JP2009153381A - オリゴヌクレオチド固定化固相担体 - Google Patents
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Abstract
【課題】５’末端に脱離基を有するオリゴヌクレオチドを結合し、かつ二重結合形成能を有する固相担体及びオリゴヌクレオチド固相合成方法の提供。
【解決手段】遺伝子中の所定の塩基配列部分に相補的な相補性塩基配列部分を有するオリゴヌクレオチドの５’末端側に脱離基を結合し、３’末端側に固相担体を結合してなる、相補性オリゴヌクレオチド固定化固相担体と、上記遺伝子中の所定の塩基配列部分に隣接する塩基配列部分に相補的な相補性塩基配列部分を有するオリゴヌクレオチドの３’末端側に求核性の高い官能基を有する、相補性オリゴヌクレオチドとを反応させるオリゴヌクレオチド固相合成方法。
【選択図】なし
【解決手段】遺伝子中の所定の塩基配列部分に相補的な相補性塩基配列部分を有するオリゴヌクレオチドの５’末端側に脱離基を結合し、３’末端側に固相担体を結合してなる、相補性オリゴヌクレオチド固定化固相担体と、上記遺伝子中の所定の塩基配列部分に隣接する塩基配列部分に相補的な相補性塩基配列部分を有するオリゴヌクレオチドの３’末端側に求核性の高い官能基を有する、相補性オリゴヌクレオチドとを反応させるオリゴヌクレオチド固相合成方法。
【選択図】なし
Description
本発明は、オリゴヌクレオチド固定化固相担体に関する。
本発明のオリゴヌクレオチド固定化固相担体は、長鎖ＤＮＡの合成や、ＳＮＰｓ解析の感度を向上させるために有用である。
本発明のオリゴヌクレオチド固定化固相担体は、長鎖ＤＮＡの合成や、ＳＮＰｓ解析の感度を向上させるために有用である。
遺伝子工学において、核酸分子、例えばＤＮＡの切断及び連結は最も重要な基本的手法の一つである。従って、遺伝子工学の発展に伴い、ＤＮＡを結合させる効率の良い技術が求められている。２種類の核酸を連結させる方法としては、従来は制限酵素を用いた２本鎖核酸のライゲーションが主な手法であった。近年、新しいＤＮＡ結合技術である、ケミカルライゲーションが報告された（非特許文献１）。ケミカルライゲーションとは、核酸の３’末端にリン酸等の求核性の高い官能基を有するオリゴヌクレオチドと、５’末端にヨード等の脱離基を有するオリゴヌクレオチドとを、相補的なＤＮＡをテンプレートとして、共有結合を形成させ、一本のオリゴヌクレオチドを合成する技術である。
一方、ヒトをはじめとする種々の生物のゲノム配列を利用し、医療、製薬をはじめとする様々な分野でゲノム配列を用いる試みが活発に行われている。その中でも、ゲノム配列中の１塩基置換である遺伝子多型は、遺伝子と疾患との関連、又は医薬品感受性との関連性を調べるという観点から解析が進められている。このような解析から、個々の遺伝子多型と疾患との関連や医薬品の感受性との関連を明らかにし、遺伝子診断といわれる検査が行われるようになってきた。
上述のような遺伝子診断を行なう技術として、ＤＮＡチップやＤＮＡマイクロアレイ等が知られている。ＤＮＡチップやＤＮＡマイクロアレイは、スライドガラス、シリコン、プラスチック等の基板に、多数のＤＮＡ分子を整列させたものであり、遺伝子の多型性の解析に有用なものである。
一方、ＤＮＡ合成に最も適した素材とされる微小多孔質ガラス（ＣＰＧ）上でＤＮＡプローブを合成した後、プローブ分子をＣＰＧ担体から切り離すことなく、ＣＰＧごとＳＮＰｓ検出に用いられるプローブオンキャリア法が開発されている。この手法では、ＤＮＡプローブの鎖伸張効率が向上するのみならず、ＤＮＡチップの低コスト化やプローブを三次元的に配置することができるため、検出感度の向上が期待できる。しかし、ＳＮＰｓ検出効率を更に向上させることが望まれている。
一方、ＤＮＡ合成に最も適した素材とされる微小多孔質ガラス（ＣＰＧ）上でＤＮＡプローブを合成した後、プローブ分子をＣＰＧ担体から切り離すことなく、ＣＰＧごとＳＮＰｓ検出に用いられるプローブオンキャリア法が開発されている。この手法では、ＤＮＡプローブの鎖伸張効率が向上するのみならず、ＤＮＡチップの低コスト化やプローブを三次元的に配置することができるため、検出感度の向上が期待できる。しかし、ＳＮＰｓ検出効率を更に向上させることが望まれている。
５’末端に脱離基を有するオリゴヌクレオチドは遺伝子診断に有用なものであり、その合成方法は多数報告されている（例えば、非特許文献２及び非特許文献３）。また、上述したような、ケミカルライゲーションの技術は、遺伝子多型を調べる遺伝子診断に有用なものであるが、５’末端に脱離基を有するオリゴヌクレオチドを結合し、かつ二重結合形成能を有する固相担体は未だ報告されていない。
このような固相担体は、上述したような遺伝子診断に有用であり、開発が望まれている。
このような固相担体は、上述したような遺伝子診断に有用であり、開発が望まれている。
Yanzheng Xu and Eric T, Kool, Journal of the American Chemical Society, 2000, 122, 9040-9041
Mathias K. Herrlein, Jeffrey S. Nelson and Robert L. Letsinger, Journal of the American Chemical Society, 1995, 117, 10151-10152
Yanzheng Xu and Eric T, Kool, Tetrahedron Letters, 1997, 38, 5595-5598
上述したような５’末端に脱離基を有するオリゴヌクレオチドを結合した固相担体を、一般的なＤＮＡ合成方法により製造した場合、５’末端に存在する脱離基が脱離してしまうか、又はオリゴヌクレオチド自体が脱離してしまう。
従って、本発明の目的は、５’末端に脱離基を有するオリゴヌクレオチドを結合し、かつ二重結合形成能を有する固相担体を提供することにある。
従って、本発明の目的は、５’末端に脱離基を有するオリゴヌクレオチドを結合し、かつ二重結合形成能を有する固相担体を提供することにある。
