JP2008241244A - Quantitative analyzing method of anionic compound due to ce/ms - Google Patents

Quantitative analyzing method of anionic compound due to ce/ms Download PDF

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Eiichiro Fukuzaki
Kazuo Harada
Akio Kobayashi
和生 原田
昭雄 小林
英一郎 福▲崎▼
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Osaka Univ
国立大学法人大阪大学
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    • G01N27/26Investigating or analysing materials by the use of electric, electro-chemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416Systems
    • G01N27/447Systems using electrophoresis

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide an analyzing system capable of more inexpensively and stably performing the simultaneous analysis of wide anionic compounds such as a sugar phosphoric acid, an organic acid, nucleotide, a CoA compound, and the like. <P>SOLUTION: This quantitative analyzing method for separating and analyzing anionic compounds by combining capillary electromigration and mass analysis is provided. This method includes: a process for setting the inlet side of the migration liquid of a capillary filled with the migration liquid as an anode and setting the outlet side thereof as a cathode and applying voltage to the capillary to electrically migrate a sample containing the anionic compounds, that is, a process for performing electromigration under a condition that the absolute value of the mobility of the electric penetration flow caused by applying the voltage exceeds the absolute value of the mobility of the electromigration of at least one kind of the anionic compound in the sample; and a process for performing the mass analysis of the anionic compounds in the sample migrated to the outlet of the capillary. <P>COPYRIGHT: (C)2009,JPO&INPIT

Description

本発明は、キャピラリー電気泳動と質量分析とを組み合わせたキャピラリー電気泳動/質量分析装置(CE/MS)およびこの装置を用いる陰イオン性化合物の分離分析方法に関する。 The present invention relates to a separation method for analyzing capillary electrophoresis and mass spectrometry and capillary electrophoresis / mass spectrometer that combines (CE / MS) and anionic compounds using this device.

近年、キャピラリー電気泳動と質量分析とを組み合わせた、高感度かつ高選択性を有するキャピラリー電気泳動/質量分析装置(CE/MS)を用いたイオン性化合物の分析法が開発されている。 Recently, a combination of a capillary electrophoresis and mass spectrometry, capillary electrophoresis / mass spectrometer (CE / MS) analysis of ionic compounds using have been developed having high sensitivity and high selectivity. この手法の優位性は、キャピラリー電気泳動(CE)については迅速な分析を可能にし、非常に高い分離能を有する点、および質量分析(MS)については非常に高い選択性と感度を有する点が挙げられる。 Advantages of this approach, the capillary electrophoresis (CE) allows for rapid analysis, is that it has a very high selectivity and sensitivity for points with very high resolution, and mass spectrometry (MS) and the like. この優れた分析手法により、カルボン酸、フェノール性化合物、アミノ酸などの分析例が報告されている。 This smart analysis method, a carboxylic acid, phenolic compounds, analytical examples of such amino acids have been reported. そして近年、CE/MSを用いたアニオン分析系が確立され、解糖系、ペントースリン酸回路、TCA回路、およびカルビン・ベンソン回路中間体の分離・検出が可能となった(非特許文献1)。 In recent years, anion analysis system using a CE / MS is established, glycolysis, pentose phosphate cycle, has enabled the separation and detection of the TCA cycle, and Calvin Benson cycle intermediates (Non-Patent Document 1).

図1Aに示すように、通常のフューズドシリカキャピラリーを用いた電気泳動では、キャピラリー内表面がシラノール基の解離によって負電荷を帯びている。 As shown in Figure 1A, the electrophoresis using conventional fused silica capillaries, the capillary inner surface is negatively charged by the dissociation of the silanol groups. したがって、キャピラリー中の泳動液に含まれている電解質はキャピラリーとの界面が正電荷を帯び、電気浸透流(EOF)は陽極(アノード)から陰極(カソード)に向かう。 Accordingly, the electrolyte contained in the electrophoresis solution in the capillary is positively charged is an interface between the capillary toward the electroosmotic flow (EOF) is the anode (anode) to the cathode (cathode). さらに、CE/MSにおいては、質量分析装置(MS)に接続した側のキャピラリーの先端を、電解質を含む泳動液に浸すことができない。 Further, in the CE / MS, the tip side of the capillary is connected to a mass spectrometer (MS), it can not be immersed in electrophoresis solution containing an electrolyte. これらの理由により、泳動液を入れたバイアル側を陰極およびMS側を陽極とした場合には、EOFがバイアル側に向かうため、MS側のキャピラリー先端に空洞が生じる。 For these reasons, the vial side containing the running buffer in the case where the cathode and MS side and anode, EOF is due toward the vial side, a cavity is generated in the capillary tip of the MS side. そのため、CEの電流が流れなくなり、泳動が中断される(図1A参照)。 Therefore, no current of CE flows, migration is interrupted (see FIG. 1A).

CEの電流が流れなくなる現象を防ぐために、SMILEキャピラリーを使用して、EOFを反転させる方法が開発されている(特許文献1)。 To prevent the phenomenon that does not flow the current of CE, using SMILE capillary method of reversing it has been developed to EOF (Patent Document 1). SMILEキャピラリーは、キャピラリー内表面が陽イオン性化合物によってコーティングされているので、キャピラリー内壁が正に荷電し、EOFを陰極から陽極へと反転させることが可能である(図1B参照)。 SMILE capillary, since the capillary inner surface is coated by cationic compounds, positively charged capillary inner wall, it is possible to reverse from the cathode to the anode of the EOF (see FIG. 1B). これにより、解糖系、TCA回路、およびペントースリン酸回路の中間体などの種々の陰イオン性化合物を連続的かつ安定に一斉分析することが可能となった。 Thus, glycolytic pathway, TCA cycle, and the various anionic compounds, such as intermediates of the pentose phosphate cycle becomes possible to continuously and stably simultaneous analysis.

しかし、このSMILEキャピラリーは高価である上、非常に耐久性が低く、ルーチンワークに適さない。 However, the SMILE on capillary is expensive, very low durability, not suitable for routine work. また、リブロース5−リン酸とリボース5−リン酸、あるいはグルコース1−リン酸、グルコース6−リン酸、フルクトース6−リン酸などの異性体の分離が不完全であり、定量分析が困難である。 Further, ribulose 5-phosphate and ribose-5-phosphate, or incomplete glucose-1-phosphate, glucose-6-phosphate, the separation of the isomers such as fructose 6-phosphate, it is difficult to quantitatively analyze . さらに、SMILEキャピラリーを用いた分析系では、一部のヌクレオチドやCoA類などの多価陰イオンは、SMILEキャピラリー内表面に吸着するため、検出することができない。 Furthermore, the analysis system using the SMILE capillary, polyanions such as a portion of the nucleotide and CoA such, in order to adsorb the SMILE capillary inner surface, can not be detected.

