JP2008539798A - 新規方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、哺乳類細胞における蛋白質の過剰発現についてのエピトープタグとしてのＧ蛋白質のＢ１ドメインの使用に関する。

Description

本発明は、哺乳類細胞における蛋白質の過剰発現についてのエピトープタグとしてのＧ蛋白質のＢ１ドメインの使用に関する。

Ｐａｒｋら．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６：１４２７７−１４２８３（１９９７）において説明されているように、連鎖球菌Ｇ蛋白質の免疫グロブリン結合Ｂ１ドメイン（本明細書中、ＧＢ１とも言う）は、十分に発達した疎水性コアを有する低分子蛋白質であり、該蛋白質は、１つの隣接するアルファヘリックスを伴う１つの４本鎖ベータシートに折り畳まれる。この蛋白質は、ジスルフィドを含まないか、または遊離システインを有し、プロリンを含まないか、または金属結合モチーフを有する。ＧＢ１は高い安定性かつ溶解性を有し、蛋白質フォールディングおよび設計の領域において最も広範に使用されるモデル系の１つである。

加えて、ＧＢ１はその表面に免疫グロブリンＧの重鎖のＣ−末端フラグメント（ＩｇＧＦｃ）についての結合部位を含む。このドメインを含む蛋白質は、Ｆｃを固定化し、アフィニティーカラムから酸により溶離させるか、または蛋白質分解的に切り出し、次いで、既存の試薬により検出することにより、精製され得る。

Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｍら．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．，１１：３１３−３２１（２００２）により、このＢ１ドメインとの蛋白質融合の可溶性発現レベルを、ＭＢＰ、ＮｕｓＡ、ＺＺ、ＧＳＴ、チオレドキシンおよびＨｉｓ６ならびに２６個の種々の蛋白質を用いる融合のものと比較することにより、ＧＢ１がＥ．ｃｏｌｉにおいてより高い割合の可溶性発現蛋白質を与えることが報告されている。Ｚｈｏｕら．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＮＭＲ，２０：１１−１４（２００１）により、Ｅ．ｃｏｌｉ発現組換え蛋白質との融合のためのエピトープタグとして使用される場合、ＮＭＲ構造を得るためにこのドメインを除去する必要がないことも報告されている。最後に、Ｃｈｅｎｇ＆Ｐａｔｅｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３０：４０１−４０５（２００４）は、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＧＢ１含有蛋白質の発現が発現レベルを増大したと結論付けた。

大部分の場合において、蛋白質フォールディングおよび溶解性の問題に起因して、多くの組換え蛋白質は、原核生物において発現され得ない。故に、哺乳類細胞は、広範な翻訳後修飾を必要とする組換え蛋白質のために選択される発現系である。しかし、哺乳類発現系を用いたとしても、小さなエピトープタグ、例えば、６×ヒスチジンおよびＳｔｒｅｐ−ｔａｇ ＩＩを用いる発現組換え蛋白質の低い発現および低い活性は、結晶学およびＨＴＳのための大規模精製に悪影響を及ぼす。内皮リパーゼの発現から得られたデータは、タグを用いなくても、６×ヒスチジンタグ、または６×ヒスチジン／Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ ＩＩを用いたとしても、発現は非常に低く、＞１ｍｇ／リットルのレベルであったことを示す。

タグとしてのＩｇＧＦｃ領域の使用は、非常に高レベルの蛋白質発現をもたらすことが実証されている。しかし、このタグは、リバースダイマーのごとき特定の配向を必要とする遺伝子に有害であり得る。それらは適切なフォールディングを阻止し、故に、活性の喪失をもたらす。

故に、哺乳類細胞における選択されたポリペプチドの発現または過剰発現がなお必要とされている。本発明において、伝統的に用いられるタグよりもＧＢ１タグを用いることで、哺乳類細胞における発現レベルが劇的に増大すること、および試験した蛋白質の全てにおいて十分な活性が示されることは、全く予期されていなかった。

一の態様において、本発明は、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに直接的または間接的に連結した少なくとも１つのＧＢ１ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む宿主細胞を適切な培養条件下で培養し、これにより、該ポリペプチドを産生し、次いで、該ポリペプチドを精製することを含む、哺乳類組換え宿主細胞における（目的の）ポリペプチドの発現方法に関する。

別の態様において、本発明は、上記方法により産生されるポリペプチドを提供する。

さらなる一の態様において、本発明は、ポリペプチドを産生するための、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに直接的または間接的に連結した少なくとも１つのＧＢ１ポリヌクレオチドを含む、哺乳類組換え宿主細胞において用いられる発現ベクターに関する。

