JP2008154497A - Method for producing transformant and new mutant of yeast - Google Patents

Method for producing transformant and new mutant of yeast Download PDF

Info

Publication number
JP2008154497A
JP2008154497A JP2006346522A JP2006346522A JP2008154497A JP 2008154497 A JP2008154497 A JP 2008154497A JP 2006346522 A JP2006346522 A JP 2006346522A JP 2006346522 A JP2006346522 A JP 2006346522A JP 2008154497 A JP2008154497 A JP 2008154497A
Authority
JP
Grant status
Application
Patent type
Prior art keywords
method
pulsed laser
laser
method according
high productivity
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2006346522A
Other languages
Japanese (ja)
Inventor
Eiichiro Fukuzaki
Yoji Hata
Kazuyuki Hirao
Shinichiro Kajiyama
Kinkai Tsukasa
Hiroko Tsutsumi
Atsumi Ueda
金海 司
浩子 堤
一之 平尾
慎一郎 梶山
充美 植田
英一郎 福崎
洋二 秦
Original Assignee
Gekkeikan Sake Co Ltd
Japan Science & Technology Agency
Kyoto Univ
Osaka Univ
国立大学法人京都大学
国立大学法人大阪大学
月桂冠株式会社
独立行政法人科学技術振興機構
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date

Links

Images

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for producing a transformant capable of easily obtaining a transformant acquired desired characteristics, and a yeast mutant capable of highly producing an active ingredient. <P>SOLUTION: Disclosed are: (1) a method for introducing random mutation into a chromogene by irradiating cells with pulsed laser having a non-linear optical effect; (2) a method for producing a transformant including a first process of irradiating cells with pulsed laser having the non-linear optical effect and a second process of selecting a cell having desired characteristics; (3) Saccharomyces cerevisiae mutant having a feature that GABA production is 0.8 mg or more per 1 g of dried bacterial body; and (4) Saccharomyces cerevisiae mutant having a feature that Glycine production is 1 mg or more per 1 g of dried bacterial body. <P>COPYRIGHT: (C)2008,JPO&INPIT

Description

本発明は、真菌、細菌、植物、動物などの各種の細胞について形質転換体を製造する方法、及びこの方法により得られた酵母の新規変異株に関する。 The present invention, fungi, bacteria, plants, methods of producing various types of cells for transformants such as an animal, and to novel mutant strain of yeast obtained by this method.

微生物は、食品産業、環境産業、工業原料製造産業などにおいて、食品加工、物質生産、環境浄化などに幅広く用いられている。 Microorganisms, the food industry, environmental industry, such as in industrial raw materials manufacturing industry, food processing, are widely used in such material production, environmental cleanup. これらの産業では、生産性、機能性、処理能力を高めるために、高い能力を有する微生物を選抜し、使用している。 In these industries, productivity, functionality, to enhance the capacity, were selected microorganism having a high capacity, are used. このような高能力を有する微生物を得る手段としては、自然界からのスクリーニング、接合による育種、変異原処理による変異株の作製、外来遺伝子導入による形質転換体の作出などの手段が採られている。 Such means for obtaining a microorganism having a high capacity, screening from the natural world, breeding by joining, producing mutants by mutagen treatment, means such as generation of transformants by a foreign gene introduced is adopted.

しかし、自然界からのスクリーニングは、発見確率が低いため確実性に劣る。 However, screening from the natural world is inferior in certainty for discovery probability is low. また、接合による育種は、目的とする形質を有する微生物の存在を前提とする。 Furthermore, breeding by bonding presupposes the presence of microorganisms having a trait of interest. 外来遺伝子導入による形質転換体の作製は、安全性やそれに対する社会的コンセンサスが得られない場合もある。 Preparation of transformants by foreign gene transfer may not social consensus for safety and it is obtained.

また、変異原処理による変異株の作製は、EMSなどの化学変異原物質による処理、紫外線やX線の照射などによりDNAにランダムに変異を導入し、この中から所望の特性を獲得した細胞を選択する方法である。 Furthermore, mutations produce mutant strains according to the original processing, treatment with a chemical mutagen such as EMS, due ultraviolet irradiation or X-rays by introducing random mutations into DNA, the acquired cells desired properties from this it is a method of selection. この方法では、染色体中に変異が導入され易い位置と、変異が導入され難い位置がある。 In this way, the likely position mutation is introduced into the chromosome, there is a position where hardly mutation is introduced. 従って、目的とする特性によってはその特性を獲得した形質転換体を取得することができない。 Therefore, it is not possible depending on the characteristics of interest to obtain a transformant that acquired the characteristics.

ここで、昨今、食品の機能化が進んでおり、清酒にもプラスアルファの機能を持たせることが求められている。 Here, in recent years, function of food is proceeding, be provided with a function of plus alpha also in Sake has been demanded. 従って、醸造微生物自体が有効成分を高生産するものであれば有用である。 Therefore, it is useful as long as it brewing microorganism itself highly producing an active ingredient.

本発明は、従来方法では変異を導入することが困難であった染色体上の位置にも変異を導入することができる形質転換体の製造方法、及び有効成分を高生産する酵母変異株を提供することを課題とする。 The present invention is, in the conventional method provides a yeast mutant for high productivity process for producing a transformant capable of introducing a mutation in position on the chromosome was difficult to introduce the mutation, and the active ingredient it is an object of the present invention.

上記課題を解決するために本発明者らは研究を重ね、いわゆるフェムト秒レーザーを細胞群に照射することにより、従来の形質転換方法では得られなかった新たな形質を獲得した変異株を容易に作出できることを見出した。 The present inventors to solve the above problems extensive research, the so-called femtosecond laser by irradiating the cell population, a mutant strain that has acquired a new trait which can not be obtained easily by conventional transformation methods It was found to be able to produce.

また、サッカロマイセス・セレビシエのコロニーにフェムト秒レーザーを照射することにより、GABA(γ−アミノ酪酸;Gamma-Amino Butyric Acid)及びグリシンを高生産する変異株を取得した。 Further, by applying femtosecond laser colony of Saccharomyces cerevisiae, GABA (.gamma.-aminobutyric acid; Gamma-Amino Butyric Acid) were obtained and mutant strains highly producing glycine.

