JP2008169116A - Anti-hepatitis c virus agent containing bmp-7 - Google Patents

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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of liver disease caused by hepatitis C virus (HCV) infection. <P>SOLUTION: A pharmaceutical composition, which contains a bone morphogenetic factor 7 (bone morphogenetic protein 7: BMP-7) as an active ingredient, suppresses the proliferation of HCV and is for the prevention or treatment of liver disease caused by HCV infection is disclosed. The pharmaceutical composition of the present invention is particularly useful for the prevention or treatment of a liver disease caused by HCV infection. The pharmaceutical composition of the present invention containing BMP-7 as an active ingredient may be administered alone or concomitantly with a preparation containing interferon (IFN) as an active ingredient or a preparation containing ribavirin as an active ingredient. <P>COPYRIGHT: (C)2008,JPO&INPIT

Description

本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）感染を伴う疾患を予防および治療するための組成物に関し、とくにHCV感染量を低減させる薬剤療法に用いる医薬組成物に関する。   The present invention relates to a composition for preventing and treating a disease associated with hepatitis C virus (HCV) infection, and more particularly to a pharmaceutical composition used for drug therapy for reducing the amount of HCV infection.

HCVの感染はＣ型肝炎、肝硬変および肝癌等の疾患発症の原因となることが広く知られている（非特許文献１：Seeff, Am J Med. 1999, 107: 10S-15S; 非特許文献２：Hu and Tong, Hepatology 1999, 29: 1311-1316）。   It is widely known that HCV infection causes onset of diseases such as hepatitis C, cirrhosis and liver cancer (Non-patent document 1: Seeff, Am J Med. 1999, 107: 10S-15S; Non-patent document 2) : Hu and Tong, Hepatology 1999, 29: 1311-1316).

HCVが感染後に消失すると、HCV感染によって起こる疾患の予防または治療に効果があることが認められており、HCV量を低減させるための抗HCV薬剤治療が行われている（非特許文献３：Liang and Heller, Gastroenterology 2004, 127: S62-71）。   When HCV disappears after infection, it is recognized that it is effective in preventing or treating diseases caused by HCV infection, and anti-HCV drug treatment for reducing the amount of HCV is performed (Non-patent Document 3: Liang). and Heller, Gastroenterology 2004, 127: S62-71).

現在、抗HCV薬剤療法に用いられる代表的な医薬品は各種のインターフェロン(IFN)製剤である。IFNはウイルスが感染した細胞の膜に結合し、細胞内を抗ウイルス状態にすることによりさまざまな種類のウイルスの増殖を抑制することが知られていた（非特許文献４：Friedman, Bacteriol Rev 1977, 41: 453-567）。HCVレプリコン試験系を用いて、IFNがHCVに対してもこの作用様式により増殖を抑えることが示され、HCVウイルスのNS5Aタンパク質がIFN-αの効果に関係することが明らかとなっている（非特許文献５：Blight et al., Science 2000, 290: 1972-1974; 非特許文献６：Frese et al., J Gen Virol 2001, 82: 723-733）。   Currently, typical pharmaceuticals used for anti-HCV drug therapy are various interferon (IFN) preparations. It has been known that IFN binds to the membrane of a virus-infected cell and suppresses the growth of various types of viruses by putting the inside of the cell into an antiviral state (Non-patent Document 4: Friedman, Bacteriol Rev 1977). , 41: 453-567). Using the HCV replicon test system, it has been shown that IFN also suppresses proliferation by this mode of action against HCV, and it is clear that NS5A protein of HCV virus is related to the effect of IFN-α (non- Patent Document 5: Blight et al., Science 2000, 290: 1972-1974; Non-Patent Document 6: Frese et al., J Gen Virol 2001, 82: 723-733).

ヒトの産生するIFNにはさまざまな種類が存在するが、一般的にIFN-α、IFN-β、IFN-γのいずれも抗HCV作用を示すことが認められている（非特許文献７：Okuse et al., Antiviral Res 2005, 65: 23-34）。臨床で用いられるIFN製剤の有効成分には、ヒトリンパ芽球由来のIFN-α、リコンビナントIFN-α-2a、リコンビナントIFN-α-2b、ヒト線維芽細胞由来のINF-βなどさまざまな種類がある。また、これらの天然型のIFNの代わりに修飾を施したIFNを用いた製剤、すなわちアミノ酸配列を一部改変したコンセンサスIFNや、ポリエチレングリコールを結合させたPEG化IFNもある。   There are various types of IFN produced by humans, and it is generally recognized that all of IFN-α, IFN-β, and IFN-γ exhibit anti-HCV action (Non-patent Document 7: Okuse). et al., Antiviral Res 2005, 65: 23-34). There are various types of active ingredients in clinically used IFN preparations such as human lymphoblast-derived IFN-α, recombinant IFN-α-2a, recombinant IFN-α-2b, and human fibroblast-derived INF-β. . In addition, there are preparations using modified IFNs instead of these natural IFNs, that is, consensus IFNs with partially modified amino acid sequences, and PEGylated IFNs with polyethylene glycol bound thereto.

しかしながら、IFNは、抗HCV療法に用いられる用量において高率に副作用を生じさせる。生じる副作用には、発熱、全身倦怠感、食欲不振、白血球減少、血小板減少、脱毛、精神症状などがある。また、IFNに対する抗体が産生される場合がある。さらに、IFN製剤単独による治療では、HCV感染を消失できない患者やHCV量が低減しない患者が数多く存在する。   However, IFN causes a high rate of side effects at doses used for anti-HCV therapy. Side effects that may occur include fever, general malaise, loss of appetite, leukopenia, thrombocytopenia, hair loss, and psychiatric symptoms. In addition, antibodies against IFN may be produced. Furthermore, there are many patients who cannot eliminate HCV infection or who do not reduce the amount of HCV by treatment with an IFN preparation alone.

一方、抗ウイルス剤であるリバビリンをIFN製剤と併用し、HCV量を低減させる効果を高める治療法も行われるようになった。リバビリン単独、およびIFNとの併用による抗HCV効果はHCVレプリコン試験系において確認されている（非特許文献８：Tanabe et al., J Infect Dis 2004, 189: 1129-1139）。   On the other hand, there is a treatment that increases the effect of reducing the amount of HCV by combining ribavirin, an antiviral agent, with an IFN preparation. The anti-HCV effect of ribavirin alone and in combination with IFN has been confirmed in the HCV replicon test system (Non-patent Document 8: Tanabe et al., J Infect Dis 2004, 189: 1129-1139).