なお一層の一の態様において、本発明は、ポリペプチドを産生するための、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに直接的または間接的に連結した少なくとも１つのＧＢ１ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む哺乳類組換え宿主細胞に関する。

詳細な説明
本明細書中で用いられる「ＧＢ１ポリペプチド」は、各々、配列番号：１、２または３の全長にわたって配列番号：１、２または３のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９７〜９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドを包含する。該ポリペプチドは配列番号：１、２または３のアミノ酸を含むものを包含する。

さらに、ＧＢ１ポリペプチドは、アミノ酸配列が、各々、配列番号：１、２または３の全長にわたって配列番号：１、２または３のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９７〜９９％の同一性を有する単離ポリペプチドを包含する。該ポリペプチドは配列番号：１、２または３のポリペプチドを包含する。

さらに、ＧＢ１ポリペプチドは、配列番号：４、５または６に含まれる配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる単離ポリペプチドを包含する。

本明細書中で用いられる「ＧＢ１ポリヌクレオチド」は、各々、配列番号：１、２または３の全長にわたって配列番号：１、２または３のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチドを包含する。これに関連して、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８〜９９％および少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドも包含される。該ポリヌクレオチドは、各々、配列番号：１、２または３のポリペプチドをコードする配列番号：４、５または６に含まれるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを包含する。

さらに、本発明のポリヌクレオチドは、各々、配列番号：４、５または６の全長にわたって配列番号：４、５または６に対して少なくとも７０％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチドを包含する。これに関連して、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８〜９９％の同一性および少なくとも９９％の同一性を有するポリヌクレオチドも包含される。該ポリヌクレオチドは、配列番号：４、５または６のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、ならびに配列番号：４、５または６のポリヌクレオチドを包含する。

本発明は、上記した全てのポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドも提供する。

上記した全てのポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下で配列番号：４、５または６にハイブリダイズし得る任意のポリヌクレオチドを含むが、これらに限定されない。

本明細書中で用いられる「ストリンジェントな条件」および「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」なる用語は、配列間に少なくとも７０％および少なくとも８０％、少なくとも９５％の同一性が存在する場合にのみハイブリダイゼーションが生じ得ることを意味する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ クエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０マイクログラム／ｍｌ 変性剪断サケ精子ＤＮＡを含有する溶液中、４２℃で一晩インキュベートすることであり、次いで、フィルターを０．１×ＳＳＣ中、約６５℃で洗浄する。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件はよく知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋら．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８９），特に、そのＣｈａｐｔｅｒ １１に例示されている。該文献の開示内容は出典明示によりその全てが本明細書の一部となる。

当該分野において知られている「同一性」とは、配列を比較することにより決定されるような、２つ以上のポリペプチド配列または２つ以上のポリヌクレオチド配列の間の関係を言う。当該分野において、「同一性」は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列の間の配列関連性の程度も意味し、場合によっては、かかる配列の連なりの間のマッチにより決定されてもよい。「同一性」および「類似性」は、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７；およびＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１；およびＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．，ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）に記載されたものを含むがこれらに限定されない既知の方法により容易に計算され得る。同一性を決定するための好ましい方法は、試験する配列間の最大マッチを与えるように設計される。同一性および類似性を決定するための方法は、公的に入手可能なコンピュータープログラムにおいて体系化されている。２つの配列間の同一性および類似性を決定するための好ましいコンピュータープログラム法は、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．ら．，Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２（１）：３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）を含むが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴ Ｘ プログラムは、ＮＣＢＩおよび他の供給元から公的に入手可能である（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら．，ＮＣＢＩ ＮＬＭ ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ ２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）。よく知られているＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用いて同一性を決定してもよい。

ポリペプチド配列比較のためのパラメーターは、以下：
１）アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０）
比較マトリックス：Ｈｅｎｔｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｔｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８９：１０９１５−１０９１９（１９９２）からのＢＬＯＳＳＵＭ６２
ギャップペナルティ：１２
ギャップ長ペナルティ：４
を含む。

これらのパラメーターを用いる有用なプログラムは、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩから「ギャップ」プログラムとして公的に入手可能である。上記パラメーターはペプチド比較のためのデフォルトパラメーターである（エンドギャップについてはペナルティなし）。

ポリヌクレオチド比較のための好ましいパラメーターは以下：
１）アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０）
比較マトリックス：マッチ＝＋１０，ミスマッチ＝０
ギャップペナルティ：５０
ギャップ長ペナルティ：３
を含み、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩからの「ギャップ」プログラムとして入手可能である。これらは、核酸比較のためのデフォルトパラメーターである。