そこで、中性ポリマー(ポリ(ジメチルシロキサン))で内表面をコーティングしたキャピラリー(DB−1)を用い、さらにキャピラリーの入口をエアーポンプで加圧することにより、一定流量の液体を質量分析計側に送り込む方法も開発されている(非特許文献2)。 Therefore, using a neutral polymer (poly (dimethylsiloxane)) capillaries coated inner surface (DB-1), by further pressurizing the inlet of the capillary with an air pump, the mass spectrometer side liquid at a constant flow rate a method of feeding has been developed (non-Patent Document 2). この方法によれば、ヌクレオチド類、ニコチンアミド補酵素類、CoA類などの一斉分析が可能である。 According to this method, nucleotides, nicotinamide coenzymes are possible simultaneous analysis such as CoA compounds. しかし、この方法では、糖リン酸の異性体を分離することができず、ヌクレオチド類の分離も充分とはいえない。 However, in this method, you can not separate the isomers of sugar phosphates, not be also sufficiently separated nucleotides. したがって、同一移動時間に多数の化合物が同時溶出し、イオン化サプレッションによるMSの定量性の低下が懸念される。 Therefore, a large number of compounds co-eluted in the same travel time, reduction in the quantitative property of the MS by ionization suppression is concerned.
特開2003−35698号公報 JP 2003-35698 JP

本発明は、糖リン酸、有機酸、ヌクレオチド、CoA化合物などの幅広い陰イオン性化合物の一斉分析を、より安価かつ安定して行うことが可能な分析系を提供することを目的とする。 The present invention aims at providing sugar phosphate, organic acids, nucleotides, the simultaneous analysis of a wide range of anionic compounds, such as CoA compounds, a less expensive and stable assay system that can be carried out.

CE/MSにおいて、分析対象イオンのみかけの移動度は、EOF移動度と電気泳動移動度とのベクトル和で表すことができる。 In CE / MS, the apparent mobility of analyte ions can be represented by the vector sum of the EOF mobility and electrophoretic mobility. 一般的に、これらの値は、陽極から陰極に向かう方向を正とする。 Generally, these values, the direction toward the cathode from the anode and positive. 陽イオン性化合物を対象としたCE/MS分析系、すなわち、泳動液を入れたバイアル側を陽極およびMS側を陰極とした系では、EOF移動度と電気泳動移動度とはいずれも正であるため、分析の途中で電流が流れなくなるという現象はほとんど見られず、安定して分析を行うことができる。 CE / MS analysis system intended for the cationic compound, i.e., in a system where the vial side containing the electrophoresis solution as a cathode an anode and a MS side, both the EOF mobility and electrophoretic mobility is positive Therefore, the phenomenon that no current flows in the course of analysis is hardly observed, can be performed stably analysis. そこで、本発明者らは、このような極性で陰イオン性化合物を分析できるか否かの検討を行ったところ、EOF移動度の絶対値を電気泳動移動度の絶対値よりも大きくして、分析対象イオンのみかけの移動度を正にすることにより、安定な陰イオン性化合物の分析系を確立した。 Accordingly, the present inventors have made examined whether such polarities can analyze anionic compound, to be larger than the absolute value of the electrophoretic mobility of the absolute value of EOF mobility, by positively the apparent mobility of the analyte ion were established analytical system stable anionic compounds.

すなわち、本発明は、キャピラリー電気泳動と質量分析とを組み合わせて陰イオン性化合物を分離分析する方法を提供し、該方法は、 That is, the present invention is an anionic compound provides a method of separating analysis and a mass spectrometer are combined capillary electrophoresis, the method comprising,
泳動液で満たされたキャピラリーの泳動液の入口側を陽極および出口側を陰極となるように設定し、該キャピラリーに電圧を印加して陰イオン性化合物を含む試料を電気泳動する工程であって、該電圧の印加により発生する電気浸透流の移動度の絶対値が、該試料中の少なくとも1種の陰イオン性化合物の電気泳動移動度の絶対値を上回るような条件で該電気泳動を行う、工程;および 該キャピラリーの出口まで泳動された該試料中の陰イオン性化合物を質量分析する工程; The inlet side of the electrophoresis solution capillaries filled with electrophoresis liquid was set so that a cathode an anode and an outlet side, a sample containing an anionic compound comprising the steps of electrophoresis by applying a voltage to said capillary , the absolute value of the mobility of the electroosmotic flow generated by the application of the voltage, perform electrophoretic under conditions exceed the absolute value of the electrophoretic mobility of at least one anionic compound in the sample ,; and step of the anionic compound in the electrophoresis has been the sample until the outlet of the capillary to the mass spectrometer;
を含む。 including.

1つの実施態様では、上記キャピラリーは、内表面が予め不活性処理されているフューズドシリカキャピラリーである。 In one embodiment, the capillary is a fused silica capillary whose inner surface has previously been deactivated.

1つの実施態様では、上記泳動液のpHは8から11である。 In one embodiment, pH of the electrophoresis solution is from 8 to 11.

1つの実施態様では、上記泳動液は、酢酸アンモニウム、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エタノールアミン、および炭酸アンモニウムからなる群より選択される少なくとも1種を含む。 In one embodiment, the migration solution comprises ammonium acetate, trimethylamine, triethylamine, ethanolamine, and at least one member selected from the group consisting of ammonium carbonate.

1つの実施態様では、上記方法は、上記電気泳動して質量分析する工程中または該工程後に、該電圧の印加を中止して、該キャピラリー内の該泳動液を該出口側へ加圧送液し、該キャピラリーの出口まで移動した試料を質量分析する工程、をさらに含む。 In one embodiment, the method, after step during or said step of mass spectrometry by the electrophoretic, discontinue application of the voltage, pressurized pumping fluid Mr a 該泳 Doeki within the capillary to the outlet side further comprising the step, of mass spectrometry moving sample to the outlet of the capillary.

本発明はまた、キャピラリーの出口側が陰極になるように設定されたキャピラリー電気泳動装置; The present invention is also a capillary electrophoresis apparatus outlet side of the capillary is set to be a cathode;
該キャピラリー電気泳動装置で分離された試料をイオン化するためのイオン化装置;および 該イオン化された試料を分析するための質量分析装置; Mass spectrometer for analyzing a sample that has been and said ionization; the separated sample ionization device for ionizing at the capillary electrophoresis apparatus;
を備えた、陰イオン性化合物の分離分析装置を提供する。 With a, to provide a separation analyzer anionic compounds.

1つの実施態様では、上記キャピラリーは、内表面が予め不活性処理されているフューズドシリカキャピラリーである。 In one embodiment, the capillary is a fused silica capillary whose inner surface has previously been deactivated.

1つの実施態様では、上記分離分析装置は、さらに、上記キャピラリー内の泳動液を該出口側に加圧送液するための手段を備える。 In one embodiment, the separation analysis apparatus further comprises means for pressurizing pumping liquid outlet side electrophoretic liquid in the capillary.

本発明はさらに、泳動液で満たされたキャピラリーにおいて、該泳動液の入口側を陽極および出口側を陰極となるように設定された、陰イオン性化合物の分離装置を提供する。 The present invention further provides the capillary filled with running buffer, the inlet side of 該泳 dynamic liquid was set to be a cathode and anode and an outlet side, to provide a separation device of the anionic compound.