しかしながら、この２剤を併用することによっても依然として十分な臨床効果は認められていない。例えば、Herrine S.K.は、この２剤の併用療法を一般的な抗HCV療法として挙げ、慢性感染患者に対してPEG化インターフェロンの皮下注射を週一回行いリバビリンの経口服用を毎日行う治療を施した際の治療成績を要約し、その持続的なウイルス学的反応が見られた患者の割合はおおよそ55%と述べている（非特許文献９：Herrine, Ann Internal Med 2002, 136: 747-757）。すなわち、この報告は、おおよそ患者の45%では十分な臨床効果が認められないことを示している。   However, a sufficient clinical effect has not been recognized even when these two agents are used in combination. Herrine SK, for example, listed the combination therapy as a general anti-HCV therapy, and treated patients with chronic infection with subcutaneous injection of PEGylated interferon once a week and oral ribavirin daily. The percentage of patients with persistent virological response was approximately 55% (Non-Patent Document 9: Herrine, Ann Internal Med 2002, 136: 747-757) . That is, this report shows that approximately 45% of patients do not have a sufficient clinical effect.

また、リバビリンを用いた治療では副作用として重篤な貧血が生じる場合があり、その場合には薬剤の用量を少なくするか中止せざるを得ない。また、リバビリンはIFNと同様に妊娠の可能性がある女性への使用に慎重になる必要があるが、これに加えて、リバビリンは精子形成に悪影響を及ぼすため男性の場合も使用中は避妊を推奨されるという問題点がある。以上のことから、リバビリンに代わる薬剤が求められている。   In addition, treatment with ribavirin may cause serious anemia as a side effect, in which case the dose of the drug must be reduced or discontinued. In addition, ribavirin needs to be used with caution in women with the possibility of pregnancy, as with IFN.In addition to this, ribavirin adversely affects spermatogenesis, so males should avoid contraception during use. There is a problem of being recommended. In view of the above, there is a need for a drug that replaces ribavirin.

これまで述べたように、現在行われている抗HCV薬剤療法は十分に満足できるものではなく、新たな治療法が求められている。   As described above, the current anti-HCV drug therapy is not fully satisfactory, and a new treatment method is required.

骨形成因子７(bone morphogenetic protein 7; BMP-7)は、別名osteogenic protein 1(OP-1)あるいはeptotermin alphaと呼ばれる、生体内に存在するタンパク質である。   Bone morphogenetic protein 7 (BMP-7) is a protein that exists in the body called alias osteogenic protein 1 (OP-1) or eptotermin alpha.

生体内に骨の成長に関わるタンパク質が存在することが見出され、骨形成因子(BMP)と名づけられた。このタンパク質を骨の形成や成長を促す薬剤として使用することが提案されている（特許文献１：US4294753）。後に、BMPには数種類のタンパク質が存在することが明らかになり、その1つがBMP-7として同定された。すなわち、BMP-7は骨の成長を促すタンパク質として発見された（非特許文献１０：Ozkaynak et al., EMBO J 1990, 9 9: 2085-2093; 非特許文献１１：Celeste et al., Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87: 9843-9847; .非特許文献１２：Sampath et al., J Biol Chem 1992, 267: 20352-20362）。   It was found that a protein involved in bone growth exists in the living body, and was named bone morphogenetic factor (BMP). It has been proposed to use this protein as a drug that promotes bone formation and growth (Patent Document 1: US4294753). Later, it was revealed that there were several types of proteins in BMP, one of which was identified as BMP-7. That is, BMP-7 was discovered as a protein that promotes bone growth (Non-patent document 10: Ozkaynak et al., EMBO J 1990, 9 9: 2085-2093; Non-patent document 11: Celeste et al., Proc Natl. Acad Sci USA 1990, 87: 9843-9847; Non-Patent Document 12: Sampath et al., J Biol Chem 1992, 267: 20352-20362).

BMP-7は、BMP7遺伝子がコードするアミノ酸431個の前駆タンパク質として合成され、ホモもしくはヘテロ2量体を形成し、糖化された後にプロテアーゼによる切断を受けた、C末端139個のアミノ酸からなるタンパク質であり（非特許文献１２：Sampath et al., J Biol Chem 1992, 267: 20352-20362; 非特許文献１３：Jones et al., Growth Factors 1994, 11: 215-225）、その遺伝子の塩基配列およびタンパク質のアミノ酸配列は公知である。   BMP-7 is a protein consisting of 139 amino acids that is synthesized as a 431 amino acid precursor protein encoded by the BMP7 gene, forms a homo- or hetero-dimer, is glycated and then cleaved by proteases (Non-patent document 12: Sampath et al., J Biol Chem 1992, 267: 20352-20362; Non-patent document 13: Jones et al., Growth Factors 1994, 11: 215-225), and the nucleotide sequence of the gene And the amino acid sequence of the protein is known.

BMP-7の骨成長を促す作用を応用した産業上の利用が進められ、すでにチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO細胞)によって生産されたリコンビナントヒトBMP-7が、骨折の修復を促進する医薬品として臨床治療に用いられている。   Recombinant human BMP-7 already produced by Chinese hamster ovary cells (CHO cells), which is industrially applied with the effect of promoting bone growth of BMP-7, is clinically treated as a drug that promotes fracture repair. It is used for.

また、歯の成長に関するBMP-7の関与が調べられており（非特許文献１４：Rutherford et al., Arch Oral Biol 1993, 38: 571-576）、BMP-7の歯周病治療への応用方法も発明されている（特許文献２：US5656593）。   In addition, the involvement of BMP-7 in tooth growth has been investigated (Non-patent Document 14: Rutherford et al., Arch Oral Biol 1993, 38: 571-576), and application of BMP-7 to periodontal disease treatment A method has also been invented (Patent Document 2: US5656593).

BMP-7はラットクローナル骨芽細胞の骨肉腫細胞ROS 17/2.8では、細胞増殖を抑制し、骨芽細胞の形質を発現させ、ヒト胚カルチノーマ細胞に対しても増殖抑制作用を示すと報告されている（非特許文献１５：Maliakal et al., Growth Factors 1994, 11: 227-234; 非特許文献１６：Andrews et al., Lab Invest 1994, 71: 243-251）。   BMP-7 is reported to inhibit cell proliferation and develop osteoblast traits in rat clonal osteoblastic osteosarcoma cell ROS 17 / 2.8, and to inhibit growth of human embryonal carcinoma cells. (Non-patent document 15: Maliakal et al., Growth Factors 1994, 11: 227-234; Non-patent document 16: Andrews et al., Lab Invest 1994, 71: 243-251).