一例として、本発明のポリヌクレオチド配列は、配列番号：４の参照配列に同一、すなわち、１００％同一であってもよく、或いは、それは参照配列と比較して特定の整数までのヌクレオチド変化を含んでもよい。かかる変化は、少なくとも１つのヌクレオチド欠失、塩基転位および塩基転換を含む置換、または挿入からなる群から選択され、該変化は、参照ヌクレオチド配列の５’または３’末端位置で生じるか、或いは、これらの末端位置の間の任意の位置で生じてもよく、参照配列内のヌクレオチドの間に個別に散在するか、または参照配列内の１つ以上の隣接する基として散在する。ヌクレオチド変化の数は、配列番号：４のヌクレオチドの総数に各々のパーセント同一性の数値パーセント（１００で割る）を掛け、次いで、その積を配列番号：４のヌクレオチドの総数から差し引くことによってか、或いは：
ｎ_ｎ≦ｘ_ｎ−（ｘ_ｎ・ｙ）
［式中、ｎ_ｎはヌクレオチド変化の数であり、ｘ_ｎは配列番号：４のヌクレオチドの総数であり、ｙは、例えば、７０％について０．７０、８０％について０．８０、８５％について０．８５、９０％について０．９０、９５％について０．９５などであり、ｘ_ｎ・ｙの整数でない任意の積は、それをｘ_ｎから差し引く前に、最も近い整数に切り捨てられる］
により決定される。配列番号：１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の変化は、このコーディング配列中にナンセンス、ミスセンスまたはフレームシフト変異を作り出してもよく、それにより、かかる変化に従って、ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを変化させてもよい。

同様に、本発明のポリペプチド配列は、配列番号：１の参照配列に同一、すなわち、１００％同一であってもよく、或いは、それは、％同一性が１００％未満となるように、参照配列と比較して特定の整数までのアミノ酸変化を含んでもよい。かかる変化は、少なくとも１つのアミノ酸欠失、保存的および非保存的置換を含む置換、または挿入からなる群より選択され、該変化は、参照ポリペプチド配列のアミノ−またはカルボキシ−末端位置で生じるか、或いは、これらの末端位置の間の任意の位置で生じてもよく、参照配列中のアミノ酸の間に個別に散在するか、または参照配列内の１つ以上の隣接する基として散在する。特定の％同一性についてのアミノ酸変化の数は、配列番号：１のアミノ酸の総数に各々のパーセント同一性の数値パーセント（１００で割る）を掛け、次いで、その積を配列番号：１のアミノ酸の総数から差し引くことによってか、或いは：
ｎ_ａ≦ｘ_ａ−（ｘ_ａ・ｙ）
［式中、ｎ_ａはアミノ酸変化の数であり、ｘ_ａは配列番号：１のアミノ酸の総数であり、ｙは、例えば、７０％について０．７０、８０％について０．８０、８５％について０．８５などであり、ｘ_ａおよびｙの整数でない任意の積は、それをｘ_ａから差し引く前に最も近い整数に切り捨てられる］
により決定される。

用いられる「発現ベクター」なる用語は、ポリペプチドの転写を提供するさらなる制御配列に作動可能に連結した１つ以上のＧＢ１ポリヌクレオチドに直接的または間接的に融合した（目的の）ポリペプチドをコードするセグメントを含む、直鎖または環状のＤＮＡ分子を言う。かかるさらなるセグメントはプロモーターおよびターミネーター配列を含み、１つ以上の複製起点、１つ以上の選択可能なマーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルなどを含んでもよい。一般的に、発現ベクターはプラスミドまたはウイルスＤＮＡに由来するか、またはその両方のエレメントを含んでもよい。適切な哺乳類発現ベクターの幾つかの例は、ＥＰ３０７，２４７；２６０，１４８；３０９，２３７；および３０７，２４８において見出される。