本発明は上記知見に基づき完成されたものであり、下記の形質転換体の製造方法、及び酵母変異株を提供する。 The present invention has been completed based on the above finding, a method of manufacturing a transformant described below, and provides a yeast mutant.
1. 1. 非線形光学効果を有するパルスレーザーを細胞に照射することを特徴とする、染色体遺伝子にランダム変異を導入する方法。 How a pulsed laser having a nonlinear optical effect and irradiating the cell, introducing a random mutation into the chromosomal gene.
2. 2. 染色体遺伝子の非露出部分にランダム変異を導入することを特徴とする、項1に記載の方法。 And introducing random mutations in the non-exposed portion of the chromosomal gene, A method according to claim 1.
3. 3. 非線形光学効果を有するパルスレーザーを細胞に照射する第1工程と、目的とする形質を有する細胞を選択する第2工程とを備える、形質転換体の製造方法。 The first comprises a step, a second step of selecting cells having the trait of interest, method for producing a transformant, which irradiates a pulsed laser having a nonlinear optical effect in the cells.
4. 4. 非線形光学効果を有するパルスレーザーがフェムト秒オーダーのパルス幅を有するパルスレーザーである、項1〜3のいずれかに記載の方法。 Nonlinear pulse laser having an optical effect is a pulsed laser having a pulse width in the order of femtoseconds, The method according to any one of Items 1 to 3.
5. 5. レーザーの出力を100μW〜800mWとする項1〜4のいずれかに記載の方法。 The method according to any one of Items 1 to 4, 100μW~800mW the output of the laser.
6. 6. パルスレーザーの繰り返し周波数を1kHz〜100MHzとする項1〜5のいずれかに記載の方法。 The method according to any one of Items 1 to 5 of the repetition frequency of the pulsed laser and 1 kHz to 100 MHz.
7. 7. パルスレーザー集光レンズの開口数を0.1〜1.5とする項1〜6のいずれかに記載の方法。 The method according to any one of Items 1 to 6, the numerical aperture of the pulsed laser condenser lens 0.1 to 1.5.
8. 8. パルスレーザーの全照射時間を0.001〜10秒とする項1〜4のいずれかに記載の方法。 The method according to any one of Items 1 to 4, the total exposure time of the pulse laser to 0.001 seconds.
9. 9. 第1工程において、パルスレーザーを間歇的に照射する項3〜8のいずれかに記載の方法。 In the first step, the method according to any one of claim 3-8 for intermittently applying a pulse laser.
10. 10. 目的とする形質が、γ−アミノ酪酸高生産性、グリシン高生産性、アラニン高生産性、ロイシン高生産性、セリン高生産性、スレオニン高生産性、及びアスパラギン酸高生産性からなる群より選ばれる少なくとも1種の形質である項1〜9のいずれかに記載の方法。 Trait of interest is, .gamma.-aminobutyric acid and high productivity, glycine high productivity, alanine high productivity, leucine high productivity, serine high productivity, threonine high productivity, and selected from the group consisting of aspartic acid and high productivity the method according to any one of claim 1 to 9 is at least one trait.
11. 11. 前記細胞が細菌または真菌である項1〜10のいずれかに記載の方法。 The method according to any one of claim 1 to 10 wherein the cell is a bacterial or fungal.
12. 12. 真菌が酵母または糸状菌である項11に記載の方法。 The method according to claim 11 fungus is a yeast or filamentous fungi.
13. 13. サッカロマイセス属に属し、乾燥菌体1g当たりのγ−アミノ酪酸生産量が0.8mg以上である新規変異株。 Belonging to the genus Saccharomyces, the new mutant strain γ- aminobutyric acid production per dry cell 1g is not less than 0.8 mg.
14. 14. 乾燥菌体1g当たりのグリシン生産量が1mg以上である項10に記載の変異株。 Mutants glycine production per dry cell 1g is described in claim 10 is at least 1 mg.
15. 15. フェムト秒オーダーのパルス幅を有するパルスレーザーをサッカロマイセス属細胞群に照射し、シクロヘキシミド耐性を獲得した細胞を選択することにより得られるものである、項13又は14に記載の変異株。 A pulsed laser having a pulse width in the order of femtoseconds is irradiated to the genus Saccharomyces cell population, is obtained by selecting cells that have acquired resistance to cycloheximide, mutant strain according to claim 13 or 14.
16. 16. サッカロマイセス属に属し、乾燥菌体1g当たりのグリシン生産量が1mg以上である新規変異株。 Belonging to the genus Saccharomyces, the new mutant strain glycine production per dry cell 1g is greater than or equal to 1 mg.
17. 17. フェムト秒オーダーのパルス幅を有するパルスレーザーをサッカロマイセス属細胞群に照射し、シクロヘキシミド耐性を獲得した細胞を選択することにより得られるものである、項16に記載の変異株。 A pulsed laser having a pulse width in the order of femtoseconds is irradiated to the genus Saccharomyces cell population, it is obtained by selecting cells that have acquired resistance to cycloheximide, mutant strain according to claim 16.
18. 18. 新規変異株が、サッカロマイセス・セレビシエK701−Lz1株(FERM P−21058)である項10〜14のいずれかに記載の変異株。 New mutants, mutant strain according to any one of Items 10 to 14 which is Saccharomyces cerevisiae K701-Lz1 strain (FERM P-21058).
19. 19. 米麹上で酵母を生育させることにより清酒を製造する方法において、酵母として、項13〜18のいずれかに記載の変異株を用いる方法。 A method of producing sake by growing yeast on rice koji, a method of using a yeast, a mutant strain of any of claim 13 to 18.

本発明方法によれば、いわゆるフェムト秒レーザーを細胞群に照射することにより、従来の形質転換方法では得られなかった特性を獲得した形質転換体が得られるようになった。 According to the method of the present invention, a so-called femtosecond laser by irradiating the cell population began to transformants that have acquired characteristics which can not be obtained by conventional transformation methods are obtained. 即ち、従来方法では変異を導入できなかった位置にもランダムに変異を導入することができるようになった。 That is, in the conventional method it has become possible to introduce mutations randomly in a position which can not be mutated. これは、染色体の高次構造のために変異原物質が接近し難かった染色体上の位置や、紫外線などの電磁波が届き難かった染色体上の位置にも、レンズ集光により高エネルギー密度のレーザー光を照射できることによると考えられる。 This mutation position and the original material on chromosomes has been difficult to close because of the conformation of chromosomes in the position on the chromosome where electromagnetic waves were reach hardly such as ultraviolet light, high energy density of the laser beam by a lens condensing It is considered to be due to the fact that the can be irradiated. また、フェムト秒レーザーは、ピークエネルギーが極めて高いため、レーザー焦点位置で非線形加工を行えることも原因であると考えられる。 Further, the femtosecond laser, has an extremely high peak energy, It would also be responsible for enabling the non-linear processing in the laser focus position.

また、従来の変異原処理や紫外線照射などの方法では、生存率約10%程度になるように処理して初めて変異を導入することができるため、形質転換体の取得率が低かったが、細胞群に対してフェムト秒レーザーを照射する本発明方法によれば、高い生存率を維持しつつ所望の変異を導入することができる。 In the method, such as a conventional mutagen treatment or ultraviolet irradiation, it is possible to introduce the first mutations is treated to be about 10% survival, but acquisition rate of the transformant was low, the cell According to the present invention a method of irradiating a femtosecond laser with respect to the group, it can be introduced into the desired mutation while maintaining a high survival rate. これは、フェムト秒レーザーは、レーザーのコヒーレンスによりレーザー焦点にのみ損傷を与えるため、レーザー焦点の周縁部では死滅しない程度にレーザー光が照射され、その結果変異株が得られるためと考えられる。 This femtosecond laser, since damage only to the laser focal point by the coherence of the laser, the laser beam is irradiated so as not to kill the periphery of the laser focal point, presumably because the results mutants are obtained.

また、本発明の第1のサッカロマイセス・セレビシエ変異株は、GABAを高生産する。 The first Saccharomyces cerevisiae mutant strain of the present invention high productivity of GABA. GABAは、主に抑制系の神経伝達物質として脳内の血流を活発にし、酸素供給量を増やし、脳細胞の代謝機能を高める働きがあることが知られている。 GABA is to actively blood flow in the brain as a neurotransmitter mainly suppression system, increase the oxygen supply, it is known that there is a function of increasing the metabolic function of brain cells. この変異株を用いて清酒醸造を行えば、GABAを別途添加することなく、GABAを多く含む清酒を製造することができる。 By performing the sake brewing using this mutant strain, without separately adding a GABA, it is possible to manufacture the sake rich in GABA.

また、本発明の第2のサッカロマイセス・セレビシエ変異株は、グリシンを高生産する変異株である。 The second Saccharomyces cerevisiae mutant strain of the present invention is a mutant strain highly producing glycine. グリシンは、心地よい眠りを誘う作用を有することが見出されているアミノ酸である。 Glycine is an amino acid that has been found to have an effect to invite a pleasant sleep. この変異株を用いて清酒醸造を行えば、グリシンを別途添加することなく、グリシンを多く含む清酒を製造することができる。 By performing the sake brewing using this mutant strain, without separately adding glycine, it is possible to manufacture the sake rich in glycine.

(I)形質転換体の製造方法/染色体遺伝子に変異を導入する方法 (I) a method of introducing a mutation to a manufacturing method / chromosomal gene transformants
本発明の形質転換体の製造方法は、フェムト秒オーダーのパルス幅を有するパルスレーザを細胞群に照射する第1工程と、目的とする形質を有する細胞を選択する第2工程とを備える方法である。 Method for producing a transformant of the present invention is a method comprising a first step of irradiating a pulsed laser having a pulse width in the order of femtoseconds to the cell population, and a second step of selecting cells having the trait of interest is there.

