molecular weight or size.

核酸分子は、当業者に公知の様々な方法によって細胞へ投与することができ、その方法にはリポソーム内への封入、イオントフォレーシス、又はハイドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノカプセル、及び生体接着性マイクロスフェア等の他の媒体への取り込み、又はタンパク質性ベクタによる取り込み(O'Hare及びNormand、国際公開公報WO00/53722参照)が含まれるがこれらに限定されない。 Nucleic acid molecules by a variety of methods known to those skilled in the art can be administered to cells, encapsulation in that the method in liposomes, iontophoresis, or hydrogels, cyclodextrins, biodegradable nanocapsules, and incorporation into other media, such as a bioadhesive microspheres, or proteinaceous vectors by uptake (O'Hare and Normand, see International Publication WO00 / 53722) include but are not limited thereto. 代替的に、核酸/媒体の組み合わせを、直接注射又は輸液ポンプの使用によって局所的に送達することもできる。 Alternatively, a combination of nucleic acid / vehicle, may be locally delivered by direct injection or by use of an infusion pump. 本発明の核酸分子の直接注射は、皮下注射、筋肉内注射、若しくは皮内注射を問わず、標準的な針とシリンジによる方法、又は、Conryら,Clin. Direct injection of the nucleic acid molecules of the present invention, subcutaneous injection, intramuscular injection, or both intradermal injection, the method according to the standard needle and syringe, or, Conry et al, Clin. Cancer Res. Cancer Res. 5: 2330−2337, 1999、及びBarryら、国際公開公報WO99/31262に記載のような無針技術を用いて行うことができる。 5: 2330-2337 can be performed using 1999, and Barry et al., The needle-free technologies such as those described in International Publication WO99 / ​​31 262.

本明細書で開示する送達促進ポリペプチド/siNA抱合体は、医薬品として用いることができる。 Delivery-enhancing polypeptide / siNA conjugates disclosed herein can be used as pharmaceuticals. 医薬品は、患者の疾患状態の発生を予防若しくは調節し、又はそれを治療(症状を、好ましくはすべての症状を、ある程度軽減)する。 Drugs, prevent or regulate the development of the disease state of the patient, or (symptoms, preferably all the symptoms, to some extent reduce) treatment it is.

本明細書で用いる「薬理学的に許容される製剤」とは、本発明の核酸分子をその所望する活性にとって最適な体内の場所へ効果的に送達させる組成物又は製剤を含むことを意図したものである。 And "pharmaceutically acceptable formulation" as used herein, a nucleic acid molecule of the present invention is intended to include the desired optimum effective composition or formulation is delivered into the body of the location for the active it is intended. 本発明の核酸分子と製剤するのに適した剤の限定されない例としては、CNSへの薬物の進入を促進可能なP−糖タンパク質阻害剤(Pluronic P85等)(Jolliet−Riant及びTillement,Fundam. Clin. Pharmacol. 13: 16−26, 1999)、脳内移植後の持続的放出送達のためのDL−ラクチド−グリコリド共重合ポリママイクロスフェア(Emerichら,Cell Transplant 8: 47−58, 1999)(Alkermes, Inc.社、マサチューセッツ州、ケンブリッジ)等の生分解性ポリマ、及び血液脳関門を通して薬物を送達可能で神経細胞の取り込みメカニズムを変性可能なポリブチルシアノアクリレートから作られたもの(Prog Neu Non-limiting examples of suitable agents for nucleic acid molecules and formulations of the present invention, it can promote P- glycoprotein inhibitor entry of drugs into the CNS (Pluronic P85, etc.) (Jolliet-Riant and Tillement, Fundam. .. Clin Pharmacol 13: 16-26, 1999), DL- lactide for sustained release delivery after intracerebral implantation - glycolide copolymer polymer microspheres (Emerich et al., Cell transplant 8: 47-58, 1999) ( Alkermes, Inc., Inc., Cambridge, MA) as of the biodegradable polymer, and that the uptake mechanism of drug deliverable nerve cells through the blood brain barrier made of modifiable polybutylcyanoacrylate (Prog Neu opsychopharmacol Biol Psychiatry 23: 941−949, 1999)等の充填されたナノ粒子が含まれる。 opsychopharmacol Biol Psychiatry 23: 941-949, 1999) include filled nanoparticles or the like.

本発明の化合物を含むリポソーム又はその他の薬物担体を使用することにより、例えば網状内皮系(RES)の組織等特定の種類の組織内で薬物を局在化することが潜在的に可能である。 The use of liposomes or other drug carrier comprising the compounds of the present invention, for example, it is potentially possible to localize the drug in tissues such as the particular type of tissue of the reticuloendothelial system (RES). 薬物とリンパ球やマクロファージ等の細胞の表面との会合を促進することができるリポソーム製剤も有用である。 Liposome formulation that can facilitate the association of drug with lymphocytes and macrophages, etc. of a cell surface are also useful. この方法によると、マクロファージ及びリンパ球によるガン細胞等の異常細胞に対する免疫認識特異性を利用して、標的細胞への薬物の送達を促進することができる。 According to this method, by utilizing the immune recognition specificity for abnormal cells such as cancer cells by macrophages and lymphocytes, it can facilitate the delivery of the drug to target cells.

本発明の核酸分子を送達する方法の他の限定されない例としては、Boadoら,J. As Other non-limiting examples of methods to deliver the nucleic acid molecules of the present invention, Boado et, J. Pharm. Pharm. Sci. Sci. 87: 1308−1315, 1998; Tylerら, FEBS Lett. 87: 1308-1315, 1998; Tyler et al., FEBS Lett. 421: 280−284, 1999; Pardridgeら,PNAS USA 92: 5592−5596, 1995; Boado,Adv. 421: 280-284, 1999; Pardridge et al., PNAS USA 92: 5592-5596, 1995; Boado, Adv. Drug Delivery Rev. Drug Delivery Rev. 15: 73−107, 1995; Aldrian−Herradaら,Nucleic Acids Res. 15: 73-107, 1995; Aldrian-Herrada, et al., Nucleic Acids Res. 26: 4910−4916, 1998;及びTylerら,PNAS USA. 26: 4910-4916, 1998; and Tyler et al., PNAS USA. 96: 7053−7058, 1999、に記載の内容が挙げられる。 96: 7053-7058, 1999, and the contents described.

本開示はさらに、ポリ(エチレングリコール)脂質を含む表面改質リポソーム(PEG改質、又は長期循環リポソーム若しくはステルスリポソーム(stealth liposome))を含有する組成物の使用も特徴とする。 The disclosure further provides poly surface modifying liposomes containing (ethylene glycol) lipids (PEG modification, or long-circulating liposomes or stealth liposomes (Stealth liposome)) use of compositions containing also features. これらの製剤は、標的組織内での薬物の蓄積を増加させる方法を提供する。 These formulations offer a method for increasing the accumulation of drugs in target tissues. この種の薬物担体は、単核食細胞系(MPS又はRES)によるオプソニン化及び排出に対する耐性を有し、そのため血液内の循環時間が長くなり、封入された薬物の組織への曝露が促進される。 This class of drug carriers, has a resistance to opsonization and discharged by the mononuclear phagocytic system (MPS or RES), therefore a longer circulation time in the blood, is accelerated exposure to tissues of encapsulated drug that. Lasicら,Chem. Lasic et al., Chem. Rev. Rev. 95: 2601−2627, 1995; Ishiwataら,Chem. 95: 2601-2627, 1995; Ishiwata, et al., Chem. Pharm. Pharm. Bull. Bull. 43: 1005−1011, 1995。 43: 1005-1011, 1995. このようなリポソームは、恐らくは新血管新生された標的組織内での血管外遊走及び捕獲により、腫瘍内で選択的に蓄積されることが分かっている。 Such liposomes are presumably by extravasation and capture in the target tissue that is neovascularization found to be selectively accumulated in the tumor. Lasicら,Science 267: 1275−1276, 1995; Okuら,Biochim. Lasic et al., Science 267: 1275-1276, 1995; Oku et al., Biochim. Biophys. Biophys. Acta 1238: 86−90, 1995。 Acta 1238: 86-90, 1995. 長期循環リポソームは、特にMPSの組織内に蓄積されることが知られている従来のカチオン性リポソームと比較して、DNA及びRNAの薬物動態及び薬効を高める。 The long-circulating liposomes, particularly compared to conventional cationic liposomes which are known to accumulate in tissues of the MPS, enhance the pharmacokinetics and efficacy of DNA and RNA. Liuら,J. Liu et al., J. Biol. Biol. Chem. Chem. 42: 24864−24870, 1995; Choiら、国際公開公報WO96/10391; Ansellら、国際公開公報WO96/10390; Hollandら、国際公開公報WO96/10392。 42: 24864-24870, 1995; Choi et al., International Publication No. WO96 / 10391; Ansell et al, International Publication No. WO96 / 10390; Holland et al., International Publication No. WO96 / 10392. 長期循環リポソームは、肝臓や膵臓等の代謝が活発なMPS組織内への蓄積を避けることができることから、カチオン性リポソームよりも強く薬物をヌクレアーゼ分解から保護する傾向もある。 The long-circulating liposomes, because the metabolism of such liver and pancreas can avoid the accumulation of the active MPS in the organization, also tend to protect against nuclease degradation drug stronger than cationic liposomes.

本開示はさらに、薬理学的に許容される担体又は希釈剤中に薬理学的に効果的な量の所望の化合物を含む、保存又は投与のために調製された組成物を含む。 The present disclosure further in a pharmacologically acceptable carrier or diluent containing the desired compound of pharmacologically effective amounts, including compositions prepared for storage or administration. 治療用途に許容可能な担体又は希釈剤は薬理分野で周知であり、例えば、A. Acceptable carriers or diluents for therapeutic use are well known in pharmacology art, for example, A. R. R. Gennaro編集、「Remington's Pharmaceutical Sciences」、Mack Publishing Co. Gennaro editing, "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co. 社、1985年、に記載されている。 Company, are described in, 1985. 例えば、保存剤、安定剤、染料、及び香味料を挙げることができる。 For example, preservatives, stabilizers, dyes, and flavors. これらには、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、及びp−ヒドロキシ安息香酸のエステルが含まれる。 These include sodium benzoate, sorbic acid and esters of p- hydroxybenzoic acid. さらに、抗酸化剤及び懸濁剤を用いることもできる。 It is also possible to use antioxidants and suspending agents.

薬理学的に効果的な投与量は、疾患状態を予防し、その発生を抑制し、又はそれを治療する(症状を、好ましくはすべての症状を、ある程度軽減する)のに必要な投与量である。 Pharmacologically effective dose, to prevent a disease state, to suppress the occurrence or treat (symptoms, preferably all the symptoms to some extent to reduce) it Dosages necessary is there. 薬理学的に効果的な投与量は、疾患の種類、用いた組成物、投与経路、治療される哺乳類の種類、想定する特定の哺乳類の身体的特性、同時に行われている薬物療法、及び医療分野の当業者が認識するその他の要因に依存する。 Pharmacologically effective dose depends on the type of disease, the composition used, the route of administration, the type of mammal being treated, the physical characteristics of the specific mammal assumed, medication being performed simultaneously, and medical one of ordinary skill in the art is dependent on other factors recognized. 一般的に、負に帯電したポリマの効力に応じて、一日あたり、体重に対して0.1mg/kg乃至100mg/kgの量の活性成分が投与される。 In general, depending on the potency of the negatively charged polymer, per day, the amount of active ingredient of 0.1 mg / kg to 100 mg / kg is administered to the body weight.

本開示はさらに、薬理学的に許容される担体又は希釈剤中に薬理学的に効果的な量の所望の化合物を含む、保存又は投与のために調製された組成物を含む。 The present disclosure further in a pharmacologically acceptable carrier or diluent containing the desired compound of pharmacologically effective amounts, including compositions prepared for storage or administration. 核酸分子の送達のための補助的な又は補完的な方法は、例えばAkhtarら,Trends Cell Bio. Ancillary or complementary methods for delivery of nucleic acid molecules, for example Akhtar et al, Trends Cell Bio. 2: 139, 1992; Akhtar編集、「Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics」、1995年; Maurerら,Mol. 2: 139, 1992; Akhtar editing, "Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics", 1995; Maurer et al., Mol. Membr. Membr. Biol. Biol. 16: 129−140, 1999; Hofland及びHuang,Handb. 16: 129-140, 1999; Hofland and Huang, Handb. Exp. Exp. Pharmacol. Pharmacol. 137: 165−192, 1999;及びLeeら,ACS Symp. 137: 165-192, 1999; and Lee et al., ACS Symp. Ser. Ser. 752: 184−192, 2000、に記載されている。 752: 184-192, have been described in 2000,. Sullivanら、国際公開公報WO94/02595には、酵素核酸分子の送達の一般的方法がさらに記載されている。 Sullivan et al., International Publication WO94 / 94/02595, the general method of delivery of enzymatic nucleic acid molecules are further described. これらのプロトコルは、本発明の範囲内で意図される実質的にいかなる核酸分子の補助的な又は補完的な送達に対しても利用することができる。 These protocols can be utilized with respect to substantially any nucleic acid molecule ancillary or complementary delivery are contemplated within the scope of the present invention.

核酸分子及びポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドは、当業者に公知の様々な方法によって細胞へ投与することができ、その方法にはsiNA及びポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドのみを含む製剤、又は薬理学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、アジュバント、乳化剤、バッファ、安定剤、保存剤等の1若しくは2種類以上の追加成分をさらに含む製剤の範囲内での投与が含まれるが、これらに限定されない。 Nucleic acid molecules and polynucleotide delivery can be administered to cells by a variety of methods known to those skilled in the art, the formulation containing only siNA and polynucleotide delivery-enhancing polypeptides in the method, or a pharmacologically acceptable carriers, diluents, excipients, adjuvants, emulsifiers, buffers, stabilizers, including but administration in the range of further comprising formulation 1 or 2 or more additional ingredients such as preservatives, these but it is not limited. ある様態において、siNA及び/又はポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドは、リポソーム内に封入されたり、イオントフォレーシスで投与されたり、又はハイドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノカプセル、生体接着性マイクロスフェア、若しくはタンパク質性ベクタ等の他の媒体へ取り込まれたりすることができる(O'Hare及びNormand、国際公開公報WO00/53722参照)。 In some aspects, siNA and / or polynucleotide delivery-enhancing polypeptides, or encapsulated within a liposome, or is administered by iontophoresis, or hydrogels, cyclodextrins, biodegradable nanocapsules, bioadhesive microspheres or or can be incorporated into other media proteinaceous vector or the like (see O'Hare and Normand, International Publication WO00 / 53722). 代替的に、核酸/ペプチド/媒体の組み合わせを、直接注射又は輸液ポンプの使用によって局所的に送達することもできる。 Alternatively, a combination of nucleic acid / peptide / medium may be locally delivered by direct injection or by use of an infusion pump. 本発明の核酸分子の直接注射は、皮下注射、筋肉内注射、若しくは皮内注射を問わず、標準的な針とシリンジによる方法、又は、Conryら,Clin. Direct injection of the nucleic acid molecules of the present invention, subcutaneous injection, intramuscular injection, or both intradermal injection, the method according to the standard needle and syringe, or, Conry et al, Clin. Cancer Res. Cancer Res. 5: 2330−2337, 1999、及びBarryら、国際公開公報WO99/31262に記載されるような無針技術を用いて行うことができる。 5: 2330-2337 can be performed using 1999, and Barry et al., The needle-free technologies such as those described in International Publication WO99 / ​​31 262.

本発明の組成物は、実質的に医薬品として使用することができる。 The compositions of the present invention can be used as a substantially medicines. 医薬品は、患者の疾患状態若しくはその他の有害な状態の発生又は重症度化を予防若しくは調節し、又はこれらを治療(1若しくは2種類以上の症状を、検出若しくは測定可能な程度で軽減)する。 Drugs, prevent or modulate the occurrence or severity of the disease state or other deleterious condition of the patient, or treatment (one or two or more symptoms, detection or measurable extent in relief) they are.

従って、追加的様態の範囲内において、本発明は、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドペプチドと組み合わされた、複合体化した、若しくは抱合した形であって、任意に希釈剤、安定剤、バッファ等の薬理学的に許容される担体と共に製剤されていてよい通常は1若しくは2種類以上のsiNAである、1若しくは2種類以上のポリ核酸の存在又は投与を特徴とする医薬組成物及び方法を提供する。 Therefore, within the scope of the additional aspects, the present invention is combined with polynucleotide delivery peptides complexed, or a conjugated form, optionally in a diluent, a stabilizer, such as a buffer pharmacologically acceptable usually may have been formulated with a carrier is 1 or 2 or more siNA, provides pharmaceutical compositions and methods, wherein the presence or administration of one or two or more polynucleic acid .

本発明は、対象の特定の疾患状態又はその他の有害な状態と関連する遺伝子の発現を調節する短鎖干渉核酸(siNA)分子を提供することにより、更なる課題及び利点を満足するものである。 The present invention, by providing a short interfering nucleic acid (siNA) molecules that modulate the expression of genes associated with a particular disease state or other deleterious condition of the subject, and satisfies additional objects and advantages . 通常siNAは、対象の疾患状態又は有害な状態と関連する原因因子又は寄与因子として、高レベルに発現された遺伝子を標的とすることになる。 Usually siNA as causative agents or contributing factor associated with the disease state or adverse condition of the subject, comprising the genes expressed at high levels to target. この点で、siNAは、1又は2種類以上の関連する疾患症状の再発が予防される、又はその重症度が軽減若しくは減少するレベルまで遺伝子の発現を効果的に下方制御するであろう。 In this regard, siNA is recurrence of one or more of the associated disease symptoms is prevented, or will effectively downregulate expression of a gene to levels that severity is reduced or decreased. 代替的に、疾患又は他の有害な状態の結果又は続きとして標的遺伝子の発現が必ずしも高まらない様々な個別の疾患モデルに対しても、それでも標的遺伝子の下方制御は遺伝子の発現を低下させる(すなわち、標的遺伝子の選択されたmRNA及び/又はタンパク質産物のレベルを下げる)ことによって治療効果を示すであろう。 Alternatively, even for various individual disease models in which the expression of the target gene is not necessarily Takamara as a result or continuation of the disease or other deleterious condition, still downregulation of the target gene reduces expression of a gene (i.e. , reduce the level of a selected mRNA and / or protein product of the target gene) would show a therapeutic effect by. 代替的に、本発明のsiNAは、一つの遺伝子の発現の低下を目的とすることによって、その標的遺伝子の産物又は活性によって発現が負の制御を受ける「下流」の遺伝子の上方制御を行うことができる。 Alternatively, siNA of the invention, by the purpose of reduction of expression of one gene, by performing the upregulation of genes in "downstream" as expressed by the product or activity of the target gene negatively regulated can.

典型的な様態の範囲内において、本発明の組成物及び方法は、腫瘍壊死因子−α(TNF−α)の発現を制御して関節リウマチ(RA)の症状を治療又は予防するための治療用ツールとして有用である。 Within a typical mode, the composition and methods of the present invention, the expression of tumor necrosis factor -α (TNF-α) is controlled to a therapy for the treatment or prevention symptoms of rheumatoid arthritis (RA) it is useful as a tool. この点で、本発明はさらに、低分子核酸を用いたRNA干渉(RNAi)によるTNF−αの発現及び活性の調節に有用な化合物、組成物、及び方法を提供する。 In this regard, the present invention further provides compounds useful for the modulation of the expression and activity of TNF-alpha by RNA interference using low molecular nucleic acid (RNAi), compositions, and methods. より詳細な様態では、本発明は、哺乳類の対象中でRAの症状を予防若しくは低減するためのTNF−α及び/又はTNF−α遺伝子の発現を調節するのに有効な、短鎖干渉核酸(siNA)、短鎖干渉RNA(siRNA)、二本鎖RNA(dsRNA)、マイクロRNA(mRNA)、及び短鎖ヘアピンRNA(shRNA)分子等の低分子核酸、並びに関連する方法を提供する。 In a more detailed aspect, the present invention is effective to modulate the TNF-alpha and / or expression of TNF-alpha gene to prevent or reduce the symptoms of RA in a mammalian subject, short interfering nucleic acid ( siNA), short interfering RNA (siRNA), double-stranded RNA (dsRNA), micro RNA (mRNA), and short hairpin RNA (shRNA) low molecular nucleic acid molecules such as, as well as related methods. これらの及び関連する治療用組成物並びに治療方法の範囲内において、化学修飾siNAの使用により、例えばインビボでのヌクレアーゼ分解に対する耐性が高まる、及び/又は細胞取り込みが改善する等によって、天然siNA分子の性質と比較して修飾siNAの性質が向上することが多い。 Within these and related therapeutic compositions and methods of treatment, the use of chemically-modified siNA, for example by resistance increases to nuclease degradation in vivo, and / or the like cellular uptake is improved, natural siNA molecule it is often to improve the properties of the modified siNA as compared to nature. 本発明の開示により容易に判断できるように、複数の化学修飾部位を持つ有用なsiNAはそのRNAi活性を保持するであろう。 As it can be readily determined by the disclosure of the present invention, useful siNA having multiple chemical modifications sites will retain its RNAi activity. 本発明のsiNA分子は、従って、種々の治療、診断、標的の確認、ゲノムの発見、遺伝子工学、及び薬理ゲノミクスへの応用に有用な試薬並びに方法を提供する。 siNA molecules of the invention, therefore, a variety of therapeutic, diagnostic, target validation, discovery of genomic, provide useful reagents and methods for applications in genetic engineering, and pharmacogenomic.

本発明のsiNAは、例えば経皮投与又は局所注射(例:乾癬治療のための乾癬性プラーク患部における局所注射、又は乾癬性関節炎若しくはRAを患う患者の関節への局所注射)等、いかなる形でも投与することができる。 siNA of the invention, for example, transdermal administration or local injection (e.g. local injection in psoriatic plaques affected part for treatment of psoriasis, or local injection into the patient's joint suffering from psoriatic arthritis or RA) and the like, in any way it can be administered. より詳細な様態では、本発明は、TNF-αのmRNAを標的とし、効果的にTNF-αのRNAを下方制御することでTNF-αと関連する1若しくは2種類以上の炎症状態を低減又は予防するsiNAを治療効果量投与するための製剤及び方法を提供する。 In a more detailed aspect, the present invention, the mRNA of TNF-alpha targeting, effectively reduce the inflammatory condition of one or two or more types associated with TNF-alpha by downregulating RNA of TNF-alpha or the siNA of preventing provides formulations and methods for administering therapeutically effective amount. 選択された疾患状態と関連する原因因子又は寄与因子として発現が異常に増加することが知られている大多数の遺伝子のいずれをも含む、対象動物の選択された疾患状態に関連する1又は2種類以上の異なる遺伝子の発現を標的とする類似の方法及び組成物が提供される。 Expression as a causative factor or contributing factor associated with the selected disease state includes any large number of genes known to be abnormally increased, associated with a selected disease state of the subject animal 1 or 2 the methods and compositions similar targeting is provided the expression of or more different genes.

本発明のsiNA/ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチド混合物は、例えばRA又は乾癬等の炎症疾患に有効な治療薬等、疾患状態を標的とするその他の標準的な治療と組み合わせて投与することができる。 siNA / polynucleotide delivery mixtures of the invention, for example, therapeutic agents effective inflammatory diseases such as RA or psoriasis, a disease state can be administered in combination with other standard treatment that target. この点で、組み合わせとして有用で効果的な薬剤の例としては、非ステロイド系抗炎症薬(NSAID)、メトトレキサート、金化合物、D−ペニシラミン、抗マラリア薬、スルファサラジン、グルココルチコイド、並びにインフリキシマブ及びエントラセプト(entracept)等その他のTNF-α中和剤が挙げられる。 In this regard, examples of useful and effective drug combinations, non-steroidal anti-inflammatory drug (NSAID), methotrexate, gold compounds, D- penicillamine, antimalarials, sulfasalazine, glucocorticoids, and infliximab and Entoraseputo (entracept) like other TNF-alpha neutralizing agents.

本発明の負に帯電したポリヌクレオチド(例:RNA又はDNA)は、医薬組成物を形成する安定剤やバッファ等を含んだ又は含まない状態で、いかなる標準的な方法によっても患者に投与することができる。 Negatively charged polynucleotides of the present invention (Example: RNA or DNA), in a state that does not contain or contains a stabilizer, a buffer, or the like to form a pharmaceutical composition, the administration to the patient by any standard method can. リポソームによる送達メカニズムの使用を所望する場合は、リポソームを形成する標準的なプロトコルに従うことができる。 If it is desired to use a delivery mechanism by liposomes may follow standard protocols for formation of liposomes. 本発明の組成物は、経口投与のために錠剤、カプセル、又はエリキシール剤として、直腸内投与のために坐薬として、注射投与のために無菌溶液又は懸濁液として、及び本技術分野で公知のその他の組成物として製剤し、使用することもできる。 The compositions of the present invention are tablets for oral administration, capsules, or as an elixir, as a suppository for rectal administration, sterile solutions or suspensions for injectable administration, and known in the art formulated as other compositions can also be used.

本発明はさらに、本明細書で述べる組成物の薬理学的に許容される製剤も含む。 The present invention also includes pharmaceutically acceptable formulations of the compositions described herein. このような製剤は、例えば塩酸、臭素酸、酢酸、及びベンゼンスルホン酸の塩といった酸付加塩等の上述の化合物の塩を含む。 Such formulations include, for example, hydrochloric acid, hydrobromic acid, acetic acid, and the salts of the aforementioned compounds, such as hydrochloric acid addition salt such as benzenesulfonic acid.

薬理組成物又は製剤とは、例えば全身投与等、細胞又は例えばヒト等を含む患者に対する投与に適した形の組成物又は製剤のことである。 The pharmacological composition or formulation, e.g. systemic administration or the like, is that the form of compositions or formulations suitable for administration to a patient comprising cells or, for example, a human or the like. 適切な形は、用途、又は例えば経口、経皮、若しくは注射等の進入経路に一部依存する。 Suitable forms, applications, or, for example orally, depends in part on the route of entry transdermal, or injection. そのような形は、組成物又は製剤が標的細胞(すなわち、負に帯電した核酸を送達させたい細胞)へ到達することを妨げてはならない。 Such forms should not prevent the composition or the formulation to reach the target cells (i.e., cells that want to deliver a negatively charged nucleic acid). 例えば、血流中に注入される薬理組成物は溶解性であるべきである。 For example, pharmacological compositions injected into the blood stream should be soluble. 他の要因は本技術分野で公知であり、毒性等の考慮が含まれる。 Other factors are known in the art and include considerations such as toxicity.

「全身投与」とは、インビボでの血流中の薬物の全身吸収又は全身蓄積、及びそれに続く全身への分配を意味する。 By "systemic administration" is meant the distribution of in vivo systemic absorption or systemic drug accumulation in the blood stream, and systemic subsequent. 全身吸収をもたらす投与経路としては、静脈内、皮下、腹腔内、吸入、経口、肺内、及び筋肉内が挙げられるがこれらに限定されない。 Administration routes which lead to systemic absorption, intravenous, subcutaneous, intraperitoneal, inhalation, oral, intrapulmonary, and intramuscular but are not limited thereto. これらの各投与経路により、例えば核酸等の所望の負に帯電したポリマが、到達可能な患部組織へ曝露される。 These each route of administration, the polymer is charged to a desired negative example nucleic acids, etc., they are exposed to accessible diseased tissue. 薬物の循環中への進入速度は、分子量又はサイズに依存することが示されている。 The rate of entry into the circulation of the drug has been shown to be dependent on the molecular weight or size. 本発明の化合物を含むリポソーム又はその他の薬物担体を使用することにより、例えば網状内皮系(RES)の組織等特定の種類の組織内で薬物を局在化することが潜在的に可能である。 The use of liposomes or other drug carrier comprising the compounds of the present invention, for example, it is potentially possible to localize the drug in tissues such as the particular type of tissue of the reticuloendothelial system (RES). 薬物とリンパ球やマクロファージ等の細胞の表面との会合を促進することができるリポソーム製剤も有用である。 Liposome formulation that can facilitate the association of drug with lymphocytes and macrophages, etc. of a cell surface are also useful. この方法によると、マクロファージ及びリンパ球によるガン細胞等の異常細胞に対する免疫認識特異性を利用して、標的細胞への薬物の送達を促進することができる。 According to this method, by utilizing the immune recognition specificity for abnormal cells such as cancer cells by macrophages and lymphocytes, it can facilitate the delivery of the drug to target cells.

「薬理学的に許容される製剤」とは、本発明の核酸分子をその所望する活性にとって最適な体内の場所へ効果的に送達させる組成物又は製剤を意味する。 By "pharmaceutically acceptable formulation" means a composition or formulation of the nucleic acid molecule to an optimal body location to its desired activity is effectively delivered to the present invention. 本発明の核酸分子と製剤するのに適した薬剤の限定されない例としては、CNSへの薬物の進入を促進可能なP−糖タンパク質阻害剤(Pluronic P85等)(Jolliet−Riant及びTillement,Fundam. Clin. Pharmacol. 13: 16−26, 1999)、脳内移植後の持続的放出送達のためのDL−ラクチド−グリコリド共重合ポリマのマイクロスフェア(Emerich,D.F.ら,Cell Transplant 8: 47−58, 1999)(Alkermes, Inc.社、マサチューセッツ州、ケンブリッジ)等の生分解性ポリマ、及び血液脳関門を通して薬物を送達可能で神経細胞の取り込みメカニズムを変性可能なポリブチルシアノアクリレートから作られたもの( Non-limiting examples of agents suitable for nucleic acid molecules and formulations of the present invention, can promote P- glycoprotein inhibitor entry of drugs into the CNS (Pluronic P85, etc.) (Jolliet-Riant and Tillement, Fundam. .. Clin Pharmacol 13:. 16-26, 1999), DL- lactide for sustained release delivery after intracerebral implantation - glycolide copolymer polymer microspheres (Emerich, D.F et, Cell transplant 8: 47 -58, 1999) (Alkermes, Inc., Inc., made from Cambridge, Mass.) biodegradable polymers, and modifiable polybutylcyanoacrylate uptake mechanisms of the drug to be delivered nerve cells through the blood brain barrier, such as thing was ( rog. Neuropsychopharmacol Biol. Psychiatry 23: 941−949, 1999)等の充填されたナノ粒子が含まれる。 rog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry 23:.. 941-949, 1999) include filled nanoparticles or the like. 本発明の核酸分子を送達する方法の他の限定されない例としては、Boadoら,J. As Other non-limiting examples of methods to deliver the nucleic acid molecules of the present invention, Boado et, J. Pharm. Pharm. Sci. Sci. 87: 1308−1315, 1998; Tylerら, FEBS Lett. 87: 1308-1315, 1998; Tyler et al., FEBS Lett. 421: 280−284, 1999; Pardridgeら,PNAS USA 92: 5592−5596, 1995; Boado,Adv. 421: 280-284, 1999; Pardridge et al., PNAS USA 92: 5592-5596, 1995; Boado, Adv. Drug Delivery Rev. Drug Delivery Rev. 15: 73−107, 1995; Aldrian−Herradaら,Nucleic Acids Res. 15: 73-107, 1995; Aldrian-Herrada, et al., Nucleic Acids Res. 26: 4910−4916, 1998;及びTylerら,PNAS USA. 26: 4910-4916, 1998; and Tyler et al., PNAS USA. 96: 7053−7058, 1999、に記載される材料が挙げられる。 96: 7053-7058, 1999, the material can be cited as described.