本質的に任意の哺乳類細胞が本発明において用いられ得る。細胞は初代細胞（例えば、初代肝細胞、初代神経細胞または初代筋芽細胞）であり得、またはそれは確立された細胞系の細胞であってもよい。細胞が細胞分裂を受ける能力があるかは必須ではなく、最終分化した細胞が本発明において用いられ得る。所望により、感染効率を最大にするために、初代細胞を蒔いた約２４時間後に、ウイルスが初代細胞に導入され得る。好ましくは、哺乳類細胞は、肝臓由来細胞、例えば、ＨｅｐＧ２細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞、Ｈｕｈ−７細胞、ＦＴＯ２Ｂ細胞、Ｈｅｐａ１−６細胞、またはＳＫ−Ｈｅｐ−１細胞であるか、またはクッパー細胞；腎細胞、例えば、腎細胞系２９３の細胞、ＰＣ１２細胞（例えば、神経成長因子により誘導された分化したＰＣ１２細胞）、ＣＯＳ細胞（例えば、ＣＯＳ７細胞）、またはベロ細胞（アフリカミドリザル腎細胞）；神経細胞、例えば、胎児神経細胞、皮質錐体細胞、僧帽細胞、顆粒細胞、または脳細胞（例えば、大脳皮質の細胞；星状膠細胞；グリア細胞；シュワン細胞）；筋細胞、例えば、筋芽細胞または筋管（例えば、Ｃ_２Ｃ_１２細胞）；胚性幹細胞、脾臓細胞（例えば、マクロファージまたはリンパ球）；上皮細胞、例えば、ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸癌上皮系）；線維芽細胞、例えば、ＮＩＨ３Ｔ３細胞；内皮細胞；ＷＩＳＨ細胞；Ａ５４９細胞；または骨髄幹細胞である。他の好ましい哺乳類細胞は、ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞、Ｒａｍｏｓ、Ｊｕｒｋａｔ、ＨＬ６０、およびＫ−５６２細胞を含む。

哺乳類細胞は、例えば、Ｓａｉｂｏ Ｋｏｇａｋｕ（Ｃｅｌｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ），ｅｘｔｒａ ｉｓｓｕｅ ８，Ｓｈｉｎ Ｓａｉｂｏ Ｋｏｇａｋｕ Ｊｉｋｋｅｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ（Ｎｅｗ Ｃｅｌｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ），２６３−２６７（１９９５），Ｓｈｕｊｕｎｓｈａ刊，またはＶｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）に記載されている方法に従って形質転換され得る。故に、発現され得るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された形質転換体が得られ得る。

哺乳類細胞が宿主として用いられる場合、形質転換体は、例えば、約５〜２０％のウシ胎仔血清を含有するＭＥＭ培地［Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）］、ＤＭＥＭ培地［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）］、ＲＰＭＩ１６４０培地［Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７）］、１９９培地［Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３，１（１９５０）］などの中で培養される。好ましくは、培地のｐＨは約６〜約８に調整される。通常、形質転換体は、約３０〜４０℃で約１５〜６０時間培養され、必要に応じて、培養は通気または攪拌され得る。

本発明は、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに直接的または間接的に融合した１つ以上のＧＢ１ポリヌクレオチド、ならびにＧＢ１ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質の細胞発現に必須である関連エレメントを含む発現ベクターも提供する。例えば、宿主細胞中のＧＢ１ポリヌクレオチドの転写を導くプロモーター配列が発現ベクターに組み込まれ得る。

本明細書中で用いられる「直接的に融合した」は、ＧＢ１ポリヌクレオチドが目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに隣接することを意味する。しかし、「間接的に融合した」は、ＧＢ１ポリヌクレオチドが目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに隣接しておらず、むしろ、１つ以上のスペーサー、例えば、タバコエッチウイルス（ｔａｂａｃｃｏ ｅｔｃｈ ｖｉｒｕｓ）（ＴＥＶ）プロテアーゼ切断部位および／または他のタグ（例えば、６ヒスチジンエピトープタグ）がＧＢ１ポリヌクレオチドと目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとの間に存在することを意味する。ＧＢ１が目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの５’末端の前または３’末端の後に位置され得ることを強調することは重要であろう。

本明細書中で用いられる「目的のポリペプチド」は、タグとしてＧＢ１ポリペプチドを用いて発現され得るポリペプチドを言う。目的のポリペプチドは、例えば、内皮リパーゼ（ＥＬ）蛋白質、コレステロールエステル転送蛋白質（ＣＥＴｐ）などを含む。

哺乳類細胞において用いるために、発現ベクター上の制御機能は、多くの場合、ウイルス材料により提供される。例えば、一般的に用いられるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、レトロウイルス、サイトメガロウイルス、およびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のゲノムに由来する。他のプロモーターは、異種ソースに由来するものであり、例えば、ベータアクチンプロモーターである。ＳＶ４０ウイルスの初期および後期プロモーターは、共に、ＳＶ４０ウイルス複製起点も含むフラグメントとしてウイルスから容易に得られるために、特に有用である［Ｆｉｅｒｓら．，Ｎａｔｕｒｅ，２７３：１１３（１９７８）］。ＨｉｎｄＩＩＩ部位からウイルス複製起点中に位置するＢｇｌＩ部位に向かって伸びる約２５０−ｂｐの配列が含まれる限り、より小さいまたはより大きいＳＶ４０フラグメントが用いられてもよい。ヒトサイトメガロウイルスの前初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントとして都合良く得られる（Ｇｒｅｅｎａｗａｙら．，Ｇｅｎｅ，１８：３５５−３６０（１９８２））。さらに、制御配列が宿主細胞系に適合する限り、所望の遺伝子配列に通常関連するプロモーターまたは制御配列を利用することが可能であり、多くの場合、そのように望まれる。

