JP2008099700A - Method of forming stable complex of transcription product of dna encoding arbitrary peptide with translation product, nucleic acid construct to be used in the method, complex formed by the method, and screening of functional protein and mrna or dna encoding the protein using the method - Google Patents

Method of forming stable complex of transcription product of dna encoding arbitrary peptide with translation product, nucleic acid construct to be used in the method, complex formed by the method, and screening of functional protein and mrna or dna encoding the protein using the method Download PDF

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Inventor
Satoshi Fujita
Kazumasa Tahira
Masaki Warashina
Shinya Yoshizaki
愼矢 吉崎
和誠 多比良
雅岐 藁科
聡史 藤田
Original Assignee
National Institute Of Advanced Industrial & Technology
独立行政法人産業技術総合研究所
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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for screening functional proteins from a group of amino acid random sequences without limiting diversity of the sequences. <P>SOLUTION: A method, by which a stable linkage between a genotype and a phenotype in a cell-free system is successfully achieved by using interaction between an RNA-binding protein and RNA, interaction between a DNA-binding protein and DNA, or a protein that inactivates a ribosome, is provided. Furthermore, a method for screening functional proteins by using the stable linkage is provided, and nucleic acid construct usable for the stable linkage is provided. <P>COPYRIGHT: (C)2008,JPO&INPIT

Description

本発明は、任意のポリペプチドをコードするDNAの転写産物と翻訳産物との複合体を形成させる方法、該方法に用いる核酸構築物、該方法により形成される複合体、並びに該方法を利用した機能性タンパク質および該タンパク質をコードするmRNAまたはDNAのスクリーニングに関する。 The present invention relates to a method of forming a complex with any transcript of DNA encoding a polypeptide translation product, the nucleic acid construct used in the method, the complex formed by the method, as well as function using the method of screening for mRNA or DNA encoding the sex protein and the protein.

一群のアミノ酸のランダムな配列から機能性タンパク質を選択および同定する方法は、近年その重要性が高まっている。 How to select and identify functional proteins from random sequences of the group of amino acids, its importance is increasing in recent years. ファージディスプレイ法やツーハイブリッド法などのような特定の機能性タンパク質の選択に有効なスクリーニング系の多くは、生細胞を利用する(Fields, S. 他 Nature 1989, 340, 245-246(非特許文献1). Harada, K. 他 Nature 1996, 380, 175-179(非特許文献2). Moore, JC 他 Nature Biotech. 1996, 14, 458-467(非特許文献3). Schatz, PJ 他 Methods Enzymol. 1996, 267, 171-191(非特許文献4). Boder, ET他 Nature Biotech. 1997, 15, 553-557(非特許文献5). Smith, GP 他 Chem, Rev. 1997, 97, 391-410(非特許文献6).)。 Many effective screening system to select a particular functional proteins, such as phage display and two-hybrid utilizes living cells (NFL Fields, S. other Nature 1989, 340, 245-246 (Non-Patent Documents 1). Harada, K. other Nature 1996, 380, 175-179 (non-Patent Document 2). Moore, JC other Nature Biotech. 1996, 14, 458-467 (non-patent document 3). Schatz, PJ other Methods Enzymol . 1996, 267, 171-191 (non-patent document 4). Boder, ET other Nature Biotech. 1997, 15, 553-557 (non-patent document 5). Smith, GP other Chem, Rev. 1997, 97, 391- 410 (non-Patent Document 6).). このような選択系においては、選択したタンパク質(表現型)をコードする配列情報(遺伝子型)は、適切な表現型を提示する各細胞に導入されたDNAから決定される。 In such selection systems, sequence information encoding the protein (phenotype) selection (genotype) is determined from the DNA introduced into the cells presenting the appropriate phenotype. 遺伝子型と表現型の連結は、ランダムな配列から機能性タンパク質を選択する際における一つの重要な決定因子である。 Coupling genotype and phenotype is an important determinant in choosing a functional protein from a random sequence.

しかし、このような方法が生細胞に依存する限り、配列ライブラリーの多様性には限界がある。 However, as long as such method is dependent on living cells, the diversity of the sequence library is limited. 例えば、トランスフェクションの効率が低いこと、提示されるタンパク質のサイズに限界があること、並びに、細胞に対して有害なタンパク質の選択は不可能であるために対象となるタンパク質の性質に制限があることを理由として、ライブラリーの多様性に限界が生じる。 For example, it transfection efficiency is low, that the size of the protein to be presented is limited, as well, there is a restriction on the nature of the protein of interest for the selection of detrimental protein is impossible to cells the grounds that limit occurs in the diversity of the library.

これらの問題を克服するために、無細胞系でタンパク質を選択するためのいくつかの方法が開発されている(Mattheakis, LC 他 Proc. Natl, Acad. Sci. USA 1994, 91, 9022-9026(非特許文献7). Mattheakis, LC 他 Methods Enzymol. 1996, 267, 195-207(非特許文献8). Hanes, J. 他 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94, 4937-4942(非特許文献9). He, M. 他 Nuclelic Acids Res. 1997, 25, 5132-5134(非特許文献10). Nemoto, N. 他 FEES Lett. 1997, 414, 405-408(非特許文献11). Roberts, RW 他 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94, 12297-12302(非特許文献12). Hanes, J. 他 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998, 95, 14130-14135(非特許文献13). Tawfik, DS 他 Nature Biotech. 1998, 16, 652-656(非特許文献14). Doi, N. 他 FEBS Lett. 1999, 457, 227-230(非特許文献15). Hanes, J. 他 FEES Lett. 1999, 450, 105-110(非特許文献16). Makeyev, EV 他 FEBS Lett. 1999, 444, 177-180(非特許文献17). He, M. 他 J. To overcome these problems, several methods for selecting proteins in a cell-free system has been developed (Mattheakis, LC others Proc. Natl, Acad. Sci. USA 1994, 91, 9022-9026 ( non-Patent Document 7). Mattheakis, LC others Methods Enzymol. 1996, 267, 195-207 (non-Patent Document 8). Hanes, J. other Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94, 4937-4942 (non Patent Document 9). the He, M. other Nuclelic Acids Res. 1997, 25, 5132-5134 (non-Patent Document 10). Nemoto, N. other FEES Lett. 1997, 414, 405-408 (non-Patent Document 11). roberts, RW other Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94, 12297-12302 (non-patent document 12). Hanes, J. other Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998, 95, 14130-14135 (non Patent Document 13). Tawfik, DS other Nature Biotech. 1998, 16, 652-656 (non-Patent Document 14). Doi, N. other FEBS Lett. 1999, 457, 227-230 (non-Patent Document 15). Hanes, J. other FEES Lett. 1999, 450, 105-110 (non-Patent Document 16). Makeyev, EV other FEBS Lett. 1999, 444, 177-180 (non-Patent Document 17). He, M. other J. Immunol. Methods 1999, 231, 105-117(非特許文献18). Schaffitzel, C. 他 J. Immunol. Methods 1999, 231, 119-135(非特許文献19). Hanes, J. 他 Nat. Biotechnol. 2000, 18, 1287-1292(非特許文献20). Hanes, J. 他 Methods Enzymol. 2000, 328, 404-430(非特許文献21).)。 Immunol. Methods 1999, 231, 105-117 (Non-Patent Document 18). Schaffitzel, C. Other J. Immunol. Methods 1999, 231, 119-135 (Non-Patent Document 19). Hanes, J. Other Nat. Biotechnol. 2000, 18, 1287-1292 (non-Patent Document 20). Hanes, J. other Methods Enzymol. 2000, 328, 404-430 (non-Patent Document 21).).
具体的には、リボゾームディスプレイ法、タンパク質-mRNA共有結合融合法、およびミセル法などが挙げられる。 Specifically, ribosome display methods, protein -mRNA covalent fusion method, and micelle method and the like. しかし、現在利用可能な無細胞系は、多様性を減縮させる操作を含むので、一般的には実用化が困難である。 However, now a cell-free system available, because it contains an operation for Genchijimi diversity is generally a practical difficulties.