本発明方法では、フェムト秒オーダーのパルス幅を有するパルス変調レーザーを使用するのが特徴であり、これにより極めて高いピークパワー密度が得られる。 In the method of the present invention, it is characterized to use a pulse modulation laser having a pulse width in the order of femtoseconds, this very high peak power density is obtained by. パルス幅は、フェムト秒オーダー、即ち、1×10 −15 〜1×10 −12秒程度であればよいが、中でも1〜500 fs程度が好ましく、50〜200 fs程度がより好ましく、200 fs程度が最も好ましい。 Pulse width, order of femtoseconds, i.e., may be about 1 × 10 -15 ~1 × 10 -12 seconds, among them 1 to 500 approximately fs, more preferably about 50 to 200 fs, of about 200 fs but most preferred.

上記のようにパルス幅が短いことにより十分な非線形効果により効率的にランダム変異を導入することができる。 It can be introduced efficiently random mutations with sufficient nonlinear effects by the short pulse width as described above. 一方、パルス幅が短すぎると、平均出力が小さくなり変異を起こす頻度が低くなる。 On the other hand, when the pulse width is too short, the frequency causing the average output decreases mutation decreases.

このパルスレーザーの繰り返し周波数は、1 KHz〜100 MHz程度が好ましく、1K Hz〜200KHz程度がより好ましい。 Repetition frequency of the pulse laser is preferably about 1 KHz~100 MHz, about 1K Hz~200KHz is more preferable. 繰り返し周波数が上記範囲であれば、パルス間のオフ時間が適切になって、細胞の生存率を高く維持しながら変異を導入することができる。 If the repetition frequency is within the above range, the off time between pulses in the proper, it is possible to introduce high maintenance while mutant cell viability. ここでいう繰り返し周波数は、1パルスの照射の開始から次のパルスの照射の開始までの繰り返しの周波数をいう。 Repetition frequency here refers to the frequency of repetition of the start of the irradiation of the next pulse from the start of one pulse irradiation.

このパルスレーザーの照射時間は、細胞の種類によって異なるが、通常1ms(0.001秒)〜10s(10秒)程度とすればよく、好ましくは4ms〜4s程度とすればよい。 Irradiation time of the pulsed laser may vary depending on the type of cells, usually 1ms well if (0.001 seconds) ~10S (10 seconds) or so, preferably about 4Ms~4s. 上記範囲であれば、細胞の生存率を高く維持しながら変異を導入することができる。 If the above-mentioned range, it is possible to introduce a high maintenance while mutant cell viability. ここでいうパルスレーザーの照射時間は、パルス間時間をも含めた照射期間をいう。 Here pulsed laser irradiation time refers refers to irradiation period, including the inter-pulse time.

また、パルスレーザーは、間歇的に照射してもよい。 The pulse laser may be intermittently irradiated. 即ち、上記範囲の繰り返し周波数を有するパルスレーザーを、オン時間を4ms〜20ms程度とし、オンオフ比(オン時間/(オン時間+オフ時間)の比率)を1/10〜1/100程度として間歇的に照射してもよい。 In other words, intermittent and pulsed laser having a repetition frequency in the above range, the on-time is about 4Ms~20ms, off ratio (ratio of ON time / (ON time + OFF time)) to be about 1 / 10-1 / 100 it may be irradiated to. これにより、細胞が受ける熱的損傷を軽減することができる。 This makes it possible to reduce thermal damage cells undergo. この場合は、オン時間の合計が通常0.1〜1s程度、好ましくは0.1〜0.5s程度となるように照射すればよい。 In this case, the total normal 0.1~1s about on-time, may be preferably irradiated such that the order of 0.1~0.5S.

また、レーザーの出力は、上記繰り返し周波数において100μW〜800mW程度とすればよく、好ましくは100〜300mW程度とすればよい。 The output of the laser may be a 100μW~800mW approximately in the repetition rate, and preferably about 100~300MW. これにより、ピークパワーが適度な値に保たれて、細胞の生存率を高く維持しながら変異を導入することができる。 Thus, kept at a moderate value the peak power, it is possible to introduce high maintenance while mutant cell viability.

また、一定厚さの細胞群にパルスレーザーを照射する場合、パルスレーザー集光の開口数が大きくなるほど一定以上のエネルギー密度が得られる部分の厚みが小さく、即ち細胞数が少なくなって、生存しつつ変異が導入される細胞数が少なくなる。 Also, when irradiating the pulsed laser to the cell group of constant thickness, small thickness of the portion more than a predetermined energy density as the numerical aperture of the pulsed laser condensing increases are obtained, i.e. the number of cells becomes smaller, survived the number of cells mutations are introduced while decreases. 一方、開口数が小さいほど一定以上のエネルギー密度が得られる部分の厚みが大きくなるが焦点部分のエネルギー密度が小さくなって変異導入効率が低下する。 On the other hand, the thickness of the portion where the energy density of a certain or more extent the numerical aperture is small is obtained increases to decreases mutagenesis efficiency decreased energy density of the focal portion. 従って、レーザーのレンズ集光による開口数は、通常0.1〜1程度とすればよく、好ましくは0.3〜0.7程度とすればよい。 Therefore, the numerical aperture by the lens condensing the laser may be usually about 0.1 to 1, preferably about 0.3 to 0.7. 上記範囲であれば、多数の細胞群について変異を引き起こすことができる程度のエネルギー密度が得られるため、形質転換体の取得効率が高くなる。 If the above-mentioned range, the energy density of an extent that can cause mutations for a number of cell groups can be obtained, the higher the efficiency of obtaining transformants.

レーザー発振のための媒質の種類は特に限定されず、液体および、固体レーザーで公知のレーザーを制限無く使用できる。 Type of medium for the laser oscillation is not particularly limited, a liquid and a known laser may be used without restriction in the solid laser.

本発明では、細胞群、すなわち複数の細胞に対してパルスレーザーを照射する。 In the present invention, irradiated cell population, i.e. a pulsed laser to a plurality of cells. これにより、照射された領域のうちいずれかの部分で、変異が導入された生存細胞が得られる。 Thus, in any part of the illuminated area, viable cells mutation has been introduced is obtained. 例えば、細菌や酵母であればコロニーに対して、コロニーの一部にレーザーが照射されるようにレンズ集光すればよい。 For example, with respect to colony if bacteria or yeast, may be a lens condensing as laser is irradiated to a portion of the colony. これにより、集光された中心部では細胞が死滅する確率が高いが、通常、集光部分の周縁部で変異が導入された生存細胞が得られる。 Thus, although a high probability of cell death is focused center usually is viable cells mutations were introduced at the periphery of the condensing portion is obtained. また、多細胞生物、例えば糸状菌ではその菌糸塊に対してその一部にレーザーが照射されるようにレンズ集光すればよい。 Further, multicellular organisms may be, for example, a lens condensing as a filamentous fungus laser part for the hypha masses are irradiated. これにより、通常、集光部分の周縁部で変異が導入された生存細胞が得られる。 Thus, typically, viable cells mutations were introduced at the periphery of the condensing portion is obtained. さらに、平板培地上に塗布された細胞層に対してレーザー照射することもできる。 Furthermore, it is also possible to laser irradiation on cell layer coated on a plate medium.

本明細書において、従来方法では変異を導入することが困難であった染色体上の位置としては、染色体の折りたたまれた高次構造の部分(非露出部分)が挙げられる。 In this specification, the conventional method as the position on the chromosome has been difficult to introduce mutations, the portion of the folded conformation of chromosomes (non-exposed portion) and the like. 例えば化学変異原物質で変異を導入する場合、当該変異原物質が細胞内の染色体のアクセス可能な部分のみに変異を起こさせる。 For example, when introducing a mutation in the chemical mutagen, the mutagen causes a mutation only accessible portion of chromosomes in the cell. また、紫外線などの光照射の場合、紫外線は細胞集団の表面部分には変異を導入するが、内部までは紫外線が到達しにくく、細胞内においても、表面に露出している部分のみに変異が導入され、しかも、紫外線により細胞が死滅する割合が高い。 Also, in the case of light irradiation such as ultraviolet rays, ultraviolet rays are on the surface portions of the cell population to introduce mutations, internal to the hard to reach UV, even in cells, mutations only in the portion exposed to the surface is introduced, moreover, the proportion of cell death is high by UV.