本開示はさらに、薬理学的に許容される担体又は希釈剤中に薬理学的に効果的な量の所望の化合物を含む、保存又は投与のために調製された組成物を含む。 The present disclosure further in a pharmacologically acceptable carrier or diluent containing the desired compound of pharmacologically effective amounts, including compositions prepared for storage or administration. 治療用途に許容可能な担体又は希釈剤は薬理分野で公知であり、例えば、A. Acceptable carriers or diluents for therapeutic use are well known in pharmacology art, for example, A. R. R. Gennaro編集、「Remington's Pharmaceutical Sciences」、Mack Publishing Co. Gennaro editing, "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co. 社、1985年、に記載されており、これは参照することで本明細書に組み入れられる。 Company, 1985, are described in, which is incorporated herein by reference. 例えば、保存剤、安定剤、染料、及び香味料を挙げることができる。 For example, preservatives, stabilizers, dyes, and flavors. これらには、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、及びp−ヒドロキシ安息香酸のエステルが含まれる。 These include sodium benzoate, sorbic acid and esters of p- hydroxybenzoic acid. さらに、抗酸化剤及び懸濁剤を用いることもできる。 It is also possible to use antioxidants and suspending agents.

薬理学的に効果的な投与量は、疾患状態を予防し、その発生を抑制し、又はそれを治療する(症状を、好ましくはすべての症状を、ある程度軽減する)のに必要な投与量である。 Pharmacologically effective dose, to prevent a disease state, to suppress the occurrence or treat (symptoms, preferably all the symptoms to some extent to reduce) it Dosages necessary is there. 薬理学的に効果的な投与量は、疾患の種類、用いた組成物、投与経路、治療される哺乳類の種類、想定する特定の哺乳類の身体的特性、同時に行われている薬物療法、及び医療分野の当業者が認識するその他の要因に依存する。 Pharmacologically effective dose depends on the type of disease, the composition used, the route of administration, the type of mammal being treated, the physical characteristics of the specific mammal assumed, medication being performed simultaneously, and medical one of ordinary skill in the art is dependent on other factors recognized. 一般的に、負に帯電したポリマの効力に応じて、一日あたり、体重に対して0.1mg/kg乃至100mg/kgの量の活性成分が投与される。 In general, depending on the potency of the negatively charged polymer, per day, the amount of active ingredient of 0.1 mg / kg to 100 mg / kg is administered to the body weight.

本開示の送達促進ポリペプチド/siNA抱合体及びその製剤は、従来の無害な薬理学的に許容可能な担体、アジュバント、及び/又は媒体を含む投与単位の製剤で、経口的に、局所的に、非経口的に、呼吸若しくはスプレーにより、又は経直腸的に投与することができる。 Delivery-enhancing polypeptide / siNA conjugates and formulations of the present disclosure, conventional nontoxic pharmacologically acceptable carrier, in the formulation of dosage units which comprise adjuvants, and / or the medium, orally, topically , parenterally, by breathing or spray, or may be administered rectally. 本明細書で用いる非経口的とは、経皮、皮下、血管(例:静脈)内、筋肉内、若しくはくも膜下腔内注射、又は注入技術等を含む。 And parenteral, as used herein, transdermal, subcutaneous, vascular: including (eg intravenous), intramuscular, or intrathecal injection or infusion techniques and the like. さらに、本発明の核酸分子及び薬理学的に許容される担体を含む医薬組成物も提供される。 Further, a pharmaceutical composition comprising a nucleic acid molecule and a pharmaceutically acceptable carrier of the present invention are also provided. 1若しくは2種類以上の本発明の核酸分子は、1若しくは2種類以上無害の薬理学的に許容される担体及び/又は希釈剤及び/又はアジュバント、並びに必要に応じてその他の活性成分と共存することができる。 The nucleic acid molecule of one or two or more kinds of the present invention, coexists with one or two or more non-toxic pharmaceutically acceptable carriers and / or diluents and / or adjuvants, and other active ingredients as required be able to. 本発明の核酸分子を含む医薬組成物は、例えば錠剤、トローチ、ロゼンジ、水性若しくは油性懸濁液、分散性粉末若しくは顆粒、エマルジョン、硬カプセル若しくは軟カプセル、又はシロップ若しくはエリキシール剤等の経口投与に適した形とすることができる。 Pharmaceutical composition comprising a nucleic acid molecule of the present invention may be in the form of tablets, troches, lozenges, aqueous or oily suspensions, dispersible powders or granules, emulsions, hard or soft capsules, or syrups or oral administration of elixirs, etc. It may be suitable shape.

経口投与を意図した組成物は、医薬組成物製造の技術分野で公知のいかなる方法によっても調製することができ、そのような組成物は、1若しくは2種類以上の甘味料、香味料、着色料、又は保存料を含有することで薬理学的に上品で飲みやすい製剤を提供することができる。 Compositions intended for oral administration, can also be prepared by any method known in the art of pharmaceutical composition preparation, such compositions, one or two or more sweeteners, flavoring, coloring , or it is possible to provide a palatable preparation pharmacologically elegant in that it contains a preservative. 錠剤は、錠剤の製造に適した無害で薬理学的に許容される賦形剤との混合物の形で活性物質を含む。 Tablets contain the active materials in admixture with nontoxic pharmacologically acceptable excipients which are suitable for the manufacture of tablets. このような賦形剤は、例えば炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム、又はリン酸ナトリウム等の不活性希釈剤、例えばコーンスターチ又はアルギン酸等の造粒剤及び崩壊剤、例えばデンプン、ゼラチン、又はアカシア等の結合剤、並びに例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、又はタルク等の潤滑剤であってよい。 Such excipients are, for example, calcium carbonate, sodium carbonate, lactose, calcium phosphate, or inert diluents, such as sodium phosphate, for example, corn starch or granulating and disintegrating agents, alginic acid, for example, starch, gelatin, or acacia binding agents etc., as well as magnesium stearate, stearic acid, or lubricants such as talc. 錠剤は被覆されていなくても、公知の技術によって被覆されていてもよい。 The tablets are not covered, it may be coated by known techniques. 公知の技術によってそのような被覆を施し、胃腸管内での崩壊と吸収を遅延させることでより長い期間にわたって活性を持続させる場合もある。 Subjected to such a coating by known techniques, in some cases prolong the activity over a longer period of time than by delaying the disintegration and absorption in the gastrointestinal tract. 例えばモノステアリン酸グリセリン又はジステアリン酸グリセリン等の遅延剤を用いることができる。 For example it is possible to use the retarder, such as glyceryl monostearate or glyceryl distearate.

経口投与のための製剤は、硬ゼラチンカプセルとして提供することもでき、この場合活性成分は、例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、若しくはカオリン等の不活性固体希釈剤と混合され、又は軟ゼラチンカプセルとして提供することもでき、この場合活性成分は、水又は例えばピーナッツ油、液体パラフィン、若しくはオリーブ油等の油性媒体と混合される。 Formulations for oral administration may also be presented as hard gelatin capsules, in which case the active ingredients are, for example calcium carbonate, calcium phosphate, or with an inert solid diluent such as kaolin, or as soft gelatin capsules can also, the active ingredient in this case, water or, for example peanut oil, liquid paraffin, or is mixed with an oil medium such as olive.

水性懸濁液は、水性懸濁液を製造するのに適した賦形剤との混合物として活性物質を含有する。 Aqueous suspensions contain the active materials in admixture with excipients suitable for the manufacture of aqueous suspensions. そのような賦形剤としては、例えばカルボキシメチルセルロースのナトリウム塩、メチルセルロース、ヒドロプロピル−メチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガントガム、及びアカシアガム等の懸濁剤であり、分散剤又は湿潤剤は例えばレシチン等の天然のホスファチド、例えばポリオキシエチレンステアレート等のアルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物、例えばヘプタデカエチレンオキシセタノール等のエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート等のエチレンオキシドと脂肪酸及びヘキシトールから誘導される部分エステルとの縮合生成物、又は例えばポリエチレンソルビタンモノオレエート等のエチレンオキシドと脂肪酸及び無 Such excipients such as sodium carboxymethylcellulose, methylcellulose, hydropropyl - methylcellulose, sodium alginate, polyvinylpyrrolidone, gum tragacanth, and a suspension of acacia gum and the like, dispersing agents or wetting agents, for example lecithin naturally-occurring phosphatide etc., for example, condensation products of an alkylene oxide with fatty acids such as polyoxyethylene stearate, for example polyoxyethylene stearate, etc. condensation products of ethylene oxide with long chain aliphatic alcohols, polyoxyethylene sorbitol mono condensation products of ethylene oxide with partial esters derived from ethylene oxide and a fatty acid and a hexitol such as oleate, or for example, such as polyethylene sorbitan monooleate ethylene oxide with fatty acids and free ヘキシトールから誘導される部分エステルとの縮合生成物であってよい。 Or condensation products of ethylene oxide with partial esters derived from hexitol. 水性懸濁液は、例えばp−ヒドロキシ安息香酸のエチル若しくはn−プロピルエステル等の1又は2種類以上の保存剤、1又は2種類以上の着色剤、1又は2種類以上の香味料、及びスクロース若しくはサッカリン等の1又は2種類以上の甘味料をさらに含んでよい。 Aqueous suspensions, for example, p- ethyl hydroxybenzoate or n- propyl 1 or 2 or more preservatives such as esters, 1 or 2 or more coloring agents, one or two or more flavors, and sucrose or it may further comprise one or two or more sweeteners, such as saccharin.

油性懸濁液は、例えば落花生油、オリーブ油、ゴマ油、若しくはココナッツ油等の植物性油、又は液状パラフィン等の鉱油中に活性成分を懸濁させることで調製することができる。 Oily suspensions may be prepared, for example arachis oil, olive oil, sesame oil, or coconut oil, etc. Vegetable oils, or in mineral oil liquid paraffin by suspending the active ingredient in. 油性懸濁液は、例えば蜜蝋、固形パラフィン、又はセチルアルコール等の増粘剤を含んでもよい。 The oily suspensions, for example beeswax, may include solid paraffin, or a thickening agent, such as cetyl alcohol. 飲みやすい経口製剤を提供するために甘味料及び香味料を加えてもよい。 It may be added sweetening and flavoring in order to provide a palatable oral preparation. このような組成物は、アスコルビン酸等の抗酸化剤を加えることで保存することができる。 Such compositions may be preserved by the addition of antioxidants such as ascorbic acid.

水の添加によって水性懸濁液を調製するのに適した分散性粉末及び顆粒により、活性成分は、分散剤又は湿潤剤と、懸濁剤と、1又は2種類以上の保存料との混合物として提供される。 Dispersible powders and granules suitable for preparation of an aqueous suspension by the addition of water, the active ingredient, a dispersing or wetting agent, a suspending agent, as a mixture with one or more types of preservatives It is provided. 適切な分散剤若しくは湿潤剤又は懸濁剤の例としては上述のものが挙げられる。 Examples of suitable dispersing or wetting agents or suspending agents include those described above. 例えば甘味料、香味料、及び着色料等の追加的な賦形剤も存在してよい。 For example sweetening, flavoring, and may also be present additional excipients colorants, and the like.

本発明の医薬組成物は、水中油型エマルジョンの形をとることもできる。 The pharmaceutical compositions of the invention may also be in the form of oil-in-water emulsions. 油相は、植物油、鉱油、又はこれらの混合物であってよい。 The oily phase may be a vegetable oil, mineral oil, or mixtures thereof. 適切な乳化剤としては、例えばアカシアガム又はトラガントガム等の天然ガム、例えば大豆、レシチン等の天然ホスファチド、並びに、例えばソルビタンモノオレエート等の脂肪酸と無水ヘキシトールとから誘導されるエステル又は部分エステル、及び例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート等の前述の部分エステルとエチレンオキシドとの縮合生成物であってよい。 Suitable emulsifying agents, for example gum acacia or gum tragacanth such as natural gums, such as soy, natural lecithin phosphatide, as well, for example, esters or partial esters derived from fatty acids and hexitol anhydrides such as sorbitan monooleate, and for example, it may be a condensation product of the aforementioned partial esters with ethylene oxide such as polyoxyethylene sorbitan monooleate. また、エマルジョンは甘味料及び香味料を含んでいてもよい。 Further, the emulsion may also contain sweetening and flavoring.

シロップ及びエリキシール剤は、グリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、グルコース、又はスクロース等の甘味料を用いて製剤することができる。 Syrups and elixirs are glycerol, propylene glycol, sorbitol, may be formulated with glucose, or a sweetener such as sucrose. そのような製剤は、さらに粘滑剤、保存料、香味料、及び着色料を含むことができる。 Such formulations may further comprise a demulcent, preservative, flavoring and coloring agents. 医薬組成物は、無菌注射用水性又は油性懸濁液の形をとることができる。 The pharmaceutical compositions may take the form of a sterile injectable aqueous or oleaginous suspension. この懸濁液は、上述の適切な分散剤又は湿潤剤、及び懸濁剤を用いて既知の技術に従って調製することができる。 This suspension can be prepared according to the known art using suitable dispersing or wetting agents described above, and a suspending agent. 無菌注射用製剤は、例えば1,3−ブタノール溶液等非経口的に許容される無害な希釈剤若しくは溶媒中の無菌注射用溶液又は懸濁液であってもよい。 The sterile injectable preparation, for example, 1,3-butanediol solution and the like may also be a sterile injectable solution or suspension in a parenterally acceptable innocuous diluent or solvent is. 使用することができる許容可能な媒体及び溶媒としては、水、リンゲル液、及び等張性の塩化ナトリウム溶液が挙げられる。 Among the acceptable vehicles and solvents that may be employed are water, Ringer's solution, and isotonic sodium chloride solution. さらに、無菌固定油は、溶媒又は懸濁媒体として従来から使用されている。 In addition, sterile, fixed oils are conventionally employed as a solvent or suspending medium. 上記目的のためには、合成モノグリセリド又はジグリセリドを含むいかなる無刺激の固定油も使用することができる。 For the above purpose, fixed oils of any bland including synthetic mono- or diglycerides can also be used. さらに、オレイン酸等の脂肪酸も注射液の調製に有用である。 In addition, fatty acids such as oleic acid find use in the preparation of injectables.

本開示で述べる送達促進ポリペプチド/siNA抱合体は、例えば薬物の直腸内投与等のために坐薬の形で投与することもできる。 Delivery-enhancing polypeptide / siNA conjugates described in this disclosure can also be administered in the form of suppositories for example rectal administration, etc. of the drug. このような組成物は、薬物を、常温で固体だが直腸内温度では液体となるため直腸内で融解して薬物を放出する適切な非刺激性賦形剤と混合することによって調製することができる。 Such compositions, drug, can but solid at room temperature be prepared by mixing with a suitable non-irritating excipient which release the drug will melt in the rectum to become liquid at rectal temperature . そのような物質としては、ココアバター及びポリエチレングリコールが挙げられる。 Such materials include cocoa butter and polyethylene glycols.

本開示で述べる送達促進ポリペプチド/siNA抱合体は、無菌媒体中で、非経口的に投与することができる。 Delivery-enhancing polypeptide / siNA conjugates described in the present disclosure, in a sterile medium, can be administered parenterally. 用いる媒体及び濃度によるが、薬物は媒体中に懸濁又は溶解することができる。 According to the vehicle and concentration used, but the drug can either be suspended or dissolved in the vehicle. 有益なことに、局部麻酔薬、保存料、及びバッファ等のアジュバントを媒体中に溶解することができる。 Advantageously, a local anesthetic, can be dissolved preservatives, and adjuvants such as a buffer in the medium.

体重1kgあたり約0.1mg乃至約140mgのオーダーの1日あたりの投与レベルが上述の状態の治療に有用である(患者一人に対して一日あたり約0.5mg乃至約7g)。 Dosage level per day on the order of about per body weight 1 kg 0.1 mg to about 140mg are useful in the treatment of the above conditions (about 0.5mg to about 7g per day for one patient). 単一投与分を作製するのに担体物質と混合することができる活性成分の量は、治療されるホスト及び個々の投与方法によって様々である。 The amount of active ingredient that may be combined with a carrier material to produce a single dosage amount will vary by the host and the particular mode of administration being treated. 単位投与分は、一般に約1mg乃至約500mgの活性成分を含有する。 The unit dosage amount will contain the active ingredient generally from about 1mg to about 500 mg.

個々の患者に対する具体的な投与レベルは、用いた具体的化合物の活性、年齢、体重、一般的健康状態、性別、食事習慣、投与時間、投与経路及び排泄速度、薬物の組み合わせ、並びに特定の治療中の疾患の重症度を含む様々な要因に依存することが理解される。 Specific dosage levels for the individual patient, the activity of the specific compound employed, the age, body weight, general health, sex, diet habit, administration time, administration route and rate of excretion, as well as specific treatment it is understood that depending on various factors including the severity of the disease in.

ヒト以外の動物への投与に関しては、組成物を飼料や飲料水に添加することもできる。 For administration to animals other than humans, it can also be added to the composition to the feed or drinking water. 動物が飼料と共に治療上適切な量の組成物を摂取するので、動物飼料組成物及び飲料水組成物を製剤することは有用であろう。 Since animals ingest a therapeutically appropriate quantity of the composition along with its diet, it is formulated animal feed compositions and drinking water compositions may be useful. 組成物を試料や飲料水に添加するための混合剤の形にすることも有用であろう。 It may also be useful that the composition in the form of admixture to be added to the sample and drinking water.

送達促進ポリペプチド/siNA抱合体は、他の治療化合物と組み合わせて患者に投与することによって、全体の治療効果を向上させることができる。 Delivery-enhancing polypeptide / siNA conjugate, by administering to a patient in combination with other therapeutic compounds, thereby improving the overall therapeutic effect. 適応症の治療に複数の化合物を使用することにより、副作用を低減すると同時に有益な効果を高めることができる。 The use of multiple compounds to indications treatment, can be enhanced simultaneously beneficial effects when reducing the side effects.

一つの様態では、本発明の組成物は、送達促進ポリペプチド/siNA抱合体を肝細胞等の特定の細胞へ投与するのに適している。 In one aspect, the compositions of the present invention, the delivery-enhancing polypeptide / siNA conjugates are suitable for administration to specific cells, such as hepatocytes. 例えば、アシアロ糖タンパク質受容体(ASGPr)は肝細胞に特有のもので、アシアロオロソムコイド(ASOR)等の分岐鎖ガラクトース末端糖タンパク質に結合する。 For example, the asialoglycoprotein receptor (ASGPr) is unique to hepatocytes and binds to branched galactose-terminal glycoproteins, such as asialoorosomucoid (ASOR). siNAは、例えば2'−アミノ、2'−C−アリル、2'−フルオロ、2'−O−メチル、2'−H等のヌクレアーゼ耐性を持つ基によって様々に修飾することによって安定性を向上することができる(レビューは、Usman及びCedergren,TIBS 17 :34, 1992; Usmanら,Nucleic Acids Symp. Ser. 31: 163, 1994を参照)。 siNA can be, for example 2'-amino, 2'-C-allyl, 2'-fluoro, 2'-O-methyl, improve stability by various modified by a group having a nuclease resistance of such 2'-H can be (review, Usman and Cedergren, TIBS 17:;: see 163, 1994 34, 1992 Usman et al, Nucleic Acids Symp Ser 31..). siNA構築物は、一般的な方法を用いたゲル電気泳動又は高圧液体クロマトグラフィーによって精製し、水中に再懸濁することができる。 siNA constructs, were purified by gel electrophoresis or high pressure liquid chromatography using a general method may be resuspended in water.

修飾(塩基、糖、及び/又はリン酸)された核酸分子を化学合成することにより、血清リボヌクレアーゼによる分解を防ぎ、その効力を高めることができる。 Modifications (base, sugar, and / or phosphoric acid) nucleic acid molecule by chemical synthesis, prevents degradation by serum ribonucleases, it can enhance its efficacy. 例えば、Ecksteinら、国際公開公報WO92/07065; Perraultら,Nature 344: 565, 1990; Piekenら,Science 253: 314, 1991; Usman及びCedergren,Trends in Biochem. For example, Eckstein et al., International Patent Publication WO92 / 07065; Perrault et al., Nature 344: 565, 1990; Pieken et al., Science 253: 314, 1991; Usman and Cedergren, Trends in Biochem. Sci. Sci. 17: 334, 1992; Usmanら、国際公開公報WO93/15187;及びRossiら、国際公開公報WO91/03162; Sproat、米国特許公報第5334711号; Goldら、米国特許公報第6300074号を参照のこと。 17: 334, 1992; Usman et al, International Publication WO93 / 15187; and Rossi et al., International Patent Publication WO91 / 03162; Sproat, U.S. Pat. No. 5334711; Gold et al., A reference in U.S. Patent No. 6,300,074. 上述の文献にはすべて、本明細書で述べる核酸分子の塩基、リン酸、及び/又は糖部分に施すことが可能な種々の化学修飾が記載されている。 All of the above documents, the nucleic acid molecules described herein bases, phosphoric acid, and / or various chemical modifications that can be made to the sugar moiety have been described.

本技術分野では、核酸分子に導入してそのヌクレアーゼに対する安定性及び有効性を著しく高める、糖、塩基、及びリン酸の修飾に関する例がいくつか存在する。 In this art, by introducing the nucleic acid molecule significantly increase the stability and efficacy for their nuclease, sugar, base, and examples there are several related modified phosphate. 例えば、オリゴヌクレオチドは、例えば2'−アミノ、2'−C−アリル、2'−フルオロ、2'−O−メチル、2'−O−アリル、2'−H等のヌクレアーゼ耐性を持つ基によるヌクレオチド塩基修飾によって、安定性及び/又は生物活性が高められる。 For example, by oligonucleotide can be, for example 2'-amino, 2'-C-allyl, 2'-fluoro, 2'-O-methyl, 2'-O-allyl, group having nuclease resistance of such 2'-H the nucleotide base modifications, stability and / or biological activity is enhanced. 総説については、Usman及びCedergren,TIBS 17 :34, 1992; Usmanら,Nucleic Acids Symp. For a review, Usman and Cedergren, TIBS 17: 34, 1992; Usman et al., Nucleic Acids Symp. Ser. Ser. 31: 163, 1994; Burginら,Biochemistry 35: 14090, 1996を参照のこと。 31: 163, 1994; Burgin et al., Biochemistry 35: 14090, 1996 reference. 核酸分子の糖修飾は、本技術分野において幅広く記述されたものがある。 Sugar modification of nucleic acid molecules are those that are broadly described in the art. Ecksteinら、国際公開公報WO92/07065; Perraultら,Nature 344: 565−568, 1990; Piekenら,Science 253: 314−317, 1991; Usman及びCedergren,Trends in Biochem. Eckstein et al., International Patent Publication WO92 / 07065; Perrault et al., Nature 344: 565-568, 1990; Pieken et al., Science 253: 314-317, 1991; Usman and Cedergren, Trends in Biochem. Sci. Sci. 17: 334−339, 1992; Usmanら、国際公開公報WO93/15187; Sproat、米国特許公報第5334711号; Beigelmanら,J. 17: 334-339, 1992; Usman et al, International Publication WO93 / 15187; Sproat, U.S. Pat. No. 5,334,711; Beigelman et al., J. Biol. Biol. Chem. Chem. 270: 25702: 1995; Beigelmanら、国際公開公報WO97/26270; Beigelmanら、米国特許公報第5716824号; Usmanら、米国特許公報第5627053号; Woolfら、国際公開公報WO98/13526; Thompsonら,Karpeiskyら,Tetrahedron Lett. 270: 25702: 1995; Beigelman et al, International Publication WO97 / 26270; Beigelman et al., U.S. Pat. No. 5,716,824; Usman et al., U.S. Pat. No. 5,627,053; Woolf et al., International Publication WO98 / 13526; Thompson et al, Karpeisky et al., Tetrahedron Lett. 39: 1131, 1998; Earnshaw及びGait,Biopolymers(Nucleic Acid Sciences) 48: 39−55, 1998; Verma及びEckstein,Annu. 39: 1131, 1998; Earnshaw and Gait, Biopolymers (Nucleic Acid Sciences) 48: 39-55, 1998; Verma and Eckstein, Annu. Rev. Rev. Biochem. Biochem. 67: 99−134, 1998;及びBurlinaら,Bioorg. 67: 99-134, 1998; and Burlina et al, Bioorg. Med. Med. Chem. Chem. 5: 1999−2010, 1997を参照のこと。 5: 1999-2010, see 1997. このような刊行物には、触媒作用を変えることなく核酸分子へ挿入された糖、塩基、及び/又はリン酸修飾等の部位を特定するための一般的な方法及び方策が記載されている。 Such publication, sugars inserted into without nucleic acid molecules altering the catalytic base, and / or general methods and strategies for identifying sites such as phosphate modifications are described. このような教示を参考にして、siNAの細胞内でRNAiを促進する能力が著しく阻害されない限りにおいて、本明細書に述べるように類似の修飾を本発明のsiNA核酸分子に施すことができる。 Such taught in the reference, to the extent that their ability to promote RNAi in cells of the siNA is not significantly inhibited, similar modifications as described herein can be applied to siNA nucleic acid molecules of the present invention.

ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、及び/又は5'−メチルホスホネート結合によるオリゴヌクレオチドのヌクレオチド間結合の化学修飾は安定性を向上させるが、過剰な修飾は幾分かの毒性の付与又は活性の低下を引き起こす場合がある。 Phosphorothioate, phosphorodithioate, and / or 5'-methylphosphonate linkages chemically modified linkages of the oligonucleotide by improves the stability, but the lowering of excessive modifications somewhat grant or activity of Kano toxicity there is a cause. 従って、核酸分子を設計する場合は、これらのヌクレオチド間の結合の量は最低限に抑えるべきである。 Therefore, when designing nucleic acid molecules, the amount of coupling between these nucleotides should be kept to a minimum. これらの結合の濃度を低下させることによって毒性が下がり、有効性が向上する結果となるはずである。 Toxicity is lowered by lowering the concentration of these linkages should efficacy results improved. Wu,J. Wu, J. Biol. Biol. Chem. Chem. 262: 4429−4432, 1987。 262: 4429-4432, 1987. このような糖タンパク質又は合成複合糖質と受容体との結合は、オリゴ糖鎖の分岐度に大きく依存する親和性に従って発生し、例えば三分岐構造(triatennary)は、二分岐(biatenarry)又は一分岐鎖(monoatennary chain)と比べてより高い親和性をもって結合する。 Binding of such a glycoprotein or synthetic glycoconjugate and receptors occurs in accordance with an affinity that depends largely on the degree of branching of the oligosaccharide chain, for example, a three-branched structure (triatennary) is bifurcated (biatenarry) or one compared with branched chain (monoatennary chain) binds with higher affinity. Baenziger及びFiete,Cell 22: 611−620, 1980、及びConnollyら,J. Baenziger and Fiete, Cell 22: 611-620, 1980, and Connolly et al., J. Biol. Biol. Chem. Chem. 257: 939−945, 1982。 257: 939-945, 1982. Lee及びLeeは、炭水化物部位として、ガラクトースに比べて受容体への親和性が高いN−アシル−D−ガラクトサミンを用いて、このような高い特異性を得た。 Lee and Lee, as the carbohydrate moiety, with high affinity to the receptor compared to galactose N- acyl -D- galactosamine, give such a high specificity. Glycoconjugate J. Glycoconjugate J. 4: 317−328, 1987。 4: 317-328, 1987. この「クラスター効果(clustering effect)」は、マンノシル末端糖タンパク質又は複合糖質の結合及び取り込みに対しても記載されている。 The "cluster effect (clustering effect)" are also described for the binding and uptake of mannosyl-terminating glycoproteins or glycoconjugates. Ponpipomら,J. Ponpipom et al., J. Med. Med. Chem. Chem. 24: 1388−1395, 1981。 24: 1388-1395, 1981. ガラクトース及びガラクトサミンとヌクレオチドの抱合体(galactosamine nucleotided conjugate)を使用して外来性の化合物を細胞膜を超えて輸送することにより、HBV感染又は肝細胞ガン等の肝臓疾患を治療するための標的送達法を提供することができる。 By using conjugates of galactose and galactosamine and nucleotides (galactosamine nucleotided conjugate) to transport exogenous compounds across cell membranes, a targeted delivery method for treating liver disease such as HBV infection or hepatocellular carcinoma it is possible to provide. 生体抱合体(bioconjugate)を使用することにより、治療に必要な治療用化合物の必要投与量を減らすこともできる。 By using biological conjugate (Bioconjugate), it is also possible to reduce the dosage requirements of therapeutic compounds required for treatment. さらに、治療的生体利用度、薬物動態、及び薬物速度パラメータを、本発明の核酸生体抱合体を用いることで調節することができる。 Furthermore, therapeutic bioavailability, pharmacokinetics, and pharmacokinetic parameters can be modulated by using the nucleic acid biological conjugate of the present invention. これらの分子のより高い特異性。 Higher specificity of these molecules.

一つの様態では、本発明はリン酸エステルバックボーンが修飾されたsiNA分子を特徴とし、その修飾には、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、モルホリノ、アミデートカルバメート、カルボキシメチル、アセトアミデート、ポリアミド、スルホネート、スルホンアミド、スルファメート、ホルムアセタール、チオホルムアセタール、及び/又はアルキルシリルによる1若しくは2種類以上の置換が含まれる。 In one aspect, the invention features siNA molecules that phosphoric acid ester backbone is modified, the modification thereof, phosphorothioate, phosphorodithioate, methyl phosphonate, phosphotriester, morpholino, amidate carbamate, carboxymethyl, acetamidate, polyamide, sulfonate, sulfonamide, include sulfamate, formacetal, thioformacetal, and / or one or two or more kinds of substitution with alkyl silyl. オリゴヌクレオチドバックボーンの修飾に関するレビューは、Hunziker及びLeumann著、「Nucleic Acid Analogues: Synthesis and Properties, in Modern Synthetic Methods」、VCH、p. Reviews related to the modification of the oligonucleotide backbone, Hunziker and Leumann al., "Nucleic Acid Analogues: Synthesis and Properties, in Modern Synthetic Methods", VCH, p. 331−417、1995年、及びMesmaekerら著、「Novel Backbone Replacements for Oligonucleotides, in Carbohydrate Modifications in Antisense Research」、ACS、p. 331-417, 1995, and Mesmaeker et al., "Novel Backbone Replacements for Oligonucleotides, in Carbohydrate Modifications in Antisense Research", ACS, p. 24−39、1994年を参照のこと。 24 - 39, a reference to it in 1994.