マウスにおいて各種臓器の発現量を比較した研究からBMP-7の発現量は腎臓に多いことが見出された（非特許文献１７：Ozkaynak et al., Biochem Biophys Res Commun 1991, 179: 116-123）。BMP-7は腎臓の虚血再灌流障害に対して保護作用を示すことが知られている（非特許文献１８：Vukicevic et al., J Clin Invest 1998, 102: 202-214）。   A study comparing the expression levels of various organs in mice found that the expression level of BMP-7 was higher in the kidney (Non-patent Document 17: Ozkaynak et al., Biochem Biophys Res Commun 1991, 179: 116-123). ). BMP-7 is known to have a protective effect against ischemia-reperfusion injury of the kidney (Non-patent Document 18: Vukicevic et al., J Clin Invest 1998, 102: 202-214).

この他に、次のようなBMP-7の作用が知られている： 心筋の虚血再灌流障害に対して保護作用を示す・脳の虚血再灌流障害に対して保護作用を示す・血管新生に関与する・神経細胞の接着や集合することに関与する・交感神経細胞の樹状突起の成長を促進する（非特許文献１９：Lefer et al., J Mol Cell Cardiol 1992, 24: 585-593; 非特許文献２０：Perides et al., Neurosci Lett 1995, 187: 21-24; 非特許文献２１：Ramoshebi and Ripamonti, Anat Rec 2000, 259: 97-107; 非特許文献２２：Perides et al., Proc Natl Acad Sci USA 1992, 89: 10326-10330; 非特許文献２３：Lein et al., Neuron 1995, 15: 597-605）。   In addition, the following actions of BMP-7 are known: Protects against myocardial ischemia / reperfusion injury Protects against cerebral ischemia / reperfusion injury Involved in neogenesis ・ Involved in adhesion and assembly of neurons ・ Stimulated dendritic growth of sympathetic neurons (Non-patent document 19: Lefer et al., J Mol Cell Cardiol 1992, 24: 585- Non-patent document 20: Perides et al., Neurosci Lett 1995, 187: 21-24; Non-patent document 21: Ramoshebi and Ripamonti, Anat Rec 2000, 259: 97-107; Non-patent document 22: Perides et al. Proc Natl Acad Sci USA 1992, 89: 10326-10330; Non-Patent Document 23: Lein et al., Neuron 1995, 15: 597-605).

また、BMP7遺伝子がアンドロゲンにより前立腺において発現すると報告されている（非特許文献２４：Thomas et al., Prostate 1998, 37: 236-245）。さらに、BMP-7は卵巣に作用し黄体化を抑制することが示唆されている（非特許文献２５：Shimasaki et al., Proc Natl Acad Sci 1999, 96: 7282-7287）。   In addition, it has been reported that the BMP7 gene is expressed in the prostate by androgen (Non-patent Document 24: Thomas et al., Prostate 1998, 37: 236-245). Furthermore, it is suggested that BMP-7 acts on the ovary and suppresses luteinization (Non-patent Document 25: Shimasaki et al., Proc Natl Acad Sci 1999, 96: 7282-7287).

ヒト好中球、単球、およびヒト胎児皮膚線維芽細胞において、BMP-7と構造的な相同性が高いTGF-βの作用と比較したところ、細胞遊走作用を有する点は共通していたが、BMP-7はTGF-βと異なり線維形成誘導作用は有していなかった（非特許文献２６：Postlethwaite et al., J Cell Physiol 1994, 161: 562-570）。BMP-7は一部の細胞にアポトーシス誘発作用を示すことが知られている（非特許文献２７：Monroe and Sanders, Mol Cell Biol 2000, 13: 4626-4636）。   In human neutrophils, monocytes, and human fetal dermal fibroblasts, when compared with the action of TGF-β, which has a high structural homology with BMP-7, it was common in that it had a cell migration effect. BMP-7, unlike TGF-β, did not have a fibrogenic effect (Non-patent Document 26: Postlethwaite et al., J Cell Physiol 1994, 161: 562-570). BMP-7 is known to show apoptosis-inducing activity in some cells (Non-patent Document 27: Monroe and Sanders, Mol Cell Biol 2000, 13: 4626-4636).

BMP-7が胎生期に発現し、中胚葉、脳、および眼の正常な形成に必要であることが示されている（非特許文献２８：Hogan, Curr Opin Genet Dev 1996, 6: 432-438; 非特許文献２９：Arkell and Beddington, Development 1997, 124: 1-12; 非特許文献３０：Luo et al., Genes Dev 1995, 9: 2808-2820）。   It has been shown that BMP-7 is expressed in the embryonic period and is required for normal formation of mesoderm, brain, and eyes (Non-patent Document 28: Hogan, Curr Opin Genet Dev 1996, 6: 432-438 Non-patent document 29: Arkell and Beddington, Development 1997, 124: 1-12; Non-patent document 30: Luo et al., Genes Dev 1995, 9: 2808-2820).

BMP-7は肝臓においても発現が見られる（非特許文献１７：Ozkaynak et al., Biochem Biophys Res Commun 1991, 179: 116-123）。肝細胞癌細胞においてBMP-7による細胞内smadを介したシグナル伝達経路の活性化がGlypican 3によって抑制されるという報告がなされている（非特許文献３１：Midorikawa et al., Int J Cancer 2003, 103: 455-465）。したがって、少なくとも肝細胞癌細胞に対してはBMP-7が作用を示すことが示唆される。   BMP-7 is also expressed in the liver (Non-patent Document 17: Ozkaynak et al., Biochem Biophys Res Commun 1991, 179: 116-123). It has been reported that activation of a signal transduction pathway via intracellular smad by BMP-7 is suppressed by Glypican 3 in hepatocellular carcinoma cells (Non-patent Document 31: Midorikawa et al., Int J Cancer 2003, 103: 455-465). Therefore, it is suggested that BMP-7 exhibits an action on at least hepatocellular carcinoma cells.

しかしながら、BMP-7の肝臓における役割、とくに、BMP-7の肝炎における役割およびBMP-7のHCV増殖に対する役割についてはこれまでに知られていなかった。   However, the role of BMP-7 in the liver, in particular, the role of BMP-7 in hepatitis and the role of BMP-7 on HCV proliferation has not been known so far.