本発明によれば、陰イオン性化合物の分析に用いられる通常のCEの系とは電極の極性を逆転させているため、分析途中でCEの電流が流れなくなる現象がなく、安定して分析を行うことができる。 According to the present invention, since the normal system of CE used in the analysis of anionic compound is made to reverse the polarity of the electrodes, the analysis is no phenomenon that does not flow the current of CE on the way, a stably Analysis It can be carried out. さらに、特殊なキャピラリーではなく、一般的なフューズドシリカキャピラリーを用いることができるため、安価に分析することができる。 Furthermore, rather than a special capillary, it is possible to use a general fused silica capillary can be inexpensively analyzed. さらに、本発明によれば、CEとCE後の加圧送液とを組み合わせることにより、今まで同時に分析を行うことが困難だった糖リン酸、有機酸、ヌクレオチド、CoA化合物などの陰イオン性化合物を、一斉分析することが可能となる。 Furthermore, according to the present invention, by combining the pressurized pumping fluid after CE and CE, sugar phosphate was difficult to simultaneously perform analytical ever organic acids, nucleotides, anionic compounds such as CoA compound a, it is possible to simultaneously analyze.

本発明は、以下の原理に基づく。 The present invention is based on the following principle.

上述のように、CE/MSにおいて、分析対象イオンのみかけの移動度は、EOF移動度と電気泳動移動度とのベクトル和で表すことができる。 As described above, in the CE / MS, the apparent mobility of analyte ions can be represented by the vector sum of the EOF mobility and electrophoretic mobility. 一般的に、これらの値は、陽極から陰極に向かう方向を正とする。 Generally, these values, the direction toward the cathode from the anode and positive. 特許文献1に記載の陰イオン性化合物の分析系の場合(図1B参照)、バイアル側を陰極およびMS側を陽極としており、分析対象が陰イオン性化合物であるため、電気泳動移動度は負となる。 For analysis system of anionic compounds described in Patent Document 1 (see FIG. 1B), the vial side and the cathode and MS side to the anode, since the analyte is an anionic compound, electrophoretic mobility negative to become. また、SMILEキャピラリーを用いてEOFを負に反転させている。 Also negatively inverts the EOF with SMILE capillary. その結果、分析対象イオンのみかけの移動速度は負となり、分析対象はMS側に泳動されてMSで検出される。 As a result, the moving speed of the apparent analyte ions is negative, the analyte is detected by the MS are electrophoresed on MS side.

分析対象の電気泳動移動度の正負を変えることはできない。 It is not possible to change the sign of the electrophoretic mobility of the analyte. しかし、泳動液を入れたバイアル側を陽極およびMS側を陰極とすれば、分析対象である陰イオン性化合物の電気泳動移動度は負であるが、通常のフューズドシリカキャピラリーにおけるEOFは正になる。 However, if the vial side containing the electrophoresis solution and a cathode an anode and a MS side, but the electrophoretic mobility of the anionic compound to be analyzed is negative, the EOF in conventional fused silica capillaries positively Become. ここで、EOFの絶対値を電気泳動移動度の絶対値よりも大きくすれば、分析対象のみかけの移動度を正にすることができ、陰イオン性化合物をMS側に泳動させることができると考えられる。 Here, if greater than the absolute value of the electrophoretic mobility of the absolute value of the EOF, can positively the mobility of analyte apparent, when the anionic compound can be electrophoresed on MS side Conceivable. そこで、本発明は、この原理に基づいて、通常のフューズドシリカキャピラリーを用いて、EOF移動度の絶対値を電気泳動移動度の絶対値よりも大きくすることによって、安定な陰イオン性化合物分析系を確立した。 The present invention is based on this principle, using conventional fused silica capillaries, by greater than the absolute value of the electrophoretic mobility of the absolute value of EOF mobility, stable anionic compound analysis It was established system.

上記の原理に基づいて構築した、本発明の陰イオン性化合物を分離分析する方法を、図2に示すシステムを例に挙げて、詳細に説明する。 Was constructed based on the above principles, the method for separating and analyzing the anionic compounds of the present invention, an example system shown in FIG. 2 will be described in detail.

本発明の方法に用いられる陰イオン性化合物の分離分析装置は、キャピラリーの出口側が陰極になるように設定されたキャピラリー電気泳動装置(CE);該CEで分離された試料をイオン化するためのイオン化装置;および該イオン化された試料を分析するための質量分析装置(MS)から構成される。 Separation analyzer anionic compounds used in the methods of the present invention, a capillary electrophoresis apparatus outlet side is set such that the cathode of the capillary (CE); ionization for ionizing the separated sample in the CE device; and composed of the mass spectrometer for analyzing the ionized sample (MS).

CEは、フューズドシリカキャピラリー;このキャピラリーに導入され、試料を分離するための泳動液を貯留するバイアル;該泳動液に先端が浸漬された電極;および、該電極に電圧を印加するための電源を含む。 CE is fused silica capillaries; is introduced into the capillary, the reservoir is a vial the electrophoresis solution for separating the sample; electrode tip 該泳 Doeki immersed; and a power supply for applying a voltage to the electrode including. フューズドシリカキャピラリーの一端は、バイアル中の泳動液に浸漬され、そして他端はイオン化装置に接続されている。 One end of the fused silica capillary is immersed in the electrophoresis solution in the vial, and the other end is connected to the ionizer.

本発明で用いられるフューズドシリカキャピラリーは、当該技術分野で通常用いられるキャピラリーであれば特に限定されず、市販のものを使用することができる。 Fused silica capillary used in the present invention is not particularly limited as long as capillary commonly used in the art, can be used commercially. EOF移動度を適切にする目的で、およびキャピラリーの耐久性を考慮して、フューズドシリカキャピラリーの内表面の遊離シラノール基をジメチルシロキサン処理した(すなわち、不活性処理した)キャピラリーが好適に用いられる。 For purposes of proper EOF mobility, and in consideration of the durability of the capillary, the free silanol groups on the inner surface of fused silica capillaries and dimethylsiloxane treated (i.e., the deactivated) capillary is preferably used . このようなキャピラリーは、タンパク質やペプチドをキャピラリーHPLC、nano−HPLCなどで分離する際によく用いられ、不活性処理キャピラリーとして市販されている。 Such capillary may be used in separating proteins and peptides capillary HPLC, etc. nano-HPLC, is commercially available as Deactivated capillary. 一般に用いられている不活性処理キャピラリーは、遊離シラノール基がすべて完全にジメチルシロキシル化されているわけではなく、部分的に遊離シラノール基が残存していると思われる。 Generally deactivated capillary used the free silanol groups are not always been completely dimethylsiloxy polyalkoxylated all, partially free silanol groups are believed to remain. そのため、本発明においては、キャピラリーの内表面に帯電したわずかな負電荷によって、適切なEOF移動度を得ることができる。 Therefore, in the present invention, a slight negative charges on the inner surface of the capillary, it is possible to obtain an appropriate EOF mobility.

