JP2008509153A - Combination therapy with transferrin fusion proteins comprising glp-1 - Google Patents

Combination therapy with transferrin fusion proteins comprising glp-1 Download PDF

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デイヴィッド, ジェー. バランス,
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Abstract

本発明は、トランスフェリン融合タンパク質とDPP−IV阻害剤及び/又は中性エンドペプチダーゼ(NEP)阻害剤とを含む併用療法を提供する。 The present invention provides a combination therapy comprising transferrin fusion proteins and DPP-IV inhibitor and / or neutral endopeptidase (NEP) inhibitors. トランスフェリン融合タンパク質は、糖尿病などの疾患の治療において有用な治療用ポリペプチド又はペプチドを含む。 Transferrin fusion protein includes a polypeptide or peptide for useful therapeutic in the treatment of diseases such as diabetes.
【選択図】 なし .BACKGROUND

Description

関連出願 RELATED APPLICATIONS

[0001]本出願は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる2004年8月3日に出願された米国特許仮出願第60/598,031号の利益を主張する。 [0001] This application claims the benefit of U.S. Provisional Patent Application No. 60 / 598,031, filed Aug. 3, 2004, the entirety of which is incorporated herein by reference.

[0002]本出願は、2003年3月4日に出願された米国特許出願第10/378,094号の一部継続出願である、2003年8月28日に出願されたPCT/US03/26818の一部継続出願に関係し、これらのいずれもその全体が参照により本明細書に組み入れられる。 [0002] This application is 2003 filed March 4 which is a continuation-in-part of U.S. Patent Application No. 10 / 378,094, August 2003, filed 28th PCT / US03 / 26,818 It related to a continuation-in-part application of, in its entirety any of which are incorporated herein by reference.

発明の分野 Field of the invention

[0003]本発明は、治療的なin vivo実効半減期が延長したインスリン分泌促進ペプチドを含むトランスフェリン融合タンパク質に関係する。 [0003] The present invention is therapeutic in vivo effective half-life is related to transferrin fusion proteins comprising an extended insulinotropic peptide. 本発明はまた、DPP−IV阻害剤及び/又は中性エンドペプチダーゼ阻害剤(NEP)とインスリン分泌促進ペプチドを用いた併用療法にも関する。 The present invention also relates to combination therapy with an insulin secretagogue peptide DPP-IV inhibitor and / or neutral endopeptidase inhibitors (NEP).

プロテアーゼ Protease
[0004]タンパク質分解酵素は、タンパク質の代謝回転及びプロセシングを調節することによって、細胞の増殖、分化及びシグナル伝達プロセスなどの生理学的プロセスを調節する際に重要な役割を果たしている。 [0004] Proteolytic enzymes by adjusting the turnover and processing of the protein, plays an important role in regulating physiological processes such as cell proliferation, differentiation and signaling processes. タンパク質分解酵素は、タンパク分解を通じて、重要な構造タンパク質、酵素及び調節タンパク質のレベルを制御する。 Proteolytic enzymes, through proteolysis, important structural proteins, to control the level of enzymes and regulatory proteins. 増大又は低減された、未制御なタンパク質分解酵素活性が、炎症、癌、動脈硬化症及び変性障害を含めて、様々な疾患状態に関連づけられている。 Is increased or decreased, uncontrolled proteolytic enzyme activity, inflammation, cancer, including arteriosclerosis and degenerative disorders, associated with various disease states.

[0005]国際生化学分子生物学連合(IUBMB)は、ペプチド結合加水分解酵素のサブセット(サブクラスE.C3.4.)に対して「ペプチダーゼ」という用語の使用を推奨した。 [0005] International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB) has recommended the use of the term "peptidase" for the subset of peptide bond hydrolases (Subclass E.C3.4.). 広く使用されているプロテアーゼという用語は、ペプチダーゼと同義である。 The term widely used protease is synonymous with peptidase. ペプチダーゼは、2つのグループの酵素、すなわちエンドペプチダーゼ及びエキソペプチダーゼを含み、これらはタンパク質内部の箇所でペプチド結合を切断し、かつそれぞれN末端又はC末端のいずれかから逐次的にアミノ酸配列を除去する。 Peptidase, an enzyme of the two groups, i.e., include endopeptidases and exopeptidases, which cleave peptide bonds at a point internal proteins, and to remove sequentially the amino acid sequence from either the N-terminus or C-terminus, respectively . プロテイナーゼという用語は、エンドペプチダーゼと同義である。 The term proteinase is synonymous with the endopeptidase. タンパク質分解酵素は、触媒作用の機序に従って分類される。 Proteolytic enzymes are classified according to the mechanism of catalysis. 4種の機構的なクラス、すなわちセリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ及びメタロプロテアーゼがIUBMBによって認識されている。 Four mechanistic classes, i.e. serine proteases, cysteine ​​proteases, aspartic acid proteases and metalloproteases has been recognized by the IUBMB.

[0006]セリンプロテアーゼは、タンパク質切断のための活性触媒部位中にセリン残基を含む、タンパク質分解酵素の大きなファミリーである。 [0006] Serine proteases include serine residue in the active catalytic site for protein cleavage, a large family of proteolytic enzymes. これらは遍在し、ウイルス、細菌及び真核生物中で発見されている。 These ubiquitous viruses have been found in bacteria and eukaryotes. セリンプロテアーゼは多様な基質特異性を有し、かつこれらの特異性に基づいてサブファミリーに細分され得る。 Serine proteases have a variety of substrate specificity, and can be subdivided into subfamilies on the basis of these specificities. セリンプロテアーゼには20を超えるサブファミリーがあり、6種の群(clan)(SA、SB、SC、SE、SF及びSG)に分類されている。 There is subfamilies more than 20 to serine proteases, have been classified into six groups (clan) (SA, SB, SC, SE, SF and SG).

[0007]プロリルオリゴペプチダーゼは、SC群に分類されたセリンプロテアーゼである。 [0007] prolyl oligopeptidase are classified serine protease SC group. これは、プロリン含有ペプチドをプロリン残基のカルボキシル側で加水分解する。 It hydrolyzes proline containing peptides at the carboxyl side of proline residues. おそらくは、これは、ペプチドホルモン及びニューロペプチドの成熟及び分解に関与しているようである(Wilk他 1983年 Life Sci.33、2149〜2157頁)。 Perhaps, this appears to be involved in the maturation and degradation of peptide hormones and neuropeptides (Wilk other 1983 Life Sci.33,2149~2157 pages). プロリルオリゴペプチダーゼの例としては、ジペプチジルペプチダーゼIV(DPP−IV)、ジペプチジルペプチダーゼII(DPP−II)、線維芽細胞活性化タンパク質及びプロリルオリゴペプチダーゼが挙げられる。 Examples of prolyl oligopeptidase, dipeptidyl peptidase IV (DPP-IV), dipeptidyl peptidase II (DPP-II), include fibroblast activation protein and prolyl oligopeptidase. これらの酵素は、異なる特異性を示す。 These enzymes show different specificities.

[0008]プロリンは、多数のペプチドホルモン中に存在する。 [0008] Proline is present in numerous peptide hormones. これは、これらのペプチドの立体構造及び安定性などの、これらのペプチドの構造的特性を決定し、非特異的なプロテアーゼによる分解を防いでいる。 This is such conformation and stability of these peptides, to determine the structural properties of these peptides, thereby preventing degradation by non-specific proteases. プロリン結合を攻撃するいくつかのペプチダーゼが存在する。 There are several peptidase to attack the proline bonds. これらのペプチダーゼは、X−Pro又はPro−X結合の切断だけでなく、対応するアラニル結合の分解にも低い活性で関与している。 These peptidases are not only X-Pro or Pro-X bonds of the cutting, are involved in the corresponding lower activity in the degradation of alanyl bonds. プロリンを含む配列に対して著しく特異的な作用を有するペプチダーゼは、それらのうちのいくつかが天然ペプチド基質の生物活性の調節に関係があるとされているため、医薬品化学の魅力的な標的である。 It peptidases with significantly specific action against sequences containing proline, because some of them have been implicated in the regulation of biological activity of the native peptide substrate, an attractive target for medicinal chemistry is there. 例えば、DPP−IVは、グルカゴン様ペプチド−1(GLP−1)レベルの調節を通じて糖尿病の治療に関係している。 For example, DPP-IV has been implicated in the treatment of diabetes through regulating glucagon-like peptide -1 (GLP-1) level. DPP−IV活性は、関節リウマチ、多発性硬化症、グレーブス病及び橋本甲状腺炎、サルコイドーシス、並びに癌などの様々な疾患において増大している。 DPP-IV activity is rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, Graves' disease and Hashimoto's thyroiditis, it is increasing sarcoidosis, as well as in a variety of diseases such as cancer. DPP−IV活性はまた、AIDS、ダウン症候群、食欲不振症/過食症、妊娠及び低ガンマグロブリン血症においても増大している。 DPP-IV activity may also, AIDS, Down's syndrome, anorexia / bulimia, has also increased in pregnancy and hypogammaglobulinemia.

DPP−IVを含むジペプチジルペプチダーゼ Dipeptidyl peptidase, including the DPP-IV
[0009]ジペプチジルアミノペプチダーゼ活性は、ペプチド、ポリペプチド及びタンパク質のN末端からのジペプチドの除去を触媒するペプチダーゼ活性である。 [0009] dipeptidyl aminopeptidase activity, a peptide, a peptidase activity which catalyzes the removal of dipeptides from the N-terminus of polypeptides and proteins. 一般に、ジペプチジルアミノペプチダーゼは、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質の置換されていないN末端アミノ基からジペプチドXY(式中、X及びYは任意のアミノ酸残基を表す)を切断することができる。 Generally, a dipeptidyl aminopeptidase, peptides, dipeptides XY (wherein, X and Y represent any amino acid residue) from the N-terminal amino groups that are not substituted in the polypeptide or protein capable of cleaving. ジペプチジルペプチダーゼ(DPP)の例としては、ジペプチジルペプチダーゼI(DPP−I)、ジペプチジルペプチダーゼII(DPP−II)、ジペプチジルペプチダーゼIII(DPP−III)及びジペプチジルペプチダーゼ(DPP−IV)が挙げられる。 Examples of dipeptidyl peptidase (DPP), dipeptidyl peptidase I (DPP-I), dipeptidyl peptidase II (DPP-II), dipeptidyl peptidase III (DPP-III) and dipeptidyl peptidase (DPP-IV) is and the like.

[0010]カテプシンCとしても知られているDPP−Iは、大半の組織で発現されるリソソームのシステインプロテアーゼである。 [0010] DPP-I, also known as cathepsin C is a cysteine ​​protease lysosomal expressed in most tissues. DPP−Iは、活性化型細胞障害性リンパ球の顆粒中でもっぱら発現される中性セリンプロテアーゼであるグランザイムのプロセシングに関係があるとされている。 DPP-I has been implicated in the processing of granzyme is a neutral serine proteases that are expressed exclusively in the granules of activated cytotoxic lymphocytes. DPP−IIは、リソソーム中に存在するセリンプロテアーゼである。 DPP-II is a serine protease that is present in the lysosome. DPP−IVと同様に、これはプロリンを含有するペプチド結合を切断する。 Similar to DPP-IV, which cleaves a peptide bond containing proline. 実際に、DPP−IIはDPP−IVに類似した基質特異性を有するが、酸性pHでのみ活性である。 Indeed, DPP-II has a substrate specificity similar to DPP-IV, which is active only in acidic pH. ジペプチジルペプチダーゼIII(DPP−III)はメタロプロテアーゼである。 Dipeptidylpeptidase III (DPP-III) is a metalloprotease.

[0011]DPP−IVは、セリンプロテアーゼモチーフGWSYGを含み、かつ広範な基質特異性を有するセリンプロテアーゼである。 [0011] DPP-IV includes serine protease motif GWSYG, and a serine protease with broad substrate specificity. これは、アミノ末端から順にペプチドを加水分解して、アミノ酸を遊離させる。 This hydrolyzes peptide from the amino terminus in order to liberate the amino acids. しかし、加水分解は、プロリンの手前のアミノ酸残基に到達すると終結する。 However, hydrolysis is terminated to reach the front of the amino acid residues of proline. 結果として、X−Pro−Y−(X及びYは任意のアミノ酸である)の結合を有するペプチドは切断されて、X−Pro及びY−を生じる。 As a result, X-Pro-Y- (X and Y is any amino acid) peptide is cleaved with binding of producing X-Pro and Y-. DPP−IVはまた、末端から2番目の位置にアラニンを有するジペプチドも切断すると考えられるが、プロリンを有するジペプチドより効果は低い(Yaron他、1993年 Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.28:31〜81頁)。 DPP-IV is also a dipeptide having alanine from the end in the second position is also believed that cutting, but more effective is low dipeptide having proline (Yaron et 1993 Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.28: pp. 31-81). この酵素はまた、他の配列も切断すると考えられるが、効率はさらに低い。 The enzyme also is believed to also cut other sequences, efficiency is lower.

[0012]DPP−IVは、ペプチド基質のN末端配列の末端から2番目の位置にプロリン又はアラニンを有する生物活性ペプチドのN末端からジペプチドを遊離させる際に極めて特異的であることが示された。 [0012] DPP-IV has been shown to be highly specific in liberating dipeptides from the N-terminus of biologically active peptides from the end of the N-terminal sequence of the peptide substrate having a second proline or alanine at position . DPP−IVに対する多数の潜在的なペプチド基質が同定された。 Large number of potential peptide substrates for DPP-IV have been identified. DPP−IV基質には、ペプチドホルモン及びケモカインが含まれる。 The DPP-IV substrates include peptide hormones and chemokines. いくつかのペプチドホルモンの例は、エンドモルフィン−2、GLP−1、GLP−2、胃抑制ペプチド(GIP)、ニューロペプチドY、成長ホルモン放出ホルモン(GHRH)及びサブスタンスPであり、またいくつかのケモカインの例は、RANTES、GCP−2、SDF−1α、SDF−2β、MDC、MCP−1、MCP−2及びMCP−3である。 Examples of some peptide hormones, endomorphin -2, GLP-1, GLP-2, gastric inhibitory peptide (GIP), a neuropeptide Y, growth hormone-releasing hormone (GHRH) and substance P, also some examples of chemokines, RANTES, GCP-2, SDF-1α, SDF-2β, MDC, is MCP-1, MCP-2 and MCP-3. DPP−IIは、DPP−IVとほぼ同一の基質特異性を有する。 DPP-II has substantially the same substrate specificity as DPP-IV.

DPP−IV及び糖尿病 DPP-IV and diabetes
[0013]インスリン依存性糖尿病(IDDM又はI型糖尿病)は、現在、患者へのインスリン投与によって治療されている。 [0013] insulin-dependent diabetes mellitus (IDDM or type I diabetes) is currently treated by insulin administration to the patient. 非インスリン依存性糖尿病(NIDDM又はII型糖尿病)は、食事療法、インスリン分泌を促進するためのスルホニル尿素の投与によって、又はグルコース取込みを増加させるビグアナイドを用いて治療される。 Non-insulin dependent diabetes mellitus (NIDDM or Type II diabetes) is diet, administration of sulphonylureas to stimulate insulin secretion, or treated with biguanides to increase glucose uptake. 抵抗性の個体はインスリン療法を必要とすることがある。 Resistant individuals may require insulin therapy. 標準療法では、インスリンを毎日静脈注射する必要があり、これにより急性の症状が治療されると考えられるが、長期の療法は、血管疾患及び神経損傷をもたらす。 The standard therapy, it is necessary to insulin daily intravenous injections, but thereby the symptoms of acute believed to be treated, long-term therapy results in vascular disease and nerve damage. 移植などの現代的な方法は高価であり、かつ危険を伴う外科的介入を必要とする。 Modern methods such as transplantation require surgical intervention involving expensive and dangerous. したがって、極めて効果的で低コストの糖尿病治療の代替手段を開発することが必要とされている。 Therefore, there is a need to develop alternative means of highly effective and low cost treatment of diabetes.

[0014]近年、血中グルコースレベルを低下させるための標的として、DPP−IVへの関心が高まってきた。 [0014] In recent years, as a target for lowering blood glucose levels, there has been increased interest in DPP-IV. 対象の血中のDPP−IV酵素又はDPP−IV様酵素活性を妨害するために阻害剤を使用すると、GIP、GLP−1、又はその類似体などの内因性又は外因的に投与されたインスリン分泌促進ペプチドの分解が減少する。 The use of inhibitors to interfere with the DPP-IV enzyme or DPP-IV-like enzyme activity in the blood of a subject, GIP, GLP-1, or an endogenous or exogenously administered insulin secretion, such as its analogs decomposition of promoting peptide is reduced. GIP及びGLP−1は、膵臓によるグルコース誘導性のインスリン分泌を促進するホルモンであり、DPP−IVの基質である。 GIP and GLP-1 is a hormone that promotes glucose-induced insulin secretion by the pancreas, are substrates of DPP-IV. 具体的には、DPP−IVは、GLP−1のアミノ末端のHis−Alaジペプチドを除去して、膵島からのグルコース依存性のインスリン分泌を誘発することができないGLP−1−(9−36)−アミドを生成させるため、このようなDPP−IV又はDPP−IV様酵素活性をin vivoで阻害すると、哺乳類生物の病理学的状態において望まれない酵素活性が効果的に抑制されるであろう。 Specifically, DPP-IV removes the His-Ala dipeptide at the amino terminus of GLP-1, GLP-1- (9-36) that fail to elicit glucose-dependent insulin secretion from pancreatic islets - in order to form an amide, inhibition of such DPP-IV or DPP-IV-like enzyme activity in in vivo, would enzymatic activity which is not desired in pathological conditions of mammalian organisms is effectively suppressed .

[0015]PCT/DE97/00820では、DPP−IV又はDPP−IV様酵素活性の阻害剤としてアラニルピロリジド及びイソロイシルチアゾリジドを開示している。 In [0015] PCT / DE97 / 00820, discloses alanyl pyrrolidide and isoleucyl Lucia sledding disilazide as inhibitors of DPP-IV or DPP-IV-like enzyme activity. DD296075では、ピロリジド及びイソロイシルチアゾリジド塩酸塩を開示している。 In DD296075, discloses pyrrolidide and isoleucyl Lucia sledding disilazide hydrochloride. 米国特許第6548481号では、アミノ酸とチアゾリジン又はピロリジン基とから形成されるジペプチド化合物並びにそれらの塩に類似した阻害剤を開示している。 In U.S. Patent No. 6548481 discloses dipeptide compounds formed from an amino acid and a thiazolidine or pyrrolidine group, as well as inhibitors similar to the salts thereof. これらはDPP−IV活性の機能的阻害剤であるが、ある種の患者又は疾患のある種の形態においてこれらの阻害剤を使用することは、問題となる可能性がある。 These are a functional inhibitor of DPP-IV activity, the use of these inhibitors in certain forms of certain patients or diseases, can be problematic. これは、この酵素が非常に多様な生物活性ペプチドの活性化又は不活性化を司っているため、すなわちDPP−IV阻害剤が所望の標的GIP及びGLP−1に対する特異性を欠くためである。 This is because this enzyme is responsible for the activation or deactivation of a wide variety of biologically active peptides, i.e. in order to DPP-IV inhibitors lack specificity for a desired target GIP and GLP-1 .

改変による治療用ペプチドの保護 Protection of the therapeutic peptides according to the modified
[0016]GIPやGLP−1などの治療用タンパク質及びペプチドがタンパク質分解酵素によって切断されるのを防ぐ別の方法は、タンパク質分解酵素への曝露を阻止するためにそれらのタンパク質及びペプチド自体を改変することである。 [0016] Another way to prevent being cut therapeutic proteins and peptides such as GIP or GLP-1 is the proteolytic enzyme, modifying their proteins and peptides themselves to prevent exposure to proteolytic enzymes It is to be. タンパク質改変は、治療用ポリペプチドの安定性、循環時間及び生物活性を増大させることが示されている。 Protein modification, the stability of therapeutic polypeptides has been shown to increase the circulation time and biological activity. アミノ酸及びペプチドを改変するいくつかの一般的な方法は、参照により本明細書に組み入れられるChemistry and Biochemistry of Amino Acids,Peptides,and Proteins−A Survey of Recent Developments(Weinstein,B.編、Marcel Dekker,Inc.出版、ニューヨーク 1983年)において開示されている。 Some general methods of modifying amino acids and peptides, referred to by herein incorporated be Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins-A Survey of Recent Developments (Weinstein, B. Ed, Marcel Dekker, Inc. publication, has been disclosed in the New York, 1983). また、参照により本明細書に組み入れられるFrancisの総説論文(1992年 Focus on Growth Factors 3;4〜10頁(Mediscript、ロンドン))では、タンパク質改変及び融合タンパク質を説明している。 Also, review articles by Francis, incorporated herein by reference (1992 Focus on Growth Factors 3; 4~10 pages (Mediscript, London)) In describes a protein modification and fusion proteins.

[0017]組換えDNA技術及び自動化技術の進歩に伴い、現在では、短い、中程度の又は長い改変タンパク質を大量に容易に調製することができる。 [0017] With advances in recombinant DNA technology and automation technology, at present, a short can be prepared medium or long modified protein easily in large quantities. 自動化ペプチド合成機、固体樹脂技術又は組換え技術を用いて、多数の小型の改変ポリペプチドホルモンを合成することができる。 Automated peptide synthesizer, using a solid resin techniques or recombinant techniques, can be synthesized a number of small modified polypeptide hormones. 例えば、ジペプチジルペプチダーゼの改変された基質、例えばGLP−1、GIP、ニューロペプチドY及びブラジキニンなどDPP−IVの基質を、自動化ペプチド合成機を用いて大量に作製することができる。 For example, dipeptidyl peptidase altered substrate of, for example, GLP-1, GIP, such as neuropeptide Y and bradykinin a substrate of DPP-IV, can be prepared in large quantities using an automated peptide synthesizer.

発明の概要 Summary of the Invention

[0018]本発明は、プロテアーゼ切断の影響を受けやすい治療用ペプチド又はタンパク質を含むトランスフェリン融合タンパク質を提供する。 [0018] The present invention provides a transferrin fusion protein comprising a sensitive therapeutic peptides or proteins of protease cleavage. 本発明はまた、プロテアーゼ切断に感受性、抵抗性、又は部分的に抵抗性である治療用ペプチド又はタンパク質を含むトランスフェリン融合タンパク質も提供する。 The present invention also susceptible to protease cleavage, resistant or partially resistant transferrin fusion proteins comprising therapeutic peptides or proteins is also provided. プロテアーゼは、DPP−IV又は中性エンドペプチダーゼ(NEP)でよい。 Protease may be DPP-IV or neutral endopeptidase (NEP). さらに、本発明は、トランスフェリン融合タンパク質と、それだけには限らないがDPP−IV及び/又はNEPの阻害剤など第2の作用物質とを含む組成物も提供する。 Furthermore, the present invention includes a transferrin fusion protein, it just is not limited to provide also compositions comprising a second agent such as inhibitors of DPP-IV and / or NEP. さらに、これらの組成物は、様々な疾患の治療において使用される薬剤組成物であり得る。 In addition, these compositions may be pharmaceutical compositions used in the treatment of various diseases.

[0019]本発明は、様々な疾患の治療においてトランスフェリン融合タンパク質及び少なくとも1種の第2の作用物質を投与するステップを含む併用療法を提供する。 [0019] The present invention provides a combination therapy comprising administering transferrin fusion proteins and at least one second agent in the treatment of various diseases. トランスフェリン融合タンパク質は、1種又は複数種の第2の作用物質と同時に投与され得る。 Transferrin fusion proteins may be administered concurrently with one or more second agent. あるいは、トランスフェリン融合タンパク質は、第2の作用物質の投与の前又は後のいずれかに、逐次的に投与される。 Alternatively, the transferrin fusion protein, either before or after the administration of the second agent are administered sequentially. 好ましくは、第2の作用物質は、DPP−IV又はNEPの阻害剤である。 Preferably, the second agent is an inhibitor of DPP-IV or NEP.

[0020]本発明のGLP−1ペプチド部分は、それらがDPP−IV切断などのプロテアーゼ切断に対して部分的又は完全に抵抗性となるように、1つ又は複数の変異を含むように改変され得る。 [0020] GLP-1 peptide moiety of the present invention, they are such that the partially or fully resistant to protease cleavage, such as DPP-IV cleavage, be modified to include one or more mutations obtain. GLP−1ペプチドは、GLP−1(7−37)(配列番号32)又はGLP−1(7−36)(配列番号2のアミノ酸1〜30)でよい。 GLP-1 peptides may be GLP-1 (7-37) (SEQ ID NO: 32) or GLP-1 (7-36) (amino acid 1-30 of SEQ ID NO: 2). 例えば、これらのペプチドは、A8からG及び/又はK34からAへの変異によって改変することができる。 For example, the peptides can be modified by mutation from G to A and / or K34 from A8.

詳細な説明 Detailed description

1. 1. 概要 Overview
[0029]本発明は、一部には、より効果的で低コストの糖尿病の治療のための代替手段を開発する必要に基づいている。 [0029] The present invention is based, in part, on the need to develop alternative means for the treatment of more effective and low-cost of diabetes. GLP−1などのインスリン分泌促進ペプチドは、2型非インスリン依存性糖尿病、並びに糖尿病前症、代謝症候群及び肥満などの関連代謝障害を治療するための有望な治療用物質である。 Insulinotropic peptides such as GLP-1 is type 2 non-insulin dependent diabetes mellitus, and pre-diabetes, a promising therapeutic agent for the treatment of associated metabolic disorders such as metabolic syndrome and obesity. 他の有用なインスリン分泌促進ペプチドとしては、エキセンディン3及びエキセンディン4が挙げられる。 Other useful insulinotropic peptides, exendin 3 and exendin-4. しかし、これらのインスリン分泌促進ペプチドは、急速な血清クリアランス及びタンパク質分解に主に起因して、in vivoでの血漿半減期が短い。 However, these insulin secretagogue peptides, mainly due to rapid serum clearance and proteolytic degradation, the short plasma half-life in vivo. GLP−1の分解を司る酵素であるDPP−IVを阻害するために、又はGLP−1を、その分解が減速され、同時に生物活性をなお維持するような方法で改変するために、多大な研究が行われた。 To inhibit DPP-IV is an enzyme responsible for degradation of GLP-1, or GLP-1, its decomposition is decelerated, to modify in a manner that still retains biological activity simultaneously, great research It has been carried out. これらの多大な努力にもかかわらず、長期に渡って活性を有するGLP−1は作製されなかった。 Despite these tremendous efforts, GLP-1 having activity over a long period was not produced. したがって、in vivoでの作用のより長い持続期間を提供し、同時にそれらの低い毒性及び治療上の利点を維持するために、GLP−1、エキセンディン3、エキセンディン4、及び他のインスリン分泌促進ペプチドを改変する必要がある。 Therefore, to provide a longer duration of action in in vivo, in order to maintain the benefits their low toxicity and therapeutic simultaneously, GLP-1, exendin 3, exendin 4, and promote other insulin secretion there is a need to modify the peptide.

2. 2. 定義 Definition
[0030]本明細書において使用される場合、「誘導体」という用語は、酵素を用いた又は用いない化学的手段による、例えばアルキル化、アシル化、エステル形成、又はアミド形成による、ペプチドの1つ又は複数のアミノ酸残基の改変を意味する。 [0030] As used herein, the term "derivative", by chemical means without or with an enzyme, such as alkylation, acylation, by ester formation, or amide formation, one of the peptides or it means a modification of multiple amino acid residues.

[0031]本明細書において使用される場合、「から誘導される(derived from)」という用語は、親分子から分子を得ること等の特定された供給源から分子を得ることを意味する。 [0031] As used herein, the term "derived from (derived from)" means to obtain a molecule from the identified source of such to obtain a molecule from a parent molecule.

[0032]本明細書において使用される場合、「ジペプチジルアミノペプチダーゼ活性」という用語は、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質配列のN末端からジペプチドを切断するペプチダーゼ活性を意味する。 [0032] As used herein, the term "dipeptidyl aminopeptidase activity" peptide means a peptidase activity which cleaves dipeptides from the N-terminus of the polypeptide or protein sequence. 一般に、ジペプチジルアミノペプチダーゼは、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の置換されていないN末端アミノ基からジペプチドXY(式中、X又はYは、Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr及びValからなる群から選択される任意のアミノ酸残基を表し得るが、少なくともAla、Arg、Asp及び/又はGlyである)を切断することができる。 Generally, a dipeptidyl aminopeptidase, peptides, in a polypeptide or a dipeptide XY (wherein the N-terminal amino groups that are not substituted protein, X, or Y is, Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly , His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, but may represent any amino acid residue selected from the group consisting of Tyr and Val, at least Ala, Arg, Asp and / or it can cleave a is) Gly. 好ましくは、Yは、Pro又はAlaである。 Preferably, Y is Pro or Ala. X及びYはすべて、異なるものでも同一のものでもよい。 All X and Y may be identical to be different. ジペプチジルアミノペプチダーゼの例としては、それだけには限らないが、DPP−I、DPP−II、DPP−III及びDPP−IVが挙げられる。 Examples of dipeptidyl aminopeptidase include, but are not limited to, DPP-I, DPP-II, include DPP-III and DPP-IV.

[0033]本明細書において使用される場合、「グルカゴン様ペプチド−1(GLP−1)」及び「GLP−1誘導体」という用語は、一般に高血糖の間にインスリン分泌を刺激し、グルカゴン分泌を抑制し、(プロ)インスリン生合成を促進し、かつ胃内容排出及び酸分泌を減速させる腸ホルモンを意味する。 [0033] As used herein, the term "glucagon-like peptide -1 (GLP-1)" and "GLP-1 derivative" generally stimulates insulin secretion during hyperglycemia, glucagon secretion suppressing, (pro) promote insulin biosynthesis, and means gut hormone to decelerate gastric emptying and acid secretion. 参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5574008号において開示されているように、いくつかのGLP−1及びGLP−1誘導体は、細胞によるグルコース取込みを促進するが、インスリン発現は刺激しない。 As disclosed in U.S. Patent No. 5574008, incorporated herein by reference, some GLP-1 and GLP-1 derivative, promotes glucose uptake by cells, insulin expression does not stimulate.

[0034]本明細書において使用される場合、「インスリン分泌促進ペプチド」という用語は、インスリン分泌促進活性を有するペプチドを意味する。 [0034] As used herein, the term "insulinotropic peptides" refers to a peptide having insulinotropic activity. インスリン分泌促進ペプチドは、インスリンホルモンの合成若しくは発現を促進する又はその促進を引き起こす。 Exendins causes to or promote promote the synthesis or expression of the hormone insulin. このようなペプチドとしては、グルカゴン様ペプチド1、エキセンディン3及びエキセンディン4などのペプチドの前駆体、類似体、断片、並びにインスリン分泌促進活性を有する他のペプチドが挙げられる。 Such peptides, glucagon-like peptide 1, precursor peptides such as exendin 3 and exendin 4, analogue, fragment, as well as other peptides with insulinotropic activity.

[0035]本明細書において使用される場合、「製薬上許容される」とは、ヒトに投与された場合に生理学的に許容され、かつ胃の不調、めまいなどのようなアレルギー性又は類似した有害反応を通常はもたらさない材料及び組成物を意味する。 As used [0035] herein, the term "pharmaceutically acceptable", physiologically acceptable when administered to humans, and upset stomach, and allergic or similar, such as dizziness usually an adverse reaction refers to a material and composition that does not result. 通常、本明細書において使用される場合、「製薬上許容される」という用語は、連邦若しくは州政府の規制機関によって承認されていること、又は、動物において、より具体的にはヒトにおいて使用するために、米国薬局方若しくは一般に認識されている他の薬局方に記載されていることを意味する。 Normally, as used herein, the term "pharmaceutically acceptable", that have been approved by a regulatory agency of the Federal or a state government, or, in animals, more particularly for use in humans for, means that are described in other pharmacopeia known to U.S. Pharmacopeia or general.

[0036]本明細書において使用される場合、「薬剤組成物」という用語は、必要に応じて、製薬上許容される担体又は希釈剤と共に作用物質を含む組成物を意味する。 [0036] As used herein, the term "pharmaceutical composition", as required, means a composition comprising an agent together with a pharmaceutically acceptable carrier or diluent. 製薬上許容される担体及び添加剤は、薬剤化合物からの副作用が最小限に抑えられ、かつその化合物の能力が、治療が無効になる程度まで打ち消されることも阻害されることもないように、選択される。 Pharmaceutically acceptable carriers and additives, side effects from the drug compound is minimized, and the ability of the compound, so no also be inhibited be canceled to the extent that treatment is ineffective, It is selected.

[0037]本明細書において使用される場合、「生理学的に有効な量」とは、所望の対症的又は治療的効果を与えるために対象に送達される量である。 [0037] As used herein, "physiologically effective amount" is that amount delivered to a subject to give the desired palliative or therapeutic effect. この量は、各薬物及び最終的に承認された投薬量レベルに対して固有である。 This amount is specific for each drug and finally approved dosage level.

[0038]本明細書において使用される場合、「治療有効量」とは、必要とする対象に投与された場合に、治療を実施するのに十分である改変された治療用ポリペプチド又はペプチドの量を意味する。 [0038] As used herein, "therapeutically effective amount" refers to when administered to a subject in need, the modified therapeutic polypeptide or peptide is sufficient to carry out the treatment It refers to an amount. 「治療有効量」に相当する改変された治療用ポリペプチド又はペプチドの量は、使用される治療用タンパク質、病態又は疾患の重症度、並びに治療される対象の年齢及び体重に応じて変動するが、当業者なら、彼/彼女自身の知識及び本開示を考慮することにより、ごく普通に決定することができる。 The amount of modified therapeutic polypeptides or peptides corresponding to "therapeutically effective amount" therapeutic protein used, the severity of the condition or disease, and will vary depending on the age and weight of the subject to be treated , one of ordinary skill in the art, by considering his / her own knowledge and the present disclosure, can be determined routinely.

[0039]本明細書において使用される場合、「治療用タンパク質」とは、1種又は複数種の治療活性及び/又は生物活性を有する、タンパク質、ポリペプチド、抗体、ペプチド断片又はその変異体を意味する。 [0039] As used herein, a "therapeutic protein" comprises one or more therapeutic activity and / or biological activity, protein, polypeptide, antibody, peptide fragment or variant thereof means. 本発明に含まれる治療用タンパク質としては、それだけには限らないが、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体及び生物製剤が挙げられる。 Therapeutic proteins encompassed by the present invention, but are not limited to, proteins, polypeptides, peptides, antibodies and biologics like. ペプチド、タンパク質及びポリペプチドという用語は、本明細書において同義的に使用される。 Terms peptide, protein and polypeptide are used interchangeably herein. さらに、「治療用タンパク質」という用語は、治療用タンパク質の内因性又は天然に存在する相関物を意味してもよい。 Furthermore, the term "therapeutic protein" may mean a correlation that is present endogenous or native therapeutic protein. 「治療活性」を示すポリペプチド若しくはペプチド、又は「治療的に活性を有する」タンパク質とは、本明細書において説明する、又はそうでなければ当技術分野において公知である治療用タンパク質のうちの1種又は複数種など、治療用タンパク質に関連した1種又は複数種の公知の生物活性及び/又は治療活性を有する、ポリペプチド、ペプチド又はタンパク質を意味する。 Polypeptide or peptide indicating "therapeutic activity" or a "therapeutically with activity" protein, described herein, or in unless the art so of therapeutic proteins are known 1 such as species or more species having one or more known biological and / or therapeutic activity associated with therapeutic proteins, it means a polypeptide, peptide or protein. 非限定的な例として、「治療用タンパク質」は、疾患、病態又は障害を治療、予防又は改善するのに有用なタンパク質、ポリペプチド又はペプチドである。 As a non-limiting example, "therapeutic protein" disease, condition or disorder treated is a useful protein, polypeptide or peptide to prevent or improve. このような疾患、病態又は障害は、ヒトにおけるものでも、ヒト以外の動物におけるもの、例えば獣医学用途でもよい。 Such diseases, conditions or disorders, also in a human, that in non-human animals, for example, may be in veterinary applications.

[0040]本明細書において使用される場合、「治療」又は「治療すること」という用語は、本発明の化合物の任意の投与を意味し、以下のステップ、すなわち、(1)その疾患に罹患しやすい可能性があるが、その疾患の病状若しくは総体的症状をまだ経験も提示もしていない動物においてその疾患が発生するのを防止するステップ;(2)罹患した個体の病状若しくは総体的症状を経験若しくは提示している動物においてその疾患を抑制するステップ(すなわち、病状及び/若しくは総体的症状のさらなる発達を阻止するステップ);又は(3)罹患した個体の病状若しくは総体的症状を経験若しくは提示している動物においてその疾患を改善するステップ(すなわち、病状及び/若しくは総体的症状を逆戻りさせるステップ)を含む。 As used [0040] herein, the term "treatment" or "treating" means any administration of a compound of the present invention, the following steps, namely, (1) suffering from the disease there is likely possibility, steps to prevent the the disease occurs in animals not nor presenting yet experience pathology or symptomatology of the disease; (2) the pathology or symptomatology of the affected individuals inhibiting the disease in an animal that is experiencing or presenting step (i.e., conditions and / or steps to prevent further development of the symptomatology); or (3) experience or present the pathology or symptomatology of the affected individuals comprising the step of improving the disease in an animal that is (i.e., the step of reversing the pathology and / or symptomatology).

[0041]本明細書において使用される場合、「生物活性」という用語は、生物学的機能を媒介する能力を意味する。 [0041] As used herein, the term "biological activity" means the ability to mediate a biological function. 「生物活性」には、機能的活性並びに構造的活性が含まれる。 The "biological activity" includes functional activity as well as structural activity.

[0042]本明細書において使用される場合、「対症的」という用語は、治癒に影響を及ぼさずに、疾患又は障害の症状を緩和又は軽減する能力を意味する。 [0042] As used herein, the term "symptomatic" is without affecting healing, refers to the ability to relieve or alleviate the symptoms of the disease or disorder. 例えば、病態又は疾患を治癒させずに疼痛を軽減する作用物質は、対症的物質である。 For example, an agent to reduce pain without curing the condition or disease is a palliative agent.

[0043]本明細書において使用される場合、「予防の」という用語は、何か、特に疾患若しくは病態から防御し、又はそれらを予防する作用をすること等の防御効果を有することを意味する。 [0043] As used herein, the term "prevention", something particularly protect against disease or condition, or means having a protective effect, such as to act to prevent them .

[0044]本明細書において使用される場合、「精製された」タンパク質又は核酸とは、細胞成分から分離されたタンパク質又は核酸を意味する。 [0044] As used herein, "purified" protein or nucleic acid is meant an isolated protein or nucleic acid from cellular components. 「精製された」タンパク質又は核酸は、天然には存在しない純度レベルまで精製されている。 "Purified" protein or nucleic acid is purified to a purity level that does not occur in nature.

[0045]本明細書において使用される場合、「実質的に純粋な」タンパク質又は核酸という用語は、他のすべての細胞成分を欠いているタンパク質又は核酸調製物を意味する。 [0045] As used herein, the term "substantially pure" protein or nucleic acid refers to a protein or nucleic acid preparation lacking all other cellular components.

[0046]本明細書において使用される場合、「治療的な(therapeutic)」という用語は、治癒的、回復推進的又は治療的効果を意味する。 As used [0046] herein, the term "therapeutic (Therapeutic)" is curative means restorative or therapeutic effect. 例えば、「治療用物質」又は「治療用組成物」は治癒的効果を有する。 For example, "therapeutic agent" or "therapeutic composition" has a curative effect.

3. 3. 特定の実施形態 ジペプチジルペプチダーゼ Certain embodiments dipeptidylpeptidase
[0047]ジペプチジルペプチダーゼは、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の置換されていないN末端アミノ基からジペプチドを除去する加水分解酵素である。 [0047] Dipeptidyl peptidase is a hydrolytic enzymes that remove dipeptides from the N-terminal amino groups that are not substituted peptide, polypeptide or protein. ジペプチジルペプチダーゼの例としては、それだけには限らないが、DPP−I、DPP−II、DPP−III、DPP−IV、アトラクチン及び線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)が挙げられる。 Examples of dipeptidyl peptidase, but are not limited to, DPP-I, DPP-II, DPP-III, DPP-IV, attractin, and fibroblast activation protein (FAP) and the like. このファミリーの、又は同様の機能を有するが構造の異なる新しい酵素が出現しつつある。 This family, or new enzyme is emerging which differ structurally have similar functions.

[0048]ジペプチジルペプチダーゼI(DPP−I)は、カテプシンCとしても知られており、パパインファミリーに属するリソソームのシステインプロテアーゼである。 [0048] Dipeptidyl peptidase I (DPP-I), also known as cathepsin C, is a lysosomal cysteine ​​protease belonging to the papain family. DPP−Iは、様々なペプチド及びタンパク質基質の遊離アミノ末端からジペプチドを逐次的に除去することができ、したがってエキソペプチダーゼ(具体的にはジペプチジルペプチダーゼ)の様式で作用する。 DPP-I is capable of sequentially removing dipeptides from the free amino terminus of various peptide and protein substrates, thus (specifically dipeptidyl peptidase) exopeptidases acting in a manner. 断片化された結合がいずれかの側にプロリン残基を有する場合、又はN末端残基がリシン若しくはアルギニンである場合、切断は無効である。 If fragmented bond has a proline residue on either side, or if the N-terminal residue is lysine or arginine, cleavage is invalid.

[0049]DPP−IIは、リソソーム中に存在するセリンプロテアーゼであり、機能は不明である。 [0049] DPP-II is a serine protease that is present in lysosomes, function is unknown. DPP−IVと同様に、これはプロリンを含有するペプチド結合を主に切断する。 Similar to DPP-IV, which is mainly cleave peptide bonds containing proline. 実際には、DPP−IIはDPP−IVと同様の基質特異性を有するが、酸性pHでのみ活性である。 In fact, DPP-II has a substrate specificity similar to DPP-IV, which is active only in acidic pH. 哺乳動物のDPP−II及びDPP−IVは、阻害剤ピューロマイシン及びバシトラシンを用いて区別することができる。 DPP-II and DPP-IV in a mammal, can be distinguished using inhibitors puromycin and bacitracin. すなわち、ピューロマイシンはDPP−IIのみを阻害すると考えられるのに対し、バシトラシンはDPP−IVのみを阻害する(1988年 J.Biol.Chem.263、6613〜6618頁)。 That is, puromycin whereas thought to inhibit only the DPP-II, bacitracin inhibits only DPP-IV (p. 1988 J.Biol.Chem.263,6613~6618). ジペプチジルペプチダーゼIII(DPP−III)はメタロプロテアーゼである。 Dipeptidylpeptidase III (DPP-III) is a metalloprotease. DPP−Vは、N末端のX−Ala、His−Ser及びSer−Tyrジペプチドを遊離させる。 DPP-V is, X-Ala at the N-terminus, to liberate the His-Ser and Ser-Tyr dipeptides.

[0050]DPP−VIIは、静止細胞プロリンジペプチダーゼとしても知られており、プロリン特異的なジペプチダーゼである。 [0050] DPP-VII, also known as quiescent cell proline dipeptidase, is a proline-specific dipeptidase. DPP−VII及びDPP−IIは、ヒトDPP−VII及びラットDPP−IIの配列比較(78%一致)に基づいて、同一のプロテアーゼであることが示唆された(Araki他、2001年 J.Biochem.129、279〜288頁)。 DPP-VII and DPP-II, based on sequence comparison of human DPP-VII and rat DPP-II (78% match), suggesting that the same protease (Araki et al., 2001 J. Biochem. pages 129,279~288).

[0051]DPP−VIIIは、DPP−IV及びFAPに相同な、ヒト由来ポストプロリンジペプチジルアミノペプチダーゼである(Abbott,C.A.他、2000年 European Journal of Biochemistry 267、6140頁)。 [0051] DPP-VIII is a homologous, human post-proline dipeptidyl aminopeptidase DPP-IV and FAP (Abbott, C.A. Et al., 2000 European Journal of Biochemistry, pp 267,6140). DPP−IVと同様、DPP−VIIIは、遍在している。 Similar to DPP-IV, DPP-VIII is ubiquitous. 完全長のDPP−VIII cDNAは、DPP−IV及びFAPに対して約27%の同一性及び51%の類似性を有する882アミノ酸のタンパク質をコードしているが、膜貫通ドメイン及びN結合型又はO結合型グリコシル化はコードしていない。 DPP-VIII cDNA of full length, but encodes a protein of 882 amino acids having approximately 27% identity and 51% similarity to DPP-IV and FAP, a transmembrane domain and N-linked or O-linked glycosylation is not code. 精製された組換え型DPP−VIIIは、DPP−IV基質のAla−Pro、Arg−Pro及びGly−Proを加水分解した。 Purified recombinant DPP-VIII was Ala-Pro of DPP-IV substrate, the Arg-Pro and Gly-Pro hydrolyzed. したがって、組換え型DPP−VIIIは、DPP−IV及びFAPとポストプロリンジペプチジルアミノペプチダーゼ活性を共有している。 Therefore, recombinant DPP-VIII shares a DPP-IV and FAP and post-proline dipeptidyl aminopeptidase activity. DPP−VIII酵素活性は中性の最適pHを有し、これはそれが非リソソーム性であることと一致した。 DPP-VIII enzyme activity has an optimum pH of neutral, which is consistent with that it is non-lysosomal. 組織発現パターン及び基質におけるDPP−VIIIとDPP−IVの類似点により、DPP−IVに類似した、T細胞活性化及び免疫機能におけるDPP−VIIIの潜在的な役割が示唆される。 The similarities of DPP-VIII and DPP-IV in tissue expression pattern and substrates, similar to DPP-IV, a potential role for DPP-VIII in T-cell activation and immune function is suggested.