US4294753US4294753 US5656593US5656593 Seeff, Am J Med. 1999, 107: 10S-15SSeeff, Am J Med. 1999, 107: 10S-15S Hu and Tong, Hepatology 1999, 29: 1311-1316Hu and Tong, Hepatology 1999, 29: 1311-1316 Liang and Heller, Gastroenterology 2004, 127: S62-71Liang and Heller, Gastroenterology 2004, 127: S62-71 Friedman, Bacteriol Rev 1977, 41: 453-567Friedman, Bacteriol Rev 1977, 41: 453-567 Blight et al., Science 2000, 290: 1972-1974Blight et al., Science 2000, 290: 1972-1974 Frese et al., J Gen Virol 2001, 82: 723-733Frese et al., J Gen Virol 2001, 82: 723-733 Okuse et al., Antiviral Res 2005, 65: 23-34Okuse et al., Antiviral Res 2005, 65: 23-34 Tanabe et al., J Infect Dis 2004, 189: 1129-1139Tanabe et al., J Infect Dis 2004, 189: 1129-1139 Herrine, Ann Internal Med 2002, 136: 747-757Herrine, Ann Internal Med 2002, 136: 747-757 Ozkaynak et al., EMBO J 1990, 9 9: 2085-2093Ozkaynak et al., EMBO J 1990, 9 9: 2085-2093 Celeste et al., Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87: 9843-9847Celeste et al., Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87: 9843-9847 Sampath et al., J Biol Chem 1992, 267: 20352-20362Sampath et al., J Biol Chem 1992, 267: 20352-20362 Jones et al., Growth Factors 1994, 11: 215-225Jones et al., Growth Factors 1994, 11: 215-225 Rutherford et al., Arch Oral Biol 1993, 38: 571-576Rutherford et al., Arch Oral Biol 1993, 38: 571-576 Maliakal et al., Growth Factors 1994, 11: 227-234Maliakal et al., Growth Factors 1994, 11: 227-234 Andrews et al., Lab Invest 1994, 71: 243-251Andrews et al., Lab Invest 1994, 71: 243-251 Ozkaynak et al., Biochem Biophys Res Commun 1991, 179: 116-123Ozkaynak et al., Biochem Biophys Res Commun 1991, 179: 116-123 Vukicevic et al., J Clin Invest 1998, 102: 202-214Vukicevic et al., J Clin Invest 1998, 102: 202-214 Lefer et al., J Mol Cell Cardiol 1992, 24: 585-593Lefer et al., J Mol Cell Cardiol 1992, 24: 585-593 Perides et al., Neurosci Lett 1995, 187: 21-24Perides et al., Neurosci Lett 1995, 187: 21-24 Ramoshebi and Ripamonti, Anat Rec 2000, 259: 97-107Ramoshebi and Ripamonti, Anat Rec 2000, 259: 97-107 Perides et al., Proc Natl Acad Sci USA 1992, 89: 10326-10330Perides et al., Proc Natl Acad Sci USA 1992, 89: 10326-10330 Lein et al., Neuron 1995, 15: 597-605Lein et al., Neuron 1995, 15: 597-605 Thomas et al., Prostate 1998, 37: 236-245Thomas et al., Prostate 1998, 37: 236-245 Shimasaki et al., Proc Natl Acad Sci 1999, 96: 7282-7287Shimasaki et al., Proc Natl Acad Sci 1999, 96: 7282-7287 Postlethwaite et al., J Cell Physiol 1994, 161: 562-570Postlethwaite et al., J Cell Physiol 1994, 161: 562-570 Monroe and Sanders, Mol Cell Biol 2000, 13: 4626-4636Monroe and Sanders, Mol Cell Biol 2000, 13: 4626-4636 Hogan, Curr Opin Genet Dev 1996, 6: 432-438Hogan, Curr Opin Genet Dev 1996, 6: 432-438 Arkell and Beddington, Development 1997, 124: 1-12Arkell and Beddington, Development 1997, 124: 1-12 Luo et al., Genes Dev 1995, 9: 2808-2820Luo et al., Genes Dev 1995, 9: 2808-2820 Midorikawa et al., Int J Cancer 2003, 103: 455-465Midorikawa et al., Int J Cancer 2003, 103: 455-465

本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）感染による肝疾患の予防または治療方法として、HCV感染量を低減させる抗HCV療法に用いる医薬組成物を提供することを目的とする。   An object of this invention is to provide the pharmaceutical composition used for the anti- HCV therapy which reduces the amount of HCV infection as a prevention or treatment method of the liver disease by hepatitis C virus (HCV) infection.

本発明は、骨形成因子７(bone morphogenetic protein 7; BMP-7)を有効成分とする、HCV感染による肝疾患を予防または治療するための医薬組成物を提供する。BMP-7前駆体タンパク質のアミノ酸をコードするBMP7遺伝子のmRNA配列はGenBank X51801に記載されている。プロテアーゼによって切断された後の成熟型のBMP-7（BMP-7前駆体タンパク質293-431；アミノ酸残基数139）の構造は、Celeste et al. (Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87: 9843-9847)に記載されている。本発明に用いるBMP-7としては、BMP7の全長遺伝子から生産される前駆体タンパク質を用いてもよく、成熟型のBMP-7を用いてもよい。また、BMP-7の生理活性を有する限り構造に修飾を加えたタンパク質を用いてもよく、例えば、特許US 5656593に開示される方法による短縮した成熟型BMP-7（38-139）またはアミノ酸を改変したタンパク質を用いてもよい。   The present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating liver disease caused by HCV infection, comprising bone morphogenetic protein 7 (BMP-7) as an active ingredient. The mRNA sequence of the BMP7 gene encoding the amino acid of the BMP-7 precursor protein is described in GenBank X51801. The structure of the mature form of BMP-7 (BMP-7 precursor protein 293-431; amino acid residue number 139) after being cleaved by protease is shown in Celeste et al. (Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87: 9843- 9847). As BMP-7 used in the present invention, a precursor protein produced from the full-length gene of BMP7 may be used, or mature BMP-7 may be used. In addition, a protein with a modified structure may be used as long as it has BMP-7 physiological activity. For example, a shortened mature BMP-7 (38-139) or amino acid obtained by the method disclosed in Patent US 5656593 can be used. Modified proteins may be used.

HCV感染による肝疾患には、肝炎、肝硬変およびウイルス性肝細胞癌が含まれる。本発明の医薬組成物は、HCV感染患者においてHCV感染量を低減させるのに特に有用である。   Liver diseases due to HCV infection include hepatitis, cirrhosis and viral hepatocellular carcinoma. The pharmaceutical composition of the present invention is particularly useful for reducing the amount of HCV infection in HCV-infected patients.