本発明で用いられる泳動液は、通常の陰イオン性化合物の分離に用いられる泳動液が用いられ得、これは電解質を含む緩衝液であり得る。 Running buffer used in the present invention may electrophoresis solution is used for use in the separation of normal anionic compounds, which may be a buffer containing electrolyte. MSに導入する際のイオン化を考慮して、揮発性の高い泳動緩衝液を用いることが好ましい。 Considering the ionization in introducing the MS, it is preferable to use a highly volatile running buffer. また、泳動緩衝液は、分析対象である陰イオン性化合物のpKaおよびpIを考慮して、中性〜アルカリ性であることが好ましい。 Further, running buffer, considering the pKa and pI of anionic compounds to be analyzed, is preferably neutral to alkaline. このような揮発性かつ中性〜アルカリ性の泳動緩衝液には、代表的には、酢酸アンモニウム、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エタノールアミン、炭酸アンモニウムなどが含まれ得る。 Such volatile and neutral to alkaline running buffer, typically, ammonium acetate, trimethylamine, may include triethylamine, ethanolamine and ammonium carbonate. 泳動液に含まれるこのような電解質および濃度は、分析対象の陰イオン性化合物の種類に応じて、および泳動液のpHを考慮して、適宜決定され得る。 Such electrolytes and concentrations included in the electrophoresis solution, depending on the type of anionic compounds to be analyzed, and in view of the pH of the electrophoresis solution can be appropriately determined. 通常、陰イオン性化合物の分離の場合、泳動液のpHは、pHが高い方がほとんどの陰イオン性化合物の一斉分析が可能であると考えられている(特許文献1)。 Typically, for separation of anionic compounds, pH of the electrophoresis solution is believed to better pH is high it is possible to simultaneously analyze the most anionic compounds (Patent Document 1). しかし、本発明においては、泳動液のpHは、好適には7〜11であり、より好適には8〜11であり、さらに好適には8〜9.5である。 However, in the present invention, pH of the electrophoresis solution is preferably a 7-11, more preferably a 8-11, more preferably a 8 to 9.5.

前述のように、CE/MSにおいては、MSに接続した側のキャピラリーの先端を、電解質を含む泳動液に浸すことができない。 As described above, in the CE / MS, the tip of the capillary on the side connected to the MS, it can not be immersed in electrophoresis solution containing an electrolyte. したがって、陰イオン性物質をCE/MSにより分析することを目的として、泳動液を入れたバイアル側を陰極およびMS側を陽極とした場合には、EOFがバイアル側に向かうため、MS側のキャピラリー先端に空洞が生じる。 Therefore, an anionic substance for the purpose of analyzing the CE / MS, when the cathode and MS side vial side containing the running buffer were used as an anode, because EOF is directed to the vial side, MS side of the capillary tip cavity to occur. そのため、CEの電流が流れなくなり、泳動が中断される(図1A参照)。 Therefore, no current of CE flows, migration is interrupted (see FIG. 1A). 本発明においては、キャピラリーの出口側(MS側)が陰極および入口側(バイアル側)が陽極になるように設定される。 In the present invention, the outlet side of the capillary (MS side) is set as the cathode and the inlet side (vial side) becomes an anode. そのため、電圧をかけた場合に、キャピラリーにおけるEOFは正方向(キャピラリーの入口側から出口側へ)となる(図2参照)。 Therefore, when a voltage is applied, EOF in capillary has a positive direction (from the inlet side of the capillary to the outlet side) (see FIG. 2).

CEを行う際、上記電極には通常当該技術分野で行われる程度の高電圧(例えば、−30kV〜+30kV)が印加される。 When performing the CE, high voltage enough to the electrode to be carried out in conventional art (e.g., -30kV~ + 30kV) is applied. 電圧の印加によって電気泳動が開始され、キャピラリー中の陰イオン性化合物は、負方向の泳動移動度で(陽極(入口側))に泳動する。 Electrophoresis is initiated by the application of a voltage, anionic compounds in the capillary, migrates to the negative direction of mobility (anode (inlet side)). しかし、本発明においては、EOF移動度の絶対値が陰イオン性化合物の泳動移動度の絶対値を上回る条件でCEが行われるので、陰イオン性化合物のみかけの移動度は正になる。 However, in the present invention, the absolute value of the EOF mobility CE is carried out under conditions exceeding the absolute value of the mobility of anionic compounds, mobility of multiplying only anionic compound is positive. そのため、陰イオン性化合物はキャピラリーの出口へと泳動される。 Therefore, the anionic compound is electrophoresed to the outlet of the capillary.

EOF移動度(EOFの流速)は、泳動液のpHと電圧とに依存して変動する。 EOF mobility (velocity of EOF) will vary depending on the pH and the voltage of the electrophoresis solution. EOF移動度は、中性マーカー(例えば、グルコース)を分析対象としてCE/MS分析を行うことにより測定可能である。 EOF mobility, neutral markers (e.g., glucose) can be measured by performing the CE / MS analysis as the analysis target. 具体的には、所定の長さのキャピラリーおよび所定の電圧下において、中性マーカーの検出時間を測定することによって、EOF移動度(cm −1・s −1 )を算出することができる。 Specifically, under the capillary and a predetermined voltage of a predetermined length, by measuring the detection time of the neutral marker can be calculated EOF mobility (cm 2 V -1 · s -1 ) . 一方、陰イオン性化合物の泳動移動度は、各化合物のpKaおよびpIと、泳動液のpHと、電圧とに依存して変動し、これは、既知のEOF移動度となる条件下でCEを行うことによって求めることができる。 On the other hand, mobility of anionic compounds are the pKa and pI of each compound, and the pH of the electrophoresis solution, vary depending on the voltage, which is a CE under conditions to be known EOF mobility it can be determined by performing.

上記のようにして算出されるEOF移動度および電気泳動移動度をもとに、泳動液のpHを適宜変えることによって、分析対象試料中の少なくとも1種の陰イオン性化合物のみかけの移動度が正になるように、EOF移動度の絶対値が陰イオン性化合物の泳動移動度の絶対値を上回る条件が決定される。 Based on EOF mobility and electrophoretic mobility is calculated as described above, by changing the pH of the electrophoresis solution appropriate, at least one mobility over only anionic compounds to be analyzed in a sample as goes positive, the condition where the absolute value of EOF mobility exceeds the absolute value of the mobility of the anionic compound is determined. なお、通常のフューズドシリカキャピラリーを用いる場合、EOFは常に正であり、その流速はpHが高くなるに従って大きくなることが知られている(非特許文献3)。 In the case of using a conventional fused silica capillaries, EOF is always positive, the flow rate is known to increase as the pH is increased (Non-Patent Document 3). また、上述のように、本発明においては、泳動液のpHは、好適には7〜11である。 Further, as described above, in the present invention, pH of the electrophoresis solution is preferably a 7-11. したがって、当該技術分野で通常用いられる泳動液中の電解質濃度および印加電圧において、泳動液のpHを7〜11の範囲で最適化することによって、本発明のCE/MSに適切な条件を決定することができる。 Therefore, the electrolyte concentration and the applied voltage of the electrophoretic solution commonly used in the art, by optimizing a range of 7 to 11 the pH of the electrophoresis solution, to determine the appropriate conditions for CE / MS of the present invention be able to. 本発明においては、好適には、例えば、−30kV〜+30kVの電圧をかける場合、約50mMの電解質を含むpH8〜9.5の泳動液を用いることにより、上記条件を達成し得る。 In the present invention, preferably, for example, when applying a voltage of -30kV~ + 30kV, by using the electrophoresis solution of pH8~9.5 containing an electrolyte of approximately 50 mM, it may achieve the above conditions.