核酸分子を送達する方法は、核酸分子を送達する方法は、例えばAkhtarら,Trends Cell Bio. Method of delivering a nucleic acid molecule, a method of delivering a nucleic acid molecule, for example Akhtar et al, Trends Cell Bio. 2: 139, 1992; Akhtar編、「Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics」、1995年; Maurerら,Mol. 2: 139, 1992; Akhtar, ed., "Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics", 1995; Maurer et al., Mol. Membr. Membr. Biol. Biol. 16: 129−140, 1999; Hofland及びHuang,Handb. 16: 129-140, 1999; Hofland and Huang, Handb. Exp. Exp. Pharmacol. Pharmacol. 137: 165−192, 1999; 及びLeeら,ACS Symp. 137: 165-192, 1999; and Lee et al., ACS Symp. Ser. Ser. 752: 184−192, 2000に記載されている。 752: 184-192, have been described in 2000. Beigelmanら、米国特許公報第6395713号及びSullivanら、国際公開公報WO94/02595にはさらに、核酸分子の送達の一般的方法が記載されている。 Beigelman et al., U.S. Pat. No. 6395713 and Sullivan et al., Further in International Publication WO94 / 94/02595, the general method of delivery of nucleic acid molecules have been described. これらのプロトコルは、実質的にいかなる核酸分子の送達に対しても利用することができる。 These protocols may also be utilized for the delivery of virtually any nucleic acid molecule. 核酸分子は、当業者に公知の様々な方法によって細胞へ投与することができ、その方法にはリポソーム内への封入、イオントフォレーシス、生分解性ポリマ、ハイドロゲル、シクロデキストリン(例えば、Gonzalezら,Bioconjugate Chem. 10: 1068−1074, 1999; Wangら、国際公開公報WO03/47518及び同WO03/46185参照)、乳酸−グリコール酸共重合ポリマ(PLGA)及びPLCAマイクロスフェア(米国特許公報第6447796号及び米国特許公開公報US2002/130430参照)、生分解性ナノカプセル、並びに生体接着性マイクロスフェア等のその他の媒体への取り込み、又はタンパク質性ベクタによる取り込み(O'Hare及びNormand、国 The nucleic acid molecule can be administered by a variety of methods known to those skilled in the cells, encapsulation in that the method in liposomes, iontophoresis, biodegradable polymers, hydrogels, cyclodextrins (e.g., Gonzalez . et al, Bioconjugate Chem 10: 1068-1074, 1999; Wang et al., see International Publication WO03 / 47,518 and the WO03 / 46185), lactic acid - glycolic acid copolymer polymer (PLGA) and PLCA microspheres (U.S. Patent No. 6,447,796 Patent and patent reference Publication US2002 / one hundred thirty thousand four hundred thirty USA), biodegradable nanocapsules, and incorporation into other media, such as a bioadhesive microspheres, or proteinaceous vectors by uptake (O'Hare and Normand, country 公開公報WO00/53722参照)が含まれるがこれらに限定されない。 But are referenced publication WO00 / 53722) it is not limited thereto. 代替的に、核酸/媒体の組み合わせは、直接注射又は輸液ポンプの使用によって局所的に送達される。 Alternatively, the nucleic acid / vehicle combination is locally delivered by direct injection or by use of an infusion pump. 本発明の核酸分子の直接注射は、皮下注射、筋肉内注射、若しくは皮内注射を問わず、標準的な針とシリンジによる方法、又は、Conryら,Clin. Direct injection of the nucleic acid molecules of the present invention, subcutaneous injection, intramuscular injection, or both intradermal injection, the method according to the standard needle and syringe, or, Conry et al, Clin. Cancer Res. Cancer Res. 5: 2330−2337, 1999、及びBarryら、国際公開公報WO99/31262に記載のような無針技術を用いて行うことができる。 5: 2330-2337 can be performed using 1999, and Barry et al., The needle-free technologies such as those described in International Publication WO99 / ​​31 262. 本発明の分子は医薬品として使用することができる。 Molecules of the present invention can be used as a medicament. 医薬品は、対象の疾患状態について、その発生を予防若しくは調節したり、又はこれを治療(症状を、好ましくはすべての症状を、ある程度軽減)したりする。 Drugs for the disease state of the subject, or to prevent or modulate the occurrence, or treat it (the symptoms, preferably all the symptoms, to some extent reduce) and or.

「リガンド」という用語は、受容体等の別の化合物と直接的に若しくは間接的に相互作用を起こすことができる、薬物、ペプチド、ホルモン、若しくは神経伝達物質等のいかなる化合物又は分子も意味する。 The term "ligand" can occur directly or indirectly interacting with another compound of the receptor such as a drug, peptide, hormone, or any compound or molecule neurotransmitter like means. リガンドと相互作用を起こす受容体は、細胞表面に存在してもよく、又は細胞内受容体でもよい。 Receptor to cause an interaction with a ligand can be present on a cell surface or intracellular receptors. リガンドの受容体との相互作用は、生化学的反応であってよく、又は単に物理的相互作用若しくは会合であってもよい。 Interaction with the receptor ligand can be a biochemical reaction, or may simply be a physical interaction or association.

本明細書で用いる「非対称ヘアピン」とは、アンチセンス領域と、ヌクレオチド又は非ヌクレオチドを含むことができるループ部と、アンチセンス領域と塩基対を作ってループ付き二重鎖を形成するのに十分な相補的ヌクレオチドを有する限りにおいてアンチセンス領域よりも少ないヌクレオチドを含むセンス領域と、を含む直鎖siNA分子を意味する。 By "asymmetric hairpin" as used herein, sufficient and antisense region, a loop portion that can comprise nucleotides or non-nucleotide, to form a duplex with loop making antisense region and base pair a sense region comprising a less nucleotides than the antisense region to the extent that with the Do complementary nucleotides, refers to a linear siNA molecule comprising a. 例えば、本発明の非対称ヘアピンsiNA分子は、T−細胞内でRNAiを媒介するのに十分な長さ(例:約19乃至約22(例:約19、20、21、又は22)ヌクレオチド)を有するアンチセンス領域と、約4乃至約8(例:約4、5、6、7、又は8)ヌクレオチドを有するループ部と、約3乃至約18(例:約3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、又は18)ヌクレオチドを有しアンチセンス領域と相補的なセンス領域と、を含むことができる。 For example, an asymmetric hairpin siNA molecule of the invention, a length sufficient to mediate RNAi in a T- cells (e.g. about 19, 20, 21, or 22) nucleotides: about 19 to about 22 (Example) and an antisense region having about 4 to about 8 (e.g. about 4, 5, 6, 7, or 8) and a loop portion having a nucleotide, from about 3 to about 18 (e.g. about 3, 4, 5, 6, 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17, or 18) and complementary to the sense region and the antisense region comprises a nucleotide can include. 非対称ヘアピンsiNA分子はさらに、化学修飾が可能な5'末端リン酸基を含むこともできる。 Asymmetric hairpin siNA molecule may further be chemically modified with 5 'terminal phosphate group that can be. 非対称ヘアピンsiNA分子のループ部は、本明細書で述べるように、ヌクレオチド、非ヌクレオチド、リンカ分子、又は抱合体分子を含むことができる。 Loop portion of the asymmetric hairpin siNA molecule as described herein, a nucleotide, non-nucleotide, can include a linker molecule, or a conjugate molecule.

本明細書で用いる「非対称二重鎖」とは、センス領域及びアンチセンス領域を含む別々の2つの鎖を有するsiNA分子を意味し、この場合センス領域は、アンチセンス領域と塩基対を作って二重鎖を形成するのに十分な相補的ヌクレオチドを有する限りにおいてアンチセンス領域よりも少ないヌクレオチドを具える。 By "asymmetric duplex" as used herein, refers to a siNA molecule having two separate strands comprising a sense region and an antisense region, where the sense region, making antisense region and base pair as long as they include enough complementary nucleotides to form a duplex comprising fewer nucleotides than the antisense region. 例えば、本発明の非対称二重鎖siNA分子は、T−細胞内でRNAiを媒介するのに十分な長さ(例:約19乃至約22(例:約19、20、21、又は22)ヌクレオチド)を有するアンチセンス領域と、約3乃至約18(例:約3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、又は18)ヌクレオチドを有しアンチセンス領域と相補的なセンス領域とを具えることができる。 For example, an asymmetric duplex siNA molecule of the invention, a length sufficient to mediate RNAi in T- cells (e.g. from about 19 to about 22 (e.g. about 19, 20, 21, or 22) nucleotides ) and antisense region having about 3 to about 18 (e.g. about 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17, or 18) It may comprise an antisense region having a nucleotide as a complementary sense region.

「遺伝子発現を調節する」とは、標的遺伝子の発現を上方制御又は下方制御することであり、細胞内に存在するmRNAのレベル、mRNAの翻訳、又は標的遺伝子によってコードされるタンパク質若しくはタンパク質サブユニットの合成の上方制御又は下方制御を含む場合がある。 By "modulate gene expression", is to upregulate or downregulate the expression of a target gene, the level of mRNA present in a cell, mRNA translation, or protein or protein subunits encoded by a target gene which may include upregulation or downregulation of the synthesis. 遺伝子発現の調節は、上方制御若しくは下方制御された標的遺伝子によってコードされた1又は2種類以上のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットの存在、量、又は活性により、対象とするタンパク質若しくはサブユニットの発現、レベル、又は活性が調節因子(例:siRNA)の非存在下で観察されるより高いか低いかに基づいて決定することもできる。 Regulation of gene expression, the presence of one or two or more proteins or protein subunits encoded by a target gene that is upregulated or downregulated, amount, or activity, the expression of a protein or subunits of interest, the level , or activity regulator (eg: siRNA) can also be determined based on the absence or higher or lower than that observed under a. 例えば、「調節」という用語は「阻害」を意味する場合もあるが、「調節」という言葉の使用はこの定義に限定されない。 For example, the term "modulation" is also mean "inhibit", use of the word "modulate" is not limited to this definition.

「阻害する」、「下方制御する」、又は「発現を低下させる」とは、遺伝子の発現、RNA分子又は1又は2種類以上のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットをコードする同等のRNA分子のレベル、又は標的遺伝子によってコードされる1又は2種類以上のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットのレベル若しくは活性が、本発明の核酸分子(例:siNA)の非存在下で観察されるよりも低下することを意味する。 "Inhibit", the term "downregulate", or "decreasing the expression" the expression of a gene, RNA molecules or one or more types of proteins or levels equivalent RNA molecules encoding a protein subunit, or level or activity of one or two or more proteins or protein subunits encoded by a target gene, nucleic acid molecules (eg: siNA) of the present invention means that lower than that observed in the absence of. 一つの様態では、siNA分子による阻害、下方制御、又は低下とは、不活性又は効果の弱い分子の存在下で観察されたレベルよりも低いことである。 In one aspect, inhibition by siNA molecules, downregulation, or a decrease, is lower than the level observed in the presence of a weak molecules inactive or effect. 別の様態では、siNA分子による阻害、下方制御、又は低下とは、例えばスクランブル配列又はミスマッチを有するsiNAの存在下で観察されたレベルよりも低いことである。 In another aspect, inhibition by siNA molecules, downregulation, or a decrease, for example, is lower than the level observed in the presence of the siNA with scrambled sequence or with mismatches. 別の様態では、本発明の核酸分子による遺伝子発現の阻害、下方制御、又は低下は、その核酸分子が存在する場合の方が存在しない場合よりも大きい。 In another aspect, the inhibition of gene expression with a nucleic acid molecule of the present invention, downregulation, or decrease, greater than when there is no person in the case where the nucleic acid molecule is present.

ジーン「サイレンシング」とは、細胞内の遺伝子発現の標的阻害による部分的な又は完全な機能喪失のことであり、「ノックダウン」と言うこともある。 The Gene "silencing" refers to a partial or complete loss of function due to targeted inhibition of gene expression in a cell, sometimes referred to as "knockdown". 状況及び扱うべき生物学的問題によっては、遺伝子発現を部分的に低下させることが好ましい場合もある。 In some circumstances and biological problems be addressed, it may be preferable to partially reduce gene expression. 代替的に、可能な限り遺伝子発現を低下させることが好ましい場合もある。 Alternatively, it may be desirable to reduce gene expression as much as possible. ジーンサイレンシングの程度は本技術分野で公知の方法によって定量することができ、方法のうちのいくつかは国際公開公報WO99/32619にまとめられている。 The extent of gene silencing may be determined by methods known in the art, some of the methods are summarized in International Publication No. WO99 / ​​99/32619. アッセイによっては、遺伝子発現の定量により、mRNAレベル又はタンパク質レベル若しくは活性という点で標的遺伝子の発現を、例えばベースライン(すなわち通常状態)又は、治療の対象である特定の疾患状態若しくはその他の状態と関連するであろう上昇した発現レベルを含む他のコントロールレベルの10%以上、30%以上、50%以上、75%以上、90%以上、95%以上、又は99%以上ノックダウンすることが可能である予防及び治療方法を含む、本発明の特定の様態において所望されるであろう種々の阻害量の検出が可能となる。 Some assays, and the quantification of gene expression, the expression of a target gene in that mRNA levels or protein levels or activity, for example, the baseline (i.e., normal state) or particular disease state or other is the treatment of a subject state associated with will try elevated 10% of the other control levels, including the level of expression over 30% or more, 50% or more, 75% or more, 90% or more, 95% or more, or can be knocked down 99% including the prevention and treatment methods is, it is possible to detect various inhibitory amount that would be desirable in certain aspects of the present invention.

「標的遺伝子の発現を阻害する」とは、本発明のsiNAが標的遺伝子のジーンサイレンシングを誘起する能力を意味する。 By "inhibiting expression of a target gene", siNA of the present invention refers to the ability to induce gene silencing of the target gene. ジーンサイレンシングの程度を調べるために、特定の構築物を発現する対象生物又は培養中の細胞のサンプル又はアッセイを、構築物を発現しないコントロールサンプルと比較する。 To examine the extent of gene silencing, the sample or assay cells in the subject organism or culture expressing a particular construct are compared to control samples which do not express the construct. コントロールサンプル(構築物の発現なし)の相対値を100%とする。 The relative values ​​of the control sample (no expression construct) is 100%. 標的遺伝子の阻害は、コントロールに対する相対値としての試験値が約90%、多くの場合は50%、そしてある様態においては25乃至0%の時に達成される。 Inhibition of the target gene, the test value of about 90% as a relative value relative to the control, 50% often and in some aspects is achieved when 25 to 0%. 適切なアッセイとしては、例えばドットブロット、ノーザンブロット、in situハイブリダイゼーション、ELISA、免疫沈降、酵素機能、並びに当業者に公知の表現型アッセイ等、当業者に公知の技術を用いたタンパク質又はmRNAレベルの検査が含まれる。 Suitable assays include, for example dot blots, northern blots, in situ hybridization, ELISA, immunoprecipitation, enzyme function, as well known phenotypic assays such to those skilled in the art, protein or mRNA levels using techniques known to those skilled in the art It is included in the inspection.

「対象」とは、生物、組織、又は細胞を意味し、対象若しくはドナーとしての生物、又は外植細胞若しくはそれ自体がsiNA送達の対象である細胞のレシピエントを含むことができる。 A "subject", organism, tissue, or cells means, organism as the target or a donor, or explanted cells or itself may comprise a recipient cell is the subject of the siNA delivery. 従って「対象」とは、本発明の核酸分子が投与され本明細書で述べるポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドによって促進され得る、インビトロ若しくはエキソビボでの対象器官、組織、又は細胞を含む生物、器官、組織、又は細胞のことである。 Thus the "target" refers to a nucleic acid molecule of the present invention may be facilitated by polynucleotide delivery-enhancing polypeptides described herein are administered, the subject organ in vitro or ex vivo, tissue, or organism comprising a cell, organ, tissue , or it is a cell. 典型的な対象としては、例えばヒトである患者若しくは細胞等、哺乳類の個体又は細胞が挙げられる。 Typical subjects, e.g. patients or cells, etc. is a human, include mammalian individual or cell.

本明細書で用いる「細胞」は、その通常の生物学的意味で用いられており、例えば特にヒト等の多細胞生物全体を意味するものではない。 "Cell" as used herein is used in its usual biological sense, for example, not particularly mean to an entire multicellular organism such as a human. 細胞は、例えばトリ、植物、並びにヒト、ウシ、ヒツジ、類人猿、サル、ブタ、イヌ、及びネコ等の哺乳類等の生物中に存在することができる。 Cells may for example birds, plants, and human, cattle, sheep, apes, monkeys, swine, dogs, and biological mammals such as cats. 細胞は原核細胞(例:バクテリア細胞)、又は真核細胞(例:哺乳類、若しくは植物細胞)であってよい。 Cells Prokaryotes (e.g. bacterial cells), or eukaryotic (e.g. mammalian, or plant cells). 細胞は、体細胞又は生殖系細胞であってよく、全能性細胞又は多能性細胞であってよく、分裂細胞又は非分裂細胞であってよい。 Cells may be somatic or germ line cells, may be a totipotent cells or pluripotent cells may be dividing cells or non-dividing cells. 細胞は、配偶子若しくは胚、幹細胞、又は完全に分化した細胞から誘導することもでき、又はこれらを具えることもできる。 Cells gamete or embryo, may also be derived from stem cells, or fully differentiated cell, or may comprise these.

「ベクタ」とは、所望の核酸を送達するために用いる核酸及び/又はウィルスに基づいた技術を意味する。 The term "vector" refers to techniques based on nucleic acids and / or viruses used to deliver a desired nucleic acid.

「具える(comprising)」とは、「具える(comprising)」に続くあらゆる言葉を含むが、それに限定されないという意味である。 The term "comprising (comprising)", including all the words following the "comprising (comprising)", in the sense that it is not limited to it. 従って、「具える(comprising)」という用語を用いた場合は、列挙された要素が必要又は必須であることを示すが、他の要素は任意であり存在しても存在しなくてもよいということを示す。 Therefore, because when using the term "comprising (comprising,)", shows that the listed elements are required or mandatory, other elements may not be present are optional indicating that. 「からなる(consisting of)」とは、「からなる(consisting of)」というフレーズに続く言葉を含み、それに限定されるという意味である。 The term "consisting of (consisting of)", includes the words following the phrase "consisting of (consisting of)", is the sense that it is limited thereto. 従って、「からなる(consisting of)」というフレーズは、列挙された要素が必要又は必須であり、他の要素は存在できないということを示す。 Thus, the phrase "consisting of (consisting of)" indicates that the listed elements are required or mandatory, other elements indicate that can not exist. 「実質的に〜からなる(consisting essentially of)」とは、このフレーズの後に列挙されたいかなる要素も含み、他の要素は列挙された要素に対する開示で特定された活性若しくは作用を妨げない又はこれらに寄与しないものに限られるという意味である。 "Consisting essentially ~ (consisting essentially of)" and includes any elements listed after the phrase, other elements do not interfere with the activity or action specified in disclosure to the listed elements or their in the sense that is limited to those that do not contribute to. 従って、「実質的に〜からなる(consisting essentially of)」というフレーズは、列挙された要素が必要又は必須であり、しかし他の要素は任意で、列挙された要素の活性若しくは作用に影響するかしないかに依存して存在してもしなくてもよいということを示す。 Thus, the phrase "substantially composed of ~ (consisting essentially of)" indicates that the listed elements are required or mandatory, but other elements are optional, or affect the activity or action of the listed elements It indicates that may or may not be present depending on or not.

「RNA」とは、少なくとも一つのリボヌクレオチド残基を含む分子を意味する。 By "RNA" is meant a molecule comprising at least one ribonucleotide residue. 「リボヌクレオチド」とは、ベータ−D−リボフラノース部位の2'位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドである。 By "ribonucleotide" is a nucleotide with a hydroxyl group at the 2 'position of the beta -D- ribofuranose site. 「RNA」という用語は、二本鎖RNA、一本鎖RNA、部分的に精製されたRNAなどの単離されたRNA、実質的に純粋なRNA、合成RNA、組み換えによって作製したRNA、並びに1若しくは2個以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換、及び/又は変性によって天然のRNAとは異なる変性されたRNAを含む。 The term "RNA", double-stranded RNA, single-stranded RNA, partially isolated RNA such as purified RNA, substantially pure RNA, synthetic RNA, RNA was prepared recombinantly and 1, or including the addition of two or more nucleotides, deletions, substitutions, and / or a naturally occurring RNA by denaturing the RNA that is different modification. このような変性は、例えばRNAの1又は2個以上のヌクレオチドのようなsiNAの末端部又は内部への非ヌクレオチド材料の付加を含む場合がある。 Such modifications, for example, may contain additional non-nucleotide material into the distal end of the siNA or internally, such as RNA of one or two or more nucleotides. 本発明のRNA分子中のヌクレオチドには、天然ではないヌクレオチド又は化学合成されたヌクレオチド若しくはデオキシヌクレオチド等の非標準的なヌクレオチドが含まれる場合もある。 The nucleotides in the RNA molecule of the present invention may also include non-standard nucleotides, such as natural non-nucleotides or chemically synthesized nucleotides or deoxynucleotides. このような変性されたRNAは類似体又は天然RNAの類似体と呼ばれる場合がある。 Such modified RNA may be referred to as analogs or analogs of naturally occurring RNA.

「高度保存配列領域」とは、標的遺伝子の1又2種類以上の領域のヌクレオチド配列が、一つの世代から別の世代へ、又は一つの生体系から別の生体系へかけて実質的に変化しないことを意味する。 By "highly conserved sequence region", a nucleotide sequence of 1 or 2 kinds or more regions of the target gene, from one generation to another generation, or substantially change over from one biological system to another biological system which means that you do not.

「センス領域」とは、siNA分子のアンチセンス領域に対して相補性を有するそのsiNA分子のヌクレオチド配列を意味する。 By "sense region" is meant a nucleotide sequence of the siNA molecule having complementarity to an antisense region of the siNA molecule. さらに、siNA分子のセンス領域は、標的核酸配列と相同性を有する核酸配列を具えることができる。 In addition, the sense region of a siNA molecule can comprise a nucleic acid sequence having homology with a target nucleic acid sequence.

「アンチセンス領域」とは、標的核酸配列に対して相補性を有するsiNA分子のヌクレオチド配列を意味する。 By "antisense region" is meant a nucleotide sequence of a siNA molecule having complementarity to a target nucleic acid sequence. さらに、siNA分子のアンチセンス領域は、任意にそのsiNA分子のセンス領域に対して相補性を有する核酸配列を具えることができる。 In addition, the antisense region of a siNA molecule can comprise any nucleic acid sequence having complementarity to a sense region of the siNA molecule.

「標的核酸」とは、発現又は活性が調節されるいずれの核酸配列も意味する。 By "target nucleic acid" means any nucleic acid sequence whose expression or activity is modulated. 標的核酸はDNA又はRNAであり得る。 Target nucleic acid can be DNA or RNA.

「相補性」とは、核酸が別の核酸配列と、従来から知られるワトソン−クリック型によるか又はその他の従来のものとは異なる種類の型により水素結合を形成できることを意味する。 By "complementarity", and another nucleic acid sequence nucleic acid, from Watson conventionally known - means that it is possible to form a hydrogen bond with a different type of mold is intended either by Crick or other conventional. 本発明の核酸分子に関連しては、核酸分子のその相補性配列との結合自由エネルギーは十分に大きく、例えばRNAi活性等の核酸の関連する機能を発することができる。 In relation to a nucleic acid molecule of the present invention, the binding free energy between the complementary sequence of a nucleic acid molecule is sufficiently large, for example, can emit the relevant function of the nucleic acid of RNAi activity, and the like. 核酸分子の結合自由エネルギーの定量は、本技術分野でよく知られている(例えば、Turnerら,CSH Symp. Quant. Biol. LII, 1987, pp.123−133; Frierら,Proc. Nat. Acad. Sci. USA 83: 9373−9377, 1986; Turnerら,J. Am. Chem. Soc. 109: 3783−3785, 1987参照)。 Determination of binding free energies for nucleic acid molecules are well known in the art (see, eg, Turner et al., CSH Symp Quant Biol LII, 1987, pp.123-133;..... Frier et al, Proc Nat Acad .. Sci USA 83:.... 9373-9377, 1986; Turner et al., J Am Chem Soc 109: 3783-3785, see 1987). 相補性のパーセントは、第二の核酸配列と水素結合(例:ワトソン−クリック塩基対)を形成することができる、核酸分子の連続する残基のパーセントを示す(例:第一のオリゴヌクレオチドにある全10ヌクレオチドのうち、10ヌクレオチドを有する第二の核酸配列と5、6、7、8、9、又は10ヌクレオチドが塩基対を形成する場合が、それぞれ50%、60%、70%、80%、90%、及び100%の相補性を表す)。 Percent complementarity, the second nucleic acid sequence and hydrogen bonds: - can be formed (eg Watson Crick base pairs), indicating the percentage of contiguous residues of a nucleic acid molecule (e.g. a first oligonucleotide of certain all 10 nucleotides, the second nucleic acid sequence and 5,6,7,8,9 having 10 nucleotides, or if 10 nucleotides form base pairs, 50% respectively, 60%, 70%, 80 %, representing a 90%, and 100% complementary). 「完全に相補的」とは、核酸配列の連続するすべての残基が、第二の核酸配列の同数の連続する残基と水素結合を形成することを意味する。 By "fully complementary", all the contiguous residues of a nucleic acid sequence, means to form a same number of contiguous residues hydrogen bond with the second nucleic acid sequence.

本明細書で用いる「ユニバーサル塩基」という用語は、天然のDNA/RNA塩基の各々とほとんど区別なく塩基対を形成するヌクレオチド塩基類似体を意味する。 The term "universal base" as used herein, refers to nucleotide base analogs that form almost without distinction bp with each of the natural DNA / RNA bases. ユニバーサル塩基の限定されない例としては、本技術分野で公知のように、C−フェニル、C−ナフチル、及び他の芳香族誘導体、イノシン、アゾール、カルボキシアミド、並びに3−ニトロピロール、4−ニトロインドール、5−ニトロインドール、及び6−ニトロインドール等のニトロアゾール誘導体が挙げられる(例えばLoakes,Nucleic Acids Research 29: 2437−2447, 2001参照)。 Non-limiting examples of universal bases, as known in the art, C-phenyl, C-naphthyl and other aromatic derivatives, inosine, azole, carboxamide, and 3-nitropyrrole, 4-nitroindole , 5-nitroindole, and nitro azole derivatives such as 6-nitroindole (e.g. Loakes, Nucleic Acids Research 29: 2437-2447, see 2001).

本明細書で用いる「非環式ヌクレオチド」という用語は、例えばリボースの炭素(C1、C2、C3、C4、若しくはC5)のいずれかが独立に又は組み合わせてヌクレオチドから欠失する場合等の非環式リボース糖を有するヌクレオチドを意味する。 As used herein, the term "acyclic nucleotide", for example, acyclic such as when any of the ribose carbons (C1, C2, C3, C4, or C5) is deleted from nucleotides independently combined or It means a nucleotide having the formula ribose sugar.

本明細書で用いる「生分解性」という用語は、例えば酵素分解又は化学分解等の生体系内での分解を意味する。 As used herein, the term "biodegradable" refers to degradation in example enzymatic degradation or chemical degradation, etc. of a biological system.

本明細書で用いる「生物学的に活性な分子」という用語は、系内での生物学的応答を誘起若しくは調節することができる化合物又は分子を意味する。 The term "biologically active molecule" as used herein, means a compound or molecule capable of inducing or modulating the biological response in a system. 単独の又は本発明で意図する他の分子と組み合わせる生物学的に活性なsiNA分子の限定されない例としては、抗体、コレステロール、ホルモン、抗ウィルス剤、ペプチド、タンパク質、化学療法剤、低分子、ビタミン、補助因子、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、酵素核酸、アンチセンス核酸、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、2,5−Aキメラ、siNA、dsRNA、アロザイム、アプタマ、デコイ、及びこれらの類似体等の治療活性分子が挙げられる。 Non-limiting examples of single or biologically active siNA molecules combined with other molecules contemplated by the present invention include antibodies, cholesterol, hormones, antivirals, peptides, proteins, chemotherapeutics, small molecules, vitamin , cofactors, nucleosides, nucleotides, oligonucleotides, enzymatic nucleic acids, antisense nucleic acids, triplex forming oligonucleotides, 2, 5-a chimeras, siNA, dsRNA, allozymes, aptamers, decoys and analogs thereof, such as the therapeutic activity molecule, and the like. 本発明の生物学的に活性な分子は、例えば脂質並びにポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、及びその他のポリエーテル等のポリマ等の他の生物学的に活性な分子の薬物動態及び/又は薬効を調節することが可能な分子も含む。 Biologically active molecules of the present invention, for example, regulate lipid and polyamines, polyamides, polyethylene glycols, and other pharmacokinetic and / or efficacy of other biologically active molecules of the polymer such as the polyether also molecules that can be.

本明細書で用いる「リン脂質」という用語は、少なくとも一つのリン含有基を含む疎水性分子を意味する。 The term "phospholipid" as used herein, refers to a hydrophobic molecule comprising at least one phosphorus-containing group. 例えば、リン脂質は、リン含有基、及び任意にOH、COOH、オキソ、アミン、又は置換若しくは非置換アリール基で置換されていてもよい飽和又は不飽和のアルキル基を含むことができる。 For example, a phospholipid can comprise a phosphorus-containing group, and optionally OH, COOH, oxo, amine, or a substituted or unsubstituted alkyl group having an aryl saturated may be substituted with a group or unsaturated.