[0052]Olsen C. [0052] Olsen C. 他(2002年 Gene 299、185〜93頁)は、ジペプチジルペプチダーゼ様タンパク質DPP−IXと名付けられた、新規のDPP−IV様分子の同定及び特性決定を報告している。 Other (2002 Gene 299,185~93 pages) was named dipeptidyl peptidase-like protein DPP-IX, we have reported the identification and characterization of the new DPP-IV-like molecules. DPP−IVと同様に、DPP−IXは、セリンプロテアーゼモチーフGWSYG(配列番号110)を含む。 Similar to DPP-IV, DPP-IX comprises the serine protease motif GWSYG (SEQ ID NO: 110). このモチーフが存在すること、並びにDPP−IVにおいて触媒作用の3つ組を形成しているSer、Asp、及びHis残基の順序及び間隔が保存されていることから、DPP−IXはDPP−IV遺伝子ファミリーに配置される。 That this motif is present, and since the Ser forming three sets of catalysis, Asp, and the order and spacing of the His residues are conserved in DPP-IV, DPP-IX is DPP-IV It is placed in gene family.

[0053]アトラクチン(DPPT−L)は、Gly−Proを加水分解することが報告されている175−kDaの可溶性糖タンパク質である。 [0053] attractin (DPPT-L) is a 175-kDa soluble glycoprotein reported to hydrolyze Gly-Pro. アトラクチンは、ケルチ反復ドメインを含み、かつDPP−IV又は他の任意のペプチダーゼとも、有意な配列相同性を共有していない。 Attractin includes Kerch repeat domain, and with DPP-IV or any other peptidase, do not share significant sequence homology. 線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)は、組織再構築の部位で発現されるプロリルオリゴペプチダーゼ遺伝子ファミリーの細胞表面結合型プロテアーゼである。 Fibroblast activation protein (FAP) is a prolyl oligopeptidase gene family of cell surface associated proteases that are expressed at sites of tissue remodeling.

[0054]プロリンオリゴペプチダーゼ(PO)とも呼ばれるプロリルエンドペプチダーゼ(PEP)は、ヒト子宮中のオキシトシン分解酵素としてWalter及び共同研究者らによって最初に発見された(Walter他、Science 173、827〜829頁(1971年))。 [0054] prolyl endopeptidase, also called proline oligopeptidase (PO) (PEP) is first discovered (Walter other by Walter and coworkers as an oxytocin-degrading enzyme in the human uterus, Science 173,827~829 page (1971)). この酵素は、配列X−Pro−Y(式中、Xは、ペプチド又はN末端で置換されたアミノ酸であり、かつYは、ペプチド、アミノ酸、アミド又はアルコールである)を含むペプチド中のプロリンのカルボキシ側でペプチド結合を切断する(Yoshimoto他、J.Biol.Chem.253、3708〜3716頁(1979年))。 This enzyme, (wherein, X is an amino acid substituted with a peptide or N-terminal, and Y is a peptide, amino acid, amide or alcohol) sequence X-Pro-Y proline in peptides containing cleaving the peptide bond at the carboxy side (Yoshimoto et pp J.Biol.Chem.253,3708~3716 (1979 years)). この酵素は、プロリンのイミノ側のペプチド結合のトランス配置に対して高い特異性を有する(Lin&Brandts、Biochemistry 22、4480〜4485頁(1983年))。 This enzyme has a high specificity for the trans configuration of the imino-side of the peptide bond of proline (Lin & Brandts, Biochemistry, pp 22,4480~4485 (1983)).

[0055]プロリルオリゴペプチダーゼは、アンギオテンシンI及びアンギオテンシンIIを加水分解して、アンギオテンシン(1−7)の遊離をもたらす。 [0055] prolyl oligopeptidase are angiotensin I and angiotensin II by hydrolysis, results in the release of angiotensin (1-7). アンギオテンシン(1−7)は、血管拡張活性を有し、かつ、特異的なPEP阻害剤と共にラットに注射することによって示されたように、記憶のプロセスに影響し得るバソプレシンの放出を調節する。 Angiotensin (1-7) has vasodilator activity, and, as shown by injecting rats with specific PEP inhibitor, modulates the release of vasopressin can affect the process of storage. この注射は、スコポラミン誘導性の健忘症を逆に戻す。 This injection returns the scopolamine-induced amnesia in reverse. この実験は、この酵素のあり得る生理的機能の証拠を提供する例であるだけでなく、さらに、PEPの阻害剤が記憶プロセスに影響し、かつ認知症を阻止し得るという仮説をもたらした(Yoshimoto他 1987年 J.Pharmacobio−Dyn.10、730〜735頁)。 This experiment, this not only a possible example of providing evidence of a physiological function of the enzyme, further, inhibitors of PEP are affected in the storage process, and led to the hypothesis that may prevent dementia ( Yoshimoto other 1987 J.Pharmacobio-Dyn.10,730~735 pages).

ジペプチジルペプチダーゼ(DPP−IV)及び基質 Dipeptidyl peptidase (DPP-IV) and substrate
[0056]DPP−IVは、いくつかのペプチド及びホルモンの分解に関係があるとされている、遍在的に発現される分子である。 [0056] DPP-IV is several have been implicated in the degradation of peptides and hormones are molecules that are ubiquitously expressed. 様々なタイプのDPP−IVが精製され、かつそれらの酵素学的諸特性が明らかにされた。 Purified Various types of DPP-IV, and their enzymatic properties are revealed. 例えば、DPP−IVは、ラット肝臓(Hopsu−Havu V.K.他、1966年 Histochem.、7:197〜201頁)、ブタ腎臓(Barth A.他、1974年 Biol.Med.Chem.、32:157〜174頁)、小腸(Svensson B.1978年 Eur.J.Biochem.、90:489〜498頁)、肝臓(Fukasawa K.M.他 1981年 Biochim.Biophys.Acta、657:179〜189頁)、ヒト顎下腺(Oya H.他、1972年 Biochim.Biophys.Acta、258:591〜599頁)、ヒツジ腎臓(Yoshimoto T.他、1977年 Biochim.Biophys.Acta、485:391〜401頁;Yoshimo For example, DPP-IV is rat liver. (Hopsu-Havu V.K. other, 1966 Histochem, 7:. 197~201 pages), pig kidney (Barth A. et 1974 Biol.Med.Chem, 32 : pp. 157-174), small intestine (Svensson B. 1978 years Eur.J.Biochem, 90:. 489~498 pages), liver (Fukasawa K.M. other 1981 Biochim.Biophys.Acta, 657: 179~189 page), under human jaw gland (Oya H. et 1972 Biochim.Biophys.Acta, 258: 591~599 pages), sheep kidney (Yoshimoto T. et 1977 Biochim. Biophys. Acta, 485: 391 to 401 page; Yoshimo to T.他、1978年 J.Biol.Chem.、253:3708〜3716頁)、又は微生物(Fukusawa K.M.1981年 Biochem.Biophys.、210:230〜237頁;Yoshimoto T.1982年 J.Biochem.、91:1899〜1906頁(1982年))から単離された。 . To T. et al., 1978 J.Biol.Chem, 253: 3708~3716 pages), or microorganisms (Fukusawa K.M. 1981 years Biochem.Biophys, 210:. 230~237 pages; Yoshimoto T. 1982 years J .Biochem, 91:. 1899~1906 (1982)) isolated from.

[0057]ヒト免疫系において、DPP−IVは、活性化されたリンパ球(T細胞、B細胞及びナチュラルキラー細胞)によって発現されるT細胞表面抗原CD26と同一である。 [0057] In the human immune system, DPP-IV is identical to the T cell surface antigen CD26 which is expressed by activated lymphocytes (T cells, B cells and natural killer cells). CD26/DPP−IVは、固有のジペプチジルペプチダーゼIV活性及びアデノシンデアミナーゼI型(ADA−1)に結合する能力を有するII型膜糖タンパク質である。 CD26 / DPP-IV is type II membrane glycoprotein with an ability to bind to specific dipeptidyl peptidase IV activity and adenosine deaminase Type I (ADA-1). これは、上皮細胞上で構成的に発現されているが、Tリンパ球上では厳密な細胞調節下で発現され、細胞が活性化されると発現が上方調節される。 It has been constitutively expressed on epithelial cells, on T lymphocytes is expressed under strict cell regulation, expression and cell activation is upregulation. CA26/DPP−IVは、その細胞外ドメイン中にジペプチジルペプチダーゼIV活性を有することが示されており(Hegen他、1990年 J.Immunol 144:2908〜2914頁;Ulmer他、1990年 Scand.J.Immunol.31:429〜435頁)、また、その同時刺激活性は、この酵素活性にある程度依存しているようである(Tanaka他、1993年 Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:4586〜4590頁)。 CA26 / DPP-IV has been shown to have dipeptidyl peptidase IV activity in its extracellular domain (Hegen et 1990 J. Immunol 144: 2908 to 2,914 pp; Ulmer et 1990 Scand.J .Immunol.31: 429~435 pages), also, the co-stimulatory activity, seems to be somewhat dependent on the enzyme activity (Tanaka et al., 1993 Proc.Natl.Acad.Sci.USA90: 4586~4590 page). DPP−IVは、ケモカイン機能の調節に関与しており、かつHIV感染において重要な役割を果たし得る。 DPP-IV is involved in the regulation of chemokine function and may play an important role in HIV infection.

[0058]米国特許第6265551号では、ヒト血清から単離された循環性の可溶型DPP−IV/CD26を開示している。 [0058] In U.S. Patent No. 6,265,551 discloses a circulation of soluble DPP-IV / CD26 isolated from human serum. 血清型は、遍在する膜型に類似した酵素特性及び抗原性特性を共有している。 Serotypes share a similar enzymatic properties and antigenic properties membrane to ubiquitous. しかし、いくつかの生化学的局面では、異なる差異が存在する。 However, in some of the biochemical aspects, different differences exist. 特に、循環血清型は、膜型の分子量が105kDaであるのと対照的に、175kDaの分子量を有し、かつADA−1に結合しない。 In particular, the circulating serum form has a molecular weight of the membrane type as opposed to a 105 kDa, it has a molecular weight of 175 kDa, and does not bind to ADA-1. それでもなお、循環型は機能的なジペプチジルペプチダーゼIV活性を発現し、かつリコール抗原へのTリンパ球応答を同時刺激する能力を保持している。 Nevertheless, recycling retains the functional di Bae express dipeptidyl peptidase IV activity and the ability to co-stimulate T lymphocyte response to recall antigens.

[0059]DPP−IVのタンパク質分解活性は、タンパク質のC末端に位置する約200アミノ酸のひと続きの配列中に存在する。 [0059] The proteolytic activity of DPP-IV is present in the sequence of about 200 amino acids stretch located at the C-terminus of the protein. 触媒残基(Ser−629、Asp−708、His−740)は、キモトリプシンやサブチリシンなど古典的なセリンプロテアーゼとは異なる独特の順序で配列されている。 Catalytic residues (Ser-629, Asp-708, His-740) are arranged in a different unique sequence from the classical serine proteases such as chymotrypsin and subtilisin. プロリンに特異的なジペプチジルペプチダーゼ活性は、とりわけ、GLP−1、神経伝達物質サブスタンスP、ヒト成長ホルモン放出因子、エリスロポイエチン、インターロイキン2及びその他多くを含む、多数の生理活性タンパク質及びポリペプチドの生物活性を改変する。 Specific dipeptidyl peptidase activity in proline, inter alia, GLP-1, a neurotransmitter substance P, comprising human growth hormone releasing factor, erythropoietin, many interleukins 2 and other, a number of bioactive proteins and polypeptides to modify the biological activity. 潜在的なDPP−IV基質を表1、2、及び3に記載する。 Potential DPP-IV substrates are listed in Tables 1, 2, and 3. DPP−IV切断に影響を及ぼすためにこれらのポリペプチドを調節することは、それだけには限らないが、糖尿病、炎症、血管疾患、自己免疫疾患、多発性硬化症、関節疾患、並びに良性及び悪性の細胞形質転換に関連した疾患を含めて、臨床状態の治療において有用となり得る。 Adjusting these polypeptides to affect the DPP-IV cleavage include, but are not limited to, diabetes, inflammation, vascular disease, autoimmune diseases, multiple sclerosis, rheumatoid disease, and benign and malignant including diseases associated with cell transformation, it may be useful in the treatment of clinical conditions.

[0060]本発明は、DPP活性から基質を保護するために基質のN末端に1つ又は複数の付加的なアミノ酸を含む、DPPの改変された基質を利用してよい。 [0060] The present invention includes one or more additional amino acids at the N-terminus of the substrate to protect the substrate from DPP activity, it may be utilized altered substrate of DPP. 本発明に従う改変のために好ましい基質を表3に開示する。 The preferred substrates for modification according to the present invention are disclosed in Table 3.

[0061] [0061]

[0062]改変用の基質は、アミノ末端にX−ProY、X−Ala−Y、X−Ser−Y又はX−Gly−Yを含む。 [0062] substrate for modifications include X-ProY the amino terminus, X-Ala-Y, the X-Ser-Y or X-Gly-Y. 好ましくは、改変用の基質はGLP−1である。 Preferably, the substrate for modification is GLP-1.

DPP活性から保護された改変ポリペプチド Protected modified polypeptide from DPP activity
[0063]本発明は、ポリペプチド基質をDPP活性から保護するためにN末端に1つ又は複数の付加的なアミノ酸を含む、DPPの改変ポリペプチド基質などの改変ポリペプチドを提供する。 [0063] The present invention, the polypeptide substrate containing one or more additional amino acids at the N-terminus to protect against DPP activity, provides a modified polypeptide such as modified polypeptide substrates of DPP. 一実施形態では、これらの改変ポリペプチドは、野生型ポリペプチドと比べて、N末端に1つの付加的なアミノ酸を有する。 In one embodiment, these modified polypeptides as compared to the wild-type polypeptide, having one additional amino acid at the N-terminus. 別の実施形態では、これらの改変ポリペプチドは、N末端に5つの付加的なアミノ酸を有する。 In another embodiment, the modified polypeptides have five additional amino acids at the N-terminus. あるいは、これらの改変ポリペプチドは、N末端に1〜5つの付加的なアミノ酸を有する。 Alternatively, these modified polypeptides have one to five additional amino acids at the N-terminus. 20種のアミノ酸のうちのいずれか1つがポリペプチド基質のN末端に付加されてよく、又は非天然アミノ酸が付加されてもよい。 Any one of 20 amino acids, but may be added to the N-terminus of the polypeptide substrate or non-natural amino acids may be added.

[0064]投与後に循環中又はin vivoの任意の場所で切断されるであろうペプチド結合を有する任意の薬学的ポリペプチドは、本発明によって与えられるDPP切断からの保護が理由となって、本発明にかかる改変による利益を受けるであろうことが予想される。 [0064] Any pharmaceutical polypeptide having any would be cut at locations peptide bonds circulating or in vivo after administration, protection from DPP cleavage that is afforded by the present invention becomes a reason, the that would benefit from such to the present invention modifications are expected.

[0065]本発明のこの態様によれば、ジペプチジルペプチダーゼ活性の少なくとも約30%、好ましくは少なくとも約50%、より好ましくは少なくとも約70%、さらにより好ましくは少なくとも約90%、最も好ましくは少なくとも約99%を消失させることが可能である。 According to this aspect of the [0065] present invention, at least about 30% of the dipeptidyl peptidase activity, preferably at least about 50%, more preferably at least about 70%, even more preferably at least about 90%, and most preferably at least it is possible to eliminate about 99%. 本発明の方法を用いて、ジペプチジルアミノペプチダーゼ活性を完全に消失させることもまた可能である。 Using the method of the present invention, it is also possible to completely eliminate the dipeptidyl aminopeptidase activity.

[0066]同様に、基質のジペプチジルペプチダーゼ感受性を、ジペプチジルペプチダーゼ感受性の少なくとも約30%、好ましくは少なくとも約50%、より好ましくは少なくとも約70%、さらにより好ましくは少なくとも約90%、最も好ましくは少なくとも約99%低減させることも可能である。 [0066] Similarly, the substrate for dipeptidyl peptidase-sensitive, at least about 30% of the dipeptidyl peptidase-sensitive, preferably at least about 50%, more preferably at least about 70%, even more preferably at least about 90%, most preferably it is also possible to reduce at least about 99%. 本発明の方法を用いて、ジペプチジルアミノペプチダーゼ感受性を完全に消失させることもまた可能である。 Using the method of the present invention, it is also possible to completely eliminate the dipeptidyl aminopeptidase sensitivity.

[0067]本発明の改変されたポリペプチド又はペプチド基質は、部分的又は実質的にDPP活性から保護されているが、改変ポリペプチド基質は、それらの機能的活性及び効力の少なくとも約10%、好ましくは少なくとも約30%、より好ましくは少なくとも約50%、より好ましくは少なくとも約70%、さらにより好ましくは少なくとも約90%、最も好ましくは少なくとも約99%保持していた。 [0067] modified polypeptide or peptide substrates of the present invention, but are protected from partial or substantially DPP activity, the modified polypeptide substrate, at least about 10% of their functional activity and potency, preferably at least about 30%, more preferably at least about 50%, more preferably at least about 70%, even more preferably at least about 90%, and most preferably retained at least about 99%. いくつかの場合では、機能的活性又は効力を低下させた改変されたポリペプチド又はペプチド基質が有用となる。 The functional activity or altered polypeptide or peptide substrates efficacy with reduced is useful in some cases. 例えば、改変されたポリペプチド又はペプチドがトランスフェリンなど別のポリペプチドに融合されて、血清安定性及びin vivo循環半減期の向上した融合タンパク質を形成する場合、機能的活性又は効力を低下させた改変ポリペプチド又はペプチド基質が有用となり得る。 For example, modified modified polypeptide or peptide is fused to another polypeptide, such as transferrin, which when forming the enhanced fusion protein of serum stability and in vivo circulatory half-life, reduces the functional activity or potency polypeptide or peptide substrates may be useful.

[0068]他の場合では、改変されたポリペプチド又はペプチドは、改変されていないポリペプチド又はペプチドと比べて高い効力を有し得る。 [0068] In other cases, the modified polypeptide or peptide may have a higher potency compared to the polypeptide or peptide is not modified.

[0069]本発明の改変ポリペプチド分子は、同じポリペプチドの非改変型と比べて、ジペプチジルペプチダーゼ切断から実質的に保護されている。 [0069] Modified polypeptide molecules of the present invention, compared to non-modified forms of the same polypeptide, are substantially protected from dipeptidyl peptidase cleavage. この実質的な保護の能力は、非改変ポリペプチドに対して改変ポリペプチドを比較するのに使用されるアッセイによって変動し得る。 The substantial protection capabilities may vary by the assay used to compare the modified polypeptide against unmodified polypeptide. しかし、実質的な保護を提示するために、改変ポリペプチドは、アッセイにおいてジペプチジルペプチダーゼ切断に対する検出可能レベルの抵抗性を提示する。 However, in order to present a substantial protection, modified polypeptides, it presents a resistance detectable level for dipeptidyl peptidase cleavage in the assay. このようなアッセイとしては、それだけには限らないが、Doyle他(2002年 Endocrinology 142、4462〜4468頁)、O'Harte他(1999年 Diabetes 48、758〜765頁)、及びSiegel他(1999年 Regulatory Peptides 79、93〜102頁)に開示されているものなどが挙げられる。 Such assays include but are not limited to, Doyle et al. (P. 2002 Endocrinology 142,4462~4468), O'Harte other (1999 Diabetes 48,758~765 pages), and Siegel et al. (1999 Regulatory such as those disclosed in Peptides 79,93~102 pages) and the like.

[0070]DPPに対して安定化された本発明のポリペプチド基質はまた、in vivoでDPPの存在下において、安定化されていないポリペプチド基質よりも安定である。 [0070] polypeptide substrate of the present invention stabilized against DPP also in the presence of DPP in in vivo, is more stable than the polypeptide substrate unregulated. DPPに対して安定化された治療用ポリペプチド基質は、一般に、同一の配列からなる安定化されていないペプチドと比べて、長い活性半減期を有する。 Therapeutic polypeptide substrate which is stabilized against DPP is generally compared to a peptide that is not stabilized comprise the same sequence, it has a long half life of activity. ペプチダーゼ安定性は、血清又は血液中の非改変ポリペプチド基質の半減期を、血清又は血液中の改変された対応する治療用ペプチドの半減期と比較することによって測定することができる。 Peptidase stability can be measured by comparing the half-life of the unmodified polypeptide substrate in serum or blood, and the half-life of the altered corresponding therapeutic peptide in serum or blood. 改変ペプチド及び非改変ペプチドの投与後に血清又は血液を試料採取し、かつペプチドの活性を測定することによって、半減期を測定することができる。 The serum or blood samples taken after administration of the modified peptide and non-modified peptide, and by measuring the activity of the peptide, can be measured half-life. 活性の測定の他に、HPLC又は質量分析法によってポリペプチド基質の長さも測定することができる。 In addition to the active measurement can be measured length of polypeptide substrate by HPLC or mass spectrometry.

[0071]本発明はまた、DPP切断から保護するために本発明に従って変更したアミノ末端を有し、かつポリペプチドの機能的活性にも効力にも影響を及ぼさない内部及び/又はC末端のアミノ酸の変更を有する、改変されたポリペプチド又はペプチドも提供する。 [0071] The present invention also has an amino-terminal has been changed in accordance with the present invention to protect against DPP cleavage, and internal and / or C-terminal amino acid that does not affect the potency in functional activity of the polypeptide having a change also provides modified polypeptides or peptides. これらの改変ポリペプチドは、通常は保存的アミノ酸置換である軽微なアミノ酸変化を有すると思われるが、非保存的置換もまた企図される。 These modified polypeptides are normally but appears to have a minor amino acid changes are conservative amino acid substitutions, non-conservative substitutions are also contemplated.

[0072]本発明の改変されたポリペプチド又はペプチドはまた、変更された機能的活性を有してもよい。 [0072] modified polypeptides or peptides of the present invention may also have altered functional activity. 例えば、機能的活性を増大させた改変されたポリペプチド又はペプチドが有用となり得る。 For example, altered polypeptides or peptides increased the functional activity may be useful. あるいは、機能的活性を低減させた改変されたポリペプチド又はペプチドも使用され得る。 Alternatively, the modified polypeptide or peptide reduced the functional activity may also be used. したがって、本発明の改変されたポリペプチド又はペプチドはまた、機能的活性又は効力に影響を及ぼすアミノ酸変化も含む。 Thus, the altered polypeptides or peptides of the present invention also include impact amino acid changes in the functional activity or potency. 例えば、機能的活性を変更されたGLP−1類似体は、DPP切断から保護するためにそのアミノ末端を改変され得る。 For example, GLP-1 analogs that have changed the functional activity may be modified to its amino terminus to protect against DPP cleavage.

[0073]保存的アミノ酸置換の例は、塩基性アミノ酸(アルギニン、リシン、ヒスチジンなど)、酸性アミノ酸(グルタミン酸及びアスパラギン酸など)、極性アミノ酸(グルタミン及びアスパラギンなど)、疎水性アミノ酸(ロイシン、イソロイシン、バリンなど)、芳香族アミノ酸(フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンなど)、並びに小型アミノ酸(グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、メチオニンなど)のグループ内のものなど同じグループ内で行われる置換である。 [0073] Conservative amino acid substitutions example, basic amino acids (arginine, lysine, histidine, etc.), (such as glutamic acid and aspartic acid) acidic amino acids, polar amino acids (such as glutamine and asparagine), hydrophobic amino acids (leucine, isoleucine, valine, etc.), aromatic amino acids (phenylalanine, tryptophan, tyrosine, etc.), and small amino acid (glycine, alanine, serine, threonine, substitutions made within the same group such as within the group methionine, etc.).

[0074]非保存的置換は、1つのグループのアミノ酸を別のグループのアミノ酸で置換することを包含する。 [0074] Non-conservative substitutions will entail replacement of an amino acid of one group with an amino acid in another group. 例えば、非保存的置換は、疎水性アミノ酸を極性アミノ酸で置換することを含むと思われる。 For example, non-conservative substitutions are expected to contain the substitution of hydrophobic amino acids in polar amino acids. ヌクレオチド置換の概要については、例えばFord他(1991年)、Prot. For an overview of nucleotide substitution, for example, Ford et al. (1991), Prot. Exp. Exp. Pur. Pur. 2:95〜107頁を参照されたい。 2: pp. 95-107.

[0075]本発明は、ポリペプチド又はペプチドの天然に存在する成熟型、ポリペプチドの対立形質/配列変異体、組換えによって誘導された天然に存在しないペプチドの変異体、並びにポリペプチド又はペプチドのオルソログ及びパラログなど、改変されたポリペプチド及びペプチドのアミノ酸配列の明らかな変異体を提供する。 [0075] The present invention, mature naturally-occurring polypeptide or peptide, allelic / sequence variants of the polypeptide variant of peptides that are not naturally occurring induced by recombinant, as well as polypeptides or peptides such orthologs and paralogs, provides a clear variants of the amino acid sequences of the modified polypeptides and peptides. このような変異体は、組換え核酸技術及びタンパク質生化学の分野の当技術分野で公知の技術を用いて容易に作製することができる。 Such variants can be readily produced using techniques known in the art in the field of recombinant nucleic acid technology and protein biochemistry. このような変異体は、分子技術及び配列情報を用いて容易に同定/作製することができる。 Such variants can readily be identified / made using molecular techniques and the sequence information. さらに、このような変異体は、本発明の改変されたポリペプチド又はペプチドに対する配列及び/又は構造の相同性に基づいて、他のペプチドから容易に区別することができる。 Further, such variants can be based on sequence identity and / or structure for the altered polypeptides or peptides of the present invention are readily distinguished from other peptides.

[0076]好ましくは、本発明の改変ペプチドは、GLP−1、及びN末端に1つ又は複数の付加的なアミノ酸を含むその類似体である。 [0076] Preferably, the modified peptides of the invention, an analogue containing one or more additional amino acids GLP-1, and the N-terminus.

[0077]いくつかの場合では、DPP−IVなどのDPPは、切断によってペプチドを不活性化する代わりに、ペプチドを活性化することがある。 [0077] In some cases, DPP such as DPP-IV, instead of inactivating the peptide by cleavage, it is possible to activate the peptide. このような場合、ペプチドの改変は、ペプチド活性化を実質的に低減、遅延、又は防止し得るはずである。 In this case, the modified peptide is substantially reduced peptide activation, it should be delayed, or prevented.

改変ポリペプチドをコードする核酸 Nucleic acid encoding a modified polypeptide
[0078]本発明は、DPP切断から部分的又は実質的に保護されており、かつ機能的活性及び効力を有する改変されたポリペプチド及びペプチドをコードする核酸分子を提供する。 [0078] The present invention provides a nucleic acid molecule encoding a modified polypeptides and peptides having a partial or substantially are protected, and functional activity and potency from DPP cleavage. 一実施形態では、本発明によって提供される核酸分子は、野生型の非改変ポリペプチドと比べて、少なくとも1つの付加的なアミノ酸をそのN末端に有する改変されたポリペプチド及びペプチドをコードする。 In one embodiment, the nucleic acid molecules provided by the present invention, as compared to the unmodified polypeptide of the wild-type, encoding a modified polypeptide and peptides having at least one additional amino acid at its N-terminus. 別の実施形態では、これらの核酸分子は、N末端に5つの付加的なアミノ酸を有する改変されたポリペプチド及びペプチドをコードする。 In another embodiment, the nucleic acid molecule encodes a modified polypeptides and peptides having five additional amino acids at the N-terminus. あるいは、これらの核酸分子は、N末端に1〜5つの付加的なアミノ酸を有する改変されたポリペプチド及びペプチドをコードする。 Alternatively, these nucleic acid molecules encode modified polypeptides and peptides having one to five additional amino acids at the N-terminus. 好ましくは、改変GLP−1をコードする核酸分子は、そのN末端の1つ又は複数の付加的なアミノ酸をコードする配列を含む。 Preferably, the nucleic acid molecule encoding a modified GLP-1 includes a sequence encoding one or more additional amino acids of the N-terminus.

[0079]本発明の核酸分子は、デオキシリボ核酸(DNA)、1本鎖及び2本鎖のデオキシリボ核酸の双方を含む。 [0079] The nucleic acid molecules of the present invention include deoxyribonucleic acid (DNA), including both deoxyribonucleic acid single-stranded and double-stranded. しかし、それらはまた、リボ核酸(RNA)、並びにRNA:DNAハイブリッド2本鎖分子でもよい。 However, they can also, ribonucleic acid (RNA), and RNA: or a DNA hybrid double-stranded molecule. 企図される核酸分子には、ゲノムDNA、cDNA、mRNA、及びアンチセンス分子も含まれる。 The nucleic acid molecules contemplated, genomic DNA, include cDNA, mRNA, and also anti-sense molecule. 本発明の核酸分子には、改変ポリペプチドをコードする天然若しくは合成のRNA、DNA若しくはcDNA、又はその相補鎖も含まれる。 Nucleic acid molecules of the invention include natural or synthetic RNA encoding a modified polypeptide, DNA or cDNA, or its complementary strand are also included.

[0080]野生型の非改変ポリペプチドと比べて、DPP活性から部分的又は実質的に保護されているが、機能的活性及び/又は効力を有している改変ポリペプチドを構築するために、野生型の非改変ポリペプチドをコードする核酸を開始点として使用し、かつ所望の改変ポリペプチドをコードするように改変することができる。 [0080] compared to the unmodified polypeptide of the wild-type, since this has been partially or substantially protected from DPP activity, to construct a modified polypeptide having a functional activity and / or efficacy, it can be modified to use a nucleic acid encoding the unmodified polypeptide of the wild-type as a starting point, and encodes the desired modified polypeptide. 配列を付加し、又はあるポリペプチドをコードする核酸配列を変異させ、かつこれらの改変された配列によってコードされるポリペプチドの機能を確認するための多数の方法が公知である。 Adding sequence, or a polypeptide mutated nucleic acid sequence encoding, and a number of methods known to check the function of the polypeptides encoded by these modified sequences.

[0081]本発明はまた、DPP切断から保護するために改変されたアミノ末端を有し、かつポリペプチドの機能的活性にも効力にも実質的に影響を及ぼさない内部及びC末端のアミノ酸の変更を有するポリペプチド及びペプチドをコードする核酸も提供する。 [0081] The present invention also has an amino-terminal that has been modified to protect against DPP cleavage, and also to potency in functional activity of the polypeptide does not substantially affect the internal and C-terminal amino acid nucleic acids encoding polypeptides and peptides having a modified also provided. これらの改変ポリペプチドは、通常は保存的アミノ酸置換である軽微なアミノ酸変化を有すると思われるが、非保存的置換もまた企図される。 These modified polypeptides are normally but appears to have a minor amino acid changes are conservative amino acid substitutions, non-conservative substitutions are also contemplated. 部位特異的変異誘発を達成するための技術を用いたヌクレオチド置換は、当技術分野において周知である。 Nucleotide substitutions using techniques for accomplishing site-specific mutagenesis is well known in the art. 好ましくは、これらの核酸は、N末端に1つ又は複数の付加的なアミノ酸を有するGLP−1類似体をコードする。 Preferably, these nucleic acids encode GLP-1 analogs with one or more additional amino acids at the N-terminus.

[0082]当技術分野において公知のように、2種のポリヌクレオチド又はポリペプチドの間の「類似性」は、一方のポリヌクレオチド又はポリペプチドのヌクレオチド又はアミノ酸配列及び保存されているヌクレオチド又はアミノ酸置換体を、第2のポリヌクレオチド又はポリペプチドの配列と比較とすることによって測定される。 [0082] As is known in the art, "similarity" between two polynucleotides or polypeptides, one of the polynucleotide or polypeptide of the nucleotide or amino acid sequences and nucleotide are conserved or amino acid substitutions the body is measured by a comparison to the sequence of a second polynucleotide or polypeptide. 同様に、2種のポリペプチド又は2種のポリヌクレオチド配列の間の配列関連性の程度を意味する「同一性」も当技術分野において公知であり、これらの配列の2つの鎖を突き合わせた際の同一性によって測定される。 Similarly, means the degree of sequence relatedness between two polypeptide or two polynucleotide sequences "identity" also are known in the art, when the butt of the two strands of these sequences of it is measured by identity. 同一性及び類似性の双方とも、容易に算出することができる(Computational Molecular Biology、Lesk,A.M.編、Oxford University Press、ニューヨーク、1988年;Biocomputing:Informatics and Genome Projects、Smith,D.W.編、Academic Press、ニューヨーク、1993年;Computer Analysis of Sequence Data,Part I、Griffin,A.M.及びGriffin,H.G.編、Humana Press、ニュージャージー、1994年;Sequence Analysis in Molecular Biology、von Heinje,G.、Ac Identity and both similarity can be readily calculated (Computational Molecular Biology, Lesk, A.M ed, Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing:. Informatics and Genome Projects, Smith, D.W eds., Academic Press, New York, 1993;.. Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M and Griffin, H.G ed., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Ac ademic Press、1987年;並びにSequence Analysis Primer、Gribskov,M.及びDevereux,J.編、M Stockton Press、ニューヨーク、1991年)。 ademic Press, 1987 years;.. and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M and Devereux, J, eds., M Stockton Press, New York, 1991).

[0083]2種のポリヌクレオチド又はポリペプチドの配列間の同一性及び類似性を測定するためのいくつかの方法が存在するが、「同一性」及び「類似性」という用語は当業者には周知である(Sequence Analysis in Molecular Biology、von Heinje,G.、Academic Press、1987年;Sequence Analysis Primer、Gribskov,M.及びDevereux,J.編、M Stockton Press、ニューヨーク、1991年;並びにCarillo,H.及びLipman,D.,SIAM J.Applied Math.、48:1073頁(1988年))。 [0083] While several methods to determine identity and similarity between sequences of two polynucleotides or polypeptide is present, the term "identity" and "similarity" to those skilled in the art are well known (Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987 years;.. Sequence Analysis Primer, Gribskov, M and Devereux, J, eds., M Stockton Press, New York, 1991; and Carillo, H . and Lipman, D., SIAM J.Applied Math, 48:. 1073 (1988)). 2種の配列間の同一性又は類似性を測定するために一般に使用される方法としては、それだけに限らないが、Guide to Huge Computers、Martin J. The method commonly used to determine identity or similarity between two sequences include, but are not limited to, Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop編、Academic Press、サンディエゴ、1994年、並びにCarillo,H. Bishop eds., Academic Press, San Diego, 1994, and Carillo, H. 及びLipman,D. And Lipman, D. 、SIAM J. , SIAM J. Applied Math. Applied Math. 、48:1073頁(1988年)において開示されているものが挙げられる。 , 48: include those disclosed in 1073 (1988).

[0084]同一性を測定するための好ましい方法は、試験される2種の配列間に最大の一致を与えるように設計される。 A preferred method for measuring [0084] identity are designed to give the largest match between the two sequences tested. 同一性及び類似性を測定するための方法は、コンピュータプログラムにおいて体系化されている。 Methods to determine identity and similarity are codified in computer programs. 2種の配列間の同一性及び類似性を測定するための好ましいコンピュータプログラム方法としては、それだけには限らないが、GCGプログラムパッケージ(Devereux他、Nucleic Acids Research 12(1):387頁(1984年))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul他、J.Molec.Biol.215;403頁(1990年))が挙げられる。 Preferred computer program methods to determine identity and similarity between two sequences include, but are not limited to, GCG program package (Devereux other, Nucleic Acids Research 12 (1): 387 (1984) ), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul other, J.Molec.Biol.215; 403 (1990)) and the like. 前述した類似性又は同一性の程度は、第1の配列の第2の配列からの派生を示す、2種の配列間の同一性の程度として測定される。 The degree of similarity or identity described above shows the derivation of the second sequence of the first sequence, is determined as the degree of identity between two sequences. 2種の核酸配列間の同一性の程度は、GCGプログラムパッケージ中で提供されるGAP(Needleman及びWunsch(1970年)Journal of Molecular Biology 48:443〜453頁)など当技術分野において公知のコンピュータプログラムを用いて測定することができる。 The degree of identity between two nucleic acid sequences, GAP (Needleman and Wunsch (1970 years) Journal of Molecular Biology 48: 443~453 page) provided in the GCG program package, such as computer programs known in the art it can be measured using the. 本発明のための2種の核酸配列間の同一性の程度を測定するために、以下の設定値でGAPを使用する:GAP生成ペナルティ5.0及びGAP伸長ペナルティ0.3。 To determine the degree of identity between two nucleic acid sequences for the present invention, using the GAP with the following settings: GAP creation penalty 5.0 and GAP extension penalty 0.3.

コドン最適化 Codon-optimized
[0085]遺伝コードの縮重により、第1のDNA配列によってコードされるポリペプチドと同一のアミノ酸配列を含む改変ポリペプチドをなお産生する、ポリペプチドのヌクレオチド配列の変形が可能となる。 [0085] The degeneracy of the genetic code, a modified polypeptide comprising an amino acid sequence identical to the polypeptide encoded by the first DNA sequence still production, modification of the nucleotide sequence of the polypeptide becomes possible. (その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5547871号において記載されている)「コドン最適化」として公知の手順により、そのような変更されたDNA配列を設計する手段が提供される。 By procedures known as (described in U.S. Pat. No. 5,547,871, incorporated herein by reference in its entirety) "codon optimization", means of designing such an altered DNA sequence is provided . コドン最適化遺伝子の設計は、ある生物中でのコドン使用の頻度、最近接頻度、RNA安定性、2次構造形成の可能性、合成経路、及びその遺伝子の予定されるその後のDNA操作を含めて、様々な因子を考慮に入れるべきである。 Design of codon-optimized gene, the frequency of codon usage in an organism, nearest neighbor frequencies, RNA stability, including the possibility of secondary structure formation, the synthetic pathway, and subsequent DNA manipulations that are scheduled for that gene Te, it should take into account a variety of factors. 特に、利用可能な方法を用いて、酵母発現系が使用される場合には酵母によって最も容易に認識されるものを用いて所与の融合タンパク質をコードするコドンを変更することができる。 In particular, using available methods, when yeast expression systems are used may change the codons encoding a given fusion protein with those most readily recognized by yeast.

[0086]遺伝コードの縮重により、同じアミノ酸配列が、多くの異なる方法でコードされ、かつ翻訳されることが可能となる。 [0086] The degeneracy of the genetic code, the same amino acid sequence is encoded in many different ways, and it is possible to be translated. 例えば、ロイシン、セリン、及びアルギニンは、それぞれ6種の異なるコドンによってコードされ、バリン、プロリン、トレオニン、アラニン、及びグリシンはそれぞれ4種の異なるコドンによってコードされている。 For example, leucine, serine, and arginine are each encoded by six different codons, valine, proline, threonine, alanine, and glycine are encoded by four different codons respectively. しかし、このような同義コドンの使用頻度は、真核生物及び原核生物の間で、ゲノムによって変動する。 However, the frequency of use of such synonymous codons, between eukaryotes and prokaryotes, varies by the genome. 例えば、哺乳動物間の同義コドンの選択パターンは非常に類似しているが、酵母(サッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae))、細菌(大腸菌など)、及び昆虫(キイロショウジョウバエ(D.melanogaster)など)など進化的に離れた生物は、明らかに異なるパターンのゲノムコドン使用頻度を示す(Grantham,R.他、Nucl.Acids Res.、8、49〜62頁(1980年);Grantham,R.他、Nucl.Acids Res.、9、43〜74頁(1981年);Maroyama,T.他、Nucl.Acids Res.、14、151〜197頁(1986年);Aota,S.他、Nucl.Acids Res.、16、315〜402頁(1988年);Wada For example, although selected pattern of synonymous codons between mammals are very similar, the yeast (Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae)), (such as E. coli) bacteria, and insects (Drosophila melanogaster (D. melanogaster), etc.) evolutionarily distant organisms such as shows Genomukodon usage clearly distinct patterns (Grantham, R other, Nucl. Acids Res, pp 8,49~62 (1980);... Grantham, R other, Nucl . .Acids Res, pp. 9,43~74 (1981);.. Maroyama, T other, Nucl.Acids Res, pp. 14,151~197 (1986);. Aota, S other, Nucl.Acids Res. , pp. 16,315~402 (1988); Wada ,K.他、Nucl.Acids Res.、19 補遺、1981〜1985頁(1991年);Kurland,C.G.、FEBS Letters、285、165〜169頁(1991年))。 , K others, Nucl. Acids Res, 19 Suppl, pp. 1981-1985 (1991);.. Kurland, C.G., FEBS Letters, pp 285,165~169 (1991)). コドン選択パターンのこれらの差異は、ペプチド伸長速度を調節することによって、個々の遺伝子の全般的な発現レベルに寄与しているようである(Kurland,C.G.、FEBS Letters、285、165〜169頁(1991年);Pedersen,S.、EMBO J.、3、2895〜2898頁(1984年);Sorensen,M.A.、J.Mol.Biol.、207、365〜377頁(1989年);Randall、L.L.他、Eur.J.Biochem.、107、375〜379頁(1980年);Curran,J.F.、及びYarus,M.、J.Mol.Biol.、209、65〜77頁(1989年);Varenne,S.他、J.Mol.Biol.、180、549〜5 These differences in codon-choice patterns by modulating peptide elongation rates seem to contribute to the overall expression levels of individual genes (Kurland, C.G., FEBS Letters, 285,165~ 169 (1991); Pedersen, S., EMBO J., pp 3,2895~2898 (1984);. Sorensen, M.A., J.Mol.Biol, pp 207,365~377 (1989 );.. Randall, L.L other, Eur. J. Biochem, pp 107,375~379 (1980);.. Curran, J.F, and Yarus, M., J.Mol.Biol, 209, pp. 65-77 (1989);.. Varenne, S other, J.Mol.Biol, 180,549~5 6頁(1984年)、Varenne,S.他、J.Mol.Biol.、180、549〜576頁(1984年);Garesl,J.P.、J.Theor.Biol.、43、211〜225頁(1974年);Ikemura,T.、J.Mol.Biol.、146、1〜21頁(1981年);Ikemura,T.、J.Mol.Biol.、151、389〜409頁(1981年))。 6 (1984), Varenne, S other, J.Mol.Biol, pp. 180,549~576 (1984);... Garesl, J.P., J.Theor.Biol, 43,211~225 page (1974); Ikemura, T., J.Mol.Biol, pp. 146,1~21 (1981);.. Ikemura, T., J.Mol.Biol, pp. 151,389~409 (1981 )).

[0087]合成遺伝子のための好ましいコドン使用頻度は、組換えタンパク質発現のために使用されることが意図される細胞/生物の正確な(又はできるだけ密接に関連した)ゲノム、特に酵母種のものから導かれる核遺伝子のコドン使用を反映すべきである。 [0087] The preferred codon usage for synthetic genes, the exact cell / organism to be used is intended for recombinant protein expression (or as closely as possible relevant) genomic, especially yeast species codon usage of nuclear genes derived from should reflect. 上述したように、好ましい一実施形態では、改変ポリペプチドは、酵母発現のために本明細書において説明するような改変の前又は後にコドン最適化される。 As described above, in one preferred embodiment, the modified polypeptide is codon optimized, before or after modification as described herein for yeast expression.

ベクター vector
[0088]本発明において使用するための発現ユニットは、一般に、5'側から3'側の向きに作動可能に連結された、以下の要素、すなわち、転写プロモーター、分泌シグナル配列、改変ポリペプチドをコードするDNA配列、及び転写ターミネーターを含む。 [0088] Expression units for use in the present invention, generally, 5 operably linked to a side direction 'to 3' side, the following elements, namely, a transcriptional promoter, a secretory signal sequence, a modified polypeptide DNA encoding sequence, and transcription terminator. 上述したように、改変されたポリペプチド及びペプチドの任意の配置を本発明のベクターにおいて使用してよい。 As mentioned above, any arrangement of the modified polypeptides and peptides may be used in the vectors of the present invention. 適切なプロモーター、シグナル配列、及びターミネーターの選択は、選択された宿主細胞によって決定されることになり、かつ当業者には明らかと考えられ、以下により具体的に考察する。 Suitable promoters, signal sequences, and selection of the terminator, will be determined by the selected host cell, and is believed apparent to those skilled in the art, specifically discussed below.

[0089]本発明で使用するのに適する酵母ベクターは、米国特許第6291212号において記載されており、YRp7(Struhl他、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:1035〜1039頁、1978年)、YEp13(Broach他、Gene8;121〜133頁、1979年)、pJDB249及びpJDB219(Beggs、Nature 275:104〜108頁、1978年)、pPPC0005、pSeCHSA、pScNHSA、pC4、並びにそれらの誘導体が含まれる。 [0089] Yeast vectors suitable for use in the present invention are described in U.S. Pat. No. 6,291,212, YRp7 (Struhl other, Proc 76: from 1035 to 1,039 pages, 1978) , YEp13 (Broach other, Gene8; 121~133 pp, 1979), PJDB249 and pJDB219 (Beggs, Nature 275: 104~108 pages, 1978), include pPPC0005, pSeCHSA, pScNHSA, pC4, as well as their derivatives . 有用な酵母プラスミドベクターとしては、Stratagene Cloning Systems社(ラ・ホーヤ、CA92037、米国)から入手可能なpRS403−406、pRS413−416及びピキア(Pichia)ベクターも挙げられる。 Useful yeast plasmid vectors, Stratagene Cloning Systems, Inc. (La Jolla, 92037, USA) available from pRS403-406, also include pRS413-416 and Pichia (Pichia) vector. プラスミドpRS403、pRS404、pRS405及びpRS406は、酵母組込み型プラスミド(YIps)であり、酵母選択マーカーHIS3、TRP1、LEU2、及びURA3を組み入れている。 Plasmids pRS403, pRS404, pRS405 and pRS406 are Yeast Integrating plasmids (YIps), incorporates a yeast selectable marker HIS3, TRP1, LEU2, and URA3. プラスミドpRS413−416は、酵母セントロメアプラスミド(YCps)である。 Plasmid pRS413-416 are Yeast Centromere plasmids (Ycps).