例えば、リボゾームディスプレイ法においては、翻訳されたタンパク質とそのタンパク質をコードするmRNAとの比較的安定な複合体が、リボゾームにより形成される。 For example, in a ribosome display method, a relatively stable complex translated as proteins and mRNA encoding the protein is formed by ribosomes. これは、終止コドンの欠失により複合体からのタンパク質の遊離が遅くなるためである。 This, by deletion of the stop codon is because free protein slows from the complex. このような条件下では、終結因子はリボゾーム複合体からのタンパク質の遊離を効率よく誘導できない。 Under such conditions, release factors can not induce efficiently free protein from the ribosome complex. しかしながら、この方法では、タンパク質の選択の可否は該複合体の半減期に依存するため(終止コドンの欠損下でのタンパク質の遊離は、限界的な程度まで遅れるだけである)、選択を短時間で終了しなければならない。 However, in this method, whether the protein of the selection is dependent on the half-life of the complex (free of proteins deficient under stop codon is only delayed until the marginal extent), a short time selection in must be terminated. 実際、完全な状態のmRNA-リボゾーム-タンパク質複合体の維持は容易ではない。 In fact, intact mRNA- ribosome - maintaining protein complex is not easy.

大腸菌を用いたリボソームディスプレイは、例えば、Jermutus L, et al. Tailoring in vitro evolution for protein affinity or stability. Proc Natl Acad Sci US A. 2001 Jan 2;98(1):75-80(非特許文献22);Hanes J, et al. Picomolar affinity antibodies from a fully synthetic naive library selected and evolved by ribosome display. Nat Biotechnol. 2000 Dec;18(12):1287-92(非特許文献20);Hanes J, et al. Selecting and evolving functional proteins in vitro by ribosome display. Methods Enzymol. 2000;328:404-30(非特許文献21);及びSchaffitzel C, et al. Ribosome display: an in vitro method for selection and evolution of antibodies from libraries. J Immunol Methods. 1999 Dec 10;231(1-2):119-35(非特許文献19)に記載されており、ウサギ網状赤血球系を用いたリボソームディスプレイは、例えば、He M, et al. Selection of a human anti-progesterone antibody fragment from a transgenic mouse library by ARM ribosome display. The ribosome display using Escherichia coli, for example, Jermutus L, et al Tailoring in vitro evolution for protein affinity or stability Proc Natl Acad Sci US A. 2001 Jan 2; 98 (1):.. 75-80 (Non-Patent Document 22 ..); Hanes J, et al Picomolar affinity antibodies from a fully synthetic naive library selected and evolved by ribosome display Nat Biotechnol 2000 Dec; 18 (12):. 1287-92 (non-Patent Document 20); Hanes J, et al .. Selecting and evolving functional proteins in vitro by ribosome display Methods Enzymol 2000; 328:.. 404-30 (non-Patent Document 21); and Schaffitzel C, et al Ribosome display: an in vitro method for selection and evolution of antibodies from . libraries J Immunol Methods 1999 Dec 10; 231 (1-2):. 119-35 is described in (non-patent Document 19), ribosome display using rabbit reticulocyte system is, for example, the He M, et al . Selection of a human anti-progesterone antibody fragment from a transgenic mouse library by ARM ribosome display. J Immunol Methods. 1999 Dec 10;231(1-2):105-17(非特許文献18);及びBieberich E, et al. Protein-ribosome-mRNA display: affinity isolation of enzyme-ribosome-mRNA complexes and cDNA cloning in a single-tube reaction. Anal Biochem. 2000 Dec 15;287(2):294-8(非特許文献23)に記載されており、小麦胚芽系を用いたリボソームディスプレイは、Gersuk GM, et al. High-affinity peptide ligands to prostate-specific antigen identified by polysome selection. Biochem Biophys Res Commun. 1997 Mar 17;232(2):578-82(非特許文献24)に記載がある。 J Immunol Methods 1999 Dec 10; 231 (1-2):.. 105-17 (Non-patent Reference 18); and Bieberich E, et al Protein-ribosome-mRNA display: affinity isolation of enzyme-ribosome-mRNA complexes and cDNA .. cloning in a single-tube reaction Anal Biochem 2000 Dec 15; 287 (2): 294-8 is described in (non-patent Document 23), ribosome display using wheat germ system, Gersuk GM, et al ... High-affinity peptide ligands to prostate-specific antigen identified by polysome selection Biochem Biophys Res Commun 1997 Mar 17; 232 (2): is described in 578-82 (non-patent Document 24).