上記目的を達成するため、本発明者らは鋭意検討した結果、ケミカルライゲーションを用いた固相合成法により上記目的を達成し得るという知見を得た。
本発明は、上記知見に基づいてなされたものであり、一般式（１）で表わされるオリゴヌクレオチド誘導体が、固相担体に結合してなる、オリゴヌクレオチド固定化固相担体を提供するものである。
本発明は、上記知見に基づいてなされたものであり、一般式（１）で表わされるオリゴヌクレオチド誘導体が、固相担体に結合してなる、オリゴヌクレオチド固定化固相担体を提供するものである。
（上記式中、Ｒ１は、同一であっても異なっていてもよく、それぞれ水素又はアルコキシ基を表わし、Ｒ２は、同一であっても異なっていてもよく、それぞれ水素、又はアルコキシ基を表わし、Ｂ１、Ｂｎ及びＢ２は、同一であっても異なっていてもよく、それぞれ天然又は非天然の核酸塩基を表わし、Ｘは脱離基を表し、ｎは２〜５０の整数を表す。）
また、本発明は、一般式（１）で表わされるオリゴヌクレオチド誘導体が、固相担体に結合してなる、オリゴヌクレオチド固定化固相担体の製造方法であって、
ホスホロアミダイド法によるオリゴヌクレオチドの固相合成において、反応促進剤として１−ヒドロキシベンゾトリアゾールを用いることを特徴とする、オリゴヌクレオチド固定化固相担体の製造方法を提供する。
ホスホロアミダイド法によるオリゴヌクレオチドの固相合成において、反応促進剤として１−ヒドロキシベンゾトリアゾールを用いることを特徴とする、オリゴヌクレオチド固定化固相担体の製造方法を提供する。
（上記式中、Ｒ１は、同一であっても異なっていてもよく、それぞれ水素又はアルコキシ基を表わし、Ｒ２は、同一であっても異なっていてもよく、それぞれ水素、又はアルコキシ基を表わし、Ｂ１、Ｂｎ及びＢ２は、同一であっても異なっていてもよく、それぞれ天然又は非天然の核酸塩基を表わし、Ｘは脱離基を表し、ｎは２〜５０の整数を表す。）
また、本発明は、遺伝子中の所定の塩基配列部分に相補的な相補性塩基配列部分を有するオリゴヌクレオチドの５’末端側に脱離基を結合し、３’末端側に固相担体を結合してなる、相補性オリゴヌクレオチド固定化固相担体と、上記遺伝子中の所定の塩基配列部分に隣接する塩基配列部分に相補的な相補性塩基配列部分を有するオリゴヌクレオチドの３’末端側に求核性の高い官能基を有する、相補性オリゴヌクレオチドとを
反応させる工程を有する、オリゴヌクレオチド固相合成方法を提供する。
反応させる工程を有する、オリゴヌクレオチド固相合成方法を提供する。
また、本発明は、正常遺伝子中の所定の塩基配列部分に相補的な相補性塩基配列部分を有するオリゴヌクレオチドの５’末端側に脱離基を結合し、３’末端側に固相担体を結合してなる、相補性オリゴヌクレオチド固定化固相担体と、上記正常遺伝子中の所定の塩基配列部分に隣接する塩基配列部分に相補的な相補性塩基配列部分を有するオリゴヌクレオチドの３’末端側に求核性の高い官能基を有する、相補性オリゴヌクレオチドとを反応させる工程を有することを特徴とする、正常遺伝子中の所定の塩基配列部分と試料遺伝子の中の対応塩基配列部分との異同を確認する方法を提供する。
本発明のオリゴヌクレオチド固定化固相担体は、長鎖ＤＮＡの合成や、ＳＮＰｓ解析の感度を向上させることができる。
本発明の正常遺伝子中の所定の塩基配列部分と試料遺伝子の中の対応塩基配列部分との異同を確認する方法は、感度が向上したものである。
本発明の正常遺伝子中の所定の塩基配列部分と試料遺伝子の中の対応塩基配列部分との異同を確認する方法は、感度が向上したものである。
以下、本発明のオリゴヌクレオチド固定化固相担体について説明する。
本発明のオリゴヌクレオチド固定化固相担体は、一般式（１）で表わされるオリゴヌクレオチド誘導体が、固相担体に結合してなる。
本発明のオリゴヌクレオチド固定化固相担体は、一般式（１）で表わされるオリゴヌクレオチド誘導体が、固相担体に結合してなる。
上記一般式（１）において、Ｒ１は、同一であっても異なっていてもよく、それぞれ水素又はアルキル基を表わす。アルコキシ基としては、炭素数が１〜５個のアルコキシ基が好ましく、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、１−ブチルオキシ基、１−ペンチルオキシ基等が挙げられ、また、２−プロピルオキシ基、イソブチルオキシ基等のように分枝したアルコキシ基、シクロプロピルオキシ基、シクロブチルオキシ基、シクロペンチルオキシ基等の、側鎖の一部もしくは全部が環化したアルコキシ基も含む。
また、Ｂ１、Ｂｎ及びＢ２は、同一であっても異なっていてもよく、それぞれ天然又は非天然の核酸塩基を表わす。具体的には、天然のアデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシルのほかに人工塩基である７−デアザアデニン、７−デアザ−８−アザアデニン、３−デアザアデニン、６−チオグアニン、２−チオウラシル、２−チオチミン、７位に種々の置換基（アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基等）が導入された７−デアザアデニン、８位に種々の置換基（アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基等）が導入されたアデニン、８位に種々の置換基（アルキル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基等）が導入された７−デアザアデニン、７位及び８位に種々の置換基（アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基等）が導入された７−デアザアデニン、７−デアザグアニン、７−デアザ−８−アザグアニン、３−デアザグアニン、７位に種々の置換基（アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基等）が導入された７−デアザグアニン、８位に種々の置換基（アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基）を導入したグアニン、8位に種々の置換基（アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基等）が導入された７−デアザグアニン、７位と８位に種々の置換基（アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基等）が導入された７−デアザグアニン、５位に種々の官能基（アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基等）が導入されたシトシン、シュードイソシトシン、１位に種々の官能基（アルキル、アルケニル、アルキニル、アシル基、水酸基等）が導入されたシュードイソシトシン、５位に種々の官能基（アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基等）が導入されたウラシル、シュードウラシル、１位に種々の官能基（アルキル、アルケニル、アルキニル、アシル基、水酸基等）が導入されたシュードウラシル等が挙げられる。
また、Ｘは脱離基を表す。脱離基としては、ハロゲン原子、トシル基、メシル基、トリフルオロメタンスルホニル基、又はリン酸基等があげられる。ハロゲン原子としては、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等があげられる。
ｎは、２〜５０の整数を表し、好ましくは５〜２０の整数を表す。ｎが２より小さいと、ケミカルライゲーションが効率よく行われず、一方、５０より大きくいと、塩基識別能が低下し、ケミカルライゲーションの精度が低下する。
また、Ｂ１、Ｂｎ及びＢ２は、同一であっても異なっていてもよく、それぞれ天然又は非天然の核酸塩基を表わす。具体的には、天然のアデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシルのほかに人工塩基である７−デアザアデニン、７−デアザ−８−アザアデニン、３−デアザアデニン、６−チオグアニン、２−チオウラシル、２−チオチミン、７位に種々の置換基（アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基等）が導入された７−デアザアデニン、８位に種々の置換基（アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基等）が導入されたアデニン、８位に種々の置換基（アルキル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基等）が導入された７−デアザアデニン、７位及び８位に種々の置換基（アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基等）が導入された７−デアザアデニン、７−デアザグアニン、７−デアザ−８−アザグアニン、３−デアザグアニン、７位に種々の置換基（アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基等）が導入された７−デアザグアニン、８位に種々の置換基（アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基）を導入したグアニン、8位に種々の置換基（アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基等）が導入された７−デアザグアニン、７位と８位に種々の置換基（アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基等）が導入された７−デアザグアニン、５位に種々の官能基（アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基等）が導入されたシトシン、シュードイソシトシン、１位に種々の官能基（アルキル、アルケニル、アルキニル、アシル基、水酸基等）が導入されたシュードイソシトシン、５位に種々の官能基（アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基等）が導入されたウラシル、シュードウラシル、１位に種々の官能基（アルキル、アルケニル、アルキニル、アシル基、水酸基等）が導入されたシュードウラシル等が挙げられる。
また、Ｘは脱離基を表す。脱離基としては、ハロゲン原子、トシル基、メシル基、トリフルオロメタンスルホニル基、又はリン酸基等があげられる。ハロゲン原子としては、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等があげられる。
ｎは、２〜５０の整数を表し、好ましくは５〜２０の整数を表す。ｎが２より小さいと、ケミカルライゲーションが効率よく行われず、一方、５０より大きくいと、塩基識別能が低下し、ケミカルライゲーションの精度が低下する。
本発明のオリゴヌクレオチド固定化固相担体は、固相担体に結合してなる。固相担体としては、ＤＮＡチップ、ＤＮＡマイクロアレイを製造するために従来より用いられているものが特に制限なく用いることができ、例えば、スライドガラス、ポーラスガラス、ポリスチレンビーズ、プラスチック、金粒子、金板、銀粒子及び銀板、微小多孔質ガラス、ポーラスガラス等のガラス、ポリスチレン、金属、フェライトを芯にグリシンメタクリレートで表面を覆った磁性ビーズ等が挙げられる。また、担体の形状は、板状（基板状）、ビーズ状等、どのような形状のものであってもよい。上記プラスチックとしては、例えば、熱可塑性樹脂、熱硬化性樹脂を用いることができる。熱可塑性樹脂としては例えばポリエチレン、ポリプロピレン等の直鎖状ポリオレフィン、環状ポリオレフィン、含フッ素樹脂等が挙げられる。微小多孔質ガラスを用いた場合、プローブオンキャリア法に用いることのできるＤＮＡチップを得ることができる。
本発明のオリゴヌクレオチド固定化固相担体は、３’末端側の残基の糖部分の３位の水酸基が担体と結合している。すなわち、本発明のオリゴヌクレオチド固定化固相担体は、一般式（２）で表わされる。