別の観点においては、本発明はBMP-7を有効成分とする医薬組成物を、インターフェロン(IFN)を有効成分とする製剤またはリバビリンを有効成分とする製剤と併用投与することによる抗HCV療法を提供する。   In another aspect, the present invention provides anti-HCV therapy by administering a pharmaceutical composition containing BMP-7 as an active ingredient in combination with a preparation containing interferon (IFN) as an active ingredient or a preparation containing ribavirin as an active ingredient. provide.

IFNを有効成分とする製剤は、それ自体抗ウイルス効果を示すIFN製剤の中から選択することができる。天然型のIFNの例として、ヒトリンパ芽球由来のIFN-α、リコンビナントIFN-α-2a、リコンビナントIFN-α-2b、ヒト線維芽細胞由来のINF-βが挙げられる。また、これらの天然型のIFNの代わりに修飾IFNを用いた製剤、例えば、アミノ酸配列を一部改変したコンセンサスIFNや、ポリエチレングリコールを結合させたPEG化IFNを含む製剤を用いることもできる。しかしながら、本発明で用いることができるIFNはこれらの例に限られるものではない。   The preparation containing IFN as an active ingredient can be selected from IFN preparations that themselves exhibit antiviral effects. Examples of natural IFNs include human lymphoblast-derived IFN-α, recombinant IFN-α-2a, recombinant IFN-α-2b, and human fibroblast-derived INF-β. In addition, preparations using modified IFNs in place of these natural IFNs, such as consensus IFNs with partially modified amino acid sequences, and preparations containing PEGylated IFNs bound with polyethylene glycol can also be used. However, the IFN that can be used in the present invention is not limited to these examples.

本発明の医薬組成物は、BMP-7を有効成分とすることを特徴とする。本発明の医薬組成物に含まれるBMP-7は公知物質であり、医薬として使用できる程度に精製されたものであれば、市販のBMP-7タンパク質を用いてもよく、種々の方法で調整したものを用いてもよい。BMP-7の製造法としては、例えば、BMP-7をコードするＤＮＡを，適当な発現ベクターに中に組み込み，これを真核生物または原核生物細胞のいずれかに導入して，所望のタンパク質を発現させることができる。BMP-7を発現させるために用いることができる宿主細胞の例としては，限定されないが，大腸菌，枯草菌等の原核生物宿主，および酵母，真菌，昆虫細胞，哺乳動物細胞等の真核生物宿主が挙げられる。   The pharmaceutical composition of the present invention comprises BMP-7 as an active ingredient. BMP-7 contained in the pharmaceutical composition of the present invention is a known substance, and a commercially available BMP-7 protein may be used as long as it is purified to the extent that it can be used as a medicine, and prepared by various methods. A thing may be used. As a method for producing BMP-7, for example, DNA encoding BMP-7 is incorporated into an appropriate expression vector, which is introduced into either a eukaryotic cell or a prokaryotic cell, and a desired protein is obtained. Can be expressed. Examples of host cells that can be used to express BMP-7 include, but are not limited to, prokaryotic hosts such as E. coli and Bacillus subtilis, and eukaryotic hosts such as yeast, fungi, insect cells and mammalian cells. Is mentioned.

ベクターは，BMP-7をコードするＤＮＡの発現を駆動するプロモーター領域を含み，さらに転写および翻訳の制御配列，例えばＴＡＴＡボックス，キャッピング配列，ＣＡＡＴ配列，３’非コード領域，エンハンサー等を含んでいてもよい。プロモーターの例としては，原核生物宿主中で用いる場合には，ｂｌａプロモーター，ｃａｔプロモーター，ｌａｃＺプロモーター，真核生物宿主中で用いる場合には，ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター，ＳＶ４０初期プロモーター，酵母解糖系酵素遺伝子配列プロモーター等が挙げられる。ベクターの例には，限定されないが，ｐＢＲ３２２，ｐＵＣ１１８，ｐＵＣ１１９，λｇｔｌ０，λｇｔ１１，ｐＭＡＭ−ｎｅｏ，ｐＫＲＣ，ＢＰＶ，ワクチニア，ＳＶ４０，２−ミクロン等が含まれる。さらに，シグナル配列を用いてBMP-7を分泌発現させるように，あるいは，BMP-7を別のタンパク質との融合タンパク質の形で発現させるように，ベクターを構築することができる。そのような発現ベクターの構築は当該技術分野においてよく知られている。   The vector includes a promoter region that drives the expression of DNA encoding BMP-7, and further includes transcriptional and translational control sequences such as a TATA box, capping sequence, CAAT sequence, 3 ′ non-coding region, enhancer, and the like. Also good. Examples of promoters include bla promoter, cat promoter, lacZ promoter when used in prokaryotic hosts, herpesvirus TK promoter, SV40 early promoter, yeast glycolysis system when used in eukaryotic hosts. Examples include enzyme gene sequence promoters. Examples of vectors include, but are not limited to, pBR322, pUC118, pUC119, λgt10, λgt11, pMAM-neo, pKRC, BPV, vaccinia, SV40, 2-micron and the like. Furthermore, the vector can be constructed so that BMP-7 is secreted and expressed using a signal sequence, or BMP-7 is expressed in the form of a fusion protein with another protein. The construction of such expression vectors is well known in the art.

BMP-7を発現するよう構築されたベクターは，トランスフォーメーション，トランスフェクション，コンジュゲーション，プロトプラスト融合，エレクトロポレーション，粒子銃技術，リン酸カルシウム沈澱，直接マイクロインジェクション等により，適当な宿主細胞中に導入することができる。ベクターを含む細胞を適当な培地中で成長させてBMP-7を産生させ，細胞または培養上清から所望の組換えタンパク質を回収し，精製することにより，BMP-7タンパク質を得ることができる。精製は，サイズ排除クロマトグラフィー，ＨＰＬＣ，イオン交換クロマトグラフィー，および免疫アフィニティークロマトグラフィー等を用いて行うことができる。   Vectors constructed to express BMP-7 are introduced into appropriate host cells by transformation, transfection, conjugation, protoplast fusion, electroporation, particle gun technology, calcium phosphate precipitation, direct microinjection, etc. be able to. BMP-7 protein can be obtained by growing cells containing the vector in an appropriate medium to produce BMP-7, and recovering and purifying the desired recombinant protein from the cells or culture supernatant. Purification can be performed using size exclusion chromatography, HPLC, ion exchange chromatography, immunoaffinity chromatography, and the like.