高等真核生物による、所望の異種ポリペプチド（目的のポリペプチド）をコードするＤＮＡの転写は、エンハンサー配列をベクターに挿入することにより増大される。エンハンサーは、その転写−開始活性を高めるようプロモーターに作用する、通常約１０〜３００ｂｐの、ＤＮＡのシス作用エレメントである。エンハンサーは、配向および位置に相対的に依存せず、イントロン内部［Ｂａｎｅｒｊｉら．，Ｃｅｌｌ．３３：７２９（１９８３）］およびコーディング配列そのものの内部［Ｏｓｂｏｒｎｅら．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．，４：１２９３（１９８４）］にある転写単位に対して５’側［Ｌａｉｍｉｎｓら．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：９９３（１９８１）］および３’側［Ｌｕｓｋｙら．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．，３：１１０８（１９８３）］で見出された。しかし、エンハンサーエレメントは、本発明については、プロモーター配列の上流に位置していてもよい。多くのエンハンサー配列が哺乳類遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、アルファ−フェトプロテインおよびインスリン）について知られている。しかし、典型的には、真核細胞ウイルスに由来するエンハンサーが用いられ得る。例としては、複製起点の後期側（１００〜２７０ｂｐ）にあるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側にあるポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。

哺乳類宿主細胞において用いられる発現ベクターは、ポリアデニル化部位も含み得る。ポリアデニル化領域の例は、ウイルス、例えば、ＳＶ４０（初期および後期）またはＨＢＶに由来するものである。

複製起点は、例えば、ＳＶ４０または他のウイルス（例えば、ポリオーマ、アデノ、ＶＳＶ、ＢＰＶ）源に由来してもよい外来起源を含むようにベクターを構築することによって提供されてもよく、或いは、宿主細胞により提供されてもよい。ベクターが宿主細胞染色体に組み込まれるならば、多くの場合、後者は十分である。

適当には、発現ベクターは、選択可能なマーカーとも言われる選択遺伝子を含んでもよい。選択遺伝子は、ベクターで形質転換される宿主細胞の生存または成長に必須である蛋白質をコードする。哺乳類細胞に適する選択可能なマーカーの例としては、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）またはネオマイシンが挙げられる。かかる選択可能なマーカーが首尾よく哺乳類宿主細胞に移入されるならば、選択圧下に置かれた場合に、形質導入された哺乳類宿主細胞は生存可能である。

２つの広く用いられている別個のカテゴリーの選択計画がある。第１のカテゴリーは、細胞の代謝、ならびに添加培地に関係なく成長能力を欠いている変異細胞系の使用に基づく。２つの例として、ＣＨＯ ＤＨＦＲ細胞およびマウスＬＴＫ細胞が挙げられる。これらの細胞は、チミジンまたはヒポキサンチンのごとき栄養素の添加がなければ成長能力を欠いている。これらの細胞は、完全なヌクレオチド合成経路に必須である特定の遺伝子を欠失しているので、欠失しているヌクレオチドが添加培地中に供給されない限り、生存することはできない。培地を補足する代替法は、各遺伝子を欠失しており、それ故に、それらの成長要件が変化している細胞へインタクトなＤＨＦＲまたはＴＫ遺伝子を導入することである。ＤＨＦＲまたはＴＫ遺伝子で形質転換されなかった個々の細胞は、非添加培地中で生存不能であろう。故に、これらの細胞の直接的選択は、添加栄養素の不在下での細胞成長を要する。

第２のカテゴリーは優性選択であり、これは、変異細胞系の使用を必要としない選択スキームを言う。この方法は、典型的に、宿主細胞の成長を妨げる薬剤を用いる。新規遺伝子を有する細胞は、薬剤耐性を伝達する蛋白質を発現し得、選択を生き延び得る。優性選択において用いられる薬剤の例としては、ネオマイシン［Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ａｎｄ Ｂｅｒｇ，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１：３２７（１９８２）］、ミコフェノール酸［Ｍｕｌｌｉｇａｎ ａｎｄ Ｂｅｒｇ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０９：１４２２（１９８０）］、またはハイグロマイシン［Ｓｕｇｄｅｎら．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５：４１０−４１３（１９８５）］が挙げられる。上記の３つの例は、真核制御下で細菌遺伝子を用いて、適切な薬剤、すなわち、各々、ネオマイシン（Ｇ４１８またはジェネテシン）、ｘｇｐｔ（ミコフェノール酸）、またはハイグロマイシンに対する耐性を伝達する。