[0090]このようなベクターは一般に選択マーカーを含み、選択マーカーは、表現型アッセイが存在し、形質転換体の選択を可能にする、優性の表現型を示す多数の遺伝子のうちの1つでよい。 [0090] comprising such vectors are generally selectable marker, the selectable marker, and a phenotypic assay exists to allow for the selection of transformants, one of a number of genes that exhibit a dominant phenotype good. 好ましい選択マーカーは、宿主細胞の栄養要求性を補完し、抗生物質抵抗性を与え、又は細胞が特定の炭素供給源の利用を可能にさせるものであり、LEU2(Broach他、同書)、URA3(Botstein他、Gene8;17、1979年)、HIS3(Struhl他、同書)、又はPOT1(Kawasaki及びBell、EP171142)が挙げられる。 Preferred selectable markers, complement host cell auxotrophy, provide antibiotic resistance, or cells are those which enable the use of a specific carbon source, LEU2 (Broach et al., Ibid), URA3 ( Botstein other, Gene8; 17, 1979 years), HIS3 (Struhl et al., ibid), or POT1 (Kawasaki and Bell, EP171142) and the like. 他の適切な選択マーカーとしては、酵母細胞にクロラムフェニコール抵抗性を与えるCAT遺伝子が挙げられる。 Other suitable selectable markers include the CAT gene, which confers chloramphenicol resistance on yeast cells. 酵母において使用するのに好ましいプロモーターとしては、酵母解糖系遺伝子(Hitzeman他、J Biol.Chem.225:12073〜12080頁、1980年;Alber及びKawasaki、J.Mol.Appl.Genet.1;419〜434頁、1982年;Kawasaki、米国特許第4599311号)又はアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子(Young他、Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals、Hollaender他(編)、355頁、Plenum、N.Y.、1982年;Ammerer、Meth.Enzymol.101:192〜201頁、1983年)に由来するプロモーターが挙げられる。 Preferred promoters for use in yeast, the yeast glycolytic genes (Hitzeman other, J Biol.Chem.225: 12073~12080 pages, 1980; Alber and Kawasaki, J.Mol.Appl.Genet.1; 419 ~434 1982; Kawasaki, U.S. Pat. No. 4,599,311) or alcohol dehydrogenase genes (Young other, genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals, Hollaender et al. (eds.), page 355, Plenum, N. Y., 1982; Ammerer , Meth.Enzymol.101: 192~201 pages, include promoters derived from in 1983). この点に関して、特に好ましいプロモーターは、TPI1プロモーター(Kawasaki、米国特許第4599311号)及びADH2−4 (米国特許第6291212号を参照されたい)プロモーター(Russell他、Nature304:652〜654頁、1983年)である。 In this regard, particularly preferred promoters are, TPI1 promoter (Kawasaki, U.S. Pat. No. 4,599,311) (see U.S. Pat. No. 6,291,212) and ADH2-4 C promoter (Russell other, Nature304: 652~654 1983 ) it is. 発現ユニットは、転写ターミネーターも含んでよい。 Expression units may also include a transcriptional terminator. 好ましい転写ターミネーターはTPI1ターミネーター(Alber及びKawasaki、同書)である。 A preferred transcriptional terminator is the TPI1 terminator (Alber and Kawasaki, ibid.). より好ましくは、プロモーターは、EP431880において開示されているPRB1プロモーターであり、かつターミネーターは、EP60057において開示されているADH1ターミネーターであり、これらの文献はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。 More preferably, the promoter is the PRB1 promoter is disclosed in EP431880, and terminator are ADH1 terminator disclosed in EP60057, these references entirely incorporated herein by reference.

[0091]酵母の他に、本発明の改変されたポリペプチド及びペプチドは、糸状菌、例えばアスペルギルス(Aspergillus)属の種においても発現され得る。 [0091] In addition to yeast, modified polypeptides and peptides of the present invention can be expressed in seeds of filamentous fungi, e.g. Aspergillus (Aspergillus) genus. 有用なプロモーターの例としては、ADH3プロモーター(McKnight他、EMBO J.4:2093〜2099頁、1985年)やtpiAプロモーターなどのアスペルギルス・ニダランス(Aspergillus nidulans)解糖系遺伝子に由来するものが挙げられる。 Examples of useful promoters are, ADH3 promoter: those derived from (McKnight other, EMBO J.4 2,093 to 2099 1985) in Aspergillus nidulans (Aspergillus nidulans) glycolytic genes, such as and tpiA promoter . 適切なターミネーターの例はADH3ターミネーター(McKnight他、同書)である。 Examples of suitable terminator is the ADH3 terminator (McKnight et al., Ibid.). このような構成要素を利用する発現ユニットは、例えばアスペルギルスの染色体DNA中に挿入することができるベクター中にクローニングすることができる。 Such expression units utilizing components may be cloned into vectors which can be inserted for example into the chromosomal DNA of Aspergillus.

[0092]本発明を実施する際に使用するための哺乳動物発現ベクターは、改変されたポリペプチド及びペプチドの転写を指示することができるプロモーターを含む。 Mammalian expression vectors for use in practicing the [0092] present invention will include a promoter capable of directing the transcription of the modified polypeptides and peptides. 好ましいプロモーターとしては、ウイルスプロモーター及び細胞プロモーターが挙げられる。 Preferred promoters include viral promoters and cellular promoters. 好ましいウイルスプロモーターとしては、アデノウイルス2に由来する主要後期プロモーター(Kaufman及びSharp、Mol.Cell.Biol.2:1304〜13199頁、1982年)及びSV40プロモーター(Subramani他、Mol.Cell.Biol.1:854〜864頁、1981年)が挙げられる。 Preferred viral promoters include the major late promoter from adenovirus 2 (Kaufman and Sharp, Mol.Cell.Biol.2: 1304~13199 1982) and the SV40 promoter (Subramani other, Mol.Cell.Biol.1 : 854-864 1981) and the like. 好ましい細胞プロモーターとしては、マウスのメタロチオネイン−1プロモーター(Palmiter他、Science222;809〜814頁、1983年)及びマウスVκ(米国特許第6291212号を参照されたい)プロモーター(Grant他、Nuc.Acids Res.15:5496頁、1987年)が挙げられる。 Preferred cellular promoters, mouse metallothionein-1 promoter (Palmiter other, Science222; 809~814 1983) (see U.S. Pat. No. 6,291,212) and mouse Vκ promoter (Grant other, Nuc. Acids Res. 15: 5496 1987) and the like. 特に好ましいプロモーターは、マウスV (米国特許第6291212号を参照されたい)プロモーターである。 Particularly preferred promoters (see U.S. Pat. No. 6,291,212) mouse V H is a promoter. このような発現ベクターはまた、プロモーターから下流、かつ改変されたポリペプチド又はペプチドをコードしているDNA配列から上流に位置する、1組のRNAスプライス部位も含み得る。 Such expression vectors are also located upstream from the downstream, and modified polypeptide or peptide encoding DNA sequence from the promoter, may also contain a set of RNA splice sites. 好ましいRNAスプライス部位は、アデノウイルス及び/又は免疫グロブリン遺伝子から得ることができる。 Preferred RNA splice sites may be obtained from adenovirus and / or immunoglobulin genes.

[0093]興味対象のコード配列の下流に位置するポリアデニル化シグナルもまた、発現ベクター中に含まれる。 [0093] the polyadenylation signal located downstream of interest coding sequences may also be included in an expression vector. ポリアデニル化シグナルとしては、SV40に由来する初期又は後期のポリアデニル化シグナル(Kaufman及びSharp、同書)、アデノウイルス5E1B領域及びヒト成長ホルモン遺伝子ターミネーター(DeNoto他、Nuc.Acids Res.9:3719〜3730頁、1981年)に由来するポリアデニル化シグナルが挙げられる。 The polyadenylation signals include the early or late polyadenylation signal from SV40 (Kaufman and Sharp, ibid.), Adenovirus 5E1B region and a human growth hormone gene terminator (DeNoto other, Nuc.Acids Res.9: 3719~3730 pages , and a polyadenylation signal derived from in 1981). 特に好ましいポリアデニル化シグナルは、V (米国特許第6291212号を参照されたい)遺伝子ターミネーターである。 A particularly preferred polyadenylation signal is (see U.S. Pat. No. 6,291,212) V H is a gene terminator. 発現ベクターは、プロモーターとRNAスプライス部位の間に位置した、アデノウイルス2の3分節リーダーなど非コード性のウイルスリーダー配列を含んでもよい。 Expression vector, located between the promoter and the RNA splice sites may contain viral leader sequence noncoding such tripartite leader of the adenovirus 2. 好ましいベクターは、SV40エンハンサーやマウスμ(米国特許第6291212号を参照されたい)エンハンサー(Gillies、Cell 33:717〜728頁、1983年)などのエンハンサー配列も含んでもよい。 Preferred vectors, SV40 enhancer and the mouse mu (see U.S. Pat. No. 6,291,212) enhancer (Gillies, Cell 33: 717~728 1983) it may also include enhancer sequences, such as. 発現ベクターは、アデノウイルスVA RNAをコードする配列も含んでよい。 Expression vectors may also include sequences encoding the adenovirus VA RNA.

[0094]これらの発現ベクターはまた、後述するように、改変されたポリペプチド又はペプチドの半減期を向上させるために、第2のポリペプチド又はペプチド、例えばトランスフェリンに融合された本発明の改変されたポリペプチド又はペプチドを含む融合タンパク質を発現させるためにも使用される。 [0094] These expression vectors are also, as described later, in order to improve the half-life of the altered polypeptide or peptide, is modified in the second polypeptide or peptide, for example, the present invention fused to transferrin also used to express a fusion protein comprising a polypeptide or peptide. 同様に、改変されたポリペプチド又はペプチドは、その改変されたポリペプチド又はペプチドを発現及び遊離させるためにタグ及び/又は切断部位に融合してもよい。 Similarly, the modified polypeptide or peptide may be fused to a tag and / or cleavage site to express and release the modified polypeptide or peptide.

形質転換 Transformation
[0095]菌類を形質転換するための技術は文献において周知であり、例えばBeggs(同書)、Hinnen他(Proc.Natl.Acad.Sci.USA75:1929〜1933頁、1978年)、Yelton他、(Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:1740〜1747頁、1984年)、及びRussell(Nature301:167〜169頁、1983年)によって説明されている。 [0095] Techniques for transforming fungi are well known in the literature, for example, Beggs (ibid.), Hinnen Other (Proc.Natl.Acad.Sci.USA75: 1929~1933 pages, 1978), Yelton et ( Proc.Natl.Acad.Sci.USA81: 1740~1747 pages, 1984), and Russell (Nature301: 167~169 pages, described by 1983). 宿主細胞の遺伝子型は、一般に、発現ベクター上に存在する選択マーカーによって補完される遺伝的欠陥を含む。 The genotype of the host cell will generally comprise a genetic defect that is complemented by the selectable marker present on the expression vector. 個々の宿主及び選択マーカーの選択は、十分に当業者のレベルの範囲内である。 Selection of particular host and selectable marker is well within the level of ordinary skill in the art.

[0096]本発明の改変されたポリペプチド及びペプチドを含むクローン化DNA配列は、例えばリン酸カルシウムによるトランスフェクション(Wigler他、Cell 14:725頁、1978年;Corsaro及びPearson、Somatic Cell Genetics 7:603頁、1981年;Graham及びVan der Eb、Virology 52:456頁、1973年)によって、哺乳動物培養細胞中へ導入することができる。 [0096] cloned DNA sequences comprising modified polypeptides and peptides of the present invention, the transfection (Wigler other eg with calcium phosphate, Cell 14: 725 pp., 1978; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7: 603 pp. , 1981; Graham and Van der Eb, Virology 52: 456 pp., by 1973), may be introduced into cultured mammalian cells. エレクトロポレーション(Neumann他、EMBO J.1:841〜845頁、1982年)又はリポフェクションなど哺乳動物細胞中にクローン化DNA配列を導入するための他の技術も使用することができる。 Electroporation (Neumann other, EMBO J.1: 841~845 1982) can also be used other techniques for introducing cloned DNA sequences into mammalian cells, such as, or lipofection. クローン化DNAを組み込んだ細胞を同定するために、選択マーカーが、興味対象の遺伝子又はcDNAと共にそれらの細胞中に一般に導入される。 To identify cells that have integrated the cloned DNA, a selection marker is generally introduced into the in their cells along with interest gene or cDNA. 哺乳動物培養細胞において使用するのに好ましい選択マーカーとしては、ネオマイシン、ヒグロマイシン及びメトトレキサートなどの薬物に対する抵抗性を与える遺伝子が挙げられる。 Preferred selectable markers for use in cultured mammalian cells, neomycin, include genes that confer resistance to drugs, such as hygromycin and methotrexate. 選択マーカーは、増幅可能な選択マーカーでもよい。 Selectable markers may be an amplifiable selectable marker. 好ましい増幅可能な選択マーカーは、DHFR遺伝子である。 A preferred amplifiable selectable marker is the DHFR gene. 特に好ましい増幅可能なマーカーは、DHFR (米国特許第6291212号を参照されたい)cDNA(Simonsen及びLevinson、Proc.Natl.Acad.Sci、USA80:2495〜2499頁、1983年)である。 A particularly preferred amplifiable marker is, DHFR r (see U.S. Pat. No. 6,291,212) cDNA (Simonsen and Levinson, Proc.Natl.Acad.Sci, USA80: 2495~2499 1983) is. 選択マーカーは、Thillyによる総説があり(Mammalian Cell Technology、Butterworth Publishers、ストーナム(Stoneham)、マサチューセッツ州)、かつ選択マーカーの選択は、十分に当業者のレベルの範囲内である。 Selectable markers may review by Thilly (Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, Stoneham (Stoneham), MA), and the choice of selectable markers is well within the level of ordinary skill in the art.

宿主細胞 Host cell
[0097]本発明はまた、本発明の改変されたポリペプチド又はペプチドを発現するように形質転換された細胞、好ましくは酵母細胞も含む。 [0097] The present invention also provides cells transformed to express a modified polypeptides or peptides of the present invention, preferably also include yeast cells. 形質転換された宿主細胞それら自体に加えて、本発明はまた、栄養培地中の、それらの細胞の培養物、好ましくはモノクローナル(クローン的に均一な)培養物、又はモノクローナル培養物に由来する培養物も含む。 In addition to the host cells themselves transformed, the present invention also includes a culture of those cells, preferably derived from monoclonal (clonally homogeneous) culture, or a monoclonal culture cultured thing also be included. ポリペプチドが分泌される場合、培地は、細胞と共に、又はそれらがろ過若しくは遠心分離で除去される場合には細胞を伴わずに、ポリペプチドを含む。 If the polypeptide is secreted, the medium with cells, or if they are removed by filtration or centrifugation without cells, comprising a polypeptide.

[0098]本発明を実施する際に使用するための宿主細胞としては、哺乳動物培養細胞、昆虫細胞、菌細胞、植物細胞、及び細菌細胞など、外因性DNAで形質転換又はトランスフェクトでき、培養状態で増殖させることができる真核細胞及びいくつかの場合では原核細胞が挙げられる。 [0098] Host cells for use in practicing the present invention, cultured mammalian cells, insect cells, fungal cells, plant cells, and bacterial cells such as, can transformed or transfected with exogenous DNA, cultured include prokaryotic cells in the case the state of eukaryotic cells and some that can cause it to grow in. 本発明の核酸配列を含むベクターは、ベクターが染色体構成要素として、又は自己複製する染色体外ベクターとして維持されるように、宿主細胞中へ導入される。 Vector comprising a nucleic acid sequence of the present invention, the vector is a chromosomal elements, or to be maintained as an extrachromosomal vector self-replicating, is introduced into a host cell. 核酸配列が細胞中で安定に維持されやすいため、組込みが有利であると一般にみなされる。 Since the nucleic acid sequence is likely to be stably maintained in the cell, it is regarded generally as incorporation is preferred. 宿主の染色体中へのベクターの組込みは、相同組換え又は非相同組換えによって起こり得る。 Integration of the vector into the host chromosome may occur by homologous recombination or non-homologous recombination.

[0099]宿主細胞の選択は、ポリペプチドをコードしている遺伝子及びその供給源に大きく依存すると考えられる。 [0099] Selection of the host cell is considered largely dependent on the gene and its source encoding a polypeptide. 宿主細胞は、単細胞の微生物、例えば原核生物でも、又は非単細胞の微生物、例えば真核生物でもよい。 Host cells, unicellular microorganisms, e.g., in prokaryotes, or non-unicellular microorganism, e.g., may be a eukaryote. 原核生物又は真核生物のいずれかを使用することができる。 It can be used either prokaryotic or eukaryotic. 原核宿主細胞としては、大腸菌(Escherichia coli)や枯草菌(Bacillus subtilis)など一般に使用される細胞を使用することができる。 The prokaryotic host cell may be used Escherichia coli (Escherichia coli) and Bacillus subtilis (Bacillus subtilis) commonly cells used like.

[00100]原核細胞が宿主細胞として使用される場合、宿主細胞中で複製可能なベクターが使用され得る。 [00100] If prokaryotic cells are used as host cells, a replicable vector in a host cell may be used. タンパク質合成を開始するために必要とされるプロモーター、SD配列(シャイン・ダルガルノ配列)、及び開始コドン(例えばATG)が、ベクター中で本発明の遺伝子の上流で提供されて、その遺伝子の発現を促進するような発現プラスミドが、好ましくは使用され得る。 Promoter which is required for starting protein synthesis, SD sequence (Shine-Dalgarno sequence), and the start codon (e.g. ATG) is provided upstream of the gene of the present invention in the vector, the expression of the gene expression plasmids that promote, can preferably be used. 上記のベクターの例としては、pBR322、pBR325、pUC12、pUC13など大腸菌に由来する一般に使用されるプラスミドが挙げられる。 Examples of the vectors, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13 include plasmids commonly used derived from Escherichia coli and the like. しかし、適用可能なベクターはこれらの例に限定されず、様々な公知のベクターも使用することができる。 However, applicable vectors are not limited to these examples, it may be used various known vectors. 大腸菌を用いた発現系において使用可能な市販のベクターの例としては、pGEX−4T(Amersham Pharmacia Biotech社)、pMAL−C2、pMAL−P2(New England Biolabs社)、pET21/lacq(Invitrogen社)、pBAD/His(Invitrogen社)などが挙げられる。 Examples of commercially available vectors usable in expression system using E. coli, pGEX-4T (Amersham Pharmacia Biotech, Inc.), pMAL-C2, pMAL-P2 (New England Biolabs, Inc.), pET21 / lacq (Invitrogen Corp.), pBAD / His (Invitrogen, Inc.), and the like.

[00101]真核宿主細胞の例としては、酵母細胞などが挙げられる。 [00101] Examples of eukaryotic host cells, and the like yeast cells. 好んで使用される有頭動物細胞の例としては、COS細胞(サル由来の細胞)(1981年 Cell、23、175頁)、チャイニーズハムスター卵巣細胞及びそれに由来するジヒドロ葉酸還元酵素欠損株(1980年 Proc.Natl.Acad.Sci.、USA.、77、4216頁)などが挙げられ、また、好んで使用される酵母細胞の例としては、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)などが挙げられる。 Examples of craniate cells willingly used, COS cells (monkey cells) (1981 Cell, pp. 23,175), Chinese hamster ovary cells and a dihydrofolate reductase-deficient strain (1980 derived therefrom Proc., USA., is like pp 77,4216), also, examples of yeast cells that are willingly used, like Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces cerevisiae). しかし、使用できる細胞はこれらの例に限定されない。 However, not cells that can be used is limited to these examples. 好ましくは、酵母細胞が、改変されたポリペプチド又はペプチドを発現させるために使用される。 Preferably, the yeast cells are used to express the modified polypeptide or peptide.

[00102]酵母の種(例えばサッカロマイセス種、分裂酵母(Schizosaccharomyces種)、ピキア(Pichia)種)を含めて、菌細胞が本発明内で宿主細胞として使用され得る。 [00102] Seed of yeast (e.g., Saccharomyces species, Schizosaccharomyces pombe (Schizosaccharomyces species), Pichia (Pichia) species), including, bacterial cells may be used as host cells within the present invention. 本発明の改変されたポリペプチド又はペプチドを発現させるための宿主として、本発明を実施する際に有用であることが予想される、酵母を含む菌類の例は、ピキア(以前はハンセヌラ(Hansenula)として分類されていた種を含む)、サッカロマイセス、クルイベロマイセス(Kluyveromyces)、アスペルギルス、カンジダ(Candida)、トルロプシス(Torulopsis)、トルラスポラ(Torulaspora)、分裂酵母、シテロマイセス(Citeromyces)、パチソレン(Pachysolen)、チゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)、デバロマイセス(Debaromyces)、トリコデルマ(Trichoderma)、セファロスポリウム(Cep As hosts for expressing the modified polypeptide or peptides of the present invention, it is useful in practicing the present invention are expected, examples of fungi including yeast, Pichia (formerly Hansenula (Hansenula) including species that have been classified as), Saccharomyces, Kluyveromyces (Kluyveromyces), Aspergillus, Candida (Candida), Torulopsis (Torulopsis), Torulaspora (Torulaspora), fission yeast, Shiteromaisesu (Citeromyces), Pachisoren (Pachysolen), Zygosaccharomyces (Zygosaccharomyces), Debaromaisesu (Debaromyces), Trichoderma (Trichoderma), Cephalosporium (Cep alosporium)、フミコーラ(Humicola)、ケカビ(Mucor)、アカパンカビ(Neurospora)、ヤロウィア(Yarrowia)、メツニコウィア(Metschnikowia)、ロドスポリジウム(Rhodosporidium)、ロイコスポリジウム(Leucosporidium)、ボトリオアスクス(Botryoascus)、スポリジオボラス(Sporidiobolus)、エンドミコプシス(Endomycopsis)などである。 alosporium), Humicola (Humicola), Mucor (Mucor), Neurospora crassa (Neurospora), Yarrowia (Yarrowia), Metsunikowia (Metschnikowia), Rhodosporidium (Rhodosporidium), Roy cost poly indium (Leucosporidium), Botorioasukusu (Botryoascus), Sporidiobolus (Sporidiobolus ), Endomikopushisu (Endomycopsis), and the like. サッカロマイセス属菌の例は、S. Examples of Saccharomyces spp., S. セレビシエ、S. Cerevisiae, S. イタリクス(italicus)、及びS. Itarikusu (italicus), and S. ロウキシイ(rouxii)である。 Is a Roukishii (rouxii). クルイベロマイセス属菌の例は、K. Examples of Kluyveromyces spp., K. フラギリス(fragilis)、K. Fragilis (fragilis), K. ラクティス(lactis)、及びK. Lactis (lactis), and K. マルキシアヌス(marxianus)である。 It is a marxianus (marxianus). 適切なトルラスポラ属菌は、T. Appropriate Torulaspora spp., T. デルブリュッキー(delbrueckii)である。 A Dell Brussels key (delbrueckii). ピキア属菌の例は、P. Examples of Pichia bacteria, P. アングスタ(angusta)(以前のH.ポリモルファ(polymorpha))、P. Angusuta (angusta) (formerly of H. polymorpha (polymorpha)), P. アノマラ(anomala)(以前のH.アノマラ)、及びP. Anomala (anomala) (formerly of H. anomala), and P. パストリス(Pastoris)である。 It is a pastoris (Pastoris).

[00103]本発明の改変されたポリペプチド又はペプチドを作製するのに特に有用な宿主細胞は、メタノール資化性ピキア・パストリス(Steinlein他(1995年)Protein Express.Purif.6:619〜624頁)である。 [00103] Particularly useful host cells to producing modified polypeptides or peptides of the present invention, methylotrophic Pichia pastoris (Steinlein et al. (1995) Protein Express.Purif.6: 619~624 page ) it is. ピキア・パストリスは、そのアルコール酸化酵素プロモーターが単離かつクローン化されたため、異種タンパク質を作製するための優れた宿主となるように開発され、その形質転換は1985年に最初に報告された。 Pichia pastoris, for the alcohol oxidase promoter has been isolated and cloned, developed to an excellent host for producing heterologous proteins, transformation was first reported in 1985. P. P. パストリスは、グルコースが無い場合は炭素源としてメタノールを利用することができる。 Pastoris, if glucose is not able to utilize methanol as a carbon source. P. P. パストリス発現系では、メタノール代謝の第1段階を触媒する酵素であるアルコール酸化酵素の発現をコードする遺伝子を制御する、メタノール誘導性のアルコール酸化酵素(AOX1)プロモーターを使用することができる。 The P. pastoris expression system, which controls the gene that codes for the expression of alcohol oxidase, an enzyme that catalyzes the first step of the methanol metabolism, methanol-induced alcohol oxidase (AOX1) can be used promoter. このプロモーターは、特性を決定され、かつ一連のP. This promoter is determined characteristic, and a series of P. パストリス発現ベクター中に組み込まれた。 It was incorporated into the P. pastoris expression vector. P. P. パストリス中で産生されるタンパク質は、通常正確に折り畳まれ、かつ培地中に分泌されるため、遺伝子操作されたP. Proteins produced in P. pastoris are typically folded correctly and to be secreted into the medium, genetically engineered P. パストリスの発酵は、大腸菌発現系の優れた代替手段となる。 Fermentation of P. pastoris is a good alternative of E. coli expression system.

[00104]酵母サッカロマイセス・セレビシエの株は、別の好ましい宿主である。 [00104] strain of yeast Saccharomyces cerevisiae are another preferred host. 好ましい実施形態では、酵母細胞、又はより具体的には、糖タンパク質のアスパラギン結合型グリコシル化のために必要な遺伝子に遺伝的欠陥を含むサッカロマイセス・セレビシエ宿主細胞が使用される。 In a preferred embodiment, a yeast cell, or more specifically, Saccharomyces cerevisiae host cell that contains a genetic defect in a gene required for asparagine-linked glycosylation of glycoproteins is used. 多数の入手可能な酵母株が、グリコシル化又は過剰なマンノシル化を防止又は低減させるために改変されたが、このような欠陥を有するS. Numerous available yeast strains have been modified to prevent or reduce glycosylation or excessive mannosylated, S. having such defects セレビシエ宿主細胞は、変異及び選択の標準技術を用いて調製することができる。 Cerevisiae host cell can be prepared using standard techniques of mutation and selection.

[00105]異種性タンパク質の産生を最適化するためには、宿主株が、タンパク質分解活性の低減をもたらすS. [00105] To optimize production of heterologous proteins, host strain results in a reduction of the proteolytic activity S. セレビシエpep4変異(Jones、Genetics 85:23〜33頁、1977年)などの変異を有することも好ましい。 Cerevisiae pep4 mutation (Jones, Genetics 85: 23~33 pages, 1977) It is also preferable to have a mutation, such as. アスパルチルプロテアーゼヤプシン1(YAP3)をコードしている遺伝子若しくはヤプシン2(MKC7)をコードしている遺伝子、又はその双方に変異を有し(Copley他 1998年 Biochem.J.330、1333〜1340頁)、その結果、塩基性残基を対象とするタンパク質分解活性が低減又は消失しているような宿主を使用することが特に有利である。 Aspartyl protease Yapu Shin 1 (YAP3) of a gene encoding the code to have gene or Yapushin 2 (MKC7), or a mutation in its both (Copley other 1998 Biochem.J.330,1333~1340 page), as a result, it is particularly advantageous that the proteolytic activity directed to the basic residues using a host such as reduced or eliminated. 他のプロテアーゼコード領域に変異を含む宿主株は、本発明の改変された治療用ポリペプチド又はペプチドを大量に作製するのに特に有用である。 Host strains containing mutations in other protease encoding regions are particularly useful in large quantities to produce the modified therapeutic polypeptides or peptides of the present invention.

[00106]本発明のDNA構築体を含む宿主細胞は、適切な増殖培地中で増殖させられる。 Host cell comprising the DNA construct of [00106] The present invention is grown in an appropriate growth medium. 本明細書において使用される場合、「適切な増殖培地」という用語は、細胞の増殖に必要とされる栄養素を含む培地を意味する。 As used herein, the term "appropriate growth medium" means a medium containing nutrients required for cell growth. 細胞増殖に必要とされる栄養素としては、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミン、無機物、及び増殖因子を挙げることができる。 Nutrients required for cell growth may include a carbon source, a nitrogen source, essential amino acids, vitamins, minerals, and growth factors. 増殖培地では、一般に、例えば、薬物による選択、又はDNA構築体上の若しくはDNA構築体と共にトランスフェクトされた選択マーカーによって補完される必須栄養素の欠乏によって、DNA構築体を含む細胞を選択する。 The growth medium, typically, for example, selection by a drug, or by the lack of essential nutrients are complemented by transfected selectable marker with the DNA construct on or DNA construct, selecting for cells containing the DNA construct. 例えば酵母細胞は、好ましくは、非アミノ酸窒素源、無機塩類、ビタミン、及び必須アミノ酸補給物を含む、既知組成培地中で増殖する。 Such as yeast cells, preferably, non-amino acid nitrogen source, inorganic salts, vitamins, and essential amino acids supplements, grown in chemically defined medium. 培地のpHは、好ましくは、2より大きく8未満のpH、好ましくはpH5.5〜6.5で維持される。 The pH of the medium is preferably, pH greater than 2 and less than 8, is maintained preferably at pH 5.5 to 6.5. 安定なpHを維持するための方法には、好ましくはアンモニア、水酸化アンモニウム又は水酸化ナトリウムの添加による緩衝化及び恒常的なpH制御が含まれる。 Methods for maintaining a stable pH, preferably included ammonia, buffered and permanent pH control by addition of ammonium hydroxide or sodium hydroxide. 好ましい緩衝剤としては、クエン酸、ホスファート、コハク酸及びBis−Tris(Sigma Chemical社、セントルイス(St.Louis)、ミズーリ州)が挙げられる。 Preferred buffers include citric acid, phosphate, succinic acid and Bis-Tris (Sigma Chemical Co., St. Louis (St.Louis), MO) and the like. アスパラギン結合型グリコシル化に必要な遺伝子に欠陥を有する酵母細胞は、好ましくは、浸透圧安定剤を含む培地中で増殖する。 Yeast cells having a defect in a gene required for asparagine-linked glycosylation are preferably grown in a medium containing an osmotic stabilizer. 好ましい浸透圧安定剤は、ソルビトールであり、0.1M〜1.5M、好ましくは0.5M又は1.0Mの濃度で培地中に追加される。 Preferred osmotic stabilizer is sorbitol, 0.1M~1.5M, are added preferably in the medium at a concentration of 0.5M or 1.0 M.

[00107]哺乳動物培養細胞は一般に、市販の血清含有培地又は無血清培地中で増殖する。 [00107] Mammalian cell cultures are generally grown in commercially available serum-containing or serum-free medium. 使用される個々の細胞系統に適した培地の選択は、当業者のレベルの範囲内である。 Selection of a medium appropriate for the individual cell lines used is within the level of skill in the art. トランスフェクトされた哺乳動物細胞を、一定期間、通常1〜2日間、増殖させて、興味対象のDNA配列の発現を開始させる。 The transfected mammalian cells, between a period of time, usually 1-2 days, grown, to begin expressing the DNA sequence of interest. 次いで、安定的に選択マーカーを発現している細胞の増殖を選択するために、薬物選択を適用する。 Then, to select for growth of cells expressing stably selection marker, to apply the drug selection. 増幅可能な選択マーカーでトランスフェクトした細胞の場合は、薬物濃度を段階的に上昇させ、コピー数の多いクローン化配列を選択し、それによって発現レベルを増大させてもよい。 For an amplifiable selectable marker transfected cells raises the drug concentration stepwise, select the cloned sequences large copy number, thereby may be increased expression levels.

[00108]バキュロウイルス/昆虫細胞発現系も、本発明の改変された治療用ポリペプチド又はペプチドを作製するのに使用してよい。 [00108] Baculovirus / insect cell expression systems may also be used to produce the modified therapeutic polypeptides or peptides of the present invention. 「BacPAK(商標)」バキュロウイルス発現系(BD Biosciences(Clontech社)は、昆虫宿主細胞において高レベルで組換えタンパク質を発現する。標的遺伝子をトランスファーベクター中に挿入し、これを、直鎖状にしたBacPAK6ウイルスDNAと共に昆虫宿主細胞中にトランスフェクトする。BacPAK6 DNAは、バキュロウイルスゲノムの不可欠な部分を欠いている。このDNAがベクターと再結合すると、その不可欠な要素が修復され、標的遺伝子がバキュロウイルスゲノムに移入される。組み換え後に、数個のウイルスプラークを採取かつ精製し、組換え表現型を確認する。次いで、新規に単離した組み換えウイルスを増幅させ、かつ昆虫細胞培養物に感染させるのに使用して所望のタンパ "BacPAK (TM)" Baculovirus Expression System (BD Biosciences (Clontech, Inc.), in insect host cells expressing a recombinant protein at high levels. Insert the target gene in the transfer vector, this linearized .BacPAK6 DNA transfected into an insect host cells along with BacPAK6 viral DNA was lack an integral part of the baculovirus genome. When the DNA recombines with the vector, the essential element is restored and the target gene after. recombination is transferred into baculovirus genome, and several collecting and purifying the virus plaques, confirming the recombinant phenotype. then, to amplify the recombinant virus isolated new, and infected insect cell cultures desired Tampa used to 質を大量に産生させることができる。 It can be made to the quality of producing large amounts.

分泌シグナル配列 Secretory signal sequence
[00109]「分泌シグナル配列」若しくは「シグナル配列」又は「分泌リーダー配列」という用語は同義的に使用され、かつ例えば、いずれもその全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第6291212号及び米国特許第5547871号において説明されている。 [00109] The term "secretory signal sequence" or "signal sequence" or "secretion leader sequence" are used interchangeably, and for example, both U.S. Patent No. 6,291,212 in its entirety is incorporated herein by reference and It is described in U.S. Patent No. 5,547,871. 分泌シグナル配列若しくはシグナル配列又は分泌リーダー配列は、分泌ペプチドをコードしている。 Secretory signal sequences or signal sequences or secretion leader sequences encode secretory peptides. 分泌ペプチドは、細胞からの成熟したポリペプチド又はタンパク質の分泌を指示する役割を果たすアミノ酸配列である。 Secretory peptide is the role amino acid sequence that directs the secretion of the mature polypeptide or protein from a cell. 分泌ペプチドは一般に、疎水性アミノ酸のコアを特徴とし、かつ通常(それだけには限らないが)、新しく合成されたタンパク質のアミノ末端に存在する。 The secretory peptide is typically characterized by a core of hydrophobic amino acids, and usually (but not limited to), present at the amino terminus of newly synthesized proteins. 分泌ペプチドは、分泌中に成熟タンパク質から切断されることが非常に多い。 Secretory peptides, is very often cleaved from the mature protein during secretion. 分泌ペプチドは、成熟タンパク質が分泌経路を通過するときに、シグナルペプチドがそれから切断され得るプロセシング部位を含んでいてもよい。 Secretory peptides, when the mature protein to pass through the secretory pathway may include a processing site, where the signal peptide may be cleaved therefrom. プロセシング部位は、シグナルペプチド内部にコードされていてもよく、又は例えばin vitro変異誘発によってシグナルペプチドに付加されてもよい。 Processing sites may be encoded within the signal peptide, or, for example may be added to the signal peptide by in vitro mutagenesis.

[00110]分泌ペプチドは、本発明の改変されたポリペプチド及びペプチドの分泌を指示するために使用してもよい。 [00110] Secretory peptides may be used to direct the secretion of modified polypeptides and peptides of the present invention. 他の分泌ペプチドと組み合わせて使用され得る1つのこのような分泌ペプチドは、酵母バリア(Barrier)タンパク質の第3ドメインである。 One such secretory peptide that may be used in combination with other secretory peptides is the third domain of the yeast Barrier (Barrier) protein. 分泌シグナル配列若しくはシグナル配列又は分泌リーダー配列は、タンパク質の分泌をもたらす複雑な一連の翻訳後プロセシング段階に必要である。 Secretory signal sequences or signal sequences or secretion leader sequences are required for a complex series of post-translational processing steps which result in secretion of the protein. 完全なシグナル配列が存在している場合には、発現されるタンパク質は、粗面小胞体の管腔に入り、次いでゴルジ体を通って分泌小胞に輸送され、最終的に細胞外へ輸送される。 When the complete signal sequence is present, the proteins expressed enters the lumen of the rough endoplasmic reticulum and is then transported to secretory vesicles through the Golgi apparatus and finally transported to the extracellular that. 一般に、シグナル配列は、開始コドンのすぐ後に続き、かつ分泌されるタンパク質のアミノ末端のシグナルペプチドをコードしている。 In general, the signal sequence encodes immediately follows the initiation codon and the signal peptide of the amino terminus of the protein to be secreted. たいていの場合は、シグナル配列は、シグナルペプチダーゼと呼ばれる特異的なプロテアーゼによって切り離される。 In most cases, the signal sequence is separated by a specific protease, called a signal peptidase. 好ましいシグナル配列により、ウイルス、哺乳動物、又は酵母の発現ベクターを用いた組換えタンパク質発現のプロセシング及び搬出効率が改善される。 Preferred by a signal sequence, viruses, processing and unloading efficiency of recombinant protein expression using a mammalian expression vector, or yeast is improved. 好ましいシグナル配列は、哺乳動物又はヒトのトランスフェリンシグナル配列である。 A preferred signal sequence is the transferrin signal sequence of mammalian or human. いくつかの場合では、天然基質のシグナル配列が、本発明の改変されたポリペプチド又はペプチドを発現及び分泌させるために使用してもよい。 In some cases, the signal sequence of the native substrate, may be used to express and secrete modified polypeptide or peptides of the present invention. シグナル配列の効率的な除去を確実にするために、いくつかの場合では、シグナル配列と成熟タンパク質の間に、そのC末端部分が酵母kex2pプロテアーゼなどのプロテアーゼに対する認識部位を含む短いプロペプチド配列を含むことが好ましいことがある。 To ensure efficient removal of the signal sequence, in some cases, between the mature protein and signal sequence, a short propeptide sequence comprising a recognition site that C-terminal portion of a protease, such as yeast kex2p protease it is that it is preferable to include. 好ましくは、プロペプチド配列は、約2〜12アミノ酸の長さ、より好ましくは約4〜8アミノ酸の長さである。 Preferably, propeptide sequence, a length of about 2-12 amino acids, more preferably a length of about 4-8 amino acids. このようなプロペプチドの例は、Arg−Ser−Leu−Asp−Lys−Arg、Arg−Ser−Leu−Asp−Arg−Arg、Arg−Ser−Leu−Glu−Lys−Arg、及びArg−Ser−Leu−Glu−Arg−Arg(それぞれ配列番号111〜114)である。 Examples of such propeptides, Arg-Ser-Leu-Asp-Lys-Arg, Arg-Ser-Leu-Asp-Arg-Arg, Arg-Ser-Leu-Glu-Lys-Arg, and Arg-Ser- Leu-Glu-Arg-Arg is (SEQ ID NO: 111-114).

DPP切断から保護された改変ポリペプチド基質の作製 Preparation of the modified polypeptide substrates protected from DPP cleavage
[00111]DPP活性に対して部分的又は実質的に抵抗性である本発明の改変ポリペプチドは、標準的な合成方法、組換えDNA技術、又はペプチド及び融合タンパク質を調製する他の任意の方法によって調製してよい。 [00111] modified polypeptides of the present invention are partially or substantially resistant to DPP activity, standard synthetic methods, recombinant DNA techniques, or peptides and any other method of preparing a fusion protein it may be prepared by.

[00112]固相ペプチド合成法は、以下の参考文献において一般に記載されている:Merrifield、J. [00112] Solid phase peptide synthesis methods are described in general in the following references: Merrifield, J. Am. Am. Chem. Chem. Soc. Soc. 、888;2149頁、1963年;Barany及びMerrifield、the Peptides、E. , 888; 2149, pp., 1963; Barany and Merrifield, the Peptides, E. Gross及びJ. Gross and J. Meinenhofer編、Academic Press、ニューヨーク、3:285頁(1980年);S. Meinenhofer eds., Academic Press, New York, 3: 285 (1980); S. B. B. H. H. Kent. Kent. Annu. Annu. Rev. Rev. Biochem. Biochem. 、57:957頁(1988年)。 , 57: 957 (1988). 固相ペプチド合成法により、固体樹脂粒子に共有結合している伸長中のペプチド鎖へのアミノ酸の段階的付加を介して、所望の長さ及び配列のペプチドを作製することができる。 By solid phase peptide synthesis, via a stepwise addition of amino acids to the growing peptide chain covalently bound to the solid resin particles, it is possible to produce peptides of desired length and sequence. この方法において自動合成を使用してもよい。 Or using an automated synthesis in this process.

[00113]上述したように、本発明の改変ポリペプチドはまた、それらのポリペプチドをコードする核酸配列を使用して、分子生物学技術によって得ることもできる。 [00113] As described above, the modified polypeptides of the present invention also uses a nucleic acid sequence encoding such polypeptide, it may be obtained by molecular biology techniques. これらの配列は、RNAでもDNAでもよく、また、制御配列に結合していても及び/又はベクター中に挿入されていてもよい。 These sequences be RNA or DNA, or may be inserted into the binding also and / or have the vector to the control sequences. 後者は次に宿主細胞、例えば細菌中にトランスフェクトされる。 The latter is then transfected into host cells such as bacteria. ベクターの調製及び宿主中でのそれらの産生又は発現は、従来の分子生物学及び遺伝子工学技術によって実施される。 Their production or expression in a preparation and hosts of the vector is carried out by conventional molecular biology and genetic engineering techniques.

[00114]さらに、本発明の改変ポリペプチドは、市販の発現系において容易に合成されるDNA配列を用いた組換え技術によって作製することもできる。 [00114] In addition, modified polypeptides of the present invention can also be made by recombinant technology using DNA sequences which are easily synthesized in commercially available expression system.

[00115]本発明の改変ポリペプチドは、(a)ポリペプチド産生の助けとなる条件下で宿主細胞を培養するステップ;及び(b)ポリペプチドを回収するステップを含む組換え手段によって得ることができる。 [00115] modified polypeptides of the present invention, the step of culturing a host cell under conditions (a) polypeptide production help; be obtained by recombinant means comprising the steps of recovering and (b) a polypeptide it can. これらの細胞は、当技術分野において公知の方法を用いて、ポリペプチドの産生に適した栄養培地中で培養される。 These cells, using methods known in the art, are cultivated in a nutrient medium suitable for production of the polypeptide. 例えば、適切な培地中、かつポリペプチドの発現及び/又は単離を可能にする条件下で実施される、実験室又は産業的な発酵槽における振とうフラスコ培養、小規模又は大規模の発酵(連続発酵、回分発酵、流加回分発酵、若しくは固層発酵を含む)によって、細胞を培養することができる。 For example, in a suitable medium, and is carried out under conditions which allow the expression and / or isolation of a polypeptide, shaking in the laboratory or industrial fermentors flask cultures, small or large-scale fermentation ( continuous fermentation batch fermentation, by including a fed-batch fermentation, or solid layer fermentation), the cells can be cultured. 培養は、炭素及び窒素源並びに無機塩類を含む適切な栄養培地中で、当技術分野において公知の手順を用いて実施される(例えば、細菌及び酵母に関する参考文献;Bennett,J.W.及びLaSure,L.編集、More Gene Manipulations in Fungi、Academic Press、カリフォルニア、1991年を参照されたい)。 Culture, references in a suitable nutrient medium comprising carbon and nitrogen sources and inorganic salts, is carried out using procedures known in the art (e.g., on Bacterial and yeast;. Bennett, J. W. and LaSure , L. editing, More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, California, see 1991). 適切な培地は、商業的供給業者から入手可能であり、又は(例えば米国微生物株保存機関(American Type Culture Collection)のカタログにおいて)公開されている組成に従って調製してもよい。 Suitable media are available from commercial suppliers, or (for example in the catalog of the American Type Culture Culture Collection Organization (American Type Culture Collection)) may be prepared according to the composition published. 改変ポリペプチドが栄養培地中に分泌される場合には、ポリペプチドを培地から直接回収することができる。 If the modified polypeptide is secreted into the nutrient medium can be recovered directly the polypeptide from the culture medium. 改変ポリペプチドが分泌されない場合には、細胞可溶化液からそれを回収することができる。 If the modified polypeptide is not secreted, it is possible to recover it from the cell lysate.

[00116]例として、改変されたポリペプチド又はペプチド融合タンパク質を含む、本発明の改変されたポリペプチド又はペプチドは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる国際公開第0044772号パンフレットにおいて開示されている発酵方法論によって作製することができる。 As [00116] Examples include a modified polypeptide or peptide fusion protein, modified polypeptides or peptides of the present invention are disclosed in WO 0044772 pamphlet its entirety is incorporated herein by reference can be produced by fermentation methodologies are.

[00117]これらの改変ポリペプチドは、それらのポリペプチドに対して特異的な当技術分野において公知の方法を用いて検出することができる。 [00117] These modified polypeptides may be detected using methods known in these art specific for the polypeptides. これらの検出方法には、特定の受容体に結合する、特異的抗体の使用、酵素生成物の形成若しくは酵素基質の消失が含まれてよく、又は細胞ベースのアッセイにおける、特定の受容体の活性化の検出によることができる。 These detection methods, bind to specific receptors, use of specific antibodies, may include formation or disappearance of an enzyme substrate of the enzyme product, or in a cell-based assay, the activity of the particular receptor it is possible by the detection of the reduction. 例えば、酵素アッセイを使用して、改変ポリペプチドの活性を測定することができる。 For example, using the enzymatic assays can measure the activity of the modified polypeptide. 結果として生じる改変ポリペプチドは、当技術分野において公知の方法によって回収することができる。 The resulting modified polypeptide may be recovered by methods known in the art. 例えば、改変ポリペプチドは、それだけには限らないが、遠心分離、ろ過、抽出、噴霧乾燥、蒸発、又は沈降を含めて、従来の手順によって栄養培地から回収することができる。 For example, modified polypeptides, but are not limited to, centrifugation, filtration, extraction, spray drying, evaporation, or including sedimentation, can be recovered from the nutrient medium by conventional procedures.