「キャップ構造」とは、オリゴヌクレオチドのいずれかの末端に取り込まれた化学修飾を意味する(例えば、本明細書に組み入れられるAdamicら、米国特許公報第5998203号を参照)。 By "cap structure" is meant chemical modifications, which have been incorporated at either terminus of oligonucleotides (e.g., Adamic et al., Incorporated herein, see US Patent Publication No. 5,998,203). このような末端修飾は、核酸分子をエキソヌクレアーゼ分解から保護し、細胞内での送達及び/又は局在化を促進することができる。 Such terminal modifications protect the nucleic acid molecule from exonuclease degradation, can facilitate the delivery and / or localization within a cell. キャップは5'末端(5'キャップ)に存在してもよく、3'末端(3'キャップ)に存在してもよく、又は両末端に存在してもよい。 Cap may be present at the 5 'end (5' Cap), 3 'end (3' cap) may be present in, or may be present on both termini. 限定されない例において、5'キャップはグリセリル、逆位デオキシ脱塩基残基(inverted deoxy abasic residue)(部位)、4',5'−メチレンヌクレオチド、1−(β−D−エリスロフラノシル)ヌクレオチド、4'−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド、1,5−無水ヘキシトールヌクレオチド、L−ヌクレオチド、α−ヌクレオチド、修飾塩基ヌクレオチド、ホスホロジチオエート結合、スレオ−ペントフラノシルヌクレオチド、非環式3',4'−セコヌクレオチド、非環式3,4−ジヒドロキシブチルヌクレオチド、非環式3,5−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、3'−3'−逆位ヌクレオチド部位(3'−3'−inverted nucleotide moiety)、3'−3'−逆位脱塩基部位 In a non-limiting example, 5 'cap glyceryl, inverted deoxy abasic residue (inverted deoxy abasic residue) (sites), 4', 5'-methylene nucleotide, 1- (β-D- erythro furanosyl) nucleotides, 4'-thio nucleotide, carbocyclic nucleotide, 1,5 anhydrous hexitol nucleotides, L- nucleotides, alpha-nucleotide, a modified base nucleotide, phosphorodithioate bonds, threo - pentofuranosyl nucleotide, an acyclic 3 ', 4'-seco nucleotide, an acyclic 3,4-dihydroxybutyl nucleotide, an acyclic 3,5-dihydroxypentyl nucleotide, 3'-3'-inverted nucleotide position (3'-3'-inverted nucleotide moiety ), 3'-3'-inverted abasic site 3'−3'−inverted abasic moiety)、3'−2'−逆位ヌクレオチド部位(3'−2'−inverted nucleotide moiety)、3'−2'− 逆位脱塩基部位(3'−2'−inverted abasic moiety)、1,4−ブタンジオールリン酸、3'−ホスホルアミデート、ヘキシルリン酸、アミノヘキシルリン酸、3'−リン酸、3'−ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、又は架橋若しくは非架橋のメチルホスホネート部位を含むがこれらに限定されない。 3'-3'-inverted abasic moiety), 3'-2'- inverted nucleotide position (3'-2'-inverted nucleotide moiety), 3'-2'- inverted abasic site (3'-2 ' -inverted abasic moiety), 1,4- butanediol phosphate, 3'-phosphoramidate, Hekishirurin acid, aminohexyl phosphate, 3'-phosphate, 3'-phosphorothioate, phosphorodithioate, or crosslinking or including non-crosslinked methylphosphonate site without limitation.

3'キャップの限定されない例としては、グリセリル、逆位デオキシ脱塩基残基(inverted deoxy abasic residue)(部位)、4',5'−メチレンヌクレオチド、1−(β−D−エリスロフラノシル)ヌクレオチド、4'−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド、5'−アミノ−アルキルリン酸、1,3−ジアミノ−2−プロピルリン酸、3−アミノプロピルリン酸、6−アミノヘキシルリン酸、1,2−アミノドデシルリン酸、ヒドロキシプロピルリン酸、1,5−無水ヘキシトールヌクレオチド、L−ヌクレオチド、α−ヌクレオチド、修飾塩基ヌクレオチド、ホスホロジチオエート、スレオ−ペントフラノシルヌクレオチド、非環式3',4'−セコヌクレオチド、3,4−ジヒドロキシブチルヌクレオチド、 3 'Non-limiting examples of the cap, glyceryl, inverted deoxy abasic residue (inverted deoxy abasic residue) (sites), 4', 5'-methylene nucleotide, 1- (β-D- erythro furanosyl) nucleotides , 4'-thio nucleotide, carbocyclic nucleotide, 5'-amino - alkyl phosphates, 1,3-diamino-2-propyl phosphate, 3-aminopropyl phosphate, 6-aminohexyl phosphate, 1,2 - aminododecyl phosphate, hydroxypropyl phosphate, 1,5-anhydride hexitol nucleotides, L- nucleotides, alpha-nucleotide, a modified base nucleotide, a phosphorodithioate, threo - pentofuranosyl nucleotide, an acyclic 3 ' , 4'-seco nucleotide, 3,4-dihydroxy-butyl nucleotides, ,5−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、5'−5'−反転ヌクレオチド部位(5'−5'−inverted nucleotide moiety)、5'−5'−逆位脱塩基部位(5'−5'−inverted abasic moiety)、5'−ホスホルアミデート、5'−ホスホロチオエート、1,4−ブタンジオールリン酸、5'−アミノ、架橋及び/若しくは非架橋の5'−ホスホルアミデート、ホスホロチオエート及び/又はホスホロジチオエート、架橋若しくは非架橋のメチルホスホネート、並びに5'−メルカプト部位を含むがこれらに限定されない(より詳細には、参照することで本明細書に組み入れられるBeaucage及びLyer,Tetrahedron 49: 1925,1993、を参照)。 , 5-dihydroxy-pentyl nucleotides, 5'-5'-inverted nucleotide site (5'-5'-inverted nucleotide moiety), 5'-5'- inverted abasic site (5'-5'-inverted abasic moiety) , 5'-phosphoramidate, 5'-phosphorothioate, 1,4-butanediol phosphate, 5'-amino, crosslinked and / or uncrosslinked 5'phosphoramidate, phosphorothioate and / or phosphorodithioate benzoate, crosslinked or non-crosslinked methyl phosphonate, and 5'-mercapto containing the site but not limited to (more specifically, Beaucage incorporated herein by reference thereto and Lyer, Tetrahedron 49: 1925,1993, see).

「非ヌクレオチド」という用語は、糖及び/又はリン酸置換基を含む1又は2個以上のヌクレオチド単位の代わりに核酸鎖に取り込まれることができ、残った塩基に酵素活性を示させる基又は化合物を意味する。 The term "non-nucleotide", instead of one or two or more nucleotide units, including sugars and / or phosphate substituents can be incorporated into a nucleic acid strand, group to exhibit enzymatic activity in the remaining basic or compound It means. この基又は化合物は、アデノシン、グアニン、シトシン、ウラシル、又はチミン等の一般的に認知されたヌクレオチド塩基を含まず、従って1'位に塩基が存在しないという点において脱塩基型である。 The group or compound, adenosine, excluding guanine, cytosine, uracil, or a generally recognized nucleotide base, such as thymine, hence abasic type in that the base is not present in the 1 'position.

本明細書で用いる「ヌクレオチド」とは、本技術分野で認知されているように、本技術分野で公知の天然塩基(標準的)及び修飾塩基を含むものである。 "Nucleotide" as used herein, as is recognized in the art, are those in the art including the known natural bases (standard), and modified bases. そのような塩基は、一般的にヌクレオチドの糖部位の1'位に位置している。 Such bases are generally located at the 1 'position of the sugar moiety of the nucleotides. ヌクレオチドは一般的に、塩基、糖及びリン酸基を含む。 Nucleotides generally comprise a base, sugar and a phosphate group. ヌクレオチドは、糖、リン酸及び/又は塩基部位において修飾されていなくても修飾されていてもよい(互換的に,ヌクレオチド類似体、修飾ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、非標準的ヌクレオチド等とも称される; 例えば、Usman及びMcSwiggen,上掲; Ecksteinら、国際公開公報WO92/07065; Usmanら、国際公開公報WO93/15187; Uhlman及びPeyman,上掲、を参照; これらはすべて参照することで本明細書に組み入れられる)。 Nucleotides, sugars, optionally modified without being modified at the phosphate and / or base moiety (interchangeably, modified nucleotides, non-natural nucleotides, non-standard nucleotides, such as ; for example, Usman and McSwiggen, supra; Eckstein et al., International Publication WO92 / 07065; Usman et al, International Publication WO93 / 15187; Uhlman and Peyman, supra; herein by all of these references incorporated in). 本技術分野で知られる修飾核酸塩基のいくつかの例が、Limbachら,Nucleic Acids Res. Some examples of modified nucleic acid bases known in the art, Limbach et al., Nucleic Acids Res. 22: 2183,1994、にまとめられている。 22: 2183,1994, to are summarized. 核酸分子中に導入することができる塩基修飾の限定されないいくつかの例としては、イノシン、プリン、ピリジン−4−オン、ピリジン−2−オン、フェニル、シュードウラシル(pseudouracil)、2,4,6−トリメトキシベンゼン、3−メチルウラシル、ジヒドロウリジン、ナフチル、アミノフェニル、5−アルキルシチジン(例:5−メチルシチジン)、5−アルキルウリジン(例:リボチミジン)、5−ハロウリジン(例:5−ブロモウリジン)、又は6−アザピリミジン若しくは6−アルキルピリミジン(例:6−メチルウリジン)、プロピン等が挙げられる(Burginら,Biochemistry 35: 14090,1996; Uhlman及びPeyman,上掲)。 Some non-limiting examples of base modifications that can be introduced into a nucleic acid molecule, inosine, purine, pyridin-4-one, pyridin-2-one, phenyl, pseudouracil uracil (pseudouracil), 2,4,6 - trimethoxy benzene, 3-methyl uracil, dihydrouridine, naphthyl, aminophenyl, 5-alkyl cytidine (e.g. 5-methyl cytidine), 5-alkyl uridine (e.g. ribothymidine), 5-Harourijin (e.g. 5-bromo uridine) or 6-azapyrimidines or 6-alkyl pyrimidines (e.g. 6-methyl uridine), propyne, and the like (Burgin et al., Biochemistry 35: 14090,1996; Uhlman and Peyman, supra). この観点において、「修飾塩基」とは、1'位におけるアデニン、グアニン、シトシン及びウラシル以外のヌクレオチド塩基又はそれらに相当するものを意味する。 In this respect, the term "modified base" is meant adenine, guanine, the equivalent of nucleotide bases or their non-cytosine and uracil at 1 'position.

「標的部位」とは、アンチセンス領域内に標的配列と相補的な配列を含むsiNA構築物によって媒介される開裂の「標的」となる標的RNA内の配列を意味する。 A "target site" is meant a sequence within a target RNA that is "targeted" for cleavage mediated by siNA construct comprising a sequence complementary to the target sequence in the antisense region.

「検出可能な開裂レベル」とは、標的RNAのランダム分解によって生成するRNAのバックグラウンドを超える、開裂産物を識別するのに十分な程度の標的RNAの開裂(及び開裂産物RNAの形成)を意味する。 By "detectable cleavage level" exceeds RNA background produced by random degradation of the target RNA, refers to the cleavage product enough to identify degree of target RNA cleavage (and cleavage product RNA form) to. ほとんどの検出方法において、標的RNAの1乃至5%の開裂産物が生成すれば、バックグランドを超えて検出するのに十分である。 In most methods of detection, it is generated from 1 to 5 percent of cleavage of the target RNA, is sufficient to detect beyond background.

「生体系」とは、純粋な又は非純粋な形での、ヒト、動物、植物、昆虫、バクテリア、ウィルス、又はその他の供給源を含むがこれらに限定されない生物的供給源に由来の物質を意味し、この場合生体系はRNAi活性に必要な成分を含有する。 "Biological system" is, in pure or impure form, human, animal, plant, insect, bacteria, viruses, or including other sources of substances derived from biological sources, including but not limited to It refers to, in this case biological system containing the components required for RNAi activity. 「生体系」という用語は、例えば細胞、組織、若しくは生命体、又はこれらの抽出物を含む。 The term "biological system" includes for example cells, tissue, or organism, or extracts thereof. 生体系という用語は、インビトロ環境下で用いることができる再構築されたRNAi系も含む。 The term biological system also includes RNAi system reconstructed can be used under in vitro environment.

本明細書で用いる「生分解性リンカ」とは、例えば生物的に活性な分子と本発明のsiNA分子とを、又は本発明のsiNA分子のセンス鎖とアンチセンス鎖とを連結させるような、一つの分子をもう一つの分子と連結させるための生分解性リンカとして設計された核酸又は非核酸リンカ分子を意味する。 The term "biodegradable linker" as used herein, such as to biologically and siNA molecules of active molecules and the present invention, or linking the sense and antisense strands of a siNA molecule of the present invention, It means biodegradable nucleic acid or non-nucleic acid linker molecule designed as a linker for linking the one molecule and another molecule. 生分解性リンカは、特定の組織又は細胞種への送達等の特定の目的のためにその安定性を調節することができるように設計されている。 Biodegradable linker is designed to be able to adjust its stability for a particular purpose of delivery, such as to a particular tissue or cell type. 核酸に基づいた生分解性リンカ分子の安定性は、例えばリボヌクレオチドと、デオキシリボヌクレオチドと、2'−O−メチル、2'−フルオロ、2'−アミノ、2'−O−アミノ、2'−C−アリル、2'−O−アリル、及びその他の2'位修飾ヌクレオチド又は塩基修飾ヌクレオチド等の化学修飾ヌクレオチドとの組み合わせ等の様々な化学的作用を用いて調節することができる。 Stability biodegradable linker molecule based on nucleic acids, and for example ribonucleotides, deoxyribonucleotides, 2'-O-methyl, 2'-fluoro, 2'-amino, 2'-O-amino, 2' C- allyl, it can be adjusted 2'-O- allyl, and using various chemical effects of combinations with other 2 'modification nucleotide or base modified nucleotides, such as chemically modified nucleotides. 生分解性核酸リンカ分子は、例えば長さが約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、若しくは20ヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドのような二量体、三量体、四量体、若しくはさらに長い核酸分子であってよく、又は例えばホスホロアミデート若しくはホスホジエステル結合等のリン含有結合を有する一つのヌクレオチドを含んでもよい。 Biodegradable nucleic acid linker molecule, for example a length of about 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19, or dimers such as oligonucleotides are 20 nucleotides, trimer, tetramer, or even longer may be a nucleic acid molecule, or for example, one having a phosphorus-containing linkage such as phosphoramidate or phosphodiester linkage it may also include a nucleotide. 生分解性核酸リンカ分子は、核酸のバックボーン、核酸の糖、又は核酸の塩基の修飾を具えていてもよい。 Biodegradable nucleic acid linker molecule is a nucleic acid backbone may comprise a nucleic acid sugar, or nucleic acid base modifications.

「脱塩基」とは、糖部位の塩基が欠失した、又は糖部位の1'位に塩基の代わりに他の化学基を有することを意味し、例えばAdamicら、米国特許公報第5998203号を参照のこと。 By "abasic" sugars site bases are deleted, or in place of base at the 1 'position of the sugar moiety means having other chemical groups, for example Adamic et al., U.S. Patent No. 5,998,203 see.

「非修飾ヌクレオシド」とは、ベータ−D−リボフラノースの1'位の炭素にアデニン、シトシン、グアニン、チミン、又はウラシルの塩基のうちの一つが結合していることを意味する。 By "unmodified nucleoside" it is meant that the adenine to the carbon of the 1 'position of the beta -D- ribofuranose, cytosine, guanine, thymine, or one of the uracil bases are attached.

「修飾ヌクレオシド」とは、非修飾ヌクレオチドの塩基、糖、及び/又はリン酸の化学構造中に修飾部を有するヌクレオチド塩基を意味する。 By "modified nucleoside" is meant an unmodified nucleotide base, sugar, and / or the nucleotide bases having a modified portion in the chemical structure of phosphoric acid. 修飾ヌクレオチドの限定されない例は、本明細書に記載の構造式I乃至VII及び/又はその他の修飾によって示される。 Non-limiting examples of modified nucleotides are shown by structural formulas I to VII and / or other modifications described herein.

本発明に関して述べる2'位修飾ヌクレオチドに関連して、「アミノ」とは、2'−NH 又は2'−O−−NH を意味し、修飾されていてもされていなくてもよい。 In connection with the 2 'position modified nucleotides described with respect to the present invention, the term "amino", 2'-NH 2 or 2'-O - means NH 2, may not be be modified. このような修飾された基は、例えばEcksteinら、米国特許公報第5672695号及びMatulic−Adamicら、米国特許公報第6248878号に記載されている。 Such modified groups are, for example Eckstein et al, U.S. Pat. No. 5672695 and Matulic-Adamic et al., Is described in U.S. Patent No. 6,248,878.

siNA分子は、カチオン性脂質と複合体化したり、リポソーム内に封入したり、又は標的細胞若しくは組織へ送達したりすることができる。 siNA molecules can be or deliver or complexed with cationic lipids, or encapsulated in liposomes, or to a target cell or tissue. 核酸又は核酸複合体は、注射、輸液ポンプ、若しくはステントにより、生体高分子に取り込まれた形若しくは取り込まれない形で、局所的に投与することができる。 Nucleic acid or nucleic acid complexes, injections, infusion pump, or by the stent, with entrapped form or not incorporated form in biopolymers may be administered topically. 別の様態では、ポリエチレングリコール(PEG)が、本発明のsiNA化合物、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチド、又はその両方と共有結合することができる。 In another aspect, it is possible to polyethylene glycol (PEG) is, siNA compounds of the present invention, be covalently linked polynucleotide delivery, or both. 結合したPEGはいかなる分子量でもよく、好ましくは約2000乃至約50,000ダルトン(Da)である。 The attached PEG can be any molecular weight, preferably from about 2000 to about 50,000 daltons (Da).

センス領域は、ポリヌクレオチドリンカ又は非ヌクレオチドリンカ等のリンカ分子によってアンチセンス領域と結合することができる。 The sense region can be coupled to the antisense region linker molecule, such as a polynucleotide linker or a non-nucleotide linker.

「逆位リピート(inverted repeat)」とは、リピートが転写された時に二本鎖siRNAを形成することができるように位置するセンス要素及びアンチセンス要素を含む核酸配列を意味する。 The "inverted repeats (Inverted repeat)" means a nucleic acid sequence comprising a sense element and antisense element positioned so as to be able to form a double stranded siRNA when the repeat is transcribed. 逆位リピートは、任意にリピートの二つの要素間に、リンカ又は自己開裂リボザイム等の異種配列を有していてもよい。 Inverted repeats are between the two elements of the repeat may optionally have a heterologous sequence such as a linker or self-cleaving ribozyme. 逆位リピートの要素は二本鎖RNAを形成するのに十分な長さを有する。 Elements of inverted repeats having a sufficient length to form a double-stranded RNA. 通常、逆位リピートの各要素の長さは、約15乃至約100ヌクレオチドであり、好ましくは約20乃至30塩基のヌクレオチド長であり、好ましくは約20乃至25ヌクレオチドであり、例えば20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、又は30ヌクレオチドである。 Usually, the length of each element of the inverted repeat is about 15 to about 100 nucleotides, preferably nucleotides in length from about 20 to 30 bases, preferably about 20 to 25 nucleotides, for example 20, 21, 22,23,24,25,26,27,28,29, or 30 nucleotides.

「核酸」とは、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド、及び一本鎖又は二本鎖の形のこれらのポリマを意味する。 "Nucleic acid" refers to those polymers in the form of deoxyribonucleotides or ribonucleotides, and single- or double-stranded. この用語は、合成、天然、及び非天然であって、基準となる核酸と同様の結合性質を有し、基準となる核酸と同様な代謝作用を受ける、既知のヌクレオチド類似体又は修飾バックボーン残基若しくは結合を含む核酸を包含する。 This term, synthetic, natural, and a non-naturally occurring, have binding properties similar to the reference nucleic acid, undergoes the same metabolic effects and nucleic acid as a reference, known nucleotide analogs or modified backbone residues or it includes a nucleic acid that contains the binding. このような類似体の例としては、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、2−O−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸(PNA)が挙げられるがこれらに限定されない。 Examples of such analogues include phosphorothioate, phosphoramidate, methyl phosphonates, chiral-methyl phosphonates, 2-O-methyl ribonucleotides, peptide - although nucleic acid (PNA) and the like without limitation.

「高分子二本鎖RNA」とは、約40塩基対(bp)を超えるサイズを有する二本鎖RNAを意味し、例えば100bp超、又はより詳細には300bp超のサイズである。 By "polymeric double-stranded RNA" refers to double-stranded RNA having a size greater than about 40 base pairs (bp), for example 100bp greater, or more particularly the size of 300bp greater. 高分子dsRNAの配列は、mRNAのセグメントに相当するものであっても、又はmRNA全体に相当するものであってもよい。 Sequence of large dsRNA may be one that corresponds to the mRNA of the segments, or may be equivalent to the entire mRNA. 本発明では、高分子dsRNAの最大サイズに制限はない。 In the present invention, there is no limit on the maximum size of the polymer dsRNA. 二本鎖RNAは、リン酸糖バックボーン又はヌクレオチドが修飾されていてもよい修飾塩基を含んでも良い。 Double-stranded RNA may include modified bases where the phosphate sugar backbone or nucleotide may be modified. そのような修飾は、ヘテロ原子である窒素若しくは硫黄による修飾、又は本技術分野で公知のその他の修飾であってよい。 Such modifications, modification by nitrogen or sulfur heteroatom, or a known other modifications in the art.

二本鎖構造は、ヘアピンRNA若しくはマイクロRNA等で発生するような自己相補的RNA鎖によって、又は二つの別々のRNA鎖のアニーリングによって形成することができる。 The double-stranded structure may be formed by the self-complementary RNA strand such as occurs in a hairpin RNA or micro RNA and the like, or of two separate RNA strands anneal.

「重複(overlapping)」とは、二つのRNA断片が、一つの鎖上で複数のヌクレオチド分重複する配列を有する状態を意味し、例えば複数のヌクレオチド(nt)の数がわずか2乃至5ヌクレオチド、又は5乃至10ヌクレオチド若しくは11ヌクレオチド以上である等の場合がある。 "Duplicate (Overlapping)" refers to two RNA fragments, one of a plurality of nucleotides partial overlapping sequences on a chain means a state having, for example, a plurality of number only 2 to 5 nucleotides of the nucleotide (nt), or it may equal is 5 to 10 nucleotides or 11 nucleotides or more.

「1又は2種類以上のdsRNA」とは、配列に基づいて互いに異なるdsRNAを意味する。 The "one or more than one dsRNA" refers to different dsRNA from each other based on the sequence.

「標的遺伝子又はmRNA」とは、対象である遺伝子又はmRNAを意味する。 "Target gene or mRNA" refers to a gene or mRNA of interest. 実際には、過去に遺伝学又はシークエンシングによって同定されたいずれの遺伝子も標的となり得る。 In fact, it may be one of the genes targets identified by genetics or sequencing the past. 標的遺伝子又はmRNAには、発生遺伝子、制御遺伝子、並びに代謝遺伝子若しくは構造遺伝子、又は酵素をコードする遺伝子を含むことができる。 The target gene or mRNA, developmental genes, regulatory genes, and metabolic gene or a structural gene, or may contain a gene encoding the enzyme. 標的遺伝子は、表現型の研究中である細胞内、又は生命体内で、表現型特性に直接的に若しくは間接的に影響を与える方法で発現される場合がある。 Target gene in a cell is being investigated phenotype, or life body, which may be expressed in a way to give directly or indirectly affect the phenotypic characteristics. 標的遺伝子は内在性であっても外来性であってもよい。 The target gene may be a foreign be endogenous. そのような細胞は、生殖細胞を含む成体若しくは胎仔動物の体内細胞又は植物の細胞、又は不死化セルライン若しくは初代細胞培養のような単離された細胞を含む。 Such cells include vivo cell or a plant cell of an adult or fetal animals including germ cells, or isolated cells, such as immortalized cell lines or primary cell cultures.

本明細書及び添付の請求項において、単数形の「1の(a)」「1の(an)」及び「その(the)」は、文脈から明確に示される場合以外は、複数の事柄を含む。 In this specification and the appended claims, the singular forms "a (a)" "1 (an,)" and "its (the)", except when explicitly indicated from the context, a plurality of matters the including.

本明細書で示された例は、単に例示目的のためのものであって、請求項に記載の本発明の範囲を制限することを意図したものではない。 Examples shown herein are merely for illustrative purposes and are not intended to limit the scope of the invention as claimed. 本明細書では具体的な用語及び数値が用いられてはいるが、そのような用語及び数値は典型的なものであって、本発明の範囲を制限するものではないことが理解されるであろう。 Der herein but is used is specific terms and numerical, such terms and numeric is a typical example, it is not intended to limit the scope of the invention wax.

本開示で引用するすべての刊行物及び参考文献の全文献は、あらゆる点で参照することで本明細書に組み入れられる。 All literature All publications and references cited in this disclosure are incorporated herein by reference in all respects.

上記の開示によって本発明を全体的に説明し、さらに以下の実施例によって本発明を例証する。 The present invention generally described by the above disclosure, further illustrate the present invention the following examples. これらの実施例は、単に例示目的のために記載されており、本発明の範囲を制限することを意図したものではない。 These examples are merely are described for illustrative purposes and are not intended to limit the scope of the present invention. ここで具体的な用語及び数値が用いられてはいるが、同様にそのような用語及び数値は典型的なものであって、本発明の範囲を制限するものではないことが理解されるであろう。 Here although the used concrete terms and numeric, likewise such terms and numeric is a typical example, der which are not intended to limit the scope of the invention wax.

実施例1 Example 1
使用したプロトコル及び方法 Protocols and methods used
siRNA/ポリペプチド抱合体の合成 The synthesis of siRNA / polypeptide conjugates
ポリペプチド及びRNAは両方とも、標準的固相合成法によって調製される。 Both polypeptides and RNA is prepared by standard solid phase synthesis. ポリペプチド及びRNA分子は、特定の部位で官能化してお互いが共有結合できるようにしなければならない。 Polypeptides and RNA molecules are each other functionalized with a specific site should be able to covalently bond. ポリペプチドについては、N−末端が3−マレイミドプロピオン酸で官能化される。 For polypeptides, N- terminus is functionalized with 3-maleimido propionic acid. しかし、ブロモ部位又はヨードアセチル部位等の他の官能基も機能することが認知されている。 However, it is recognized also function other functional groups such as bromo site or iodoacetyl site. RNA分子については、センス鎖の5'末端又はアンチセンス鎖の5'末端が1−O−ジメトキシトリチル−へキシル−ジスルフィドリンカで官能化される。 The RNA molecule, the 5 'end of the end or the antisense strand 5' of the sense strand 1-O-dimethoxytrityl - is functionalized with a disulfide linker - hexyl.

RNAオリゴを、2mLのバッファA(20mMTris−HCl、pH6.8、50%ホルムアミド)を添加した水0.5mLに溶解した。 The RNA oligos buffer A (20mMTris-HCl, pH6.8,50% formamide) of 2mL dissolved in water 0.5mL was added. 続いてポリペプチドPN277を添加して析出物を形成させ、さらに2MのTEAAバッファ1mLを加えて析出物を溶解した。 Then to form a precipitate by the addition of polypeptide PN277, was dissolved precipitate further adding TEAA buffer 1mL of 2M. 反応が完了した時点で溶媒を減圧留去し、得られた固体をバッファA(20mMTris−HCl、pH6.8、50%ホルムアミド)中に溶解した。 The solvent When the reaction was complete was distilled off under reduced pressure, and dissolved the resulting solid buffer A (20mMTris-HCl, pH6.8,50% formamide) in. その物質をAmersham Rersource Qカラムへローディングし、5カラム分の体積のバッファAを用いて6mL/分で洗浄した。 Loading the material to Amersham Rersource Q column was washed with 6 mL / min using a buffer A for 5 column fraction volume. 分離は、15カラム分の体積のバッファB(20mMTris−HCl、pH6.8、50%ホルムアミド、1M NaCl)を用い、6mL/分で15から60%の直線勾配を流すことで完了した。 Separation, 15 column fraction of the volume of buffer B (20mMTris-HCl, pH6.8,50% formamide, 1M NaCl) was used to complete by flowing a linear gradient of 15 to 60% 6 mL / min. 精製した抱合体を、slidalyzer透析カセット(3.5K MWCO)を用いてPBSに対して脱塩した。 The purified conjugate was desalted against PBS using slidalyzer dialysis cassette (3.5K MWCO). 抱合体の量は、λ=260nmでのモル吸光度係数の算出値に基づいて分光測定により定量した。 The amount of the conjugate was determined by spectrophotometry based on the calculated value of the molar extinction coefficient at lambda = 260 nm. RP−HPCLによるこの抱合体の純度の分析を以下に示す。 RP-HPCL by showing the analysis of the purity of the conjugate below.

ポリペプチドと抱合したアンチセンスRNA鎖と、それと相補的なセンスRNA鎖とを、50mM酢酸カリウム、1mM酢酸マグネシウム、及び15mMのHEPES(pH7.4)でアニーリングさせ、90℃で2分間加熱し、続いて37℃で1時間インキュベートした。 An antisense RNA strand conjugated with polypeptides therewith and a complementary sense RNA strand, 50mM potassium acetate, magnesium 1mM acetic acid, and allowed to anneal in 15mM of HEPES (pH 7.4), heated for 2 minutes at 90 ° C., followed by 1 hour at 37 ° C.. 二本鎖RNA抱合体の形成を、非変性(15%)ポリアクリルアミドゲル電気泳動及び臭化エチジウム染色により確認した。 The formation of double-stranded RNA conjugate was confirmed by non-denaturing (15%) polyacrylamide gel electrophoresis and ethidium bromide staining.

本発明のsiRNA/ポリペプチド抱合体の例を実施例3に示す。 Examples of siRNA / polypeptide conjugates of the present invention shown in Example 3.

抱合体調製例1:以下の構造を有するペプチドPN277(H2B13−48)(配列番号37)とアンチセンス鎖CN950asen(N163asen)(配列番号60)の5'末端との抱合体 Conjugate Preparation Example 1: The following peptides having the structure PN277 (H2B13-48) conjugate with the 5 'end (SEQ ID NO: 37) and antisense strand CN950asen (N163asen) (SEQ ID NO: 60)
オリゴCN950asenを、2mLのバッファA(20mMTris−HCl、pH6.8、50%ホルムアミド)を添加した水0.5mLに溶解した。 Oligo CN950asen, buffer A (20mMTris-HCl, pH6.8,50% formamide) of 2mL dissolved in water 0.5mL was added. 続いてペプチド(PN0277)を添加して析出物を形成させ、さらに2MのTEAAバッファ1mLを加えて析出物を溶解した。 Subsequently peptide (PN0277) and to form a precipitate added to dissolve the precipitate further adding TEAA buffer 1mL of 2M. 反応が完了した時点で溶媒を減圧留去し、得られた固体をバッファA(20mMTris−HCl、pH6.8、50%ホルムアミド)中に溶解した。 The solvent When the reaction was complete was distilled off under reduced pressure, and dissolved the resulting solid buffer A (20mMTris-HCl, pH6.8,50% formamide) in. その物質をAmersham Resource Qカラムへローディングし、5カラム分の体積のバッファAを用いて6mL/分で洗浄した。 Loading the material to Amersham Resource Q column was washed with 6 mL / min using a buffer A for 5 column fraction volume. 分離は、15カラム分の体積のバッファB(20mMTris−HCl、pH6.8、50%ホルムアミド、1M NaCl)を用い、6mL/分で15から60%の直線勾配を流すことで完了した。 Separation, 15 column fraction of the volume of buffer B (20mMTris-HCl, pH6.8,50% formamide, 1M NaCl) was used to complete by flowing a linear gradient of 15 to 60% 6 mL / min. 精製した抱合体を、slidalyzer透析カセット(3.5K MWCO)を用いてPBSに対して脱塩した。 The purified conjugate was desalted against PBS using slidalyzer dialysis cassette (3.5K MWCO). 抱合体の量は、λ=260nmでのモル吸光度係数の算出値に基づいて分光測定により定量した。 The amount of the conjugate was determined by spectrophotometry based on the calculated value of the molar extinction coefficient at lambda = 260 nm. 抱合体の純度はRP−HPCLによって確認した。 The purity of the conjugates was confirmed by RP-HPCL. ペプチド抱合体のアンチセンス鎖と、相補的なアンチセンス鎖とを、50mM酢酸カリウム、1mM酢酸マグネシウム、及び15mMのHEPES(pH7.4)中でアニーリングさせ、90℃で2分間加熱し、続いて37℃で1時間インキュベートした。 And an antisense strand of the peptide conjugate, and a complementary antisense strand, 50mM potassium acetate, magnesium 1mM acetic acid, and allowed to anneal in HEPES (pH 7.4) of 15 mM, were heated 2 minutes at 90 ° C., followed by incubated for 1 hour at 37 ° C.. 二本鎖RNA抱合体の形成を、非変性(15%)ポリアクリルアミドゲル電気泳動及び臭化エチジウム染色により確認した。 The formation of double-stranded RNA conjugate was confirmed by non-denaturing (15%) polyacrylamide gel electrophoresis and ethidium bromide staining.