一方、本発明で使用するフェムト秒レーザーは、細胞集団の深部に到達可能な高い透過性を有し、染色体の非露出部分に有効に作用することができるので、従来法では変異の導入が困難であった染色体の(非露出)部分にも変異を導入でき、従来にない変異導入細胞を得ることができる。 On the other hand, the femtosecond laser used in the present invention has a deep in high permeability reachable cell populations, it is possible to effectively act in the non-exposed portion of the chromosome, difficult to introduce a mutation in the conventional method can introduce mutations in (unexposed) portions of the chromosome was, it is possible to obtain a mutated cells in the prior art. また、コロニーや細胞塊などの内部の細胞にも変異を導入できる。 In addition, we introduce a mutation in the interior of cells, such as colony or cell mass. したがって、細菌や真菌の場合、液体培地の培養物だけでなく、固形培地の培養物を標的とすることができ、効率的に変異を導入できる。 Therefore, in the case of bacteria and fungi, as well as culture broth, the culture of solid media can be targeted, can be introduced efficiently mutation. 例えばEMS(ethyl methanesulfonate)変異は対数増殖期に変異誘発率が最大になり、細胞増殖期の染色体複製のときに変異が導入されると考えられる。 For example EMS (ethyl methanesulfonate) mutation is maximized mutagenesis rate in logarithmic growth phase, believed to mutation at the chromosomal replication of the cell growth phase is introduced. フェムト秒レーザー変異処理に用いた細胞(例えば酵母)は、定常期の細胞や、各増殖フェーズの細胞が混在した状態であると考えられる。 Femtosecond laser mutation treatment were used for cell (e.g., yeast) is or stationary phase cells are considered to be state of the cells are mixed in the growth phase. よって、高次構造を形成している染色体にアタックし得る。 Thus, it can attack in the chromosome with which to form a higher-order structure.

レーザー照射は、コロニー、菌糸塊、細胞層などに対して走査しつつ行ってもよい。 Laser irradiation, colonies, hypha masses, may be performed while scanning with respect to such cell layers. これにより、多数の細胞に対して効率よく変異を導入することができる。 Thus, it is possible to introduce a high efficiency variants for a number of cells. この場合のレーザー照射時間は、各点における照射時間が前述した範囲になるようにすればよい。 Laser irradiation time in this case may be as the irradiation time at each point it is in the range mentioned above.

形質転換体の選択方法は、目的とする形質に応じて適宜選択すればよい。 Selection method of transformants may be appropriately selected depending on the trait of interest. レーザー照射した細胞群を、例えば抗生物質耐性や栄養要求性などの形質を選択できる培地に塗布し、培養することにより、目的とする形質を獲得した形質転換体を選択することができる。 The laser irradiation cell populations, for example a trait such as antibiotic resistance or auxotrophy was applied to a medium that can be selected by culturing, it is possible to select for transformants that have acquired the trait of interest.

目的とする形質は、特に限定されないが、従来の形質転換方法、特に変異処理方法では導入することが難しかった形質である、GABA高生産性、グリシン高生産性、アラニン高生産性、ロイシン高生産性、セリン高生産性、スレオニン高生産性、及びアスパラギン酸高生産性などが挙げられる。 Traits of interest include, but are not limited to, conventional transformation methods, a trait it is difficult to introduce a particular mutation treatment method, GABA high productivity, glycine high productivity, alanine high productivity, leucine high production sex, serine high productivity, threonine high productivity, and the like aspartic acid and high productivity. 高生産性とは、親株よりも生産量が増大したことをいう。 The high productivity, means that amount of production is increased than the parent strain. 目的とする形質は、1または複数導入することができる。 Trait of interest may be one or more introduction.

本発明方法の対象となる細胞の種類は特に限定されず、細菌、真菌、植物、動物などのどのような細胞であってもよい。 Subject to the type of cell of the present invention method is not particularly limited, bacteria, may be any cell, such as fungi, plants, animals. 中でも、真菌が好適である。 Among them, it is preferable fungus. 真菌では糸状菌でも酵母でも効率的に形質転換を行えるが、酵母がより好適である。 Although capable of efficiently transformed in yeast in filamentous fungi fungal, yeast is more preferred.
(II)サッカロマイセス属変異株 (II) Saccharomyces mutant strain
本発明の第1の変異株は、サッカロマイセス属に属し、乾燥菌体1g当たりのGABA生産量が0.8mg以上である新規変異株である。 The first mutant strain of the present invention belongs to the genus Saccharomyces, GABA production per dry cell 1g is a new mutant strain is at least 0.8 mg. GABA生産量は菌体内に生産されたもの、及び菌体外に生産されたものの双方の合計であるが、殆どは菌体内に蓄積される。 GABA production is one produced in the cells, and the sum of both those produced extracellularly, most are accumulated in the cells. このGABA高生産株の中には、乾燥菌体1g当たりのグリシン生産量が1mg以上である変異株も存在する。 This in GABA high producing strain are glycine production per dry cell 1g is also present mutant strain is at least 1 mg.

また本発明の第2の変異株は、サッカロマイセス属に属し、乾燥菌体1g当たりのグリシン生産量が1mg以上である新規変異株である。 The second mutant strain of the present invention belongs to the genus Saccharomyces, glycine production per dry cell 1g is a new mutant strain is at least 1 mg. グリシン生産量は菌体内に生産されたもの、及び菌体外に生産されたものの双方の合計であるが、殆どは菌体内に蓄積される。 Glycine production is one produced in the cells, and the sum of both those produced extracellularly, most are accumulated in the cells.

本発明の第1及び第2の変異株は、サッカロマイセス属微生物を平板培地上にコロニー状に生育させ、コロニーに対してその一部に集光されるようにフェムト秒レーザーを照射し、シクロヘキシミド耐性を指標に選択することにより得ることができる。 First and second mutant strain of the present invention, Saccharomyces microorganism grown into colonies on plate medium, by irradiating a femtosecond laser as is focused on a portion thereof with respect to the colonies, cycloheximide resistant it can be obtained by selecting an indicator.

この場合の、フェムト秒レーザーのパルス幅は100〜300fs程度、出力は1〜300mW程度、繰り返し周波数は100〜300Hz程度、開口数は0.3〜0.7程度、全照射時間は0.01〜10秒程度とすればよい。 In this case, by the pulse width about 100~300fs the femtosecond laser, the output is about 1~300MW, the repetition frequency of about 100 to 300 Hz, the numerical aperture is about 0.3 to 0.7, the total irradiation time is about 0.01 to 10 seconds Bayoi. また、選択培地中のシクロヘキシミド濃度は0.1〜10μg/ml程度とすればよい。 Moreover, cycloheximide concentration in the selection medium may be about 0.1-10 / ml.

