JP2009504181A - 膜に囲まれた細胞または細胞小器官の内外へ生体分子をデリバリーするのに適したナノ粒子 - Google Patents
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Abstract
Description
膜に囲まれた細胞または細胞小器官および本発明の複数の粒子を含むサンプルを提供すること;
前記サンプルに交番磁界を適用し、これにより粒子コアの熱エネルギーが、前記粒子の熱感受性コーティングの分解を引き起こし、これにより前記破壊剤が、膜に囲まれた細胞または細胞小器官の膜を破壊し、前記物質が放出すること
を含む方法に関する。
鉄カルボン酸塩の熱分解
単分散粒子(11±1 nm)を作成するために、以下の手順を使用した。360 mgの酸化鉄(III)を小粒子にすりつぶし、5 gのオレイン酸および11 gの1-オクタデセンに添加した。その溶液を混合し、三つ口ボトルフラスコに移し、磁気スターラーを備えた加熱マンテルに置き、温度が少なくとも320℃に達し、1-オクタデセンが沸騰し始めるまで加熱する。1時間の反応時間の間、温度をモニターし、好ましくは、上記温度以下に下がらないようにすべきである。1時間のインキュベーション後、溶液を室温まで冷却した。粒子を、エタノール、メタノール、クロロホルム、またはこれらの組み合わせにより繰返し洗浄することにより、余分な試薬から精製し、最後に、クロロホルムまたはヘキサンに再懸濁する。
ポリ(エチレングリコール)−脂質表面コーティング
粒子をクロロホルムに短時間で懸濁し、その後、真空下で乾燥させた。30〜60モル%のリン脂質(たとえば、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリンまたは化学構造の類似した他のもの)および40モル%以上のPEG-脂質(たとえば、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000]、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[アミノ(ポリエチレングリコール)2000]または類似のPEG-脂質、または化学構造の類似した他のもの)を含有するクロロホルム溶液を、乾燥粒子に添加し、その後、これを溶液に戻す。クロロホルムを蒸発させ、粒子を1〜4時間更に乾燥させる。その後、粒子を、水、NaClまたは通常の生理緩衝液を用いて水和し、穏やかに超音波処理し、100 nmフィルターを通して無菌濾過することができる透明な溶液を得る。粒子を、急勾配磁選により脂質およびPEG-脂質から精製し、4℃で保存する。しかし、粒子は、性質に目立った変化がなければ、室温で何週間もの間、保存してもよい。粒子は、生理食塩水の濃度の通常の緩衝液中で、何週間もの間、コロイド状で安定なままである。粒子は、10% FCS(血清)を含有する複合増殖培地においても、3日間を超える期間、安定なままであり、上限の時間は試験していないが、更に長期間、溶液中で安定なままである。
粒子懸濁液を、1.2 Tの高い永久磁界に晒された磁気マトリクスを含有するカラムに添加する。磁気マトリクスが高い磁界に晒されている限り、粒子は、磁気マトリクスに保持される。磁界を除くと、粒子は、水または所望の緩衝溶液を用いて溶出された。また、少量の体積を溶出することにより、磁気カラム上で磁性流体を濃縮することもできる。
粒子懸濁液を、SephacrylTM S-500高分解能ゲルを充填したカラムに添加する。磁性流体を、サイズ排除により、結合している化学物質および/または塩から分離する。磁性流体は、水または所望の緩衝溶液を用いて溶出される。
粒子の酸化鉄コアの平均直径は、TEM(透過型電子顕微鏡)を用いて11±1 nmであると算定された(図1参照)。全粒子の直径は、脂質の表面層の組成およびキャリア液体の特徴に依存して変化する。磁性ナノ粒子は、容易に無菌濾過され、通常の生理緩衝液中で、コロイド状で安定であるため、粒子の作成および更なる修飾のプロセスの間に、サイズ排除クロマトグラフィー、透析、および急勾配磁選を利用することができた。粒子の表面上のアミノ基は、Fluram(登録商標)を用いて標準的なプロトコールで分析し、アミノ基の量は、粒子の安定性に影響を及ぼすことなく、粒子あたり数百〜数千のアミノ基の間で変化させることができた。更に、アミノ基は、他の官能基または分子を付加するために、通常の確立されたカップリング化学を用いて共有結合に利用することができる。
交番磁界における熱損失
粒子のコアは、超常磁性であり、かかる粒子が交番磁界に晒されると、周囲の培地へと熱が失われる。粒子の比吸光率(SAR)の振動数依存性を試験し、評価した。500ワット/gを超えるSAR値は、図2に示されるとおり、10 MHzの振動数および2.8 mTの磁界の強さで達成された。