抱合体調製例2:上述の抱合体調製例1の方法及び手順を用いて以下の抱合体を合成した。 Conjugate Preparation Example 2: was synthesized following conjugates using the methods and procedures conjugate Preparation Example 1 above.

以下の構造を有するペプチドPN277(配列番号37)とオリゴCN952sen(N163sen)(配列番号59)との抱合体 Conjugates of the following peptides having the structure PN277 (SEQ ID NO: 37) oligo CN952sen (N163sen) (SEQ ID NO: 59)

以下の構造を有するペプチドPN277とオリゴCN740sen(配列番号63)との、ダイザの基質である27−merの抱合体 With a peptide PN277 and oligo CN740sen (SEQ ID NO: 63) having the following structure, conjugates of 27-mer which is a substrate of the pedestal

以下の構造を有するペプチドPN277とオリゴCN741asen(配列番号64)との、ダイザの基質である29−merの抱合体 With a peptide PN277 and oligo CN741asen (SEQ ID NO: 64) having the following structure, conjugates of 29-mer which is a substrate of the pedestal

細胞及び細胞培養 Cells and cell culture
マウス尾線維芽細胞はC57BL/6Jマウス又はtg197hTNF−αトランスジェニックマウスの尾から得た。 Mouse tail fibroblasts were obtained from the tail of C57BL / 6J mice or tg197hTNF-α transgenic mice. 尾を切り離し、剃刀の刃で切って小片とした。 Disconnect the tail, it was a small piece cut with a razor blade. この小片をPBSで3回洗浄した後、0.5mg/mlのコラゲナーゼ、100ユニット/mlのペニシリン、及び100μg/mlのストレプトマイシンと共に37℃で振とう器中でインキュベートして組織を破壊した。 After the pieces were washed 3 times with PBS, and disrupted the 0.5 mg / ml of collagenase, 100 units / ml penicillin, and 100 [mu] g / ml streptomycin and incubated to tissue in a shaker at 37 ° C. with. 次に尾の小片を補助剤(上記の通り)含有DMEM培地中で培養した。 Then the small piece of tail aids were cultured in (As described above) containing DMEM medium. 9L/lacZ細胞は恒常的にLacZを発現するラット膠肉腫維芽細胞であり、ATCC(#CRL−2200)より入手してこれも補助剤(上記の通り)含有DMEM培地中で培養した。 9 L / lacZ cells are rat gliosarcoma fibroblasts expressing constitutively LacZ, which were also cultured in DMEM medium containing supplements (as above) was obtained from ATCC (# CRL-2200).

単離したヒト単球は、4mMのL−グルタミン、非必須アミノ酸、及び10%ウシ胎児血清含有イスコフ改変ダルベッコ培地(IMDM)中で保持した。 Isolated human monocytes were held 4mM L- glutamine, in a non-essential amino acids, and 10% fetal bovine serum-containing Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM). マウス尾線維芽細胞(MTF)は、1mMのピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、及び20%ウシ胎児血清の補助剤含有ダルベッコ改変必須培地(DMEM)中で保持した。 Mouse tail fibroblast (MTF) were held 1mM sodium pyruvate, nonessential amino acids, and 20% fetal bovine serum in adjuvant containing Dulbecco's modified essential medium (DMEM). 細胞はすべて、100ユニット/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン、及び0.25mg/mlのFungizone(Invitrogen社、カリフォルニア州、カールズバッド)を含む抗生物質混合物を補充し、37℃、5%CO 下で培養した。 All cells, 100 units / ml penicillin, 100 [mu] g / ml streptomycin, and 0.25 mg / ml of Fungizone supplemented (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) antibiotic mixture comprising, 37 ℃, 5% CO 2 They were cultured under.

ヒト単球の単離および精製 Isolation and purification of human monocytes
健康な提供者からのヒトの新鮮血サンプルをGolden West Biologicals社(カリフォルニア州、テメキュラ)より購入した。 Fresh blood sample the Golden West Biologicals, Inc. of the person from healthy donors (California, Temecula) was purchased from. 単球の単離のために、血液サンプルは入手後直ちにPBSにより1:1の比率で希釈した。 For isolation of monocytes, blood samples by immediately PBS upon obtainment was diluted 1: 1 ratio. まず全血から末梢血液単核細胞(PBMC)をFicoll(Amersham社、ニュージャージー州、ピスカタウェイ)勾配法により単離した。 First whole blood from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) Ficoll was isolated by (Amersham, Inc., Piscataway, NJ) gradient method. さらにMiltenyiCD14ポジティブ選別キット(MILTENYI BIOTEC GmbH社、ドイツ)を用い、製造元の説明書に従って単球をPBMCから分離した。 Further MiltenyiCD14 positive selection kit (MILTENYI BIOTEC GmbH Co., Germany) using monocytes isolated from PBMC according to the manufacturer's instructions. 単球試料の純度は、細胞を抗CD14抗体(BD Biosciences社、カリフォルニア州、サンノゼ)で染色後、フローサイトメトリで評価したところ95%超であった。 The purity of the monocyte samples, cells were stained with anti-CD14 antibody (BD Biosciences, Inc., San Jose, California) after staining with was 95% was evaluated by flow cytometry. 精製したヒト単球は導入及びノックダウンアッセイの前に、完全培地(上述)中で一晩保持した。 Purified human monocytes prior to introduction and knockdown assays were held overnight in complete medium (described above).

ヒト単球の活性化 Activation of human monocytes
0.1乃至1.0ng/mlのリポ多糖、LPS(Sigma社、ミズーリ州、セントルイス)を細胞培養液に添加して腫瘍壊死因子−α(TNF−α)の生成を刺激することにより、ヒト単球の活性化を行った。 0.1 to 1.0 ng / ml of lipopolysaccharide, LPS (Sigma Corp., St. Louis, MO) by the addition of the cell culture to stimulate the production of tumor necrosis factor -α (TNF-α), human the activation of monocytes was carried out. 細胞はLPSと共に3時間インキュベートした後に回収し、Quantigeneアッセイ(Genospectra社、カリフォルニア州、フリーモント)を用いて製造元の説明書に従ってmRNAレベルを測定した。 Cells were harvested after 3 hours of incubation with LPS, Quantigene assay (Genospectra, Inc., California, Fremont) mRNA levels were measured according to the manufacturer's instructions. 導入後のTNF−αレベルの変化は、ELISA(BD Biosciences社、カリフォルニア州、サンノゼ)を用いて製造元のプロトコルに従って測定した。 Changes in TNF-alpha levels after introduction, ELISA was measured according to (BD Biosciences, Inc., San Jose, California) manufacturer's protocol using the.

mRNA(bDNA)及びタンパク質(ELISA)のためのヒトTNF−αノックダウンアッセイ Human TNF-alpha knockdown assay for mRNA (bDNA) and protein (ELISA)
TNF−αノックダウン実験のために、単球を、OptiMEM(Invitrogen社、米国、カールズバッド)を用いた96ウェルプレート中へ、100K細胞/100μl/ウェルで播種した。 For TNF-alpha knockdown experiments, monocytes, OptiMEM (Invitrogen Corp., Carlsbad, USA) into 96 well plates with were seeded at 100K cells / 100 [mu] l / well. ペプチドとsiRNAをOptiMEM中で5分間複合体化させ、次にウシ胎児血清(FBS)を複合体に添加してFBS最終濃度を3%とした。 The peptide and siRNA was 5 minutes complexed in OptiMEM, was 3% FBS final concentration followed by addition of fetal bovine serum (FBS) to the complex. Lipofectamine 2000(Invitrogen社、カリフォルニア州、カールズバッド)による細胞のトランスフェクションについては、製造元のプロトコルに従った。 Lipofectamine 2000 (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) for the transfection of cells with is, according to the manufacturer's protocol. トランスフェクションはすべて、細胞を37℃、5%CO 下で3時間インキュベートし、続いてトランスフェクション試薬を除去し、完全培地を補充して一晩培養することで行った。 All transfections, cells 37 ° C., 3 hours incubation under 5% CO 2, followed by removal of the transfection reagent was performed by culturing overnight supplemented with complete medium. bDNAアッセイ(Quantigene assay、Genospectra社、カリフォルニア州、フリーモント)は、製造元の説明書に従って行った。 bDNA assay (Quantigene assay, Genospectra, Inc., California, Fremont) was carried out according to the manufacturer's instructions. ELISAアッセイについては、細胞培地から採取したサンプルをそのまま使用した。 The ELISA assay was used as a sample taken from the cell culture medium. トランスジェニックマウスを用いた実験の分析に関しては、血漿サンプルを眼窩採血で採取した全血から分離した。 For the analysis of the experiments with transgenic mice were separated plasma samples from whole blood collected in orbital bleeding. hTNF−αの血漿中レベルを、ELISAにより、1:2の希釈で製造元の説明書(R&D systems社、ミネソタ州、ミネアポリス)に従って定量した。 Plasma levels of hTNF-alpha, by ELISA, 1: 2 in the manufacturer's instructions with dilute (R & D systems Inc., Minneapolis, MN) was determined according to.

フローサイトメトリ Flow cytometry
フローサイトメトリ分析は、Beckman社のCoulter FC500セルアナライザー(カリフォルニア州、フラートン)を用いて行った。 Flow cytometry analysis, Beckman's Coulter FC500 cell analyzer (Fullerton, CA) was performed using. 装置は、用いた蛍光プローブ(siRNAにはFAM又はCy5、CD14にはFITC又はPE)に合わせて調節した。 Apparatus (the siRNA in FAM or Cy5, CD14 FITC or PE) fluorescent probes used were adjusted for. 細胞生存率及び細胞毒性の指標として、ヨウ化プロピジウム(Fluka社、ミズーリ州、セントルイス)及びアネキシンV(BD Biosciences社、カリフォルニア州、サンノゼ)を用いた。 As an indicator of cell viability and cytotoxicity, propidium iodide (Fluka, Inc., St. Louis, MO) and annexin V (BD Biosciences, Inc., San Jose, California) was used.

ダイザ媒介siRNA分解アッセイ Pedestal mediated siRNA degradation assay
siRNA及びsiRNA/ポリペプチド抱合体をダイザエンドヌクレアーゼ(Stratagene社、カタログ番号240100)と共にインキュベートし、これらが分解されやすいかどうかを調べた。 siRNA and siRNA / polypeptide conjugate die The endonuclease (Stratagene, Inc., Cat # 240100) and incubated with, we investigated whether they susceptible to degradation. 製造元のプロトコルに従った。 According to the manufacturer's protocol. 簡潔に述べると、分解反応は全体積10μLで行い、37℃で一晩インキュベートした。 Briefly, the decomposition reaction is carried out in a total volume 10 [mu] L, and incubated overnight at 37 ° C.. 一晩のインキュベーション後、分解混合物のサンプル2μLを2×ローディング色素(loading dye)と混合し、尿素含有15%TBE及び15%TBEによる非変性ポリアクリルアミドゲルでのゲル電気泳動で分析した。 After overnight incubation, the samples 2μL decomposition mixture is mixed with 2 × loading dye (loading dye), and analyzed by gel electrophoresis under non-denaturing polyacrylamide gels by urea containing 15% TBE and 15% TBE.

LC−MSによるRNAのダイザ分解のモニタリング Monitoring of the pedestal degradation of RNA by LC-MS
LC−MSは、2.5μm、2.1×50mmのXTerra C18カラム(Waters Corp.社)を用いて65℃で行った。 LC-MS is, 2.5 [mu] m, was carried out at 65 ° C. using a XTerra C18 column 2.1 × 50mm (Waters Corp., Inc.). 移動相は、100mMヘキサフルオオロイソプロパノール及び7mMトリエチルアミンであり、溶出は100%メタノールで行った。 Mobile phase was 100mM hexafluoride Oro isopropanol and 7mM triethylamine, elution was performed with 100% methanol. 勾配は、40分間で5から16%とした。 The gradient was 16% from 5 to 40 minutes. 溶出液はPDA中へ分割し、Waters社のシングル四重極型質量分析器Micromass ZQ ESIを負イオンモードで作動させた。 The eluate was divided into PDA, it was activated by Waters single quadrupole mass spectrometer Micromass ZQ ESI in the negative ion mode. キャピラリー電圧は3.0kV、コーン電圧は45Vであった。 The capillary voltage 3.0kV, cone voltage was 45V. 脱溶媒は600L/hの窒素中、300℃で行った。 Removing the solvent in a nitrogen of 600L / h, it was carried out at 300 ℃. イオン源は90℃に維持した。 The ion source was maintained at 90 ° C.. 測定用のスキャン速度は1秒あたり1000乃至2000m/zであった。 Scan speed for measurement was 1000 to 2000 m / z per second.

実施例2 Example 2
hTNF−αノックダウン活性のためのスクリーニングされたダイザエンドヌクレアーゼ基質siRNA screened die The endonuclease substrate siRNA for hTNF-α knockdown activity
本実施例では、hTNF−α遺伝子発現レベルを効果的に低下させるためにスクリーニングされた本発明の典型的siRNAを例示する。 In this embodiment, it illustrates an exemplary siRNA of the invention were screened in order to reduce the hTNF-alpha gene expression levels effectively. hTNF−α遺伝子は、ヒトやその他の哺乳類の対象中で過剰発現すると関節リウマチ(RA)の発症と進行を媒介することが示唆されているため、これを標的とすることは重要である。 hTNF-alpha gene, because when overexpressed in human or other mammalian subject to mediate the onset and progression of rheumatoid arthritis (RA) has been suggested, it is important to do this targeting. 従って、hTNF−α遺伝子を標的にしてその発現を低下させることは、RAの治療に役立てることができる。 Thus, reducing its expression by the hTNF-alpha gene targeting can be useful in the treatment of RA.

最近の研究結果により、25乃至30ヌクレオチドの長さのRNA二重鎖が、標的遺伝子の発現レベルの低下に関して、対応するより短いRNA二重鎖と比べて最大100倍の効果を有することが示唆されている。 Recent studies, suggested to have 25 to 30 nucleotides in length of RNA duplex, with respect to reduction of target gene expression level, up to 100 times more effective compared to short RNA duplexes than the corresponding It is. このようにノックダウン活性が向上するのは、これらの長鎖siRNA二重鎖がダイザエンドヌクレアーゼ(RNAseIII)の基質であるという事実に起因する。 This to improved knockdown activity as these long-chain siRNA duplex is due to the fact that is a substrate of the die The endonuclease (RNAse III). 以下の表3に、長さが21乃至27ヌクレオチドのsiRNA二重鎖を示す。 Table 3 below shows the siRNA duplexes are 21 to 27 nucleotides in length. YC12及びN161からN164は、hTNF−α遺伝子の配列特異的な転写後ジーンサイレンシングのためにスクリーニングしたものである。 From YC12 and N161 N164 is obtained by screening for sequence-specific post-transcriptional gene silencing of hTNF-alpha gene. この最初のスクリーニングプロセスには、Lipofectamine 2000(Invitrogen社、カリフォルニア州、カールズバッド)を用いて表3に挙げた個々のsiRNAをLPSで刺激したヒト単球中へトランスフェクトすることも含まれていた。 The initial screening process, Lipofectamine 2000 (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) was also included transfecting individual siRNA listed in Table 3 to the human monocytes which had been stimulated with LPS with.

表3に挙げたYC12及びN161からN164の配列は、5'−3'のセンス鎖(上)及び3'−5'のアンチセンス鎖(下)である。 Sequences N164 from YC12 and N161 listed in Table 3 is a 5'-3 'sense strand (top) and 3'-5' antisense strand (bottom).

YC12及びN161からN164の各配列は、Lipofectamine 2000(Invitrogen社、カリフォルニア州、カールズバッド)を用いて、0.16nM、0.8nM、4nM、及び20nMの各濃度でトランスフェクトした。 Each sequence from YC12 and N161 N164 is, Lipofectamine 2000 (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) using, 0.16 nM, 0.8 nM, were transfected with each concentration of 4 nM, and 20 nM. 各siRNAのTNF−αノックダウン活性をパーセント表示で表4にまとめた。 They are summarized in Table 4 in the percentage of TNF-alpha knockdown activity of each siRNA. Qnegは、ランダムsiRNA配列であり、ネガティブコントロールとした。 Qneg is a random siRNA sequence, as a negative control. 観察されたQnegによるノックダウン活性を100%(遺伝子発現レベル100%)の基準とし、各siRNAのノックダウン活性をこのネガティブコントロールに対する相対パーセントで表した。 The knockdown activity by observed Qneg a reference of 100% (100% gene expression levels) were expressed knockdown activity of each siRNA a relative percentage of the negative control. 表4のデータは、N161、N162及びN164のsiRNAが、QnegのsiRNAネガティブコントロールと比較してTNF−α mRNAレベルに対して有意の影響を与えなかったことを示している。 The data in Table 4, N161, N162 and N164 of the siRNA indicates that did not have a significant effect against compared to TNF-alpha mRNA levels with siRNA negative control Qneg. 対照的に、Y12のsiRNAは、TNF−α mRNAレベルをネガティブコントロールQnegの66%まで低下させ、N163のsiRNAは、mRNAレベルをネガティブコントロールQnegの57%まで低下させた。 In contrast, siRNA of Y12 reduces the TNF-alpha mRNA levels to 66% of the negative control Qneg, siRNA of N163 reduced the mRNA level to 57% of the negative control Qneg.

表4のデータは、ダイザ基質siRNAであるN163とYC12が、ヒト単球中のhTNF−α mRNAレベルを効果的に低下させたことを示している。 The data in Table 4 is the base substrate siRNA N163 and YC12 have shown that effectively reduced hTNF-alpha mRNA levels in human monocytes. N163のsiRNAを選択してさらなる特性分析を行った。 Was further characteristic analysis by selecting the N163 of siRNA.

実施例3 Example 3
siRNA/ポリペプチド抱合体によるヒト単球中hTNF−α mRNAレベルの効果的な低下 Effective reduction of siRNA / human monocytes in accordance polypeptide conjugate hTNF-alpha mRNA levels
本例は、本発明の典型的なダイザ基質siRNAが、本発明の典型的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドと抱合した場合に、hTNF−α mRNAの発現レベルを効果的に低下させたことを示すものである。 This example shows that the typical pedestal substrate siRNA of the present invention, if conjugated with typical polynucleotide delivery-enhancing polypeptides of the present invention, effectively reduced the expression levels of hTNF-alpha mRNA it is intended. siRNA/ポリペプチド抱合体のノックダウン活性を以下の表5にまとめた。 The knockdown activity of siRNA / polypeptide conjugate are summarized in Table 5 below.

実施例2の表4に示したデータによると、Lipofecamine 2000(Invitrogen社、カリフォルニア州、カールズバッド)でトランスフェクトされた場合に、N163のsiRNAがhTNF−α mRNAレベルを効果的に低下させたことを示しており、従ってこれは、TNF−αと関連する1若しくは2種類以上の炎症状態を治療及び/又は予防するのに優れた候補物質である。 According to the data shown in Table 4 in Example 2, Lipofecamine 2000 (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) when transfected with, that siRNA of N163 is effectively reduced hTNF-alpha mRNA levels It is shown and which therefore is an excellent candidate material for the treatment and / or prevention of one or two or more types of inflammatory conditions associated with TNF-alpha. しかし、カチオン性脂質は細胞毒性を示す場合があり、従って疾患治療におけるインビボでの送達用途には適さない。 However, the cationic lipid may indicate cytotoxicity, therefore not suitable for delivery applications in vivo in disease treatment. 従って、このカチオン性脂質媒介による送達の欠点を克服するため、本発明の典型的siRNAであるN163を、送達媒体として用いた時に細胞毒性効果が最小限乃至ゼロであるポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドと抱合させた。 Thus, this in order to overcome the disadvantages of the cationic lipid-mediated delivery by a typical siRNA in which N163 of the present invention, the polynucleotide delivery cytotoxic effect is minimal to zero when used as delivery vehicles It was conjugated. 送達ポリペプチドをダイザ基質型(27−mer)であるsiRNA配列と抱合させることにより、RISCへのローディングの前にsiRNAからポリペプチドを除去することができ、従ってポリペプチドがRISC活性を阻害する可能性を低減できる。 By delivery polypeptide conjugated with siRNA sequences are base-substrate (27-mer), it can be removed polypeptide from siRNA prior to loading into RISC, thus enabling the polypeptide to inhibit RISC activity it is possible to reduce the gender. 実際、これらの抱合体は、プロセッシングを受けると所望の標的遺伝子の効果的なノックダウンを媒介するsiRNA前駆体を効率的に細胞質内へ送達する。 In fact, these conjugates deliver siRNA precursor that mediate effective knockdown of the desired target gene and subjected to processing to efficiently cytoplasm.

本発明の典型的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチド(PN277)は、ヒトのヒストン2B(H2B)タンパク質のアミノ酸配列から誘導し、その一次構造は以下の通りである。 Typical polynucleotide delivery-enhancing polypeptides of the invention (PN277) is derived from human histone 2B (H2B) the amino acid sequence of the protein, its primary structure is as follows.

PN277 PN277
NH2−KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ−アミド(配列番号37) NH2-KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ- amide (SEQ ID NO: 37)

抱合体は、本発明の典型的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドPN277を、本発明の典型的siRNAであるN163のセンス鎖の5'末端又はアンチセンス鎖の5'末端へ共有結合させることで作製した。 Conjugates produced by causing typical polynucleotide delivery-enhancing polypeptides PN277, covalently linked to the 5 'end of the end or the antisense strand 5' of the sense strand of a typical siRNA in which N163 of the present invention of the present invention did. siRNA/ポリペプチド抱合体の例は以下の通りである。 Examples of siRNA / polypeptide conjugate is as follows.

siRNAであるN163のアンチセンス鎖の5'末端へポリペプチドPN277を抱合させた(dsCoP277nfR950;配列番号37及び35)。 To 5 'end of the antisense strand of an siRNA N163 was conjugated polypeptide PN277 (dsCoP277nfR950; SEQ ID NO: 37 and 35). siRNAであるN163のセンス鎖は図示していない。 The sense strand of an siRNA N163 is not shown.

siRNAであるN163のセンス鎖の5'末端へポリペプチドPN277を抱合させた(dsCoP277nfR952;配列番号37及び36)。 To 5 'end of the sense strand of an siRNA N163 was conjugated polypeptide PN277 (dsCoP277nfR952; SEQ ID NO: 37 and 36). siRNAであるN163のアンチセンス鎖は図示していない。 The antisense strand of an siRNA N163 is not shown.

本発明でネガティブコントロールとして用いるQnegのsiRNAのセンス鎖の5'末端へポリペプチドPN277を抱合させたものは図示していない。 The polypeptide PN277 to 5 'end of the sense strand of siRNA Qneg used as a negative control in the present invention that is conjugated is not shown.

この実施例では、Qneg siRNA/ポリペプチド抱合体を含む上述の各siRNA/ポリペプチド抱合体は、1nM、10nM、100nM、及び200nMの濃度で、ヒト単球と共にインキュベートした。 In this embodiment, Qneg siRNA / polypeptide comprising a conjugate described above each siRNA / polypeptide conjugates of, 1 nM, 10 nM, 100 nM, and at a 200nM concentration, were incubated with human monocytes. 各siRNA/ポリペプチド抱合体のTNF−αノックダウン活性をパーセント表示で表5にまとめた。 It is summarized in Table 5 percentage of TNF-alpha knockdown activity of each siRNA / polypeptide conjugate. 観察されたQnegによるノックダウン活性を100%(遺伝子発現レベル100%)の基準とし、各siRNAのノックダウン活性をこのネガティブコントロールに対する相対パーセントで表した。 The knockdown activity by observed Qneg a reference of 100% (100% gene expression levels) were expressed knockdown activity of each siRNA a relative percentage of the negative control.

表5のデータは、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドと抱合したsiRNA二重鎖N163が、siRNA分子N163のセンス鎖の5'末端への共有結合又はアンチセンス鎖の5'末端への共有結合に関係なく、hTNF−α mRNA発現レベルを効果的に低下させたことを示している。 The data in Table 5, polynucleotide delivery-enhancing polypeptides conjugated with siRNA duplexes N163 is, 'covalent or 5 of the antisense strand of the' end relationship covalent bond to the ends 5 of the sense strand of the siRNA molecule N163 without shows that effectively reduced hTNF-alpha mRNA expression levels. より具体的には、siRNA/ポリペプチド抱合体であるdsCoP277nfR952は、hTNF−α mRNAレベルをQneg/ポリペプチド抱合体ネガティブコントロールのmRNAレベルの62%まで低下させ、dsCoP277nfR950は、hTNF−α mRNAレベルをQneg/ポリペプチド抱合体ネガティブコントロールのmRNAレベルの38%まで低下させた。 More specifically, a siRNA / polypeptide conjugate dsCoP277nfR952 reduces the hTNF-alpha mRNA levels to 62% of the Qneg / polypeptide conjugate negative control mRNA levels, DsCoP277nfR950 is a hTNF-alpha mRNA levels to 38% of the Qneg / polypeptide conjugate negative control mRNA level decreased.

表5に示すデータは驚くべき予期せぬ発見であり、本発明の典型的なダイザ基質siRNAが、本発明の典型的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドと抱合されると、hTNF−α mRNAの発現レベルを効果的に低下させたことを示している。 Data shown in Table 5 are discovered unexpected surprising, typical pedestal substrate siRNA is typical when it is conjugated with polynucleotide delivery, expression of hTNF-alpha mRNA of the present invention of the present invention It indicates that the level was effectively lowered. さらに、抱合体のノックダウン活性は、リポフェクタミンによって送達された同じsiRNAが示したノックダウン活性を上回った。 Moreover, knockdown activity of the conjugate, exceeded knockdown activity shown the same siRNA delivered by lipofectamine.

実施例4 Example 4
ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドと抱合したsiRNAのダイザエンドヌクレアーゼによるプロセッシング Processing by die The endonuclease siRNA conjugated with polynucleotide delivery
この実施例は、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドと抱合したsiRNAが、ダイザエンドヌクレアーゼ(RNaseIII)によって分解されることを示すものである。 This embodiment, siRNA conjugated with polynucleotide delivery is intended to indicate that is decomposed by the die The endonuclease (RNase III). 本例では、実施例3で示した3種類のsiRNA/ポリペプチド抱合体(Qneg、dsCoP277nfR950、及びdsCoP277nfR952)を、ダイザエンドヌクレアーゼの存在下又は非存在下でインキュベートした。 In this example, three types of siRNA / polypeptide conjugate shown in Example 3 (Qneg, dsCoP277nfR950, and DsCoP277nfR952), were incubated in the presence or absence of the die The endonuclease. さらに、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドのないsiRNA二重鎖N163も、ダイザエンドヌクレアーゼの存在下又は非存在下でインキュベートした。 Moreover, polynucleotide delivery-free siRNA duplexes N163 were also incubated in the presence or absence of the die The endonuclease. 目的は、siRNAがダイザによる分解の標的であるかどうか、及びポリペプチドによるsiRNA RISCのローディング阻害を防ぐために不可欠である、共有結合しているsiRNA二重鎖からのポリペプチドの除去が行われるかどうか、を調べることであった。 Or purpose, siRNA whether a target for degradation by the pedestal, and is essential to prevent the loading inhibition of siRNA RISC by a polypeptide, removal of the polypeptide from the siRNA duplexes are covalently bonded is performed It was to investigate whether, the. RISC複合体を阻害すると、標的遺伝子の転写後ジーンサイレンシングを妨げることになる。 Inhibition of the RISC complex, would prevent gene silencing after transcription of target genes.