[00118]本発明のポリペプチドは、それだけには限らないが、クロマトグラフィー(例えば、イオン交換、アフィニティ、疎水性、クロマトフォーカシング、及びサイズ排除)、電気泳動的手順(例えば分取用等電点電気泳動)、示差的な溶解性(例えば硫安沈殿)、SDS−PAGE又は抽出を含めて、様々な手順によって精製することができる(例えば、Protein Purification、J.−C.Janson及びLars Ryden編集、VCH Publishers、ニューヨーク、1989年を参照されたい)。 [00118] The polypeptides of the present invention, it is not limited to, chromatography (e.g., ion exchange, affinity, hydrophobic, chromatofocusing, and size exclusion), electrophoretic procedures (e.g., isoelectric prep focusing), differential solubility (e.g., ammonium sulfate precipitation), including SDS-PAGE, or extraction, can be purified by a variety of procedures (e.g., Protein purification, J.-C.Janson and Lars Ryden editing, VCH Publishers, New York, see 1989).

融合タンパク質及びタンパク質複合体 Fusion proteins and protein complexes
[00119]本発明は、組換え手段又は共有結合によって異種分子に結合された、改変されたポリペプチド又はペプチドを提供する。 [00119] The present invention has been linked to a heterologous molecule by recombinant means or covalent bonding, to provide a modified polypeptide or peptide. 異種分子、例えば血漿タンパク質への結合により改変されたポリペプチド又はペプチドの活性は、数日間から数週間延長する。 Heterologous molecule, for example the activity of the modified polypeptide or peptide by binding to plasma proteins prolongs days to weeks. いくつかの場合では、このような改変された治療用ポリペプチド又はペプチドの投与の実施は、この期間の間に1回しか必要とされないことがある。 In some cases, the implementation of the administration of such modified therapeutic polypeptide or peptide may not be only once required during this period. 活性化合物は主として大型分子に結合され、細胞内に取り込まれて他の生理学的プロセスを妨害する可能性が低いため、より高い特異性を実現させることができる。 Active compound is primarily bonded to large molecules, since there is less likely to be taken up into cells to interfere with other physiological processes, it is possible to achieve higher specificity.

[00120]別の実施形態では、組換え手段によって本発明の改変されたポリペプチド又はペプチドを異種配列に結合させ、キメラ又は融合タンパク質を形成させることができる。 [00120] In another embodiment, the modified polypeptides or peptides of the present invention by recombinant means coupled to a heterologous sequence can be form chimeric or fusion proteins. このようなキメラ又は融合タンパク質は、DPP切断から部分的又は実質的に保護され、改変されたポリペプチド又はペプチドに実質的に同種ではないアミノ酸配列を有する異種タンパク質に作動的に連結されている、改変されたポリペプチド又はペプチドを含む。 Such chimeric or fusion protein is partially or substantially protected from DPP cleavage, the modified polypeptide or peptide is operatively linked to a heterologous protein having an amino acid sequence not substantially homologous, comprising modified polypeptides or peptides. 「作動的に連結された」とは、改変されたポリペプチド又はペプチド及び異種タンパク質がインフレームで融合されていることを示す。 By "operatively linked" indicates that the modified polypeptide or peptide and the heterologous protein are fused in-frame. 異種タンパク質は、改変されたポリペプチド又はペプチドのN末端又はC末端に融合させることができる。 The heterologous protein can be fused to the N-terminus or C-terminus of the modified polypeptide or peptide.

[00121]一実施形態では、融合タンパク質は、本発明の改変ポリペプチドそれ自体の活性に影響を及ぼさない。 [00121] In one embodiment, the fusion protein does not affect the modified polypeptide itself of the activity of the present invention. 例えば、融合タンパク質としては、それだけには限らないが、酵素学的な融合タンパク質、例えばβ−ガラクトシダーゼ融合物、酵母2ハイブリッドGAL融合物、ポリHis融合物、MYCタグ付き融合物、HIタグ付き融合物、及びIg融合物を挙げることができる。 For example, a fusion protein, but it is not limited to, enzymatic fusion proteins, for example β- galactosidase fusions, yeast two-hybrid GAL fusions, poly-His fusions, MYC-tagged fusions, HI-tagged fusion , and it can be exemplified Ig fusions. このような融合タンパク質、特にポリHis融合物は、組換え改変ポリペプチドの精製を容易にすることができる。 Such fusion proteins, particularly poly-His fusions, can facilitate the purification of recombinant modified polypeptide. さらなる実施例では、融合タンパク質は、本発明の改変ペプチドと他の部分の間にアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列は、化学的又は酵素的切断後に本発明の改変ペプチドの遊離を可能にする認識配列を与える。 Recognition In a further embodiment, the fusion protein comprises the amino acid sequence between the modified peptide and the other portion of the present invention, the amino acid sequence, which allows the release of the modified peptide of the invention after chemical or enzymatic cleavage give the array. ある種の宿主細胞(例えば哺乳動物宿主細胞)では、異種シグナル配列を用いることによって、タンパク質の発現及び/又は分泌を増大させることができる。 In certain host cells (e.g., mammalian host cells), by using a heterologous signal sequence, it is possible to increase the expression and / or secretion of the protein. 別の実施形態では、改変されたポリペプチド又はペプチドは、血漿タンパク質などその血清安定性を高め又は血清半減期を延長すると考えられる分子に融合される。 In another embodiment, the modified polypeptide or peptide is fused to a molecule believed to extend the enhanced or serum half-life its serum stability such as plasma proteins. 好ましくは、改変ポリペプチド又はタンパク質は、血清アルブミン、免疫グロブリン又はFcドメインなどその一部分に融合される。 Preferably, the modified polypeptide or protein, serum albumin is fused like a portion thereof immunoglobulins or Fc domain. より好ましくは、改変されたポリペプチド又はペプチドは、トランスフェリン、ラクトトランスフェリン、メラノトランスフェリン又はそれらのハイブリッドに融合される。 More preferably, the modified polypeptide or peptide, transferrin is fused lacto transferrin, the melanotransferrin, or hybrids thereof. このような融合タンパク質を作製するための方法は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願第10/231,494号及び第10/378,094号、並びに国際出願PCT/US03/26818によって提供される。 Such methods for making fusion proteins are described in U.S. Patent Application Serial No. 10 / 231,494 and No. 10 / 378,094 in its entirety is incorporated herein by reference, and International Application PCT / US03 / It is provided by 26,818.

[00122]これらの特許出願で考察されているように、改変されたポリペプチド又はペプチドに結合されるトランスフェリンを改変してもよい。 [00122] As discussed in these patent applications, it may be modified transferrin coupled to the modified polypeptide or peptide. それにより、低減されたグリコシル化が示され得る。 Thus, reduced glycosylated can be shown. 改変されたトランスフェリンポリペプチドは、単一のトランスフェリンNドメイン、単一のトランスフェリンCドメイン、トランスフェリンのN及びCドメイン、2つのトランスフェリンNドメイン、並びに2つのトランスフェリンCドメインからなる群から選択することができる。 Modified transferrin polypeptide may be selected single transferrin N domain, a single transferrin C domain, N and C domains of Transferrin, two transferrin N domains, and from the group consisting of two transferrin C domains .

[00123]TfのCドメインが融合タンパク質の一部分である場合、2つのN結合型グリコシル化部位、すなわちN413及びN611(その全体が参照により本明細書に組み入れられるPCT/US03/26818の配列番号3)に対応するアミノ酸残基を、酵母系での発現用に変異して、グリコシル化又は過剰なマンノシル化を防止し、かつ融合タンパク質及び/又は治療用タンパク質の血清半減期を延長することができる(アシアロ−Tf又は場合によってはモノアシアロ−Tf若しくはジシアロ−Tfを生成させる)。 [00123] When the C domain of Tf is part of a fusion protein, the two N-linked glycosylation sites, namely N413 and N611 (SEQ ID NO: 3 of PCT / US03 / 26818 in its entirety is incorporated herein by reference amino acid residue corresponding to), mutated for expression in yeast systems, it is possible to prevent glycosylation or excessive mannosylation, and increase the serum half life of the fusion protein and / or therapeutic protein (If asialo -Tf or some to produce Monoashiaro -Tf or disialo -Tf). N413及びN611に対応するTfアミノ酸の他に、グリコシル化を防止又は実質的に低減させるために、N−X−S/Tグリコシル化部位内の隣接残基に変異があってもよい。 Other Tf amino acids corresponding to N413 and N611, in order to prevent or substantially reduce glycosylation, there may be a mutation in the flanking residues of the N-X-S / T in glycosylation sites. Funk他の米国特許第5986067号を参照されたい。 Funk See other U.S. Patent No. 5,986,067. ピキア・パストリスにおいて発現されたTfのNドメインは、S32で1つのヘキソースによってO結合型グリコシル化され、このようなグリコシル化を防止するためにも変異又は改変させ得ることもまた報告されている。 N domain of the expressed Tf in Pichia pastoris, is O-linked glycosylation by a single hexose at S32, it has also been reported that may be mutated or modified in order to prevent such glycosylation.

[00124]したがって、本発明の一実施形態では、トランスフェリン融合タンパク質は、それだけには限らないがTfのアシアロ型、モノシアロ型及びジシアロ型を含めて、グリコシル化の低減を示す改変されたトランスフェリン分子を含む。 [00124] Accordingly, in one embodiment of the present invention, the transferrin fusion protein, only but not limited to asialo form of Tf it, including monosialo type and disialo type, includes a modified transferrin molecule exhibits reduced glycosylation . 別の実施形態では、トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、グリコシル化を防止するように変異した組換えトランスフェリン変異体を含む。 In another embodiment, the transferrin portion of the transferrin fusion protein includes a mutant, recombinant transferrin mutant to prevent glycosylation. 別の実施形態では、トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、完全にグリコシル化される組換えトランスフェリン変異体を含む。 In another embodiment, the transferrin portion of the transferrin fusion protein includes a fully recombinant transferrin mutant that is glycosylated. 別の実施形態では、トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、Asn413及びAsn611のうちの少なくとも1つ(その全体が参照により本明細書に組み入れられるPCT/US03/26818の配列番号3)が、グリコシル化を生じないアミノ酸に変異している、グリコシル化を防止するように変異した組換えヒト血清トランスフェリン変異体を含む。 In another embodiment, the transferrin portion of the transferrin fusion protein, at least one of Asn413 and Asn611 (SEQ ID NO: 3 of PCT / US03 / 26818 in its entirety is incorporated herein by reference) is a glycosylated mutated to an amino acid that does not occur it is, including mutated recombinant human serum transferrin mutant to prevent glycosylation. 別の実施形態では、トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、グリコシル化を防止又は実質的に低減させるように変異した組換えヒト血清トランスフェリン変異体であって、N−X−S/Tグリコシル化部位内の隣接残基にそれらの変異があってもよい組換えヒト血清トランスフェリン変異体を含む。 In another embodiment, the transferrin portion of the transferrin fusion protein is a mutated recombinant human serum transferrin mutant so as to prevent or substantially reduce glycosylation, N-X-S / T glycosylation within sites even if those mutations in adjacent residues including good recombinant human serum transferrin mutant. さらに、グリコシル化は、セリン又はトレオニン残基を変異することによって低減又は防止してもよい。 Moreover, glycosylation may be reduced or prevented by mutating the serine or threonine residue. さらに、Xをプロリンに変更することによりグリコシル化が阻害されることが公知である。 Furthermore, it is known that glycosylation is inhibited by changing the X to proline.

[00125]キメラ又は融合タンパク質は、標準的な組換えDNA技術によって作製することができる。 [00125] The chimeric or fusion protein can be produced by standard recombinant DNA techniques. 例えば、異なるタンパク質配列をコードしているDNA断片は、従来の技術に従ってインフレームで相互に連結される。 For example, DNA fragments coding for the different protein sequences are ligated in-frame to each other in accordance with conventional techniques. 別の実施形態では、自動DNA合成機を含む従来の技術によって、融合遺伝子を合成することができる。 In another embodiment, by conventional techniques including automated DNA synthesizer, it can be synthesized fusion gene. あるいは、アンカープライマーを用いて2つの連続した遺伝子断片の間に相補的なオーバーハングを生じさせ、その後にアニール及び再増幅させてキメラ遺伝子配列を生成させる遺伝子断片のPCR増幅を実施することもできる(Ausubel他 1992年 Current Protocols in Molecular Biologyを参照されたい)。 Or may cause to complementary overhangs between two consecutive gene fragments using anchor primers, also it is followed by annealing and reamplified performing PCR amplification of gene fragments to generate a chimeric gene sequence (see Ausubel et al., 1992 Current Protocols in Molecular Biology). さらに、融合部分(例えばGSTタンパク質)を予めコードしている多くの発現ベクターが市販されている。 Moreover, many expression vectors are preliminarily encode a fusion moiety (eg, a GST protein) are commercially available. 融合部分が、改変されたポリペプチド又はペプチドにインフレームで連結されるように、改変されたポリペプチド又はペプチドをコードしている核酸をこのような発現ベクター中にクローニングすることができる。 Fusion moiety, as is linked in-frame to the modified polypeptide or peptide, to clone the nucleic acids encoding the modified polypeptides or peptides into such an expression vector.

[00126]別の実施形態では、改変された治療用ポリペプチド又はペプチドは、その安定性及びDPP活性からの保護を増大させるために、異種分子への共有結合を介して結合する。 [00126] In another embodiment, the modified therapeutic polypeptide or peptide, in order to increase protection from the stability and DPP activity, linked via a covalent bond to a heterologous molecule.

[00127]例として、改変されたポリペプチド又はペプチドは、連結基を伴って又は伴わずに、改変されたポリペプチド又はペプチドの反応性基と血液成分の間で形成される共有結合を介して血液成分に結合する。 As [00127] example, the modified polypeptide or peptide, without with a linking group or via a covalent bond formed between the reactive group and the blood component of the modified polypeptides or peptides binding to blood components. 血液成分は、固定性でも可動性でもよい。 Blood component may be a mobile in fixative. 固定性血液成分の例は、非可動性の血液成分であり、組織、膜受容体、間質タンパク質、フィブリンタンパク質、コラーゲン、血小板、内皮細胞、上皮細胞、並びにそれらに結合した膜及び膜性受容体、体細胞、骨格及び平滑筋細胞、ニューロン構成要素、骨細胞及び破骨細胞、並びにすべての身体組織、特に循環系及びリンパ系に関連したものが挙げられる。 Examples of fixed blood components are non-mobile blood components, tissue, membrane receptors, interstitial proteins, fibrin proteins, collagens, platelets, endothelial cells, epithelial cells, as well as membrane and membranous receptors bound thereto somatic, somatic cells, skeletal and smooth muscle cells, neuronal components, osteocytes and osteoclasts, as well as all body tissues include those associated with the particular circulation and lymphatic system. 可動性の血液成分の例は、任意の長期間、通常は5分を超えない期間、より一般的には1分間、位置が固定されない血液成分である。 Examples of mobile blood components are any long-term period usually not exceeding 5 minutes, more usually one minute, a blood component whose position is not fixed. これらの血液成分は、膜に結合しておらず、長期間、血液中に存在し、かつ少なくとも0.1μg/mlの最小濃度で存在している。 These blood components are not membrane bound, long term, present in the blood, and are present at a minimum concentration of at least 0.1 [mu] g / ml. 可動性の血液成分としては、血清アルブミン、トランスフェリン、IgMやIgGなどの免疫グロブリン、α プロテアーゼ阻害因子、抗トロンビンIII及びα −抗プラスミンが挙げられる。 The mobile blood components include serum albumin, transferrin, immunoglobulins such as IgM and IgG, alpha 1 protease inhibitor, antithrombin III and alpha 2 - antiplasmin, and the like. 可動性血液成分の半減期は、典型的には少なくとも約12時間である。 The half-life of mobile blood components is typically at least about 12 hours.

[00128]血液成分と改変された治療用ポリペプチド又はペプチドの間の共有結合の形成は、in vivo又はex vivoで起こり得る。 [00128] formation of a covalent bond between the blood component and the modified therapeutic polypeptide or peptide may occur in vivo or ex vivo. ex vivoでの共有結合形成の場合、血液、血清、又は血液成分、例えばヒト血清アルブミン若しくはIgGを含有する生理食塩水溶液に、改変されたポリペプチド又はペプチドを添加して、改変されたポリペプチド又はペプチドと血液成分の間の共有結合形成を可能にさせる。 For covalent bond formation in ex vivo, blood, serum, or blood components, for example in physiological saline solution containing human serum albumin or IgG, was added to the modified polypeptide or peptide, the modified polypeptide or It allows for covalent bond formation between the peptide and the blood component. また、マレイミド又は同様に反応性の高い化学基で改変ポリペプチドペプチドを修飾し、かつ生理食塩水溶液中で血液成分と反応させてもよい。 Moreover, modifying the modified polypeptide peptide maleimide or a similarly highly reactive groups, and may be reacted with a blood component in saline solution. 改変された治療用ポリペプチド又はペプチドを血液成分と反応させて、改変されたポリペプチド又はペプチドの結合物を形成させた後に、その結合物を患者に投与してよい。 The modified therapeutic polypeptide or peptide is reacted with the blood component, after forming the bond of the modified polypeptide or peptide may be administered the conjugate to a patient. あるいは、改変された治療用ポリペプチド又はペプチドと血液成分の間でin vivoで共有結合が形成するように、改変された治療用ポリペプチド又はペプチドを患者に直接投与してもよい。 Alternatively, as covalent bonds are formed by in vivo between the modified therapeutic polypeptide or peptide and the blood component, the modified therapeutic polypeptide or peptide may be administered directly to the patient. また、同じ反応を組換えタンパク質、例えばアルブミンを用いて実施してもよい。 Further, the same reaction may be carried out using a recombinant protein, such as albumin.

[00129]非特異的な改変された治療用ポリペプチド又はペプチドの化学的に反応性の基がin vivoで反応し得る様々な部位としては、細胞、特に赤血球細胞(赤血球)及び血小板、並びにIgG及びIgMを含む免疫グロブリン、血清アルブミン、フェリチン、ステロイド結合タンパク質、トランスフェリン、チロキシン結合タンパク質、α−2−マクログロブリンなどのタンパク質が挙げられる。 [00129] The various sites chemically reactive groups of the non-specific modified therapeutic polypeptide or peptide may react with in vivo, cells, particularly red blood cells (erythrocytes) and platelets, and IgG and immunoglobulins containing IgM, serum albumin, ferritin, steroid binding proteins, transferrin, thyroxin binding protein, and a protein such as alpha-2-macroglobulin.

[00130]改変されたポリペプチド又はペプチドは、チオールに結合する反応性基を含んでもよく、又は含むように化学的に改変してもよい。 [00130] modified polypeptides or peptides may comprise a reactive group attached to a thiol, or may be chemically modified to contain. 本発明の一実施形態では、改変されたポリペプチド又はペプチドは、ポリエチレングリコールに結合してもよい。 In one embodiment of the present invention, the modified polypeptide or peptide may be conjugated to polyethylene glycol. あるいは、改変されたポリペプチド又はペプチドは、ポリエチレングリコールで修飾された糖脂質又はポリエチレングリコールで修飾された脂肪酸に結合してもよい。 Alternatively, the modified polypeptide or peptide may be attached to the modified fatty acid glycolipids or polyethylene glycol which is modified with polyethylene glycol.

[00131]一態様では、改変されたポリペプチド又はペプチドは、その安定性を改善するために脂肪酸又は脂肪酸誘導体に結合してもよい。 [00131] In one aspect, the modified polypeptide or peptide may be attached to a fatty acid or fatty acid derivative to improve its stability. 脂肪酸の例としては、それだけには限らないが、ラウリン酸、パルミチン酸、オレイン酸、及びステアリン酸が挙げられる。 Examples of fatty acids include, but are not limited to, lauric acid, palmitic acid, oleic acid, and stearic acid. 脂肪酸誘導体の例としては、エチルエステル、プロピルエステル、コレステリルエステル、補酵素Aエステル、ニトロフェニルエステル、ナフチルエステル、モノグリセリド、ジグリセリド、及びトリグリセリド、脂肪アルコール、脂肪アルコールアセタートなどが挙げられる。 Examples of fatty acid derivatives, ethyl ester, propyl ester, cholesteryl esters, coenzyme A esters, nitrophenyl esters, naphthyl esters, monoglycerides, diglycerides, and triglycerides, fatty alcohols, such as fatty alcohols acetate.

[00132]別の態様では、改変されたポリペプチド又はペプチドは、薬物親和性複合体(DAC(商標))に作り変えてもよい。 In the 00132] In another aspect, the modified polypeptide or peptide drug affinity complex may be reshaped to (DAC (TM)). 薬物親和性複合体は3つの部分を有する:すなわち、生物活性を担う薬物成分;その薬物成分を反応性化学基に結合させる連結部;及び、体内の特定の標的タンパク質への構築物の持続的結合を担う、連結部と反対の末端側にある反応性化学基である。 Drug affinity complex has three parts: a drug component responsible for biological activity; persistent binding and body of the construct into specific target protein; connecting part to couple the drug component reactive chemical groups the responsible, a reactive chemical groups at the end side opposite to the connecting portion. 例えば、Kim他(2003年、Diabetes 52(3):751頁)では、GLP−1−アルブミン薬物親和性複合体を開示している。 For example, Kim et al. (2003, Diabetes 52 (3): 751 pp.) In discloses a GLP-1-albumin drug affinity complex. Kim他は、アルブミンを結合したDAC:GLP−1がGLP−1受容体(GLP−1R)に結合し、その受容体を発現している異種性の線維芽細胞においてcAMP形成を活性化したことを示している。 Kim et al, DAC bound albumin: the GLP-1 binds to GLP-1 receptor (GLP-1R), and activated cAMP formation in heterologous fibroblasts expressing the receptor the shows. これらの結果は、アルブミンを結合したDAC:GLP−1が天然のGLP−1を擬態していることを示唆する。 These results, DAC bound albumin: suggesting that GLP-1 has been mimicking the GLP-1 native. Kim他は、GLP−1Rシグナル伝達をより長い時間活性化するための新しい手法を提供している。 Kim et provides a new approach to longer time activates GLP-1R signaling.

[00133]改変されたポリペプチド又はペプチドの薬物親和性複合体は、皮下注射によって投与されるように設計され、その後、in vivoで迅速かつ選択的にアルブミンに結合する。 [00133] altered polypeptide or peptide drug affinity complex is designed to be administered by subcutaneous injection, then, quickly and selectively bind to albumin in vivo. 形成されたバイオコンジュゲートは、内因性のポリペプチド又はペプチドと同じ治療活性及び同様の効力を有するが、動物において、アルブミンのものにより近い薬物動態プロファイルを有する。 Formed bioconjugates have the same therapeutic activity and similar potency as endogenous polypeptide or peptide, in an animal, with a pharmacokinetic profile closer to that of albumin.

薬剤組成物 Pharmaceutical compositions
[00134]本発明は、DPP切断から部分的又は実質的に保護されているが機能的活性及び効力は実質的に保持している、改変された治療用ポリペプチド及びペプチドを含む薬剤組成物を提供する。 [00134] The present invention has been partially or substantially protected from DPP cleavage functional activity and potency are substantially retained, the pharmaceutical compositions comprising modified therapeutic polypeptides and peptides provide. このような薬剤組成物は、経口的に、血管内(IV)、動脈内(IA)、筋肉内(IM)、皮下(SC)、腹腔内、経皮など非経口的に投与することができる。 Such pharmaceutical compositions can be administered orally, intravascularly (IV), intraarterially (IA), intramuscular (IM), subcutaneously (SC), intraperitoneally, can be administered such as transdermal parenterally . 適切な場合には、輸注によって投与してもよい。 Where appropriate, it may be administered by infusion. いくつかの場合では、投与は経口、経鼻、直腸、経皮、又はエアロゾルでよく、その際、改変ポリペプチドは血管系に移行される。 In some cases, administration orally, nasal, rectally, percutaneously, or well in an aerosol, in which the modified polypeptide is migrated to the vascular system. 例えば、本発明の改変ポリペプチドをトランスフェリン部分に融合又は結合させると、その全体が参照により本明細書に組み入れられる国際出願PCT/US03/26778において記載されているように、トランスフェリン受容体への結合を介して、その改変ポリペプチドの血管系への輸送又は血液脳関門を通過しての輸送が可能になる。 For example, binding of the modified polypeptides of the present invention when fused or conjugated to transferrin moiety, as described in International Application PCT / US03 / 26778 in its entirety is incorporated herein by reference, to the transferrin receptor via a transport becomes possible through the transport or the blood brain barrier to the vascular system of the modified polypeptide. 通常、1回の注射が使用されるが、望ましいならば複数回の注射を用いてもよい。 Normally, one injection will be used, it may be used multiple injections if desired. 改変された治療用ポリペプチド又はペプチドは、注射器、トロカール、カテーテルなど任意の好都合な手段によって投与してよい。 Modified therapeutic polypeptide or peptide, a syringe, trocar, may be administered by any convenient means such as a catheter. 個々の投与様式は、単回ボーラス投与であるか持続投与であるかなど、投与される量に応じて変動すると考えられる。 The particular mode of administration, such as either a continuous administration or a single bolus dose, will vary depending upon the amount administered. 好ましくは血管内に投与され、この際、導入部位は本発明にとって重要ではないが、好ましくは血流が速い部位、例えば静脈内、末梢静脈、若しくは中心静脈である。 Preferably is administered intravascularly, this time, is not critical to the introduction sites present invention are preferably fast site bloodstream, for example intravenously, peripheral vein or central venous. より好ましくは、これらの薬剤組成物は、皮下投与される。 More preferably, these pharmaceutical compositions are administered subcutaneously. 投与が徐放技術又は保護マトリックスと一緒に行われる他の経路も使用してよい。 Other routes of administration are performed with slow release techniques or a protective matrix may also be used. 目的は、改変された治療用ペプチド又はポリペプチドが、血液成分又は組織成分と反応することができるように、例えば血液中に効果的に分布されることである。 Object is modified therapeutic peptides or polypeptides, to be able to react with the blood components or tissue component is to be effectively distributed, for example, in blood.

[00135]一般に、本発明は、有効量の本発明の改変された治療用ポリペプチド又はペプチドを、製薬上許容される希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、補助剤及び/又は担体と共に含む薬剤組成物を包含する。 [00135] In general, the present invention, the modified therapeutic polypeptide or peptide of an effective amount of the present invention, pharmaceutically acceptable diluents, preservatives, solubilizers, emulsifiers, together with auxiliaries and / or carriers It encompasses a pharmaceutical composition comprising. このような組成物は、様々な緩衝液内容物(例えばTris−HCl、酢酸塩、リン酸塩)、pH及びイオン強度の希釈剤;界面活性剤や可溶化剤(例えばポリソルベート80)、抗酸化剤(例えばアスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム)、保存剤(例えば、チメルソール(Thimersol)、ベンジルアルコール)、及び増量物質(例えばラクトース、マンニトール)などの添加剤;ポリ乳酸、ポリグリコール酸などのポリマー化合物の粒子状調製物又はリポソーム中への材料の組込みを含んでよい。 Such compositions, various buffer content (e.g., Tris-HCl, acetate, phosphate), pH and ionic strength; surfactants and solubilizing agents (e.g. polysorbate 80), antioxidant agent (such as ascorbic acid, sodium metabisulfite), preservatives (e.g., thimersol (Thimersol), benzyl alcohol), and bulking substances (eg, lactose, mannitol) additives such as; polylactic acid, polymeric compounds, such as polyglycolic acid of it may include materials embedded in the particulate preparation or liposome. ヒアルロン酸も使用してよく、これは、血液循環中での持続期間の延長を促進する効果を有し得る。 May also use hyaluronic acid, this may have the effect of promoting the extension of the duration in the circulation. このような組成物は、本発明のタンパク質及び誘導体の物理的状態、安定性、in vivoでの放出速度、及びin vivoでのクリアランス速度に影響し得る。 Such compositions will influence the physical state of the protein and derivatives of the present invention, stability can influence the clearance rate of the rate of release, and in vivo in in vivo. 例えば、参照により本明細書に組み入れられるRemington's Pharmaceutical Sciences、第18版(1990年、Mack Publishing Co.、イーストン、ペンシルバニア州、18042)1435〜1712頁を参照されたい。 For example, Remington's Pharmaceutical Sciences, which is incorporated herein by reference, 18th ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 18042), which is incorporated herein by reference pages from 1435 to 1712.

[00136]例えば、改変された治療用ポリペプチド又はペプチドは、例えば脱イオン水、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)、生理食塩水、水性エタノール又は他のアルコール、血漿、タンパク質性の溶液、マンニトール、グルコース水溶液、アルコール、植物油など生理学的に許容される媒体中で投与され得る。 [00136] For example, the modified therapeutic polypeptide or peptide, for example, deionized water, phosphate buffered saline (PBS), saline, aqueous ethanol or other alcohol, plasma, proteinaceous solutions, mannitol, aqueous glucose, alcohol, may be administered in a physiologically acceptable medium such as a vegetable oil. 含まれ得る他の添加剤としては、一般に約5〜10の範囲のpHに媒体を緩衝化し、一般に濃度が約50〜250mMの範囲である緩衝剤、一般に濃度が約5〜500mMの範囲である塩、生理学的に許容される安定化剤などが挙げられる。 Other additives which may be included, generally the medium to a pH of about 5 to 10 range in buffered, typically buffer concentration is in the range of about 50 to 250 mM, typically the concentration is in the range of about 5~500mM salts, and the like physiologically acceptable stabilizing agent. 特に注射用の生理学的緩衝液の例としては、ハンクス溶液及びリンガー溶液が挙げられる。 Examples of particularly physiological buffer for injection, and Hank's solution and Ringer's solution. 経皮製剤は、胆汁酸塩やフシダートなどの浸透剤を含んでもよい。 Transdermal formulations may contain penetrants such as bile salts or Fushidato.

[00137]薬剤組成物は、錠剤若しくは糖衣錠、舌下錠、サシェ、パケット(paquet)、軟ゼラチンカプセル剤、坐剤、クリーム剤、軟膏、皮膚用ゲル剤、経皮デバイス、エアロゾル、飲用可能なアンプル及び注射用アンプルとして調製してもよい。 [00137] The pharmaceutical compositions, tablets or dragees, sublingual tablets, sachets, packets (Paquet), soft gelatin capsules, suppositories, creams, ointments, dermal gels, transdermal devices, aerosols, drinkable ampoules and may be prepared as injectable ampoules. これらの組成物は、液状形態で調製してもよく、又は保管及び輸送に便利な凍結乾燥形態など乾燥させた粉末でもよい。 These compositions may be prepared in liquid form, or stored and may be powder dried such convenient lyophilized form for transport. 埋め込み可能な徐放製剤もまた、企図される。 Sustained release formulation implantable also contemplated.

経口剤形 Oral dosage form
[00138]一実施形態では、本発明は、参照により本明細書に組み入れられるRemington's Pharmaceutical Sciences(1990年)、第18版、(Mack Publishing Co.、イーストン、ペンシルバニア州、18042)で一般的に記載されている経口固形剤形中に、改変された治療用ポリペプチド又はペプチドを含む薬剤組成物を提供する。 [00138] In one embodiment, the present invention is, Remington's Pharmaceutical Sciences (1990 years), incorporated herein by reference, 18th edition, generally at (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 18042) the oral solid dosage forms described, provides pharmaceutical compositions comprising the modified therapeutic polypeptide or peptide. 固形剤形としては、錠剤、カプセル剤、丸剤、トローチ若しくはロゼンジ、カシェ剤、又はペレット剤が挙げられる。 Solid dosage forms include tablets, capsules, pills, troches or lozenges, cachets or pellets agents. また、リポソーム又はプロテイノイドによるカプセル化を使用して、(例えば米国特許第4925673号において報告されているプロテイノイドマイクロスフェアとして)本発明の組成物を調製してもよい。 Further, with the encapsulation by liposomes or proteinoid may be prepared (e.g. as proteinoid microspheres reported in U.S. Pat. No. 4,925,673) the composition of the present invention. リポソームによるカプセル化も使用することができ、かつ様々なポリマーでこれらのリポソームを誘導体化してもよい(例えば米国特許第5013556号)。 Encapsulation Liposomes also can be used, and may be derivatized to these liposomes with various polymers (e.g., U.S. Pat. No. 5,013,556). 治療用物質のために考え得る固形剤形は、参照により本明細書に組み入れられる、G. Solid dosage forms conceivable for the therapeutic agent, is incorporated herein by reference, G. S. S. Banker及びC. Banker and C. T. T. Rhodesによって編集されたMarshall,K. Marshall edited by Rhodes, K. 、Modern Pharmaceutics(1979年)の10章で説明されている。 , Are described in Chapter 10 of Modern Pharmaceutics (1979 years). 一般に、製剤は、改変された治療用ポリペプチド又はペプチド、並びに胃環境からの保護及び腸中での生物活性のある材料の放出を可能にさせる不活性成分を含む。 In general, the formulation comprises an inert component which allows release of the biologically active in protection and in the intestine from the modified therapeutic polypeptides or peptides, as well as the gastric environment material.

[00139]必要であれば、経口送達が有効になるように、改変された治療用ポリペプチド又はペプチドを化学的に改変してもよい。 If [00139] necessary, so that oral delivery is enabled, the modified therapeutic polypeptide or peptide may be chemically modified. 一般に、企図される化学的改変は、改変された治療用ポリペプチド又はペプチドそれ自体への少なくとも1つの部分の付加であり、前記部分により、胃又は腸から血流中への取込みが可能になる。 Generally, the chemical modification contemplated is the addition of at least one moiety to the modified therapeutic polypeptide or peptide itself, by the portion allows incorporation of the stomach or intestine into the blood stream . また、その化合物の全般的な安定性の上昇及び身体中での循環時間の増大も望まれる。 Further, also desired overall increase in stability and increase in circulation time in the body of the compound. 本発明において共有結合的に付加されたビヒクルとして有用な部分も、この目的のために使用してよい。 Moieties useful as covalently appended vehicle in the present invention also may be used for this purpose. このような部分の例としては、PEG、エチレングリコール及びプロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、並びにポリプロリンが挙げられる。 Examples of such moieties, PEG, copolymers of ethylene glycol and propylene glycol, carboxymethyl cellulose, dextran, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, and polyproline. 例えば、Abuchowski及びDavis、Soluble Polymer−Enzyme Adducts,Enzymes as Drugs(1981年)、Hocenberg及びRoberts編、Wiley−Interscience、ニューヨーク、ニューヨーク州、367〜83頁;Newmark他(1982年)、J. For example, Abuchowski and Davis, Soluble Polymer-Enzyme Adducts, Enzymes as Drugs (1981 years), Hocenberg and Roberts, eds, Wiley-Interscience, New York, NY, 367-83 pp; Newmark et al. (1982), J. Appl. Appl. Biochem. Biochem. 4:185〜9頁を参照されたい。 4: pp. 185-9. 使用され得る他のポリマーは、ポリ−1,3−ジオキソラン及びポリ−1,3,6−チオキソカン(tioxocane)である。 Other polymers that could be used are poly-1,3-dioxolane and poly-1,3,6-tioxocane (tioxocane). 先に示したように、薬学的使用に好ましいのはPEG部分である。 As indicated above, preferred for pharmaceutical uses are PEG moieties.

[00140]同様に、その全般的な安定性を上昇させ、又は経口送達を改善させるために、改変された治療用ポリペプチド又はペプチドを組換えによって別のポリペプチドに融合してもよい。 [00140] Similarly, the overall increased stability, or to improve oral delivery, the modified therapeutic polypeptide or peptide may be fused to another polypeptide by recombinant. 例えば、改変された治療用ポリペプチド又はペプチドを、トランスフェリン、メラノトランスフェリン又はラクトフェリンに融合してよい。 For example, the modified therapeutic polypeptide or peptide, transferrin, may be fused to melanotransferrin or lactoferrin. このような融合タンパク質を作製するための方法は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願第10/378,094号に記載されている。 Methods for making such fusion proteins are described in U.S. Patent Application No. 10 / 378,094 in its entirety is incorporated herein by reference.

[00141]経口送達剤形の場合、本発明の治療用化合物の吸収を促進するための担体として、N−(8−[2−ヒドロキシベンゾイル]アミノ)カプリル酸ナトリウム(SNAC)など改変された脂肪アミノ酸の塩を使用することも可能である。 [00141] For oral delivery dosage forms, as carriers for promoting the absorption of the therapeutic compounds of the present invention, N-(8- [2-hydroxybenzoyl] amino) fat that has been modified, such as sodium caprylate (SNAC) it is also possible to use the salt of the amino acid. SNACを用いたヘパリン製剤の臨床的有効性は、Emisphere Technologies社によって実施された第2相臨床試験において実証された。 Clinical efficacy of a heparin formulation using SNAC has been demonstrated in phase II trial conducted by Emisphere Technologies Corporation. その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5792451号「経口薬物送達組成物及び方法(Oral drug delivery composition and methods)」を参照されたい。 In its entirety is referred to herein incorporated U.S. Patent No. 5792451 "oral drug delivery composition and methods (Oral drug delivery composition and methods)" by reference.

[00142]本発明の改変された治療用ポリペプチド又はペプチドは、粒径約1mmの顆粒又はペレットの形態の微細な多粒子として製剤中に含めることができる。 [00142] modified therapeutic polypeptides or peptides of the present invention can be included in the formulation as fine multiparticulates in the form of granules or pellets of particle size about 1 mm. カプセル剤投与用の材料の製剤は、散剤、軽く圧縮された詰め物として、又はさらに錠剤としてでもよい。 The formulation of the material capsules for administration include powders, lightly as a compressed wadding, or even in a tablet. 治療用物質は、圧縮によって調製され得る。 Therapeutic agents may be prepared by compression.

[00143]着色剤及び矯味剤もすべて含まれ得る。 [00143] may include any coloring agents and flavoring agents. 例えば、改変された治療用ポリペプチド又はペプチドは、(リポソーム若しくはマイクロスフェアによるカプセル化などによって)配合してよく、次いで、着色剤及び矯味剤を含有する冷蔵飲料など食用の製品内にさらに含めてよい。 For example, the modified therapeutic polypeptides or peptides (such as by encapsulation liposomes or microspheres) may be formulated, then further include the colorants and the product edible such as a refrigerated beverage containing flavoring good.

[00144]不活性な材料を用いて本発明の薬剤組成物を希釈しても、又はその体積を増加させてもよい。 [00144] be diluted pharmaceutical compositions of the present invention with an inert material, or may increase its volume. これらの希釈剤としては、炭水化物、特にマンニトール、cc−ラクトース、無水ラクトース、セルロース、スクロース、改変デキストラン及びスターチを挙げることができる。 These diluents could include carbohydrates, especially mannitol, cc- lactose, it may be mentioned anhydrous lactose, cellulose, sucrose, modified dextrans and starch. 3リン酸カルシウム、炭酸マグネシウム及び塩化ナトリウムを含めて、いくつかの無機塩類も増量剤として使用してよい。 Tricalcium phosphate, including magnesium carbonate and sodium chloride, several inorganic salts may also be used as a bulking agent. いくつかの市販の希釈剤は、Fast−Flo、Emdex、STA−Rx1500、Emcompress及びAvicellである。 Some commercially available diluents are, Fast-Flo, Emdex, a STA-Rx 1500, Emcompress and Avicell.

[00145]治療用物質を固形剤形中に配合する際に、崩壊剤を含めてもよい。 [00145] In formulating a therapeutic agent in the solid dosage form may include a disintegrant. 崩壊剤として使用される材料としては、それだけには限らないが、デンプンをベースとする市販の崩壊剤であるエクスプロタブ(Explotab)を含めて、デンプンが挙げられる。 Materials used as disintegrants include but are not limited to, including Explotab is a commercial disintegrant based on starch (Explotab), include starch. グリコール酸デンプンナトリウム、アンバーライト(Amberlite)、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ウルトラミロペクチン(ultramylopectin)、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、橙皮、酸性カルボキシメチルセルロース、天然のスポンジ及びベントナイトもすべて使用してよい。 Sodium starch glycolate, Amberlite (Amberlite), sodium carboxymethylcellulose, ultramylopectin (ultramylopectin), sodium alginate, gelatin, orange peel, acid carboxymethyl cellulose, may be used any naturally occurring sponges and bentonite also. 崩壊剤の別の形態は、不溶性陽イオン交換樹脂である。 Another form of the disintegrants are the insoluble cationic exchange resins. 粉末状ゴムを崩壊剤及び結合剤として使用してよく、これらとしては、寒天、カラヤ又はトラガントなどの粉末状ゴムを挙げることができる。 Well powdered rubber used as disintegrants and binders, as these can include agar, powdered gums such as karaya or tragacanth. アルギン酸及びそのナトリウム塩も、崩壊剤として有用である。 Alginic acid and its sodium salt are also useful as disintegrants.

[00146]改変された治療用ポリペプチド又はペプチドを一緒にまとめて硬い錠剤を形成させるために、結合剤を使用してよく、アラビアゴム、トラガントゴム、デンプン及びゼラチンなど天然産物に由来する材料が挙げられる。 [00146] The modified therapeutic polypeptide or peptide to form a hard tablet and grouped together, often using a binder, include gum arabic, gum tragacanth, is a material derived from natural products such as starch and gelatin It is. 他には、メチルセルロース(MC)、エチルセルロース(EC)及びカルボキシメチルセルロース(MC)が挙げられる。 Other, methyl cellulose (MC), ethyl cellulose (EC) and carboxymethyl cellulose (MC) and the like. ポリビニルピロリドン(PVP)及びヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)の双方とも、治療用物質を顆粒化するためにアルコール液剤中で使用することができる。 Both polyvinylpyrrolidone (PVP) and hydroxypropylmethyl cellulose (HPMC), a therapeutic agent can be used in alcoholic solutions to granulate.

[00147]製剤工程の進行中の粘着を防止するために、本発明の薬剤組成物の調剤中に潤滑剤を含めてもよい。 [00147] In order to prevent sticking during the course of the preparation process, a lubricant may be included in the preparation of the pharmaceutical composition of the present invention. 改変された治療用ポリペプチド又はペプチドと金型壁の間の層として滑沢剤を使用してよく、これらとしては、それだけには限らないが、そのマグネシウム塩及びカルシウム塩を含むステアリン酸、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)、液体パラフィン、植物油、並びにワックスを挙げることができる。 May use the lubricant as a layer between the modified therapeutic polypeptide or peptide and the die wall, These include, but are not limited to, stearic acid including its magnesium and calcium salts, polytetra fluoroethylene (PTFE), liquid paraffin, can be mentioned vegetable oils and waxes. ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、様々な分子量のポリエチレングリコール、カーボワックス(Carbowax)4000及び6000など可溶性の滑沢剤も使用してよい。 Sodium lauryl sulfate, magnesium lauryl sulfate, polyethylene glycol of various molecular weights, lubricants soluble such as Carbowax (Carbowax) 4000 and 6000 may also be used.

[00148]調剤中の改変された治療用ポリペプチド又はペプチドの流動性を改善し得、かつ圧縮中の再配列を助けるための流動促進剤を添加してもよい。 [00148] The resulting improve the flow properties of the modified therapeutic polypeptide or peptide in preparations, and glidants to aid rearrangement during compression can be added. これらの流動促進剤としては、デンプン、タルク、発熱性シリカ及び含水シリコアルミナートを挙げることができる。 These glidants may include starch, talc, pyrogenic silica and hydrated silico aluminate.

[00149]本発明の改変された治療用ポリペプチド又はペプチドの水性環境中への溶解を促進するために、湿潤剤として表面活性剤を添加してもよい。 [00149] To facilitate the dissolution of the modified therapeutic polypeptides or peptides of the present invention into the aqueous environment, it may be added a surfactant as a wetting agent. 表面活性剤としては、ラウリル硫酸ナトリウム、スルホコハク酸ジオクチルナトリウム及びスルホン酸ジオクチルナトリウムなどの陰イオン性界面活性剤を挙げることができる。 As the surface active agent include sodium lauryl sulfate, an anionic surfactant such as sodium dioctyl sulfosuccinate and dioctyl sodium sulfonate. 陽イオン性界面活性剤を使用してもよく、これらとしては塩化ベンザルコニウム又は塩化ベンゼトニウムを挙げることができる。 May be used cationic surfactants, these Examples may be mentioned benzalkonium chloride or benzethonium chloride. 表面活性剤として製剤中に含めることができる有望な非イオン性界面活性剤のリストは、ラウロマクロゴール400、ステアリン酸ポリオキシル40、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油10、50及び60、モノステアリン酸グリセロール、ポリソルベート40、60、65及び80、スクロースの脂肪酸エステル、メチルセルロース、並びにカルボキシメチルセルロースである。 The list of potential nonionic surfactants that can be included in the formulation surfactants are lauromacrogol 400, polyoxyl 40 stearate, polyoxyethylene hydrogenated castor oil 10, 50 and 60, glycerol monostearate, polysorbate 40, 60, 65 and 80, fatty acid esters of sucrose, methyl cellulose, and carboxymethyl cellulose. これらの表面活性剤は、単独で又は異なる比率での混合物として、タンパク質又は誘導体の製剤中に存在することができる。 These surface active agents, as a mixture of singly or different ratios, can be present in the formulation of the protein or derivative.

[00150]改変された治療用ポリペプチド及びペプチドの取込みを向上させるための添加剤も製剤中に含めてよい。 [00150] Additives for improving the uptake of modified therapeutic polypeptides and peptides may also be included in the formulation. この特性を潜在的に有する添加剤は、例えば脂肪酸のオレイン酸、リノール酸及びリノレン酸である。 Additives with the characteristic potential, for example fatty oleic acid, linoleic acid and linolenic acid.

[00151]制御放出製剤もまた、望ましいことがある。 [00151] Controlled release formulations may also be desirable. 本発明の改変された治療用ポリペプチド又はペプチドは、拡散又は浸出機序のいずれかによる放出を可能にする不活性なマトリックス、例えばゴム中に混和させることができる。 Modified therapeutic polypeptides or peptides of the present invention, can be incorporated inert matrix which permits release by either mechanism diffusion or leaching machine, for example in the rubber. 緩徐に変質するマトリックス、例えばアルギナート、多糖も、製剤中に混和させてよい。 Matrix alteration slowly, for example alginates, polysaccharides, may also is incorporated into the formulation. 本発明の化合物の制御放出の別の形態は、オロス(Oros)治療系(AlzaCorp.社)、すなわち水が浸入し、浸透圧作用によって単一の小さな孔から薬物を押し出すことを可能にする半透膜中に薬物が封入されている系に基づく方法による。 Another form of a controlled release of the compounds of the present invention, Oros (Oros) treatment system (AlzaCorp. Companies), i.e. water penetrates, makes it possible to push the drug from a single small hole by osmotic action half by a method based on the system in which the drug is encapsulated in semipermeable membrane. 一部の腸溶コーティングもまた、放出遅延効果を有している。 Some enteric coatings also have a delayed release effect.