タンパク質-mRNA共有結合融合法では、翻訳されたタンパク質は、3'末端がピューロマイシン(puromycin)で標識されている各mRNAと共有結合する。 The protein -mRNA covalent fusion, translated protein, 3 'end is covalently linked with each mRNA are labeled with puromycin (puromycin). この方法には、通常、mRNAにピューロマイシンを結合させるための化学合成が必要であるが、この工程により利用可能なライブラリーのサイズが減少する。 The method usually mRNA is necessary chemical synthesis for coupling puromycin, the size of the available library is reduced by this process. タンパク質-mRNA共有結合融合法に関する文献としては、Keefe AD, et al. Functional proteins from a random-sequence library. Nature. 2001 Apr 5;410(6829):715-8(非特許文献25); Wilson DS, et al. The use of mRNA display to select high-affinity protein-binding peptides. Proc Natl Acad Sci US A. 2001 Mar 27;98(7):3750-5(非特許文献26); Liu R, et al. Optimized synthesis of RNA-protein fusions for in vitro protein selection. Methods Enzymol. 2000;318:268-93(非特許文献27);及び、Cho G, et al. Constructing high complexity synthetic libraries of long ORFs using in vitro selection. J Mol Biol. 2000 Mar 24;297(2):309-19(非特許文献28)などが挙げられる。 The literature on protein -mRNA covalent fusion method, Keefe AD, et al Functional proteins from a random-sequence library Nature 2001 Apr 5; 410 (6829):... 715-8 (non-patent document 25); Wilson DS , et al The use of mRNA display to select high-affinity protein-binding peptides Proc Natl Acad Sci US A. 2001 Mar 27; 98 (7):.. 3750-5 (non-Patent Document 26); Liu R, et al .. Optimized synthesis of RNA-protein fusions for in vitro protein selection Methods Enzymol 2000; 318:.. 268-93 (non-Patent Document 27); and, Cho G, et al Constructing high complexity synthetic libraries of long ORFs using in vitro .. selection J Mol Biol 2000 Mar 24; 297 (2): 309-19 (non-patent Document 28), and the like.

ミセル法では、化学的修飾を受けた個々のDNA分子が一個づつ、一つのコロイド状ミセルにパッケージングされて、転写および翻訳を受けるが、その修飾されたDNAはミセルの内腔でそのコードするタンパク質と結合する。 The micelle method, individual DNA molecules one by one that have undergone a chemical modification, are packaged into a single colloidal micelles, but under the transcriptional and translational, its modified DNA is the code in the lumen of the micelles It binds to the protein. しかし、個々のミセルにDNA1分子がパッケージングされるように設計して反応混合物を希釈することにより、配列ライブラリーの多様性が減縮する。 However, DNA1 molecules individual micelles by diluting the reaction mixture was designed to be packaged, the diversity of sequence library is reduced shrinkage. 従って、無細胞系は、生細胞を用いる系に比べると、より多くの配列を試験できるという利点を有するものの、現在利用可能な無細胞系では、配列のプールのかなりの部分が十分に探索されていない。 Therefore, cell-free system is compared to a system using live cells, although having the advantage of testing more sequences, in the currently available cell-free system, a significant portion of the pool of sequences are well explored not.

本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、配列の多様性を減縮させることなく、一群のアミノ酸のランダムな配列から機能性タンパク質を選択しうる方法を提供することにある。 The present invention has been made in view of such circumstances, and its object is without Genchijimi the sequence diversity provides a method capable of selecting a functional protein from a random sequence of a group of amino acids It lies in the fact. また、本発明は、このような機能性タンパク質の選択を可能とするために、無細胞系においても、遺伝子型と表現型の安定的な連結を行いうる方法を提供することをも目的とする。 Further, in order to allow for the selection of such functional protein, even in a cell-free system, an object of the present invention is to provide a method which can make phenotypically stable connection between the genotype . さらに、本発明は、このような遺伝子型と表現型の安定的な連結に利用しうる核酸構築物を提供することをも目的とする。 Furthermore, the present invention aims also to provide such genotype and phenotype stable nucleic acid construct which can be utilized for linking.

本発明者は、上記課題を解決するために、無細胞系において、遺伝子型と表現型の安定的な連結を試みた。 The present inventors, in order to solve the above problems, in a cell-free system, tried phenotypically stable connection between the genotype.
第1の手法は、遺伝子型と表現型の安定的な連結のために、RNA結合タンパク質とRNAとの強い相互作用を利用するものである。 The first approach, for stable coupling of genotype and phenotype, is to utilize a strong interaction with the RNA binding protein and RNA. 一例として、TAR(trans activating response region;トランス活性化応答領域)として知られているTat(trans activation;トランス活性化)タンパク質と相互作用するRNAより強い強度でHIV-1のTatタンパク質に結合するアプタマー(Tatアプタマーと呼ぶ)を選択した(Yamamoto, R. 他 Genes Cells 2000, 5, 371-388)。 As an example, TAR; Tat known as (trans activating response region transactivation response region); aptamers that bind to Tat protein of HIV-1 with a strong strength than (trans activation transactivation) protein that interact with RNA (referred to as Tat aptamer) were selected (Yamamoto, R. other Genes Cells 2000, 5, 371-388). TatアプタマーとTat由来のペプチド(REペプチド、38アミノ酸、またはCQペプチド、36アミノ酸)との相互作用は非常に強く、その解離定数(Kd)はnM以下の範囲である。 Tat aptamer and Tat-derived peptides (RE peptide, 38 amino acids or CQ peptide, 36 amino acids) and the interaction is very strong, its dissociation constant (Kd) is in the range of less nM. 本発明者らは、この相互作用を利用して遺伝子型と表現型の連結を行うために、TatアプタマーとTat由来のペプチドをコードするDNAがDHFR遺伝子に連結されたDNA構築物を調製し、DHFR遺伝子の転写産物(mRNA)と翻訳産物(タンパク質)が安定的な複合体を形成しうるかを検証した。 The present inventors have found that in order to perform phenotypic connection with the genotype by utilizing this interaction to prepare a DNA construct DNA encoding a peptide derived from Tat aptamer and Tat are linked to the DHFR gene, DHFR transcript of a gene (mRNA) and the translation product (protein) has verified whether can form a stable complex.

その結果、TatアプタマーとTat由来のペプチドの相互作用が、ネットワーク構造を形成しない限り、DHFR遺伝子の遺伝子型と表現型、つまり転写産物と翻訳産物を連結するために有用であることを見出した。 As a result, the interaction of peptides from Tat aptamer and Tat is, unless form a network structure, genotype and phenotype of DHFR gene, it was found that words are useful for connecting the transcript translation product. DNA構築物におけるアプタマーとペプチドモチーフの数の増加や、転写産物が終止コドンを欠損するようなDNA構築物の改変は、この複合体の安定性の向上に有効であった。 The number increases and the aptamer and peptide motifs in the DNA construct, modification of DNA constructs as transcript lacking a termination codon, it was effective in improving the stability of this complex.

また、他の一例として、MS2コートタンパク質二量体と、それに対応する特異的結合モチーフRNA配列との相互作用を利用して、遺伝子型と表現型の連結を試みたところ、安定的なMS2コートタンパク質遺伝子の転写産物と翻訳産物の複合体を形成することができた。 As another example, the MS2 coat protein dimer, it utilizes the interaction between the corresponding specific binding motif RNA sequences, was tried phenotype connection between genotype, stable MS2 coat it was possible to form a complex of the transcript and translation product of the protein gene.