本発明のオリゴヌクレオチド固定化固相担体は、３’末端側の残基の糖部分の３位の水酸基が担体と結合している。すなわち、本発明のオリゴヌクレオチド固定化固相担体は、一般式（２）で表わされる。
一般式（２）において、Ｒ１、Ｒ２、Ｂ１、Ｂ２、Ｂｎ、Ｘ及びｎは、一般式（１）で説明したのと同様であり、Ｄは担体を表す。
本発明のオリゴヌクレオチド固定化固相担体の製造方法に特に制限はないが、一般式（１）で表わされるオリゴヌクレオチド誘導体を製造した後、担体に固定又は吸着させてもよいが、ヌクレオチド単位１個毎に結合させていってもよい。後者の場合、製造は固相合成において、反応促進剤として１−ヒドロキシベンゾトリアゾールを用いて行うことができる。
本発明のオリゴヌクレオチド固定化固相担体の製造方法に特に制限はないが、一般式（１）で表わされるオリゴヌクレオチド誘導体を製造した後、担体に固定又は吸着させてもよいが、ヌクレオチド単位１個毎に結合させていってもよい。後者の場合、製造は固相合成において、反応促進剤として１−ヒドロキシベンゾトリアゾールを用いて行うことができる。
すなわち、本発明によれば、一般式（１）で表わされるオリゴヌクレオチド誘導体が、固相担体に結合してなる、オリゴヌクレオチド固定化固相担体の製造方法であって、ホスホロアミダイド法によるオリゴヌクレオチドの固相合成において、反応促進剤として１−ヒドロキシベンゾトリアゾールを用いることを特徴とする、オリゴヌクレオチド固定化固相担体の製造方法が提供される。
固相合成法においては、最初の段階として、固相担体に３’末端側の塩基が固定されたものを材料として用い、ここに、隣接するオリゴヌクレオチドを結合するためのホスホロアミダイドを結合させるが、このときに、反応促進剤として、１−ヒドロキシベンゾトリアゾールを用いて行なう。なお、１−ヒドロキシベンゾトリアゾールとしては、置換基を有している化合物であっても特に制限なく用いることができる。例えば、６−ニトロ−１−ヒドロキシベンゾトリアゾールが使用可能である。使用量は、特に制限はないが、ホスホロアミダイドに対し、０．５〜４０等量程度、好ましくは５〜３５等量、更に好ましくは１０〜３０等量程度が用いられる。また、この反応によれば、塩基部に保護基を必要とせずにオリゴヌクレオチド誘導体を製造できるので、脱離基を有するオリゴヌクレオチド誘導体を高純度で合成できる点から好ましい。
なお、固相合成反応により伸張反応においては、トリクロロ酢酸等による脱トリチル化、ジクロロメタンによる洗浄、ヨウ素等による酸化、ピリジン等による洗浄の工程が含まれる。反応収率を向上させるためには、カップリングとその後の洗浄の工程を複数回、好ましくは２回行なう。
固相合成法においては、最初の段階として、固相担体に３’末端側の塩基が固定されたものを材料として用い、ここに、隣接するオリゴヌクレオチドを結合するためのホスホロアミダイドを結合させるが、このときに、反応促進剤として、１−ヒドロキシベンゾトリアゾールを用いて行なう。なお、１−ヒドロキシベンゾトリアゾールとしては、置換基を有している化合物であっても特に制限なく用いることができる。例えば、６−ニトロ−１−ヒドロキシベンゾトリアゾールが使用可能である。使用量は、特に制限はないが、ホスホロアミダイドに対し、０．５〜４０等量程度、好ましくは５〜３５等量、更に好ましくは１０〜３０等量程度が用いられる。また、この反応によれば、塩基部に保護基を必要とせずにオリゴヌクレオチド誘導体を製造できるので、脱離基を有するオリゴヌクレオチド誘導体を高純度で合成できる点から好ましい。
なお、固相合成反応により伸張反応においては、トリクロロ酢酸等による脱トリチル化、ジクロロメタンによる洗浄、ヨウ素等による酸化、ピリジン等による洗浄の工程が含まれる。反応収率を向上させるためには、カップリングとその後の洗浄の工程を複数回、好ましくは２回行なう。
次に、本発明のオリゴヌクレオチド固相合成方法について説明する。
本発明のオリゴヌクレオチド固相合成方法は、遺伝子中の所定の塩基配列部分に相補的な相補性塩基配列部分を有するオリゴヌクレオチドの５’末端側に脱離基を結合し、３’末端側に固相担体を結合してなる、相補性オリゴヌクレオチド固定化固相担体（以下、単に、「相補性オリゴヌクレオチド固定化固相担体」ともいう）と、上記遺伝子中の所定の塩基配列部分に隣接する塩基配列部分に相補的な相補性塩基配列部分を有するオリゴヌクレオチドの３’末端側に求核性の高い官能基を有する、相補性オリゴヌクレオチド（以下、単に「相補性オリゴヌクレオチド」ともいう）とを反応させる工程を有する。
上記相補性オリゴヌクレオチド固定化固相担体としては、上述した、本発明のオリゴヌクレオチド固定化固相担体が用いられる。
本発明のオリゴヌクレオチド固相合成方法は、遺伝子中の所定の塩基配列部分に相補的な相補性塩基配列部分を有するオリゴヌクレオチドの５’末端側に脱離基を結合し、３’末端側に固相担体を結合してなる、相補性オリゴヌクレオチド固定化固相担体（以下、単に、「相補性オリゴヌクレオチド固定化固相担体」ともいう）と、上記遺伝子中の所定の塩基配列部分に隣接する塩基配列部分に相補的な相補性塩基配列部分を有するオリゴヌクレオチドの３’末端側に求核性の高い官能基を有する、相補性オリゴヌクレオチド（以下、単に「相補性オリゴヌクレオチド」ともいう）とを反応させる工程を有する。
上記相補性オリゴヌクレオチド固定化固相担体としては、上述した、本発明のオリゴヌクレオチド固定化固相担体が用いられる。
本発明のオリゴヌクレオチド固相合成方法においては、まず、合成しようとするオリゴヌクレオチド鎖と相補的な塩基配列の遺伝子を準備する。次いで、この遺伝子の所定の（任意の部位）塩基配列部分を選択し、この塩基配列部分に相補的な相補性塩基配列部分を有するオリゴヌクレオチドの５’末端側に脱離基を結合し、３’末端側に固相担体を結合してなる、相補性オリゴヌクレオチド固定化固相担体を準備する。次いで、この相補性オリゴヌクレオチド固定化固相担体と、相補性オリゴヌクレオチドとを反応させる。