実施例 Example
以下、本発明を実施例を示してより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 As described more fully below the present invention by showing Examples, the present invention is not limited thereto.
(1) シクロヘキシミド耐性形質転換体の作製における生存率の比較 (1) Comparison of survival rates in making cycloheximide-resistant transformants
実施例1 Example 1
<レーザー照射> <Laser irradiation>
YPD寒天培地に、コロニーが単一となるようにきょうかい7号酵母、きょうかい701号酵母、及び酵母G1103株(きょうかい701号酵母の1倍体株;月桂冠株式会社分離株)、をそれぞれ塗布し、直径1〜3mmのコロニーが形成されるまで、30℃で1〜2日間培養した。 In YPD agar medium, Association No. 7 yeasts such colonies is single, Association 701 No. yeast, and yeast G1103 strain (haploid strain of Association 701 No. yeast; laurel Ltd. isolates), respectively coated, until colonies diameter 1~3mm is formed, and cultured for 1-2 days at 30 ° C.. その中の一つのコロニーの周縁部の1点に、レーザー発信器(コヒーレント社製ReaA、発振の媒質はチタン‐サファイア)を用いて、対物レンズ×5を使用し、パルス幅200fsのフェムト秒レーザーを、パルス繰り返し周波数200KHz、出力100mW、開口数0.45として、全照射時間4秒間(オフ時間を含む)照射した。 At one point of the periphery of one of the colonies of them, the laser oscillator (manufactured by Coherent Inc. ReaA, oscillation medium titanium - sapphire) was used to use an objective lens × 5, femtosecond laser pulse width 200fs the pulse repetition frequency 200 KHz, output 100 mW, as a numerical aperture of 0.45, was irradiated total irradiation time 4 seconds (including off-time).
<形質転換体の選択> <Selection of transformants>
レーザー照射したコロニーの細胞全部を採取して滅菌水に懸濁し、1プレートあたり10 細胞となるように、シクロヘキシミド1ppmを含むYM寒天培地(1%グルコース、0.5%ペプトン、0.3%酵母エキス、0.3%麦芽エキス)に塗布し、30℃で2日間培養した。 Were taken all cells of colonies laser irradiation were suspended in sterilized water, so as to be 10 7 cells per plate, YM agar medium (1% glucose containing cycloheximide 1 ppm, 0.5% peptone, 0.3% yeast extract, 0.3 % was applied to the malt extract) and cultured for 2 days at 30 ° C..
生育したシクロヘキシミド耐性株の数を数え、塗布した細胞数に対する生育コロニー数の比率をシクロヘキシミド耐性株の生育率とした。 Counting the number of the grown cycloheximide-resistant strains, the ratio of the growth colony count for the applied number of cells was grown rate of cycloheximide-resistant strains.
<生存率の測定> <Measurement of survival>
レーザー照射したコロニーの細胞を全部を採取して滅菌水に懸濁したコロニー懸濁液を希釈し、1プレートあたり100細胞となるようにYPD培地(1%酵母エキス、2%ポリペプトン、2%グルコース、2%寒天)に塗布し、30℃で2日間培養し、生育したコロニー数を数えた。 Were taken all cells of colonies laser irradiation was diluted colonies suspension suspended in sterile water, YPD medium so that 100 cells per plate (1% yeast extract, 2% polypeptone, 2% glucose was applied to 2% agar), and cultured for 2 days at 30 ° C., it was counted colonies grown. 1プレートに塗布した細胞数に対する成育したコロニー数の比率を生存率とした。 The ratio by the number of colonies grown on cell number was applied to 1 plate was survival. 各株2系列で希釈及びYPD培地での生育を行い、生存率は平均値で表した。 Perform dilution and growth on YPD medium at each strain 2 sequences, viability was expressed as mean.

比較例1,2 Comparative Examples 1 and 2
実施例1においてレーザー照射により形質転換するのに代えて、エチルメタンスルホネート(EMS)処理(比較例1)、及びUV照射(比較例2)により変異を誘発した。 Instead of transforming the laser irradiation in Example 1, ethyl methanesulfonate (EMS) treatment (Comparative Example 1), and was mutagenized by UV irradiation (Comparative Example 2). これらの変異誘発は常法により行った。 These mutagenesis was performed by a conventional method. また、各変異処理は、生存率が実施例1のフェムト秒レーザー照射照射したときの生存率とほぼ同じになるような条件で行った。 Each mutation treatment was carried out under conditions such that substantially the same as the survival rate when viability is femtosecond laser irradiation irradiation of Example 1. また、生育率、及び生存率を実施例1と同様にして求めた。 Moreover, the growth rate and viability were determined in the same manner as in Example 1.
結果を以下の表1に示す。 The results shown in Table 1 below.

表1から分かるように、本発明の方法のみが、高生存率の条件下において、シクロヘキシミド耐性株を取得することができる。 As can be seen from Table 1, only the method of the present invention, under conditions of high viability, it is possible to obtain cycloheximide-resistant strains.

(2)変異パターンの検討 (2) study of the mutation pattern
実施例2 Example 2
実施例1で用いた酵母3株に対して、実施例1と同様にしてフェムト秒レーザーを照射した。 To yeast three strains used in Example 1 was irradiated with femtosecond laser in the same manner as in Example 1. レーザー照射したコロニーの細胞全部を採取して滅菌水に懸濁し、1プレートあたり10 細胞となるように、それぞれセルレニン含有培地、5-フルオロオロチン酸(5-FOA)含有培地、及びシクロヘキシミド含有培地に塗布し、30℃で2日間培養した。 Were taken all cells of colonies laser irradiation were suspended in sterilized water, 1 so that the 10 7 cells per plate respectively cerulenin-containing medium, 5-fluoroorotic acid (5-FOA) medium containing and cycloheximide-containing medium It was applied to, and cultured for 2 days at 30 ℃. 各培地の組成を以下に示す。 The composition of each medium is shown below.
セルレニン含有培地:25μM セルレニン(Sigma)、0.67重量%イーストナイトロジェンベース(w/oアミノ酸)、2重量%グルコース、2重量%寒天5-FOA含有培地:2重量%グルコース、0.67重量%イーストナイトロジェンベース(w/oアミノ酸)、0.005重量%ウラシル、0.1重量%5-FOA、2重量%寒天シクロヘキシミド含有培地:実施例1で使用したものと同様 各株について、シクロヘキシミド耐性株の生育率、5-FOA耐性株の生育率、及びセルレニン耐性株の生育率を求めた。 Cerulenin-containing medium: 25μM cerulenin (Sigma), 0.67% by weight of yeast nitrogen base (w / o amino acid), 2% by weight glucose, 2% agar medium containing 5-FOA: 2 weight% glucose, 0.67% by weight of yeast nitrogen base (w / o amino acids), 0.005 wt% uracil, 0.1 wt% 5-FOA, 2% by weight agar cycloheximide-containing medium: for each strain similar to that used in example 1, the growth rate of cycloheximide-resistant strains, 5- the growth rate of the FOA-resistant strains, and to determine the growth rate of cerulenin-resistant strains.

比較例3,4 Comparative Examples 3 and 4
比較例1と同様にして、但し生存率が10%となるような条件でEMS変異処理を行った(比較例3)。 In the same manner as in Comparative Example 1, except were EMS mutation treatment under the condition survival rate is 10% (Comparative Example 3). また、比較例2と同様にして、但し、生存率が10〜20%となるような条件でUV照射処理を行った。 Further, in the same manner as in Comparative Example 2, however, subjected to UV irradiation treatment under the condition survival rate is 10-20%. 実施例2と同様にして、それぞれセルレニン含有培地、5-FOA含有培地、及びシクロヘキシミド含有培地に塗布し、30℃で2日間培養し、生育率を求めた。 In the same manner as in Example 2, respectively cerulenin-containing medium, 5-FOA-containing medium, and was applied to cycloheximide-containing medium, and cultured for 2 days at 30 ° C., it was determined growth rate. 結果を以下の表2に示す。 The results shown in Table 2 below.

表2から、フェムト秒レーザー照射した場合は、変異パターンが、EMS処理した場合、及びUV照射した場合と異なることが分かる。 From Table 2, if you femtosecond laser irradiation, a mutation pattern, when EMS treatment, and different it can be seen the case of UV-irradiated. フェムト秒レーザーは、生存率を高く維持しながらシクロヘキシミド耐性酵母を効率よく取得できること、及び一倍体G1103株についてウラシル(5-FOA)要求性変異株を高頻度で取得できることが特徴である。 Femtosecond laser to cycloheximide resistant yeast efficiently can be obtained while maintaining a high survival rate, and it is characterized in that the haploid G1103 strain uracil (5-FOA) auxotrophs can be obtained at high frequency.