さらに、本発明者らは、遺伝子型と表現型の安定的な連結のために、上記のRNA結合タンパク質とRNAとの相互作用に代えて、DNA結合タンパク質とDNAとの相互作用の利用を考えた。 Furthermore, the present inventors have found that in order phenotypic stable connection between the genotype, in place of the interaction between the RNA-binding proteins and RNA, consider the use of the interaction of DNA-binding proteins and DNA It was. 即ち、DNA結合タンパク質と任意のペプチドとのキメラペプチドをコードするmRNAと該DNA結合タンパク質が結合する領域を含むDNAとの複合体である核酸構築物を調製し、該核酸構築物におけるmRNAを翻訳させれば、翻訳産物が該核酸構築物におけるDNAに結合し、これにより該翻訳産物と該核酸構築物との安定的な複合体を形成しうると考えた。 That is, the nucleic acid construct is a complex with DNA containing a region mRNA and the DNA binding protein encoding the chimeric peptide binds to the DNA binding protein and any peptide was prepared, caused to translate the mRNA in the nucleic acid construct if the translation product binds to DNA in the nucleic acid construct, thereby it was considered capable of forming a stable complex with the translation product and the nucleic acid construct.

第2の手法は、遺伝子型と表現型の安定的な連結のために、リボソームの不活性化を利用するものである。 The second approach for phenotypic stable connection between the genotype, is to utilize the inactivation of ribosomes. リボソームの不活性化のために、一例として、リシンA鎖を選択した。 For inactivation of ribosomes, as an example, it was chosen ricin A chain. リシンはヒマ由来の細胞毒性を持つタンパク質でリボソームを不活性化することでタンパク質の合成を停止させる。 Lysine stops protein synthesis by inactivating ribosomes in protein with cytotoxic from castor. サブユニットであるリシンA鎖は、極めて特異的に28S rRNAに存在するα−サリシン部位のN-グルコシド結合を加水分解し、リボソームを不活性化する。 Ricin A chain is a subunit, a very specifically present in 28S rRNA alpha-salicin site of N- glucosidic linkages hydrolyze and inactivate the ribosomes. ラットの28S rRNAでは、4324番目のアデノシンが加水分解を受ける。 In the 28S rRNA of the rat, 4324 th of adenosine is subjected to hydrolysis. リシンに不活性化されたリボソームはmRNA鎖上に停止する。 Lysine inactivation ribosome stops on the mRNA strand. 本発明者は、リシンA鎖によるリボソーム相互作用を利用して遺伝子型と表現型の連結を行うために、リシンA鎖をコードするDNAが、DHFR遺伝子、GST遺伝子、あるいはストレプトアビジン遺伝子に連結されたDNA構築物を調製し、それら遺伝子の転写産物(mRNA)と翻訳産物(タンパク質)が安定的な複合体を形成しうるかを検証した。 The present inventors, in order to utilize the ribosome interaction by ricin A chain performs connection genotype and phenotype, DNA encoding the ricin A chain, is linked to the DHFR gene, GST genes or streptavidin gene, a DNA construct is prepared, transcripts thereof gene (mRNA) and the translation product (protein) has verified whether can form a stable complex.

その結果、リシンA鎖によるリボソームの不活性化が、これら遺伝子の転写産物と翻訳産物の複合体の安定化に有効であることを見出した。 As a result, inactivation of ribosomes by ricin A chain has been found to be effective in stabilizing the complex of transcripts and translation products of these genes. 立体障害を回避するための翻訳産物へのスペーサーペプチドの挿入は、リボソームの不活性化に有効であった。 Insertion of the spacer peptide into translation products to avoid steric hindrance, was effective in inactivating the ribosomes.

また、DHFR遺伝子、GST遺伝子、またはストレプトアビジン遺伝子を含む上記DNA構築物を利用して調製された複合体は、それぞれMTXリガンド、グルタチオン-セファロースまたはビオチン-アガロースに選択的に結合した。 Moreover, DHFR gene, GST gene or streptavidin gene complex prepared using the above DNA construct comprising, in, MTX ligand respectively, glutathione - sepharose or biotin - bound selectively to agarose. この事実は、特定の遺伝子の表現型に相互作用しうる分子を標的物質として、上記手法により形成された複合体の中から、該標的物質に結合する機能性タンパク質およびそれをコードするmRNAをスクリーニングすることが可能であることを示すものである。 This fact, a molecule capable of interacting in the phenotype of a particular gene as the target substance, screened from the complex formed by the above method, the functional protein and mRNA encoding it binds to the target substance it is intended to indicate that it is possible to. 本発明の手法は、スクリーニングの対象となるペプチドのアミノ酸配列の多様性を減縮させることなく、機能性タンパク質およびそれがコードするmRNAの効率的な選択を可能とする。 Approach of the present invention, without Genchijimi diversity of the amino acid sequence of a peptide to be screened, to enable efficient selection of a functional protein and mRNA it encodes. また、転写産物と翻訳産物を含む複合体の安定化を、該転写産物および翻訳産物をコードするDNAと該安定化に寄与するDNAとの融合という遺伝子操作で行い、一連の選択工程には複雑な化学合成の工程は含まれておらず、簡便に操作できる点も本方法のさらなる利点である。 Further, stabilization of the complex comprising a transcription product and translation product, carried out by genetic engineering of a fusion between the transcript and the DNA coding for the translation product and the contributing to stabilizing DNA, complex for a series of selection steps chemical synthesis process is not included, it is a further advantage of also the method that can be conveniently operated.