相補性オリゴヌクレオチドの３’末端側には求核性の高い官能基が結合している。求核性の高い官能基としては、例えば、チオリン酸基、リン酸基、アミノ基、カルボキシル基、チオール基等が挙げられる。この反応によって、上記相補性オリゴヌクレオチド固定化固相担体の５’末端側と上記相補性オリゴヌクレオチドの３’末端側とが求核反応によって連結し、オリゴヌクレオチドの鎖長が長くなる。上記相補性オリゴヌクレオチド固定化固相担体と、相補性オリゴヌクレオチドとの反応は、適当な緩衝液中で実施することができ、反応温度、反応時間は、それぞれ５〜６０℃、及び１〜４８時間程度でよい。この反応は、一般にケミカルライゲーションと呼ばれる反応であり、反応条件は、オリゴヌクレオチドの塩基数や塩基対の種類によって適宜選択することができる。なお、反応終了後、アンモニア処理を行うことが好ましい。アンモニア処理は、短時間の処理が好ましく、好ましくは６〜１８時間である。このアンモニア処理によって、リン酸基の保護基の脱保護が行われる。
本発明のオリゴヌクレオチド固相合成方法においては、上記相補性オリゴヌクレオチドの５’末端側に脱離基を結合させておくことによって、新たな第２の相補性オリゴヌクレオチドを更に連結させることができる。なお、第２の相補性オリゴヌクレオチドも、相補性オリゴヌクレオチドに対して相補的な鋳型となる遺伝子の隣接する配列に相補性のものを使用する。このように、新たな相補性オリゴヌクレオチドを順に用いることにより、オリゴヌクレオチドの鎖長を延長することが可能となり、数百塩基のオリゴヌクレオチドをケミカルライゲーションによって合成することができる。
次に、本発明の試料遺伝子の中の対応塩基配列部分との異同を確認する方法について説明する。本発明の試料遺伝子の中の対応塩基配列部分との異同を確認する方法は、正常遺伝子中の所定の塩基配列部分に相補的な相補性塩基配列部分を有するオリゴヌクレオチドの５’末端側に脱離基を結合し、３’末端側に固相担体を結合してなる、相補性オリゴヌクレオチド固定化固相担体と、上記正常遺伝子中の所定の塩基配列部分に隣接する塩基配列部分に相補的な相補性塩基配列部分を有するオリゴヌクレオチドの３’末端側に求核性の高い官能基を有する、相補性オリゴヌクレオチドとを反応させる工程を有することを特徴とする。
本方法においては、相補性オリゴヌクレオチドの３’末端側には求核性の高い官能基が結合している。求核性の高い官能基としては、上述した通りである。この反応によって、上記相補性オリゴヌクレオチド固定化固相担体の５’末端側と上記オリゴヌクレオチドの３’末端側とが求核反応によって連結し、オリゴヌクレオチドの鎖長が長くなる。上記相補性オリゴヌクレオチド固定化固相担体と、相補性オリゴヌクレオチドとの反応は、適当な緩衝液中で実施することができ、反応温度、反応時間は、それぞれ５〜６０℃、及び１〜４８時間程度でよい。この反応は、一般にケミカルライゲーションと呼ばれる反応であり、反応条件は、オリゴヌクレオチドの塩基数や塩基対の種類によって適宜選択することができる。
本方法においては、上記相補性オリゴヌクレオチドが、正常遺伝子の所定の塩基配列部分に隣接する塩基配列部分に相補的である場合、ケミカルライゲーションが起こり、上記相補性オリゴヌクレオチド固定化固相担体と上記相補性オリゴヌクレオチドが連結する。従って、上記相補性オリゴヌクレオチドの５’末端側に標識物質を結合しておくことにより、ケミカルライゲーションが起こったことを確認することができる。用いられる標識物質としては、どのようなものであっても特に制限なく用いることができ、例えば、放射性同意元素、蛍光物質、酵素等が使用可能である。すなわち、相補性オリゴヌクレオチドに標識化合物が結合しているか、又は放射性同位元素が含まれており、この標識を用いてケミカルライゲーションを検出することができる。正常遺伝子の所定の塩基配列部分に隣接する塩基配列部分と、用いられる相補性オリゴヌクレオチドとが、完全に相補的でない場合、ケミカルライゲーションが起こらず、標識物質によって連結を確認できないので、正常遺伝子と、塩基の置換、欠失又は付加等が存在することが検出できる。
本方法においては、上記相補性オリゴヌクレオチドが、正常遺伝子の所定の塩基配列部分に隣接する塩基配列部分に相補的である場合、ケミカルライゲーションが起こり、上記相補性オリゴヌクレオチド固定化固相担体と上記相補性オリゴヌクレオチドが連結する。従って、上記相補性オリゴヌクレオチドの５’末端側に標識物質を結合しておくことにより、ケミカルライゲーションが起こったことを確認することができる。用いられる標識物質としては、どのようなものであっても特に制限なく用いることができ、例えば、放射性同意元素、蛍光物質、酵素等が使用可能である。すなわち、相補性オリゴヌクレオチドに標識化合物が結合しているか、又は放射性同位元素が含まれており、この標識を用いてケミカルライゲーションを検出することができる。正常遺伝子の所定の塩基配列部分に隣接する塩基配列部分と、用いられる相補性オリゴヌクレオチドとが、完全に相補的でない場合、ケミカルライゲーションが起こらず、標識物質によって連結を確認できないので、正常遺伝子と、塩基の置換、欠失又は付加等が存在することが検出できる。
なお、上記ヌクレオチド固相合成方法、及び試料遺伝子の中の対応塩基配列部分との異同を確認する方法においては、上述した本発明のオリゴヌクレオチド固相担体を用いることができる。
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明する。なお、本発明の範囲は、かかる実施例に限定されないことはいうまでもない。
実施例１
下記式（３）〜（７）で表わされる、５種類のホスホロアミダイドユニットを用いて、Applied Biosynthesis Incの自動合成機、商品名「DNA/RNA Synthesizer 392」を用いて、配列番号：１（TCCGGTCATTTTTT）の塩基配列を有するプローブ（オリゴヌクレオチド固定化固相担体）の合成を行った。なお、５’末端のTにはヨードが結合している。ＤＮＡオリゴマーの自動合成機による合成は、末端に１６−ヒドロキシヘキサデカン酸を導入した微小多孔質ガラス（ＣＰＧ）固相担体（１０ｍｇ、１０μｍｏｌ／ｇ）を用いて行った。合成各鎖伸張サイクルは、以下の表１に示す通りであり、縮合反応では、ベンゾイミダゾリウムトリフラート（ＢＩＴ）及び６−ニトロ−１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ｎＨｏＢｔ）を用いた。