[00152]他のコーティング剤を製剤用に使用してもよい。 [00152] may use other coatings for the formulation. これらには、コーティングパン中で適用することができる様々な糖が含まれる。 These include a variety of sugars which could be applied in a coating pan. 改変された治療用ポリペプチド又はペプチドは、フィルムコーティング錠中で与えることもでき、この場合に使用される材料は、2つのグループに分けられる。 Modified therapeutic polypeptides or peptides may also be given in a film coated tablet, the material used in this case are divided into two groups. 1つめは、非腸溶性の材料であり、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシ−エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピル−メチルセルロース、カルボキシ−メチルセルロースナトリウム、プロビドン、及びポリエチレングリコールが挙げられる。 The first is the material of the non-enteric, methyl cellulose, ethyl cellulose, hydroxyethyl cellulose, methyl hydroxyethyl - cellulose, hydroxypropyl cellulose, hydroxypropylmethyl - cellulose, carboxy - methyl cellulose sodium, providone and polyethylene glycol. 2つめのグループは、一般にフタル酸のエステルである腸溶性材料からなる。 The second group consists of the enteric materials that are commonly esters of phthalic acid.

[00153]最適なフィルムコーティングを提供するために材料の混合物を使用してもよい。 [00153] it is also possible to use mixtures of materials to provide the optimum film coating. フィルムコーティングは、パンコーティング装置若しくは流動層中で、又は圧縮コーティングによって実施することができる。 Film coating may be carried out in a pan coating apparatus or a fluidized bed or by compression coating.

肺送達形態 Pulmonary delivery forms
[00154]別の実施形態では、本発明は、肺送達用の改変された治療用ポリペプチド又はペプチドを含む薬剤組成物も提供する。 [00154] In another embodiment, the present invention also provides pharmaceutical compositions comprising the modified therapeutic polypeptides or peptides for pulmonary delivery. この薬剤組成物は、吸息の間に哺乳動物の肺に送達され、かつ肺の上皮層を通過して血流に入る。 The pharmaceutical compositions may be delivered to the lungs of a mammal while inspiration, and enters the blood stream through the epithelial layer of the lung.

[00155]本発明は、それだけには限らないが、すべて当業者には良く知られているネブライザー、計量吸入器及び粉末吸入器を含めて、治療用製品を肺に送達するために設計された多様な機械器具の使用を提供する。 [00155] The present invention is diverse but are not limited to, all nebulizer which is well known to those skilled in the art, including metered dose inhalers and powder inhalers, designed therapeutic product for delivery to the pulmonary It provides for the use of such machinery and equipment. 本発明の実施に適した市販の器具のいくつかの具体的な例は、Mallinckrodt,Inc. Some specific examples of commercially available instruments suitable for the practice of the present invention, Mallinckrodt, Inc. 社(セントルイス、ミズーリ州)製のウルトラベント(Ultravent)ネブライザー;Marquest Medical Products社(エングルウッド、コロラド州)製のアコーン(Acorn)IIネブライザー;Glaxo,Inc. Company (St. Louis, MO) made of Ultra vent (Ultravent) nebulizer; Marquest Medical Products, Inc. (Englewood, CO) manufactured by Acorn (Acorn) II nebulizer; Glaxo, Inc. 社(Research Triangle Park、ノースカロライナ州)製のベントリン(Ventolin)計量吸入器;及びFisons Corp. Inc. (Research Triangle Park, NC) made of Bentorin (Ventolin) metered dose inhaler; and Fisons Corp. 社(ベッドフォード、マサチューセッツ州)製のスピンバラー(Spinbaler)粉末吸入器である。 Inc. (Bedford, MA) is made of Supinbara (Spinbaler) powder inhaler.

[00156]このような器具はすべて、改変された治療用ポリペプチド及びペプチドの投薬に適した製剤の使用を必要とする。 [00156] require the use of formulations suitable for the dispensing of all such instruments, modified therapeutic polypeptides and peptides. 典型的には、各製剤は、使用される器具のタイプに特異的であり、治療法に有用な希釈剤、補助剤及び/又は担体に加えて、適切な噴霧物質の使用を伴い得る。 Typically, each formulation is specific to the type of instruments used, diluents useful in therapy, in addition to auxiliaries and / or carriers, may involve the use of an appropriate spray material.

[00157]改変された治療用ポリペプチド又はペプチドは、最も有利には、遠位の肺への最も効果的な送達のために、平均粒径が10μm未満、最も好ましくは0.5〜5μmの微粒子形態で調製されるべきである。 [00157] modified therapeutic polypeptides or peptides, most advantageously, for most effective delivery to the distal lung, the mean particle size of less than 10 [mu] m, and most preferably of 0.5~5μm It should be prepared in particulate form.

[00158]製薬上許容される担体としては、トレハロース、マンニトール、キシリトール、スクロース、ラクトース、及びソルビトールなどの炭水化物が挙げられる。 [00158] Pharmaceutically acceptable carriers, trehalose, mannitol, xylitol, sucrose, lactose, and include carbohydrates such as sorbitol. 製剤中で使用するための他の成分としては、DPPC、DOPE、DSPC及びDOPCを挙げることができる。 Other ingredients for use in formulations may include DPPC, DOPE, the DSPC and DOPC. 天然又は合成の表面活性剤を使用してよい。 It may be used surface active agents of natural or synthetic. PEGも(タンパク質又は類似体の誘導体化におけるその使用は別としてさらに)使用してよい。 PEG also (its use in derivatizing the protein or analog further apart) may be used. シクロデキストランなどのデキストランも使用してよい。 Dextran, such as cyclo dextran may also be used. 胆汁酸塩及び他の関連した促進物質も使用してよい。 Bile salts and other related promoting substances may also be used. セルロース及びセルロース誘導体も使用してよい。 Cellulose and cellulose derivatives may also be used. 緩衝製剤における使用などアミノ酸も使用してよい。 Amino acids such as use in a buffer formulation may also be used.

[00159]また、リポソーム、マイクロカプセル若しくはマイクロスフェア、包接錯体又は他のタイプの担体の使用も企図される。 [00159] In addition, liposomes, microcapsules or microspheres, the use of inclusion complexes, or other types of carriers is contemplated.

[00160]ジェット式又は超音波式のネブライザーを用いて使用するのに適した製剤は、典型的には、溶液1mL当たり生物活性のあるタンパク質が約0.1〜25mg含まれる濃度で水中に溶解された本発明の化合物を含む。 [00160] Formulations suitable for use with a jet or ultrasonic nebulizer is typically dissolved in water at a concentration of protein of the solution 1mL per bioactivity contained about 0.1~25mg comprising a compound of the invention has been. この製剤はまた、(例えばタンパク質安定化及び浸透圧調節のために)緩衝剤及び単糖も含んでよい。 The formulations may also (e.g., for protein stabilization and regulation of osmotic pressure) may also comprise buffering agents and monosaccharides. ネブライザー製剤はまた、エアロゾルを形成する際の溶液の噴霧化によって引き起こされる、表面で誘発されるタンパク質の凝集を低減又は防止するために、表面活性剤も含んでよい。 Nebulizer formulation may also be caused by atomization of the solution in forming the aerosol, in order to reduce or prevent aggregation of the protein induced by the surface it may also comprise a surface active agent.

[00161]計量吸入器を用いた使用のための製剤は、一般に、表面活性剤の助けにより噴霧剤中に懸濁された本発明の化合物を含む、微粉砕された粉末を含む。 Formulations for use with [00161] metered dose inhalers generally comprise a compound of the invention suspended in a propellant with the aid of a surface active agent, including finely divided powders. 噴霧剤は、トリクロロフルオルメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール及び1,1,1,2−テトラフルオロエタン、又はそれらの組合せを含めて、クロロフルオロカーボン、ヒドロクロロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボン又は炭化水素などこの目的用に使用される任意の従来の材料でよい。 Sprays trichloro fluoroalkyl methane, dichlorodifluoromethane, dichlorotetrafluoroethane ethanol and 1,1,1,2-tetrafluoroethane, or including a combination thereof, chlorofluorocarbons, hydrochlorofluorocarbons, hydrofluorocarbon, or hydrocarbon etc. may be any conventional material used for this purpose. 適切な表面活性剤としては、トリオレイン酸ソルビタン及び大豆レシチンが挙げられる。 Suitable surface active agents include sorbitan trioleate and soya lecithin. オレイン酸もまた、表面活性剤として有用となり得る。 Oleic acid also may be useful as a surface active agent.

[00162]粉末吸入器から投薬するための製剤は、本発明の化合物を含む微粉砕された乾燥粉末を含み、かつラクトース、ソルビトール、スクロース、マンニトール、トレハロース又はキシリトールなどの増量剤を、器具からの粉末の分散を促進する量、例えば製剤の約50〜90重量%の量で含んでもよい。 [00162] Formulations for dispensing from a powder inhaler, comprises a dry powder that is pulverized comprising a compound of the present invention, and lactose, sorbitol, sucrose, mannitol, bulking agents such as trehalose or xylitol, from the instrument amounts which facilitate dispersal of the powder, for example, may be in an amount of about 50 to 90% by weight of the formulation.

経鼻送達形態 Nasal delivery form
[00163]本発明の改変されたポリペプチド又はペプチドの薬剤組成物の経鼻送達も企図される。 [00163] Nasal delivery of the modified polypeptides or peptides of the pharmaceutical compositions of the invention are also contemplated. 経鼻送達は、改変された治療用ポリペプチド又はペプチドを鼻に投与した後にそのタンパク質が直接血流に移動することを可能にし、肺に製品を沈着させる必要が無い。 Nasal delivery allows that the protein the modified therapeutic polypeptide or peptide after administration to the nose is moved directly into the bloodstream, it is not necessary to deposit the product in the lung. 経鼻送達用の製剤としては、デキストラン又はシクロデキストランを含むものが挙げられる。 Formulations for nasal delivery include those with dextran or cyclodextran. 他の粘膜を通過する輸送を介した送達も開示される。 Delivery via transport across other mucous membranes is also disclosed.

投薬量 Dosage
[00164]前述した状態の治療のための方法において使用される投与計画は、薬物の作用を変化させる様々な要因、例えば患者の年齢、状態、体重、性別及び食生活、感染症があればその重症度、投与時間、並びに他の臨床的要因を考慮して、主治医によって決定される。 [00164] The dosage regimen that can be used in a method for treatment of the conditions described above, the if various factors which modify the action of drugs, eg the age, condition, body weight, sex and diet, infections severity, time of administration, as well as taking into account other clinical factors, as determined by the attending physician. 一般に、毎日の投薬量は、体重1キログラム当たり本発明の化合物0.01〜1000マイクログラム、好ましくは1キログラム当たり0.1〜150マイクログラムの範囲であるべきである。 In general, the daily dosage, compounds 0.01 to 1000 micrograms of the present invention per kilogram of body weight, should preferably in the range of 0.1 to 150 micrograms per kilogram.

改変された治療用タンパク質を用いた疾患の治療 Treatment of disease using the modified therapeutic protein
[00165]本発明は、様々な疾患の治療において使用することができる様々なトランスフェリン融合タンパク質を提供する。 [00165] The present invention provides various transferrin fusion proteins that can be used in the treatment of various diseases. 例えば、本発明の融合ポリペプチド又はペプチドを含む薬剤組成物は、それだけには限らないが、インスリン抵抗性、高血糖症、高インスリン血症、又は遊離脂肪酸若しくはグリセロールの高い血中レベル、高脂血症、肥満、X症候群、代謝異常症候群、炎症、糖尿病合併症、糖恒常性障害、耐糖能障害、II型糖尿病、糖尿病前症、高トリグリセリド血症、アテローム性動脈硬化症、神経系障害、うっ血性心不全、消化不良及び過敏性腸症候群などの疾患を治療するのに使用することができる。 For example, pharmaceutical compositions comprising the fusion polypeptides or peptides of the present invention, it is but not limiting of, insulin resistance, hyperglycemia, hyperinsulinemia, or free fatty acids or high blood levels of glycerol, hyperlipidemia , obesity, X syndrome, metabolic syndrome, inflammation, diabetic complications, glucose homeostasis disorder, impaired glucose tolerance, II diabetes, prediabetes, hypertriglyceridemia, atherosclerosis, nervous system disorders, congestive sex heart failure, it can be used to treat diseases such as dyspepsia and irritable bowel syndrome. 改変されたポリペプチド及びペプチドは、CNSを活性化するため、又は手術後治療のためにCNSに対する抗不安効果を誘導するのにも使用することができる。 Modified polypeptides and peptides can also be used to induce an anxiolytic effect on the CNS for to activate, or after surgery treating CNS.

[00166]本発明の改変された治療用ポリペプチド及びペプチドは、トランスフェリン若しくは改変トランスフェリンに融合されており、又はDPP活性から部分的若しくは実質的に保護されているため、未改変の治療用ポリペプチド及びペプチドよりもin vivoでより安定である。 [00166] modified therapeutic polypeptides and peptides of the present invention is fused to transferrin or modified transferrin or because it is partially or substantially protected from DPP activity, the therapeutic polypeptide of unmodified and it is more stable in vivo than the peptide. したがって、効果的な治療のために、より少量の分子を投与してよい。 Therefore, for effective treatment, it may be administered smaller amounts of the molecule. 低投薬量では、場合によっては副作用が軽減され得る。 At low dosages, side effects in some cases can be alleviated.

[00167]一実施形態では、本発明の改変された治療用ポリペプチド及びペプチドを鎮静薬として使用してよい。 [00167] In one embodiment, it may use the modified therapeutic polypeptides and peptides of the present invention as a sedative. したがって、本発明は、本発明の改変されたポリペプチド又はペプチドを用いた、中枢又は末梢の神経系の活動化増大をもたらす、異常を有する哺乳動物対象を鎮静させる方法を提供する。 Accordingly, the present invention, the modified polypeptides or peptides of the present invention is used, resulting in activation increase of the nervous system of the central or peripheral provides a method of sedating a mammalian subject with an abnormality. この方法は、対象に鎮静効果又は抗不安効果をもたらすのに十分な量の改変された治療用ポリペプチド又はペプチドを対象に投与するステップを含む。 The method comprises administering to the subject a sufficient amount of modified therapeutic polypeptide or peptide to provide a sedative effect or an anti-anxiety effect to the subject. 改変された治療用ポリペプチド又はペプチドは、脳室内に、経口的に、皮下に、筋肉内に又は静脈内に投与してよい。 Modified therapeutic polypeptide or peptide, intraventricularly, orally, subcutaneously, may be administered intramuscularly or intravenously. このような方法は、不安、運動障害、精神病、攻撃性、発作、パニック発作、ヒステリー及び睡眠障害などの神経系の状態を治療又は寛解させるのに有用である。 Such methods, anxiety, movement disorders, psychosis, aggression, seizures, are useful for treating or ameliorating the condition of the nervous system, such as panic attacks, hysteria and sleep disorders.

[00168]さらに、本発明は、対象に活動化効果をもたらすのに十分な量の改変された治療用ポリペプチド又はペプチドを対象に投与するステップを含む、哺乳動物対象の活動性を高める方法も包含する。 [00168] Furthermore, the present invention includes the step of administering to the subject a sufficient amount of modified therapeutic polypeptide or peptide to effect an activation effect to the subject, a method of increasing the activity of a mammalian subject It encompasses. この対象は、中枢又は末梢の神経系の活動化の低下をもたらす状態を有している。 The subject has a condition resulting in decreased activation of the nervous system of the central or peripheral. 改変された治療用ポリペプチド又はペプチドは、中枢神経系の覚醒が有利となり得るいくつかの状態を挙げてみると、うつ病、分裂情動性障害、睡眠時無呼吸、集中力の乏しい注意欠陥障害、記憶力減退、健忘症及びナルコレプシーの治療又は改善に有用である。 Modified therapeutic polypeptide or peptide, the awakening of the central nervous system try are some conditions that may be advantageous, depression, schizoaffective disorders, sleep apnea, poor attention deficit disorder of concentration , memory power loss, are useful in the treatment or amelioration of forgetfulness and narcolepsy.

[00169]また、特定のタイプの手術、待期的腹部手術の後に起こるインスリン抵抗性は術後1日目に最も甚だしく、少なくとも5日間続き、かつ正常にするのに最長3週間を要することがある。 [00169] In addition, certain types of surgery, insulin resistance occurring after elective abdominal surgery most severely on the first day after surgery, it may take up to three weeks to at least 5 days lasts, and normal is there. したがって、術後の患者は、手術の外傷に続く一定期間、本発明の改変されたインスリン分泌促進ペプチドの投与を必要とし得る。 Thus, postoperative patients, a certain period following the trauma of surgery may require administration of the modified insulinotropic peptides of the present invention. したがって、本発明の改変された治療用ポリペプチド又はペプチドは、手術後の治療のために利用することができる。 Thus, modified therapeutic polypeptides or peptides of the present invention can be utilized for the treatment after surgery. 患者は、手術が患者に実施される前の約1〜16時間、患者の手術中、及び患者の手術後約5日以下の期間、本発明の改変されたインスリン分泌促進ペプチドを必要としている。 Patients about 1-16 hours before surgery is performed on the patient, and the patient's surgery, and about 5 days following the period after surgery patients, requires modified insulinotropic peptides of the present invention.

[00170]さらに、インスリン分泌促進ペプチドなど本発明の改変された治療用ポリペプチド及びペプチドは、手術後治療における使用とは別に、インスリン抵抗性を治療するのに利用してもよい。 [00170] In addition, the modified therapeutic polypeptides and peptides of the present invention, such as exendins, apart from the use in the postoperative treatment, may be utilized to treat insulin resistance. インスリン抵抗性は、細胞表面受容体へのインスリンの結合の減少、又は細胞内代謝の変化に起因し得る。 Insulin resistance may be due to changes in the reduced binding of insulin to cell-surface receptors, or intracellular metabolism. インスリン感受性の低下として特徴付けられる第1のタイプは、通常、インスリン濃度の上昇によって克服することができる。 The first type, characterized as a decrease in insulin sensitivity, can typically be overcome by increased insulin concentration. インスリン応答性の低下として特徴付けられる第2のタイプは、多量のインスリンによって克服することはできない。 The second type, characterized as a decrease in insulin responsiveness, can not be overcome by large quantities of insulin. 外傷に続いて起こるインスリン抵抗性は、インスリン抵抗性の程度に比例した用量のインスリンによって克服することができ、したがって、インスリン感受性の低下によって引き起こされるようである。 Insulin resistance occurs following trauma can be overcome by doses of insulin that are proportional to the degree of insulin resistance, therefore, likely to be caused by a decrease in insulin sensitivity.

[00171]好ましくは、本発明は、グルコース依存性、インスリン依存性、及びインスリン非依存性の機序を介して高血糖症を正常化するための改変されたインスリン分泌促進ペプチドを提供する。 [00171] Preferably, the present invention provides glucose-dependent, insulin-dependent, and the modified insulinotropic peptides to normalize hyperglycemia through insulin-independent mechanisms. したがって、改変されたインスリン分泌促進ペプチドは、糖尿病、特にII型糖尿病の治療用の主要作用物質として有用である。 Accordingly, the modified insulinotropic peptides are diabetes, particularly useful as the main agent for the treatment of type II diabetes. 本発明は、ペプチドの作用が血液のグルコース濃度に依存しており、したがって血糖降下の副作用のリスクが、現在の治療方法を用いた際のリスクより大幅に低減されているという点で、I型及びII型双方の糖尿病の患者の治療に特に適している。 The present invention is dependent on the glucose concentration of action blood peptide, thus the risk of side effects of hypoglycemic is, in that it is greatly reduced than the risks of using current methods of treatment, I type It is particularly suitable for the treatment of patients with and type II both diabetes.

[00172]患者の血中グルコースレベルを正常化するのに効果的な改変されたインスリン分泌促進ペプチドの用量は、いくつかの要因に依存すると考えられ、例としては、それだけには限らないが、患者の性別、体重、及び年齢、血中グルコース調節不能の重症度、血中グルコース調節不能を引き起こしている原因、グルコース又は別の炭水化物供給源が同時に投与されるかどうか、投与経路及び生物学的利用能、体内での持続性、処方、並びに効力が挙げられる。 [00172] Dose effective modified exendins to normalize blood glucose levels in patients is believed to depend on several factors, examples include, but are not limited to, patients the sex, weight, and age, the severity of the blood glucose dysregulation, whether, route of administration and bioavailability is causing blood glucose regulation impossible, glucose or another carbohydrate source is simultaneously administered ability, persistence in the body, the formulation, as well as efficacy.

[00173]好ましくは、インスリン分泌促進ペプチドなど本発明の改変された治療用ペプチドは、耐糖能障害、糖尿、高脂血症、代謝性酸性血症(acidoses)、糖尿病、糖尿病性神経障害及び腎障害の治療用に使用される。 [00173] Preferably, the modified therapeutic peptides of the present invention, such as exendins are impaired glucose tolerance, diabetes, hyperlipidemia, metabolic acidemia (acidoses), diabetes, diabetic neuropathy and renal It is used for the treatment of disorders. より好ましくは、改変ペプチドは、II型糖尿病の治療用の改変GLP−1及びその類似体である。 More preferably, the modified peptide is modified GLP-1 and analogs thereof for the treatment of type II diabetes.

改変された治療用ポリペプチド及びペプチドの存在のモニタリング Presence monitoring of the modified therapeutic polypeptides and peptides
[00174]改変された治療用ポリペプチド及びペプチドは、機能的活性を測定するためのアッセイ、HPLC−MS又はポリペプチド若しくはペプチドを標的とする抗体を用いて、モニターすることができる。 [00174] modified therapeutic polypeptides and peptides, assays for measuring the functional activity, the HPLC-MS or polypeptide or peptide with antibodies that target can be monitored. 例えば、改変された治療用ポリペプチド若しくはペプチドの活性及び/又は改変された治療用ポリペプチド若しくはペプチドの存在について、哺乳動物宿主の血液をモニターすることができる。 For example, it is possible to monitor the modified for the presence of a therapeutic polypeptide or peptide activity and / or modified therapeutic polypeptides or peptides, The blood of the mammalian host. 様々な時点で宿主の血液の一部分又は試料を採取することによって、改変された治療用ポリペプチド又はペプチドが、治療活性を有するのに十分な量で寿命の長い血液成分に結合されたかどうか、また、その後の血中の改変された治療用ポリペプチド又はペプチドのレベルを測定することができる。 By collecting the blood of the host of a portion or sample at various times, whether modified therapeutic polypeptide or peptide, coupled to a long blood components lived in an amount sufficient to have a therapeutic activity and it can measure the level of modified therapeutic polypeptides or peptides subsequent blood. 望ましいならば、改変されたインスリン分泌促進ペプチドなど改変された治療用ポリペプチド又はペプチドがどの血液成分に結合しているかも測定することができる。 If desired, it is possible to measure may modified therapeutic polypeptides or peptides such as modified insulinotropic peptide is attached to any blood components.

[00175]例として、インスリン分泌促進活性に関するアッセイを、本発明の改変されたインスリン分泌促進ペプチドをモニターするのに使用してよい。 As [00175] Example, the assay for insulinotropic activity may be used to monitor the modified insulinotropic peptides of the present invention. 本発明の改変されたインスリン分泌促進ペプチドは、未改変のインスリン分泌促進ペプチドのインスリン分泌促進活性に少なくとも等しいインスリン分泌促進活性を有する。 It modified insulinotropic peptides of the present invention have at least equal insulinotropic activity insulinotropic activity of unmodified insulinotropic peptide. 改変されたインスリン分泌促進ペプチドのインスリン分泌促進特性は、改変ペプチドを動物細胞に与え、又はそのペプチドを動物に注射し、培地又はその動物の循環系中への免疫反応性インスリンの放出をそれぞれモニターすることによって測定することができる。 Insulinotropic property of a modified insulinotropic peptide, give the modified peptide to animal cells, or the peptide and injected into animals, the culture medium or each monitoring the release of immunoreactive insulin into the animal's circulatory system in it can be measured by. 免疫反応性インスリンの存在は、インスリンを特異的に検出することができるラジオイムノアッセイの使用によって検出される。 The presence of immunoreactive insulin is detected by use of a radioimmunoassay which can detect insulin specifically. IRIの存在を検出できる任意のラジオイムノアッセイを使用してよいが、その全体が参照により本明細書に組み入れられるAlbano,J. May use any radioimmunoassay capable of detecting the presence of IRI is, the entirety of which is incorporated herein by reference Albano, J. D. D. M. M. 他、(1972年 Acta Endocrinol.70:487〜509頁)のアッセイ法の改良法を用いることが好ましい。 Other, (1972 Acta Endocrinol.70: 487~509 pages) it is preferable to use a modification of the assay method.

[00176]改変された治療用ポリペプチド又はペプチドのインスリン分泌促進特性はまた、膵臓灌流(infusion)によって測定することもできる(参照により本明細書に組み入れられるPenhos,J.C.他 1969年 Diabetes 18:733〜738頁)。 [00176] The modified insulinotropic properties of a therapeutic polypeptide or peptide may also, Penhos, incorporated herein by also possible (see be determined by pancreatic perfusion (infusion), J.C. Other 1969 Diabetes 18: 733-738 pages). 灌流を実施、改良、及び分析する様式は、参照により本明細書に組み入れられるWeir,G. Implementing perfusion, improvements, and manner of analyzing, Weir, incorporated herein by reference, G. C. C. 他、(J.Clin.Investigat.54:1403〜1412頁(1974年)の方法に従う。 Other, (J.Clin.Investigat.54: according to the method of the 1,403 to 1,412 pages (1974).

[00177]当業者には周知であるように、質量分析法(MS)と連結されたHPLCを利用して、改変された治療用ポリペプチド及びペプチドの存在を解析することもできる。 [00177] As is known to those skilled in the art, using the HPLC coupled with mass spectrometry (MS), the presence of modified therapeutic polypeptides and peptides may also be analyzed. 典型的には、0.1%TFA/水や0.1%TFA/アセトニトリルなど2種の移動相が使用される。 Typically, two mobile phases, such as 0.1% TFA / water and 0.1% TFA / acetonitrile are used. カラム温度、並びに勾配条件も変更することができる。 Column temperature, as well as gradient conditions can be modified.

[00178]改変された治療用ポリペプチド及びペプチドの存在をモニターするための別の方法は、それらの改変された治療用ポリペプチド及びペプチドに特異的な抗体を使用するものである。 [00178] modified therapeutic polypeptides and peptides Another method for monitoring the presence of is to use antibodies specific to their modified therapeutic polypeptides and peptides. 特定の改変された治療用ポリペプチド又はペプチドに対する特異性を有する、モノクローナル又はポリクローナルの抗体の使用は、このような問題を解決する助けとなり得る。 With specificity for particular modified therapeutic polypeptides or peptides, the use of monoclonal or polyclonal antibodies may help to solve this problem. 抗体は、特定の改変された治療用ポリペプチド若しくはペプチドで、又はその作用物質の免疫原性断片若しくはその作用物質の抗原決定基に対応する合成免疫原で免疫された宿主から作製又は誘導することができる。 Antibodies, in particular modified therapeutic polypeptide or peptide, or be made or derived from an immunized host with the corresponding synthetic immunogen antigenic determinant of an immunogenic fragment or agents of the agent can. 好ましい抗体は、改変された治療用ポリペプチド又はペプチドに対して高い特異性及び親和性を有すると考えられる。 Preferred antibodies are believed to have a high specificity and affinity for the modified therapeutic polypeptide or peptide. このような抗体は、酵素、蛍光色素、又は放射標識物質で標識することもできる。 Such antibodies, enzymes, can be a fluorescent dye, or also be labeled with a radiolabeled substance.

[00179]これらの抗体は、血流中の改変された治療用ポリペプチド及びペプチドの存在をモニターするために使用してもよい。 [00179] These antibodies may be used to monitor the presence of modified therapeutic polypeptides and peptides in the blood stream. 血液及び/又は血清試料は、SDS−PAGE及びウェスタンブロット法によって解析してもよい。 Blood and / or serum samples may be analyzed by SDS-PAGE and Western blotting. このような技術により、血液又は血清の解析をして、改変された治療用ポリペプチド又はペプチドの血液成分への結合を測定することが可能になる。 Such techniques, and analysis of blood or serum, it is possible to measure the binding of blood components modified therapeutic polypeptide or peptide.

グルカゴン様ペプチド−1(GLP−1) Glucagon-like peptide -1 (GLP-1)
[00180]組換えDNA技術を使用して、安定性及び生物活性の増大した新しい分子を作り出した。 [00180] Using recombinant DNA technology, they produced a new molecule with increased stability and biological activity. これらの分子は、免疫グロブリンのFc部分、アルブミン、及びトランスフェリンなど天然に長い半減期を有する安定化タンパク質に融合された生物活性のあるタンパク質及びペプチドの組合せである。 These molecules, Fc portion of an immunoglobulin, albumin, and transferrin is a combination of proteins and peptides with naturally fused to stabilize proteins with a longer half-life biological activity like. これらの融合分子は、融合されていない天然のタンパク質又はペプチド対応物よりはるかに長い薬物動態を有する活性部分の生物活性を保持している。 These fusion molecules retain the biological activity of the protein or active portion having a much longer pharmacokinetics than peptide counterparts of natural unfused. 薬物動態の上昇はまた、生物活性を改善し、望まれない副作用を低減させ、かつ患者に対する利便性を改善する。 Increase in pharmacokinetics also improves the biological activity, reduces unwanted side effects and improves convenience to the patient. インターフェロン−アルブミン、インターフェロン−Fc、BNP−アルブミン、GLP−1−アルブミン、GLP−1−トランスフェリンのようなこのような融合タンパク質の多くの例がある。 Interferon - albumin, interferon -Fc, BNP-albumin, GLP-1-albumin, there are many examples of such fusion proteins, such as GLP-1-transferrin.

[00181]融合タンパク質は安定かつ分解に対して抵抗性であるが、活性部分を分解する潜在的なプロテアーゼ機序が、分子の緩徐な不活性化をもたらし得る。 [00181] Although the fusion protein is resistant to stability and degradation, potential protease mechanisms degrade active moiety, may result in slow inactivation of the molecule. 具体的には、GLP−1、ダイノルフィン(Berman YL、Juliano L、Devi LA J Biol Chem.1995年10月6日;270:23845〜50頁)、エンケファリン(Gu ZF、Menozzi D、Okamoto A、Maton PN、Bunnett NW Exp Physiol.1993年1月;78:35〜48頁)、BNP、ANP、アンギオテンシン、ブラジキニン、及びPYYなどの多くのペプチドは、ジペプチジルペプチダーゼIV、中性エンドペプチダーゼなどのプロテアーゼに対して非常に感受性が高い。 Specifically, GLP-1, dynorphin (Berman YL, Juliano L, Devi LA J Biol Chem 10 06, 1995; 270:. 23845-50 pp), enkephalin (Gu ZF, Menozzi D, Okamoto A, . Maton PN, Bunnett NW Exp Physiol 1 January 1993; 78: 35-48 pp), BNP, ANP, angiotensin, bradykinin, and many peptides, such as PYY, dipeptidyl peptidase IV, proteases such as neutral endopeptidase very sensitive to. これらのプロテアーゼは、個別に又は組み合わせて、循環中のペプチドの急速な不活性化を引き起こす。 These proteases individually or in combination, cause a rapid deactivation of the peptides in the circulation. アルブミン、Fc、及びトランスフェリンなどの大型タンパク質へのペプチドの融合は、プロテアーゼに対する著しい抵抗性を与える。 Albumin, Fc, and fusion of peptides to large proteins such as transferrin, offer significant resistance to proteases. しかし、プロテアーゼによる不活性化の影響を完全に排除することはできない。 However, it is not possible to completely eliminate the influence of the inactivation by proteases. したがって、融合タンパク質及びプロテアーゼ阻害剤の組合せは、融合タンパク質単独よりも優れたPK及びPDを有し得る。 Thus, the combination of fusion protein and the protease inhibitors may have superior PK and PD than the fusion protein alone.

[00182]本発明は、プロテアーゼに抵抗性である治療用ペプチドを含むトランスフェリン融合タンパク質を提供する。 [00182] The present invention provides a transferrin fusion protein comprising a therapeutic peptides that are resistant to proteases. 好ましくは、本発明の改変された治療用ペプチドは、DPP活性から部分的又は実質的に保護された、改変されたインスリン分泌促進ペプチドである。 Preferably, the modified therapeutic peptides of the present invention has been partially or substantially protected from DPP activity, a modified insulinotropic peptide. より好ましくは、改変されたインスリン分泌促進ペプチドは、改変GLP−1ペプチド並びにその類似体及び断片である。 More preferably, the modified insulinotropic peptides are modified GLP-1 peptide and analogues and fragments thereof. 改変GLP−1ペプチド並びにその類似体及び断片は、糖尿病、具体的にはII型糖尿病を治療するのに有用である。 Modified GLP-1 peptide and analogues and fragments thereof are diabetes, particularly useful for treating type II diabetes. 野生型GLP−1のN末端配列は、His−Ala−Gluである。 N-terminal sequence of the wild-type GLP-1 is His-Ala-Glu. 本発明の改変GLP−1ポリペプチドは、His−His−Ala−Glu(配列番号115)、Gly−His−Ala−Glu(配列番号116)、His−Gly−Glu、His−Ser−Glu、His−Ala−Glu、His−Gly−Glu、His−Ser−Glu、His−His−Ala−Glu(配列番号82)、His−His−Gly−Glu(配列番号83)、His−His−Ser−Glu(配列番号84)、Gly−His−Ala−Glu(配列番号85)、Gly−His−Gly−Glu(配列番号86)、Gly−His−Ser−Glu(配列番号;87)、His−X−Ala−Glu、His−X−Gly−Glu、及びHis−X−Ser−Glu(式中、Xは任意のアミノ酸である Modified GLP-1 polypeptides of the present invention, His-His-Ala-Glu (SEQ ID NO: 115), Gly-His-Ala-Glu (SEQ ID NO: 116), His-Gly-Glu, His-Ser-Glu, His -Ala-Glu, His-Gly-Glu, His-Ser-Glu, His-His-Ala-Glu (SEQ ID NO: 82), His-His-Gly-Glu (SEQ ID NO: 83), His-His-Ser-Glu (SEQ ID NO: 84), Gly-His-Ala-Glu (SEQ ID NO: 85), Gly-His-Gly-Glu (SEQ ID NO: 86), Gly-His-Ser-Glu (SEQ ID NO; 87), His-X- ala-Glu, His-X-Gly-Glu, and His-X-Ser-Glu (wherein, X is any amino acid からなる群から選択されるN末端配列を含み得る。 It may include an N-terminal sequence selected from the group consisting of. 後述するように、プロテアーゼ分解を低減及び防止するために他の改変を行ってもよく、これらの分子を本発明の方法及び組成物において使用してもよい。 As described below, may be performed other modifications to reduce and prevent protease degradation, it may be used in the methods and compositions of the present invention these molecules. さらに、任意のGLP−1部分又はGLP−1類似体、誘導体、若しくは模倣体を(融合タンパク質として)本発明の方法及び組成物において使用してもよい。 Further, any GLP-1 moiety or GLP-1 analogs, derivatives, or mimetics (as a fusion protein) may be used in the methods and compositions of the present invention.

[00183]GLP−1のN末端に1つのアミノ酸を付加することにより、立体的な妨害が寄与して、ジペプチジルペプチダーゼがGLP−1の2番目のアミノ酸を切断するのを防止することができる。 [00183] By adding one amino acid to the N-terminus of GLP-1, steric interference contributes, dipeptidyl peptidase can be prevented from cutting the second amino acid of GLP-1 . したがって、GLP−1は機能的に活性なままであると考えられる。 Thus, GLP-1 is considered to remain functionally active. 20種のアミノ酸又は非天然アミノ酸のうちいずれか1つをGLP−1のN末端に付加してよい。 It may be added one of the N-terminus of GLP-1 of 20 amino acids or unnatural amino acids. ヒスチジンも、好ましいアミノ酸である。 Histidine is also a preferred amino acid. いくつかの場合では、非荷電又は正荷電アミノ酸を使用してよく、好ましくはグリシンなどより小型のアミノ酸が付加される。 In some cases, it may be used and uncharged or positively charged amino acid, preferably added small amino acids than as glycine. 次いで、余分なアミノ酸を有する改変GLP−1をトランスフェリンに融合させて、融合タンパク質を作製することができる。 Then, the modified GLP-1 having extra amino acids may be fused to transferrin to make a fusion protein. 一実施形態では、GLP−1ペプチドは、そのアミノ末端に少なくとも1つの付加的なアミノ酸を含むように改変される。 In one embodiment, GLP-1 peptide is modified to comprise at least one additional amino acid at its amino terminus. 別の実施形態では、GLP−1ペプチドは、そのアミノ末端に少なくとも5つの付加的なアミノ酸を含むように改変される。 In another embodiment, GLP-1 peptide is modified to contain at least five additional amino acids at its amino terminus. あるいは、GLP−1ペプチドは、そのアミノ末端に1〜5つの付加的なアミノ酸を含むように改変される。 Alternatively, GLP-1 peptide is modified to contain one to five additional amino acids at its amino terminus.

[00184]グルカゴン様ペプチド−1(GLP−1)は、いわゆる腸膵系(enteroinsular axis)に属する、インスリン分泌を調節する胃腸管ホルモンである。 [00184] Glucagon-like peptide -1 (GLP-1) belongs to the so-called intestinal 膵系 (enteroinsular axis), a gastrointestinal hormone that regulates insulin secretion. 腸膵系は、インスリンの早期かつ増強された放出を促進する、腸における栄養素の存在及び吸収に応答して胃腸管粘膜から放出されるホルモンの1群を指す。 Intestinal 膵系 promotes early and enhanced release of insulin, refers to a group of hormone released from the gastrointestinal mucosa in response to the presence and absorption of nutrients in the intestine. インスリン分泌に対する促進効果であるインクレチン効果は、正常な耐糖能のためにおそらく不可欠である。 Incretin effect is a promoting effect on insulin secretion, is probably essential for normal glucose tolerance. GLP−1は、インクレチン効果を担っているため、生理的に重要なインスリン分泌促進ホルモンである。 GLP-1, since plays an incretin effect, it is physiologically important insulinotropic hormone.

[00185]GLP−1は、プログルカゴン遺伝子(Bell他、Nature、1983年、304;368〜371頁)の産生物である。 [00185] GLP-1 is, proglucagon gene (Bell other, Nature, 1983 years, 304; 368-371 pages) is a product of. これは、2種の最も主要な分子形態、すなわちGLP−1(7−36)アミド及びGLP−1(7−37)として、腸の内分泌細胞において合成される。 This is the two most dominant molecular form, i.e. as GLP-1 (7-36) amide and GLP-1 (7-37), is synthesized in endocrine cells of the gut. このペプチドは、1980年代初期に、プログルカゴンのcDNA及び遺伝子のクローニングに続いて最初に同定された。 This peptide, in the early 1980s, was first identified following the cloning of cDNA and gene of proglucagon.

[00186]完全長ペプチドGLP−1(1−37及び1−36 アミド )に対して実施され初期の研究により、大型のGLP−1分子は生物活性を欠いていることが結論づけられた。 [00186] The enforced early studies over the full length peptide GLP-1 (1-37 and 1-36 amide), GLP-1 molecules of large size was concluded to be devoid of biological activity. 1987年に、3つの別個の研究グループが、最初の6つのアミノ酸を除去すると、生物活性の向上したGLP−1分子が生じることを実証した。 In 1987, three separate research groups, removal of the first six amino acids, it was demonstrated that occurs improved GLP-1 molecule biological activity.

[00187]GLP−1のアミノ酸配列は、Schmidt他(1985年 Diabetologia 28 704〜707頁)によって開示されている。 [00187] GLP-1 amino acid sequence is disclosed by Schmidt et al (1985 Diabetologia 28, pp 704-707). ヒトGLP−1は、回腸遠位部中のL細胞、膵臓中及び脳中において合成されるプレプログルカゴンに由来する37アミノ酸残基のペプチドである。 Human GLP-1 is a peptide of 37 amino acid residues derived from preproglucagon which L cells in the distal ileum, in the pancreas and brain are synthesized. プレプログルカゴンのGLP−1(7−36)アミド、GLP−1(7−37)及びGLP−2へのプロセシングは、主にL細胞において起こる。 GLP-1 (7-36) amide of preproglucagon, processing of the GLP-1 (7-37) and GLP-2 occurs mainly in the L-cells. GLP−1(7−37)のアミノ酸配列は、配列番号32(X=Gly)、すなわち、 The amino acid sequence of GLP-1 (7-37), SEQ ID NO: 32 (X = Gly), i.e.,
His−Ala−Glu−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Val−Ser−Ser−Tyr−Leu−Glu−Gly−Gln−Ala−Ala−Lys−Glu−Phe−Ile−Ala−Trp−Leu−Val−Lys−Gly−Arg−Glyである。 His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp- is Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly.
GLP−1(7−36)アミドでは、末端のGlyがNH に置き換えられている。 In GLP-1 (7-36) amide, end of Gly is replaced by NH 2.

[00188]GLP−1様分子は、II型(非インスリン依存性糖尿病(NIDDM))、かついくつかの場合にはさらにI型糖尿病に罹患しているヒト対象において抗糖尿病活性を有する。 [00188] GLP-1 like molecule, with type II (non-insulin dependent diabetes mellitus (NIDDM)), and several anti-diabetic activity in yet a human subject suffering from type I diabetes when. GLP−1を用いた治療は、高いグルコースレベルでのみ、インスリン分泌及び生合成の増大、グルカゴン分泌の低減、胃内容排出の遅延などの活性を導き出し、したがって、インスリン又はスルホニル尿素より潜在的にはるかに安全な療法を提供する。 Treatment with GLP-1 is only at high glucose levels, increased insulin secretion and biosynthesis, reduced glucagon secretion, derive the activity, such as delayed gastric emptying, thus, potentially much more insulin or sulfonylurea to provide a safe therapy. 患者の食後グルコースレベルは、適切なGLP−1療法を用いて正常レベルに近づけることができる。 Postprandial glucose levels in patients can be close to normal levels with proper GLP-1 therapy. GLP−1様分子がII型患者の膵臓β細胞機能を保護し、かつさらには修復する能力を有することを示唆する報告もある。 GLP-1 like molecule protects pancreatic β cell function of type II patients, and furthermore is also reports suggesting that it has the ability to repair.

[00189]GLP−1(7−34)、GLP−1(7−35)、GLP−1(7−36)及びGLP−1(7−37)を含めて、そのアミノ末端に1つ又は複数のアミノ酸を付加することによって、任意のGLP−1配列を改変することができる。 [00189] GLP-1 (7-34), GLP-1 (7-35), GLP-1 (7-36) and including GLP-1 (7-37), one at its amino terminus or by adding the amino acids can be modified to any GLP-1 sequence. GLP−1はまた、胃腸管に対して強力な作用を有する。 GLP-1 also has a strong effect on the gastrointestinal tract. 生理的な量で注入されると、GLP−1は、ペンタガストリンに誘導された胃酸分泌並びに食事に誘導された胃酸分泌を強力に阻害する(Schjoldager他、Dig.Dis.Sci.1989年、35:703〜708頁;Wettergren他、DigDis Sci 1993年;38:665〜673頁)。 When injected in a physiological amounts, GLP-1 potently inhibits induced gastric acid secretion in gastric acid secretion and meal induced in pentagastrin (Schjoldager other, Dig.Dis.Sci. 1989 years, 35 : 703 to 708 pages; Wettergren other, DigDis Sci 1993 years; 38: 665-673 pages). これはまた、胃内容排出速度及び膵臓酵素分泌を抑制する(Wettergren他、Dig Dis Sci 1993年;38:665〜673頁)。 It also inhibits gastric emptying rate and pancreatic enzyme secretion (Wettergren other, Dig Dis Sci 1993 Apr; 38: 665-673 pages). 炭水化物また脂質を含む溶液で回腸を灌流すると、胃及び膵臓の分泌及び運動性に対する同様の抑制効果をヒトにおいて誘導することができる(Layer他、Dig Dis Sci 1995年、40:1074〜1082頁;Layer他、Digestion 1993年、54:385〜38頁)。 When perfused ileum with a solution containing carbohydrates also lipids, a similar inhibitory effect on secretion and gastric motility and pancreas can be induced in humans (Layer others, Dig Dis Sci 1995 year, 40: 1074-1082, pp; Layer another, Digestion 1993 years, 54: 385-38, pp.). 付随して、GLP−1分泌が大いに刺激され、GLP−1がこのいわゆる「回腸ブレーキ(ileal−brake)」に少なくともある程度関与している可能性があることが推測された(Layer他、Digestion 1993年、54:385〜38頁)。 Concomitantly, stimulated GLP-1 secretion greatly, GLP-1 is likely to be at least to some extent involved, it might be found in the so-called "ileal brake (ileal-brake)" (Layer others, Digestion 1993 year, 54: 385-38, pp.). 実際に、最近の研究では、生理学的に、GLP−1の回腸ブレーキ効果は、膵島に対するその効果よりずっと重要である可能性があることが示唆されている。 In fact, a recent study, physiologically, the ileal brake effect of GLP-1, that there is likely to be much more important than its effect on the islets has been suggested. したがって、用量反応研究では、GLP−1は、膵島分泌に影響するのに必要とされる速度と少なくとも同じくらい遅い注入速度で胃内容排出速度に影響を与える(Nauck他、Gut 1995年;37(補遺2):A124頁)。 Thus, in dose response studies, GLP-1 at a rate at least as much slower infusion rate required to affect the pancreatic islets secrete affect gastric emptying rate (Nauck other, Gut 1995 Jan; 37 ( Appendix 2): A124 pages).