即ち、本発明は、以下の発明を提供するものである。 That is, the present invention provides the following inventions.
(1) 下記(i)および(ii)のDNAを含み、かつ、下記(i)および(ii)のDNAが、融合された転写産物および翻訳産物を発現するように結合されている、DNA構築物。 (1) a DNA of the following (i) and (ii), and, DNA of following (i) and (ii) is coupled to express the fused transcription and translation products, DNA constructs .
(i)任意のポリペプチドをコードするDNA (I) DNA encoding any polypeptide
(ii)(i)のDNAの転写産物と翻訳産物を含む複合体を安定化させる機能を有するポリペプチドをコードするDNA (Ii) DNA encoding a polypeptide having a function of stabilizing a complex comprising a transcription product and translation product of the DNA of (i)
(2) (ii)のDNAが、リボソームを不活性化する機能を有するポリペプチドをコードするDNAである、(1)に記載のDNA構築物。 (2) DNA of (ii) is a DNA encoding a polypeptide having the function of inactivating ribosomes, DNA construct according to (1).
(3) リボソームを不活性化する機能を有するポリペプチドをコードするDNA の下流にスペーサーペプチドをコードするDNAが結合されている、(2)に記載のDNA構築物。 (3) DNA encoding a spacer peptide downstream of DNA encoding a polypeptide having the function of inactivating the ribosomes are bound, DNA construct according to (2).
(4) 任意のポリペプチドをコードするDNAとリボソームを不活性化する機能を有するポリペプチドをコードするDNAの間にリンカーペプチドをコードするDNAが挿入されている、(2)に記載のDNA構築物。 (4) any of the DNA encoding a linker peptide between the DNA encoding the polypeptide DNA and ribosomes which encodes a polypeptide having the ability to inactivate is inserted, DNA construct according to (2) .
(5) (ii)のDNAが、RNA結合タンパク質をコードするDNAと該RNA結合タンパク質が結合するRNAをコードするDNAとの組み合わせである、(1)に記載のDNA構築物。 (5) DNA of (ii) is a combination of DNA encoding an RNA DNA and the RNA binding protein coding RNA binding protein binds, DNA construct according to (1).
(6) (i)および(ii)のDNAの融合された転写産物が終止コドンを欠損するように改変されている、(5)に記載のDNA構築物。 (6) (i) and fusion transcripts of the DNA of (ii) has been modified to lack the stop codon, DNA construct according to (5).
(7) RNA結合タンパク質をコードするDNAが複数個並置されており、かつ該RNA結合タンパク質が結合するRNAをコードするDNAが複数個並置されている、(5)に記載のDNA構築物。 (7) DNA encoding an RNA binding proteins have been several juxtaposed and DNA in which the RNA binding protein encoding RNA binding is plural juxtaposed DNA construct according to (5).
(8) 複数個並置されたRNA結合タンパク質をコードするDNAが、互いに異なる複数個のRNA結合タンパク質をコードするDNAであり、かつ、複数個並置されたRNA結合タンパク質が結合するRNAをコードするDNAが互いに異なる複数個のRNA結合タンパク質が結合するRNAをコードするDNAである、(7)に記載の核酸構築物。 (8) DNA encoding a plurality juxtaposed RNA binding protein, a DNA encoding a plurality of different RNA binding proteins to one another, and, DNA encoding RNA which a plurality juxtaposed RNA binding protein that binds There is a DNA encoding an RNA plurality of different RNA binding protein binds together, the nucleic acid construct according to (7).
(9) 下記(i)のmRNAと下記(ii)のDNAの複合体である核酸構築物。 (9) mRNA and nucleic acid construct is a complex of DNA below (ii) below (i).
(i)DNA結合タンパク質をコードするRNAと任意のポリペプチドをコードするRNAとの融合mRNA (I) a fusion mRNA with RNA encoding RNA and any polypeptide encoding the DNA binding protein
(ii)(i)の融合mRNAの翻訳産物が結合するDNA領域を含むDNA (Ii) (i) DNA translation product of the fusion mRNA contains a DNA region which binds the
(10) (i)のmRNAと(ii)のDNAがハイブリダイズすることにより複合体を形成している、(9)に記載の核酸構築物。 (10) DNA of (i) of the mRNA (ii) form a complex by hybridization, nucleic acid construct according to (9).
(11) (i)のmRNAの3'側領域と(ii)のDNAの3'側領域がハイブリダイズしている、(9)に記載の核酸構築物。 (11) side region 3 'of the DNA of the side region and (ii) the 3' mRNA of (i) is hybridized, the nucleic acid construct according to (9).
(12) (1)に記載のDNA構築物の調製に用いるための、下記(i)または(ii)のDNA構築物。 (12) (1) for use in the preparation of the DNA construct according to, DNA construct following (i) or (ii).
(i)任意のポリペプチドをコードするDNAの転写産物と翻訳産物の複合体を安定化させる機能を有するDNAを含むDNA構築物(ii)任意のポリペプチドをコードするDNAの転写産物と翻訳産物の複合体を安定化させる機能を有するDNAと、該任意のポリペプチドをコードするDNAのクローニング部位とを含むDNA構築物(13) (1)に記載のDNA構築物における(i)および(ii)のDNAを発現させることを特徴とする、(i)および(ii)のDNAの転写産物と翻訳産物を含む複合体を製造する方法。 (I) any DNA construct comprising a DNA having a function of stabilizing a complex of transcript and translation product of the DNA encoding the polypeptide (ii) any transcript of DNA encoding a polypeptide with the translation product DNA of a DNA having a function of stabilizing a complex, in said any DNA construct comprising a cloning site of the DNA encoding the polypeptide (13) DNA construct according to (1) (i) and (ii) characterized in that the expression of, (i) and process for producing a composite comprising a translation product with the transcription product of the DNA of (ii).
(14) (9)に記載の核酸構築物における(i)のmRNAを翻訳させ、翻訳産物を(9)に記載の核酸構築物における(ii)のDNAに結合させることを特徴とする、該翻訳産物と(9)に記載の核酸構築物との複合体を製造する方法。 (14) (9) is translated mRNA of (i) in the nucleic acid construct according to, characterized in that to bind to DNA of (ii) in the nucleic acid construct according to the translation product (9), the translation product method for producing a complex of a nucleic acid construct according to (9).
(15) (i)のmRNAと(ii)のDNAがハイブリダイズすることにより複合体を形成している核酸構築物を用いる、(14)に記載の方法。 (15) DNA of (i) of the mRNA (ii) is used a nucleic acid construct that forms a complex by hybridization, the method described in (14).
(16) (i)のmRNAの3'側領域と(ii)のDNAの3'側領域がハイブリダイズしている核酸構築物を用いる、(14)に記載の方法。 (16) side region 3 'of the DNA of the side region and (ii) the 3' mRNA of (i) is used a nucleic acid construct hybridizing method according to (14).
(17) (15)に記載の方法により製造された複合体における(ii)のDNAを伸長する方法であって、該複合体に逆転写酵素を接触させて、(i)のmRNAを鋳型に逆転写反応を行うことを含む方法。 (17) (15) The method for extending the DNA of (ii) in the complex produced by the method described, by contacting the reverse transcriptase complex, a template of the mRNA (i) the method comprising performing a reverse transcription reaction.
(18) (16)に記載の方法により製造された複合体における(ii)のDNAの3'側領域を伸長する方法であって、該複合体に逆転写酵素を接触させて、(i)のmRNAを鋳型に(ii)のDNAをプライマーとして逆転写反応を行うことを含む方法。 (18) A method for extending the 3 'side region of the DNA of (ii) in the complex produced by the method described in (16), contacting the reverse transcriptase complex, (i) method comprising the mRNA by performing the reverse transcription reaction as a primer the DNA of (ii) as a template.
(19) 無細胞系で行われる、(13)から(18)のいずれかに記載の方法。 (19) is carried out in a cell-free system, the method according to any one of (13) to (18).
(20) (13)に記載の方法により製造される複合体。 (20) a composite body produced by the method described in (13).
(21) (14)から(18)のいずれかに記載の方法により製造される複合体。 (21) a composite body produced by the method according to any one of (14) (18).
(22) 特定の標的物質に結合するポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードするmRNAをスクリーニングする方法であって、下記(a)から(c)の工程を含む方法。 (22) A method of screening for mRNA encoding the polypeptide or said polypeptide to bind to a particular target substance, the method comprising the following (a) of step (c).