実施例１
下記式（３）〜（７）で表わされる、５種類のホスホロアミダイドユニットを用いて、Applied Biosynthesis Incの自動合成機、商品名「DNA/RNA Synthesizer 392」を用いて、配列番号：１（TCCGGTCATTTTTT）の塩基配列を有するプローブ（オリゴヌクレオチド固定化固相担体）の合成を行った。なお、５’末端のTにはヨードが結合している。ＤＮＡオリゴマーの自動合成機による合成は、末端に１６−ヒドロキシヘキサデカン酸を導入した微小多孔質ガラス（ＣＰＧ）固相担体（１０ｍｇ、１０μｍｏｌ／ｇ）を用いて行った。合成各鎖伸張サイクルは、以下の表１に示す通りであり、縮合反応では、ベンゾイミダゾリウムトリフラート（ＢＩＴ）及び６−ニトロ−１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ｎＨｏＢｔ）を用いた。
なお、式（３）〜（５）で表わされるホスホロアミダイドユニットは以下の方法で合成した。
５’−Ｏ− (ジメトキシ)トリチル−Ｎ−フェノキシアセチル−２’−デオキシアデノシン３’−（２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト (215 mg, 0.24 mmol) を2Mアンモニア-メタノール溶液 (2.5ml)に溶解した。得られた溶液を１時間撹拌した後、溶媒を減圧留去し、粗生成物を得た。得られた粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー(１％トリエチルアミン)により精製し、ヘキサンに５０〜１００％クロロホルム、次いで、クロロホルムに０〜３％メタノールのグラジエントをかけて溶出し、溶媒を留去し、５’−Ｏ−ジメトキシ）トリチル−２’−デオキシアデノシン３’−（２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）（式（３）で表わされるホスホロアミダイドユニット）を白色固体として得た。(177 mg, 98%)
５’−Ｏ− (ジメトキシ)トリチル−Ｎ−フェノキシアセチル−２’−デオキシアデノシン３’−（２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト (215 mg, 0.24 mmol) を2Mアンモニア-メタノール溶液 (2.5ml)に溶解した。得られた溶液を１時間撹拌した後、溶媒を減圧留去し、粗生成物を得た。得られた粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー(１％トリエチルアミン)により精製し、ヘキサンに５０〜１００％クロロホルム、次いで、クロロホルムに０〜３％メタノールのグラジエントをかけて溶出し、溶媒を留去し、５’−Ｏ−ジメトキシ）トリチル−２’−デオキシアデノシン３’−（２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）（式（３）で表わされるホスホロアミダイドユニット）を白色固体として得た。(177 mg, 98%)
また、５’−Ｏ−(ジメトキシ)トリチル−Ｎ−フェノキシアセチル−２’−デオキシアデノシン３’−（２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト(420 mg, 0.44 mmol) を2Mアンモニア-メタノール溶液 (4.5ml)に溶解した。得られた溶液を２時間撹拌した後、溶媒を減圧留去し、粗生成物を得た。得られた粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー(１％トリエチルアミン)により精製し、ヘキサンに５０〜１００％クロロホルム、次いで、クロロホルムに０〜３％メタノールのグラジエントをかけて溶出し、溶媒を留去し、５’−Ｏ−（ジメトキシ）トリチル−２’−デオキシグアノシン３’−（２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）（式（４）で表わされるホスホロアミダイドユニット）を白色固体として得た。(298 mg, 88%)
また、５’−Ｏ−（ジメトキシ）トリチル−Ｎ−アセチル−２’−デオキシシチジン３’−（２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）(215ｍｇ,0.28mmol)を２Ｍアンモニア−メタノール溶液 (2.5ml)に溶解した。得られた溶液を2時間撹拌した後、溶媒を減圧留去し、粗生成物を得た。得られた粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー(１％トリエチルアミン)により精製し、ヘキサンに５０〜１００％クロロホルム、次いで、クロロホルムに０〜３％メタノールのグラジエントをかけて溶出し、溶媒を留去し、５’−Ｏ−（ジメトキシ）トリチル−２’−デオキシシチジン３’−３’−（２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）（式（５）で表わされるホスホロアミダイドユニット）を白色固体として得た。(190 mg, 94%)
式（６）及び（７）で表わされるホスホロアミダイドユニットは、グレンリサーチ社から購入したものを用いた。
式（６）及び（７）で表わされるホスホロアミダイドユニットは、グレンリサーチ社から購入したものを用いた。
なお、鎖伸張後、１０分間のアンモニア処理を行い、リン酸部のシアノエチル基を除去し、目的のオリゴヌクレオチド固定化固相担体を得た。
実施例２
下記に示す、配列番号：２〜４の塩基配列を有する、オリゴヌクレオチド固定化固相担体を、実施例１と同様にして合成した。なお、全ての配列の５’末端側にはヨードが、３’末端側にはCPGが結合している。
配列番号：２（TCTGGTTCATTTTTT）
配列番号：３（TCCGGTTCATTTTTT）