また、宿主細胞中で発現されたタンパク質は、種々の翻訳後修飾を受ける場合がある。したがって、本発明の医薬組成物において用いられる組換えBMP-7タンパク質には、そのような翻訳後修飾を受けたタンパク質も含まれる。さらに、本発明の医薬組成物において用いられるBMP-7は、公知の無細胞タンパク質合成系、例えば、ウサギ網状赤血球溶解物や小麦胚芽抽出物等によって調製することもできる。   In addition, proteins expressed in host cells may undergo various post-translational modifications. Therefore, the recombinant BMP-7 protein used in the pharmaceutical composition of the present invention includes a protein having undergone such post-translational modification. Furthermore, BMP-7 used in the pharmaceutical composition of the present invention can also be prepared by a known cell-free protein synthesis system, for example, rabbit reticulocyte lysate or wheat germ extract.

本発明の医薬組成物は、当業者に公知の方法で製剤化することができる。例えば、薬学的に許容しうる担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することができる。   The pharmaceutical composition of the present invention can be formulated by methods known to those skilled in the art. For example, a pharmaceutically acceptable carrier or medium, specifically, sterile water or saline, vegetable oil, emulsifier, suspension, surfactant, stabilizer, flavoring agent, excipient, vehicle, preservative It can be formulated by mixing in a unit dosage form as required for generally accepted pharmaceutical practice, in appropriate combination with a binder and the like.

経口投与用には、BMP-7を当該技術分野においてよく知られる薬学的に許容しうる担体と混合することにより、錠剤、丸薬、糖衣剤、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液等として処方することができる。担体としては、当該技術分野において公知のものを広く使用することができ、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、グルコース、尿素、澱粉、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸等の賦形剤；水、エタノール、プロパノール、単シロップ、グルコース液、澱粉液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニルピロリドン等の結合剤、乾燥澱粉、アルギン酸ナトリウム、寒天末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、澱粉、乳糖等の崩壊剤；白糖、ステアリンカカオバター、水素添加油等の崩壊抑制剤；第４級アンモニウム塩類、ラウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤；グリセリン、澱粉等の保湿剤；澱粉、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等の吸着剤；精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ酸末、ポリエチレングリコール等の潤沢剤等を用いることができる。さらに錠剤は、必要に応じ、通常の剤皮を施した錠剤、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠、あるいは二重錠、多層錠とすることができる。   For oral administration, tablets, pills, dragees, capsules, liquids, gels, syrups, slurries, suspensions by mixing BMP-7 with pharmaceutically acceptable carriers well known in the art Etc. can be prescribed as As the carrier, those known in the art can be widely used. For example, excipients such as lactose, sucrose, sodium chloride, glucose, urea, starch, calcium carbonate, kaolin, crystalline cellulose, silicic acid and the like; Water, ethanol, propanol, simple syrup, glucose solution, starch solution, gelatin solution, carboxymethylcellulose, shellac, methylcellulose, potassium phosphate, polyvinylpyrrolidone and other binders, dried starch, sodium alginate, agar powder, laminaran powder, hydrogen carbonate Disintegrating agents such as sodium, calcium carbonate, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, sodium lauryl sulfate, stearic acid monoglyceride, starch, lactose; disintegrating inhibitors such as sucrose, stear cocoa butter, hydrogenated oil; quaternary ammonium salts, lauric Absorption promoters such as sodium sulfate; humectants such as glycerin and starch; adsorbents such as starch, lactose, kaolin, bentonite and colloidal silicic acid; lubricants such as purified talc, stearate, boric acid powder and polyethylene glycol Etc. can be used. Furthermore, the tablet can be a tablet coated with a normal coating, for example, a sugar-coated tablet, a gelatin-encapsulated tablet, an enteric-coated tablet, a film-coated tablet, a double tablet, or a multilayer tablet, if necessary.

非経口投与用には、BMP-7を当該技術分野においてよく知られる薬学的に許容しうるベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。   For parenteral administration, BMP-7 can be formulated according to conventional pharmaceutical practice using pharmaceutically acceptable vehicles well known in the art.

注射剤用の水溶性ベヒクルとしては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０と併用してもよい。   Examples of water-soluble vehicles for injection include isotonic solutions containing physiological saline, glucose and other adjuvants such as D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol, sodium chloride, and suitable solubilizing aids. An agent such as an alcohol, specifically ethanol, a polyalcohol such as propylene glycol, polyethylene glycol, a nonionic surfactant such as polysorbate 80 (TM), HCO-50 may be used in combination.

油性ベヒクルとしてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。   Oily vehicles include sesame oil and soybean oil, and benzyl benzoate and benzyl alcohol may be used in combination as solubilizing agents. Moreover, you may mix | blend with buffer, for example, phosphate buffer, sodium acetate buffer, a soothing agent, for example, procaine hydrochloride, stabilizer, for example, benzyl alcohol, phenol, antioxidant. The prepared injection solution is usually filled into a suitable ampoule.

また、BMP-7の分散を制御するなどの目的で、担体、例えば、コラーゲン、ハイドロキシアパタイト、ヒアルロン酸、フィブリン、多糖、リポゾームと配合してもよい。調製された製剤は、経口剤または非経口投与剤として使用できる。   Further, for the purpose of controlling the dispersion of BMP-7, it may be blended with a carrier such as collagen, hydroxyapatite, hyaluronic acid, fibrin, polysaccharide, or liposome. The prepared preparation can be used as an oral preparation or a parenteral administration preparation.

本発明の医薬組成物の適当な投与経路には、限定されないが、経口、直腸内、経粘膜、または腸内投与、または筋肉内、皮下、骨髄内、鞘内、直接心室内、静脈内、硝子体内、腹腔内、鼻腔内、または眼内注射が含まれる。投与経路は、患者の年齢や病状、併用する他の薬剤等を考慮して適宜選択することができる。   Suitable routes of administration of the pharmaceutical composition of the present invention include, but are not limited to, oral, rectal, transmucosal, or enteral administration, or intramuscular, subcutaneous, intramedullary, intrathecal, direct intraventricular, intravenous, Intravitreal, intraperitoneal, intranasal, or intraocular injection is included. The administration route can be appropriately selected in consideration of the age and medical condition of the patient, other drugs used in combination, and the like.