(a)(1)に記載のDNA構築物における(i)および(ii)のDNAを発現させることにより、(i)および(ii)のDNAの転写産物と翻訳産物を含む複合体を形成させる工程(b)該特定の標的物質と、工程(a)で形成された複合体とを接触させる工程(c)該標的物質に結合した複合体を回収する工程(23) 特定の標的物質に結合するポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードするmRNAをスクリーニングする方法であって、下記(a)から(c)の工程を含む方法。 (A) by expressing the DNA of (i) and (ii) in the DNA construct according to (1), the step of forming a complex comprising a transcription product of the translation product of the DNA of (i) and (ii) (b) and the specific target substance, step (a) recovering the complex bound to step (c) the target substance to the contacting the complex formed in (23) to bind to a particular target substance a method of screening for mRNA encoding the polypeptide or said polypeptide, a method comprising the following (a) of step (c).
(a)(9)に記載の核酸構築物における(i)のmRNAを翻訳させ、翻訳産物を(9)に記載の核酸構築物における(ii)に記載のDNAに結合させることにより、該翻訳産物と(9)に記載の核酸構築物を含む複合体を形成させる工程(b)該特定の標的物質と、工程(a)で形成された複合体とを接触させる工程(c)該標的物質に結合した複合体を回収する工程(24) 特定の標的物質に結合するポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードするmRNA若しくはDNAをスクリーニングする方法であって、下記(a)から(d)の工程を含む方法。 (A) (9) is translated mRNA of (i) in the nucleic acid construct according to, by binding to the DNA according to (ii) in the nucleic acid construct according to the translation product (9), with said translation product bound and step (b) the specific target substance to form a complex comprising a nucleic acid construct, in step (c) the target substance to the contacting the complex formed in step (a) according to (9) a method of screening for mRNA or DNA encoding the polypeptide or the polypeptide binds to step (24) a particular target substance recovering the complex, the method comprising the following steps (a) from (d).
(a)(10)に記載の核酸構築物における(i)のmRNAを翻訳させ、翻訳産物を(10)に記載の核酸構築物における(ii)に記載のDNAに結合させることにより、該翻訳産物と(10)に記載の核酸構築物とを含む複合体を形成させる工程(b)工程(a)で形成された複合体に逆転写酵素を接触させて、該複合体における(i)のmRNAを鋳型に逆転写反応を行うことにより、該複合体における(ii)のDNAを伸長する工程(c)該特定の標的物質と、工程(b)で形成された複合体とを接触させる工程(d)該標的物質に結合した複合体を回収する工程(25) 特定の標的物質に結合するポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードするmRNA若しくはDNAをスクリーニングする方法であって、下記(a)から(d)の工程を含む方法。 (A) to translate the mRNA of (i) in the nucleic acid construct according to (10), by binding to the DNA according to (ii) in the nucleic acid construct according to the translation product (10), with said translation product (10) contacting the reverse transcriptase complex formed in step (b) step (a) to form a complex containing the nucleic acid construct according template mRNA of (i) in the complex step by performing a reverse transcription reaction, contacting a target substance DNA process of the extension (c) the identification of the complex (ii), and a complex formed in step (b) in (d) of a method of screening for mRNA or DNA encoding the polypeptide or the polypeptide binds to step (25) a particular target substance recovering the complex bound to the target substance, from the following (a) (d) the method comprising the steps.
(a)(11)に記載の核酸構築物における(i)のmRNAを翻訳させ、翻訳産物を(11)に記載の核酸構築物における(ii)に記載のDNAに結合させることにより、該翻訳産物と(11)に記載の核酸構築物とを含む複合体を形成させる工程(b)工程(a)で形成された複合体に逆転写酵素を接触させて、該複合体における(i)のmRNAを鋳型に、該複合体における(ii)のDNAをプライマーとして逆転写反応を行うことにより、該複合体における(ii)のDNAの3'側領域を伸長する工程(c)該特定の標的物質と、工程(b)で形成された複合体とを接触させる工程(d)該標的物質に結合した複合体を回収する工程(26) 特定の標的物質に結合するポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードするmRNA若しくはDNAをスクリーニングする (A) (11) to translate the mRNA of (i) in the nucleic acid construct according to, by binding to the DNA according to (ii) in the nucleic acid construct according to the translation product (11), with said translation product (11) contacting the reverse transcriptase complex formed in step (b) step (a) to form a complex containing the nucleic acid construct according template mRNA of (i) in the complex to, by performing a reverse transcription reaction the DNA of (ii) in the complex as a primer, a step (c) the specific target substance to extend the 3 'side region of the DNA of (ii) in the complex, step (b) in the step to the contacting the complex formation (d) mRNA encoding the polypeptide or the polypeptide binds to the target step (26) for collecting the complex bound to the substance specific target substance or to screen for DNA 法であって、下記(a)から(d)の工程を含む方法。 A method, the method comprising the following (a) of step (d).
(a)(10)に記載の核酸構築物における(i)のmRNAを翻訳させ、翻訳産物を(10)に記載の核酸構築物における(ii)に記載のDNAに結合させることにより、該翻訳産物と(10)に記載の核酸構築物とを含む複合体を形成させる工程(b)該特定の標的物質と、工程(a)で形成された複合体とを接触させる工程(c)該標的物質に結合した複合体に逆転写酵素を接触させて、該複合体における(i)のmRNAを鋳型に逆転写反応を行うことにより、該複合体における(ii)のDNAを伸長する工程(d)該標的物質に結合している複合体を回収する工程(27) 特定の標的物質に結合するポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードするmRNA若しくはDNAをスクリーニングする方法であって、下記(a)から(d)の工程を含む方法。 (A) to translate the mRNA of (i) in the nucleic acid construct according to (10), by binding to the DNA according to (ii) in the nucleic acid construct according to the translation product (10), with said translation product bond and step (b) the specific target substance to form a complex, the step (c) the target substance to the contacting the complex formed in step (a) comprising a nucleic acid construct according to (10) was contacting the reverse transcriptase complex, said plurality mRNA by the performing reverse transcription reaction as a template of (i) in the polymer, DNA and extending step (d) target of (ii) in the complex a method of screening for mRNA or DNA encoding the polypeptide or the polypeptide binds to step (27) a particular target substance recovering complexes bound to the material, from the following (a) (d) the method comprising the steps.
(a)(11)に記載の核酸構築物における(i)のmRNAを翻訳させ、翻訳産物を(11)に記載の核酸構築物における(ii)に記載のDNAに結合させることにより、該翻訳産物と(11)に記載の核酸構築物とを含む複合体を形成させる工程(b)該特定の標的物質と、工程(a)で形成された複合体とを接触させる工程(c)該標的物質に結合した複合体に逆転写酵素を接触させて、該複合体における(i)のmRNAを鋳型に、該複合体における(ii)のDNAをプライマーとして逆転写反応を行うことにより、該複合体における(ii)のDNAの3'側領域を伸長する工程(d)該標的物質に結合している複合体を回収する工程(28) 該標的物質が担体に固定されている、(22)から(27)のいずれかに記載の方法。 (A) (11) to translate the mRNA of (i) in the nucleic acid construct according to, by binding to the DNA according to (ii) in the nucleic acid construct according to the translation product (11), with said translation product bond and a step (b) the specific target substance to form a complex comprising a nucleic acid construct, in step (c) the target substance to be formed contacting the complexes formed in step (a) according to (11) It was contacting the reverse transcriptase complex, the mRNA of (i) in the complex as a template by performing the reverse transcription reaction the DNA of (ii) in the complex as a primer, in the complex ( bound recovering the complex has (28) the target substance in step (d) the target substance to extend the 3 'side region of the DNA of ii) is fixed to the carrier, from (22) (27 the method according to any one of).
(29) (1)もしくは(12)に記載のDNA構築物、または(20)に記載の複合体を含む、(21)に記載のスクリーニング方法に用いるためのキット。 (29) (1) or DNA construct according to (12), or a complex according to (20), a kit for use in the screening method described in (21).
(30) (9)に記載の核酸構築物、または(21)に記載の複合体を含む、(23)から(27)のいずれかに記載のスクリーニング方法に用いるためのキット。 (30) The nucleic acid construct according to (9), or (21) a complex according kit for use in the screening method according to any one of (23) to (27).