配列番号：４（TCCAGTTCATTTTTT）
また、下記に示す配列番号：５の塩基配列を有する、オリゴヌクレオチドを、実施例１と同様にして合成した。なお、５’末端側にはフルオレセインが、３’末端側にはチオリン酸基が結合している。
配列番号：５（ATGGGCC）
下記に示す、配列番号：２〜４の塩基配列を有する、オリゴヌクレオチド固定化固相担体を、実施例１と同様にして合成した。なお、全ての配列の５’末端側にはヨードが、３’末端側にはCPGが結合している。
配列番号：２（TCTGGTTCATTTTTT）
配列番号：３（TCCGGTTCATTTTTT）
配列番号：４（TCCAGTTCATTTTTT）
また、下記に示す配列番号：５の塩基配列を有する、オリゴヌクレオチドを、実施例１と同様にして合成した。なお、５’末端側にはフルオレセインが、３’末端側にはチオリン酸基が結合している。
配列番号：５（ATGGGCC）
また、別に、下記配列番号：６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを、実施例１と同様にして合成した。
配列番号：６（ATGAACCAGAGGCCCAT）
配列番号：６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（０．２５ｎｍｏｌ）、配列番号：２の塩基配列を有する、オリゴヌクレオチド固定化固相担体（１０μｇ）、及び配列番号：５の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（０．２５ｎｍｏｌ）を、オリゴヌクレオチド溶液（0.5 mL, 30 mM リン酸バッファー (pH 7.2), 1 M NaCl, 50 μM DTT)に浸し、４０℃で１４時間撹拌を行った。撹拌終了後、固相担体を水で洗浄し、乾燥させた。乾燥後、固相担体の蛍光輝度を、蛍光顕微鏡（オリンパス（株）製、ＢＸ５１ＷＩ）を用いて４７０〜４９０ｎｍの波長測定した。
配列番号：６（ATGAACCAGAGGCCCAT）
配列番号：６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（０．２５ｎｍｏｌ）、配列番号：２の塩基配列を有する、オリゴヌクレオチド固定化固相担体（１０μｇ）、及び配列番号：５の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（０．２５ｎｍｏｌ）を、オリゴヌクレオチド溶液（0.5 mL, 30 mM リン酸バッファー (pH 7.2), 1 M NaCl, 50 μM DTT)に浸し、４０℃で１４時間撹拌を行った。撹拌終了後、固相担体を水で洗浄し、乾燥させた。乾燥後、固相担体の蛍光輝度を、蛍光顕微鏡（オリンパス（株）製、ＢＸ５１ＷＩ）を用いて４７０〜４９０ｎｍの波長測定した。
配列番号：２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド固定化固相担体に変え、配列番号３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド固定化固相担体を用いて、同様に操作を行い、蛍光輝度を測定した。
配列番号：２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド固定化固相担体を用いた場合、配列番号：３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド固定化固相担体を用いた場合に比較し、蛍光輝度は約１０倍であった。配列番号：２の塩基配列は、配列番号：６の塩基配列の一部と相補的であり、配列番号：３の塩基配列は一塩基のみが異なっている。従って、配列番号：２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド固定化固相担体の場合はケミカルライゲーション反応が起こり、配列番号：３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド固定化固相担体を用いた場合はケミカルライゲーション反応が起こらなかった。従って、本実施例により、一塩基のミスマッチ（Ａ−Ｃミスマッチ）を検出できることがわかった。
また、本発明のオリゴヌクレオチド固定化固相担体は、二重結合形成能を有するものであることがわかった。
配列番号：２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド固定化固相担体を用いた場合、配列番号：３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド固定化固相担体を用いた場合に比較し、蛍光輝度は約１０倍であった。配列番号：２の塩基配列は、配列番号：６の塩基配列の一部と相補的であり、配列番号：３の塩基配列は一塩基のみが異なっている。従って、配列番号：２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド固定化固相担体の場合はケミカルライゲーション反応が起こり、配列番号：３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド固定化固相担体を用いた場合はケミカルライゲーション反応が起こらなかった。従って、本実施例により、一塩基のミスマッチ（Ａ−Ｃミスマッチ）を検出できることがわかった。
また、本発明のオリゴヌクレオチド固定化固相担体は、二重結合形成能を有するものであることがわかった。
実施例２
配列番号：２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド固定化固相担体に変え、配列番号４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド固定化固相担体を用いて、同様に操作を行い、蛍光輝度を測定した。