実施例3;GABA、グリシン高生産変異株の取得 Example 3; GABA, acquisition of glycine highly productive mutants
きょうかい701号酵母(サッカロマイセス・セレビシエ)に対して実施例1と同じ条件でフェムト秒レーザー照射し、シクロヘキシミド1ppmを含むYM寒天培地(1%グルコース、0.5%ペプトン、0.3%酵母エキス、0.3%麦芽エキス)に塗布し,30℃で3日間培養し、生育するコロニー23株(Lz1〜Lz23)をピックアップした。 Association 701 No. yeast (Saccharomyces cerevisiae) femtosecond laser irradiation under the same conditions as in Example 1 with respect to, YM agar medium (1% glucose containing cycloheximide 1 ppm, 0.5% peptone, 0.3% yeast extract, 0.3% malt was applied to extract) and cultured for 3 days at 30 ° C., picked up colonies 23 strain (Lz1~Lz23) growing. YPD培地で培養すると、生育した酵母に増殖の差が認められた。 When cultured in YPD medium, the difference in growth was observed in the growth yeast. 親株と比較して、増殖速度が低い株(例Lz1,Lz2)と増殖速度が高い株(Lz8,Lz10)とを取得した(図1)。 Compared to the parent strain, it was obtained and a low growth rate strains (eg Lz1, Lz2) and growth rate is high strain (LZ8, LZ10) (Figure 1).
親株より増殖速度が低い変異株Lz1株、及びLz2株を、YPD液体培地5mlで30℃一晩振盪培養し、集菌後、2回水洗した。 Growth rate than the parent strain is less mutant Lz1 strain, and Lz2 strain shaking cultured 30 ° C. overnight in YPD liquid medium 5 ml, cells were collected, washed twice with water. 洗浄した菌体を凍結乾燥し、その菌体の重量を測定した結果を後掲の表3に示す。 The washed cells were freeze-dried, shown in Table 3 given later the results of the measurement of the weight of the cells.

凍結乾燥した菌体に水1mlを添加しサーモミキサー(エッペンドルフ)で40℃で1時間撹拌後、メタノール1mlを添加し40℃で1時間撹拌した。 After stirring for 1 hour at 40 ° C. in water was added 1ml of cells lyophilized thermomixer (Eppendorf), and stirred for 1 hour at methanol was added 1ml 40 ° C.. 遠心後、抽出液を10倍希釈し、アミノ酸分析計(L−8800形高速アミノ酸分析計;日立)に供した。 After centrifugation, the extract was diluted 10-fold, an amino acid analyzer; was subjected to (L-8800 form fast amino acid analyzer of Hitachi).
アミノ酸分析計の測定値を、乾燥菌体あたりに換算した結果を後掲の表3に示す。 The measurement of amino acid analyzer shows the results in terms of per dried cells Table 3 given later. その結果、フェムト秒レーザー変異処理をした酵母は、グリシン、GABA、アラニン、ロイシン、セリン、スレオニン、アスパラギン酸を親株よりも多く蓄積していた。 As a result, yeast femtosecond laser mutation treatment, glycine, GABA, alanine, leucine, serine, threonine, had accumulated more than the parent strain aspartate. 特に、グリシン、及びGABAの蓄積量が多かった。 In particular, the accumulation amount of glycine and GABA was often.

実施例4(酵母の特性) Example 4 (characteristic of the yeast)
実施例3で得た変異株Lz1〜Lz23についてパントテン酸要求性を調べた。 It was examined auxotrophic for pantothenic acid for mutant Lz1~Lz23 obtained in Example 3.
まず、β−アラニン含有培地での生育を調べるために、β−アラニン含有培地(20gグルコース、0.5g(NH 4 ) 2 SO 4 、1.5gKH 2 PO 4 、0.5gMgSO 4・7H 2 O、200μgチアミン、200μgピリドキシン、200μgニコチン酸,1mgイノシトール、0.2μgビオチン、200μgアミノ安息香酸、40μg β−アラニン、1L 蒸留水pH5.0)に2%寒天を含む寒天培地に、各菌株を塗布し、それぞれ30℃、及び35℃で培養した。 First, in order to examine the growth in beta-alanine containing medium, beta-alanine containing medium (20 g of glucose, 0.5g (NH 4) 2 SO 4, 1.5gKH 2 PO 4, 0.5gMgSO 4 · 7H 2 O, 200μg Thiamine , 200 [mu] g pyridoxine, 200 [mu] g nicotinic acid, 1 mg inositol, 0.2 [mu] g biotin, 200 [mu] g-aminobenzoic acid, 40 [mu] g beta-alanine, an agar medium containing 2% agar in 1L of distilled water pH 5.0), was applied to each strain, respectively 30 ° C., and were cultured at 35 ° C..

また、パントテン酸要求性を調べるために、パントテン酸含有培地(20gグルコース、0.5g(NH 4 ) 2 SO 4 、1.5gKH 2 PO 4 、0.5gMgSO 4・7H 2 O、200μgチアミン、200μgピリドキシン、200μgニコチン酸,1mgイノシトール、0.2μgビオチン、200μgアミノ安息香酸、200μgパントテン酸カルシウム、1L蒸留水 pH5.0)に2%寒天を含む寒天培地に、各菌株を塗布し、それぞれ30℃、及び35℃で培養した。 Further, in order to examine auxotrophic for pantothenic acid, pantothenic acid-containing medium (20 g of glucose, 0.5g (NH 4) 2 SO 4, 1.5gKH 2 PO 4, 0.5gMgSO 4 · 7H 2 O, 200μg thiamine, 200 [mu] g pyridoxine, 200 [mu] g nicotinic acid, 1 mg inositol, 0.2 [mu] g biotin, 200 [mu] g-aminobenzoic acid, calcium 200 [mu] g pantothenic acid, on an agar medium containing 2% agar in 1L of distilled water pH 5.0), and each strain was applied, respectively 30 ° C., and 35 ° C. in the culture.
各培地での生育結果を後掲の表4に示す。 Shown in Table 4 given later growth results in each medium.

また、親株であるきょうかい701号酵母は35℃の高温では、パントテン酸を含まないβ−アラニン含有培地に生育できず、パントテン酸含有培地には生育することから、パントテン酸要求性の特性を有している。 Further, the high temperature of Association 701 No. yeast parent strain 35 ° C., can not grow in β- alanine containing medium without pantothenic acid, since growing in pantothenic acid-containing medium, the pantothenic acid required properties It has. また、きょうかい701号酵母にフェムト秒レーザー照射して得られた変異株Lz1〜Lz23も、35℃においてパントテン酸要求性を示したことから、パントテン酸要求性については親株と同じ性質を有していた。 Further, mutant strains Lz1~Lz23 obtained by femtosecond laser irradiation Association 701 No. yeast also because it showed auxotrophic for pantothenic acid at 35 ° C., has the same properties as the parent strain for pantothenic acid auxotrophy which was.

実施例5(アルコール生産性) Example 5 (Alcohol productivity)
実施例3で取得したLz1〜Lz23株と親株きょうかい701号酵母とを、5mlのYPD培地中で30℃で一晩振盪培養し,前培養とした。 A Lz1~Lz23 strain and the parent strain Association 701 No. yeast obtained in Example 3, overnight shaking culture at 30 ° C. in YPD medium 5 ml, was pre-cultured. 前培養液を、2×10 6 cells/mlとなるようにYPD10培地(10%グルコース、2%ポリペプトン、1%酵母エキス)10mlに植菌し、15℃静置で3日間培養し、発酵試験を行った。 Preculture, 2 × 10 6 cells / ml and made as YPD10 medium (10% glucose, 2% polypeptone, 1% yeast extract) was inoculated into 10 ml, and cultured for 3 days in static 15 ° C., fermentation test It was carried out.