以下、本発明の実施方法及び実施態様について詳細に説明する。 It will be described below in detail the methods and embodiments of the present invention.
(1)核酸構築物 本発明のDNA構築物は、(i)任意のポリペプチドをコードするDNA、および(ii)該DNAの転写産物と翻訳産物の複合体を安定化させる機能を有するDNAを含むものである。 (1) a nucleic acid construct DNA constructs of the present invention comprises a DNA having a function of stabilizing a complex of (i) any DNA encoding the polypeptide, and (ii) the DNA of the transcription product and translation product . 該DNA構築物においては、上記(i)および(ii)のDNAが、融合された転写産物および翻訳産物を発現するように結合されている。 In the DNA construct, DNA of (i) and (ii) is coupled to express the fused transcription and translation products.

「任意のポリペプチドをコードするDNA」とは、その転写産物と翻訳産物の複合体の形成を行いたい所望のDNAを意味する。 "DNA encoding any polypeptide" is meant a desired DNA to be subjected to formation of a complex of the transcription product and translation product. 機能性タンパク質のスクリーニングにおいては、例えば、cDNAライブラリーやランダムライブラリーを好適に用いることができる。 In screening for functional proteins, for example, it can be suitably used a cDNA library or a random library.

転写産物と翻訳産物の複合体を安定化させる機能を有するDNAの種類は特に限定されない。 Type of DNA that has a function of stabilizing a complex of transcripts and translation products is not particularly limited. 好適なDNAの第一の例としては、リボソームを不活性化する機能を有するポリペプチドをコードするDNAである。 As a first example of a suitable DNA, DNA that is a DNA encoding a polypeptide having the function of inactivating ribosomes.

本明細書で言う「リボソームを不活性化する機能を有するポリペプチド」とは、リボソーム自体を破壊してそれを不活性化するポリペプチドのみならず、リボソームをmRNA上で停止することによりリボソームの翻訳機能を停止させることができるポリペプチドも包含する。 Referred to herein as "polypeptide having the function of inactivating ribosomes" not only polypeptide inactivates it by destroying ribosomes itself, ribosomes of ribosome by stopping on mRNA also encompasses polypeptides that can stop the translation function.

このようなポリペプチドの具体例としては、N-グリコシラーゼ又はRNaseが挙げられる。 Specific examples of such polypeptides include N- glycosylase or RNase. N-グリコシラーゼの具体例としては、Pokeweed antiviral protein (PAP) (Phytolacca americana)、Momordin (Momordica charantia)、Luffin (Luffa cylindrica)、Bryodin (Bryonia dioica)、Dianthin (Dianthus caryophyllus)、Trichosanthin (Trichosanthes anguina)、a-Momorcharin (Momordia charantia)、Saporin (Saponaria officinalis)、Ricin A-chain (RTA) (ricinus communis)、Abrin A-chain (Abrus precatorius)、Mistletoe lectin I (MLI) (Viscum album)、Shiga toxin AI、またはDiphtheria toxin (DT) A-chainが挙げられる。 Specific examples of the N- glycosylase, Pokeweed antiviral protein (PAP) (Phytolacca americana), Momordin (Momordica charantia), Luffin (Luffa cylindrica), Bryodin (Bryonia dioica), Dianthin (Dianthus caryophyllus), Trichosanthin (Trichosanthes anguina), a-Momorcharin (Momordia charantia), saporin (Saponaria officinalis), Ricin A-chain (RTA) (ricinus communis), abrin A-chain (Abrus precatorius), Mistletoe lectin I (MLI) (Viscum album), Shiga toxin AI, or Diphtheria toxin (DT) A-chain and the like. RNaseの具体例としてはα-Sarcinが挙げられる。 Specific examples of the RNase include alpha-sarcin.