分析すべき試料中に、電気泳動移動度の絶対値がEOF移動度の絶対値と同等であるかまたは大きい陰イオン性化合物が含まれている場合は、この化合物は、電気泳動によってキャピラリーの出口まで移動することができず、キャピラリー内に滞留する。 In the sample to be analyzed, when the absolute value of electrophoretic mobility is included to or greater anionic compound it is equivalent to the absolute value of EOF mobility, this compound, by electrophoresis capillary outlet It can not be moved to and retained in the capillary. そこで、電気泳動の途中の適切な時点で電圧の印加を中止して、キャピラリー内の泳動液を入口側から加圧して出口側へ送液することによって、滞留している化合物を出口へ移動させることができる。 Therefore, to stop the application of the voltage at the appropriate time in the course of the electrophoresis, by feeding to the outlet side pressurizes the electrophoresis solution in the capillary from the inlet side to move the compound staying to the outlet be able to. あるいは、電圧を変化させることによって、あるいは電圧を下げかつ加圧を上げることによって、化合物を出口へ移動させてもよい。 Alternatively, by varying the voltage or by increasing the lowering and pressing the voltage, it may move the compound into the outlet.

したがって、本発明に用いられる陰イオン性化合物の分離分析装置は、このような泳動液を加圧送液するための手段を備えていることが好ましい。 Therefore, separation analyzer anionic compound used in the present invention preferably comprises means for pressurizing pumping fluid such electrophoresis solution. 加圧送液手段としては、例えば、エアーポンプが挙げられる。 As the vulcanizing pumping liquid means, for example, an air pump.

CEで分離されてキャピラリーの出口に移動した試料は、キャピラリー出口に接続されたイオン化装置でイオン化される。 Separated by CE and moved to the outlet of the capillary sample is ionized in the connected ionizer the capillary outlet.

イオン化の方法は、通常MSにおいて行われる方法であれば特に限定されない。 The method of ionisation is not particularly limited as long as it is a method that is performed in the normal MS. 例えば、エレクトロスプレー法(ESI)、大気圧化学イオン化法(APCI)、高速原子衝突法(FAB)が採用され得る。 For example, electrospray method (ESI), atmospheric pressure chemical ionization (APCI), fast atom bombardment (FAB) may be employed.

例えば、ESIの場合、イオン化装置には、シース液がエレクトロスプレーに適した流量で供給され、同時に、細かい液滴を生成してイオン化を促進するためのネブライザガス(例えば、窒素ガス)が供給される。 For example, in the case of ESI, the ionizer is supplied at a flow rate sheath liquid suitable for electrospray, simultaneously, the nebulizer gas for to generate fine droplets promotes ionization (e.g., nitrogen gas) is supplied that.

イオン化された試料は、質量分析装置(MS)で分析される。 Ionized sample is analyzed by mass spectrometry (MS). MSは、通常用いられる質量分析装置が用いられ、例えば、シングルステージの四重極型、磁場型、飛行時間、イオントラップなどの種々の形式の質量分析装置、あるいはタンデム型の質量分析装置であってもよい。 MS is mass commonly used analytical device is used, for example, quadrupole single-stage, magnetic sector, time of flight, there in various types of mass spectrometer, or a tandem mass spectrometer, such as an ion trap it may be.

本発明の方法によって分析され得る陰イオン性化合物としては、糖リン酸、有機酸、ヌクレオチド、CoA化合物などが挙げられる。 Anionic compounds that can be analyzed by the method of the present invention, sugar phosphate, organic acids, nucleotides, and the like CoA compounds. これらの化合物は、異性体の分離分析も可能である。 These compounds, separation and analysis of the isomers are possible.

以下の実施例におけるすべてのCE/ESI−MS実験は、P/ACE MDQ (Beckman Coulter, Fullerton, CA)、Esquire 3000 plus ion trap mass spectrometer (Bruker Daltonics, Billerica, MA, USA)、syringe pump IC3100 (Cole parmer, Illinois, USA)、およびCE ESI sprayer (Aglient Technologies, California, USA)を用いて行った。 The following all CE / ESI-MS experiments in the embodiment of the, P / ACE MDQ (Beckman Coulter, Fullerton, CA), Esquire 3000 plus ion trap mass spectrometer (Bruker Daltonics, Billerica, MA, USA), syringe pump IC3100 ( Cole parmer, Illinois, USA), and CE ESI sprayer (Aglient Technologies, California, USA) was performed using. CEの制御は、32 Karat software (Beckman Coulter)を用い、MSの制御およびデータ取得は、Esquire Control 5.1 (Bruker Daltonics)を用い、そしてデータ解析は、Data Analysis 3.1 (Bruker Daltonics)を用いて行った。 Control of CE is used 32 Karat software (Beckman Coulter), control and data acquisition of the MS, using Esquire Control 5.1 (Bruker Daltonics), and data analysis was performed using Data Analysis 3.1 a (Bruker Daltonics) .

以下の実施例を行うにあたって、分析に初めて使用するキャピラリーは、泳動液を30psi(2.1bar)、60分の条件で送液することにより洗浄した。 In performing the following examples, the capillary for the first time used for the analysis was washed by feeding the running buffer 30 psi (2.1 bar), at 60 minutes. 各分析において、キャピラリーに試料を注入する前には、キャピラリーに泳動液を30psi(2.1bar)、10分の条件で送液し、平衡化を行った。 In each analysis, before injecting the sample into the capillary is, 30 psi (2.1 bar) with running buffer to the capillary, was fed by the 10-minute condition were equilibrated. 試料の注入は、2.0psi(0.14bar)の圧力で5秒間行った(約6nL)。 Sample injection was performed for 5 seconds at a pressure of 2.0psi (0.14bar) (about 6 nL).

電気泳動は、バイアル側を陽極およびMS側を陰極に設定し、キャピラリーの両端に30kVの電圧を掛けた。 Electrophoresis, the vial side to set the anode and MS side to the cathode, multiplied by the voltage of 30kV across the capillary. 電圧印加開始から設定した電圧値に達するまでに要する時間(ランプ時間)は0.30分とした。 Time required to reach the voltage value set by the voltage application start (ramp time) was 0.30 minutes. 電気泳動時に、キャピラリーには22.5〜23.0μAの電流が流れ、電力は0.68Wであった。 During electrophoresis, the capillary flow current 22.5~23.0Myuei, power was 0.68 W. キャピラリーの温度は20℃に保った。 The capillary temperature was kept at 20 ℃. シース液として、5mM酢酸アンモニウムを含む50%(v/v)メタノール水溶液を用い、シリンジポンプにより5μL/分の流速でイオン化室に送液した。 As sheath liquid, using 50% (v / v) aqueous methanol solution containing 5mM ammonium acetate, was fed into the ionization chamber at a flow rate of 5 [mu] L / min by syringe pump.