培養上清のアルコールをGC分析により測定した。 The alcohol of the culture supernatant was measured by GC analysis. 結果を以下の表5に示す。 The results shown in Table 5 below.
<アルコール測定方法:GC分析条件> <Alcohol measurement method: GC analysis conditions>
使用機器;GC-9A shimadzu Used equipment; GC-9A shimadzu
分析条件;カラムGaskuropak54 Analytical conditions; Column Gaskuropak54
Column Temp. 180℃,INJ.Temp. Column Temp. 180 ℃, INJ.Temp. 250℃ 250 ℃
N 2流速;60ml/min N 2 flow rate; 60 ml / min
検出器;60ml/min Detector; 60 ml / min

GABA高生産性を示す株はYPD培地系での発酵試験において、親株よりも、アルコール生産が低い特徴があることが分かる(Lz1,Lz2,Lz3,Lz4,Lz5,Lz6,Lz7,Lz9,Lz10,Lz11,Lz12,Lz13,Lz14,Lz15,Lz20,)。 In the fermentation test in strains YPD medium system showing the GABA high productivity, than the parent strain, it can be seen that there is a low characteristic alcohol production (Lz1, Lz2, Lz3, Lz4, Lz5, Lz6, Lz7, Lz9, Lz10, Lz11, Lz12, Lz13, Lz14, Lz15, Lz20,). 一方、GABA高生産性を示さない株は、親株よりもエタノール生産性が高い特徴があることが分かる(Lz8, Lz16, Lz17, Lz18, Lz19, Lz21,Lz22,Lz23)。 Meanwhile, strains which do not exhibit GABA high productivity, it can be seen that there is a characteristic high ethanol productivity than the parent strain (Lz8, Lz16, Lz17, Lz18, Lz19, Lz21, Lz22, Lz23).

実施例6(きょうかい701号酵母株及びその変異株を用いた清酒製造) Example 6 (Sake production using the association 701 No. yeast strain and its mutants)
総米40g、麹歩合を総米に対して21容量%、汲み水を総米に対して140重量%の仕込み配合として、仕込み試験を行った。 Total rice 40 g, 21% by volume based on the total rice koji ratio, the pumped water as 140% by weight of the feed blend to the total rice were charged test.

きょうかい701号酵母、及びL1〜L3株をYPD培地を用いて30℃で1日間振盪培養し、2回水洗を行い仕込み用の酵母菌体とした。 Association 701 No. yeast, and shaken for 1 day incubation at 30 ° C. using a YPD medium L1~L3 strain was yeast cells for charging performed twice with water. 各仕込みで、1×10 cells/mlとなるように、上記仕込み用酵母菌体を添加した。 Each charge, so that 1 × 10 7 cells / ml, were added to the charge for the yeast cell. 温度を15℃一定にして20日間の仕込みを行った。 And the temperature to 15 ℃ constant was charged of 20 days.
上槽(仕込みの終わったもろみを遠心分離機を用いて3000gで15分間遠心して固体部と液体部に分離する操作)後、液体部である上槽酒についての一般分析(アミノ酸、総酸)を、国税庁所定分析法に従い行った。 Upper tank after (operating the mash was over the charge separating the centrifugation a solid portion and a liquid portion for 15 min at 3000g using a centrifuge), the general analysis of the upper tank liquor is a liquid portion (amino acids, the total acid) It was performed in accordance with the Internal Revenue Service analysis method. また、上槽酒中のアルコール濃度は実施例5と同じ方法で測定した。 Moreover, the alcohol concentration in the upper tank liquor was measured in the same manner as in Example 5. 結果を後掲の表6に示す。 The results shown in Table 6 given later and.

さらに、上槽酒中のアミノ酸を実施例3と同様にしてアミノ酸分析計を用いて測定した。 Furthermore, it was determined using an amino acid analyzer and the amino acids in the upper tank liquor in the same manner as in Example 3. さらに酒粕中のアミノ酸測定は次のようにして行った。 In addition amino acid measurement in lees it was carried out as follows. 酒粕を凍結乾燥で一晩乾燥した後、酒粕5mgに加水分解用液 200μl(濃塩酸:トリフルオロ酢酸=2:1溶液中に0.05%フェノールを含有)を添加し、165℃、1時間加水分解した。 After drying overnight in a freeze dried sake cake, liquid for hydrolysis lees 5 mg 200 [mu] l was added (concentrated hydrochloric acid: trifluoroacetic acid = 2 containing 0.05% phenol 1 solution), 165 ° C., 1 hour It was hydrolyzed. 減圧により塩酸を除去し、0.02N 塩酸で溶解した後、実施例3と同様にしてアミノ酸分析計を用いて測定した。 Vacuum was removed by hydrochloric acid, it was dissolved in 0.02N hydrochloric acid was measured using an amino acid analyzer in the same manner as in Example 3. それらの結果をそれぞれ後掲の表7、表8に示す。 Table 7 supra after their results are shown in Table 8.

本発明方法により得た変異株を用いることにより、GABA含量の高い清酒、及び酒粕が得られた。 By using the mutant strain obtained by the method of the present invention, a high GABA content sake, and sake cake was obtained. また、変異株を用いた仕込みのアミノ酸量も親株使用の場合より多かった。 In addition, amino acid amount of the charge using a mutant strain also was greater than the case of the parent strain used.

レーザー変異処理した酵母の生育 Growth of laser mutation treated yeast

Claims (19)

  1. 非線形光学効果を有するパルスレーザーを細胞に照射することを特徴とする、染色体遺伝子にランダム変異を導入する方法。 How a pulsed laser having a nonlinear optical effect and irradiating the cell, introducing a random mutation into the chromosomal gene.
  2. 染色体遺伝子の非露出部分にランダム変異を導入することを特徴とする、請求項1に記載の方法。 And introducing random mutations in the non-exposed portion of the chromosomal gene, The method of claim 1.
  3. 非線形光学効果を有するパルスレーザーを細胞に照射する第1工程と、目的とする形質を有する細胞を選択する第2工程とを備える、形質転換体の製造方法。 The first comprises a step, a second step of selecting cells having the trait of interest, method for producing a transformant, which irradiates a pulsed laser having a nonlinear optical effect in the cells.
  4. 非線形光学効果を有するパルスレーザーがフェムト秒オーダーのパルス幅を有するパルスレーザーである、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。 Pulsed laser with a nonlinear optical effect is a pulsed laser having a pulse width in the order of femtoseconds, The method according to any one of claims 1 to 3.
  5. レーザーの出力を100μW〜800mWとする請求項1〜4のいずれかに記載の方法。 The method according to any one of claims 1 to 4 100μW~800mW the output of the laser.
  6. パルスレーザーの繰り返し周波数を1kHz〜100MHzとする請求項1〜5のいずれかに記載の方法。 The method according to any one of claims 1 to 5, the repetition frequency of the pulsed laser and 1 kHz to 100 MHz.
  7. パルスレーザー集光レンズの開口数を0.1〜1.5とする請求項1〜6のいずれかに記載の方法。 The method according to claim 1, the numerical aperture of the pulsed laser condensing lens is 0.1 to 1.5.
  8. パルスレーザーの全照射時間を0.001〜10秒とする請求項1〜4のいずれかに記載の方法。 The method according to claim 1, the total irradiation time of the pulsed laser to 0.001 seconds.
  9. 第1工程において、パルスレーザーを間歇的に照射する請求項3〜8のいずれかに記載の方法。 In the first step, the method according to any one of claims 3-8 for intermittently applying a pulse laser.
  10. 目的とする形質が、γ−アミノ酪酸高生産性、グリシン高生産性、アラニン高生産性、ロイシン高生産性、セリン高生産性、スレオニン高生産性、及びアスパラギン酸高生産性からなる群より選ばれる少なくとも1種の形質である請求項1〜9のいずれかに記載の方法。 Trait of interest is, .gamma.-aminobutyric acid and high productivity, glycine high productivity, alanine high productivity, leucine high productivity, serine high productivity, threonine high productivity, and selected from the group consisting of aspartic acid and high productivity at least one trait method according to any one of claims 1 to 9 is to be.
  11. 前記細胞が細菌または真菌である請求項1〜10のいずれかに記載の方法。 The method according to any one of claims 1 to 10 wherein said cell is a bacterium or a fungus.
  12. 真菌が酵母または糸状菌である請求項11に記載の方法。 The method of claim 11 fungus is a yeast or filamentous fungi.
  13. サッカロマイセス属に属し、乾燥菌体1g当たりのγ−アミノ酪酸生産量が0.8mg以上である新規変異株。 Belonging to the genus Saccharomyces, the new mutant strain γ- aminobutyric acid production per dry cell 1g is not less than 0.8 mg.
  14. 乾燥菌体1g当たりのグリシン生産量が1mg以上である請求項10に記載の変異株。 Mutants glycine production per dry cell 1g is claimed in claim 10 is at least 1 mg.
  15. フェムト秒オーダーのパルス幅を有するパルスレーザーをサッカロマイセス属細胞群に照射し、シクロヘキシミド耐性を獲得した細胞を選択することにより得られるものである、請求項13又は14に記載の変異株。 A pulsed laser having a pulse width in the order of femtoseconds is irradiated to the genus Saccharomyces cell population, is obtained by selecting cells that have acquired resistance to cycloheximide, mutant strain according to claim 13 or 14.
  16. サッカロマイセス属に属し、乾燥菌体1g当たりのグリシン生産量が1mg以上である新規変異株。 Belonging to the genus Saccharomyces, the new mutant strain glycine production per dry cell 1g is greater than or equal to 1 mg.
  17. フェムト秒オーダーのパルス幅を有するパルスレーザーをサッカロマイセス属細胞群に照射し、シクロヘキシミド耐性を獲得した細胞を選択することにより得られるものである、請求項16に記載の変異株。 A pulsed laser having a pulse width in the order of femtoseconds is irradiated to the genus Saccharomyces cell population, it is obtained by selecting cells that have acquired resistance to cycloheximide, mutant strain of claim 16.
  18. 新規変異株が、サッカロマイセス・セレビシエK701−Lz1株(FERM P−21058)である請求項10〜14のいずれかに記載の変異株。 New mutants, mutant strain according to any one of claims 10 to 14 which is Saccharomyces cerevisiae K701-Lz1 strain (FERM P-21058).
  19. 米麹上で酵母を生育させることにより清酒を製造する方法において、酵母として、請求項13〜18のいずれかに記載の変異株を用いる方法。 A method of producing sake by growing yeast on rice koji, a method of using a yeast, a mutant strain of any of claims 13 to 18.
JP2006346522A 2006-12-22 2006-12-22 Method for producing transformant and new mutant of yeast Pending JP2008154497A (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2006346522A JP2008154497A (en) 2006-12-22 2006-12-22 Method for producing transformant and new mutant of yeast