ポリアクリルアミドゲルの電気泳動による比較を図1に示す。 Comparison by polyacrylamide gel electrophoresis is shown in Figure 1. 図1では、ダイザなしのインキュベーション及びダイザありのインキュベーションの両方で、Qneg siRNA/ポリペプチド抱合体が分子量の等しい「シャープな」バンドで移動しており、これは予想通り、Qneg siRNA/ポリペプチド抱合体がダイザエンドヌクレアーゼの存在下でも非存在下でも分解しなかったことを示している。 In Figure 1, both of incubation there incubation and the pedestal without base, Qneg siRNA / polypeptide conjugate is moving at a molecular weight equal "sharp" band, which is expected, Qneg siRNA / polypeptide Idaku coalescence shows that did not degrade even under non-existent even in the presence of die the endonuclease. 本発明の典型的なN163 siRNA(ポリペプチドなし)は、ダイザエンドヌクレアーゼの非存在下ではポリアクリルアミドゲル上を「シャープな」バンドで移動した。 Typical N163 siRNA of the present invention (no polypeptide), in the absence of die. The endonuclease was moved on polyacrylamide gels in the "sharp" band. しかし、ダイザでインキュベートした場合、ダイザでインキュベートしていないN163 siRNAと比べてわずかに分子量の小さいバンドで示されるように、わずかに短いN163 siRNA二重鎖が観察された。 However, when incubated in the pedestal, as shown in the non-incubated N163 siRNA as compared to a slightly smaller band of molecular weight in the base, slightly shorter N163 siRNA duplexes was observed. アンチセンス鎖の5'末端でポリヌクレオチド送達促進ポリペプチド共有結合した典型的なsiRNA N163(dsCoP277nfR950)とセンス鎖の5'末端でポリヌクレオチド送達促進ポリペプチド共有結合した典型的なsiRNA N163(dsCoP277nfR952)との間で分解に違いが見られた。 'Typical siRNA N163 (dsCoP277nfR950) and 5 of the sense strand was terminated by polynucleotide delivery covalently linked' and end with polynucleotide delivery covalent typical siRNA N163 5 of the antisense strand (dsCoP277nfR952) the difference in degradation between was observed. ダイザの非存在下では、予想通りこのsiRNA/ポリペプチド抱合体は両方とも分子量に相当するはっきりしたバンドとして移動しており、分解されなかったことを示している。 In the absence of the pedestal, as expected the siRNA / polypeptide conjugate is moving as distinct bands corresponding to both the molecular weight, it indicates that the undecomposed. しかし、ダイザエンドヌクレアーゼの存在下では、dsCoP277nfR952(センス鎖結合)は二本の異なる分子量のバンドを示した。 However, in the presence of the die The endonuclease, DsCoP277nfR952 (sense strand binding) showed a band of different molecular weights two. 一方のバンドの分子量は分解されていないdsCoP277nfR952に相当し、二本目のバンドはダイザで分解されたN163 siRNA(ポリペプチドなし)の分子量に相当し、このことは共有結合したN163 siRNAがポリペプチドから分離されたことを示している。 The molecular weight of one of the bands corresponds to dsCoP277nfR952 undegraded, two in band corresponds to a molecular weight of N163 siRNA decomposed by base (no polypeptide), this is N163 siRNA covalently bound a polypeptide indicating that separated. 高分子量側のバンド(すなわち非分解N163 siRNA/ポリペプチド)は低分子側のバンド(すなわち分解N163 siRNA/ポリペプチド)の約2倍の濃さであり、このことはdsCoP277nfR952(センス鎖結合)の大部分が分解されなかったことを示している。 High molecular weight side of the band (i.e. non-degraded N163 siRNA / polypeptide) is about 2 times the density of the low molecular side-band (i.e. degradation N163 siRNA / polypeptide), this is dsCoP277nfR952 of (sense strand binding) It shows that the majority was not degraded. 対照的に、非分解dsCoP277nfR950のサイズに相当するバンドが比較的薄く、ダイザで分解されたN163 siRNA(ポリペプチドなし)のサイズに相当する分子量のバンドの方が濃いことから分かるように、dsCoP277nfR950(アンチセンス鎖結合)はダイザによってより分解されやすいことを示した。 In contrast, non-degradable DsCoP277nfR950 band corresponding to the size of the relatively thin, as evidenced by dark found the following molecular weight bands corresponding to the size of the decomposed N163 siRNA (no polypeptide) at the base, DsCoP277nfR950 ( antisense strand binding) showed that susceptible to degradation more by the pedestal. siRNA/ポリペプチドdsCoP277nfR950(アンチセンス鎖結合)がdsCoP277nfR952(センス鎖結合)と比較して相対的にダイザによる分解をより受けやすいということは、dsCoP277nfR950(アンチセンス鎖結合;実施例2参照)で見られたより高いノックダウン活性と強い相関を示している。 siRNA / polypeptide DsCoP277nfR950 (antisense strand binding) that is DsCoP277nfR952 (sense strand binding) and more susceptible to degradation by relatively pedestal by comparison, dsCoP277nfR950; seen in (antisense strand bound see Example 2) shows high knockdown activity strongly correlated than was. siRNA/ポリペプチドがダイザによる分解を受けやすいということは、ポリペプチドによるRISC複合体の干渉の可能性が低減され、従って標的遺伝子のより高いサイレンシングを意味する。 That siRNA / polypeptide susceptible to degradation by pedestal possibility of interference RISC complex by the polypeptide is reduced, thus it means a higher silencing of the target gene.

このようなデータは、本発明のポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドと抱合した典型的なsiRNAがダイザによる分解を受けやすく、標的ジーンサイレンシングのために細胞へ治療用siRNA前駆体を効果的に送達する理想的な候補であることを示している。 Such data, typical siRNA conjugated with polynucleotide delivery-enhancing polypeptides of the invention susceptible to degradation by the pedestal, to effectively deliver therapeutic to a cell siRNA precursors for targeted gene silencing It shows that it is an ideal candidate.

siRNA N163はダイザエンドヌクレアーゼで分解されると21−merのRNAとなる。 siRNA N163 is made when it is decomposed in the die The endonuclease with the 21-mer of RNA. 図2は、非抱合siRNA N163二重鎖に対するRP−HPLCによるダイザエンドヌクレアーゼによるプロセッシングの動態解析を示す。 Figure 2 shows the kinetic analysis of the processing by the die The endonuclease by RP-HPLC against unconjugated siRNA N163 duplex. 図2(A)はプロセッシングなしのN163二重鎖に対するRP−HPLCを示す。 FIG. 2 (A) shows the RP-HPLC for N163 duplex without processing. 図2(B)から(E)は、ダイザエンドヌクレアーゼとそれぞれ(B)1時間、(C)2.5時間、(D)5時間、及び(E)7時間インキュベートしたN163二重鎖のRP−HPLCを示す。 2 from (B) (E) the die The endonucleases respectively (B) 1 hour, (C) 2.5 hours, (D) 5 hours, and (E) incubated N163 duplexes 7 hours It shows the RP-HPLC. これらのデータを図3にグラフで示す。 These data are shown graphically in Figure 3.

図2(E)に示すダイザエンドヌクレアーゼによりsiRNA N163を7時間分解した後のRNAの同一性を、図4に示すようにESI−MS分析で確認した。 The identity of the RNA after decomposing siRNA N163 for 7 hours by the die The endonuclease shown in FIG. 2 (E), confirmed by ESI-MS analysis as shown in FIG. 図4は、N163のダイザによる開裂産物である21−merのセンス鎖に相当する質量6606.6、及びN163のダイザによる開裂産物である21−merのアンチセンス鎖に相当する質量6965.7にピークを示している。 Figure 4 is a mass 6965.7 corresponding to the antisense strand cleavage product is a 21-mer by the corresponding mass 6606.6, and N163 of the pedestal to the sense strand cleavage product is a 21-mer by pedestal N163 It shows the peak.

抱合したsiRNA N163のダイザエンドヌクレアーゼによる分解後のRNAの同一性を、図5に示すようにESI−MS分析で確認した。 The identity of the RNA after degradation by die The endonuclease conjugated with siRNA N163, was confirmed by ESI-MS analysis as shown in FIG. 図5は、siRNA N163と抱合したポリペプチドPN857を有する抱合体化siRNAのダイザエンドヌクレアーゼによるプロセッシングのESI−MSを示す。 Figure 5 shows an ESI-MS of the processing by the die The endonuclease conjugated body of siRNA having a polypeptide PN857 conjugated with siRNA N163. 本発明の典型的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドPN857は、ヒトのヒストン2B(H2B)タンパク質のアミノ酸配列から誘導し、その一次構造は以下の通りである。 Typical polynucleotide delivery PN857 of the present invention derived from human histone 2B (H2B) the amino acid sequence of the protein, its primary structure is as follows.

PN857 PN857
Mal−KGSKKAVTKAQKKEGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ−アミド(配列番号52) Mal-KGSKKAVTKAQKKEGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ- amide (SEQ ID NO: 52)

ポリペプチドPN857は、N163 siRNAのアンチセンス鎖の5'末端で抱合させた。 Polypeptide PN857 was then conjugated at the 5 'end of the antisense strand of N163 siRNA.

図5(A)には、ダイザエンドヌクレアーゼ非存在下における抱合体二重鎖のコントロールインキュベーションを示した。 The FIG. 5 (A), the shown control incubation of the conjugate duplex in the die. The endonuclease absence. 図5(A)は、N163の27-ntのアンチセンス鎖とポリペプチドPN857との抱合体に相当する質量13436.2、及びN163の25-ntのセンス鎖に相当する質量7835.3にピークを示している。 FIG. 5 (A), peak mass 7835.3 corresponding to the sense strand of 25-nt of the corresponding mass 13436.2, and N163 to conjugate the antisense strand and polypeptides PN857 of 27-nt of N163 the shows.

図5(B)には、ダイザエンドヌクレアーゼ存在下における抱合体二重鎖の8時間のインキュベーションを示した。 Figure 5 (B) showed a 8 hours incubation of the conjugate duplex in the die. The endonuclease presence. 図5(B)は、N163の27-ntのアンチセンス鎖とポリペプチドPN857との抱合体に相当する質量13436.1、N163の25-ntのセンス鎖に相当する質量7835.6、27−merのN163抱合体のダイザによる開裂産物である21−merのアンチセンス鎖に相当する質量6966.3、及び25−merのN163のダイザによる開裂産物である21−merのセンス鎖に相当する質量6607.6にピークを示している。 FIG. 5 (B), the mass 13436.1 corresponding to conjugate with 27-nt antisense strand and polypeptides PN857 of N163, which corresponds to the sense strand of 25-nt of N163 mass 7835.6,27- mass corresponding to the sense strand of 21-mer is a cleavage product by the pedestal N163 of the corresponding mass 6966.3, and 25-mer antisense strand of 21-mer is a cleavage product by the pedestal N163 conjugate mer It shows a peak at 6607.6.

実施例5 Example 5
インターフェロン応答を誘起しないダイザ基質siRNA/ポリペプチド抱合体 Pedestal substrate siRNA does not induce interferon response / polypeptide conjugates
本実施例は、本発明の典型的なsiRNA/ポリペプチド抱合体が、ヒト単球とインキュベートされた場合にインターフェロン反応を誘起しないことを示すものである。 This embodiment, typical siRNA / polypeptide conjugate of the present invention, showing that no inducing the interferon response when incubated with human monocytes. インターフェロン反応性は、siRNAでトランスフェクトされた細胞に起こり得る副作用である。 Interferon reactivity, a side effect that may occur cells transfected with siRNA. 従って、siRNA/ポリペプチドdsCoP277nfR950(アンチセンス鎖結合)及びdsCoP277nfR952(センス鎖結合)がインターフェロン反応を誘起するかどうかを評価するためにインビトロでの実験を行った。 Therefore, siRNA / polypeptide DsCoP277nfR950 (antisense strand binding) and DsCoP277nfR952 (sense strand binding) was carried out in vitro experiments to evaluate whether to induce interferon response. Qneg siRNA/ポリペプチド抱合体(CoP840)をネガティブコントロールとし、インターフェロン−1(IFN−1)をポジティブコントロールとした。 Qneg siRNA / polypeptide conjugate (CoP840) as a negative control was interferon -1 (IFN-1) and positive control. 各抱合体は1nM、10nM、100nM、及び200nMの濃度で実験を行った。 Each conjugate was conducted 1nM, 10nM, 100nM, and the experiments 200nM concentrations. インターフェロン反応性のアッセイは分子マーカーMIP1αを用いて行った。 Interferon response of the assay was performed using molecular markers MIPl [alpha]. 予想通り、Qneg siRNA/ポリペプチド抱合体はMIP1αの発現を誘起せず、ポジティブコントロールであるIFN−1は大量のMIP1αの発現を誘起した。 As expected, Qneg siRNA / polypeptide conjugate does not induce the expression of MIP1α, IFN-1 is a positive control were induced the expression of large amounts of MIPl [alpha]. 抱合体dsCoP277nfR950及びdsCoP277nfR952は、Qneg siRNA/ポリペプチドのネガティブコントロールが誘起したMIP1αのレベルと同等であり、このことはこれらの抱合体が、有効なTNF−αのノックダウン活性を示す濃度(実施例3の表5参照)においてインターフェロン反応を誘起しないことを示している。 Conjugates dsCoP277nfR950 and dsCoP277nfR952 is equivalent to the level of MIP1α the negative control Qneg siRNA / polypeptide is induced, which these conjugates, concentration shows knockdown activity of active TNF-alpha (Example It indicates that no induce interferon response in see Table 5) 3.

実施例6 Example 6
24ウェルプレートを用いたベロ細胞トランスフェクション Vero cell transfection using a 24-well plate
この実施例は、siRNAを標的細胞へ導入する方法を開示するものである。 This embodiment is intended to disclose a method of introducing siRNA into target cells.

ベロ細胞は、10%FBS、2mLのL−グルタミン、10nMのHepes、及び100ユニット/mlのペニシリン/ストレプトマイシンを添加したDMEM培地で培養する。 Vero cells, 10% FBS, 2mL of L- glutamine, 10 nM of Hepes, and cultured in DMEM medium supplemented with 100 units / ml penicillin / streptomycin. トランスフェクションの一日前に、対数期にある培養ベロ細胞を24ウェルプレート中に50,000細胞/ウェルで播種する。 One day before transfection, seeded cultured Vero cells in log phase in 24-well plates at 50,000 cells / well. トランスフェクションの前に、すべてのsiRNA投与分に対してL2K(Lipofectamine(商標)2000、Invitrogen社)の適切なストック溶液を調製する。 Before transfection, prepare the appropriate stock solutions of all L2K respect siRNA administration component (Lipofectamine (TM) 2000, Invitrogen Corporation). L2KをOptiMEM(登録商標)細胞培地(Invitrogen社)中へゆっくり混合し、希釈したsiRNAに添加する。 Slowly mixed L2K to OptiMEM (TM) cell medium (Invitrogen) in is added to the diluted siRNA. この混合物を室温で15乃至30分間インキュベートし、トランスフェクション複合体を形成させる。 The mixture was incubated for 15 to 30 minutes at room temperature, to form a transfection complex. インキュベーションの最後に培養液の上清を吸引し、各ウェル中に10%FBSを含有するDMEM培養液150μlを添加する。 And finally aspirated supernatants culture of incubation, the addition of DMEM culture solution 150μl containing 10% FBS in each well. 次に、各トランスフェクション複合体150μlを各ウェルへ三つの系に重複して添加する。 Then added each transfection complex 150μl overlap into three systems to each well. プレートをゆっくり前後に振とうして混合させる。 Plates shaken to be mixed vibration slowly back and forth. 37℃で3時間インキュベートした後、上清を除去し、1mlの完全培地を各ウェルに添加する。 After incubation for 3 hours at 37 ° C., the supernatant was removed, the addition of complete medium 1ml into each well. Cy5−siRNAの検出には、細胞を一晩インキュベートし、顕微鏡下で蛍光を測定する。 The detection of cy5-siRNA, cells were incubated overnight, the fluorescence is measured under a microscope. 翌日、HoechstDNA染料を用い、1.5μlのHoechstストックを各ウェルへ添加することによって細胞を染色して毒性の検出を行う。 The next day, using the HoechstDNA dye, by staining the cells for detection of toxicity by the addition of Hoechst stock 1.5μl to each well. ウェルをゆっくり回転させ、37℃で15分間インキュベートする。 Slowly rotated the well and incubated for 15 minutes at 37 ° C.. 細胞の測定は、Cy5及びUVフィルターを用いて、蛍光顕微鏡により直ちに行うことができる。 Measurement of cells, using a Cy5 and UV filters, can be immediately performed by fluorescence microscopy. トランスフェクション化合物の毒性については、位相差顕微鏡を用いて細胞の測定を行う。 The toxicity of the transfection compound, to measure the cells using a phase contrast microscope.

実施例7 Example 7
血球凝集アッセイ(HAアッセイ) Hemagglutination Assay (HA assay)
この例は、ウィルス感染細胞から産生されたウィルスの力価を算出するために用いることができる血球凝集アッセイを開示するものである。 This example is intended to disclose a hemagglutination assay that can be used to calculate the titer of the produced viruses from virus-infected cells.

血球凝集アッセイ(HAアッセイ)を用いて細胞培養液の上清中のウィルスの定量を行う。 Performing quantification of virus in the cell culture supernatant using the hemagglutination assay (HA assay). 例えばインフルエンザウィルス等、ウィルスの科の中には、ヒト又は動物の赤血球(RBC)を凝集(に付着)し、RBC表面上のN−アセチルノイラミン酸と結合することができる表面又はエンベロープタンパク質を有するものがある。 Such as influenza virus, etc., in a family of viruses, the human or animal red blood cells (RBC) aggregate (the attachment), a surface or envelope protein can bind to N- acetylneuraminic acid on RBC surface those having. 各ウィルスは多くの表面タンパク質を有しているため、一つのウィルスは一つ以上のRBCに付着することができる。 Each virus since it has a number of surface proteins, one of the virus can be adhered to one or more RBC. この結果、ウィルスと結合したRBCがウィルスによって架橋されることになり、一種のRBC「格子」を形成する。 This results in the RBC bound to the virus is crosslinked by the virus, forming a sort of RBC "grid". この格子が形成されると、凝集されたRBCをカウントすることができ、ウィルスの力価を算出することができる。 If this grating is formed, it is possible to count the aggregated RBC, it can be calculated titer of the virus. siRNAがトランスフェクトされた細胞のウィルス力価がsiRNAがトランスフェクトされていない細胞の力価と比べて低下したということは、siRNA分子が標的ウィルス遺伝子又は標的遺伝子の発現を阻害したことを示す。 That the siRNA virus titer of transfected cells siRNA was reduced as compared to titers of cells untransfected shows that siRNA molecules inhibited the expression of a target viral gene or target gene.

PBS中0.5%のニワトリ赤血球を、4枚のプレートに対して20mlずつ調製する。 0.5% chicken red blood cells in PBS, prepared by 20ml against four plates. 各サンプルの培養液の上清100μlを、96ウェルV底プレートの第一列目にある各ウェルへ移す。 The supernatant 100μl of the culture solution of each sample are transferred to each well in the first row of 96-well V-bottom plates. サンプル間でチップは交換する。 Chip is exchanged between the sample. 無菌状態が必要である場合は細胞培養室フード内で行う。 If sterility is required is carried out in the cell culture chamber hood. ウィルス培養液の上清を移した第一列目を除くプレートの残りの部分は、マルチチャネルピペットを用いて各ウェルに50μlずつのPBSを添加する。 The remaining portion of the plate except for the first row of the supernatant was transferred to a virus culture, the addition of PBS in each 50μl to each well using a multichannel pipette. マルチチャネルピペットを用いて第一列目から培養液の上清50μlを吸い上げ、第二列目のPBS50μlと混合する。 Siphoning the supernatant 50μl of the culture solution from the first row with a multichannel pipette, mix the second row of 50 [mu] l PBS. ピペットによる吸い上げと押し出しを3回繰り返す。 Repeated 3 times siphoning and extrusion with a pipette. マルチチャネルピペットを用いて第二列目の希釈サンプル50μlを吸い上げ、第三列目のPBS50μlと混合する。 Siphoning diluted sample 50μl of the second column using a multichannel pipette, mix the third column of 50 [mu] l PBS. ピペットによる吸い上げと押し出しを3回繰り返す。 Repeated 3 times siphoning and extrusion with a pipette. これらの操作を最後の列まで繰り返す。 Repeat these operations until the end of the column. 希釈サンプル50μlを捨てる。 Discard the diluted sample 50μl. 0.5%のニワトリ赤血球50μlを各ウェルに添加する。 0.5% chicken erythrocytes 50μl added to each well. プレートを氷上で1時間インキュベートする。 Plates are incubated for 1 hour on ice. HAの結果を読み取り、ウィルス力価を算出する。 Read the results of HA, to calculate the virus titer.

実施例8 Example 8
24ウェルプレートによるベロ細胞トランスフェクション/インフェクション力価ノックダウンスクリーンニングアッセイ 24-well plates by Vero cell transfection / Infection titer knockdown screen training assay
本例は、本発明のギャップ又はニックを有する二重鎖siRNAが1又は2種類以上のウィルス標的遺伝子の発現を下方制御することができるかどうかを調べるために用いることができるアッセイを開示するものである。 This example, disclose an assay that can be used to double-stranded siRNA with a gap or nick of the present invention investigate whether it is possible to downregulate the expression of one or more of the viral target genes it is.

本実施例では、哺乳類の細胞を、ウィルスRNAと相同的なギャップ又はニックを有する二重鎖siRNAでトランスフェクトする。 In this embodiment, the mammalian cells are transfected with double-stranded siRNA having homologous gap or nick and viral RNA. トランスフェクションの後、トランスフェクトされた細胞は、トランスフェクトした本発明にかかるsiRNA分子と相同的な配列を有する1又は2個の遺伝子を含むウィルスに感染させる。 After transfection, transfected cells are infected with a virus containing one or two genes with siRNA molecule homologous sequences according to the present invention transfected.

ベロ細胞を、実施例6の方法に従ってギャップ又はニックを有する二重鎖siRNAでトランスフェクトする。 Vero cells are transfected with double-stranded siRNA with a gap or nick according to the method of Example 6. siRNA及びベロ細胞のインキュベーションの終了にかけて、感染ステップのためのウィルスの希釈を行う。 Toward the end of incubation siRNA and Vero cells, performing diluted virus for infection step. ウィルスサンプルは、所望の感染効率(MOI)が達成されるように希釈する。 Virus samples are diluted to the desired infection efficiency (MOI) is achieved. ウィルスサンプルをPBS/BSA/PS中に希釈し、適量のウィルス溶液を各ウェルに添加する。 Virus samples were diluted in PBS / BSA / PS, adding an appropriate amount of virus solution to each well. 37℃で1時間インキュベートした後、一定量の感染媒体(0.3%BSA、2mLのL−グルタミン、10nMのHepes、100ユニット/mlのペニシリン/ストレプトマイシン、及びトリプシンを添加したDMEM培養液)を各ウェルに添加する。 After incubation for 1 hour at 37 ° C., a certain amount of infection (0.3% BSA, L-glutamine 2 mL, 10 nM Hepes, and 100 units / ml penicillin / streptomycin, and DMEM medium supplemented with trypsin) to It is added to each well. 37℃で48時間インキュベートする。 At 37 ° C. Incubate for 48 hours. インキュベーションの最後に上清を回収し、4℃で保存する。 Finally the supernatant was recovered in the incubation and stored at 4 ℃. siRNAによるウィルスRNA干渉は、実施例7に記載するHAアッセイを行って測定する。 Viral RNA interference by siRNA is measured by performing the HA assay described in Example 7.

実施例9 Example 9
ノックダウン活性でスクリーニングしたインフルエンザ特異的ダイザエンドヌクレアーゼ基質siRNA Was screened at knock-down activity influenza-specific die The endonuclease substrate siRNA
この実施例は、感染したベロ細胞中のインフルエンザウィルス力価の効果的な低下に基づいてスクリーニングした、本明細書で示す典型的なインフルエンザ特異的siRNAを例示するものである。 This example illustrates the infected Vero cells based on the effective reduction of influenza virus titer and screened, typical influenza-specific siRNA indicated herein. 非標的コントロールsiRNAでトランスフェクトした細胞のウィルス力価と比較して、インフルエンザ特異的siRNAでトランスフェクトした細胞のウィルス力価が低下したということの意味は、それが、インフルエンザ特異的siRNA分子が標的ウィルス遺伝子又は標的遺伝子の発現を阻害したことを示すということである。 In non-targeting control siRNA as compared to the viral titer of transfected cells, meaning of that viral titers in transfected cells was reduced with influenza specific siRNA, it is influenza-specific siRNA molecules targeting it is that indicate that inhibit the expression of viral genes or target genes.

以下の表6には、インフルエンザ特異的siRNA二重鎖の5'−3'センス鎖(上)及び5'−3'アンチセンス鎖(下)を示す。 Table 6 below shows the 5'-3 'sense strand (upper) and 5'-3' antisense strand of influenza-specific siRNA duplexes (bottom).

ベロ細胞を、100μlの10%FBS/DMEM培地中へ96ウェルプレートの各ウェルに1.5×10 個、トランスフェクションの前日に播種した。 Vero cells, 1.5 × 10 4 cells per well in 96-well plates to 10% FBS / DMEM medium in 100 [mu] l, were seeded the day before transfection. 100、20、若しくは5nMの各インフルエンザ特異的siRNA又は非標的コントロールsiRNAであるQneg、をlipofectamine2000(Invitrogen社)0.3μl(1mg/Lのストック)と複合体化し、OptiMEM25μl中(全体積)(Gibco社)室温で20分間インキュベートした。 100,20, or Qneg is the influenza-specific siRNA or non-targeting control siRNA of 5 nM, was complexed with Lipofectamine2000 (Invitrogen Corporation) 0.3 Pl (stock 1 mg / L), in OptiMEM25myueru (total volume) (Gibco company) and incubated at room temperature for 20 minutes. 播種されたベロ細胞の各ウェル中の上清を除去し、10%DMEM完全培養液75μLを添加した。 The supernatant in each well of the seeded Vero cells were removed, it was added 10% DMEM complete medium 75 [mu] L. それから、OptiMEM中のsiRNA/lipofectamine複合体25μlを各ウェルへ添加した。 Then, was added siRNA / lipofectamine complexes 25μl in OptiMEM to each well. 各条件について、三つのウェルで重複して実験を行った。 For each condition, an experiment was performed in duplicate in three of the wells. トランスフェクションの条件ではない追加的なコントロールウェルを調製した。 It was prepared additional control wells not a condition of transfection. トランスフェクションから3時間後、培養液を除去した。 3 hours after transfection, the medium was removed. 各ウェルを0.3%BSA/10mM HEPES/PSを含有する1×PBS100μlで1回洗浄した。 Each well was washed once with 1 × 100 l PBS containing 0.3% BSA / 10mM HEPES / PS. MOI=0.1のPR8インフルエンザウィルス30μlを各ウェルに添加して感染を行った。 The PR8 influenza virus 30μl of MOI = 0.1 were infected was added to each well. プレートを室温で1時間振とうした。 The plate was shaken at room temperature for 1 hour. 感染後、細胞は脱着し始めるので、0.3%BSA/10mM HEPES/PS及び4μg/mlのトリプシンを含有するDMEM100μlを各ウェルへゆっくり側壁上へ添加した。 After infection, cells so begin to desorb, the DMEM100μl containing 0.3% BSA / 10mM HEPES / PS and 4 [mu] g / ml of trypsin was added to the slowly sidewalls to each well. プレートを37℃で、5%のCO 下、48時間インキュベートした。 Plates at 37 ° C., 5% of CO 2 under and incubated for 48 hours. 各ウェルの上清50μlを、二つの系に重複してHAアッセイで分析した。 The supernatant 50μl in each well was analyzed by HA assay duplicate two systems.

濃度が5nM、20nM、及び100nMのDX2852、DX2855、DX2858、DX2861、DX2956、及びG1498の各インフルエンザ特異的ダイザ基質siRNA、並びに非標的コントロールsiRNAであるQnegをLipofectamine2000(Invitrogen社、カリフォルニア州、カールズバッド)と複合体化させ、それを用いて播種したベロ細胞をトランスフェクトした。 Concentration DX2852 is 5 nM, 20 nM, and 100nM, DX2855, DX2858, DX2861, DX2956, and each influenza-specific base substrate siRNA of G1498, as well as Qneg a non-targeting control siRNA Lipofectamine2000 (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) and complexed, were transfected with Vero cells plated therewith. トランスフェクション後、細胞をMOI(感染効率)が0.1であるPR8インフルエンザウィルスで感染させた。 After transfection, cells MOI (infection efficiency) were infected with PR8 influenza virus is 0.1. 産生されたウィスルを定量するために、感染細胞を含むウェルの上清を、実施例7に示すように血球凝集(HA)アッセイで分析した。 To quantify produced is Wisuru, the supernatant wells containing infected cells were analyzed by haemagglutination (HA) assay as shown in Example 7. 表7には、各siRNAのインフルエンザ遺伝子発現活性のノックダウンを、ウィルス力価の低下をパーセントで表してまとめた(1−(インフルエンザsiRNA処理のHAユニット)/(コントロールsiRNA処理のHAユニット))。 Table 7, the knockdown of influenza gene expression activity of each siRNA, summarizes represents a decrease in viral titer as a percentage (1-(HA units of influenza siRNA treatment) / (HA units of control siRNA treated)) .

表7のデータは、インフルエンザ特異的ダイザ基質siRNAのDX2956が、インフルエンザウィルスに感染したベロ細胞中のインフルエンザ力価を効果的に低下させたことを示している。 The data in Table 7, DX2956 of influenza-specific base substrate siRNA have shown that effectively reduced influenza titers in Vero cells infected with influenza virus. DX2956はG1498と同様の活性を示したが、他の4種類のダイザ基質siRNAはDX2956よりも低い活性を示した。 DX2956 showed similar activity as G1498, other four base substrate siRNA showed low activity than DX2956. これらのデータより、siRNA DX2956は、Lipofectamine2000(Invitrogen社、カリフォルニア州、カールズバッド)でトランスフェクトされた場合にインフルエンザのmRNAレベルを効果的に低下させており、従ってこれがインフルエンザ感染の治療及び/又は予防のための優れた候補であることが示された。 These data, siRNA DX2956 is, Lipofectamine2000 (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) and effectively reduced the mRNA levels of influenza when transfected with, and therefore this is the treatment and / or prophylaxis of influenza infection order to be excellent candidates were shown.

上述の本発明を、明確な理解を目的として例を挙げる方法で詳細に説明してきたが、限定されるのではなく、例示の形で示された添付の請求項の範囲内において特定の変形及び変更を行うことが可能であることは、熟練者には明らかであろう。 Above the present invention has been described in detail in the examples how for purposes of clarity of understanding, rather than being limited to particular variations within the scope of the claims set forth for illustrative form attachments and it is possible to make changes will be apparent to the skilled person. この意味で、説明を省略するために、上述の本開示の範囲内において様々な刊行物及びその他の文献を引用した。 In this sense, in order to omit the description, it cited various publications and other references within the scope of the present disclosure described above. これらの全文献は各々、あらゆる点で参照することで本明細書に組み入れられる。 All these references are each incorporated herein by reference in all respects. しかし、留意点として、本明細書で取り上げた種々の刊行物は、本出願の出願日以前の開示事項を組み入れただけであって、発明者は先行発明の理由により、そのような開示に先行する権利を保持する。 However, as noted point, various publications mentioned in this specification is merely incorporate the filing date earlier disclosure of the present application, for reasons of inventors prior invention, antedate such disclosure to retain the right to.

siRNA N163と抱合したポリペプチドPN277を有する抱合体dsCoP277nfR952及びdsCoP277nfR950のインビトロでのダイザ分解生成物のゲル電気泳動を示す図である。 It is a diagram showing a gel electrophoresis of the pedestal degradation products in vitro conjugate dsCoP277nfR952 and dsCoP277nfR950 having a polypeptide PN277 conjugated with siRNA N163. 非抱合siRNAであるN163二重鎖の、ダイザエンドヌクレアーゼプロセッシング反応速度のRP−HPCL分析を示す図である。 Of N163 duplex is unconjugated siRNA, and is diagram showing a RP-HPCL analysis dies The endonuclease processing kinetics. (A)未処理N163二本鎖、(B)ダイザエンドヌクレアーゼと共に1時間インキュベート、(C)ダイザエンドヌクレアーゼと共に2.5時間インキュベート、(D)ダイザエンドヌクレアーゼと共に5時間インキュベート、(E)ダイザエンドヌクレアーゼと共に7時間インキュベート。 (A) Untreated N163 duplex, (B) 1 hour incubation with the die The endonuclease, (C) 2.5 hour incubation with the die The endonuclease, 5 hour incubation with (D) Die The endonuclease, (E ) 7 hour incubation with die The endonuclease. 図2に示した非抱合siRNA N163二本鎖の、ダイザエンドヌクレアーゼプロセッシング反応速度のRP−HPCL分析のチャートである。 Unconjugated siRNA N163 duplexes shown in FIG. 2 is a chart of the RP-HPCL analysis dies The endonuclease processing kinetics. 非抱合N163を7時間ダイザ分解したもののESI−MS分析を示す図である。 Is a diagram showing an ESI-MS analysis although unconjugated N163 to decompose 7 hours pedestal. siRNA N163と抱合したポリペプチドPN857を有する抱合体化siRNAの、ダイザエンドヌクレアーゼプロセッシングのESI−MS分析を示す図である。 Conjugation body of siRNA having a polypeptide PN857 conjugated with siRNA N163, illustrates the ESI-MS analysis of the die The endonuclease processing. (A)ダイザエンドヌクレアーゼの非存在下での8時間のコントロール、(B)ダイザエンドヌクレアーゼにより抱合体を8時間分解。 (A) 8 hours of the control in the absence of the die The endonuclease, 8 hours decompose conjugate by (B) die THE endonuclease.