ESI−MSはネガティブイオンモードで検出を行った。 ESI-MS was carried out to detect in the negative ion mode. MSのパラメーターは以下の通りである:ターゲットマス、m/z 150;スキャン範囲、m/z=50〜1000;スキャン速度、13,000m/z/sの標準スキャン分解能;ネブライザガス、6.0psi、ドライガス流速、4.0L/分;ドライガス温度、300℃;キャピラリー電圧、4.0kV。 MS parameters were as follows: target mass, m / z 150; scan range, m / z = 50~1000; scan rate, standard scanning resolution of 13,000m / z / s; nebulizer gas, 6.0 psi dry gas flow rate, 4.0 L / min; dry gas temperature, 300 ° C., capillary voltage, 4.0 kV.

以下の実施例において分析に供した試料としての陰イオン性化合物は、以下のとおりである:グリオキシル酸;ピルビン酸;乳酸;グリセリン酸;フマル酸;コハク酸;ニコチン酸;リンゴ酸;2−オキソグルタル酸;リビトール;β−グリセロリン酸;シキミ酸;3−ホスホグリセリン酸;クエン酸;イソクエン酸;エリトロース4−リン酸;リボース5−リン酸;リブロース5−リン酸;グルコース6−リン酸;フルクトース6−リン酸;グルコース1−リン酸;セドヘプツロース7−リン酸;1,4−ピペラジンジエタンスルホン酸(PIPES);リブロース1,5−ビスリン酸;チアミン一リン酸(TMP);シチジル酸(CMP);ウリジル酸(UMP);フルクトース1,6−ビスリン酸;フルクトース2,6−ビスリン酸; The following exemplary anionic compound as samples for analysis in the examples are as follows: glyoxylic acid; pyruvic acid; lactic, glyceric acid, fumaric acid, succinic acid, nicotinic acid, malic acid; 2-oxoglutaric acid; ribitol; beta-glycerophosphate; shikimate; 3-phosphoglycerate; citric acid; isocitrate; erythrose 4-phosphate; ribose 5-phosphate; ribulose 5-phosphate; glucose 6-phosphate; fructose 6 - phosphoric acid; glucose 1-phosphate; sedoheptulose 7-phosphate; 1,4-piperazine-di-ethanesulfonic acid (PIPES); ribulose 1,5-bisphosphate; thiamine monophosphate (TMP); cytidylate (CMP) ; uridylate (UMP); fructose-1,6-bisphosphate; fructose 2,6-bisphosphate; MP;GMP;セドヘプツロース1,7−ビスリン酸;CDP;UDP;ADP;パントテン酸;GDP;FMN;CTP;UTP;ATP;GTP;ADP−リボース;UDP−グルコース;ADP−グルコース;NAD;NADH;NADP;NADPH;FAD;およびアセチルCoA。 MP; GMP; sedoheptulose 1,7-bisphosphate; CDP; UDP; ADP; pantothenic acid; GDP; FMN; CTP; UTP; ATP; GTP; ADP- ribose; UDP-glucose; ADP-glucose; NAD; NADH; NADP ; NADPH; FAD; and acetyl CoA.

各化合物のストック溶液は純水を用いて、100mMの濃度に調製した。 Stock solutions of each compound with pure water to prepare a concentration of 100 mM. 分析用試料は、これらのストック溶液を適宜混合し、純水で希釈して用いた。 An analytical sample, these stock solutions were appropriately mixed and used by diluting with pure water.

(実施例1) (Example 1)
50μmφ×100cmの通常のフューズドシリカキャピラリー(GL sciences製)を用いた。 Using 50Myuemufai × normal fused silica capillary 100 cm (manufactured by GL sciences). バイアル側を陽極およびMS側を陰極に設定した。 The vial side is set an anode and a MS side to the cathode. 泳動液は、特許文献1に記載の方法に従って50mM酢酸アンモニウム(pH9.0)を用いた。 Running buffer used was 50mM ammonium acetate (pH 9.0) according to the method described in Patent Document 1.

種々の陰イオン性化合物について、上記の条件下でCE/ESI−MSを行った結果、EOFはMS側に流れることにより、電気泳動が成立し、ほとんどの陰イオン性化合物が検出できた。 The various anionic compounds, as a result of the CE / ESI-MS under the conditions described above, EOF is by flowing to the MS side, the electrophoresis is established, it can be detected most anionic compounds. キャピラリーの内表面に特殊なコーティングを施す必要がないため、キャピラリーの品質にばらつきが少なく、安定した結果を得ることができた。 It is not necessary to apply a special coating on the inner surface of the capillary, small variations in the quality of the capillary, it was possible to obtain stable results.

しかし、共溶出する化合物が存在し、一部イオン化サプレッションにより検出が困難になる場合もあった。 However, there are compounds that co-elute, there sometimes is detected by some ionization suppression difficult. また、グルコース1−リン酸、グルコース6−リン酸、フルクトース6−リン酸などの異性体の分離は不十分であり、これらを区別することが困難であった。 Further, glucose 1-phosphate, glucose-6-phosphate, the separation of the isomers such as fructose 6-phosphate is insufficient, it is difficult to distinguish between them. さらに、クエン酸、イソクエン酸などの多価有機酸を検出することができなかった。 Moreover, it was not possible to detect the multivalent organic acids such as citric acid, isocitric acid. このように、検出が良好でない原因としては、EOFが早すぎるため、十分に分離しないうちにMSに分析対象化合物が到達すること、異性体間の電気泳動移動度の差が小さすぎることなどが考えられる。 Thus, as a cause detection not good, because EOF is too early, and that the analytes to the MS in less sufficiently separated to reach the difference in electrophoretic mobility between the isomers is too small Conceivable.

(実施例2) (Example 2)
通常のフューズドシリカキャピラリーの代わりに、フューズドシリカキャピラリーの内表面をジメチルシロキサン処理したキャピラリー(50μmφ×100cm、GL sciences製)を用いたこと以外は、上記実施例1と同様にCE/ESI−MSを行った。 Instead of the usual fused silica capillary, fused silica capillaries (50μmφ × 100cm, GL manufactured sciences) to an inner surface and dimethylsiloxane treated capillary except for using, in the same manner as in Example 1 CE / ESI- MS was carried out. ジメチルシロキサン処理したキャピラリーでは、その内表面の極性が低くなり、ゼータ電位(電気二重層における滑り面と液体内部の電位との差)が小さくなり、EOFをある程度遅くすることができると予想される。 The dimethylsiloxane-treated capillary, the lower the polarity of the inner surface, (sliding surface and the difference between the potential of the internal liquid in the electric double layer) decreases the zeta potential is expected that EOF to be able to some extent slow .