粒子の表面からの分子の放出に対する熱の効果
リン脂質およびFluram(登録商標)で蛍光標識されたアミノ基をもつアミノ-PEG-脂質を有する粒子を含有するサンプルを、10 MHz、2.9 mTで5分間処理し、その後、磁選を行い、粒子の表面上の熱に対する最初の徴候と、磁界において起こり得る熱放出を得た。
1.2〜6%のアミノ基が、加熱により粒子から放出される。
アミノ-PEG-nnおよびリン脂質の両方が、同じ速度および温度で放出されるかどうか調べるために、FITC標識リン脂質を有する粒子を含むサンプルを、通常の水浴中で40〜95℃の温度で5分間処理した。
1.FITC標識リン脂質の最大25%が、80℃より高い温度で5分間加熱すると、粒子から放出される。
粒子の表面上のアミノ基に共有結合したFITC標識HIV TATぺプチドを有する粒子を含むサンプルを、上述のとおり処理した。この例は、アミノ基と別の分子の間に熱感受性の結合を共有結合でつくることにより放出効果を高めることができるかどうか調べるためにセットアップした。粒子とTATペプチドの間にジスルフィド架橋を生成するメディエイターとしてSPDPを用いて、ペプチドを粒子に結合させた。ジスルフィド架橋は、相対的に熱感受性であることが知られている。
1.3〜13%のTAT-ペプチドが、加熱により粒子から放出された。
細胞増殖
付着細胞株COS-7は、DMEM、10% FCSおよび5%ストレプトマイシン/ペニシリンにおいて増殖させた。懸濁細胞株K562は、RPMI、10% FCS、および5% CO2において増殖させた。細胞は、一週間あたり2回継代した。
COS-7およびK562細胞を回収し、96ウェルプレートに、ウェルあたり105細胞で、それぞれ100μlの完全DMEMまたはRPMIに播いた。増殖スタンダードのための細胞を、104〜105細胞/ウェルで、同じものを3つずつ播いた。アミノ基、直鎖PEI、または分枝PEIを有する粒子を、適切な緩衝液で様々なFe濃度に希釈した。様々な粒子の各希釈液を、同じものを4つずつ、細胞に添加し、細胞あたり50〜250 pg Feの最終Fe濃度にした。更に、粒子/細胞複合体を交番磁界10 MHz、2.9 mTに晒した際のCOS-7細胞の増殖に関する試験を、図3に示される実験セットアップを用いて行った。コイルを冷却し、サンプルを所望の温度に維持するために水浴を使用した。サンプル内の温度は、RF磁界に影響を受けない光ファイバー温度計を用いて継続的にモニターする。
細胞の分離および洗浄
K562細胞を、24ウェルマイクロタイタープレートに、ウェルあたり1 mlの培地を用いて播いた。DOTAB/DOPE/リン脂質を混合コーティングで有する粒子を、以下の濃度で細胞に添加した:
サンプル1:1ピコグラムFe/細胞、2時間インキュベートした
サンプル2:2ピコグラムFe/細胞、2時間インキュベートした
サンプル3:2ピコグラムFe/細胞、2時間インキュベートし、分離カラムで磁石を使用しなかった
サンプル4:2ピコグラムFe/細胞、24時間インキュベートした
サンプル5:2ピコグラムFe/細胞、48時間インキュベートした
サンプル5:2ピコグラムFe/細胞、72時間インキュベートした
サンプル7:0ピコグラムFe/細胞、2時間インキュベートした。
フロースルー(FT)
洗浄1、2、3(W1、W2、W3)
溶出(E)。
細胞の取込みおよび粒子の分布
超常磁性ナノ粒子とともに1時間および24時間インキュベートしたCOS-7細胞の蛍光顕微鏡検査を、細胞を通過する輸送について粒子を追跡するために利用した。粒子は、細胞により容易かつ比較的迅速に取り込まれ、細胞内に均一に分布することが分かる。
プラスミドDNA結合能
粒子表面上のアミノPEGに直鎖PEI(ポリエチレンイミン)または分枝PEIを共有結合しているか、または共有結合していないナノ粒子を、緩衝液で同じ粒子濃度に希釈した。粒子を、同量のDNA(100 ng)と、DNAに対する粒子の様々な比率(0.1−500)で混合した。DNAスタンダードを調製した(10−500 ng/ml)。その溶液を室温で10分間インキュベートし、その後、PicoGreen(登録商標)を添加し、蛍光を測定した(Ex 485/Em 520)。その結果を図5に示し、粒子の全てが、DNAを結合することができ、分枝PEIを露出した表面を有する粒子が、最も効率よくDNAを結合すると結論づけることができる。
PEG-NH2のみを有する粒子と比較した、SDS、DOPEおよびDOTABの混合物を有する粒子によるトランスフェクション