[00190]GLP−1は、食品摂取に対する影響を有するようである。 [00190] GLP-1 appears to have an effect on food intake. GLP−1の脳室内投与は、ラットにおいて食品摂取を著しく抑制する(Schick他、Ditschuneit他編、Obesity in Europe、John Libbey&Company ltd、1994年;363〜367頁;Turton他、Nature 1996年、379:69〜72頁)。 Intraventricular administration of GLP-1, significantly inhibits food intake in rats (Schick other, Ditschuneit other eds., Obesity in Europe, John Libbey & Company ltd, 1994 years; from 363 to 367 pages; Turton other, Nature 1996 years, 379: pp. 69 to 72). この効果は極めて特異的であるようである。 This effect appears to be highly specific. したがって、N末端を伸長されたGLP−1(1−36 アミド )は不活性であり、適切な用量のGLP−1アンタゴニストであるエキセンディン9−39は、GLP−1の効果を無効にする(Tang−Christensen他、Am.J.Physiol.、1996年、271(4Pt2):R848〜56)。 Thus, GLP-1, which is extended N-terminal (1-36 amide) is inactive, a GLP-1 antagonists suitable dosage exendin 9-39 will neutralize the effect of GLP-1 ( . Tang-Christensen other, Am.J.Physiol, 1996 years, 271 (4Pt2): R848~56). GLP−1の急速な(Acute)末梢投与はラットにおいて急速に(acutely)食品摂取を抑制しない(Tang−Christensen他、Am.J.Physiol.、1996年、271(4Pt2):R848〜56;Turton他、Nature 1996年、379:69〜72頁)。 Rapid (Acute) peripheral administration of GLP-1 does not inhibit the rapid (acutely) Food intake in rats (Tang-Christensen other, Am.J.Physiol, 1996 years, 271 (4Pt2):. R848~56; Turton other, Nature 1996 years, 379: 69 to 72 pages). しかし、腸のL細胞から分泌されるGLP−1が満腹シグナルとしても作用し得る可能性も依然としてある。 However, GLP-1 secreted from the intestinal L-cells there is still a possibility that may also act as a satiety signal.

[00191]糖尿病患者において、GLP−1のインスリン分泌促進効果及び胃腸管に対するGLP−1の影響は維持されており(Willms他、Diabetelogia 1994年;37、補遺1:A118)、これは、食事に誘導されたグルコース量の逸脱を縮小するのに寄与し得るが、より重要なことには、食品摂取にも影響を及ぼし得る。 [00191] In diabetic patients, the effect of GLP-1 on insulin secretion promoting effect and gastrointestinal tract of GLP-1 is maintained (Willms other, Diabetelogia 1994 Jan; 37 Suppl 1: A 118), which is the meal It may contribute to reduce the deviation of the induced glucose levels, but more importantly, may also affect the food intake. GLP−1を4ng/kg/分で1週間継続的に静脈内投与すると、顕著な副作用を伴わずに、NIDDM患者における血糖コントロールを劇的に改善することが実証された(Larsen他、Diabetes 1996年;45、補遺2:233A)。 If the GLP-1 administered 1 week continuously intravenously at 4 ng / kg / min, without significant side effects, it has been demonstrated to dramatically improve glycemic control in NIDDM patients (Larsen other, Diabetes 1996 year; 45, Appendix 2: 233A).

[00192]DPP活性から部分的又は実質的に保護された改変GLP−1及び改変GLP−1類似体は、1型及び2型糖尿病並びに肥満の治療において有用である。 [00192] partially from DPP activity or substantially protected modified GLP-1 and modified GLP-1 analogs are useful in the treatment of type 1 and type 2 diabetes and obesity.

[00193]本明細書において使用される場合、「GLP−1分子」という用語は、GLP−1、GLP−1類似体、又はGLP−1誘導体を意味する。 [00193] As used herein, the term "GLP-1 molecule" means GLP-1, GLP-1 analog, or GLP-1 derivatives.

[00194]本明細書において使用される場合、「GLP−1類似体」という用語は、GLP−1と比べて1つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失、逆位、又は付加を有する分子として定義される。 [00194] As used herein, the term "GLP-1 analog" substitution of one or more amino acids as compared to GLP-1, a molecule having deletions, inversions, or additions It is defined. 多くのGLP−1類似体が当技術分野において公知であり、例えば、GLP−1(7−34)、GLP−1(7−35)、GLP−1(7−36)、Val −GLP−1(7−37)、Gln −GLP1(7−37)、D−Gln −GLP−1(7−37)、Thr 16 -Lys 18 −GLP−1(7−37)、及びLys 18 −GLP−1(7−37)(配列番号72)が挙げられる。 Are known many GLP-1 analogs in the art, for example, GLP-1 (7-34), GLP-1 (7-35), GLP-1 (7-36), Val 8 -GLP- 1 (7-37), Gln 9 -GLP1 (7-37), D-Gln 9 -GLP-1 (7-37), Thr 16 -Lys 18 -GLP-1 (7-37), and Lys 18 - GLP-1 (7-37) (SEQ ID NO: 72) can be mentioned. 米国特許第5118666号では、GLP−1(7−34)やGLP−1(7−35)などGLP−1類似体の例を開示している。 In U.S. Patent No. 5118666 discloses an example of a GLP-1 (7-34) or GLP-1 (7-35) such as GLP-1 analogs.

[00195]「GLP−1誘導体」という用語は、GLP−1又はGLP−1類似体のアミノ酸配列を有するが、そのアミノ酸側鎖、α−炭素原子、末端アミノ基又は末端カルボン酸基の1つ又は複数の化学的改変をさらに有する分子として定義される。 [00195] The term "GLP-1 derivative" is defined as a molecule having the amino acid sequence of GLP-1 or GLP-1 analog, one of its amino acid side chains, alpha-carbon atoms, terminal amino group, or terminal carboxylic acid group or it is defined as a molecule further comprising a plurality of chemical modification. 化学的改変としては、それだけには限らないが、化学的部分の付加、新しい結合の作製及び化学的部分の除去が挙げられる。 The chemical alterations include, but are not limited to, adding chemical moieties, include removal of making and chemical moieties of the new bond.

[00196]本明細書において使用される場合、「GLP−1に関連した化合物」という用語は、GLP−1、GLP−1類似体又はGLP−1誘導体の定義の範囲に入る任意の化合物を意味する。 [00196] As used herein, the term "compound associated with GLP-1" is meant any compound falling within the definition of GLP-1, GLP-1 analog or GLP-1 derivative to.

[00197]国際公開第91/11457号パンフレットでは、GLP−1部分としても有用となり得る、活性なGLP−1ペプチド7−34、7−35、7−36及び7−37の類似体を開示している。 In the 00197] WO 91/11457 pamphlet, can become useful as GLP-1 moieties, discloses analogues of the active GLP-1 peptides 7-34, 7-35, 7-36 and 7-37 ing.

[00198]EP0708179−A2(Eli Lilly&Co.)では、N末端のイミダゾール基及び場合によっては34位のリシン残基に結合された非分枝状C 〜C 10アシル基を含む、GLP−1類似体及び誘導体を開示している。 [00198] In EP0708179-A2 (Eli Lilly & Co .), As the case and imidazole group of the N-terminal containing unbranched C 6 -C 10 acyl group attached to the lysine residue at position 34, GLP-1 analogs It discloses body and derivatives.

[00199]EP0699686−A2(Eli Lilly&Co.)では、生物活性を有することが報告されている、いくつかのGLP−1のN末端切断型断片を開示している。 [00199] In EP0699686-A2 (Eli Lilly & Co.), Discloses has been reported to have biological activity, several N-terminal truncated fragments of GLP-1.

[00200]米国特許第5545618号では、以下からなる群から選択される少なくとも1つの改変を有する、本質的にGLP−1(7−34)、GLP−1(7−35)、GLP−1(7−36)、若しくはGLP−1(7−37)からなるGLP−1分子、又はそのアミド型、及び薬剤として許容されるその塩を開示している:(a)26位及び/若しくは34位のリシンをグリシン、セリン、システイン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、アルギニン、若しくはD−リシンで置換;又は36位のアルギニンをグリシン、セリン、システイン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、 [00200] In U.S. Patent No. 5,545,618, having at least one modification selected from the group consisting essentially of GLP-1 (7-34), GLP-1 (7-35), GLP-1 ( 7-36), or GLP-1 molecule consisting of GLP-1 (7-37), or amide type, and disclose pharmaceutically acceptable salts thereof: (a) 26-position and / or 34-position glycine lysine, serine, cysteine, threonine, asparagine, glutamine, tyrosine, alanine, valine, isoleucine, leucine, methionine, phenylalanine, substituted with arginine, or D- lysine; or 36-position arginine glycine, serine, cysteine, threonine, asparagine, glutamine, tyrosine, alanine, valine, isoleucine, leucine, メチオニン、フェニルアラニン、リシン、若しくはD−アルギニンで置換(配列番号73);(b)31位のトリプトファンを酸化抵抗性のアミノ酸で置換(配列番号74);(c)16位のバリンをチロシンで置換;18位のセリンをリシンで置換;21位のグルタミン酸をアスパラギン酸で置換;22位のグリシンをセリンで置換;23位のグルタミンをアルギニンで置換;24位のアラニンをアルギニンで置換;及び26位のリシンをグルタミンで置換、のうちの少なくとも1つの置換(配列番号75);並びに(d)8位のアラニンをグリシン、セリン、若しくはシステインで置換;9位のグルタミン酸をアスパラギン酸、グリシン、セリン、システイン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、アラニン、バリン、イ Substituting (c) 16 the valine tyrosine; methionine, phenylalanine, lysine, or substituted with D- arginine (SEQ ID NO: 73); (b) replacing the 31-position of tryptophan oxidation resistant amino acid (SEQ ID NO: 74) ; 18 serine substitutions at lysine; substituted with arginine to alanine at position 24; glycine 22-substituted with a serine; substitution position 21 glutamic acid aspartic acid substituted with arginine and glutamine 23-position and 26-position lysine substituted by glutamine, at least one substitution of (SEQ ID NO: 75); and (d) 8 alanine glycine, serine, or substituted with cysteine; 9-position glutamic aspartic acid, glycine, serine, cysteine, threonine, asparagine, glutamine, tyrosine, alanine, valine, Lee ロイシン、ロイシン、メチオニン、若しくはフェニルアラニンで置換;10位のグリシンをセリン、システイン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、若しくはフェニルアラニンで置換;並びに15位のアスパラギン酸をグルタミン酸で置換、のうちの少なくとも1つの置換(配列番号76);並びに(e)7位のヒスチジンをグリシン、セリン、システイン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、若しくはフェニルアラニン、あるいはヒスチジンのD−若しくはN−アシル化型又はアルキル化型で置換(配列番号77);この際、(a)、(b)、(d)、及び(e)の置換において、 Leucine, leucine, methionine, or substituted with phenylalanine; 10th glycine serine, cysteine, threonine, asparagine, glutamine, tyrosine, alanine, valine, isoleucine, leucine, methionine, or substituted phenylalanine; and the 15-position aspartic acid substituted with glutamic acid, at least one substitution of (SEQ ID NO: 76); and (e) 7-position histidine glycine, serine, cysteine, threonine, asparagine, glutamine, tyrosine, alanine, valine, isoleucine, leucine, methionine, or phenylalanine or substituted by D- or N- acylated type or alkylated form of histidine (SEQ ID NO: 77); this time, in replacement of (a), (b), (d), and (e), 換されるアミノ酸は場合によってはD型でよく、かつ7位で置換されるアミノ酸は場合によってはNアシル化型又はNアルキル化型でよい。 Well D type sometimes amino acids conversion is and the amino acid to be substituted in position 7 may be a N-acylated-type or N-alkylated form in some cases.

[00201]米国特許第5118666号では、インスリン分泌促進活性を有するGLP−1分子を開示している。 [00201] In U.S. Patent No. 5,118,666 discloses a GLP-1 molecule having insulinotropic activity. このような分子は、アミノ酸配列His−Ala−Glu−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Val−Ser−Ser−Tyr−Leu−Glu−Gly−Gln−Ala−Ala−Lys−Glu−Phe−Ile−Ala−Trp−Leu−Val−Lys(GLP−1、7−34、配列番号32を参照されたい)又はHis−Ala−Glu−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Val−Ser−Ser−Tyr−Leu−Glu−Gly−Gln−Ala−Ala−Lys−Glu−Phe−Ile−Ala−Trp−Leu−Val−Lys−Gly(GLP−1、7−35、配列番号32を参照されたい)を有するペプチド、及び前記ペプチドの誘導体からなる群から選択され、ここで、前 Such molecules, the amino acid sequence His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu- Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys (GLP-1,7-34, see SEQ ID NO: 32) or His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val -Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly (GLP-1,7-35, SEQ ID NO: 32 peptides with see) to, and is selected from the group consisting of derivatives of said peptides, wherein, prior to ペプチドは、前記ペプチドの薬剤として許容される酸付加塩;前記ペプチドの薬剤として許容されるカルボン酸塩;前記ペプチドの薬剤として許容される低級アルキルエステル;並びにアミド、低級アルキルアミド及び低級ジアルキルアミドからなる群から選択される、前記ペプチドの薬剤として許容されるアミドからなる群から選択される。 Peptides, acid addition salts are pharmaceutically acceptable for the peptide; lower alkyl esters are pharmaceutically acceptable for the peptide; carboxylate pharmaceutically acceptable of said peptides and amides, lower alkyl amide and lower dialkyl amide made is selected from the group, is selected from the group consisting of amide a pharmaceutically acceptable of said peptide.

[00202]米国特許第6277819号では、GLP−1、GLP−1類似体、及びGLP−1誘導体を患者に投与するステップを含む、心筋梗塞後の死亡率及び罹患率を減少させる方法を教示している。 [00202] In U.S. Patent No. 6,277,819, GLP-1, GLP-1 analogs, and GLP-1 derivative comprising administering to a patient, teaches a method of reducing mortality and morbidity after myocardial infarction ing. 以下の構造式(配列番号**):R −X −Glu−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Val−Ser−Ser−Tyr−Leu−X −Gly−Gln−A1a−A1a−Lys−X −Phe−Ile−Ala−Trp−Leu−Val−Lys−Gly−Arg−R (配列番号78)[式中、R はL−ヒスチジン、D−ヒスチジン、デスアミノ−ヒスチジン、2−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジン及びα−メチル−ヒスチジンからなる群から選択され;X はAla、Gly、Val、Thr、Ile、及びα−メチル−Alaからなる群から選択され;X はGlu、Gln、Ala、Thr、Ser及びGlyからなる群から Following structural formula (SEQ ID **): R 1 -X 1 -Glu -Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-X 2 -Gly-Gln-A1a- A1a-Lys-X 3 -Phe- Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-R 2 ( SEQ ID NO: 78) wherein, R 1 is L- histidine, D- histidine, desamino - histidine 2-amino - histidine, beta-hydroxy - histidine, homo-histidine, alpha-fluoromethyl - histidine and alpha-methyl - is selected from the group consisting of histidine; X 1 is Ala, Gly, Val, Thr, Ile, and α - it is selected from the group consisting of methyl -Ala; X 2 is Glu, Gln, Ala, Thr, from the group consisting of Ser and Gly 択され;X はGlu、Gln、Ala、Thr、Ser及びGlyからなる群から選択され;R はNH 及びGly−OHからなる群から選択される。 Is-option; X 3 is Glu, Gln, Ala, Thr, selected from the group consisting of Ser and Gly; R 2 is selected from the group consisting of NH 2 and Gly-OH. ただし、GLP−1類似体は、約6.0〜約9.0の範囲に等電点を有し、さらに、R がHisであり、X がAlaであり、X がGluであり、X がGluである場合、R はNH でなければならない。 However, GLP-1 analog has an isoelectric point in the range of about 6.0 to about 9.0, further, R 1 is His, X 1 is Ala, X 2 is located at Glu when X 3 is Glu, R 2 must be NH 2. ]で表されるGLP−1類似体及び薬剤として許容されるその塩。 Acceptable salt thereof GLP-1 analogs and drug represented by.

[00203]Ritzel他(Journal of Endocrinology、1998年、159:93〜102頁)は、N末端から2番目のアラニンがセリンに置き換えられているGLP−1類似体の[Ser ]GLP−1を開示している。 [00203] Ritzel other (Journal of Endocrinology, 1998 years, 159: 93-102 pages) is a GLP-1 analog second alanine from N-terminus is replaced by serine [Ser 8] GLP-1 It discloses. この改変によってペプチドのインスリン分泌促進作用は弱まらなかったが、GLP−1と比べて高い血漿安定性を有する類似体が生成された。 Although not weaken the insulinotropic action of the peptide by this modification, analogs with high plasma stability as compared to GLP-1 was produced.

[00204]米国特許第6429197号では、急性脳卒中又は出血後のGLP−1治療、好ましくは静脈内投与が、インスリン分泌を最適化し、脳の同化作用を増大させ、グルカゴンを抑制することによってインスリン有効性を高め、かつ重度の低血糖のリスクも他の有害な副作用も伴わずに正常血糖又は軽度の低血糖を維持するための手段を実現するため、理想的な治療となり得ることを教示している。 [00204] In U.S. Patent No. 6,429,197, GLP-1 treatment after acute stroke or hemorrhage, preferably intravenous administration, to optimize insulin secretion, increasing the anabolism of the brain, effective insulin by suppressing glucagon enhance sex, and since the risk of severe hypoglycemia implementing means for maintaining euglycemia or mild hypoglycemia without also other adverse side effects, teaches that may be ideal therapeutic there. 本発明は、急性脳卒中又は出血後に、インスリン分泌を最適化し、グルカゴン拮抗作用を抑制することによってインスリン有効性を高め、かつ重度の低血糖のリスクを伴わずに正常血糖又は軽度の低血糖を維持するために、GLP−1又は生物活性を有するその類似体で虚血性又は再灌流された脳を治療する方法を提供する。 The present invention is, after acute stroke or hemorrhage to optimize insulin secretion, increase insulin effectiveness by suppressing glucagon antagonism, and maintaining euglycemia or mild hypoglycemia with no risk of severe hypoglycemia to provide a method for treating ischemic or reperfusion brain in its analogs with GLP-1 or biological activity.

[00205]米国特許第6277819号では、GLP−1、GLP−1類似体、GLP−1誘導体及び薬剤として許容されるその塩からなる群から選択される化合物を、血中グルコースを正常化するのに効果的な用量で、必要とする患者に投与するステップを含む、心筋梗塞後の死亡率及び罹患率を減少させる方法を提供している。 [00205] In U.S. Patent No. 6,277,819, GLP-1, GLP-1 analog, a compound selected from the group consisting acceptable salt thereof GLP-1 derivatives and agents, to normalize blood glucose an effective dose, comprising the step of administering to a patient in need, provides a method of reducing mortality and morbidity after myocardial infarction.

[00206]米国特許第6191102号では、少なくとも4週間である、重量減少をもたらすのに効果的な期間、グルカゴン様ペプチド(GLP−1)、グルカゴン様ペプチド類似体(GLP−1類似体)、グルカゴン様ペプチド誘導体(GLP−1誘導体)又は薬剤として許容されるその塩を含む組成物を、体重の減少を引き起こすのに十分な用量で体重減少を必要とする対象に投与することによって、その対象の体重を減少させる方法を開示している。 [00206] In U.S. Patent No. 6,191,102, at least 4 weeks, effective period to result in weight loss, glucagon-like peptide (GLP-1), glucagon-like peptide analogs (GLP-1 analog), glucagon by administering a composition comprising an acceptable salt thereof like peptide derivative (GLP-1 derivatives) or drug to a subject in need of weight loss in a dosage sufficient to cause reduction in body weight, of the subject It discloses a method of reducing body weight.

[00207]GLP−1は、皮下投与後は十分に活性を有するが(Ritzel他、Diabetologia 1995年;38:720〜725頁)、ジペプチジルペプチダーゼIV様酵素による分解が主な原因で急速に分解される(Deacon他、J Clin Endocrinol Metab 1995年、80;952〜957頁;Deacon他、1995年、Diabetes 44:1126〜1131頁)。 [00207] GLP-1 is after subcutaneous administration with a sufficiently active (Ritzel other, Diabetologia 1995 Jan; 38: 720-725 p.), Degradation by dipeptidyl peptidase IV-like enzyme rapidly degraded primary cause It is the (Deacon et J Clin Endocrinol Metab 1995, 80; 952-957, pp; Deacon et 1995, Diabetes 44: 1126-1,131 pages). したがって、残念ながら、GLP−1及びその類似体の多くのヒトにおける血漿半減期は短い(Orskov他、Diabetes 1993年;42;658〜661頁)。 Therefore, unfortunately, the plasma half-life in many human GLP-1 and analogs thereof is shorter (Orskov other, Diabetes 1993 Jan; 42; 658-661 pages). したがって、GLP−1(7−37)に比べて長い作用プロファイルを有する、改変GLP−1又はその類似体を提供することが本発明の目的である。 Therefore, with long acting profile compared to GLP-1 (7-37), it is an object of the present invention to provide a modified GLP-1 or an analog thereof. GLP−1(7−37)より低いクリアランスを有するGLP−1及びその類似体の誘導体を提供することが本発明のさらなる目的である。 It is a further object of the present invention to provide GLP-1 and derivatives of analogues thereof having a lower clearance than GLP-1 (7-37). さらに、改善された安定性を有する、改変されたGLP−1又はGLP−1類似体を含む薬剤組成物を提供することも本発明の目的である。 It is a further object of the present invention to provide a with improved stability, modified GLP-1 or a pharmaceutical composition comprising a GLP-1 analog. さらに、本発明は、それだけには限らないが、前述したものなどGLP−1に関連した疾患を治療するための、改変されたGLP−1又はGLP−1類似体の使用も含む。 Furthermore, the present invention is not limited to, for the treatment of diseases associated with GLP-1, such as those described above, including the use of modified GLP-1 or GLP-1 analog.

[00208]本発明の一態様では、改変されたGLP−1及びGLP−1類似体を含む薬剤組成物は、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences、1985年で記載されているような薬剤組成物を調製する確立された方法のうちのいずれかによって調製され得る。 [00208] In one aspect of the present invention is also directed to pharmaceutical compositions comprising a modified GLP-1 and GLP-1 analogues, prepared for example, Remington's Pharmaceutical Sciences, pharmaceutical compositions as described in 1985 It may be prepared by any of the established methods for. 組成物は、全身的な注射又は輸注に適した形態でよく、したがって、滅菌水や等張性の生理食塩水若しくはグルコース溶液など適切な液体ビヒクルと共に調製してよい。 The composition may be in a form suitable for systemic injection or infusion and therefore may be prepared with a suitable liquid vehicle such as sterile water or isotonic saline or glucose solution. これらの組成物は、当技術分野において周知の従来の滅菌技術によって滅菌してよい。 These compositions may be sterilized by well known conventional sterilization techniques in the art. 結果として得られる水性液剤は使用するために容器に入れても、又は無菌条件下でろ過し、かつ凍結乾燥してもよく、凍結乾燥された調製物は投与の前に無菌の水溶液と混合される。 Even resulting aqueous solutions in containers for use or filtered under aseptic conditions, and may be lyophilized, the lyophilized preparation being combined with a sterile aqueous solution prior to administration that. 組成物は、生理的条件に近づけるために、緩衝剤、等張化剤、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムなどのような製薬上許容される補助物質を必要に応じて含んでよい。 Composition to approximate physiological conditions, optionally buffering agents, tonicity agents, such as sodium acetate, sodium lactate, sodium chloride, potassium chloride, a pharmaceutically acceptable auxiliary substances, such as calcium chloride it may include Te.

[00209]本発明の改変されたGLP−1及びGLP−1類似体は、経鼻、経皮、経肺又は直腸投与用に適合させてもよい。 [00209] The modified GLP-1 and GLP-1 analogs of the present invention, nasal, transdermal, may be adapted for pulmonary or rectal administration. 組成物中で使用される製薬上許容される担体又は希釈剤は、任意の従来の固形担体でよい。 Pharmaceutically acceptable carrier or diluent employed in the composition may be any conventional solid carrier. 固形担体の例は、ラクトース、白土、スクロース、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アラビアゴム、ステアリン酸マグネシウム及びステアリン酸である。 Examples of solid carriers are lactose, terra alba, sucrose, talc, gelatin, agar, pectin, acacia, magnesium stearate and stearic acid. 同様に、担体又は希釈剤は、単独又はワックスと混合したモノステアリン酸グリセリル又はジステアリン酸グリセリルなど、当技術分野において公知の任意の徐放物質を含んでもよい。 Similarly, the carrier or diluent, such as glyceryl monostearate or glyceryl distearate which alone or mixed with a wax may comprise any known controlled release material in the art.

[00210]徐放製剤の形態で本発明の組成物を提供することは、特に有利となり得る。 [00210] to provide a composition of the present invention in the form of sustained-release preparations may be particularly advantageous. したがって、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、若しくは乳酸/グリコール酸コポリマーなど製薬上許容される適切な生分解性ポリマーによってカプセル化された、又はそれらに分散された、改変されたGLP−1又はGLP−1類似体を含むマイクロカプセル又は微粒子として組成物を調製してもよい。 Thus, polylactic acid, polyglycolic acid, or encapsulated by a pharmaceutically acceptable suitable biodegradable polymer such as lactic acid / glycolic acid copolymer, or their dispersed, GLP-1 or GLP-1 that has been modified the composition as microcapsules or microparticles containing the analogs may be prepared.

[00211]経鼻投与の場合、調製物は、エアロゾル適用のための液状担体、特に水性担体中に溶解又は懸濁された、改変されたGLP−1又はGLP−1類似体を含んでよい。 [00211] For nasal administration, the preparation liquid carrier for aerosol application, which particularly is dissolved or suspended in an aqueous carrier, may contain modified GLP-1 or GLP-1 analog. 担体は、可溶化剤、例えばプロピレングリコール、表面活性剤、レシチン(ホスファチジルコリン)やシクロデキストリンなどの吸収促進物質又はパラベンなどの保存剤などの添加剤を含んでよい。 Carrier, solubilizer, such as propylene glycol, surface active agents may comprise additives such as preservatives, such as absorption-promoting substances or parabens, such as lecithin (phosphatidylcholine) or cyclodextrin.

[00212]一般に、本発明の改変されたポリペプチド又はペプチドは、単位投薬量当たりの製薬上許容される担体と共に、単位剤形で投薬される。 [00212] Generally, the modified polypeptides or peptides of the present invention, together with a pharmaceutically acceptable carrier per unit dosage, dosed in unit dosage form.

[00213]さらに、本発明は、それだけには限らないが前述したもののような高いグルコースレベルを伴う疾患(代謝疾患)の治療において使用することができる医薬製品の製造のための、改変されたGLP−1及びGLP−1類似体の使用も企図する。 [00213] Furthermore, the present invention is not limited to it, but for the manufacture of a pharmaceutical product that can be used in the treatment of diseases (metabolic disorders) with high glucose levels, such as those described above, modified GLP- using 1 and GLP-1 analogs are also contemplated. 具体的には、本発明は、II型糖尿病を含む糖尿病、肥満、重度の熱傷、並びにうっ血性心不全を含む心不全及び急性冠症候群の治療のための、改変されたGLP−1及びGLP−1類似体の使用を企図する。 Specifically, the present invention is diabetes including type II diabetes, obesity, severe burns, as well as for the treatment of heart failure and acute coronary syndromes, including congestive heart failure, modified GLP-1 and GLP-1 analogs It contemplates the use of the body.

[00214]本発明はまた、DPP活性から部分的及び実質的に保護された、改変されたエキセンディン−3及びエキセンディン−4ペプチドも提供する。 [00214] The present invention has also been partially and substantially protected from DPP activity, also provides modified Exendin-3 and exendin-4 peptide. エキセンディン−3及びエキセンディン−4は、39個のアミノ酸(2番目及び3番目の残基が異なる)を含むインスリン分泌促進ペプチドであり、GLP−1に対して約53%の相同性を有する。 Exendin-3 and exendin-4 is a 39 amino acid exendins comprising (second and third different residues) homology of about 53% relative to GLP-1 . エキセンディン−3配列は、HSDGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS(配列番号79)であり、エキセンディン−4配列は、HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS(配列番号80)である。 Exendin-3 sequence is EichiesudijitiefutiesudieruesukeikyuemuEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 79), exendin-4 sequence is EichijiijitiefutiesudieruesukeikyuemuEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 80). 本発明はまた、エキセンディン−4(1−31)HGEGTFTSDLSKQMEEAVRLFIEWLKNGGPY(配列番号81)などのアミノ酸配列を含む、改変されたエキセンディン−4断片も包含する。 The present invention also comprises the amino acid sequence, such as exendin--4 (1-31) HGEGTFTSDLSKQMEEAVRLFIEWLKNGGPY (SEQ ID NO: 81), also encompasses modified exendin-4 fragments. さらに、本発明は、エキセンディン−3及びエキセンディン−4ペプチドの改変類似体も含む。 Furthermore, the present invention also includes modified analogs of exendin-3 and exendin-4 peptide.

糖尿病、糖尿病前症、又は肥満を治療するための改変GLP−1融合タンパク質又はコンジュゲート Diabetes, pre-diabetes, or modification to treat obesity GLP-1 fusion protein or conjugate
[00215]改変GLP−1は、in vivoでの全般的な安定性を上昇させるために異種分子に融合してよい。 [00215] Modified GLP-1 may be fused to a heterologous molecule to increase the overall stability in vivo. 改変GLP−1は、組換え手段によって異種分子に融合させ、又は当技術分野において周知の方法によって異種分子に共有結合させることができる。 Modified GLP-1 is fused to a heterologous molecule by recombinant means, or can be covalently linked to a heterologous molecule by methods well known in the art. 改変GLP−1は、例えば、血清アルブミンやトランスフェリンなどの血漿タンパク質、免疫グロブリン又はFcドメインなどその一部分に、融合又は共有結合させることができる。 Modified GLP-1 is, for example, plasma proteins such as serum albumin or transferrin, in a portion thereof, such as immunoglobulins or Fc domain may be fused or covalently linked. より好ましくは、改変されたポリペプチド又はペプチドは、トランスフェリン、ラクトトランスフェリン又はメラノトランスフェリンに融合される。 More preferably, the modified polypeptide or peptide, transferrin is fused to lacto transferrin or melanotransferrin. このような融合タンパク質を作製するための方法は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願第10/378,094号によって提供される。 The method for producing a fusion protein as is provided by U.S. Patent Application No. 10 / 378,094 in its entirety is incorporated herein by reference.

[00216]より大きな物理的距離を提供し、かつそれらの融合タンパク質間により大きな空間的可動性を与え、それによって、例えばその同族受容体に結合するための治療用タンパク質の接近容易性を最大化するために、変動可能な長さのリンカーを介してGLP−1分子を異種タンパク質に結合させてよい。 [00216] provides a greater physical distance from, and have a significant spatial mobility by between fusion proteins thereof, whereby, for example, maximizing the accessibility of the therapeutic protein for binding to its cognate receptor to, the GLP-1 molecule may be conjugated to a heterologous protein via a linker of the variation possible length. リンカーペプチドは、可撓性又はより硬いアミノ酸からなり得る。 The linker peptide may consist of flexible or harder amino acids. 例えば、ポリグリシンストレッチのようなリンカーを使用してよい。 For example, a linker may be used, such as poly-glycine stretch. リンカーは、約50個、40個、30個、20個、10個又は5個未満のアミノ酸残基でよい。 Linker is about 50, 40, 30, 20, may be 10 or less than five amino acid residues. リンカーは、異種タンパク質及びGLP−1に、かつその間に共有結合的に連結され得る。 Linker, to a heterologous protein and GLP-1, and may be covalently linked therebetween. 好ましくは、リンカーは、1つのSer残基、2つのSer残基、ペプチドSer−Ser−Gly、ペプチドPEAPTD、ペプチド(PEAPTD) 、IgGヒンジリンカーと組み合わせたペプチドPEAPTT、及びIgGヒンジリンカーと組み合わせたペプチド(PEAPTD) でよい。 Preferably, the linker is combined one Ser residue, two Ser residues, the peptide Ser-Ser-Gly, the peptide PEAPTD, the peptide (PEAPTD) 2, IgG hinge linker combination with peptides PEAPTT, and the IgG hinge linker peptide (PEAPTD) may be 2. これらのリンカーを使用して、GLP−1をトランスフェリンに連結してよい。 Using these linkers may be linked to GLP-1 to transferrin.

[00217]改変されたポリペプチド又はペプチドに結合されるトランスフェリンを改変してもよい。 [00217] may be modified transferrin coupled to the modified polypeptide or peptide. これは、グリコシル化の低減を示し得る。 This may indicate a reduction in glycosylation. 改変されたトランスフェリンポリペプチドは、単一のトランスフェリンNドメイン、単一のトランスフェリンCドメイン、トランスフェリンのN及びCドメイン、2つのトランスフェリンNドメイン、並びに2つのトランスフェリンCドメインからなる群から選択することができる。 Modified transferrin polypeptide may be selected single transferrin N domain, a single transferrin C domain, N and C domains of Transferrin, two transferrin N domains, and from the group consisting of two transferrin C domains .

[00218]前述したように、GLP−1は、体内の重要な内分泌ホルモン系を活性化及び調節し、かつグルコースの代謝において極めて重要な管理的役割を果たしている。 [00218] As mentioned above, GLP-1 is an important endocrine hormone systems in the body activated and adjusted, and plays a critical management role in the metabolism of glucose. 市場に出ている他のすべての糖尿病治療とは異なり、GLP−1は、β細胞の増殖因子として作用してそれによって膵臓のインスリン分泌能力を改善することにより回復を推進する潜在能力、及び、感受性を改善してグルコースレベルをより安定にさせることによってより効率的に既存のインスリンレベルが作用するようにさせる潜在能力も有する。 Unlike all other diabetic treatments on the market, GLP-1 is potential to promote recovery by improving it by pancreatic insulin secretory capacity to act as a growth factor for β cells and, more efficiently existing insulin levels by improved sensitivity to glucose levels more stable also has potential to to act. これにより、グルコースレベルを毎日モニターする負担が軽減され、かつ糖尿病に起因する血中グルコースの変動によって引き起こされる重篤な長期の副作用が潜在的に遅延される。 Thus, the burden of monitoring the glucose level every day is reduced, and serious long-term side effects caused by fluctuations in blood glucose due to diabetes is delayed potentially. さらに、GLP−1は、食欲を減退させ、かつ体重を減少させることができる。 Furthermore, GLP-1 causes the appetite, and it is possible to reduce the weight. 肥満は、グルコース代謝の不十分な制御に特有の転帰であり、これは糖尿病の病態を悪化させる働きをするに過ぎない。 Obesity is the outcome of specific to the inadequate control of glucose metabolism, this is not only serves to exacerbate the pathology of diabetes.

[00219]、天然GLP−1は血液循環中で急速に分解されるため(半減期は数分である)、その臨床応用は限られている。 [00219], native GLP-1 is to be rapidly degraded in the blood circulation (half-life is several minutes), its clinical application is limited. 血液循環中で治療的レベルを維持するには、ポンプ又は貼付器具を用いて高用量を恒常的に投与することを要し、これは治療コストを増加させる。 To maintain therapeutic levels in the blood circulation, requires that constitutively high doses using pumps or patch device, which increases the cost of treatment. これは、特に、糖尿病を治療し、かつグルコースレベルをモニターするための他のすべての薬物療法と併用した長期連用には不都合である。 This is particularly to treat diabetes and is inconvenient for long-term use of combination with all the other medications for monitoring glucose levels. 改変GLP−1融合タンパク質は、GLP−1の活性を保持しているが、トランスフェリンの長い半減期(14〜17日)、溶解性及び体内分布特性を有している。 Modified GLP-1 fusion protein, while retaining the activity of GLP-1, transferrin long half-life (14-17 days), and has a solubility and biodistribution characteristics. これらの諸特性により、低コスト、小体積、月1回のs. These properties, low cost, small volume, monthly s. c. c. (皮下)注射が実現され得、このタイプの製品は、長期連用のために間違いなく必要とされている。 (Subcutaneous) injection is realized obtained, this type of product is required undoubtedly for long-term use.

[00220]改変GLP−1は、その安定性を高めるために、血液成分に共有結合されてもよい。 [00220] Modified GLP-1, in order to enhance its stability, it may be covalently bonded to a blood component. 例えば、改変GLP−1は、血清アルブミン、トランスフェリン、免疫グロブリン又は免疫グロブリンのFc部分に共有結合させることができる。 For example, the modified GLP-1 is, serum albumin, transferrin, can be covalently attached to the Fc portion of an immunoglobulin or immunoglobulin. 一実施形態では、改変GLP−1は、脂肪酸又は脂肪酸誘導体に結合され得る。 In one embodiment, the modified GLP-1 may be coupled to a fatty acid or fatty acid derivative. 別の実施形態では、改変GLP−1は、薬物親和性複合体(DAC)に作り変えられ得る。 In another embodiment, the modified GLP-1 can be reshaped in the drug affinity complex (DAC). 先に考察したように、Kim他(2003年、Diabetes52(3):751頁)は、GLP−1−アルブミン薬物親和性複合体を開示している。 As discussed earlier, Kim et al (2003, Diabetes52 (3): 751 pp.) Discloses a GLP-1-albumin drug affinity complex. Kim他は、アルブミンを結合されたDAC:GLP−1が天然のGLP−1を擬態すること示している。 Kim et al, DAC coupled albumin: indicates that GLP-1 is to simulate the GLP-1 native. Kim他は、GLP−1Rシグナル伝達をより長い時間活性化するための新しい手法を提供している。 Kim et provides a new approach to longer time activates GLP-1R signaling.

[00221]皮下投与すると、DAC:改変GLP−1は、in vivoでアルブミンに急速かつ選択的に結合する。 [00221] Upon subcutaneous administration, DAC: modified GLP-1 is rapidly and selectively bind to albumin in vivo. 形成されたバイオコンジュゲートは、内因性のGLP−1と同じ治療活性及び同様の効力を有するが、アルブミンにより近い薬物動態プロファイルを有する。 Formed bioconjugates have the same therapeutic activity and similar potency as GLP-1 endogenous, having close pharmacokinetic profile by albumin.

他の治療用物質と組み合わせた、改変GLP−1及びその融合タンパク質 In combination with other therapeutic agents, modified GLP-1 and its fusion proteins
[00222]本発明の一態様では、本発明の改変GLP−1ペプチド及びその融合タンパク質、例えばGLP−1−Tf融合タンパク質は、II型糖尿病、肥満及び異常なグルコースレベルを伴う他の疾患又は状態を治療するために、「Glucophage(登録商標)」(塩酸メトホルミン錠剤)や「Glucophage(登録商標)XR」(塩酸メトホルミン徐放錠剤)など少なくとも1種の第2の治療用分子と組み合わせて使用される。 [00222] In one aspect of the present invention, the modified GLP-1 peptide and its fusion protein, for example, GLP-1-Tf fusion protein, II type diabetes, other diseases or conditions involving obesity and abnormal glucose levels of the present invention to treat, it is used in conjunction with "Glucophage (R) '(metformin hydrochloride tablets) or" Glucophage (R) XR' (metformin hydrochloride extended-release tablets) such as at least one second therapeutic molecule that.

[00223]「Glucophage(登録商標)」及び「Glucophage(登録商標)XR」は、II型糖尿病の処置用の経口抗高血糖薬である。 [00223] "Glucophage (R)" and "Glucophage (R) XR" is an oral antihyperglycemic agents for the treatment of type II diabetes. 「Glucophage(登録商標)XR」は、Glucophageの徐放製剤である。 "Glucophage (registered trademark) XR" is a sustained-release formulation of Glucophage. したがって、「Glucophage(登録商標)XR」は、剤形から薬物が緩徐に放出されるため、1日1回服用してよい。 Thus, "Glucophage (R) XR", because the drug is released slowly from the dosage form, may be taken once a day. 「Glucophage(登録商標)」は、身体による肝臓からのグルコース産生量を減らすのに寄与する。 "Glucophage (registered trademark)" contributes to reduce glucose production from the liver by the body. したがって、「Glucophage(登録商標)」は、患者の血糖値レベルを制御するのに有効である。 Thus, "Glucophage (R)" is effective in controlling blood glucose levels in patients. 「Glucophage(登録商標)」は、身体によるより多くのインスリン産生を引き起こさないため、低血中グルコース(低血糖)を引き起こすことはめったにない。 "Glucophage (registered trademark)", in order not to cause a lot of insulin production than by the body, it is rarely cause low blood glucose (hypoglycemia).

[00224]「Glucophage(登録商標)」はまた、II型糖尿病に罹患している人々においてしばしば高い、脂肪性の血液成分であるトリグリセリド及びコレステロールを低下させるのにも寄与する。 [00224] "Glucophage (R)" is also often high in people suffering from type II diabetes, also contributes to lowering the triglyceride and cholesterol is a fatty blood components. メトホルミンは、食欲を減退させ、人々がその医薬品を摂取し始めた場合には、数ポンドの減量に寄与することが示された。 Metformin is appetite, when people began taking the drugs, were shown to contribute to weight loss of a few pounds.

[00225]メトホルミンは、スルホニル尿素との併用治療、若しくはインスリンとの併用治療、又は単独療法としての(それだけによる)治療用に承認された。 [00225] Metformin, combination therapy with sulfonylureas, or combination therapy with insulin, or (depending only on it) monotherapy as the approved for the treatment. メトホルミンは、インスリン抵抗性患者の高血圧(国際公開第9112003号パンフレット−Upjohn社)、(t−PA−誘導体と組み合わせて)凝血塊を溶解するため(国際公開第9108763号パンフレット、国際公開第9108766号パンフレット、国際公開第9108767号パンフレット、及び国際公開第9108765号パンフレット−Boehringer Mannheim社)、虚血及び組織無酸素(EP283369−Lipha社)、アテローム性動脈硬化症(DE1936274−Brunnengraber&Co.社、DE2357875−Hurka、及び米国特許第4205087号−ICI社)など様々な心血管疾患を治療する際に使用することが提案された。 Metformin, insulin-resistant patients with hypertension (WO 9112003 pamphlet -Upjohn Inc.), (t-PA- in combination with derivatives) to dissolve the clot (WO 9108763 pamphlet, WO 9108766 pamphlet, International Publication No. 9108767 pamphlet, and WO 9108765 pamphlet -Boehringer Mannheim Co., Ltd.), ischemia and tissue oxygen-free (EP283369-Lipha Co., Ltd.), atherosclerosis (DE1936274-Brunnengraber & Co. company, DE2357875-Hurka , and U.S. Patent No. 4205087 -ICI Inc.) be used in treating various cardiovascular diseases such as has been proposed. さらに、冠血管拡張薬として、かつ血圧を低下させるために、プロスタグランジンに類似したシクロペンタン誘導体と組み合わせてメトホルミンを使用することも提案された(米国特許第4182772号−Hoechst社)。 Furthermore, as coronary vasodilators, and in order to lower blood pressure, it has also been proposed to use metformin in combination with cyclopentane derivatives similar to prostaglandins (U.S. Pat. No. 4,182,772 -Hoechst Inc.). メトホルミンはまた、2−ヒドロキシ−3,3,3−トリフルオロプロピオン酸誘導体(米国特許第4107329号−ICI社)、1,2−ジアリールエチレン誘導体(米国特許第4061772号−Hoechst社)、置換されたアリールオキシ−3,3,3-トリフルオロ−2−プロピオン酸、エステル及び塩(米国特許第4055595号−ICI社)、置換されたヒドロキシフェニル−ピペリドン(米国特許第4024267号−Hoechst社)、並びに部分水素化1H−インデノ−[1,2B]−ピリジン誘導体(米国特許第3980656号−Hoechst社)と組み合わせて使用してコレステロールを低下させるのに使用することも提案された。 Metformin also 2-hydroxy-3,3,3-trifluoropropionic acid derivatives (U.S. Pat. No. 4,107,329 No. -ICI Co.), 1,2-diaryl ethylene derivative (U.S. Pat. No. 4,061,772 -Hoechst Co.), substituted aryloxy-3,3,3-trifluoro-2-propionic acid, esters and salts (U.S. Pat. No. 4,055,595 No. -ICI Co.), substituted hydroxyphenyl - piperidone (U.S. Pat. No. 4,024,267 -Hoechst Co.) as well as partially hydrogenated 1H- indeno - [1,2B] - it has also been proposed to use in combination with the pyridine derivative (U.S. Pat. No. 3980656 -Hoechst Co.) is used to lower cholesterol.

[00226]Montanari他(Pharmacological Research、第25巻、第1号1992年)は、500mgの量のメトホルミンを1日2回(b.i.d.)使用すると、メトホルミン850mgを1日3回(t.i.d.)に類似した様式で虚血後の血流量を増加させたことを開示している。 [00226] Montanari other (Pharmacological Research, Vol. 25, No. 1, 1992) is, 500 mg of the amount of metformin twice a day (b.i.d.) Using, metformin 850 mg per day 3 times ( discloses that increased blood flow after ischemia in a manner similar to t.i.d.). Sirtori他(J.Cardiovas.Pharm.、6:914〜923頁、1984年)は、850mgの量のメトホルミンを1日3回(t.i.d.)使用すると、末梢血管疾患を有する患者の動脈流量を増加させたことを開示している。 Sirtori other (J.Cardiovas.Pharm, 6:. 914~923 pages 1984) three times a day of metformin in an amount of 850mg if (t.i.d.) use, in patients with peripheral vascular disease It discloses that increased arterial flow.

[00227]本発明は、本発明の改変GLP−1又はその融合タンパク質をメトホルミンなど1種又は複数種の治療用物質と組み合わせて含む、様々な疾患の治療を提供する。 [00227] The present invention cover the modifications GLP-1 or a fusion protein of the present invention in combination with one or more therapeutic agents such as metformin, to provide a treatment of various diseases. 一実施形態では、メトホルミンと組み合わせた改変GLP−1又はその融合タンパク質は、糖尿病など異常な血中グルコースレベルを伴う疾患及び状態を治療するのに使用される。 In one embodiment, the modified GLP-1 or a fusion protein in combination with metformin is used to treat diseases and conditions associated with abnormal blood glucose levels, such as diabetes. 好ましくは、メトホルミンと組み合わせたGLP−1/mTf融合タンパク質は、II型糖尿病又は肥満を治療するのに使用される。 Preferably, GLP-1 / mTf fusion protein in combination with metformin is used to treat type II diabetes or obesity.