分析時間は長くなったが、各陰イオン性化合物の分離が大きく向上した。 Analysis time was longer, but the separation of the anionic compound has improved significantly. 実施例1では共溶出したグルコース1−リン酸、グルコース6−リン酸、フルクトース6−リン酸などが分離し、異性体の分離も可能になった。 Glucose 1-phosphate, which co-eluted in the first embodiment, glucose 6-phosphate, such as fructose 6-phosphate is separated, made possible the separation of the isomers. また、電流値が落ちるということはなく、上記実施例1で用いた通常のフューズドシリカキャピラリーと同様に、安定して結果が得られた。 Also, rather than the fact that the current value falls, as in the conventional fused silica capillaries used in the above Example 1, stable results were obtained.

(実施例3) (Example 3)
通常のフューズドシリカキャピラリーの代わりに、フューズドシリカキャピラリーの内表面をジメチルシロキサン処理したキャピラリー(50μmφ×100cm、GL sciences製)を用い、そして泳動液として酢酸アンモニウム(pH9.0)の代わりに50mM酢酸+92mMトリメチルアミン(pH9.4)を用いたこと以外は、上記実施例1と同様にCE/ESI−MSを行った。 Instead of the usual fused silica capillary, 50 mM the inner surface of the fused silica capillary dimethylsiloxane-treated capillary (50μmφ × 100cm, GL manufactured sciences) used, and in place of ammonium acetate (pH 9.0) as running buffer except for the use of acetic acid + 92 mM trimethylamine (pH 9.4), was carried out in the same manner as CE / ESI-MS as in example 1.

その結果、陰イオン性化合物の分離が全体的に向上し、特に、リブロース5−リン酸とリボース5−リン酸、あるいはグルコース1−リン酸、グルコース6−リン酸、フルクトース6−リン酸などの異性体の分離が向上した。 As a result, separation of the anionic compound is generally improved, particularly, ribulose 5-phosphate and ribose-5-phosphate or glucose-1-phosphate, glucose-6-phosphate, such as fructose 6-phosphate separation of isomers was improved. これは、アンモニウムイオンよりもかさ高いトリメチルアミンがこれらの陰イオン性化合物を取り囲むため、異性体の構造の相違が強調され、異性体間の電気泳動移動度の差が大きくなったためと考えられる。 This is because the bulky trimethylamine than ammonium ions surrounds these anionic compounds, differences in the structure of the isomer is emphasized, is considered to be because the difference in electrophoretic mobility between the isomers is larger.

一方、フルクトース1,6−ビスリン酸、フルクトース2,6−ビスリン酸、クエン酸、イソクエン酸などの分子量が小さくかつ極性の非常に高い化合物は検出ができなかった。 On the other hand, fructose-1,6-bisphosphate, fructose 2,6 bisphosphate, citric acid, a very high molecular weight compounds is small and the polarity such as isocitric acid could not be detected. これは、EOF移動度よりも電気泳動移動度の絶対値のほうが大きいため、MS側ではなく、バイアル側に移動してしまったためと考えられる。 This is due to the larger of the absolute value of the electrophoretic mobility than the EOF mobility, rather than the MS side, presumably because you've moved to the vial side.

(実施例4) (Example 4)
次に、電気泳動を行うと同時に、エアーポンプでキャピラリーの入口側に0.5psi(34mbar)の圧力を掛けて補助的に送液を行う条件で、上記実施例3と同様にCE/ESI−MSを行った。 Then, at the same time subjected to electrophoresis, in condition for supplementarily feeding under pressure of 0.5psi (34mbar) to the inlet side of the capillary at an air pump, in the same manner as in Example 3 CE / ESI- MS was carried out.

その結果、リブロース5−リン酸とリボース5−リン酸、あるいはグルコース1−リン酸、グルコース6−リン酸、フルクトース6−リン酸などの異性体は分離可能であり、そしてフルクトース1,6−ビスリン酸、フルクトース2,6−ビスリン酸、クエン酸、イソクエン酸などの検出も可能であった。 As a result, ribulose 5-phosphate and ribose-5-phosphate or glucose-1-phosphate, glucose-6-phosphate, isomers such as fructose 6-phosphate is separable, and fructose 1,6-bisphosphate acid, fructose 2,6 bisphosphate, citric acid, it was possible also detect such isocitrate. しかし、後者の化合物の検出時間は遅く、それまでに拡散が起こってピークが非常にブロードになった。 However, the detection time of the latter compound is slow, diffusion until it peaks became very broad happening.

(実施例5) (Example 5)
次に、電気泳動の途中で電圧を落とし、それ以降は、単にエアーポンプで送液する手法で、CE/ESI−MSを行った。 Then, drop the voltage in the middle of electrophoresis, after that, simply a technique for feeding an air pump, were CE / ESI-MS. 上記実施例4と同様に、ジメチルシロキサン処理したフューズドシリカキャピラリー(50μmφ×100cm)および泳動液として50mM酢酸、92mMトリメチルアミン(pH9.4)を用い0.5psiで補助的に送液しながら30分間電気泳動を行い、その後電圧を落としてエアーポンプのみで1.5psi(0.10bar)にて20分間送液した。 In the same manner as in Example 4, dimethylsiloxane-treated fused silica capillary (50μmφ × 100cm) and 50mM acetate as running buffer, 92 mM trimethylamine (pH 9.4) 30 min while supplementally fed by 0.5psi using subjected to electrophoresis, and was fed for 20 minutes at 1.5psi (0.10bar) only with an air pump and then drop the voltage. 結果を図3に示す。 The results are shown in Figure 3. なお、CE/MSに供した各化合物の濃度は100μMである。 The concentration of each compound was subjected to CE / MS is 100 [mu] M.

図3からわかるように、種々の陰イオン性化合物が非常に良好に分離され、糖リン酸、有機酸、ヌクレオチド、CoAなどの51種の陰イオン性化合物の一斉分析が可能となった。 As can be seen from FIG. 3, a variety of anionic compounds are very good separation, it was sugar phosphates, organic acids, nucleotides, enabling simultaneous analysis of 51 types of anionic compounds, such as CoA. このようなエアーポンプを補助的に用いる方法は、エアーポンプの圧力の調整を自由に行うことができるので、分離・検出時間の微妙な調整を容易に行うことが可能である。 Methods of using such air pump supplementarily, since it is possible to adjust the pressure of the air pump freely, it is possible to easily perform fine adjustment of the separation and detection time.