配列番号：２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド固定化固相担体を用いた場合、配列番号：４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド固定化固相担体を用いた場合に比較し、蛍光輝度は約１０倍であった。配列番号：２の塩基配列は、配列番号：６の塩基配列の一部と相補的であり、配列番号：３の塩基配列は二塩基のみが異なっている。従って、配列番号：２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド固定化固相担体の場合はケミカルライゲーション反応が起こり、配列番号：４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド固定化固相担体を用いた場合はケミカルライゲーション反応が起こらなかった。従って、本実施例により、二塩基のミスマッチ（Ａ−Ｃミスマッチ、Ｃ−Ａミスマッチ）を検出できることがわかった。
従来のＳＮＰｓ検出においては、マッチと一塩基ミスマッチとの比率は約１．９倍である。これを考慮すると、本発明のオリゴヌクレオチド固定化固相担体を用いた方法は、従来の方法の５倍以上の精度を有することがわかる。
配列番号：２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド固定化固相担体に変え、配列番号４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド固定化固相担体を用いて、同様に操作を行い、蛍光輝度を測定した。
配列番号：２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド固定化固相担体を用いた場合、配列番号：４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド固定化固相担体を用いた場合に比較し、蛍光輝度は約１０倍であった。配列番号：２の塩基配列は、配列番号：６の塩基配列の一部と相補的であり、配列番号：３の塩基配列は二塩基のみが異なっている。従って、配列番号：２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド固定化固相担体の場合はケミカルライゲーション反応が起こり、配列番号：４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド固定化固相担体を用いた場合はケミカルライゲーション反応が起こらなかった。従って、本実施例により、二塩基のミスマッチ（Ａ−Ｃミスマッチ、Ｃ−Ａミスマッチ）を検出できることがわかった。
従来のＳＮＰｓ検出においては、マッチと一塩基ミスマッチとの比率は約１．９倍である。これを考慮すると、本発明のオリゴヌクレオチド固定化固相担体を用いた方法は、従来の方法の５倍以上の精度を有することがわかる。
Claims (12)
- 一般式（１）で表わされるオリゴヌクレオチド誘導体が、固相担体に結合してなる、オリゴヌクレオチド固定化固相担体。
- 一般式（２）で表わされる、オリゴヌクレオチド固定化固相担体。
- 上記固相担体が、スライドガラス、ポーラスガラス、ポリスチレンビーズ、プラスチック、 金粒子、金板、銀粒子及び銀板である、請求項１又は２に記載のオリゴヌクレオチド固定化固相担体。
- 一般式（１）で表わされるオリゴヌクレオチド誘導体が、固相担体に結合してなる、オリゴヌクレオチド固定化固相担体の製造方法であって、
ホスホロアミダイド法によるオリゴヌクレオチドの固相合成において、反応促進剤として１−ヒドロキシベンゾトリアゾールを用いることを特徴とする、オリゴヌクレオチド固定化固相担体の製造方法。
- 遺伝子中の所定の塩基配列部分に相補的な相補性塩基配列部分を有するオリゴヌクレオチドの５’末端側に脱離基を結合し、３’末端側に固相担体を結合してなる、相補性オリゴヌクレオチド固定化固相担体と、
上記遺伝子中の所定の塩基配列部分に隣接する塩基配列部分に相補的な相補性塩基配列部分を有するオリゴヌクレオチドの３’末端側に求核性の高い官能基を有する、相補性オリゴヌクレオチドとを
反応させる工程を有する、オリゴヌクレオチド固相合成方法。 - 上記固相担体が、スライドガラス、ポーラスガラス、ポリスチレンビーズ、プラスチック、 金粒子、金板、銀粒子及び銀板である、請求項５に記載のオリゴヌクレオチド固相合成方法。
- 上記脱離基が、ハロゲン、トシル基、メシル基、トリフルオロメタンスルホニル基又はリン酸基である、請求項５又は６に記載のオリゴヌクレオチド固相合成方法。
- 正常遺伝子中の所定の塩基配列部分に相補的な相補性塩基配列部分を有するオリゴヌクレオチドの５’末端側に脱離基を結合し、３’末端側に固相担体を結合してなる、相補性オリゴヌクレオチド固定化固相担体と、
上記正常遺伝子中の所定の塩基配列部分に隣接する塩基配列部分に相補的な相補性塩基配列部分を有するオリゴヌクレオチドの３’末端側に求核性の高い官能基を有する、相補性オリゴヌクレオチドとを
反応させる工程を有することを特徴とする、
正常遺伝子中の所定の塩基配列部分と試料遺伝子の中の対応塩基配列部分との異同を確認する方法。 - 上記固相担体が、スライドガラス、ポーラスガラス、ポリスチレンビーズ、プラスチック、 金粒子、金板、銀粒子及び銀板である、請求項８に記載の方法。
- 上記脱離基が、ハロゲン、トシル基、メシル基、トリフルオロメタンスルホニル基又はリン酸基である、請求項８又は９に記載の方法。
- 上記相補性オリゴヌクレオチドに標識化合物が結合しているか、又は放射性同位元素が含まれており、該標識を用いて上記反応を検出する、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
- 相補性オリゴヌクレオチド固相担体として、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド固定化固相担体を用いる、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の方法。
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