Claims (67)

  1. 組成物において: In the composition:
    (a)二本鎖リボ核酸(dsRNA)分子であって、当該鎖が約25乃至約30ヌクレオチドの同一又は異なる長さを有する分子と; (A) a double-stranded ribonucleic acid (dsRNA) molecules, and molecular said chains have the same or different length from about 25 to about 30 nucleotides;
    (b)約5乃至約40個のアミノ酸を具えるペプチドであって、アミノ酸配列KVLKQ(配列番号51)を含むペプチドと; (B) about 5 to a peptide comprising about 40 amino acids, and a peptide comprising the amino acid sequence KVLKQ (SEQ ID NO: 51);
    を具える組成物において、前記dsRNA分子が前記ペプチドと抱合していることを特徴とする組成物。 In a composition comprising a composition, wherein the dsRNA molecule is conjugated to the peptide.
  2. 請求項1に記載の組成物において、前記dsRNA分子がsiRNAであることを特徴とする組成物。 A composition according to claim 1, composition characterized in that the dsRNA molecule is a siRNA.
  3. 請求項2に記載の組成物において、前記siRNAが、ヒトTNF−α遺伝子の核酸配列の一部と相同的な核酸配列を含むことを特徴とする組成物。 A composition according to claim 2, wherein the siRNA is a composition which comprises a portion homologous nucleic acid sequence of human TNF-alpha gene nucleic acid sequences.
  4. 請求項2に記載の組成物において、前記siRNAが、ウィルス遺伝子の核酸配列の一部と相同的な核酸配列を含むことを特徴とする組成物。 A composition according to claim 2, wherein the siRNA is a composition which comprises a portion homologous nucleic acid sequence of the nucleic acid sequence of the viral gene.
  5. 請求項4に記載の組成物において、前記ウィルス遺伝子の供給源がインフルエンザウィルスであることを特徴とする組成物。 A composition according to claim 4, the composition, wherein the source of said virus gene is an influenza virus.
  6. 請求項1に記載の組成物が更に担体を具えることを特徴とする組成物。 Composition characterized by the composition according further comprises a carrier in claim 1.
  7. 請求項1に記載の組成物において、前記dsRNA分子が、2個のヌクレオチドを含む一本鎖3'アンチセンス鎖オーバハングを更に具えることを特徴とする組成物。 A composition according to claim 1, the composition wherein the dsRNA molecule, characterized by further comprising a single-stranded 3 'antisense strand overhang comprising 2 nucleotides.
  8. 請求項1に記載の組成物において、前記dsRNA分子が、2個のヌクレオチドを含む一本鎖3'センス鎖オーバハングを更に具えることを特徴とする組成物。 A composition according to claim 1, the composition wherein the dsRNA molecule, characterized by further comprising a single-stranded 3 'sense strand overhang comprising 2 nucleotides.
  9. 請求項1に記載の組成物において、前記dsRNA分子がオーバハングを有しないことを特徴とする組成物。 A composition according to claim 1, composition characterized in that said dsRNA molecule has no overhang.
  10. 請求項1に記載の組成物において、前記鎖が、約25乃至約29ヌクレオチドの同一又は異なる長さを有することを特徴とする組成物。 A composition according to claim 1, wherein the strand, the composition characterized by having the same or different lengths from about 25 to about 29 nucleotides.
  11. 請求項1に記載の組成物において、前記dsRNA分子がセンスRNA鎖及びアンチセンスRNA鎖からなり、前記ペプチドが前記アンチセンスRNA鎖の5'末端に抱合されることを特徴とする組成物。 A composition according to claim 1, wherein the dsRNA molecule is a sense RNA strand and an antisense RNA strand, a composition wherein the peptide is characterized in that it is conjugated to the 5 'end of the antisense RNA strand.
  12. 請求項1に記載の組成物において、前記ペプチドの前記アミノ酸配列が: A composition according to claim 1, wherein the amino acid sequence of said peptide is:
    KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(配列番号33); KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ (SEQ ID NO: 33);
    KKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(配列番号42); KKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ (SEQ ID NO: 42);
    VTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(配列番号43); VTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ (SEQ ID NO: 43);
    AQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(配列番号44); EikyuKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ (SEQ ID NO: 44);
    KDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(配列番号45); KDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ (SEQ ID NO: 45);
    KKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(配列番号46); KKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ (SEQ ID NO: 46);
    KRSRKESYSVYVYKVLKQ(配列番号47); KRSRKESYSVYVYKVLKQ (SEQ ID NO: 47);
    RKESYSVYVYKVLKQ(配列番号41); RKESYSVYVYKVLKQ (SEQ ID NO: 41);
    SYSVYVYKVLKQ(配列番号48); SYSVYVYKVLKQ (SEQ ID NO: 48);
    VYVYKVLKQ(配列番号49); VYVYKVLKQ (SEQ ID NO: 49);
    YKVLKQ(配列番号50); YKVLKQ (SEQ ID NO: 50);
    KVLKQ(配列番号51); KVLKQ (SEQ ID NO: 51);
    からなる群から選択されることを特徴とする組成物。 Composition being selected from the group consisting of.
  13. 請求項1に記載の組成物において、前記ペプチドが動物の細胞と結合する分子と抱合していることを特徴とする組成物。 A composition according to claim 1, composition characterized in that the peptide is conjugated to a molecule that binds to animal cells.
  14. TNF−αに関連する炎症を回復させるための請求項1乃至3又は請求項6乃至13のいずれか1項に記載の組成物の使用において、回復する量の前記組成物を動物へ投与するステップを具えることを特徴とする使用。 In use of the composition according to any one of claims 1 to 3 or claims 6 to 13 for recovering the inflammation associated with TNF-alpha, the step of administering the composition in an amount to recover to the animal use characterized in that it comprises a.
  15. 動物のTNF−αに関連する炎症を回復させる薬物の製造における請求項1乃至3又は請求項6乃至13のいずれか1項に記載の組成物の使用。 Use of a composition according to any one of claims 1 to 3 or claims 6 to 13 in the manufacture of a medicament for restoring the inflammation associated with animal TNF-alpha.
  16. 請求項14又は15に記載の使用において、前記炎症が関節炎に生じていることを特徴とする使用。 Usage according to claim 14 or 15, use the inflammation is characterized by occurring arthritis.
  17. 請求項14又は15に記載の使用において、前記炎症が乾癬に生じていることを特徴とする使用。 Usage according to claim 14 or 15, use the inflammation is characterized by being caused to psoriasis.
  18. 炎症回復のために動物の遺伝子発現を阻害する医薬組成物の使用において、二本鎖リボ核酸(dsRNA)分子を前記動物へ投与するステップを具え、前記医薬組成物が前記dsRNA分子とペプチドを具え、前記dsRNA分子が約25乃至約30の塩基対を具え、前記ペプチドが約5乃至約40個のアミノ酸を具え、かつ、アミノ酸配列KVLKQ(配列番号51)を具え、前記dsRNA分子が前記ペプチドと抱合していることを特徴とする使用。 In use of a pharmaceutical composition for inhibiting an animal gene expression for inflammatory resolution, a double-stranded ribonucleic acid (dsRNA) molecules comprising the step of administering to said animal, said pharmaceutical composition comprises the dsRNA molecule with the peptide , comprising the dsRNA molecule is from about 25 to about 30 base pairs, wherein the peptide comprises from about 5 to about 40 amino acids, and comprises the amino acid sequence KVLKQ (SEQ ID NO: 51), and wherein the dsRNA molecule is a peptide whereby said are conjugated.
  19. 炎症回復のために動物の遺伝子発現を阻害する薬物の製造における二本鎖リボ核酸(dsRNA)分子及びペプチドを具える医薬組成物の使用において、前記dsRNA分子が約25乃至約30の塩基対を具え、前記ペプチドが約5乃至約40個のアミノ酸を具え、かつアミノ酸配列KVLKQ(配列番号51)を具え、前記dsRNA分子が前記ペプチドと抱合していることを特徴とする使用。 In use of the double-stranded ribonucleic acid (dsRNA) pharmaceutical composition comprising a molecule and a peptide in the manufacture of a medicament for inhibiting an animal gene expression for inflammatory resolution, the dsRNA molecule is from about 25 to about 30 base pairs comprising, using said peptide comprises from about 5 to about 40 amino acids, and comprises the amino acid sequence KVLKQ (SEQ ID NO: 51), wherein the dsRNA molecule is characterized in that it conjugated to said peptide.
  20. 請求項18又は19に記載の使用において、前記炎症が関節炎に生じていることを特徴とする使用。 Usage according to claim 18 or 19, use the inflammation is characterized by occurring arthritis.
  21. 請求項18又は19に記載の使用において、前記炎症が乾癬に生じていることを特徴とする使用。 Usage according to claim 18 or 19, use the inflammation is characterized by being caused to psoriasis.
  22. インフルエンザウィルスに関連する感染症を回復させるための請求項1に記載の組成物の使用において、回復する量の前記組成物を動物へ投与するステップを具えることを特徴とする使用。 In use of a composition according to claim 1 for recovering the infectious diseases associated with influenza virus, using, characterized in that it comprises the step of administering the composition in an amount to restore to the animal.
  23. 動物のインフルエンザウィルスに関連する感染症を回復させる薬物の製造における請求項1に記載の組成物の使用。 Use of a composition according to claim 1 in the manufacture of a medicament for restoring an infection associated with an animal influenza viruses.
  24. 組成物において: In the composition:
    (a)約15乃至約50個のヌクレオチドを具える第1のRNA鎖(A鎖)と、約1乃至約25個のヌクレオチドを具える第2のRNA鎖(B1鎖)と、約1乃至約25個のヌクレオチドを具える第3のRNA鎖(B2鎖)とを具える低分子抑制核酸(siRNA)分子であって: And (a) a first RNA strand comprising about 15 to about 50 nucleotides (A chain), about 1 to about 25 amino second RNA strand (B1 chain) comprising a nucleotide from about 1 to about 25 third RNA strand comprising nucleotides (B2 chain) and a low molecular suppression nucleic acids (siRNA) molecule comprising a:
    前記siRNA分子がペプチドと抱合し; The siRNA molecule is conjugated with a peptide;
    前記B1鎖及び前記B2鎖が、前記A鎖の非オーバラップ領域と各々相補的であり; Wherein B1 chain and the B2 chain, a non-overlapping area with each complementary of the A chain;
    第1の二重鎖領域(A:B1)が、前記B1鎖と前記A鎖とをアニーリングすることによって形成され; First double-stranded region (A: B1) is formed by annealing and the A chain and the B1 chain;
    第2の二重鎖領域(A:B2)が、前記B2鎖と前記A鎖とをアニーリングすることによって形成された; The second double-stranded region (A: B2) was formed by annealing and the A chain and the B2 chain;
    低分子抑制核酸(siRNA)分子と; Low molecular suppression nucleic acids (siRNA) and molecules;
    (b)約5乃至約40個のアミノ酸を具えるペプチドであって、前記siRNA分子が前記ペプチドと抱合するペプチドと; (B) about 5 to a peptide comprising about 40 amino acids, and a peptide wherein the siRNA molecule is conjugated to the peptide;
    を具えることを特徴とする組成物。 Composition characterized by comprising a.
  25. 前記A:B1二重鎖が、ニック又はギャップによって前記A:B2二重鎖から分離されており、前記ギャップが前記A:B1二重鎖と前記A:B2二重鎖との間に位置するA鎖内の少なくとも一つの不対ヌクレオチドから生ずることを特徴とする請求項24に記載の組成物。 Wherein A: B1 duplex, wherein the nick or gap A: B2 is separated from the duplex, the gap is the A: located between the B2 duplex: the the B1 duplex A a composition according to claim 24, wherein the resulting at least one unpaired nucleotide of the a chain.
  26. 前記A鎖、前記B1鎖、及び/若しくは前記B2鎖のいずれか又は両方の3'末端に1又はそれ以上の不対ヌクレオチドを更に具えることを特徴とする請求項25に記載の組成物。 The A-chain, the B1 chain, and / or composition of claim 25, wherein either or both of the 3 'end, further comprising one or more unpaired nucleotides in the B2 chain.
  27. 前記A鎖が約18ヌクレオチド乃至約40ヌクレオチドであることを特徴とする請求項25乃至26のいずれか1項に記載の組成物。 The composition according to any one of claims 25 to 26, wherein the A chain is about 18 nucleotides to about 40 nucleotides.
  28. 前記A鎖が約20ヌクレオチド乃至約32ヌクレオチドであることを特徴とする請求項27に記載の組成物。 The composition of claim 27, wherein the A chain is about 20 nucleotides to about 32 nucleotides.
  29. 前記A鎖が21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、又は31ヌクレオチドであることを特徴とする請求項28に記載の組成物。 The composition of claim 28, wherein the A chain 21,22,23,24,25,26,27,28,29,30, or 31 is a nucleotide.
  30. 前記A:B1二重鎖及び前記A:B2二重鎖が、合計で約15の塩基対乃至約40の塩基対を具えることを特徴とする請求項25乃至26のいずれか1項に記載の組成物。 Wherein A: B1 duplex and the A: B2 duplex, according to any one of claims 25 to 26, characterized in that it comprises about 15 base pairs to about 40 base pairs in total of the composition.
  31. 前記A:B1二重鎖及び前記A:B2二重鎖が、合計で約18の塩基対乃至約35の塩基対を具えることを特徴とする請求項30に記載の組成物。 Wherein A: B1 duplex and the A: B2 duplex A composition according to claim 30, characterized in that it comprises about 18 base pairs to about 35 base pairs in total.
  32. 前記A:B1二重鎖及び前記A:B2二重鎖が、合計で約20の塩基対乃至約30の塩基対を具えることを特徴とする請求項31に記載の組成物。 Wherein A: B1 duplex and the A: B2 duplex A composition according to claim 31, characterized in that it comprises about 20 base pairs to about 30 base pairs in total.
  33. 前記A:B1二重鎖及び前記A:B2二重鎖が、合計で21、22、23、24、25、26、27、28、又は29の塩基対を具えることを特徴とする請求項32に記載の組成物。 Wherein A: B1 duplex and the A: B2 claims duplex, characterized in that it comprises a total of 21,22,23,24,25,26,27,28, or 29 base pairs the composition according to 32.
  34. 前記siRNA分子が、1ヌクレオチド乃至5ヌクレオチドである1又は2個の一本鎖3'オーバハングを具えることを特徴とする請求項26に記載の組成物。 The siRNA molecule composition of claim 26, characterized in that it comprises a nucleotide to 5 nucleotides at which one or two single stranded 3 'overhang.
  35. 前記A鎖がヌクレオチド配列3'TTCCUAGAAUAAAGAAGCCUCUGUUAC5'(配列番号76)を具えることを特徴とする請求項25乃至26のいずれか1項に記載の組成物。 The composition according to any one of claims 25 to 26 wherein the A chain characterized in that it comprises a nucleotide sequence 3'TTCCUAGAAUAAAGAAGCCUCUGUUAC5 '(SEQ ID NO: 76).
  36. 前記B1鎖がヌクレオチド配列5'GGAUCU3'(配列番号77)を具えることを特徴とする請求項22に記載の組成物。 The composition of claim 22, wherein the B1 chain is characterized in that it comprises a nucleotide sequence 5'GGAUCU3 '(SEQ ID NO: 77).
  37. 前記B2鎖がヌクレオチド配列5'ACAAUG3'(配列番号90)を具えることを特徴とする請求項25に記載の組成物。 The composition of claim 25, wherein the B2 chain, characterized in that it comprises a nucleotide sequence 5'ACAAUG3 '(SEQ ID NO: 90).
  38. 前記A:B1二重鎖が、ニックによって前記A:B2二重鎖から分離されていることを特徴とする請求項25に記載の組成物。 Wherein A: B1 duplex, wherein the nick A: B2 composition according to claim 25, characterized in that it is separated from the duplex.
  39. 前記B2鎖が5'ヒドロキシル末端を有することを特徴とする請求項38に記載の組成物。 The composition of claim 38, wherein the B2 chain has 5 'hydroxyl terminus.
  40. 前記B1鎖がヌクレオチド配列5'GGAUCUUAUUU3'(配列番号135)を具え、前記B2鎖がヌクレオチド配列5'CUUCGGAGTT3'(配列番号136)を具え、前記A鎖がヌクレオチド配列5'CUCCGAAGAAAUAAGAUCCTT3'(配列番号137)を具えることを特徴とする請求項38に記載の組成物。 Wherein B1 chain 'comprises a (SEQ ID NO: 135), the B2 chain nucleotide sequence 5'CUUCGGAGTT3' nucleotide sequence 5'GGAUCUUAUUU3 comprises a (SEQ ID NO: 136), wherein the A chain nucleotide sequence 5'CUCCGAAGAAAUAAGAUCCTT3 '(SEQ ID NO: 137 ) a composition according to claim 38, characterized in that it comprises a.
  41. 前記B1鎖がヌクレオチド配列5'GGATCTTATTT3'(配列番号144)を具え、前記B2鎖がヌクレオチド配列5'CTTCGGAGTT3'(配列番号145)を具え、前記A鎖がヌクレオチド配列5'CTCCGAAGAAATAAGATCCTT3'(配列番号146)を具えることを特徴とする請求項38に記載の組成物。 Wherein B1 chain 'comprises a (SEQ ID NO: 144), the B2 chain nucleotide sequence 5'CTTCGGAGTT3' nucleotide sequence 5'GGATCTTATTT3 comprises a (SEQ ID NO: 145), wherein the A chain nucleotide sequence 5'CTCCGAAGAAATAAGATCCTT3 '(SEQ ID NO: 146 ) a composition according to claim 38, characterized in that it comprises a.
  42. 前記B1鎖がヌクレオチド配列5'CTCCGAAGAA3'(配列番号148)を具え、前記B2鎖がヌクレオチド配列5'ATAAGATCCTT3'(配列番号149)を具え、前記A鎖がヌクレオチド配列5'GGATCTTATTTCTTCGGAGTT3'(配列番号147)を具えることを特徴とする請求項38に記載の組成物。 Wherein B1 chain 'comprises a (SEQ ID NO: 148), the B2 chain nucleotide sequence 5'ATAAGATCCTT3' nucleotide sequence 5'CTCCGAAGAA3 comprises a (SEQ ID NO: 149), wherein the A chain nucleotide sequence 5'GGATCTTATTTCTTCGGAGTT3 '(SEQ ID NO: 147 ) a composition according to claim 38, characterized in that it comprises a.
  43. 前記B1鎖がヌクレオチド配列5'GGAUCUUAUUU3'(配列番号153)を具え、前記B2鎖がヌクレオチド配列5'CUUCGGAGTT3'(配列番号154)を具え、前記A鎖がヌクレオチド配列5'CUCCGAAGAAAUAAGAUCCTT3'(配列番号155)を具えることを特徴とする請求項38に記載の組成物。 Wherein B1 chain 'comprises a (SEQ ID NO: 153), the B2 chain nucleotide sequence 5'CUUCGGAGTT3' nucleotide sequence 5'GGAUCUUAUUU3 comprises a (SEQ ID NO: 154), wherein the A chain nucleotide sequence 5'CUCCGAAGAAAUAAGAUCCTT3 '(SEQ ID NO: 155 ) a composition according to claim 38, characterized in that it comprises a.
  44. 前記B1鎖がヌクレオチド配列5'GGATCTTATTT3'(配列番号159)を具え、前記B2鎖がヌクレオチド配列5'CTTCGGAGTT3'(配列番号160)を具え、前記A鎖がヌクレオチド配列5'CTCCGAAGAAATAAGATCCTT3'(配列番号161)を具えることを特徴とする請求項38に記載の組成物。 The 'comprising a (SEQ ID NO: 159), the B2 chain nucleotide sequence 5'CTTCGGAGTT3' B1 chain nucleotide sequence 5'GGATCTTATTT3 comprises a (SEQ ID NO: 160), wherein the A chain nucleotide sequence 5'CTCCGAAGAAATAAGATCCTT3 '(SEQ ID NO: 161 ) a composition according to claim 38, characterized in that it comprises a.
  45. 前記B1鎖がヌクレオチド配列5'CTCCGAAGAA3'(配列番号166)を具え、前記B2鎖がヌクレオチド配列5'ATAAGATCCTT3'(配列番号34)を具え、前記A鎖がヌクレオチド配列5'GGATCTTATTTCTTCGGAGTT3'(配列番号165)を具えることを特徴とする請求項38に記載の組成物。 Wherein B1 chain 'comprises a (SEQ ID NO: 166), the B2 chain nucleotide sequence 5'ATAAGATCCTT3' nucleotide sequence 5'CTCCGAAGAA3 comprises a (SEQ ID NO: 34), wherein A chain nucleotide sequence 5'GGATCTTATTTCTTCGGAGTT3 '(SEQ ID NO: 165 ) a composition according to claim 38, characterized in that it comprises a.
  46. 前記B1鎖が5'リン酸末端であることを特徴とする請求項38に記載の組成物。 The composition of claim 38, wherein the B1 chain 5 'phosphate terminus.
  47. 前記B1鎖がヌクレオチド配列5'GGAUCUUAUUU3'(配列番号138)を具え、前記B2鎖がヌクレオチド配列5'CUUCGGAGTT3'(配列番号139)を具え、前記A鎖がヌクレオチド配列5'CUCCGAAGAAAUAAGAUCCTT3'(配列番号140)を具えることを特徴とする請求項46に記載の組成物。 Wherein B1 chain 'comprises a (SEQ ID NO: 138), the B2 chain nucleotide sequence 5'CUUCGGAGTT3' nucleotide sequence 5'GGAUCUUAUUU3 comprises a (SEQ ID NO: 139), wherein the A chain nucleotide sequence 5'CUCCGAAGAAAUAAGAUCCTT3 '(SEQ ID NO: 140 ) a composition according to claim 46, characterized in that it comprises a.
  48. 前記B1鎖がヌクレオチド配列5'GGATCTTATTT3'(配列番号141)を具え、前記B2鎖がヌクレオチド配列5'CTTCGGAGTT3'(配列番号142)を具え、前記A鎖がヌクレオチド配列5'CTCCGAAGAAATAAGATCCTT3'(配列番号143)を具えることを特徴とする請求項46に記載の組成物。 Wherein B1 chain 'comprises a (SEQ ID NO: 141), the B2 chain nucleotide sequence 5'CTTCGGAGTT3' nucleotide sequence 5'GGATCTTATTT3 comprises a (SEQ ID NO: 142), wherein the A chain nucleotide sequence 5'CTCCGAAGAAATAAGATCCTT3 '(SEQ ID NO: 143 ) a composition according to claim 46, characterized in that it comprises a.
  49. 前記B1鎖がヌクレオチド配列5'CTCCGAAGAA3'(配列番号151)を具え、前記B2鎖がヌクレオチド配列5'ATAAGATCCTT3'(配列番号152)を具え、前記A鎖がヌクレオチド配列5'GGATCTTATTTCTTCGGAGTT3'(配列番号150)を具えることを特徴とする請求項46に記載の組成物。 Wherein B1 chain 'comprises a (SEQ ID NO: 151), the B2 chain nucleotide sequence 5'ATAAGATCCTT3' nucleotide sequence 5'CTCCGAAGAA3 comprises a (SEQ ID NO: 152), wherein the A chain nucleotide sequence 5'GGATCTTATTTCTTCGGAGTT3 '(SEQ ID NO: 150 ) a composition according to claim 46, characterized in that it comprises a.
  50. 前記B1鎖がヌクレオチド配列5'GGAUCUUAUUU3'(配列番号156)を具え、前記B2鎖がヌクレオチド配列5'CUUCGGAGTT3'(配列番号157)を具え、前記A鎖がヌクレオチド配列5'CUCCGAAGAAAUAAGAUCCTT3'(配列番号158)を具えることを特徴とする請求項46に記載の組成物。 Wherein B1 chain 'comprises a (SEQ ID NO: 156), the B2 chain nucleotide sequence 5'CUUCGGAGTT3' nucleotide sequence 5'GGAUCUUAUUU3 comprises a (SEQ ID NO: 157), wherein the A chain nucleotide sequence 5'CUCCGAAGAAAUAAGAUCCTT3 '(SEQ ID NO: 158 ) a composition according to claim 46, characterized in that it comprises a.
  51. 前記B1鎖がヌクレオチド配列5'GGATCTTATTT3'(配列番号162)を具え、前記B2鎖がヌクレオチド配列5'CTTCGGAGTT3'(配列番号163)を具え、前記A鎖がヌクレオチド配列5'CTCCGAAGAAATAAGATCCTT3'(配列番号164)を具えることを特徴とする請求項46に記載の組成物。 Wherein B1 chain 'comprises a (SEQ ID NO: 162), the B2 chain nucleotide sequence 5'CTTCGGAGTT3' nucleotide sequence 5'GGATCTTATTT3 comprises a (SEQ ID NO: 163), wherein the A chain nucleotide sequence 5'CTCCGAAGAAATAAGATCCTT3 '(SEQ ID NO: 164 ) a composition according to claim 46, characterized in that it comprises a.
  52. 前記B1鎖がヌクレオチド配列5'CTCCGAAGAA3'(配列番号39)を具え、前記B2鎖がヌクレオチド配列5'ATAAGATCCTT3'(配列番号40)を具え、前記A鎖がヌクレオチド配列5'GGATCTTATTTCTTCGGAGTT3'(配列番号38)を具えることを特徴とする請求項46に記載の組成物。 Wherein B1 chain 'comprises a (SEQ ID NO: 39), the B2 chain nucleotide sequence 5'ATAAGATCCTT3' nucleotide sequence 5'CTCCGAAGAA3 comprises a (SEQ ID NO: 40), wherein A chain nucleotide sequence 5'GGATCTTATTTCTTCGGAGTT3 '(SEQ ID NO: 38 ) a composition according to claim 46, characterized in that it comprises a.
  53. 組成物において: In the composition:
    (a)低分子抑制核酸(siRNA)分子であって、当該siRNAがA、B1、及びB2(A:B1B2)の3つの鎖を具え; A (a) low molecular suppression nucleic acids (siRNA) molecule, the siRNA is A, B1, and B2 (A: B1B2) comprises three strands of;
    A:B1B2が合計で約14の塩基対乃至約24の塩基対を具え; A: B1B2 comprises a about 14 base pairs to about 24 base pairs in total;
    Aがセンス鎖を表し、B1B2がアンチセンス鎖を表し; A represents the sense strand, B1B2 represents an antisense strand;
    Aが約19ヌクレオチド乃至約25ヌクレオチドであり; A is about 19 nucleotides to about 25 nucleotides;
    B1及びB2が各々個別に約1ヌクレオチド乃至約15ヌクレオチドであり; B1 and B2 are located at each individually about 1 nucleotide to about 15 nucleotides;
    B1及びB2を合わせた長さが約13ヌクレオチド乃至約23ヌクレオチドである; The combined length of B1 and B2 is about 13 nucleotides to about 23 nucleotides;
    siRNA分子と; And the siRNA molecule;
    (b)約5乃至約40個のアミノ酸を具えるペプチドと; (B) a peptide comprising from about 5 to about 40 amino acids;
    を具え、前記siRNA分子が前記ペプチドと抱合していることを特徴とする組成物。 The comprise a composition wherein the siRNA molecule is conjugated to the peptide.
  54. 組成物において: In the composition:
    (a)低分子抑制核酸(siRNA)分子であって、当該siRNAがA、B1、及びB2(A:B1B2)の3つの鎖を具え; A (a) low molecular suppression nucleic acids (siRNA) molecule, the siRNA is A, B1, and B2 (A: B1B2) comprises three strands of;
    A:B1B2が合計で約16の塩基対乃至約22の塩基対を具え; A: B1B2 comprises a about 16 base pairs to about 22 base pairs in total;
    Aがセンス鎖を表し、B1B2がアンチセンス鎖を表し; A represents the sense strand, B1B2 represents an antisense strand;
    Aが約19ヌクレオチド乃至約23ヌクレオチドであり; A is about 19 nucleotides to about 23 nucleotides;
    B1及びB2が各々個別に約1ヌクレオチド乃至約15ヌクレオチドであり; B1 and B2 are located at each individually about 1 nucleotide to about 15 nucleotides;
    B1及びB2を合わせた長さが約13ヌクレオチド乃至約23ヌクレオチドである; The combined length of B1 and B2 is about 13 nucleotides to about 23 nucleotides;
    siRNA分子と; And the siRNA molecule;
    (b)約5乃至約40個のアミノ酸を具えるペプチドと; (B) a peptide comprising from about 5 to about 40 amino acids;
    を具え、前記siRNA分子が前記ペプチドと抱合していることを特徴とする組成物。 The comprise a composition wherein the siRNA molecule is conjugated to the peptide.
  55. 組成物において: In the composition:
    (a)低分子抑制核酸(siRNA)分子であって、当該siRNAがA、B1、及びB2(A:B1B2)の3本の鎖を具え; A (a) low molecular suppression nucleic acids (siRNA) molecule, the siRNA is A, B1, and B2 (A: B1B2) comprises three strands of;
    A:B1B2が合計で約14の塩基対乃至約24の塩基対を具え; A: B1B2 comprises a about 14 base pairs to about 24 base pairs in total;
    Aがアンチセンス鎖を表し、B1B2がセンス鎖を表し; A represents the anti-sense strand, B1B2 represents the sense strand;
    Aが約14ヌクレオチド乃至約24ヌクレオチドであり; A is about 14 nucleotides to about 24 nucleotides;
    B1及びB2が各々個別に約1ヌクレオチド乃至約15ヌクレオチドであり; B1 and B2 are located at each individually about 1 nucleotide to about 15 nucleotides;
    B1及びB2を合わせた長さが約18ヌクレオチド乃至約24ヌクレオチドである; The combined length of B1 and B2 is about 18 nucleotides to about 24 nucleotides;
    siRNA分子と、 And the siRNA molecule,
    (b)約5乃至約40個のアミノ酸を具えるペプチドと; (B) a peptide comprising from about 5 to about 40 amino acids;
    を具え、前記siRNA分子が前記ペプチドと抱合していることを特徴とする組成物。 The comprise a composition wherein the siRNA molecule is conjugated to the peptide.
  56. 組成物において: In the composition:
    (a)低分子抑制核酸(siRNA)分子であって、当該siRNAがA、B1、及びB2(A:B1B2)の3本の鎖を具え; A (a) low molecular suppression nucleic acids (siRNA) molecule, the siRNA is A, B1, and B2 (A: B1B2) comprises three strands of;
    A:B1B2が合計で約14の塩基対乃至約22の塩基対を具え; A: B1B2 comprises a about 14 base pairs to about 22 base pairs in total;
    Aがアンチセンス鎖を表し、B1B2がセンス鎖を表し; A represents the anti-sense strand, B1B2 represents the sense strand;
    Aが約16ヌクレオチド乃至約22ヌクレオチドであり; A is about 16 nucleotides to about 22 nucleotides;
    B1及びB2が各々個別に約1ヌクレオチド乃至約15ヌクレオチドであり; B1 and B2 are located at each individually about 1 nucleotide to about 15 nucleotides;
    B1及びB2を合わせた長さが約18ヌクレオチド乃至約22ヌクレオチドである; The combined length of B1 and B2 is about 18 nucleotides to about 22 nucleotides;
    siRNA分子と、 And the siRNA molecule,
    (b)約5乃至約40個のアミノ酸を具えるペプチドと; (B) a peptide comprising from about 5 to about 40 amino acids;
    を具え、前記siRNA分子が前記ペプチドと抱合していることを特徴とする組成物。 The comprise a composition wherein the siRNA molecule is conjugated to the peptide.
  57. 組成物において: In the composition:
    (a)請求項24及び請求項53乃至56のいずれか1項に記載のsiRNA分子であって、当該siRNA分子が、レトロウィルス、呼吸器系ウィルス、ヒトメタニューモウィルス、ヒトパラインフルエンザウィルス、及びインフルエンザウィルスからなる群から選択される標的ウィルスの力価を低下させるのに有効であるsiRNA分子と; (A) a siRNA molecule according to any one of claims 24 and claims 53 to 56, the siRNA molecule, retroviruses, respiratory viruses, human metapneumovirus virus, human parainfluenza virus, and and siRNA molecules are effective in reducing the titer of the target virus is selected from the group consisting of influenza virus;
    (b)約5乃至約40個のアミノ酸を具えるペプチドと; (B) a peptide comprising from about 5 to about 40 amino acids;
    を具え、前記siRNA分子が前記ペプチドと抱合していることを特徴とする組成物。 The comprise a composition wherein the siRNA molecule is conjugated to the peptide.
  58. 前記ペプチドが、KRRQRRR(配列番号1)、RQIKIWFQNRRMKWKK(配列番号2)、DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVD(配列番号3)、AAVALLPAVLLALLAP(配列番号4)、AAVLLPVLLPVLLAAP(配列番号5)、VTVLALGALAGVGVG(配列番号6)、GALFLGWLGAAGSTMGA(配列番号7)、MGLGLHLLVLAAALQGA(配列番号8)、LGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP(配列番号9)、GWTLNSAGYLLKINLKALAALAKKIL(配列番号10)、TPPKKKRKVEDPKKKK(配列番号11)、RRRRRRR(配列番号12)、KLALKLALKALKAAL Said peptide, KRRQRRR (SEQ ID NO: 1), RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 2), DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVD (SEQ ID NO: 3), AAVALLPAVLLALLAP (SEQ ID NO: 4), AAVLLPVLLPVLLAAP (SEQ ID NO: 5), VTVLALGALAGVGVG (SEQ ID NO: 6), GALFLGWLGAAGSTMGA (SEQ ID NO: 7), MGLGLHLLVLAAALQGA (SEQ ID NO: 8), LGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP (SEQ ID NO: 9), GWTLNSAGYLLKINLKALAALAKKIL (SEQ ID NO: 10), TPPKKKRKVEDPKKKK (SEQ ID NO: 11), RRRRRRR (SEQ ID NO: 12), KLALKLALKALKAAL LA(配列番号13)、GLFGAIAGFIENGWEG(配列番号14)、FFGAVIGTIALGVATA(配列番号15)、FLGFLLGVGSAIASGV(配列番号16)、GVFVLGFLGFLATAGS(配列番号17)、GAAIGLAWIPYFGPAA(配列番号18)、ACTCPYCKDSEGRGSGDPGKKKQHICHIQGCGKVYGKTSHLRAHLRWHTGERPFMC(配列番号19)、ACTCPNCKDGEKRSGEQGKKKHVCHIPDCGKTFRKTSLLRAHVRLHTGERPFVC(配列番号20)、ACTCPNCKEGGGRGTNLGKKKQHICHIPGCGKVYGKTSHLRAHLRWHSGERPFVC(配列番号21)、ACSC LA (SEQ ID NO: 13), GLFGAIAGFIENGWEG (SEQ ID NO: 14), FFGAVIGTIALGVATA (SEQ ID NO: 15), FLGFLLGVGSAIASGV (SEQ ID NO: 16), GVFVLGFLGFLATAGS (SEQ ID NO: 17), GAAIGLAWIPYFGPAA (SEQ ID NO: 18), ACTCPYCKDSEGRGSGDPGKKKQHICHIQGCGKVYGKTSHLRAHLRWHTGERPFMC (SEQ ID NO: 19), ACTCPNCKDGEKRSGEQGKKKHVCHIPDCGKTFRKTSLLRAHVRLHTGERPFVC (SEQ ID NO: 20), ACTCPNCKEGGGRGTNLGKKKQHICHIPGCGKVYGKTSHLRAHLRWHSGERPFVC (SEQ ID NO: 21), ACSC NCREGEGRGSNEPGKKKQHICHIEGCGKVYGKTSHLRAHLRWHTGERPFIC(配列番号22)、RCTCPNCTNEMSGLPPIVGPDERGRKQHICHIPGCERLYGKASHLKTHLRWHTGERPFLC(配列番号23)、TCDCPNCQEAERLGPAGVHLRKKNIHSCHIPGCGKVYGKTSHLKAHLRWHTGERPFVC(配列番号24)、RCTCPNCKAIKHGDRGSQHTHLCSVPGCGKTYKKTSHLRAHLRKHTGDRPFVC(配列番号25)、PQISLKKKIFFFIFSNFRGDGKSRIHICHLCNKTYGKTSHLRAHLRGHAGNKPFAC(配列番号26)、WWETWKPFQC EnushiaruijiijiarujiesuenuiPijikeikeikeikyueichiaishieichiaiijishiGKVYGKTSHLRAHLRWHTGERPFIC (SEQ ID NO: 22), RCTCPNCTNEMSGLPPIVGPDERGRKQHICHIPGCERLYGKASHLKTHLRWHTGERPFLC (SEQ ID NO: 23), TCDCPNCQEAERLGPAGVHLRKKNIHSCHIPGCGKVYGKTSHLKAHLRWHTGERPFVC (SEQ ID NO: 24), RCTCPNCKAIKHGDRGSQHTHLCSVPGCGKTYKKTSHLRAHLRKHTGDRPFVC (SEQ ID NO: 25), PQISLKKKIFFFIFSNFRGDGKSRIHICHLCNKTYGKTSHLRAHLRGHAGNKPFAC (SEQ ID NO: 26), WWETWKPFQC RICMRNFSTRQARRNHRRRHR(配列番号27)、GKINLKALAALAKKIL(配列番号28)、RVIRVWFQNKRCKDKK(配列番号29)、GRKKRRQRRRPPQGRKKRRQRRRPPQGRKKRRQRRRPPQ(配列番号30)、GEQIAQLIAGYIDIILKKKKSK(配列番号31)、KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(配列番号33)、KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(配列番号37)、RKESYSVYVYKVLKQ(配列番号41)、KKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(配列番号42)、VTKAQKKDGKKRKRSRKE RICMRNFSTRQARRNHRRRHR (SEQ ID NO: 27), GKINLKALAALAKKIL (SEQ ID NO: 28), RVIRVWFQNKRCKDKK (SEQ ID NO: 29), GRKKRRQRRRPPQGRKKRRQRRRPPQGRKKRRQRRRPPQ (SEQ ID NO: 30), GEQIAQLIAGYIDIILKKKKSK (SEQ ID NO: 31), KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ (SEQ ID NO: 33), KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ (SEQ ID NO: 37), RKESYSVYVYKVLKQ (SEQ ID NO: 41), KKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ (SEQ ID NO: 42), VTKAQKKDGKKRKRSRKE YSVYVYKVLKQ(配列番号43)、AQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(配列番号44)、KDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(配列番号45)、KKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(配列番号46)、KRSRKESYSVYVYKVLKQ(配列番号47)、SYSVYVYKVLKQ(配列番号48)、VYVYKVLKQ(配列番号49)、YKVLKQ(配列番号50)、KVLKQ(配列番号51)、及びKGSKKAVTKAQKKEGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(配列番号52)からなる群から選択されるアミノ酸配列を具えることを特徴とする、請求項24及び請求項53乃至56のいずれか1項に記載の組成物。 YSVYVYKVLKQ (SEQ ID NO: 43), AQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ (SEQ ID NO: 44), KDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ (SEQ ID NO: 45), KKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ (SEQ ID NO: 46), KRSRKESYSVYVYKVLKQ (SEQ ID NO: 47), SYSVYVYKVLKQ (SEQ ID NO: 48), VYVYKVLKQ (SEQ ID NO: 49), YKVLKQ (SEQ ID NO: 50), KVLKQ (SEQ ID NO: 51), and characterized in that it comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of KeijiesukeikeieibuitikeieikyuKKEGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ (SEQ ID NO: 52), any one of claims 24 and claims 53 to 56 a composition according to item 1.
  59. 標的ウィルスの力価を低下させるためのsiRNA分子の使用において: In the use of siRNA molecules for reducing the titer of a target virus:
    (a)標的遺伝子が標的ウィルス遺伝子であるsiRNA媒介性ジーンサイレンシング用の標的遺伝子を選択するステップと; Comprising the steps of: (a) the target gene to select a target gene for siRNA-mediated gene silencing is a target viral gene;
    (b)前記標的ウィルス遺伝子のsiRNA媒介性ジーンサイレンシング用に適切なsiRNA分子を設計及び/又は合成するステップであって、前記siRNA分子の各々がギャップ又はニックを有する二重鎖を具え、前記ギャップ又はニックが前記siRNA二重鎖のセンス鎖又はアンチセンス鎖のいずれかに発現するステップと、 A step of designing and / or synthesizing suitable siRNA molecules for siRNA-mediated gene silencing (b) the target viral genes, comprising a duplex, each having a gap or nick of the siRNA molecule, wherein a step gap or Nick expressed in either sense or antisense strand of the siRNA duplex,
    (c)前記siRNAを、約5乃至約40個のアミノ酸を具えるペプチドに抱合するステップと、 (C) a said siRNA, comprising the steps of conjugating to a peptide comprising from about 5 to about 40 amino acids,
    (d)前記siRNA分子を前記標的ウィルス遺伝子を発現する細胞へ投与するステップと; And (d) step of administering the siRNA molecule to cells expressing the target viral gene;
    を具え、前記siRNA分子とペプチドとの抱合体が前記対応する標的ウィルスのmRNAと特異的に結合可能であり、これによって前記細胞内の発現レベルを低下させることを特徴とする使用。 The comprises the a conjugate between siRNA molecule and a peptide can bind to mRNA specifically of the corresponding target virus, use, characterized in that that reduces the expression level of said cell thereby.
  60. 標的ウィルス遺伝子のsiRNA媒介性ジーンサイレンシングによって標的ウィルスの力価を低下させる薬物を製造するためのsiRNA分子の使用において、前記siRNA分子の各々がギャップ又はニックを有する二重鎖を具え、前記ギャップ又はニックが前記siRNA二重鎖のセンス鎖又はアンチセンス鎖の一方に発現し;前記siRNAが約5乃至約40個のアミノ酸を含むペプチドと抱合し;前記siRNA分子とペプチドとの抱合体が前記対応する標的ウィルスのmRNAと特異的に結合可能であり、これによって前記細胞内の発現レベルを低下させることを特徴とする使用。 In the use of siRNA molecules for the production of drugs that lower the titer of the target virus by siRNA-mediated gene silencing of a target viral gene, comprising a duplex, each having a gap or nick of the siRNA molecule, wherein the gap or nick expressed in one of the sense or antisense strand of the siRNA duplex; the siRNA is conjugated to a peptide containing about 5 to about 40 amino acids; conjugates of the siRNA molecule and peptide wherein a possible mRNA specifically binds to a corresponding target virus used, wherein this by reducing the expression level of said cell.
  61. 内在性遺伝子の発現を低下させるためのsiRNA分子の使用において: In the use of siRNA molecules for reducing the expression of endogenous genes:
    (a)siRNA媒介性ジーンサイレンシングのための標的遺伝子を選択するステップであって、当該標的遺伝子が内在性遺伝子であるステップと; Comprising the steps of: (a) selecting a target gene for siRNA-mediated gene silencing, a step the target gene is an endogenous gene;
    (b)前記内在性標的遺伝子のsiRNA媒介性ジーンサイレンシングのための適切なギャップ又はニックを有する二重鎖siRNA分子を設計及び/又は合成するステップであって、前記siRNA分子がギャップ又はニックを有する二重鎖を具え、前記ギャップ若しくはニックが前記siRNA分子のセンス鎖又はアンチセンス鎖のいずれかに発現するステップと; And (b) designing and / or synthetic double stranded siRNA molecule with appropriate gaps or nicks for siRNA-mediated gene silencing of the endogenous target gene, wherein the siRNA molecule is a gap or nick comprising a duplex with the steps of the gap or nick expressed either sense or antisense strand of the siRNA molecule;
    (c)前記siRNAを約5乃至約40個のアミノ酸を具えるペプチドと抱合するステップと; (C) a step of conjugation to a peptide comprising from about 5 to about 40 amino acids of the siRNA;
    (d)前記siRNA分子を前記内在性標的遺伝子を発現する細胞へ投与するステップと; And (d) step of administering the siRNA molecule to cells expressing the endogenous target gene;
    を具え、前記siRNA分子とペプチドとの抱合体が前記対応する内在性標的mRNAと特異的に結合可能であり、これによって前記細胞内の発現レベルを低下させることを特徴とする方法。 The comprises the a conjugate between siRNA molecule and a peptide can bind the so corresponding endogenous target mRNA-specific, wherein the reducing the expression level of said cell thereby.
  62. 内在性標的遺伝子のsiRNA媒介性ジーンサイレンシングによって内在性遺伝子の発現を低下させる薬物を製造するためのsiRNA分子の使用において、前記siRNA分子がギャップ又はニックを有する二重鎖を具え、前記ギャップ又はニックが前記siRNA分子のセンス鎖又はアンチセンス鎖のいずれかに発現し;前記siRNAが約5乃至約40個のアミノ酸を含むペプチドと抱合し;前記siRNA分子とペプチドとの抱合体が前記対応する内在性標的mRNAと特異的に結合可能であり、これによって前記細胞内の発現レベルを低下させることを特徴とする使用。 In the use of siRNA molecules for the manufacture of a medicament for decreasing expression of endogenous genes by siRNA-mediated gene silencing of the endogenous target gene, comprising a duplex wherein the siRNA molecule has a gap or nick, the gap or Nick expressed in either sense or antisense strand of the siRNA molecule; wherein the siRNA is conjugated to a peptide containing about 5 to about 40 amino acids; conjugates of the siRNA molecule and peptide said corresponding is capable of binding endogenous target mRNA and specific, which by the use, characterized in that reduces the expression level of said cell.
  63. 医療に使用する、請求項1乃至13又は請求項24乃至58のいずれか1項に記載の組成物。 Medical use, the composition according to any one of claims 1 to 13 or claim 24 to 58.
  64. TNF−αに関連する炎症を回復させる薬物として使用する、請求項1乃至3又は請求項6乃至13のいずれか1項に記載の組成物。 Use as a medicament for recovering the inflammation associated with TNF-alpha, composition according to any one of claims 1 to 3 or claims 6 to 13.
  65. 前記炎症が関節炎に生じていることを特徴とする請求項64に記載の組成物。 The composition of claim 64, wherein said inflammation occurs in arthritis.
  66. 前記炎症が乾癬に生じていることを特徴とする請求項64に記載の組成物。 The composition of claim 64, wherein said inflammation occurs in psoriasis.
  67. インフルエンザウィルスに関連する感染症を回復させる薬物として使用する、請求項1に記載の組成物。 Use as a medicament for recovering the infectious diseases associated with influenza virus composition of claim 1.
JP2008539062A 2005-11-04 2006-11-03 Peptides as delivery vehicles for siRNA - base substrate RNA conjugates Granted JP2009514877A (en)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US73366505P true 2005-11-04 2005-11-04
US82289606P true 2006-08-18 2006-08-18
PCT/US2006/042978 WO2007056153A2 (en) 2005-11-04 2006-11-03 Peptide-dicer substrate rna conjugates as delivery vehicles for sirna