本発明の医薬組成物の投与量としては、例えば、一回につき体重1 kgあたり0.01 mgから1 mgの範囲で選ぶことが可能である。あるいは、例えば、患者あたり１回投与あたり0.02〜100 mgの範囲で投与量を選ぶことができるが、これらの数値に必ずしも制限されるものではない。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢、症状、併用する他の薬剤など等を考慮して適宜選択することができる。また、本発明の医薬組成物をインターフェロン製剤またはリバビリン製剤と併用する場合には、これらの薬剤を同時に投与してもよく、別々に投与してもよい。   The dosage of the pharmaceutical composition of the present invention can be selected, for example, in the range of 0.01 mg to 1 mg per kg of body weight at a time. Alternatively, for example, the dose can be selected in the range of 0.02 to 100 mg per dose per patient, but is not necessarily limited to these values. The dosage and administration method can be appropriately selected in consideration of the patient's weight, age, symptoms, other drugs used in combination, and the like. Moreover, when using the pharmaceutical composition of this invention together with an interferon formulation or a ribavirin formulation, these agents may be administered simultaneously or separately.

以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。   EXAMPLES The present invention will be described below in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.

HCVレプリコン系におけるBMP-7によるHCV増殖抑制
レプリコン試験系に用いた細胞としては、Tanabe et al., (J Infect Dis 2004, 189: 1129-1139)に記載されるHuh 7/Feo細胞を用いた。この細胞は、HCV-N, 1bから作成されたレプリコンプラスミドpHCV1bneo-delSのNeo遺伝子の代わりに、ホタルルシフェラーゼをネオマイシンホスホトランスフェラーゼにインフレームで融合したキメラ遺伝子コーディング(Feo)を導入したHCVレプリコンプラスミドを、ヒト肝臓癌細胞株Huh 7にトランスフェクションし、定常的な発現を示す細胞を選択することにより樹立した細胞株である。 Huh 7 / Feo cells described in Tanabe et al., (J Infect Dis 2004, 189: 1129-1139) were used as cells used in the HCV growth suppression replicon test system with BMP-7 in the HCV replicon system . . In this cell, instead of the Neo gene of the replicon plasmid pHCV1bneo-delS created from HCV-N, 1b, an HCV replicon plasmid introduced with chimeric gene coding (Feo) in which firefly luciferase was fused in frame to neomycin phosphotransferase was introduced. This is a cell line established by transfecting the human liver cancer cell line Huh 7 and selecting cells showing constant expression.

Huh7/Feo細胞をBMP-7処置の20時間前から24ウエルプレートに2.5×104個／穴ずつ撒き、5%CO2下で37℃にて培養した。培地には、ダルベッコ改変最少必須培地(Sigma-Aldrich, Co.)にウシ胎児血清10%、ペニシリン100 IU/mL、ストレプトマイシン100 μg/mL、G418（和光純薬工業株式会社） 250 μg/mLを加えたものを用いた。 Huh7 / Feo cells were seeded at 2.5 × 10 4 cells / well in a 24-well plate 20 hours before BMP-7 treatment, and cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 . The medium is Dulbecco's modified minimal essential medium (Sigma-Aldrich, Co.) with fetal bovine serum 10%, penicillin 100 IU / mL, streptomycin 100 μg / mL, G418 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 250 μg / mL What was added was used.

BMP-7は、R&D Systems Inc.製のリコンビナントヒトBMP-7の市販品を用いた。BMP-7をDMSOで溶解し培地にて希釈して培地に加え、50 ng/mLまたは100 ng/mLの濃度とした。BMP-7添加72時間後に細胞を回収し、ルシフェラーゼおよび蛋白量を測定した。ルシフェラーゼアッセイはLuciferase Assay System （Promega Corporation）およびルミノメーター（Promega Corporation）用いて定量した。蛋白量はProtein assay dye reagent (Bio-Rad Laboratories)およびBioPhotometer (Eppendorf AG)を用いて測定した。   As BMP-7, a commercial product of recombinant human BMP-7 manufactured by R & D Systems Inc. was used. BMP-7 was dissolved in DMSO, diluted with a medium and added to the medium to a concentration of 50 ng / mL or 100 ng / mL. Cells were collected 72 hours after addition of BMP-7, and luciferase and protein levels were measured. The luciferase assay was quantified using a Luciferase Assay System (Promega Corporation) and a luminometer (Promega Corporation). The amount of protein was measured using Protein assay dye reagent (Bio-Rad Laboratories) and BioPhotometer (Eppendorf AG).

HCVの増殖が多い場合には、ルシフェラーゼの発現が多くなりルシフェラーゼ活性は増加する。一方、宿主であるHuh7の増殖が抑制されると蛋白量は少なくなる。そのため、細胞あたりのHCVレプリコンの増殖能を評価するために、ルシフェラーゼ活性／蛋白量をその尺度に用いた。   When the proliferation of HCV is large, the expression of luciferase increases and the luciferase activity increases. On the other hand, if the growth of the host Huh7 is suppressed, the amount of protein decreases. Therefore, in order to evaluate the proliferation ability of HCV replicon per cell, luciferase activity / protein amount was used as the scale.

薬剤処置72時間後のルシフェラーゼ活性および蛋白量を図１に示す。図中、棒はHCVレプリコンを導入したHuh7細胞の蛍光の相対光量を示す。蛍光強度はルシフェラーゼを挿入したHCVレプリコンの増殖に伴うルシフェラーゼ活性を反映する。折れ線は蛋白量を示す。蛋白量はHCVレプリコン宿主のHuh7の増殖の程度を反映する。   FIG. 1 shows the luciferase activity and protein amount after 72 hours of drug treatment. In the figure, the bar indicates the relative light intensity of the fluorescence of Huh7 cells into which the HCV replicon was introduced. The fluorescence intensity reflects the luciferase activity associated with the growth of the HCV replicon inserted with luciferase. A broken line shows the amount of protein. The amount of protein reflects the degree of growth of Huh7 in the HCV replicon host.

ルシフェラーゼ活性はBMP-7添加により濃度依存的に低下した。また、蛋白量もBMP-7添加により濃度依存的に減少した。図2に細胞あたりのHCV増殖量を評価するためのルシフェラーゼ活性／蛋白量を示した。この値は宿主のHuh7の増殖の程度を補正したHCVレプリコンの増殖の程度を反映する。   Luciferase activity decreased in a concentration-dependent manner with the addition of BMP-7. The amount of protein also decreased in a concentration-dependent manner with the addition of BMP-7. FIG. 2 shows the luciferase activity / protein amount for evaluating the amount of HCV proliferation per cell. This value reflects the degree of growth of the HCV replicon corrected for the degree of Huh7 growth in the host.