本明細書中で用いられる「制御配列」なる用語は、宿主細胞中のコーディング配列の転写および翻訳を集合的に提供する、プロモーター配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流調節ドメイン、エンハンサーなどを集合的に言う。目的のＤＮＡ配列が適切に転写および翻訳され得るならば、これらの制御配列の全てが常に組換えベクター中に存在する必要はない。

本明細書中で用いられる「作動可能に連結した」なる用語は、エレメントの並び方を言い、ここで、記載した成分はその有用な機能を果たすように構成されている。故に、コーディング配列に作動可能に連結した制御配列は、コーディング配列の発現を成し遂げ得る。制御配列がコーディング配列の発現を導くよう機能する限り、該制御配列はコーディング配列に隣接する必要はない。故に、例えば、翻訳されていないが転写された介在配列は、プロモーター配列とコーディング配列の間に存在し得、プロモーター配列は依然としてコーディング配列に「作動可能に連結した」と考えられ得る。

さらに、両核酸分子についてのコーディング領域が同じリーディングフレーム中で発現可能である場合、核酸コーディング配列は別の核酸コーディング配列に作動可能に連結している。核酸配列は、それらが同じリーディングフレーム中で発現可能である限り、隣接する必要はない。故に、例えば、介在するコーディング配列および特定の核酸コーディング領域は依然として「作動可能に連結した」と考えられ得る。

故に、本発明において、哺乳類組換え宿主細胞中でポリペプチドを発現するための方法であって、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに直接的または間接的に連結した少なくとも１つのＧＢ１ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む宿主細胞を適切な条件下で培養し、次いで、該ポリペプチドを精製することを含む方法が提供される。ポリペプチドはコレステロールエステル転送蛋白質または内皮リパーゼであってもよい。幾つかの場合、ＧＢ１ポリヌクレオチドは配列番号：４、５または６である。該宿主細胞はチャイニーズハムスター卵巣細胞であってもよい。特定のチャイニーズハムスター卵巣細胞はアデノウイルスＥ１Ａ遺伝子を含んでもよい。本発明の別の態様において、宿主細胞はＣＯＳまたはＨＥＫ細胞である。

さらなる別の態様において、少なくとも１つのＧＢ１ポリヌクレオチドは、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのカルボキシ末端に直接的または間接的に連結される。少なくとも１つのＧＢ１ポリヌクレオチドは、選択的な切断部位を介して、該ポリペプチドをコードする該ポリヌクレオチドのカルボキシ末端に連結されてもよい。選択可能な切断部位はタバコエッチウイルスプロテアーゼ切断部位を含んでもよい。別の態様において、該ポリペプチドを精製する前に該選択可能な切断部位を切断するための方法が提供される。

本発明の別の態様において、ポリペプチドを産生するための、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに直接的または間接的に連結した少なくとも１つのＧＢ１ポリヌクレオチドを含む、哺乳類組換え宿主細胞において用いるための発現ベクターが提供される。

本発明のさらなる別の態様において、宿主細胞においてポリペプチドを産生するための、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに直接的または間接的に連結した少なくとも１つのＧＢ１ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む哺乳類組換え宿主細胞が提供される。

本明細書中、別記しない限り、利用される技法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら．１９８９，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ），Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８５ ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｄ．Ｇｏｅｄｄｅｌ，１９９１，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．），“Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ” ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｍ．Ｐ．Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，ｅｄ．，（１９９０）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら．１９９０．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．），Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，２ｎｄ Ｅｄ．（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，１９８７．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｐｐ．１０９−１２８，ｅｄ．Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ，Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．Ｃｌｉｆｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．），およびｔｈｅ Ａｍｂｉｏｎ Ｃａｔａｌｏｇ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘ．）のごときよく知られている幾つかの参考文献のいずれかにおいて見出されてもよい。

以下の実施例は、本発明を実施するために現時点で知られている特定の実施態様を説明するためのものであり、本発明はそれに限定されるものではない。

ＧＢ１ドメインのクローニング
一の実施態様において、ＧＢ１ポリヌクレオチドは配列番号：４のポリヌクレオチドである。配列番号：４のポリヌクレオチドを以下の実施例で用いた。配列番号：４のポリヌクレオチドは慣用的方法により合成した。将来のクローニングを補助するために、Ｃ−末端タグとして使用するために、Ａｓｐ７１８制限部位を遺伝子の５’末端に付加し、終止コドンおよびＥｃｏＲＶ制限部位を遺伝子の３’末端に付加した。