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2009514877A true JP2009514877A (en) 2009-04-09

Family

ID=37873110

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2008539062A Granted JP2009514877A (en) 2005-11-04 2006-11-03 Peptides as delivery vehicles for siRNA - base substrate RNA conjugates

Country Status (7)

Country Link
EP (1) EP1942943A2 (en)
JP (1) JP2009514877A (en)
KR (1) KR20080066987A (en)
AU (1) AU2006311912A1 (en)
CA (1) CA2628113A1 (en)
IL (1) IL191147D0 (en)
WO (1) WO2007056153A2 (en)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010506598A (en) * 2006-10-18 2010-03-04 エムディーアールエヌエー,インコーポレイテッド Containing nucleic acid molecules and their use of the nick or gap

Families Citing this family (86)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1606406B2 (en) 2003-03-21 2013-11-27 Santaris Pharma A/S SHORT INTERFERING RNA (siRNA) ANALOGUES
ES2384940T3 (en) 2004-01-16 2012-07-16 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Inmunoquinasas
US20070213293A1 (en) * 2005-04-08 2007-09-13 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Rnai therapeutic for respiratory virus infection
EP1800695A1 (en) * 2005-12-21 2007-06-27 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Immuno-RNA-constructs
AU2007229161B2 (en) * 2006-03-23 2012-07-12 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Small internally segmented interfering RNA
CA2663601C (en) * 2006-09-22 2014-11-25 Dharmacon, Inc. Duplex oligonucleotide complexes and methods for gene silencing by rna interference
DE102007008596B4 (en) 2007-02-15 2010-09-02 Friedrich-Schiller-Universität Jena Biologically active molecules on the basis of PNA and siRNA, methods for their cell-specific activation and application kit for administration
WO2008109475A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting sirt2 gene expression and uses thereof
WO2008109379A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting il17a gene expression and uses thereof
WO2008109556A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting telomerase gene expression and uses thereof
WO2008109551A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting tacstd1 gene expression and uses thereof
WO2008109369A2 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting tnf gene expression and uses thereof
WO2008109495A2 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting cd40 gene expression and uses thereof
US20100041140A1 (en) * 2007-03-02 2010-02-18 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting bcl2 gene expression and uses thereof
WO2008109356A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting tnfsf13b gene expression and uses thereof
WO2008109374A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting mapk gene expression and uses thereof
WO2008109526A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting egr gene expression and uses thereof
WO2008109468A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting mmp gene expression and uses thereof
WO2008109350A2 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting il6 gene expression and uses thereof
WO2008109497A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting folh1 gene expression and uses thereof
WO2008109359A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting pdgfr family gene expression and uses thereof
WO2008109500A2 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting prkca gene expression and uses thereof
WO2008109376A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting bcr-abl gene expression and uses thereof
WO2008109553A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting ptpn11 gene expression and uses thereof
WO2008109377A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting vegf family gene expression and uses thereof
WO2008109454A2 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting fos gene expression and uses thereof
WO2008109443A2 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting cdk2 gene expression and uses thereof
WO2008109532A2 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting fas gene expression and uses thereof
WO2008109358A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting mapk1 gene expression and uses thereof
WO2008109547A2 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting tymp gene expression and uses thereof
JP2010519911A (en) * 2007-03-02 2010-06-10 エムディーアールエヌエー,インコーポレイテッド Nucleic acid compounds and their use for inhibiting the expression of Myc gene
WO2008109372A2 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting pdgf gene expression and uses thereof
WO2008109511A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting fcer2 gene expression and uses thereof
WO2008109555A2 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting nrg1 gene expression and uses thereof
WO2008109558A2 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting tlr gene expression and uses thereof
US20100112687A1 (en) * 2007-03-02 2010-05-06 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting erbb family gene expression and uses thereof
WO2008109548A2 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting tgfb gene expression and uses thereof
US20080293136A1 (en) * 2007-03-02 2008-11-27 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting akt gene expression and uses thereof
WO2008109492A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting igf1r gene expression and uses thereof
WO2008109373A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting erbb gene expression and uses thereof
WO2008109503A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting ms4a1 gene expression and uses thereof
WO2008109490A2 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting chek1 gene expression and uses thereof
WO2008109544A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting muc1 gene expression and uses thereof
WO2008109546A2 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting tgfbr gene expression and uses thereof
CA2679388A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting ras gene expression and uses thereof
WO2008109534A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting ezh2 gene expression and uses thereof
WO2008109473A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting abcb1 gene expression and uses thereof
WO2008109493A2 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting cd19 gene expression and uses thereof
WO2008109370A2 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting srd5a1 gene expression and uses thereof
WO2008109368A2 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting vegfr gene expression and uses thereof
JP2010519908A (en) * 2007-03-02 2010-06-10 エムディーアールエヌエー,インコーポレイテッド Nucleic acid compounds and their use for inhibiting the expression of Hif1a gene
WO2008109382A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting pkn3 gene expression and uses thereof
WO2008109365A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting raf1 gene expression and uses thereof
WO2008109506A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting jun gene expression and uses thereof
WO2008109354A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting il18 gene expression and uses thereof
WO2008109366A2 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting ccnd1 gene expression and uses thereof
WO2008109487A2 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting mme gene expression and uses thereof
US20080299659A1 (en) * 2007-03-02 2008-12-04 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting apob gene expression and uses thereof
WO2008109380A2 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting vegfr family gene expression and uses thereof
WO2008109371A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting p38 mapk family gene expression and uses thereof
WO2008109488A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting angpt2 gene expression and uses thereof
WO2008109505A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting cd22 gene expression and uses thereof
WO2008109509A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting snca gene expression and uses thereof
WO2008109461A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting cd3 gene expression and uses thereof
WO2008109364A2 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting frap1 gene expression and uses thereof
WO2008109498A2 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting hdac gene expression and uses thereof
WO2008109378A2 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting pdgfr gene expression and uses thereof
WO2008109531A2 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Ndrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting hsd11b1 expression and uses thereof
WO2008109375A2 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting pik3c gene expression and uses thereof
WO2008109353A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting map2k gene expression and uses thereof
WO2008109494A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting stat3 gene expression and uses thereof
WO2008109362A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting vegf gene expression and uses thereof
WO2008109355A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting srd5a2 gene expression and uses thereof
WO2008109520A2 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting cxc gene expression and uses thereof
EP2121926A1 (en) * 2007-03-02 2009-11-25 MDRNA, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting wnt gene expression and uses thereof
CN101918554B (en) * 2007-12-18 2013-07-03 独立行政法人产业技术综合研究所 Complex of polysaccharide and double-stranded RNA
KR20110110776A (en) 2008-12-18 2011-10-07 다이서나 파마수이티컬, 인크. Extended dicer substrate agents and methods for the specific inhibition of gene expression
WO2010093788A2 (en) 2009-02-11 2010-08-19 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Multiplex dicer substrate rna interference molecules having joining sequences
DE102009043743B4 (en) 2009-03-13 2016-10-13 Friedrich-Schiller-Universität Jena Cell specific molecules on the basis of effective siRNA and application kits for their preparation and use
US9096850B2 (en) 2009-08-24 2015-08-04 Sirna Therapeutics, Inc. Segmented micro RNA mimetics
AU2010306940A1 (en) 2009-10-12 2012-06-07 Smith, Larry Methods and compositions for modulating gene expression using oligonucleotide based drugs administered in vivo or in vitro
CN102791862B (en) * 2009-12-31 2017-04-05 库尔纳公司 By inhibiting insulin receptor substrate 2 (irs2) and transcription factor e3 (tfe3) natural antisense transcripts treating related diseases IRS2
KR101678876B1 (en) * 2010-01-15 2016-11-23 한국과학기술원 Multi-conjugate of siRNA targeting multiple genes and preparing method thereof
DE102010009445A1 (en) * 2010-02-25 2011-08-25 Universitätsklinikum Jena, 07743 Expression vector comprising promoter, interfaces to insert use-specific gene sequence and genetic information expressing enzyme, useful to express peptide-inhibited small interfering RNA cleaving enzyme, preferably protease or peptidase
TW201141513A (en) 2010-04-14 2011-12-01 Sanofi Aventis Insulin-siRNA conjugates
US8987377B2 (en) * 2010-11-19 2015-03-24 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Poly(amide) polymers for the delivery of oligonucleotides

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH08301791A (en) * 1995-05-12 1996-11-19 Agency Of Ind Science & Technol Functional molecule transporter
JPH1121255A (en) * 1997-07-02 1999-01-26 Hisamitsu Pharmaceut Co Inc Functional molecule transporter and its production
WO2004015107A2 (en) * 2002-08-05 2004-02-19 Atugen Ag Further novel forms of interfering rna molecules
WO2004044136A2 (en) * 2002-11-05 2004-05-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions comprising alternating 2’-modified nucleosides for use in gene modulation
WO2004044138A2 (en) * 2002-11-05 2004-05-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Chimeric oligomeric compounds and their use in gene modulation
JP2004528266A (en) * 2000-04-12 2004-09-16 インプリクス リミテッド Drug delivery composition
JP2005508394A (en) * 2001-11-06 2005-03-31 マイラス コーポレイション siRNA, the compositions and methods using amphiphilic compound and a polycation

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2003217550A1 (en) * 2002-02-20 2003-09-09 Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF TNF AND TNF RECEPTOR SUPERFAMILY GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
WO2003086273A2 (en) * 2002-04-08 2003-10-23 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Histone conjugates and uses thereof
AU2003279004B2 (en) * 2002-09-28 2009-10-08 Massachusetts Institute Of Technology Influenza therapeutic
CA2506714A1 (en) * 2002-11-26 2004-06-10 University Of Massachusetts Delivery of sirnas
EP1750775A2 (en) * 2004-05-04 2007-02-14 Nastech Pharmaceutical Company, Inc. Compositions and methods for enhancing delivery of nucleic acids into cells and for modifying expression of target genes in cells
US20060040882A1 (en) * 2004-05-04 2006-02-23 Lishan Chen Compostions and methods for enhancing delivery of nucleic acids into cells and for modifying expression of target genes in cells

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH08301791A (en) * 1995-05-12 1996-11-19 Agency Of Ind Science & Technol Functional molecule transporter
JPH1121255A (en) * 1997-07-02 1999-01-26 Hisamitsu Pharmaceut Co Inc Functional molecule transporter and its production
JP2004528266A (en) * 2000-04-12 2004-09-16 インプリクス リミテッド Drug delivery composition
JP2005508394A (en) * 2001-11-06 2005-03-31 マイラス コーポレイション siRNA, the compositions and methods using amphiphilic compound and a polycation
WO2004015107A2 (en) * 2002-08-05 2004-02-19 Atugen Ag Further novel forms of interfering rna molecules
WO2004044136A2 (en) * 2002-11-05 2004-05-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions comprising alternating 2’-modified nucleosides for use in gene modulation
WO2004044133A2 (en) * 2002-11-05 2004-05-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modified oligonucleotides for use in rna interference
WO2004044138A2 (en) * 2002-11-05 2004-05-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Chimeric oligomeric compounds and their use in gene modulation

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JPN6012034894; Mol. Cell. Biol. Vol.7, No.11, 1987, p.4048-4057 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010506598A (en) * 2006-10-18 2010-03-04 エムディーアールエヌエー,インコーポレイテッド Containing nucleic acid molecules and their use of the nick or gap

Also Published As

Publication number Publication date
WO2007056153A3 (en) 2007-09-07
AU2006311912A1 (en) 2007-05-18
IL191147D0 (en) 2008-12-29
KR20080066987A (en) 2008-07-17
CA2628113A1 (en) 2007-05-18
EP1942943A2 (en) 2008-07-16
WO2007056153A2 (en) 2007-05-18
WO2007056153B1 (en) 2007-10-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1458741B1 (en) Rna interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid
JP5697988B2 (en) Silencing method of Polo-like kinase expression using interfering rna
EP1423404B1 (en) RNA INTERFERENCE MEDIATED TREATMENT OF ALZHEIMER'S DISEASE USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
DK2494993T3 (en) Aminosyrelipider and uses thereof
AU2004266311B2 (en) RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
KR101857707B1 (en) Compositions and methods for modulating apolipoprotein c-iii expression
EP1713915B1 (en) RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF GENE EXPRESSION USING MULTIFUNCTIONAL SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (MULTIFUNCTIONAL siNA)
JP6165158B2 (en) RNAi agents for treating transthyretin (TTR) related disease, the composition, and methods of using these
CN102643818B (en) Oligoribonucleotides and methods of use thereof for treatment of alopecia, acute renal failure and other diseases
US7838658B2 (en) siRNA silencing of filovirus gene expression
US20050239731A1 (en) RNA interference mediated inhibition of MAP kinase gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20150259686A1 (en) Nicked or gapped nucleic acid molecules and uses thereof
EP1572128B1 (en) RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF HIV GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US20030148507A1 (en) RNA interference mediated inhibition of prostaglandin D2 receptor (PTGDR) and prostaglandin D2 synthetase (PTGDS) gene expression using short interfering RNA
US20040019001A1 (en) RNA interference mediated inhibition of protein typrosine phosphatase-1B (PTP-1B) gene expression using short interfering RNA
US20050227935A1 (en) RNA interference mediated inhibition of TNF and TNF receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US9023820B2 (en) Compositions and methods for silencing apolipoprotein C-III expression
US20070155658A1 (en) Nanoparticles for delivery of nucleic acids and stable double-stranded rna
RU2623160C9 (en) Composition of delivery system based on conjugate for rna-interference polynucleotide delivery to liver cell and process for its preparation
US20080214436A1 (en) Methods and compositions for the treatment of cancer or other diseases
JP4358521B2 (en) Conjugates and compositions for cell delivery
US20040219671A1 (en) RNA interference mediated treatment of parkinson disease using short interfering nucleic acid (siNA)
US7517864B2 (en) RNA interference mediated inhibition of vascular endothelial growth factor and vascular endothelial growth factor receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US10131904B2 (en) Modified RNAi polynucleotides and uses thereof
US20050048529A1 (en) RNA interference mediated inhibition of intercellular adhesion molecule (ICAM) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20091028

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20091028

RD04 Notification of resignation of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424

Effective date: 20100407

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20120710

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20121204