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2006346522A JP2008154497A (en) 2006-12-22 2006-12-22 Method for producing transformant and new mutant of yeast

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2008154497A true true JP2008154497A (en) 2008-07-10

Family

ID=39656083

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2006346522A Pending JP2008154497A (en) 2006-12-22 2006-12-22 Method for producing transformant and new mutant of yeast

Country Status (1)

Country Link
JP (1) JP2008154497A (en)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH09238650A (en) * 1996-03-07 1997-09-16 Hokkaido Togyo Kk Food material containing large amount of gamma-aminobutyric acid and production of the same
JP2001136962A (en) * 1999-11-12 2001-05-22 Japan Science & Technology Corp Method for controlling local gene expression
JP2001299377A (en) * 2000-04-28 2001-10-30 Asahi Kasei Corp Method of microbiological production for glycine
JP2006141251A (en) * 2004-11-17 2006-06-08 Nichirei Foods:Kk METHOD FOR PRODUCING FOOD CONTAINING γ-AMINOBUTYRIC ACID AND YEAST HAVING HIGH γ-AMINOBUTYRIC ACID PRODUCING ABILITY
JP2006204259A (en) * 2005-01-31 2006-08-10 Nichirei Foods:Kk FERMENTED ACEROLA PRODUCT CONTAINING LARGE AMOUNT OF γ-AMINOBUTYRIC ACID AND METHOD FOR PRODUCING THE SAME
WO2006110891A2 (en) * 2005-04-12 2006-10-19 E. I. Du Pont De Nemours And Company Treatment of biomass to obtain a target chemical

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH09238650A (en) * 1996-03-07 1997-09-16 Hokkaido Togyo Kk Food material containing large amount of gamma-aminobutyric acid and production of the same
JP2001136962A (en) * 1999-11-12 2001-05-22 Japan Science & Technology Corp Method for controlling local gene expression
JP2001299377A (en) * 2000-04-28 2001-10-30 Asahi Kasei Corp Method of microbiological production for glycine
JP2006141251A (en) * 2004-11-17 2006-06-08 Nichirei Foods:Kk METHOD FOR PRODUCING FOOD CONTAINING γ-AMINOBUTYRIC ACID AND YEAST HAVING HIGH γ-AMINOBUTYRIC ACID PRODUCING ABILITY
JP2006204259A (en) * 2005-01-31 2006-08-10 Nichirei Foods:Kk FERMENTED ACEROLA PRODUCT CONTAINING LARGE AMOUNT OF γ-AMINOBUTYRIC ACID AND METHOD FOR PRODUCING THE SAME
WO2006110891A2 (en) * 2005-04-12 2006-10-19 E. I. Du Pont De Nemours And Company Treatment of biomass to obtain a target chemical

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Finogenova et al. Organic acid production by the yeast Yarrowia lipolytica: a review of prospects
Spencer et al. Genetic improvement of industrial yeasts
US5232842A (en) Method for preparing chitosan
Silar Peroxide accumulation and cell death in filamentous fungi induced by contact with a contestant
Hou Improved production of ethanol by novel genome shuffling in Saccharomyces cerevisiae
Weikert et al. Use of a glycerol-limited, long-term chemostat for isolation of Escherichia coli mutants with improved physiological properties
Meleigy et al. Biosynthesis of gibberellic acid from milk permeate in repeated batch operation by a mutant Fusarium moniliforme cells immobilized on loofa sponge
Hou Novel methods of genome shuffling in Saccharomyces cerevisiae
Rywińska et al. Comparison of citric acid production from glycerol and glucose by different strains of Yarrowia lipolytica
Javadekar et al. Industrial yeast strain improvement: construction of a highly flocculent yeast with a killer character by protoplast fusion
Zhao et al. Screening and breeding of high taxol producing fungi by genome shuffling
CN101173240A (en) Method for producing D-lactic acid and brood-cell lactobacillus special for the same
US5231007A (en) Efficient riboflavin production with yeast
CN101690463A (en) Mutagenic strain of cordyceps militaris and breeding method
Shah et al. Method to immobilize the aphid-pathogenic fungus Erynia neoaphidis in an alginate matrix for biocontrol
Wang et al. Lactic acid production from kitchen waste with a newly characterized strain of Lactobacillus plantarum
Mahalaxmi et al. Corn husk as a novel substrate for the production of rifamycin B by isolated Amycolatopsis sp. RSP 3 under SSF
WO1991018994A1 (en) Hyperproduction of poly-hydroxyalkanoates during exponential growth by mutant strains of azotobacter vinelandii
Su et al. Mutation breeding of chitosanase-producing strain Bacillus sp. S65 by low-energy ion implantation
Yang et al. Production of erythritol from glucose by an osmophilic mutant of Candida magnoliae
Vallini et al. Candida aquaetextoris sp. nov., a new species of yeast occurring in sludge from a textile industry wastewater treatment plant in Tuscany, Italy
JP2006042774A (en) New yeast of yarrowia and method for biologically treating waste water
JPH09313169A (en) Production of yeast extract
Kapsopoulou et al. Growth and fermentation characteristics of a strain of the wine yeast Kluyveromyces thermotolerans isolated in Greece
Gu et al. A novel approach to microbial breeding—low-energy ion implantation

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20090821

A711 Notification of change in applicant

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711

Effective date: 20090918

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20090918

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20120306

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20120626