細胞(K562)を、texas redおよびルシフェラーゼをコードするプラスミド(phRL-SV40)を有するDOTAB/DOPE/SDSコーティングを備えた粒子とともに3時間インキュベートし、レファレンスとして、細胞を、ルシフェラーゼをコードするプラスミド(phRL-SV40)を有するアミノ-PEG(NH2)コーティングを備えた粒子とともに同様にインキュベートした。インキュベーション後、細胞を、AMF(交番磁界)において、30秒のパルスおよびパルス間の30秒の休止で繰返し処理した。
Claims (21)
- 膜に囲まれた細胞または細胞小器官の内外へ、物質の熱誘導放出を介して物質をデリバリーするのに適した粒子であって、前記物質および膜破壊剤が結合している熱感受性コーティングでカプセル化された、交番磁界で熱を発生させることが可能な超常磁性コアを含む粒子。
- 前記超常磁性コアのサイズが、1〜100 nm、好ましくは8〜15ナノメートルである、請求項1に記載の粒子。
- 前記超常磁性コアが、磁鉄鉱、磁赤鉄鉱、酸化鉄水和物(ironoxidehydrate)、一般式MeOxFe2O3のフェライト(ここでMeはCo, Ni, Mn, Be, Mg, Ca, Ba, Sr, Cu, Zn, Pt, Al, Cr, Biおよびこれらの組合せからなる群より選択される二価金属である)からなる、請求項1または2に記載の粒子。
- 前記熱感受性コーティングが、前記コアと直接接触したミセル様構造を含む、請求項1〜3の何れか1項に記載の粒子。
- 前記ミセル様構造が、少なくとも一つの疎水性分子、および疎水性部分と親水性部分の両方を含有する少なくとも一つの分子により形成される、請求項4に記載の粒子。
- 前記熱感受性コーティングが、一または複数のジスルフィド結合、ペルオキシド結合、またはアゾ結合、またはこれらの組合せにより、前記物質および膜破壊剤に結合している、請求項4または5に記載の粒子。
- 前記親水性部分の構造が、ポリマー、脂質、合成分子、タンパク質、またはこれらの組合せを含有する、請求項5に記載の粒子。
- 認識分子が、熱感受性コーティングに更に結合している、請求項1〜7の何れか1項に記載の粒子。
- 前記認識分子が、抗体、抗体のフラグメント、およびレクチンからなる群より選択される、請求項8に記載の粒子。
- 前記膜破壊剤が、洗浄剤、コレステロール、疎水性タンパク質、および界面活性剤、およびこれらの混合物からなる群より選択される、請求項1〜9の何れか1項に記載の粒子。
- 前記物質が、DNA分子、RNA分子、タンパク質、ペプチド、脂質、化学製品、有機化合物、洗浄剤、合成ポリマー、およびこれらの組合せからなる群より選択される、請求項1〜10の何れか1項に記載の粒子。
- 宿主細胞の遺伝暗号および/または代謝を改変するための、請求項1〜11の何れか1項に記載の粒子の使用。
- エンドソームまたはリソソームの細胞小器官から前記物質を放出するための、請求項1〜11の何れか1項に記載の粒子の使用。
- 膜に囲まれた細胞または細胞小器官の内外へ、膜破壊剤の熱誘導放出と組合せて物質の熱誘導放出を介して、物質をデリバリーする方法であって、
膜に囲まれた細胞または細胞小器官および請求項1〜11の何れか1項に記載の複数の粒子を含むサンプルを提供すること;
前記サンプルに交番磁界を適用し、これにより粒子コアの熱エネルギーが、前記粒子の熱感受性コーティングの分解を引き起こし、これにより前記破壊剤が、膜に囲まれた細胞または細胞小器官の膜を破壊し、前記物質が放出すること
を含む方法。 - 前記磁界が、0.1〜5 MHzの範囲の振動数の交番磁界の向きを有する、請求項14に記載の方法。
- 前記磁界が、1〜100 mTの範囲の磁界の強さを有する、請求項14または15に記載の方法。
- 前記磁界が、時間をかけて一連のパルスとして繰返し暴露され、各パルスの期間が、好ましくは1〜600 s、更に好ましくは1〜45秒である、請求項16に記載の方法。
- 前記磁界が、不均一な交番磁界を有するとともに、勾配交番磁界の向きを有し、前記交番磁界の向きが、二つのコイルにより発生され、前記サンプルが、コイルの間に挿入される、請求項14〜17の何れか1項に記載の方法。
- 前記コイルが、供給される交流のポジティブ部分またはネガティブ部分の何れかを供給されている、請求項18に記載の方法。
- 前記物質が、DNA分子、RNA分子、タンパク質、ペプチド、脂質、化学製品、有機化合物、洗浄剤、合成ポリマー、およびこれらの組合せからなる群より選択される、請求項14〜19の何れか1項に記載の方法。
- 前記膜破壊剤が、洗浄剤、コレステロール、疎水性タンパク質、および界面活性剤、およびこれらの混合物からなる群より選択される、請求項14〜20の何れか1項に記載の方法。
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