本発明によれば、陰イオン性化合物の分析に用いられる通常のCEの系とは電極の極性を逆転させているため、分析途中でCEの電流が流れなくなる減少がなく、安定して分析を行うことができる。 According to the present invention, since the normal system of CE used in the analysis of anionic compound is made to reverse the polarity of the electrodes, the analysis is no reduction current does not flow in CE halfway, the stable analysis It can be carried out. さらに、特殊なキャピラリーではなく、一般的なフューズドシリカキャピラリーを用いることができるため、安価に分析することができる。 Furthermore, rather than a special capillary, it is possible to use a general fused silica capillary can be inexpensively analyzed. さらに、本発明によれば、CEとCE後の加圧送液とを組み合わせることにより、今まで同時に分析を行うことが困難だった糖リン酸、有機酸、ヌクレオチド、CoA化合物などの陰イオン性化合物を、一斉分析することが可能となる。 Furthermore, according to the present invention, by combining the pressurized pumping fluid after CE and CE, sugar phosphate was difficult to simultaneously perform analytical ever organic acids, nucleotides, anionic compounds such as CoA compound a, it is possible to simultaneously analyze. したがって、本発明の方法は、メタボローム解析の新たな必須技術となり得る。 Accordingly, the method of the present invention can be a new essential technology metabolome analysis.

従来技術のCE/MSにおけるEOFの方向を示す模式図である。 It is a schematic diagram showing the direction of EOF in CE / MS of the prior art. A:未修飾フューズドシリカキャピラリーを用いた場合;およびB:SMILEキャピラリーを用いた場合。 A: When using the unmodified fused silica capillary; and B: the case of using the SMILE capillary. 本発明の陰イオン性化合物を分離分析する方法を示す模式図である。 The anionic compound of the present invention is a schematic diagram showing a method for separation analysis. 30分間の電気泳動後に電圧を落として送液した場合の、種々の陰イオン性化合物の測定結果を示すクロマトグラムである(実施例5)。 In the case of feeding dropped voltage after electrophoresis for 30 minutes, is a chromatogram showing the results of measurement of various anionic compounds (Example 5).

Claims (9)

  1. キャピラリー電気泳動と質量分析とを組み合わせて陰イオン性化合物を分離分析する方法であって、 An anionic compound in combination with capillary electrophoresis and mass spectrometry to a method for separation analysis,
    泳動液で満たされたキャピラリーの泳動液の入口側を陽極および出口側を陰極となるように設定し、該キャピラリーに電圧を印加して陰イオン性化合物を含む試料を電気泳動する工程であって、該電圧の印加により発生する電気浸透流の移動度の絶対値が、該試料中の少なくとも1種の陰イオン性化合物の電気泳動移動度の絶対値を上回るような条件で該電気泳動を行う、工程;および 該キャピラリーの出口まで泳動された該試料中の陰イオン性化合物を質量分析する工程; The inlet side of the electrophoresis solution capillaries filled with electrophoresis liquid was set so that a cathode an anode and an outlet side, a sample containing an anionic compound comprising the steps of electrophoresis by applying a voltage to said capillary , the absolute value of the mobility of the electroosmotic flow generated by the application of the voltage, perform electrophoretic under conditions exceed the absolute value of the electrophoretic mobility of at least one anionic compound in the sample ,; and step of the anionic compound in the electrophoresis has been the sample until the outlet of the capillary to the mass spectrometer;
    を含む、方法。 Including, method.
  2. 前記キャピラリーが、内表面が予め不活性処理されているフューズドシリカキャピラリーである、請求項1に記載の方法。 The capillary is a fused silica capillary whose inner surface has previously been deactivated Method according to claim 1.
  3. 前記泳動液のpHが8から11である、請求項1または2に記載の方法。 The pH of the electrophoresis solution is 11 to 8, the method according to claim 1 or 2.
  4. 前記泳動液が、酢酸アンモニウム、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エタノールアミン、および炭酸アンモニウムからなる群より選択される少なくとも1種を含む、請求項3に記載の方法。 The electrophoresis solution, ammonium acetate, trimethylamine, triethylamine, ethanolamine, and at least one member selected from the group consisting of ammonium carbonate The method of claim 3.
  5. 前記電気泳動して質量分析する工程中または該工程後に、該電圧の印加を中止して、該キャピラリー内の該泳動液を該出口側へ加圧送液し、該キャピラリーの出口まで移動した試料を質量分析する工程、をさらに含む、請求項1から4のいずれかに記載の方法。 After step during or said step of mass by the electrophoretic analysis, discontinue application of the voltage, the 該泳 Doeki within the capillary pressure pumped liquid to the outlet side, the sample was moved to the outlet of the capillary a step of mass spectrometry, further comprising a method according to any one of claims 1 to 4.
  6. キャピラリーの出口側が陰極になるように設定されたキャピラリー電気泳動装置; Set as the exit side of the capillary is the cathode by capillary electrophoresis apparatus;
    該キャピラリー電気泳動装置で分離された試料をイオン化するためのイオン化装置;および 該イオン化された試料を分析するための質量分析装置; Mass spectrometer for analyzing a sample that has been and said ionization; the separated sample ionization device for ionizing at the capillary electrophoresis apparatus;
    を備えた、陰イオン性化合物の分離分析装置。 With a separation analyzer anionic compounds.
  7. 前記キャピラリーが、内表面が予め不活性処理されているフューズドシリカキャピラリーである、請求項6に記載の分離分析装置。 The capillary is a fused silica capillary whose inner surface has previously been deactivated, separation analyzer according to claim 6.
  8. さらに、前記キャピラリー内の泳動液を該出口側に加圧送液するための手段を備える、請求項6または7に記載の分離分析装置。 Further comprising means for pressurizing pumping fluid electrophoretic liquid in said capillary outlet side, the separation analyzer according to claim 6 or 7.
  9. 泳動液で満たされたキャピラリーにおいて、該泳動液の入口側を陽極および出口側を陰極となるように設定された、陰イオン性化合物の分離装置。 In capillary filled with running buffer, the inlet side of 該泳 dynamic liquid was set to be a cathode and anode and an outlet side, of the anionic compound separation device.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101160389B1 (en) 2009-09-08 2012-06-26 서울대학교산학협력단 The coupling system of single drop microextraction with capillary electrophoresis-mass spectrometry
JP2013537973A (en) * 2010-09-27 2013-10-07 フラウンホーファー−ゲゼルシャフト ツア フォルデルング デア アンゲヴァンテン フォルシュング エー ファウ Electrophoresis capillary tube

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4885076A (en) * 1987-04-06 1989-12-05 Battelle Memorial Institute Combined electrophoresis-electrospray interface and method
JP3341765B1 (en) * 2001-07-25 2002-11-05 学校法人慶應義塾 Separating analytical method and apparatus anionic compound
CA2476493A1 (en) * 2002-02-19 2003-08-28 Genome Institute Of Singapore Device for isoelectric focussing
US20040236603A1 (en) * 2003-05-22 2004-11-25 Biospect, Inc. System of analyzing complex mixtures of biological and other fluids to identify biological state information

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101160389B1 (en) 2009-09-08 2012-06-26 서울대학교산학협력단 The coupling system of single drop microextraction with capillary electrophoresis-mass spectrometry
JP2013537973A (en) * 2010-09-27 2013-10-07 フラウンホーファー−ゲゼルシャフト ツア フォルデルング デア アンゲヴァンテン フォルシュング エー ファウ Electrophoresis capillary tube

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