[00228]本発明の改変GLP−1及びその融合タンパク質と組み合わせて使用することができる他の治療用物質としては、それだけには限らないが、スルホニル尿素及びスルホニル尿素様の物質、チアゾリジンジオン、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体(PPAR)γ調節物質、PPARα調節物質、プロテインチロシンホスファターゼ−1B阻害剤、インスリン受容体チロシンキナーゼ活性化因子、11β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ阻害剤、グリコーゲンホスホリラーゼ阻害剤、グルコキナーゼ活性化因子、β−3アドレナリン作動薬、及びグルカゴン受容体アゴニストが挙げられる。 [00228] Other therapeutic agents that can be used in combination with modified GLP-1 and its fusion proteins of the present invention, but are not limited to, sulfonylurea and sulfonylurea-like agents, thiazolidinediones, peroxisome proliferator activated receptor (PPAR) gamma modulators, PPARa modulator, protein tyrosine phosphatase -1B inhibitors, insulin receptor tyrosine kinase activator, 11 [beta] - hydroxysteroid dehydrogenase inhibitors, glycogen phosphorylase inhibitors, glucokinase activators factor, beta-3 adrenergic agonists, and include glucagon receptor agonists.

DPP−IV阻害剤 DPP-IV inhibitor
[00229]DPP−IVの阻害剤は、DPP−IVによって媒介される様々な状態を処置する際に有望であることが示された。 [00229] Inhibitors of DPP-IV has been shown to be promising in treating various conditions mediated by DPP-IV. 例えば、DPP−IVの阻害剤は、耐糖能異常の治療において、かつII型糖尿病や肥満など高血糖を伴う疾患において非常に有望なアプローチである。 For example, inhibitors of DPP-IV in the treatment of impaired glucose tolerance, and a very promising approach in diseases involving hyperglycemia such as type II diabetes and obesity. さらに、DPP−IVは、移植拒絶反応などの免疫応答においてある役割を果たしていることが示された(Transplantation 1997年、63(10):1495〜1500頁)。 Moreover, DPP-IV has been shown to play a role in immune responses, such as transplant rejection (Transplantation 1997 years, 63 (10): 1495-1500, pp). したがって、DPP−IVは、移植拒絶反応を予防するのにも有用となり得る。 Thus, DPP-IV may also be useful in preventing transplant rejection. また、DPP−IVの阻害剤は、肺の内皮DPP−IVが癌性細胞のフィブロネクチンに結合することによりそれらの細胞の転移が促進されるため、癌の治療及び癌転移の防止においても有用となり得る(J.Biol.Chem.1998年、273(37):24207〜24215頁)。 Also, inhibitors of DPP-IV, since endothelial DPP-IV in the lung metastasis of those cells is promoted by binding to fibronectin of cancerous cells, also be useful in the prevention of cancer therapy and cancer metastasis get (J.Biol.Chem 1998 years, 273 (37):. 24,207 to 24,215 pages). DPP−IVは、同様に、歯周炎の病因において重要な役割を果たし(Infect.Immun.2000年、68(2)、716〜724頁)、かつGLP−2、すなわち広範囲切除後の腸の復元を促進する因子の不活性化を司っていると考えられている。 DPP-IV is likewise play an important role in the pathogenesis of periodontitis (Infect. 2000 year, 68 (2), pp. 716-724), and GLP-2, i.e. intestinal after extensive resection It is believed responsible for the inactivation of factors that promote recovery. したがって、DPP−IV阻害剤は、腸の復元においても有用な可能性がある。 Therefore, DPP-IV inhibitors may be useful also in the recovery of the intestine.

[00230]国際公開第95/15309号パンフレットでは、DPP−IVの阻害剤であり、したがっていくつかのDPP−IVに媒介されたプロセスを処置するのに有用であるいくつかのペプチド誘導体を開示している。 [00230] In the WO 95/15309 pamphlet, inhibitors of DPP-IV, thus discloses a number of several peptide derivatives are useful for treating mediated processes DPP-IV ing. 国際公開第95/13069号パンフレットでは、天然又は内因性の成長ホルモンの放出を刺激するのに有用であるいくつかの環状アミン化合物を開示している。 In WO 95/13069 pamphlet, discloses several cyclic amine compounds that are useful for stimulating the release of natural or endogenous growth hormone. 欧州特許第555824号では、トロンビン時間を延長し、かつトロンビン及びセリンに関連したプロテアーゼを阻害するいくつかのベンゾイミダゾリル化合物を開示している。 In EP 555 824, discloses several benzimidazolyl compounds prolong the thrombin time and inhibit the associated protease thrombin and serine. Archives of Biochemistry and Biophysics、第323巻、第1号、148〜154頁(1995年)では、DPP−IV阻害剤として有用であるいくつかのアミノアシルピロリジン−2−ニトリルを開示している。 Archives of Biochemistry and Biophysics, # 323, Vol, No. 1, at pp. 148-154 (1995), discloses several aminoacyl pyrrolidine-2-carbonitrile is useful as a DPP-IV inhibitor. Journal of Neurochemistry、第66巻、2105〜2112頁(1996年)では、プロリルオリゴペプチダーゼを阻害するのに有用であるいくつかのFmoc−アミノアシルピロリジン−2−ニトリルを開示している。 Journal of Neurochemistry, Vol. 66, at pp. 2105-2112 (1996), discloses several Fmoc- aminoacyl pyrrolidine-2-carbonitrile is useful in inhibiting prolyl oligopeptidase. Bulletin of the Chemical Society of Japan、第50巻、第7号、1827〜1830頁(1977年)では、アミノヘキサペプチド、すなわちZ−Val−Val−lmPro−Gly−Phe−Phe−OMe、及びそれに関連したアミノペプチドの合成を開示している。 Bulletin of the Chemical Society of Japan, Vol. 50, No. 7, in pp 1827 to 1830 (1977), amino hexapeptide, i.e. Z-Val-Val-lmPro-Gly-Phe-Phe-OMe, and its associated It discloses the synthesis of the amino peptide. さらに、前記化合物の抗菌特性を検査した。 Furthermore, it was examined antimicrobial properties of the compound. 国際公開第90/12005号パンフレットでは、プロリルエンドペプチダーゼ活性を阻害し、したがって認知症又は健忘症を治療するのに有用であるいくつかのアミノ酸化合物を開示している。 In WO 90/12005 pamphlet discloses inhibiting prolyl endopeptidase activity and therefore some of the amino acid compounds useful in treating dementia or amnesia. Derwent Abstract 95:302548頁では、コリンエステラーゼ活性の低下に起因する状態を処置するのに有用な高い末梢選択性を有するコリンエステラーゼ活性化因子である、いくつかのN−(アリール(アルキル)カルボニル)置換された複素環系化合物を開示している。 Derwent Abstract 95: The page 302,548, a cholinesterase activators with high useful peripheral selectivity in treating conditions caused by decreased cholinesterase activity, some N- (aryl (alkyl) carbonyl) substituted It discloses heterocyclic compounds. Chemical Abstracts 84:177689頁では、アンギオテンシン変換酵素(ACE)阻害活性を示すプロリン化合物の中間体として有用であるいくつかの1−アシル−ピロリジン−2−カルボニトリル化合物を開示している。 Chemical Abstracts 84: The page 177,689, some 1-acyl useful as intermediates for proline compounds exhibiting angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitory activity - discloses pyrrolidine-2-carbonitrile compound. Chemical Abstracts 96:116353頁では、様々な癌腫又は骨髄性白血病を治療するのに有用なRasファルネシル−トランスフェラーゼ阻害剤であるいくつかの3−アミノ−2メルカプト−プロピル−プロリン化合物を開示している。 Chemical Abstracts 96: The page 116,353, various carcinomas or useful Ras farnesyl in treating myelogenous leukemia - discloses proline compounds - some 3-amino-2-mercapto an transferase inhibitor - propyl. 国際公開第95/34538号パンフレットでは、DPP−IVを阻害し、したがって、DPP−IV阻害によって寛解される状態を処置するのに有用である、いくつかのピロリジド、ホスホナート、アゼチジン、ペプチド及びアザプロリンを開示している。 In WO 95/34538 pamphlet, inhibit DPP-IV, and thus are useful in treating conditions ameliorated by DPP-IV inhibition, some pyrrolidide, phosphonate, azetidine, peptides and Azapurorin It discloses. 国際公開第95/29190号パンフレットでは、酵素DPP−IVに対する複数の提示を可能にし、かつそれに対する親和性を有するペプチドマトリックスによって支持された複数のKPR型の繰り返しパターンを特徴とするいくつかの化合物を開示しており、これらの化合物は細胞中へのHIVの侵入を阻害する能力を示す。 In WO 95/29190 pamphlet, and allows multiple presentation to the enzyme DPP-IV, and a number of compounds characterized by a plurality of KPR iterative pattern supported by a peptide matrix having affinity for it It discloses, these compounds show the ability to inhibit the entry of HIV into cells. 国際公開第91/16339号パンフレットでは、IL−2抑制によって媒介される自己免疫性の疾患及び状態を治療するのに有用なDPP−IV阻害剤であるいくつかのテトラペプチドボロン酸を開示している。 In WO 91/16339 pamphlet, discloses several tetrapeptide boronic acids which are useful DPP-IV inhibitors to treat autoimmune diseases and conditions mediated by IL-2 suppression there. 国際公開第93/08259号パンフレットでは、IL−2抑制によって媒介される自己免疫性の疾患及び状態を治療するのに有用なDPP−IV阻害剤であるいくつかのポリペプチドボロン酸を開示している。 In WO 93/08259 pamphlet, discloses several polypeptide boronic acids which are useful DPP-IV inhibitors to treat autoimmune diseases and conditions mediated by IL-2 suppression there. 国際公開第95/11689号パンフレットでは、HIVの細胞侵入を阻止するのに有用なDPP−IV阻害剤であるいくつかのテトラペプチドボロン酸を開示している。 In WO 95/11689 pamphlet, discloses several tetrapeptide boronic acids which are DPP-IV inhibitors useful for inhibiting cell entry of HIV. 東ドイツ特許第158109号では、特にDPP−IV阻害剤として有用である、いくつかのN−保護されたペプチジル−ヒドロキサム酸及びニトロベンゾイルオキサミドを開示している。 In East German Patent No. 158,109, particularly useful as DPP-IV inhibitors, some N- protected peptidyl - discloses hydroxamic acid and nitrobenzoyl oxamide. 国際公開第95/29691号パンフレットでは、免疫系障害の治療において有用なDPP−IV阻害剤であるいくつかのジペプチドプロリンホスホナートを特に開示している。 In WO 95/29691 pamphlet, especially discloses several dipeptide proline phosphonates which are useful DPP-IV inhibitors in the treatment of immune system disorders. ドイツ特許DD296075では、DPP−IVを阻害するいくつかのアミノ酸アミドを開示している。 In German patent DD296075, discloses several amino acid amide to inhibit DPP-IV. Biochimica et Biophysica Acta、1293巻、147〜153頁では、側鎖の改変がDPP−IV及びPEPに触媒された加水分解に与える影響を研究するために、いくつかのジ及びトリペプチドp−ニトロアニリドの調製を開示している。 Biochimica et Biophysica Acta, 1293 Volume in pages 147 to 153, in order to study the effect on hydrolysis modification of the side chains is catalyzed DPP-IV and PEP, some di- and tripeptides p- nitroanilide It discloses the preparation. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters、第6巻、第10号、1163〜1166頁(1996年)では、DPP−IV阻害剤であるいくつかの2−シアノピロリジンを開示している。 Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, Vol. 6, No. 10, at pp. 1163-1166 (1996), discloses several 2-cyano pyrrolidines a DPP-IV inhibitor. J. J. Med. Med. Chem. Chem. 、第39巻、2087〜2094頁(1996年)では、DPP−IVの阻害剤であるいくつかのプロリンボロン酸含有ジペプチドを開示している。 , Vol. 39, at pp. 2087-2094 (1996), discloses several proline boronic acid-containing dipeptides which are inhibitors of DPP-IV. Diabetes、第44巻、1126〜1131頁(1996年9月)は、糖尿病及び非糖尿病の対象に皮下又は静脈内の経路によって投与された場合にGLP−Iアミドが急速に分解されることを実証する研究を対象としている。 Diabetes, Vol. 44, pp. 1126-1131 (September 1996) is demonstrated that GLP-I amide is rapidly degraded when administered by subcutaneous routes, or intravenously to a subject diabetic and non-diabetic It is directed to research that.

[00231]米国特許第6727261号では、糖尿病、特に非インスリン依存性糖尿病、及び耐糖能障害などDPP−IVに関連付けられている疾患の治療及び/又は予防のために有用な新規のDPP−IV阻害剤としてピリド[2,1−a]イソキノリン誘導体を提供する。 [00231] In U.S. Patent No. 6,727,261, diabetes, particularly non-insulin dependent diabetes mellitus, and DPP-IV inhibitors useful novel for the treatment and / or prophylaxis of diseases which are associated with DPP-IV such as impaired glucose tolerance providing pyrido [2,1-a] isoquinoline derivatives as agents. これらの化合物はまた、腸(Bowl)疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病(MorbusCrohn)、肥満及び/又は代謝症候群の治療及び/又は予防にも有用である。 These compounds are also intestine (Bowl) disease, ulcerative colitis, Crohn's disease (MorbusCrohn), it is also useful for the treatment and / or prevention of obesity and / or metabolic syndrome.

[00232]米国特許第6716843号では、DPP−IVの阻害剤として有用なα−アミノ酸スルホニル化合物を提供する。 [00232] In U.S. Patent No. 6,716,843, provides useful α- amino sulfonyl compound as an inhibitor of DPP-IV.

[00233]米国特許第6645995号では、複素環中の窒素原子がアミド結合又はペプチド結合を介してアミノ酸又はアミノ酸誘導体に結合されている、2位置換の不飽和複素環系化合物を開示している。 [00233] In U.S. Patent No. 6,645,995 discloses a nitrogen atom in the heterocyclic ring is bonded to an amino acid or amino acid derivative via an amide bond or a peptide bond, the 2-substituted unsaturated heterocyclic compounds . これらの化合物はDPP−IVの強力かつ選択的な阻害剤であり、DPP−IVの阻害によって調節又は正常化され得る状態を治療する際に有効である。 These compounds are potent and selective inhibitors of DPP-IV, it is effective in treating conditions that may be regulated or normalized by inhibition of DPP-IV.

[00234]米国特許第6617340号では、N−(置換グリシル)ピロリジン、及びジペプチジルペプチダーゼ−IVの阻害における前記化合物の使用を開示している。 [00234] In U.S. Patent No. 6,617,340, N-discloses the use of (substituted glycyl) pyrrolidine, and dipeptidyl peptidase said compound in inhibiting the -IV. 米国特許第6124305号では、DPP−IVを阻害するN−(置換グリシル)−2−シアノピロリジンを開示している。 In U.S. Patent No. 6124305 discloses a DPP-IV inhibiting N- (substituted glycyl) -2-cyano pyrrolidines. これらの化合物は、DPP−IVによって媒介される状態を処置する際に効果的である。 These compounds are effective in treating conditions mediated by DPP-IV.

[00235]ノバルティス(Novartis)製の化合物1−[[[2−[(5−シアノピリジン−2−イル)アミノ]エチル]アミノ]アセチル]−2−シアノ−(S)−ピロリジン(NVP DPP728)を4週間に渡って2型糖尿病患者93名(HbA 1c平均値7.4%)に投与すると、4週間の研究期間に渡って血漿グルコース、インスリン及びHbA 1cのレベルが低下した(Diabetes Care 2002年、25(5):869〜875頁を参照されたい)。 [00235] Novartis (Novartis) made of compound 1 - [[[2 - [(5-cyano-2-yl) amino] ethyl] amino] acetyl] -2-cyano - (S) - pyrrolidine (NVP DPP728) when administered to a over 4 weeks patients with type 2 diabetes 93 patients (HbA 1c mean 7.4%), plasma glucose over the study period of 4 weeks, levels of insulin and HbA 1c is lowered (diabetes Care 2002 year, 25 (5): pp. 869-875).

DPP−IVの阻害剤を用いた併用療法 Combination therapy with inhibitors of DPP-IV
[00236]一態様では、本発明は、様々な状態の処置のために1種又は複数種のDPP−IV阻害剤と組み合わせた、治療用タンパク質、ポリペプチド又はペプチドを含むトランスフェリン融合タンパク質の使用を提供する。 [00236] In one aspect, the present invention is, in combination with one or more DPP-IV inhibitors for the treatment of various conditions, a therapeutic protein, the use of the transferrin fusion protein comprising a polypeptide or peptide provide. 本発明は、トランスフェリン融合タンパク質及び1種又は複数種のDPP−IV阻害剤を含む薬剤組成物を提供する。 The present invention provides a pharmaceutical composition comprising a transferrin fusion protein and one or more DPP-IV inhibitors. その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願第10/378,094号で開示されているように、治療用タンパク質、ポリペプチド又はペプチドに結合されるトランスフェリンは改変されてもよい。 As disclosed in U.S. Patent Application Serial No. 10 / 378,094 in its entirety is incorporated herein by reference, therapeutic proteins, transferrin attached to the polypeptide or peptide may be modified. これは、グリコシル化の低減を示し得る。 This may indicate a reduction in glycosylation. 改変されたトランスフェリンポリペプチドは、単一のトランスフェリンNドメイン、単一のトランスフェリンCドメイン、トランスフェリンのN及びCドメイン、2つのトランスフェリンNドメイン、並びに2つのトランスフェリンCドメインからなる群から選択することができる。 Modified transferrin polypeptide may be selected single transferrin N domain, a single transferrin C domain, N and C domains of Transferrin, two transferrin N domains, and from the group consisting of two transferrin C domains . トランスフェリンに結合される治療用タンパク質又はペプチドは、天然型でも改変型でもよい。 Therapeutic protein or peptide is bound to transferrin may be modified in the native. 好ましくは、トランスフェリン融合タンパク質は、米国特許出願第10/378,094号で説明されているように、改変トランスフェリン分子に連結された、治療用ペプチドとしてのGLP−1を含む。 Preferably, the transferrin fusion protein, as described in U.S. Patent Application Serial No. 10 / 378,094, including linked to a modified transferrin molecule, the GLP-1 as a therapeutic peptide. さらに、本発明の併用療法は、GLP−1/mTf融合タンパク質、1種又は複数種のDPP−IV阻害剤、及び別の治療用分子を含む。 Furthermore, the combination therapies of the invention comprise GLP-1 / mTf fusion protein, one or more DPP-IV inhibitors, and other therapeutic molecules. このような分子は「Glucophage(登録商標)」又は「Glucophage(登録商標)XR」である。 Such molecules are "Glucophage (R)" or "Glucophage (registered trademark) XR".

[00237]別の態様では、本発明は、1種又は複数種のDPP−IV阻害剤と組み合わせた、ジペプチジルプロテアーゼ切断に抵抗性である改変されたタンパク質若しくはペプチド又はその融合タンパク質の使用を提供する。 In the 00237] In another aspect, the invention provides that one or in combination with plural kinds of DPP-IV inhibitor, the use of dipeptidyl protease cleavage resistant and is modified protein or peptide or a fusion protein to. 本発明は、改変されたタンパク質若しくはペプチド又はその融合タンパク質を、1種又は複数種のDPP−IV阻害剤と組み合わせて含む薬剤組成物を開示する。 The present invention is a modified protein or peptide or a fusion protein, discloses a pharmaceutical composition comprising in combination with one or more DPP-IV inhibitors. 好ましくは、改変ペプチドは改変GLP−1であり、融合タンパク質は、改変GLP−1/mTfタンパク質である。 Preferably, the modified peptide is modified GLP-1, the fusion protein is a modified GLP-1 / mTf protein. さらに、本発明の併用療法は、改変GLP−1又は改変GLP−1/mTf融合タンパク質、1種又は複数種のDPP−IV阻害剤、及び「Glucophage(登録商標)」や「Glucophage(登録商標)XR」など別の治療用分子も含む。 Furthermore, the combination therapies of the invention, the modified GLP-1 or modified GLP-1 / mTf fusion protein, one or more DPP-IV inhibitors, and "Glucophage (R)" and "Glucophage (R) XR "also includes another therapeutic molecules such as.

[00238]DPP−IV阻害剤は、任意の関連疾患を治療するための本発明の方法において使用することができる。 [00238] DPP-IV inhibitors can be used in the methods of the invention to treat any relevant disease. 例えば、本明細書において説明するGLP−1−トランスフェリン融合タンパク質は、糖尿病前症、糖尿病、肥満又は糖尿病症状を治療するための1−[[[2−[(5−シアノピリジン−2−イル)アミノ]エチル]アミノ]アセチル]−2−シアノ−(S)−ピロリジン(NVP DPP728)などのDPP−IV阻害剤と併用することができる。 For example, GLP-1-transferrin fusion proteins described herein, prediabetes, diabetes, 1 for the treatment of obesity or diabetes symptoms - [[[2 - [(5-cyano-2-yl) amino] ethyl] amino] acetyl] -2-cyano - (S) - pyrrolidine (NVP DPP728) can be used in combination with a DPP-IV inhibitor such as. これらの治療用物質は逐次的に又は同時に投与してよい。 These therapeutic agents may be administered sequentially or simultaneously.

[00239]トランスフェリン融合タンパク質は、GLP−1(7−37)ペプチド(配列番号32)又はGLP−1(7−36)ペプチド(配列番号32のアミノ酸1〜30)を含み得る。 [00239] Transferrin fusion proteins may include GLP-1 (7-37) peptide (SEQ ID NO: 32) or GLP-1 (7-36) peptide (amino acids 1-30 of SEQ ID NO: 32). より好ましくは、GLP−1(7−37)ペプチド又はGLP−1(7−36)ペプチドは、A8からG及びK34からAへの変異を含む。 More preferably, GLP-1 (7-37) peptide or GLP-1 (7-36) peptide comprises a mutation of G to A and K34 from A8. トランスフェリンタンパク質はまた、GLP−1(7−37)ペプチド又はGLP−1(7−36)ペプチドとトランスフェリン分子の間にリンカーを含んでもよい。 Transferrin protein may also comprise a linker between the GLP-1 (7-37) peptide or GLP-1 (7-36) peptide and the transferrin molecule. 好ましくは、リンカーは(PEAPTD) ペプチドである。 Preferably, the linker is (PEAPTD) 2 peptide.

エンドペプチダーゼ阻害剤を用いた併用療法による、融合タンパク質の薬物動態及び薬力の向上 By combination therapy with an endopeptidase inhibitors, improved pharmacokinetics and pharmacodynamics force of the fusion protein
[00240]本発明はまた、中性エンドペプチダーゼ(NBP)阻害剤及びトランスフェリン融合タンパク質を用いた併用療法も提供する。 [00240] The present invention also provides combination therapy using neutral endopeptidase (NBP) inhibitors and transferrin fusion proteins. さらに、本発明はまた、NBP阻害剤及びDPP−IV阻害剤並びにトランスフェリン融合タンパク質を用いた併用療法も含む。 Furthermore, the present invention also includes combination therapy with NBP inhibitor and a DPP-IV inhibitor and the transferrin fusion protein. NEP阻害剤及びDPP−IV阻害剤は、同時に又は逐次的に投与してよい。 NEP inhibitor and a DPP-IV inhibitor may be administered simultaneously or sequentially. さらに、これらの阻害剤及びトランスフェリン融合タンパク質も、同時に又は逐次的に投与してよい。 Additionally, these inhibitors and transferrin fusion proteins may be administered simultaneously or sequentially. これらの阻害剤は、トランスフェリン融合タンパク質を投与する前又は後に投与してよい。 These inhibitors may be administered before or after administering the transferrin fusion protein.

[00241]トランスフェリン融合タンパク質は、GLP−1(7−37)ペプチド(配列番号32)又はGLP−1(7−36)ペプチド(配列番号32のアミノ酸1〜30)を含む。 [00241] Transferrin fusion protein includes GLP-1 (7-37) peptide (SEQ ID NO: 32) or GLP-1 (7-36) peptide (amino acids 1-30 of SEQ ID NO: 32). より好ましくは、GLP−1(7−37)ペプチド又はGLP−1(7−36)ペプチドは、A8からG及びK34からAへの変異を含む。 More preferably, GLP-1 (7-37) peptide or GLP-1 (7-36) peptide comprises a mutation of G to A and K34 from A8. トランスフェリンタンパク質はまた、GLP−1(7−37)ペプチド又はGLP−1(7−36)ペプチドとトランスフェリン分子の間にリンカーを含んでもよい。 Transferrin protein may also comprise a linker between the GLP-1 (7-37) peptide or GLP-1 (7-36) peptide and the transferrin molecule. 好ましくは、リンカーは(PEAPTD) ペプチドである。 Preferably, the linker is (PEAPTD) 2 peptide.

[00242]エンケファリナーゼ、ネプリライシン及びアトリオペプチダーゼとしても公知の中性エンドペプチダーゼ(NEP)は、脳、腎臓、肺、胃腸管、心臓及び末梢血管系を含めて多くの組織中に存在する膜結合型亜鉛メタロエンドペプチダーゼである。 [00242] enkephalinase, neprilysin and Atrio Bae known neutral endopeptidase as peptidase (NEP), the film bonds present in many tissues, including brain, kidney, lungs, gastrointestinal tract, heart and peripheral vasculature it is the type zinc metallo endopeptidase. NEPは、循環しているナトリウム利尿ペプチドを分解し、それにより血管拡張、血圧及び血液量に対するそれらの影響を防ぐことによって、ナトリウム利尿ペプチドのクリアランスにおいて重要な役割を果たしている。 NEP decomposes the natriuretic peptides in circulation, thereby vasodilation, by preventing their effect on blood pressure and blood volume, play an important role in the clearance of natriuretic peptides. NEPは、ナトリウム利尿ペプチドを分解及び不活性化することによって、高血圧、心不全及び腎不全に関連している。 NEP, by decomposing and inactivating the natriuretic peptides, hypertension has been associated with heart failure and renal failure.

[00243]循環しているナトリウム利尿ペプチドを分解することに加えて、NEPは、循環しているブラジキニン;アドレノメデュリン、腎臓の血管拡張性かつナトリウム排泄増加性の利尿ペプチド;及び/又はウロジラチン、すなわちANPの腎臓型を含めて、他の血管拡張性物質も分解する。 [00243] In addition to degrading natriuretic peptides in circulation, NEP is bradykinin circulates; adrenomedullin, renal vasodilating and natriuretic diuretic peptide; and / or urodilatin, i.e. ANP including kidney type, it decomposes other vasodilating substance.

[00244]NEPは、血管収縮薬であるエンドセリンアイソフォームET1の分解にも関与しており、かつET−1の形成にも関与している可能性がある(Brunner−La Rocca他、Cardiovascular Research 51(2001年)510〜520頁)。 [00244] NEP is also the degradation of endothelin isoforms ET1 is vasoconstrictor are involved, and there may be involved in the formation of ET1 (Brunner-La Rocca other, Cardiovascular Research 51 (2001), pp. 510-520). NEPはまた、強力な血管収縮薬であるアンギオテンシンII、エンドモルフィン、並びにブラジキニン、GLP−1(Hupe−Sodmann,K.、McGregor,G P.、Bridenbaugh,R他 Regulatory Peptides 1995年;58:149〜56頁、Hupe−Sodmann,K、Goeke,R.、Goeke,B他 Peptides 1997年;18:625〜32頁)、PYY(Medeiros MD、Turner AJ.、Endocrinology.1994年5月;134(5):2088〜94頁)、及びグルカゴン(Trebbien R他 Am J Physiol Endocrinol Metab.2004年9月;287(3):E431〜8)など代謝に関与し NEP also angiotensin II, endomorphin a potent vasoconstrictor, and bradykinin, GLP-1 (Hupe-Sodmann, K., McGregor, G P., Bridenbaugh, R other Regulatory Peptides 1995 Jan; 58: 149~ 56 pp., Hupe-Sodmann, K, Goeke, R., Goeke, B other Peptides 1997 Jan; 18: 625-32 pp), PYY (.. Medeiros MD, Turner AJ, Endocrinology 5 May 1994; 134 (5) : pp. 2088-94), and glucagon (Trebbien R other Am J Physiol Endocrinol Metab 9 2004; 287 (3.): E431~8) such as involved in the metabolism いるいくつかのペプチドも分解する。 Decomposes even some of the peptides are.

[00245]ホスホラミドンやNEP/ACE阻害剤などいくつかのNEP阻害剤(米国特許第5508272号で開示されているオマパトリラト、米国特許第5552397号で開示されているゲムパトリラト(gempatrilat)、米国特許第5430145号で開示されているサムパトリラト及びMDL100240を含む)が、例えば高血圧及び心不全の単独治療処置用に有用であるとして文献で報告された。 [00245] Some NEP inhibitors such as phosphoramidon or NEP / ACE inhibitors (U.S. Patent No. 5,508,272 disclosed No. omapatrilat, disclosed in U.S. Pat. No. 5,552,397 Gemupatorirato (Gempatrilat), U.S. Patent No. 5,430,145 in including sampatrilat and MDL100240 disclosed) it is, for example, have been reported in the literature as being useful for monotherapy treatment of hypertension and heart failure. Nathisuwan他、「A Review of Vasopeptidase Inhibitors:A New Modality in the Treatment of Hypertension and Chronic Heart Failure」、Pharmacotherapy、第22巻(1)、27〜42頁(2002年)。 Nathisuwan et al., "A Review of Vasopeptidase Inhibitors: A New Modality in the Treatment of Hypertension and Chronic Heart Failure", Pharmacotherapy, Vol. 22 (1), pp. 27-42 (2002). カンドキサトリル及びエカドトリルは、心不全の将来の薬物として臨床試験が現在実施されている、2種の極めて特異的なNEP阻害剤である。 Candoxatril and ecadotril are clinical trials as future drugs for heart failure is in effect, a two very specific NEP inhibitors. どちらの化合物も、体内で代謝されて同種の活性を持つものになるプロドラッグである。 Both compounds are prodrugs which become those are metabolized in the body with the same type of activity. カンドキサトリルは肝臓中で活性化されてカンドキサトリラトになるのに対し、エカドトリルはその同種の活性を持つS−チオルファンに変換される。 Candoxatril whereas becomes cans Doki Satori Lato activated in the liver, ecadotril is converted to S- thiorphan with the activity of its cognate.

[00246]ACE/NEP阻害剤の一部の例が、米国特許第5508272号、第5362727号、第5366973号、第5225401号、第4722810号、第5223516号、第5552397号、第4749688号、第5504080号、第5612359号、及び第5525723号、並びに欧州特許出願第0481,522号、第0534363 A2号、第534,396号、及び第534,492号で開示されている。 [00246] Some examples of ACE / NEP inhibitors, U.S. Patent No. 5,508,272, No. 5,362,727, No. 5,366,973, No. 5,225,401, No. 4,722,810, No. 5,223,516, No. 5,552,397, No. 4,749,688, No. No. 5504080, No. 5612359, and No. 5525723, and European Patent application No. 0481,522, No. 0,534,363 No. A2, disclosed in Patent No. 534,396, and No. 534,492.

[00247]本発明は、様々な疾患又は状態を治療するための、トランスフェリン融合タンパク質並びにDPP−IV阻害剤及び又はACE/NEP阻害剤を含む併用療法を提供する。 [00247] The present invention provides methods for treating various diseases or conditions, provide for combination therapy comprising transferrin fusion proteins and DPP-IV inhibitor and or ACE / NEP inhibitors. このような疾患又は状態としては、それだけには限らないが、糖尿病、好ましくはII型糖尿病、うっ血性心不全、肥満、高血圧及び過敏性腸症候群が挙げられる。 Such diseases or conditions include, but are not limited to, diabetes, preferably type II diabetes, congestive heart failure, obesity, and high blood pressure and irritable bowel syndrome.

トランスジェニック動物 Transgenic animal
[00248]DPP活性から保護されている改変されたポリペプチド又はペプチドを発現するトランスジェニック非ヒト動物の作製が、本発明の一実施形態において企図される。 [00248] Preparation of transgenic non-human animal expressing a modified polypeptide or peptide are protected from DPP activity is contemplated in one embodiment of the present invention. いくつかの実施形態では、高い安定性を有する改変されたポリペプチド又はペプチドを含む融合タンパク質を発現するトランスジェニック非ヒト動物が企図される。 In some embodiments, the transgenic non-human animal expressing a fusion protein comprising modified polypeptides or peptides having high stability are contemplated.

[00249]例えば、その内容の全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第6291740号(2001年9月18日発行);米国特許第6281408号(2001年8月28日発行);及び米国特許第6271436号(2001年8月7日発行)などいくつかの特許及び刊行物において、成功裡なトランスジェニック非ヒト動物作製が説明された。 [00249] For example, herein incorporated U.S. Pat. No. 6,291,740 (Sep. 18, 2001 issue) by reference in its entirety for its contents; U.S. Pat. No. 6,281,408 (issued Aug. 28, 2001); and U.S. in Patent No. 6271436 (issued Aug. 7, 2001), etc. several patents and publications, successful transgenic nonhuman animal produced have been described.

[00250]乳牛、ブタ、ヤギ、ウマ、ウシ及びヒツジを含む家畜化された哺乳動物などの動物の遺伝的性質を改変することができると、いくつかの商業的応用が可能となる。 [00250] cows, pigs, goats, horses, to be able to modify the genetic characteristics of the animals, such as domesticated mammals including cows and sheep, it is possible to some commercial applications. これらの応用には、大量の外因タンパク質を容易に回収される形態で発現する(すなわち、乳汁又は血液中への発現)動物の作製、体重増加、飼料効率、枝肉組成、乳汁産生又は産生量、耐病性及び特定の微生物による感染に対する抵抗性の増大した動物の作製、並びに向上した成長速度又は生殖能力を有する動物の作製が含まれる。 These applications, are expressed in the form that is easily recovered large quantities of exogenous proteins (i.e., expression into the milk or blood) Preparation of animal weight gain, feed efficiency, carcass composition, milk production or production amount, disease resistance and production of specific microorganisms by increased resistance animals against infection, as well as production of animals with growth rate or reproductive capacity was improved. ゲノム中に外因性DNA配列を含む動物は、トランスジェニック動物と呼ばれる。 Animal comprising an exogenous DNA sequence into the genome are referred to as transgenic animals.

[00251]トランスジェニック動物作製のために最も広く使用されている方法は、受精胚の前核中へのDNAのマイクロインジェクションである(Wall他、J.Cell.Biochem.49:113頁[1992年])。 [00251] The method most widely used for producing transgenic animals are microinjection of DNA into pronuclei of fertilized embryos (Wall other, J.Cell.Biochem.49: 113 pp [1992 ]). トランスジェニック動物作製のための他の方法としては、レトロウイルス又はレトロウイルスベクターによる胚の感染が挙げられる。 Other methods for producing transgenic animals include the infection of embryos with retroviruses or retroviral vectors. 野生型又は組換型のレトロウイルスによる着床前及び着床後の双方のマウス胚の感染が報告された(Janenich、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 73:1260頁[1976年];Janenich他、Cell 24:519頁[1981年];Stuhlmann他、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:7151頁[1984年];Jahner他、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:6927頁[1985年];Van der Putten他、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:6148〜6152頁[1985年];Stewart他、EMBO J.6:383〜388頁[1987年])。 Infection of both mouse embryos after preimplantation and implantation by the wild-type or recombinant retroviruses has been reported (Janenich, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 73: 1260, pp. [1976]; Janenich other, Cell 24: 519 pp [1981]; Stuhlmann other, Proc 81: pp. 7151 [1984]; Jahner other, Proc 82: pp 6927 [ 1985]; Van der Putten other, Proc 82: pp 6148-6152 [1985]; Stewart other, EMBO J.6: pp 383-388 [1987]).

[00252]胚をレトロウイルスに感染させるための代替手段は、マウス胚の卵割腔中へのウイルス又はウイルス産生細胞の注入である(Jahner,D.他、Nature 298:623頁[1982年])。 [00252] Alternative means for infecting embryos Retroviruses are viruses or infusion of the virus-producing cells into the cleavage lumen of mouse embryos (Jahner, D others, Nature 298:. 623 pp [1982] ). 妊娠中期のマウス胚の子宮内レトロウイルス感染を用いたマウスの生殖系列への導入遺伝子の導入が報告された(Jahner他、前掲[1982年])。 The introduction of the transgene into the germline of mice with intrauterine retroviral infection of mouse embryos of mid-gestation have been reported (Jahner other, supra [1982]). トランスジェニック動物を作製するための、レトロウイルス又はレトロウイルスベクターによるウシ胚及びヒツジ胚の感染が報告された。 For producing transgenic animals, infections of cattle and ovine embryos with retroviruses or retroviral vectors has been reported. これらのプロトコールは、レトロウイルス粒子、又は受精卵若しくは初期胚の囲卵腔中にレトロウイルス粒子を落とす、増殖を抑制された(すなわちマイトマイシンC処理された)細胞のマイクロインジェクションを含む(PCT国際出願国際公開第90/08832号パンフレット[1990年];並びにHaskell及びBowen、Mol.Reprod.Dev.、40:386頁[1995年])。 These protocols, retroviral particles, or drop the retroviral particles into fertilized eggs or early embryos perivitelline cavity, growth (as ie mitomycin C treated) was inhibited microinjection of cells (PCT international application . WO 90/08832 pamphlet [1990]; and Haskell and Bowen, Mol.Reprod.Dev, 40: 386 pp. [1995]). PCT国際出願国際公開第90/08832号パンフレットでは、2〜8細胞期のヒツジ胚の囲卵腔中への野生型ネコ白血病ウイルスBの注入を記載している。 In PCT International Application WO 90/08832 pamphlet describes the injection of wild-type feline leukemia virus B into the perivitelline cavity of sheep embryos 2-8 cell stage. 注入を受けた胚に由来する胎児は、複数の組込み部分を含むことが示された。 Fetal derived from injected receiving embryos were shown to contain a plurality of built-in parts.

[00253]米国特許第6291740号(2001年9月18日発行)では、分裂中の細胞に形質導入するレトロウイルスベクター(例えばマウス白血病ウイルス[MLV]に由来するベクター)を用いた、成熟前の卵母細胞及び成熟した未受精卵母細胞(すなわち受精前卵母細胞)中に外因性DNAを導入することによる、トランスジェニック動物の作製を記載している。 [00253] In U.S. Patent No. 6,291,740 (issued Sep. 18, 2001), it was used a retroviral vector to transduce dividing cells (e.g., vectors derived from murine leukemia virus [MLV]), premature by introducing the exogenous DNA into oocytes and in mature unfertilized oocytes (i.e. fertilization before oocytes), describe the production of transgenic animals. この特許は、様々な組換えタンパク質のサイトメガロウイルスプロモーター駆動による発現、並びにマウス乳癌LTRによる発現のための方法及び組成物も記載している。 This patent describes the expression, as well as methods and compositions for the expression by mouse mammary tumor LTR by the cytomegalovirus promoter driving of various recombinant proteins.

[00254]米国特許第6281408号(2001年8月28日発行)では、胚性幹細胞を用いてトランスジェニック動物を作製するための方法を記載している。 [00254] In U.S. Patent No. 6,281,408 (issued Aug. 28, 2001), describes a method for producing transgenic animals using embryonic stem cells. 手短に言えば、胚性幹細胞は、トランスジェニック動物を作製するために、桑実胚と混合された細胞共培養において使用される。 Briefly, embryonic stem cells, in order to produce a transgenic animal, as used in the mixed cell co-culture with a morula. 外来遺伝物質が、例えばエレクトロポレーション、マイクロインジェクション又はレトロウイルス送達によって、共培養の前に胚性幹細胞中に導入される。 Foreign genetic material, for example, electroporation, microinjection or retroviral delivery, is introduced into an embryonic stem cells prior to co-culture. この様式でトランスフェクトされたES細胞は、ネオマイシンなどの選択マーカーによって遺伝子の組込みのために選択される。 ES cells transfected in this manner are selected by the selection marker such as neomycin for gene integration.

[00255]米国特許第6271436号(2001年8月7日発行)では、始原生殖細胞を単離するステップ、これらの細胞を培養して始原生殖細胞に由来する細胞系統を作製するステップ、始原生殖細胞及び培養細胞系統の双方を形質転換するステップ、並びにこれらの形質転換された細胞及び細胞系統を用いてトランスジェニック動物を発生させるステップを含む方法を用いた、トランスジェニック動物の作製を記載している。 [00255] In U.S. Patent No. 6,271,436 (issued Aug. 7, 2001), isolating primordial germ cells, these steps the cells are cultured to produce a cell line derived from primordial germ cells, primordial germ step of both transformed cells and cultured cell lines, as well as using a method comprising the steps of generating transgenic animals using these transformed cells and cell lines, and describes the generation of transgenic animals there. トランスジェニック動物が生じる効率は大きく上昇し、それによって、トランスジェニック非げっ歯動物種を作製する際に相同組換えを使用することが可能になる。 Efficiency transgenic animals occurs greatly increased, thereby allowing the use of homologous recombination in producing transgenic non-rodent species.

遺伝子療法 Gene therapy
[00256]遺伝子療法のために本発明の改変されたポリペプチド又はペプチド構築物を使用することが、本発明の一実施形態において企図される。 [00256] The use of modified polypeptide or peptide constructs of the invention for gene therapy is contemplated in one embodiment of the present invention. ポリペプチド又はペプチドは、N末端に1つ又は複数の付加的なアミノ酸を付加することによってDPP活性から保護されるように改変された。 Polypeptides or peptides have been modified so as to be protected from DPP activity by the addition of one or more additional amino acids at the N-terminus. 例えば、N末端に付加的なHis残基を含むGLP−1をコードしている核酸構築物が、遺伝子療法のために提供される。 For example, a nucleic acid construct encoding the GLP-1 comprising the additional His residue at the N-terminus is provided for gene therapy. また、改変GLP−1/トランスフェリン融合タンパク質をコードしている核酸構築物が、遺伝子療法のために提供される。 The nucleic acid construct encoding a modified GLP-1 / transferrin fusion protein is provided for gene therapy. 本発明の改変GLP−1構築物は、DPP活性から保護されており、より安定であり、したがって、遺伝子療法の治療に理想的に適している。 Modified GLP-1 constructs of the invention are protected from DPP activity, are more stable, thus, are ideally suited for the treatment of gene therapy.

[00257]手短に言えば、細胞障害性リンパ球抗原4(CTLA4)及びヒト免疫グロブリンG1のFc部分からなる可溶性融合タンパク質をコードしている遺伝子を含むアデノウイルスベクターの注射による遺伝子療法が、Ijima他(2001年6月10日)Human Gene Therapy(米国)12/9:1063〜77頁において最近示された。 [00257] Briefly, gene therapy via injection of an adenoviral vector comprising a gene encoding a soluble fusion protein consisting of the Fc portion of cytotoxic lymphocyte antigen 4 (CTLA4) and the human immunoglobulin G1, Ijima other (June 10, 2001) Human Gene Therapy (USA) 12/9: has recently been shown in the pages 1063-77. 遺伝子療法のこの応用では、II型コラーゲンに誘発される関節炎のマウスモデルが、ベクターの関節内注射によって首尾良く治療された。 In this application of gene therapy, a murine model of arthritis induced in type II collagen have been successfully treated by intraarticular injection of the vector.

[00258]遺伝子療法は、米国特許第6225290号(2001年5月1日発行);米国特許第6187305号(2001年2月13日発行);及び米国特許第6140111号(2000年10月31日発行)を含めて、いくつかの米国特許においても記載されている。 [00258] Gene therapy is U.S. Patent No. 6,225,290 (issued May 1, 2001); U.S. Pat. No. 6,187,305 (issued Feb. 13, 2001); and U.S. Pat. No. 6,140,111 (Oct. 31, 2000 It is also described in published), including a number of U.S. patents.

[00259]米国特許第6225290号では、哺乳動物対象の腸上皮細胞を、所望の治療効果を有するタンパク質を発現する遺伝子を作動的に組み込むように遺伝子改変する方法及び構築物を提供する。 [00259] In U.S. Patent No. 6,225,290, a mammalian subject intestinal epithelial cells, it provides a gene genetically modified to incorporate activated methods and constructs expressing proteins having the desired therapeutic effect. 腸細胞の形質転換は、主として裸DNAから構成される調製物の投与によって達成され、このDNAは経口投与され得る。 Intestinal cell transformation is accomplished by administration of a composed preparation predominantly from naked DNA, the DNA may be administered orally. 経口又は他の胃腸管内の投与経路により、簡単な投与方法が実現し、同時に、裸核酸を使用することにより、遺伝子療法を遂行するためのウイルスベクター使用に関連する合併症が回避される。 The oral route of administration or other gastrointestinal tract, to achieve a simple method of administration, at the same time, by the use of naked nucleic acid, complications associated with viral vectors used for performing gene therapy is avoided. 発現されたタンパク質は、胃腸管及び/又は血流中に直接分泌されて、治療効果のあるタンパク質血中レベルをもたらし、それによってそのタンパク質を必要とする患者を治療する。 The expressed protein, gastrointestinal tract and / or are secreted directly into the bloodstream, resulted in protein blood level of therapeutic effect thereby treating the patient in need of the protein. 形質転換された腸上皮細胞は、特定のタンパク質の欠乏に関連した、又はタンパク質の過剰発現による治療が適用できる疾患に対する、短期又は長期の治療的回復を実現する。 Intestinal epithelial cells transformed was associated with depletion of a particular protein, or protein for diseases treatment applicable overexpression, to achieve a short-term or long-term therapeutic recovery.