実施例１
ＣＨＯ−Ｅ１Ａ細胞におけるヒト内皮リパーゼのクローニングおよび安定な発現
ＰＣＲプライマーを設計し、ＥｃｏＲ１制限部位を内皮リパーゼ（ＥＬ）遺伝子の５’末端に付加した。遺伝子の３’末端用プライマーを設計し、終止コドンを除去し、ＴＥＶプロテアーゼ切断部位を付加し、Ａｓｐ７１８制限部位を導入した。

標準的技法を用いて、これらの２つのフラグメントを、ＥｃｏＲ１およびＥｃｏＲＶで消化したベクターｐＣＤＮにライゲートし、ｐＣＤＮ−ＥＬ／ＴＥＶ／ＧＢ１を作成した。

安定な細胞系を作成するために、制限酵素Ｎｏｔ１を用いてプラスミドｐＣＤＮ−ＥＬ−ＴＥＶ−ＧＢ１を直線化し、次いで、Ｈｅｎｓｌｅｙら．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：２３９４９−２３９５８（１９９４）に記載の技法を用いて、電気穿孔処理によりＣＨＯ−Ｅ１Ａ細胞系、Ａｃｃ−３１７へ導入した。ヌクレオシド不含ＢＳＡ含有の１×ＭＲ１−４培地中で細胞をポリクローナル集団として選択した。ポリクローナル細胞系を、３リットルのボトルに入れた１．５リットルの２×ＭＲ１−４培地中にて、３４℃で７日間、７．５×１０^５個の細胞／ｍｌとし、精製用の培地を得た。

内皮リパーゼ、ＥＬ／ＴＥＶ／ＧＢ１を以下のとおり精製した。ＥＬは、培地から、Ｆｃ樹脂（４ｍｇヒトＦｃ／ｍｌのＮＨＳ−活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で回収した。Ｆｃ樹脂を２５ｍＭリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、２０％グリセロール、ｐＨ＝７で徹底的に洗浄し、０．１Ｍトリエチルアミン、ｐＨ＝１１．６で溶離した。溶離液を１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ＝６で中和した。収量は約０．９ｍｇ全蛋白質／ｍｌＦｃ樹脂だった。初期の発現レベルは２０ｍｇ／ｌを超えた。

さらに、制限酵素Ｎｏｔ１を用いてプラスミドｐＣＤＮ−ＥＬ−ＴＥＶ−ＧＢ１を直線化し、次いで、電気穿孔処理によりＣＨＯ−Ｌｅｃ−Ｅ１Ａ細胞系、Ａｃｃ−１１６９へ導入した。ＢＳＡ、ヌクレオシドおよび４００ｕｇ／ｍｌ Ｇ４１８（ジェネテシン）含有の１×ＭＲ１−４培地を用いて、９６穴プレート中、細胞をクローン集団として選択した。

単一のクローンを、３リットルのボトルに入れたヌクレオシド含有の２×ＭＲ１−４培地中にて、３４℃で７日間、７．５×１０^５個の細胞／ｍｌとし、精製用の培地を得た。精製後、蛋白質をＮ−末端分析に付し、ＳＰＶＰＦＧＰＥＧＲＬ（配列番号：７）の配列を得、これは推定した配列に適合した。ＭＡＬＤＩ−ＭＳも実施し、５６３０２および５０４６８（Ｃ−末端切断）の分子量が観測され、これは５６４０９の予測分子量に適合した。ｐＨ＝７でのエンドＨ処理は首尾よく実施され、消化の後、十分な活性が維持された。

酵素活性を測定するために、基質としてＰＥＤ６を用いて、精製したＥＬ−ＴＥＶ−ＧＢ１蛋白質をホスホリパーゼ活性についてアッセイした。

ｐＣＤＮ−ＥＬ−ＴＥＶ−Ｈｉｓコンストラクトの精製からの結果に基づくと、上記細胞系は、ＥＬ／Ｈｉｓコンストラクトよりも約２７倍多い蛋白質を産生した。これらのコンストラクトの両方は活性を有する。ＥＬ−ＴＥＶ−Ｆｃコンストラクトの精製からの結果に基づくと、Ｆｃコンストラクトは約３倍多い蛋白質を産生した。しかし、Ｆｃコンストラクトは不活性だった。