図２から明らかなように、BMP-7処置によりルシフェラーゼ活性／蛋白量の値は濃度依存的な低下を示した。したがって、BMP-7はHCVレプリコンの増殖能を抑制していることが示された。   As is apparent from FIG. 2, the value of luciferase activity / protein amount decreased in a concentration-dependent manner by treatment with BMP-7. Therefore, BMP-7 was shown to suppress the proliferation ability of the HCV replicon.

HCVレプリコン系におけるIFNおよびBMP-7によるHCV増殖抑制
薬剤処置条件を除いて、実施例１と同じ方法にて試験を実施した。インターフェロン(IFN)αには、PBL Biomedical Laboratories製のIFN-α2の市販品を用いた。IFN-αはDMSOで溶解し培地にて希釈した。IFN-αおよびBMP-7のそれぞれ単独または両方を培地に添加し、72時間後に細胞を回収し、ルシフェラーゼ活性および蛋白量を測定した。 The test was carried out in the same manner as in Example 1 except for the conditions for treating HCV growth inhibitory drugs with IFN and BMP-7 in the HCV replicon system . As interferon (IFN) α, a commercial product of IFN-α2 manufactured by PBL Biomedical Laboratories was used. IFN-α was dissolved in DMSO and diluted in a medium. IFN-α and BMP-7 alone or both were added to the medium, and after 72 hours, the cells were collected, and luciferase activity and protein amount were measured.

薬剤処置72時間後のルシフェラーゼ活性／蛋白量を図３に示す。蛋白量あたりの相対光量の値は、宿主のHuh7の増殖の程度を補正したHCVレプリコンの増殖の程度を反映する。BMP-7 100 ng/mL単独の適用によりHCV増殖度を示すルシフェラーゼ活性／蛋白量は低下した。ウエルあたり0.5 UのIFN-α添加は強い効果を示さなかった。一方、IFN-α 0.5 UおよびBMP-7 100 ng/mLの両方を適用することにより、IFN 1 U添加時に匹敵する強い相対光量／蛋白量の減少が認められた。以上の結果から、BMP-7がIFN-αのHCV増殖抑制効果を増強することが示された。   The luciferase activity / protein amount after 72 hours of drug treatment is shown in FIG. The value of the relative light amount per protein amount reflects the degree of growth of the HCV replicon corrected for the degree of Huh7 growth in the host. Application of BMP-7 100 ng / mL alone reduced the luciferase activity / protein content indicating the degree of HCV proliferation. Addition of 0.5 U IFN-α per well did not show a strong effect. On the other hand, by applying both IFN-α 0.5 U and BMP-7 100 ng / mL, a strong decrease in relative light quantity / protein amount comparable to that when IFN 1 U was added was observed. From the above results, it was shown that BMP-7 enhances the HCV proliferation inhibitory effect of IFN-α.

HCVレプリコン系におけるリバビリンおよびBMP-7によるHCV増殖抑制
薬剤処置条件を除いて、実施例１と同じ方法にて試験を実施した。リバビリンは、Sigma-Aldrich Corporation製の市販品を用いた。リバビリンはDMSOで溶解し培地にて希釈した。薬剤処置の条件は、無処置、リバビリン 100 μM単独処置、あるいはリバビリン 100 μMとBMP-7 100 ng/mLの両方を処置する条件とした。薬剤を培地に添加後72時間後に細胞を回収し、ルシフェラーゼ活性および蛋白量を測定した。各薬剤処置条件のルシフェラーゼ活性／蛋白量を無処置条件を1とした相対値として算出したところ、リバビリン単独処置条件0.52、リバビリンとBMP-7の両方を処置した条件0.26であった。以上の結果から、BMP-7がリバビリンのHCV増殖抑制効果を増強することが示された。 The test was performed in the same manner as in Example 1 except for the conditions for treating HCV growth inhibitory drugs with ribavirin and BMP-7 in the HCV replicon system . As ribavirin, a commercial product manufactured by Sigma-Aldrich Corporation was used. Ribavirin was dissolved in DMSO and diluted in medium. The drug treatment conditions were as follows: no treatment, ribavirin 100 μM alone treatment, or treatment with both ribavirin 100 μM and BMP-7 100 ng / mL. Cells were collected 72 hours after the drug was added to the medium, and luciferase activity and protein content were measured. When the luciferase activity / protein amount of each drug treatment condition was calculated as a relative value with 1 as the non-treatment condition, it was a ribavirin-only treatment condition of 0.52, and a condition of 0.26 where both ribavirin and BMP-7 were treated. From the above results, it was shown that BMP-7 enhances the inhibitory effect of ribavirin on HCV proliferation.

図１はHCVレプリコン系におけるHCV増殖に対するBMP-7の効果を示す。FIG. 1 shows the effect of BMP-7 on HCV proliferation in the HCV replicon system. 図２はHCVレプリコン系におけるHCV増殖に対するBMP-7の効果を示す。FIG. 2 shows the effect of BMP-7 on HCV proliferation in the HCV replicon system. 図３はHCVレプリコン系におけるIFNおよびBMP-7によるHCV増殖抑制を示す。FIG. 3 shows suppression of HCV proliferation by IFN and BMP-7 in the HCV replicon system.

Claims (6)

BMP-7を有効成分とする、HCV感染による肝疾患を予防または治療するための医薬組成物。 A pharmaceutical composition for preventing or treating liver disease caused by HCV infection, comprising BMP-7 as an active ingredient. BMP-7を有効成分とする、HCV感染量を低減させるための医薬組成物。 A pharmaceutical composition for reducing the amount of HCV infection, comprising BMP-7 as an active ingredient. BMP-7を有効成分とする、インターフェロン製剤と併用してHCV感染量を低減させるための医薬組成物。 A pharmaceutical composition for reducing the amount of HCV infection in combination with an interferon preparation comprising BMP-7 as an active ingredient. BMP-7を有効成分とする、リバビリン製剤と併用してHCV感染量を低減させるための医薬組成物。 A pharmaceutical composition for reducing the amount of HCV infection in combination with a ribavirin preparation comprising BMP-7 as an active ingredient. BMP-7およびインターフェロンを有効成分とする、HCV感染量を低減させるための医薬組成物。 A pharmaceutical composition for reducing the amount of HCV infection, comprising BMP-7 and interferon as active ingredients. BMP-7およびリバビリンを有効成分とする、HCV感染量を低減させるための医薬組成物。

A pharmaceutical composition for reducing the amount of HCV infection, comprising BMP-7 and ribavirin as active ingredients.

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