[00260]米国特許第6187305号では、脊椎動物、特に哺乳動物起源の細胞における遺伝子又はDNAターゲティングの方法を提供する。 [00260] In U.S. Patent No. 6,187,305, a vertebrate, particularly a method of gene or DNA targeting in cells of mammalian origin. 手短に言えば、DNAは、相同組換え、又は初代細胞若しくは2次細胞のゲノムDNA中の予め選択された部位に導入されるDNAのターゲティングによって、脊椎動物起源の初代細胞又は2次細胞中に導入される。 Briefly, DNA homologous recombination, or by targeting of the DNA to be introduced into a preselected site of a primary cell or secondary cell genome DNA, the primary cells or secondary cells of vertebrate origin be introduced.

[00261]米国特許第6140111号(2000年10月31日発行)では、レトロウイルスの遺伝子療法ベクターを記載している。 [00261] In US Pat. No. 6,140,111 (issued Oct. 31, 2000), describes a gene therapy vector of retrovirus. 開示されているレトロウイルスベクターは、興味対象の遺伝子のための挿入部位を含み、かつ多種多様のトランスフェクトされた細胞型において興味対象の遺伝子に由来するタンパク質を高レベルで発現することができる。 Retroviral vectors disclosed are capable of expressing comprises an insertion site for the gene of interest and a protein derived from the gene of interest in a wide variety of transfected cell types at high levels. また、選択マーカーを欠き、したがって抗生物質などマーカー産物の同時発現を伴わない、様々な病態の治療におけるヒト遺伝子療法に適したレトロウイルスベクターも開示されている。 Also, lack a selectable marker, thus without co-expression of a marker product, such as antibiotics, it is also disclosed retroviral vectors suitable for human gene therapy in the treatment of various disease states. これらのレトロウイルスベクターは、ある種のパッケージング細胞系統において使用するのに特に適している。 These retroviral vectors are especially suited for use in certain packaging cell lines. レトロウイルスベクターは、哺乳動物細胞のゲノム中への挿入が可能であるため、ヒト及び動物の遺伝病の遺伝子療法において使用するための特に有望な候補となっている。 Retroviral vectors are the possible insertion into mammalian cell genome has become a particularly promising candidates for use in gene therapy of genetic diseases in humans and animals. 遺伝子療法は、典型的には、(1)新しい遺伝物質を患者細胞にin vivoで添加すること、又は(2)身体から患者細胞を取り出し、それらの細胞に新しい遺伝物質を添加し、かつ身体中にそれらを再導入すること、すなわちin vitro遺伝子療法を含む。 Gene therapy is typically a (1) new genetic material be added in in vivo in patient cells, or (2) taken out of the patient cells from the body, adding new genetic material to the cells, and the body reintroducing them into, i.e. including in vitro gene therapy. レトロウイルスベクターを用いて様々な細胞において遺伝子療法を実施する方法の考察は、例えば、1989年9月19日に発行された米国特許第4868116号、及び1990年12月25日に発行された第4980286号(上皮細胞)、1989年8月10日に公開された国際公開第89/07136号パンフレット(肝細胞)、1990年7月25日に公開されたEP378576(線維芽細胞)、並びに1989年6月15日に公開された国際公開第89/05345号パンフレット及び1990年6月28日に公開された国際公開第90/06997号パンフレット(内皮細胞)において確認することができ、これらの開示内容は参照により本明細書に組み入れられる。 Discussion of how to implement the gene therapy in a variety of cells using retroviral vectors, for example, issued in U.S. Patent No. 4,868,116, and December 25, 1990, issued September 19, 1989 No. No. 4980286 (epithelial cells), international has been published on August 10, 1989 Publication No. 89/07136 pamphlet (liver cells), EP378576 (fibroblasts), which was published on July 25, 1990, and 1989 can be confirmed in the June 15, published in the International Publication No. WO 89/05345 pamphlet and June 28, 1990, published in the International Publication WO 90/06997 pamphlet (endothelial cells), the disclosures of It is incorporated herein by reference.

[00262]さらなる説明をせずとも、当業者なら、前述の説明及び以下の例示的な実施例を用いて、特許請求される本発明を実施及び利用することができると考えられる。 [00262] without further explanation, those skilled in the art, using the exemplary embodiment of the description and the following above, would be able to implement and use the invention as claimed. したがって、以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を具体的に示すが、開示の残りの部分を何らかの方法で限定するものとして解釈されるべきではない。 Thus, the following examples are preferred embodiments of the present invention is shown in detail, it should not be construed as limiting the remainder of the disclosure in any way. 本出願の全体を通して言及されるすべての論文、刊行物、特許、及び文書は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。 All articles referred to throughout this application, publications, patents, and documents in their entirety are incorporated herein by reference.

実施例1:ジペプチジル−ペプチダーゼIV保護を有する改変GLP−1 Example 1: dipeptidyl - modified GLP-1 having a peptidase IV protected
[00263]本実施例では、DPP−IV活性から保護された改変GLP−1ペプチドを説明する。 [00263] In this embodiment, illustrating a modified GLP-1 peptide, which is protected from DPP-IV activity. 標準的な固相Fmoc化学反応を用いて以下のペプチドを合成し、C18カラムを用いた逆相HPLCによって精製し、かつ220nmの吸光度により定量した。 It was synthesized following peptides using standard solid phase Fmoc chemistry and purified by reverse phase HPLC using a C18 column, and quantified by 220nm absorbance. 精製したペプチドを質量分析法(MALDI−TOF)によって解析した: The purified peptides were analyzed by mass spectrometry (MALDI-TOF):

ジペプチジルペプチダーゼIV処理 Dipeptidyl peptidase IV treatment
[00264]等モル濃度の各ペプチド(6μM)を、25mM Tris−Cl(pH8.0)中の組換えヒトDPP−IV(1μg/μL、R&D Systems社、ミネアポリス、ミネソタ州)2μgで処理した。 The 00264] Equimolar concentrations of each peptide (6 [mu] M), recombinant human DPP-IV in 25mM Tris-Cl (pH8.0) (1μg / μL, R & D Systems Inc., Minneapolis, MN) was treated with 2 [mu] g. DPP−IVを除いた対照反応を各ペプチドについて同時に設定した。 Control reactions excluding DPP-IV were simultaneously set for each peptide. これらの消化物を室温で2時間インキュベートし、2時間目にそれらの反応物を1mM 3−イソブチル−1−メチルキサンチン(IBMX、Calbiochem社、サンディエゴ、カリフォルニア州)を添加したクレブスリンガー緩衝液(Biosource International社、カマリロ、カリフォルニア州)中で10倍に希釈した。 These digests were incubated at room temperature for 2 hours, at 2 hours and their reaction 1 mM 3- isobutyl-1-methylxanthine (IBMX, Calbiochem Corp., San Diego, CA) Krebs Ringer buffer supplemented with (Biosource International, Inc., Camarillo, was diluted 10-fold in California). 次いで、後述するように、残存するGLP−1受容体活性化活性を測定するためにこれらのペプチドを解析した。 Then, as described below, it was analyzed these peptides to measure GLP-1 receptor activation activity remaining.

環状AMP刺激アッセイ Cyclic AMP stimulation assay
[00265]処理をする1日前に、CHO−GLP1R細胞(Montrose−Rafizadeh他、1997年 J.Biol.Chem.272、21201〜21206頁)をRPMI/10%FBS培地中に2×10 細胞/ウェルの密度で4枚の96ウェル組織培養プレートに播種した。 [00265] treatment one day prior to the, CHO-GLP1R cells (Montrose-Rafizadeh et page 1997 J.Biol.Chem.272,21201~21206) the RPMI / 10% FBS in the medium 2 × 10 4 cells / They were seeded in four 96-well tissue culture plates at a density of wells. 翌日、細胞は概算の集密度60〜80%で均一に分布しているようであった。 The next day, the cells appeared to be uniformly distributed confluence 60-80% estimated. 培養プレートへの播種後1日目に、細胞をクレブスリンガー緩衝液(KRB)で2回洗浄し、続いてKRB中で37℃、1時間インキュベートしてcAMPの細胞内レベルを低下させた。 One day after seeding the culture plates, the cells were washed twice with Krebs Ringer buffer (KRB), followed by 37 ° C. in KRB, and then incubated for 1 hour to reduce the intracellular levels of cAMP. これに続いて、KRB/IBMX中で10分間インキュベートして、cAMPを破壊する細胞内酵素を阻害した。 Following this, and incubated in KRB / IBMX 10 minutes, they inhibited intracellular enzymes which destroy cAMP. 各試験化合物の希釈物をKRB/IBMX中で調製し、かつCHO−GLP1R細胞の3つのウェルを、ウェル当たり試験化合物50μlで37℃、厳密に20分間処理した。 Dilutions of each test compound were prepared in KRB / IBMX, and three wells of CHO-GLP1R cells, 37 ° C. per well test compounds 50 [mu] l, was treated exactly 20 minutes. これらの培養物を氷冷したリン酸緩衝化生理食塩水で2回洗浄することによってこの処理を停止した。 And stop this process by washing twice these cultures with phosphate-buffered saline cooled with ice. 室温で10分間、溶解緩衝液1B(Amersham Biosciences社 cAMP Biotrak EIAキット)0.1mlを添加することによって溶解産物を調製した。 10 minutes at room temperature to prepare a lysate by addition of lysis buffer 1B (Amersham Biosciences Corp. cAMP Biotrak EIA kit) 0.1 ml. 次いで、cAMP Biotrak Enzyme Immunoassay System(Amersham Biosciences Corporation社、ピスカタウェイ、ニュージャージー州、製品コードRPN225)をキットの取扱い説明書に従って用いて、各細胞抽出物の全体積を解析してcAMP濃度を測定した。 Then, cAMP Biotrak Enzyme Immunoassay System (Amersham Biosciences Corporation, Piscataway, NJ, product code RPN225) used in accordance with the instruction manual of the kit, the cAMP concentration was measured analyzing the total volume of each cell extract. 本発明のペプチドの方が、未改変の形態よりもDPP−IVに対して抵抗性が高いことが判明した。 Towards the peptides of the present invention, it has been found highly resistant to DPP-IV than the form of unmodified.

活性型GLP−1に特異的なELISA Specific ELISA in active GLP-1
[00266]あるいは、完全な活性型GLP−1に特異的であり、かつDPP−IVの作用が原因でN末端の2つのアミノ酸が除去されているGLP−1、すなわちGLP−1(9−36又は9−37)を認識しないELISA系(グルカゴン様ペプチド−1[活性]ELISAキット[Linco Research,Inc.社、セントチャールズ、ミズーリ州])を用いて、本発明のGLP−1及びGLP−1誘導体のDPP−IV分解を解析した。 [00266] Alternatively, a complete active specific for GLP-1, and GLP-1 in which two amino acids N-terminal due to the action of DPP-IV has been removed, i.e. GLP-1 (9-36 or 9-37) ELISA system that does not recognize (glucagon-like peptide-1 [active] ELISA kit [Linco Research, Inc. company, St. Charles, MO]) using, GLP-1 and GLP-1 of the present invention It was analyzed DPP-IV degradation of derivatives. 等モル濃度のGLP−1及びH−GLP−1(1200pM)を、25mM Tris−Cl(pH8.0)中の組換えヒトDPP−IV(200ng/μL、R&D Systems社、ミネアポリス、ミネソタ州)で処理し、かつ、プロテアーゼ阻害剤を含む、キットと共に支給されるアッセイ緩衝液中に希釈することによって反応を停止させた。 Equimolar GLP-1 and H-GLP-1 a (1200PM), recombinant human DPP-IV in 25mM Tris-Cl (pH8.0) (200ng / μL, R & D Systems Inc., Minneapolis, MN) in processing, and includes a protease inhibitor, the reaction was stopped by diluting the assay buffer to be paid with the kit.

[00267]このキットは、抗GLP−1モノクローナル抗体で被覆された96ウェルのマイクロタイタープレートを含む。 [00267] The kit includes a 96-well microtiter plate coated with anti-GLP-1 monoclonal antibody. このプレートを洗浄し(プレート洗浄機、ThermoLabsystems Ultrawash Plus、25mMホウ酸緩衝生理食塩水で4回)、次いでペプチド試料(300pM及びプレートの下方への10倍段階希釈)と共に室温で3時間インキュベートした。 The plates were washed (plate washer, ThermoLabsystems Ultrawash Plus, 4 times with 25mM borate buffered saline), then incubated at room temperature for 3 hours with peptide samples (10-fold serial dilutions to lower 300pM and plate). 前述したように洗浄した後、(キットのすぐ使用できる構成要素として供給されている)アルカリ性ホスファターゼを結合させた抗GLP抗体と共に室温で2時間、プレートをインキュベートした。 After washing as described above, and incubated for 2 hours, the plate at room temperature with anti-GLP antibody conjugated with (supplied as a component ready-to-use kits) alkaline phosphatase. 洗浄後、4−メチルウンベリフェリルホスファート(MUP)基質(50mMホウ酸(Borate)pH9.5中の1:200希釈物)をすべてのウェルに添加し、室温、暗所で30分間インキュベートした。 After washing, 4-methylumbelliferyl phosphate (MUP) substrate (1 in 50mM borate (Borate) pH 9.5: 200 dilution) was added to all wells and incubated at room temperature for 30 min in the dark . このプレートをSpectraMax Gemini EM蛍光プレートリーダー上で、励起波長355nm及び発光波長460nmで読み取りした。 The plate on the SpectraMax Gemini EM fluorescence plate reader and read at an excitation wavelength of 355nm and emission wavelength 460 nm. H−GLP−1は、GLP−1それ自体よりもモノクローナル抗体に結合しにくかったため、DPP−IV処理後に残存している活性H−GLP−1の濃度は、H−GLP−1検量線を用いて決定した。 H-GLP-1, since than GLP-1 itself was difficult to bind to the monoclonal antibody, the concentration of active H-GLP-1 remaining after DPP-IV treatment with H-GLP-1 standard curve It was determined Te. 図8は、H−GLP−1の方が、DPP−IVの作用に対してGLP−1より実質的に抵抗性が高いことを示す。 8, towards the H-GLP-1 is indicative of an increased substantially resistant than GLP-1 to the action of DPP-IV.

実施例2:改変GLP−1融合タンパク質 Example 2: Modified GLP-1 fusion protein
[00268]本実施例では、改変トランスフェリン分子に融合された、DPP−VI活性から保護された改変GLP−1を含む、融合タンパク質を説明する。 [00268] In this embodiment, it fused to modified transferrin molecule, comprising a modified GLP-1 protected from DPP-VI activity is described a fusion protein.

[00269]トランスフェリン分泌リーダーに続いてGLP−1及びトランスフェリンのN末端部分をコードする配列を構築するために、以下の重複するプライマーを設計した。 [00269] To construct subsequently encoding the N-terminal portion of GLP-1 and transferrin sequence in transferrin secretion leader, primers were designed to the following overlap.

これらのプライマーの位置を以下に示す。 The position of these primers are shown below.

プライマー(8μL、濃度20pmol)を混合し、5分間65℃まで加熱し、次いでアニーリング反応を起こさせ、室温までゆっくり放冷させた。 Primers (8 [mu] L, concentration 20 pmol) were mixed and heated to 5 minutes 65 ° C., then to cause the annealing reaction was allowed to cool slowly to room temperature.

[00270]アニーリング反応物にT4 DNAリガーゼを添加し、室温でさらに2時間インキュベートした後、反応物1μLを取り出し、PCR反応で使用して、アウタープライマーP0236及びP0251を用いて完成された挿入物を増幅させた。 [00270] was added T4 DNA ligase annealing reaction was incubated for further 2 hours at room temperature, the reaction 1μL removed and used in the PCR reaction, the insert was completed using the outer primers P0236 and P0251 It was amplified. PCR条件は以下のとおりであった。 PCR conditions were as follows.
94℃で5分94℃で30秒、50℃で30秒、72℃で1分を25サイクル72℃で7分4℃で維持 30 sec 5 min 94 ° C. at 94 ° C., 30 sec at 50 ° C., maintained for 7 minutes 4 ° C. for 1 minute 25 cycles 72 ° C. at 72 ° C.

[00271]得られるPCR生成物をAflII及びKpnIで消化し、予めAflII及びKpnIで消化されたpREX0094(図1)中に連結した。 [00271] The resulting PCR product was digested with AflII and KpnI, and ligated into pREX0094 was digested with AflII and KpnI (Figure 1). ライゲーションを用いて大腸菌を形質転換した。 E. coli was transformed with the ligation. 結果として生じるクローンに由来するDNAの配列を決定し、AflII/KpnI挿入物の長さが正確なクローンを選択し、pREX0198と命名した(図2)。 Determining the sequence of DNA derived from the clones resulting length of AflII / KpnI insert selects the correct clone was named PREX0198 (Figure 2). 次に、pREX0198をNotI及びPvuIで消化し、pSAC35(図3)中に挿入して、pREX0240(図4)を作製した。 Then, it was digested pREX0198 with NotI and PvuI, and inserted into pSAC35 (Figure 3), were prepared PREX0240 (Figure 4).

[00272]天然のトランスフェリン分泌リーダーとそれに続く改変トランスフェリン(mTf)に融合されたH−GLP−1(7−36)をコードするプラスミドを作製するため、pREX0198によってコードされた配列に余分なN末端ヒスチジンを付加するように、重複プライマーP0424及びP0425を設計した。 [00272] To produce the natural transferrin secretion leader and subsequent modified transferrin (mTf) to fused H-GLP-1 (7-36) encoding plasmid, an extra N-terminal to the sequence encoded by pREX0198 to add a histidine were designed overlapping primers P0424 and P0425.

[00273]これら2種の変異誘発性の重複プライマー及び2種のアウタープライマー、すなわちP0424とP0012及びP0425とP0025を別々の反応で用いる、最初のPCR反応用の鋳型としてpREX0198を使用した。 [00273] These two mutagenic overlapping primers and two outer primers, i.e. using P0424 and P0012 and P0425 and P0025 in separate reaction, using pREX0198 as a template for the first PCR reactions. 次いで、これらの反応の生成物を、それらを結合させるために、アウタープライマーのみ、すなわちP0012及びP0025を用いる2ラウンド目のPCRにおける鋳型として使用した。 Then, the products of these reactions, in order to bind them, only the outer primers, i.e. was used as template in the second round of PCR using P0012 and P0025. いずれのラウンドのPCR反応条件も、94℃で1分間を1回、94℃で30秒間、50℃で30秒間、72℃で1分間を20回、及び終結させるために72℃で7分間を1回であった。 PCR reaction conditions either round even once for 1 minute at 94 ° C., 30 sec at 94 ° C., 30 sec at 50 ° C., 20 times for 1 minute at 72 ° C., and 7 minutes at 72 ° C. in order to terminate It was once.

[00274]最終反応物から得たPCR生成物をAflII及びKpnIで消化し、AflII/KpnIで消化されたpREX0052(図5)中に連結してpREX0367(図6)を作製した。 [00274] The PCR product obtained from the final reaction was digested with AflII and KpnI, to produce a pREX0052 digested with AflII / KpnI pREX0367 linked in (FIG. 5) (Fig. 6). 余分なヒスチジンのためのコドンの挿入を確認するために、構築物のDNA配列を決定した。 To confirm the insertion of the codon for the extra histidine was determined DNA sequence of the construct.

[00275]次いで、pREX0367をNotI及びPvuI(後者はアンピシリン耐性遺伝子を破壊するため)で消化し、予めNotIで消化されたpSAC35中に連結してpREX0368(図7)を作製した。 [00275] Then, digested with pREX0367 NotI and PvuI (for the latter to destroy the ampicillin resistance gene) was prepared pREX0368 was ligated into pSAC35 which had been digested in advance with NotI (Fig. 7).

[00276]エレクトロポレーションによって、pREX0368を宿主のサッカロミセス・セレビシエ株中に形質転換させ、かつ、緩衝化した最小培地プレート上でロイシン原栄養性に基づいて、形質転換されたコロニーを選択した。 By [00276] Electroporation, PREX0368 was transformed into Saccharomyces cerevisiae strain of the host to and on the basis of leucine prototrophy on minimal medium plates were buffered, colonies were selected that have been transformed. 単独のコロニーを選択した後、酵母形質転換体を40%トレハロース中に入れ、−70℃で保存した。 After selecting a single colony, put yeast transformants in 40% trehalose and stored at -70 ° C.. pH6.5に緩衝化した液状最小培地中での増殖、並びにSDS−PAGE、ウェスタンブロット及びELISAによる上清の解析によって、発現を測定した。 Growth in liquid minimal medium buffered to pH 6.5, and SDS-PAGE, by analysis of the supernatant by Western blot and ELISA, expression was measured.

[00277]その全体が参照により本明細書に組み入れられる、2003年3月4日に出願された米国特許出願第10/378,094号で記載されているようにして、GLP−1/mTfをコードしているプラスミド(pREX0100)及びH−GLP−1/mTfをコードしているプラスミドを構築した。 [00277] entirely incorporated herein by reference, and as described in U.S. Patent Application Serial No. 10 / 378,094, filed March 4, 2003, the GLP-1 / mTf to construct a plasmid encoding the code to have a plasmid (pREX0100) and H-GLP-1 / mTf. GLP−1/mTf融合タンパク質を作製するために、GLP−1(7−36)及びGLP−1(7−37)のアミノ酸配列を使用することができる。 To generate GLP-1 / mTf fusion protein, it can be used GLP-1 (7-36) and GLP-1 amino acid sequence of (7-37).

[00278]例えば、GLP−1(7−36)のペプチド配列を、酵母用に最適化されたDNA及びコドンに逆翻訳することができる。 [00278] For example, the peptide sequence of GLP-1 (7-36), can be reverse translated into optimized DNA and codon yeast.

[00279]これらのプライマーは、アニーリング後に5'XbaI及び3'KpnIの付着末端を形成するように、かつXbaI/KpnIで切断されたpREX0052中への、リーダー配列の末端のちょうど5'側及びmTfのN末端での直接的なライゲーションが可能となるように特異的に設計した。 [00279] These primers, later to form cohesive ends 5'XbaI and 3'KpnI annealing, and into pREX0052 cut with XbaI / KpnI, the end of the leader sequence just 5 'and mTf It was designed for the specific such that direct ligation at N-terminal is possible. あるいは、他のベクター中にライゲーションするために他の付着末端を人工的に作製してもよい。 Alternatively, other sticky ends may be artificially created to ligation into other vectors.

[00280]アニーリング及びライゲーション後、クローンを配列決定して正確な挿入を確認した。 [00280] After annealing and ligation, the clones were sequenced to confirm correct insertion. このベクターをpREX0094と呼んだ。 This vector was called pREX0094. NotIを用いてpREX0094からカセットを切り取り、NotIで切断した酵母ベクターpSAC35中にサブクローニングして、pREX0010を作製した。 Cut cassette from pREX0094 using NotI, and subcloned into the yeast vector pSAC35 cut with NotI, to prepare a pREX0010.

[00281]次いで、このプラスミドを宿主のサッカロミセス酵母株中にエレクトロポレーションし、かつ最小培地プレート上でのロイシン原栄養性に基づいて形質転換体を選択した。 [00281] Then, the plasmid was electroporated into Saccharomyces yeast strain host, and transformants were selected on the basis of leucine prototrophy on minimal medium plates. 液状最小培地中での増殖、並びにSDS−PAGE、ウェスタンブロット、及びELISAによる上清の解析によって発現を測定した。 Growth in liquid minimal medium, as well as SDS-PAGE, expression was measured by analysis of Western blot, and supernatant by ELISA.

[00282]GLP−1/mTf及びH−GLP−1/mTfを発現させ、かつ陽イオン交換及び陰イオン交換クロマトグラフィーによって、標準条件下で増殖させた発酵培養物から精製した。 [00282] GLP-1 / mTf and to express H-GLP-1 / mTf, and by cation exchange and anion exchange chromatography, was purified from fermentation cultures grown under standard conditions.

ジペプチジルペプチダーゼIV処理 Dipeptidyl peptidase IV treatment
[00283]等モル濃度のGLP−1/mTf及びH−GLP−1/mTF(2μM)を、25mM Tris−Cl溶液(pH8.0)中の組換えヒトDPP−IV(1μg/μL、R&D Systems社)で処理した。 [00283] of equimolar GLP-1 / mTf and H-GLP-1 / mTF a (2 [mu] M), recombinant human DPP-IV in 25 mM Tris-Cl solution (pH8.0) (1μg / μL, R & D Systems It was treated with the company). DPP−IVを除いた対照反応を各融合タンパク質について同時に設定した。 Control reactions excluding DPP-IV were simultaneously set for each fusion protein. これらの消化物を室温で2時間インキュベートし、2時間目にそれらの反応物を1mM IBMX(Calbiochem社)を添加したクレブスリンガー緩衝液(Biosource International社)中で20倍に希釈した。 These digests were incubated for 2 hours at room temperature, these reactions at 2 hours was diluted 20-fold in Krebs Ringer buffer supplemented with 1 mM IBMX (Calbiochem Corp.) (Biosource International Inc.).

環状AMP刺激アッセイ Cyclic AMP stimulation assay
[00284]処理をする1日前にRPMI/10%FBS培地中に1×10 細胞/ウェルの密度で、CHO−GLP1R細胞を組織培養プレート(24ウェル)に播種した。 [00284] treatment at a density of 1 × 10 5 cells / well one day prior in RPMI / 10% FBS medium was a CHO-GLP1R cells were seeded in tissue culture plates (24 wells). 翌日、細胞は概算の集密度60〜80%で均一に分布しているようであった。 The next day, the cells appeared to be uniformly distributed confluence 60-80% estimated. 培養プレートへの播種後1日目に、細胞をクレブスリンガー緩衝液(KRB)で2回洗浄し、続いてKRB中で37℃、1時間インキュベートしてcAMPの細胞内レベルを低下させた。 One day after seeding the culture plates, the cells were washed twice with Krebs Ringer buffer (KRB), followed by 37 ° C. in KRB, and then incubated for 1 hour to reduce the intracellular levels of cAMP. これに続いて、KRB/IBMX中で10分間インキュベートして、cAMPを破壊する細胞内酵素を阻害した。 Following this, and incubated in KRB / IBMX 10 minutes, they inhibited intracellular enzymes which destroy cAMP. 各試験化合物の希釈物をKRB/IBMX中で調製し、かつCHO−GLP1R細胞の3つのウェルをウェル当たり試験化合物0.15mlで37℃、厳密に50分間処理した。 Dilutions of each test compound were prepared in KRB / IBMX, and 37 ° C. Three wells of CHO-GLP1R cells per well test compounds 0.15 ml, was treated exactly 50 minutes. これらの培養物を氷冷したリン酸緩衝化生理食塩水で2回洗浄することによってこの処理を停止した。 And stop this process by washing twice these cultures with phosphate-buffered saline cooled with ice. 室温で10分間、溶解緩衝液1B(Amersham Biosciences社 cAMP Biotrak EIAキット)0.2mlを添加することによって溶解産物を調製し、次いで、cAMP Biotrak Enzyme Immunoassay System(Amersham Biosciences社)をキットの取扱い説明書に従って用いて、各細胞抽出物の100μlを解析してcAMP濃度を測定した。 10 minutes at room temperature, lysis buffer 1B (Amersham Biosciences Corp. cAMP Biotrak EIA kit) was prepared lysates by addition of 0.2 ml, then manual of cAMP Biotrak Enzyme Immunoassay System and (Amersham Biosciences, Inc.) kit used in accordance with, the cAMP concentration was measured analyzing 100μl of each cell extract.

[00285]H−GLP−1/mTfの方が、GLP−1/mTfよりもDPP−IVに対して抵抗性が高いことが判明した。 [00285] toward the H-GLP-1 / mTf is, it is highly resistant to DPP-IV than GLP-1 / mTf was found.

実施例3:糖尿病治療用の改変GLP−1/mTf Example 3: Modified GLP-1 / mTf for the treatment of diabetes
[00286]本実施例において、本発明の改変GLP−1/mTfは、糖尿病を治療するための治療用物質として使用される。 [00286] In the present embodiment, the modified GLP-1 / mTf of the present invention is used as a therapeutic agent for the treatment of diabetes. II型糖尿病の標準的な動物モデルであるズッカー(Zucker)ラットに改変GLP−1/mTfを投与する。 Is a standard animal model of type II diabetes to administer Zucker (Zucker) modified GLP-1 / mTf rats. ズッカーラットは、異常に高い血中グルコースレベルを有する。 Zucker rats have abnormally high blood glucose levels. GLP−1でこれらの動物を処置するとインスリン分泌が誘導され、血中グルコースが低下することが示された。 Treatment of these animals with GLP-1 is induced insulin secretion, blood glucose was shown to be reduced.

[00287]ズッカーラットを一晩絶食させ、次いでH−GLP−1又はトランスフェリンに融合させたH−GLP−1(H−GLP−1/mTf)で処置する。 [00287] Zucker rats are fasted overnight and then treated with H-GLP-1 was fused to H-GLP-1 or transferrin (H-GLP-1 / mTf). H−GLP−1又はH−GLP−1/mTfの皮下注射後30分に、これらの動物をグルコース負荷試験(GTT)に供する。 The H-GLP-1 or H-GLP-1 / mTf 30 minutes after subcutaneous injection of subjecting the animals to glucose tolerance test (GTT). この試験のために、絶食させた動物にグルコース溶液(1.5mg/g体重)を与え、かつ適切な時間間隔で血中グルコースを測定する。 For this test, give a glucose solution (1.5 mg / g body weight) to fasted animals, and measuring blood glucose at appropriate time intervals. グルコース投与後すぐに、未処置の動物の血中グルコースレベルは上昇し、かつベースラインに向かってゆっくりと低下するのに対し、H−GLP−1又はH−GLP−1/mTfを注射された動物は、GLP−1のインスリン分泌促進効果の寄与により、血中グルコースレベルのより速い正常化を示す。 Immediately after glucose administration, animals blood glucose levels of untreated rose, and while decreases slowly toward the baseline, were injected with H-GLP-1 or H-GLP-1 / mTf animals, due to the contribution of the insulinotropic effect of GLP-1, indicating a faster normalization of blood glucose levels.

[00288]別の実験では、グルコース投与をせずに、改変されたH−GLP−1又はH−GLP−1/mTfを使用して、ズッカーラットの高い空腹時血糖を正常化する。 In the 00288] In another experiment, without glucose administration, using a modified H-GLP-1 or H-GLP-1 / mTf, normalize fasting blood glucose of Zucker rats. 未処置の動物では血中グルコースレベルが高いままであるのに対し、H−GLP−1又は改変H−GLP−1/mTfで処置した動物では有意な低下が認められる。 Whereas the untreated animals remain high blood glucose levels, a significant reduction is observed in animals treated with H-GLP-1 or modified H-GLP-1 / mTf.

実施例4:ジペプチジル−ペプチダーゼIVからの保護を有する改変グルカゴン Example 4: dipeptidyl - modified glucagon with protection from peptidase IV
[00289]本実施例では、DPP−IV活性から保護された改変グルカゴン分子を説明する。 [00289] In this embodiment, illustrating a modified glucagon molecules protected from DPP-IV activity.

[00290]標準的な固相Fmoc化学反応を用いて以下のペプチドを合成し、C18カラムを用いた逆相HPLCによって精製し、かつ220nmの吸光度により定量した。 [00290] synthesized the following peptides using standard solid phase Fmoc chemistry and purified by reverse phase HPLC using a C18 column, and quantified by 220nm absorbance. 精製したペプチドを質量分析法(MALDI−TOF)によって解析した: The purified peptides were analyzed by mass spectrometry (MALDI-TOF):

[00291]前述したようにしてこれらのペプチドをDPP−IVで前処理し、次いでクローン化されたグルカゴン受容体を発現する組換え細胞系統を用いて、グルカゴン受容体を活性化する能力について解析した。 [00291] pretreated these peptides DPP-IV as described above, and then using recombinant cell lines expressing cloned glucagon receptor were analyzed for their ability to activate the glucagon receptor .

実施例5:ジペプチジル−ペプチダーゼIVからの保護を有する改変GIP Example 5: dipeptidyl - modified GIP with protection from peptidase IV
[00292]本実施例では、DPP−IV活性から保護された改変GIP分子を提供する。 [00292] In this embodiment, provides a modified GIP molecules protected from DPP-IV activity.

[00293]標準的な固相Fmoc化学反応を用いて以下のペプチドを合成し、C18カラムを用いた逆相HPLCによって精製し、かつ220nmの吸光度により定量した。 [00293] synthesized the following peptides using standard solid phase Fmoc chemistry and purified by reverse phase HPLC using a C18 column, and quantified by 220nm absorbance. 精製したペプチドを質量分析法(MALDI−TOF)によって解析した: The purified peptides were analyzed by mass spectrometry (MALDI-TOF):

[00294]前述したようにしてこれらのペプチドをDPP−IVで前処理し、次いでクローン化されたGIP受容体を発現する組換え細胞系統を用いて、GIP受容体を活性化する能力について解析した。 [00294] pretreated these peptides DPP-IV as described above, and then using recombinant cell lines expressing cloned GIP receptor were analyzed for their ability to activate the GIP receptor .

[00295]前述の考察及び実施例は特定の好ましい実施形態の詳細な説明を提示するに過ぎないことが理解されるべきである。 [00295] Discussion and examples of the foregoing it should be understood that only present a detailed description of certain preferred embodiments. したがって、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく様々な修正を行い、均等物を作製できることが当業者には明らかなはずである。 Therefore, make various modifications without departing from the spirit and scope of the present invention, it should be apparent to those skilled in the art that equivalents can be produced. 本特許出願中で特定されるすべての学術論文、他の参考文献、特許、及び特許出願は、その全体が参照により組み入れられる。 All journal articles identified in this patent application, other references, patents, and patent applications are incorporated by reference in their entirety.

pREX0094の制限酵素地図を示す図である。 It is a diagram illustrating a restriction map of PREX0094. プラスミドpREX0198の制限酵素地図を示す図である。 It is a diagram illustrating a restriction map of plasmid PREX0198. pSAC35の制限酵素地図を示す図である。 Is a diagram showing the restriction enzyme map of pSAC35. プラスミドpREX0240の制限酵素地図を示す図である。 It is a diagram illustrating a restriction map of plasmid PREX0240. pREX0052の制限酵素地図を示す図である。 Is a diagram showing the restriction enzyme map of pREX0052. pREX0367の制限酵素地図を示す図である。 It is a diagram illustrating a restriction map of PREX0367. pREX0368の制限酵素地図を示す図である。 It is a diagram illustrating a restriction map of PREX0368. GLP−1及びH−GLP−1とDPP−IVとのインキュベーションの経時変化を示すグラフである。 Is a graph showing changes with time of incubation with GLP-1 and H-GLP-1 and DPP-IV. グラフは、活性GLP−1に特異的なELISAによって測定した、残存する活性型完全長ペプチドの量を示す。 Graph was determined by an ELISA specific for active GLP-1, indicating the amount of active full-length peptide remaining.

Claims (52)

  1. 有効量のトランスフェリン(Tf)融合タンパク質及び少なくとも1種の第2の作用物質を投与するステップを含む、患者の疾患又は状態を治療する方法。 Effective amount of transferrin (Tf) comprises the step of administering a fusion protein and at least one second agent, a method of treating a disease or condition in a patient.
  2. 前記第2の作用物質が、DPP−IV阻害剤及び中性エンドペプチダーゼ(NEP)阻害剤からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。 The second agent is selected from the group consisting of DPP-IV inhibitor and a neutral endopeptidase (NEP) inhibitor, A method according to claim 1.
  3. 前記Tf融合タンパク質がDPP−IVクリアランスの影響を受けやすい、請求項1に記載の方法。 The Tf fusion proteins are susceptible to DPP-IV clearance A method according to claim 1.
  4. 前記Tf融合タンパク質が、DPP−IVクリアランスに感受性、抵抗性又は部分的に抵抗性である、請求項1に記載の方法。 The Tf fusion protein is sensitive, resistant or partially resistant to DPP-IV clearance A method according to claim 1.
  5. 前記Tf融合タンパク質が、Tf分子に融合された1種又は複数種のGLP−1ペプチドを含む、請求項1に記載の方法。 The Tf fusion protein comprises one or more GLP-1 peptides fused to Tf molecule The method of claim 1.
  6. 前記Tf融合タンパク質が、リンカーをさらに含む、請求項5に記載の方法。 The Tf fusion protein further comprises a linker, A method according to claim 5.
  7. 前記リンカーが、PEAPTD又は(PEAPTD) である、請求項6に記載の方法。 Wherein the linker is PEAPTD or (PEAPTD) 2, The method of claim 6.
  8. 前記GLP−1ペプチドが前記融合タンパク質のN末端にある、請求項5に記載の方法。 The GLP-1 peptide at the N-terminus of the fusion protein The method of claim 5.
  9. 前記GLP−1ペプチドが、配列番号32を有するGLP−1(7−37)又はGLP−1(7−36)(配列番号32のアミノ酸1〜30)である、請求項5に記載の方法。 The GLP-1 peptide, is GLP-1 (7-37) or GLP-1 having SEQ ID NO: 32 (7-36) (amino acids 1-30 of SEQ ID NO: 32), The method of claim 5.
  10. 前記GLP−1ペプチドが、A8からGへの変異によって改変された、請求項9に記載の方法。 The GLP-1 peptide was modified by mutation from A8 to G, The method of claim 9.
  11. 前記GLP−1ペプチドが、K34からAへの変異によって改変された、請求項9に記載の方法。 The GLP-1 peptide was modified by mutation to A K34, The method of claim 9.
  12. 前記GLP−1ペプチドが、A8からG及びK34からAへの変異によって改変された、請求項9に記載の方法。 The GLP-1 peptide was modified by mutation from G and K34 from A8 to A, method according to claim 9.
  13. 前記GLP−1ペプチドが、リンカー(PEAPTD) を介して前記Tf分子に連結されている、請求項12に記載の方法。 The GLP-1 peptide is linked to the Tf molecule via the linker (PEAPTD) 2, The method of claim 12.
  14. 前記Tf分子が、完全にグリコシル化されたTf分子と比べて少ないグリコシル化を示すように改変された、請求項5に記載の方法。 Wherein Tf molecule, completely modified to show less glycosylation than the glycosylated Tf molecule The method of claim 5.
  15. 前記Tf分子が、グリコシル化を示さないように改変された、請求項5に記載の方法。 Wherein Tf molecule has been modified to exhibit no glycosylation method of claim 5.
  16. 前記Tf分子が、グリコシル化を防止する少なくとも1つの変異を含むように改変された、請求項5に記載の方法。 Wherein Tf molecule has been modified to contain at least one mutation that prevents glycosylation, The method of claim 5.
  17. 前記Tf分子が、野生型Tf分子と比べてトランスフェリン受容体(TfR)に対して低い親和性を示すように改変された、請求項5に記載の方法。 Wherein Tf molecule has been modified to exhibit decreased affinity relative to wild-type Tf molecule against transferrin receptor (TfR), The method of claim 5.
  18. 前記Tf分子が、TfRに結合しないように改変された、請求項5に記載の方法。 Wherein Tf molecule has been modified so as not to bind to TfR, The method of claim 5.
  19. 前記Tf分子が、野生型Tf分子と比べて鉄に対して低い親和性を示すように改変された、請求項5に記載の方法。 Wherein Tf molecule has been modified to exhibit lower affinity for iron as compared to wild-type Tf molecule The method of claim 5.
  20. 前記Tf分子が、鉄に結合しないように改変された、請求項5に記載の方法。 Wherein Tf molecule has been modified so as not to bind to the iron, the method according to claim 5.
  21. 前記Tf分子が、ラクトフェリン又はメラノトランスフェリンである、請求項5に記載の方法。 Wherein Tf molecule is lactoferrin or melanotransferrin The method of claim 5.
  22. 前記疾患が代謝疾患である、請求項1に記載の方法。 Wherein the disease is metabolic disease, The method of claim 1.
  23. 前記代謝疾患が糖尿病前症、糖尿病又は肥満である、請求項22に記載の方法。 It said metabolic disease is prediabetes, diabetes or obesity, the method according to claim 22.
  24. 前記糖尿病がII型糖尿病である、請求項23に記載の方法。 The diabetes is type II diabetes, The method of claim 23.
  25. 前記疾患がうっ血性心不全である、請求項1に記載の方法。 Wherein the disease is congestive heart failure, the method according to claim 1.
  26. 前記疾患が過敏性腸症候群又は消化不良である、請求項1に記載の方法。 Wherein the disease is irritable bowel syndrome or dyspepsia, the method according to claim 1.
  27. 2種の第2の作用物質がある、請求項1に記載の方法。 There are two types of second agent The method of claim 1.
  28. 前記2種の第2の作用物質がDPP−IV阻害剤及びNEP阻害剤である、請求項27に記載の方法。 The two second agent is a DPP-IV inhibitor and NEP inhibitors The method of claim 27.
  29. 前記2種の第2の作用物質が同時に投与される、請求項29に記載の方法。 The two second agents are administered concurrently, the method of claim 29.
  30. 前記トランスフェリン融合タンパク質及び前記1種又は複数種の第2の作用物質が逐次的に投与される、請求項1又は29に記載の方法。 The transferrin fusion protein and the one or more second agents are administered sequentially, the method according to claim 1 or 29.
  31. 前記トランスフェリン融合タンパク質及び前記1種又は複数種の第2の作用物質が同時に投与される、請求項1又は29に記載の方法。 The transferrin fusion protein and the one or more second agents are administered concurrently, the method of claim 1 or 29.
  32. トランスフェリン(Tf)融合タンパク質及び少なくとも1種の第2の作用物質を含む組成物。 Transferrin (Tf) fusion protein and compositions comprising at least one second agent.
  33. 前記第2の作用物質が、DPP−IV阻害剤及び中性エンドペプチダーゼ(NEP)阻害剤からなる群から選択される、請求項32に記載の組成物。 The second agent is selected from the group consisting of DPP-IV inhibitor and a neutral endopeptidase (NEP) inhibitor composition of claim 32.
  34. 前記Tf融合タンパク質がDPP−IVクリアランスの影響を受けやすい、請求項32に記載の組成物。 The Tf fusion proteins are susceptible to DPP-IV clearance composition of claim 32.
  35. 前記Tf融合タンパク質が、DPP−IVクリアランスに感受性、抵抗性又は部分的に抵抗性である、請求項32に記載の組成物。 The Tf fusion protein is susceptible to DPP-IV clearance, resistant or partially resistant composition of claim 32.
  36. Tf融合タンパク質が、Tf分子に融合された1種又は複数種のGLP−1ペプチドを含む、請求項32に記載の組成物。 Tf fusion protein comprises one or more GLP-1 peptides fused to Tf molecule composition of claim 32.
  37. 前記Tf融合タンパク質がリンカーをさらに含む、請求項36に記載の組成物。 The Tf fusion protein further comprises a linker composition of claim 36.
  38. 前記リンカーが、PEAPTD又は(PEAPTD) である、請求項37に記載の組成物。 Wherein the linker is PEAPTD or (PEAPTD) 2, The composition of claim 37.
  39. 前記GLP−1ペプチドが前記融合タンパク質のN末端にある、請求項36に記載の組成物。 The GLP-1 peptide at the N-terminus of the fusion protein The composition of claim 36.
  40. 前記GLP−1ペプチドが、配列番号32を有するGLP−1(7−37)又はGLP−1(7−36)(配列番号32のアミノ酸1〜30)である、請求項36に記載の組成物。 The GLP-1 peptide, is GLP-1 (7-37) or GLP-1 having SEQ ID NO: 32 (7-36) (amino acids 1-30 of SEQ ID NO: 32) The composition of claim 36 .
  41. 前記GLP−1ペプチドが、A8からGへの変異によって改変された、請求項40に記載の組成物。 The GLP-1 peptide was modified by mutation from A8 to G, A composition according to claim 40.
  42. 前記GLP−1ペプチドが、K34からAへの変異によって改変された、請求項40に記載の組成物。 The GLP-1 peptide was modified by mutation to A K34, composition according to claim 40.
  43. 前記GLP−1ペプチドが、A8からG及びK34からAへの変異によって改変された、請求項40に記載の組成物。 The GLP-1 peptide was modified by mutation from G and K34 from A8 to A, composition according to claim 40.
  44. 前記GLP−1ペプチドが、リンカー(PEAPTD) を介して前記Tf分子に連結されている、請求項43に記載の組成物。 The GLP-1 peptide, via a linker (PEAPTD) 2 is connected to the Tf molecule composition of claim 43.
  45. 前記Tf分子が、完全にグリコシル化されたTf分子と比べて少ないグリコシル化を示すように改変された、請求項32に記載の組成物。 Wherein Tf molecule, completely modified to show less glycosylation than the glycosylated Tf molecule composition of claim 32.
  46. 前記Tf分子が、グリコシル化を示さないように改変された、請求項32に記載の組成物。 Wherein Tf molecule has been modified to exhibit no glycosylation, composition of claim 32.
  47. 前記Tf分子が、グリコシル化を防止する少なくとも1つの変異を含むように改変された、請求項32に記載の組成物。 Wherein Tf molecule has been modified to contain at least one mutation that prevents glycosylation, composition of claim 32.
  48. 前記Tf分子が、野生型Tf分子と比べてトランスフェリン受容体(TfR)に対して低い親和性を示すように改変された、請求項32に記載の組成物。 Wherein Tf molecule has been modified to exhibit lower affinity for the transferrin receptor compared to wild-type Tf molecule (TfR), The composition of claim 32.
  49. 前記Tf分子が、TfRに結合しないように改変された、請求項32に記載の組成物。 Wherein Tf molecule has been modified so as not to bind to TfR, composition according to claim 32.
  50. 前記Tf分子が、野生型Tf分子と比べて鉄に対して低い親和性を示すように改変された、請求項32に記載の組成物。 Wherein Tf molecule has been modified to exhibit lower affinity for iron as compared to wild-type Tf molecule composition of claim 32.
  51. 前記Tf分子が、鉄に結合しないように改変された、請求項32に記載の組成物。 Wherein Tf molecule has been modified so as not to bind to the iron composition of claim 32.
  52. 前記Tf分子が、ラクトフェリン又はメラノトランスフェリンである、請求項32に記載の組成物。 Wherein Tf molecule is lactoferrin or melanotransferrin composition of claim 32.
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