実施例２
ＣＨＯ−Ｅ１Ａ細胞におけるヒトＣＥＴＰのクローニングおよび安定な発現
ＰＣＲプライマーを設計し、ヒトＣＥＴＰ（コレステロールエステル転送蛋白質）遺伝子の５’末端にＥｃｏＲ１制限部位を付加した。遺伝子の３’末端用プライマーを設計し、ＴＥＶプロテアーゼ切断部位を付加し、Ａｓｐ７１８制限部位を導入した。

ＰＣＲプライマーを作成し、ＧＢ１ドメインの５’末端上にＡｓｐ７１８部位を付加し、および６×ヒスチジンエピトープタグ、終止コドン、次いで、ＥｃｏＲＶ制限部位を遺伝子の３’末端に付加した。標準的技法を用いて、これらのフラグメントをＥｃｏＲ１およびＥｃｏＲＶで消化したベクターｐＣＤＮにライゲートし、ｐＣＤＮ−ＣＥＴＰ／ＴＥＶ／ＧＢ１−Ｈｉｓを作成した。

安定な細胞系を作成するために、制限酵素Ｎｏｔ１を用いて、プラスミドｐＣＤＮ−ＣＥＴＰ／ＴＥＶ／ＧＢ１−Ｈｉｓを直線化し、Ｈｅｎｓｌｅｙら．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：２３９４９−２３９５８（１９９４）に記載の技法を用いて、電気穿孔処理によりＣＨＯ−Ｅ１Ａ細胞系、Ａｃｃ−３１７へ導入した。９６穴プレート中、ヌクレオシド不含ＢＳＡ含有の１×ＭＲ１−４培地中のクローン集団として細胞を選択した。

生じた様々な細胞クローンの活性を測定するために、コレステリルエステル転送蛋白質活性アッセイキット（Ｒｏａｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｉｎｃ．）およびＣａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｔａｒｇｅｔｓ，Ｉｎｃにより供給されるｒＣＥＴＰスタンダードを用いて、濃縮ならし培地をアッセイした。結果は、蛋白質が活性を有することを示す。

クローン＃１５を、３リットルのボトルに入れたヌクレオシド含有の２リットルの２×ＭＲ１−４培地中にて、３４℃で１４日間、７．５×１０^５個の細胞／ｍｌとし、精製用の培地を得た。ＮｉＮＴＡ樹脂カラムを用いて、３０ｍＭのイミダゾール（ｉｍａｄａｚｏｌｅ）での洗浄、次いで、３００ｍＭのイミダゾールでの溶離により、ならし培地を精製した。精製結果は、約２．５ｍｇ／Ｌの発現レベルを示す。Ｎ−末端分析は、ＳＫＧＴＳＨＥＡＧＩＶＸＲＩ（配列番号：８）の配列を示し、これは推定配列に適合した。

Claims (12)

1. 哺乳類組換え宿主細胞におけるポリペプチドの発現方法であって、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに直接的または間接的に連結した少なくとも１つのＧＢ１ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む宿主細胞を適切な条件下で培養し、次いで、該ポリペプチドを精製することを含む、方法。
2. 少なくとも１つのＧＢ１ポリヌクレオチドが配列番号：４、５または６である、請求項１記載の方法。
3. 宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞である、請求項１記載の方法。
4. 宿主細胞がアデノウイルスＥ１Ａ遺伝子を含むチャイニーズハムスター卵巣細胞である、請求項１記載の方法。
5. 宿主細胞がＣＯＳまたはＨＥＫ細胞である、請求項１記載の方法。
6. 少なくとも１つのＧＢ１ポリヌクレオチドが、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのカルボキシ末端に直接的または間接的に連結している、請求項１記載の方法。
7. 少なくとも１つのＧＢ１ポリヌクレオチドが、選択的な切断部位を介して、該ポリペプチドをコードする該ポリヌクレオチドのカルボキシ末端に連結している、請求項１記載の方法。
8. 選択可能な切断部位がタバコエッチウイルスプロテアーゼ切断部位を含む、請求項７記載の方法。
9. 該ポリペプチドを精製する前に、該選択可能な切断部位を切断することをさらに含む、請求項１記載の方法。
10. 該ポリペプチドがコレステロールエステル転送蛋白質または内皮リパーゼ蛋白質である、請求項１記載の方法。
11. ポリペプチドを産生するための、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに直接的または間接的に連結した少なくとも１つのＧＢ１ポリヌクレオチドを含む、哺乳類組換え宿主細胞において使用される発現ベクター。
12. 哺乳類組換え宿主細胞においてポリペプチドを産生するための、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに直接的または間接的に連結した少なくとも１つのＧＢ１ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む、哺乳類組換え宿主細胞。