なお、ricinについては、The RNA N-glycosidase activity of ricin A-chain. The characteristics of the enzymatic activity of ricin A-chain with ribosomes and with rRNA.J Biol Chem. 1988 Jun 25;263(18):8735-9に記載され、α−sarcinについては、The ribonuclease activity of the cytotoxin alpha-sarcin. The characteristics of the enzymatic activity of alpha-sarcin with ribosomes and ribonucleic acids as substrates. J Biol Chem. 1983 Feb 25;258(4):2662-7に記載され、Pokeweed antiviral protein (PAP)については、X-ray crystallographic analysis of the structural basis for the interaction of pokeweed antiviral protein with guanine residues of ribosomal RNA. Protein Sci. 1999 Nov;8(11):2399-405に記載されている。 .. It should be noted that, for ricin, The RNA N-glycosidase activity of ricin A-chain The characteristics of the enzymatic activity of ricin A-chain with ribosomes and with rRNA.J Biol Chem 1988 Jun 25; 263 (18): 8735- 9 is described in, for α-sarcin, the ribonuclease activity of the cytotoxin alpha-sarcin the characteristics of the enzymatic activity of alpha-sarcin with ribosomes and ribonucleic acids as substrates J Biol Chem 1983 Feb 25;... 258 (4 ):.. 2662-7 are described in, Pokeweed antiviral for the protein (PAP), X-ray crystallographic analysis of the structural basis for the interaction of pokeweed antiviral protein with guanine residues of ribosomal RNA Protein Sci 1999 Nov; 8 (11 ): it has been described in 2399-405.

本発明のDNA構築物の好ましい態様の一つにおいては、リボソームを不活性化する機能を有するポリペプチドをコードするDNAの下流にスペーサーペプチドをコードするDNAが結合されている。 In one preferred embodiment of the DNA construct of the present invention, DNA encoding an spacer peptide downstream of DNA encoding a polypeptide having the function of inactivating the ribosomes are bound. この「スペーサーペプチド」とは、リボソームによる翻訳が終了する前に、リボソームを不活性化する機能を有するポリペプチドが、リボソームをcisで攻撃できるようにするためのペプチドである。 The "spacer peptide" before translation by ribosomes is completed, a polypeptide having the function of inactivating ribosomes, a peptide so that the ribosomes can attack in cis. スペーサーペプチドは、それ自体折りたたまれないペプチドであることが好ましい。 Spacer peptide preferably is itself folded without peptide. スペーサーペプチドは、翻訳された、リボソームを不活性化する機能を有するポリペプチドが、リボソームをcisで攻撃することを保証することができる鎖長を有する。 Spacer peptide has been translated, the polypeptide having the function of inactivating ribosomes, the chain length can be guaranteed to attack ribosomes in cis. 鎖長は、通常、50から200アミノ酸であり、好ましくは100アミノ酸から140アミノ酸である。 Chain length is usually 200 amino acids from 50, preferably 140 amino acids from the 100 amino acids.

また、本発明のDNA構築物の他の好ましい態様において、本発明のDNA構築物上の任意のポリペプチドをコードするDNAとリボソームを不活性化する機能を有するポリペプチドをコードするDNAの間にリンカーペプチドをコードするDNAが挿入されている。 Further, in another preferred embodiment of the DNA construct of the present invention, the linker peptide between the DNA encoding the polypeptide having the function of inactivating the DNA encoding the ribosome any polypeptide on DNA construct of the invention encoding DNA is inserted a. この「リンカーペプチド」とは、本発明のDNA構築物からの翻訳産物(融合タンパク質)において、融合されるポリペプチド同士が立体障害によりそのフォールディングが阻害されるのを回避するために、融合されるポリペプチドの間に挿入されるポリペプチドである。 This "linker peptide" in the translation product from the DNA constructs of the present invention (fusion protein), a polypeptide with each other in order to avoid its folding is inhibited by steric hindrance fusion, poly fused is a polypeptide that is inserted between the peptides. リンカーペプチドの鎖長さに特に制限はないが、一般的には、10から30アミノ酸程度のペプチドが用いられる。 There is no particular limitation on the chain length of the linker peptide, is generally 10 to 30 amino acids of approximately peptide is used.

転写産物と翻訳産物の複合体を安定化させる機能を有するDNAの好適な第二の例としては、RNA結合タンパク質をコードするDNAと該RNA結合タンパク質が結合するRNAをコードするDNAとの組み合わせが挙げられる。 Suitable second example of a DNA having a function of stabilizing a complex of transcripts and translation products, the combination of a DNA encoding an RNA DNA and the RNA binding protein coding RNA binding protein binds and the like. このようなRNA結合タンパク質をコードするDNA配列と、該RNA結合タンパク質が結合するRNAをコードするDNA配列との組み合わせを使用する場合、DNA構築物中に、RNA結合タンパク質をコードするDNAが複数個並置されており、かつ該RNA結合タンパク質が結合するRNAをコードするDNAが複数個並置されていることが好ましい。 And DNA sequences encoding such RNA binding proteins, when using a combination of a DNA sequence encoding an RNA the RNA binding protein binds, in the DNA construct, DNA a plurality juxtaposition that encodes an RNA binding protein It is, and that the DNA encoding an RNA the RNA binding protein binds is a plurality juxtaposed are preferred. これによりRNA結合タンパク質とRNAとの相互作用を強化することができる。 This makes it possible to enhance the interaction between RNA binding proteins and RNA.

またさらに好ましくは、複数個のRNA結合タンパク質をコードするDNAとして、互いに異なる複数個のRNA結合タンパク質をコードするDNAを使用し、複数個の該RNA結合タンパク質が結合するRNAをコードするDNAとして、上記した互いに異なる複数個のRNA結合タンパク質が結合する互いに異なるRNAをコードするDNAを使用する。 Even more preferably, DNA encoding a plurality of RNA binding proteins, DNA encoding different using a plurality of DNA that encodes an RNA binding protein, the RNA which a plurality of the RNA binding proteins that bind to each other, using the DNA encoding different RNA from each other a plurality of RNA binding proteins differ from each other as described above are bonded. このような互いに異なる複数個のDNAを使用することにより、異なる複合体の間におけるネットワーク構造の形成が妨げることができる。 By using a plurality of DNA differ in such each other can form a network structure between the different complexes interfere.

RNA結合タンパク質と該RNA結合タンパク質が結合するRNAの組み合わせの具体例としては、Tatタンパク質とTAR RNAもしくはTatアプタマー、Revタンパク質とRRE RNAもしくはRevアプタマー、U1A spliceosomal proteinとU1A spliceosomal proteinアプタマーもしくはU1A Sn RNA、ジンクフィンガータンパク質若しくはその変異体とそれが認識するRNAなどが挙げられる。 Specific examples of combinations of RNA RNA binding proteins and the RNA binding protein binds, Tat protein and TAR RNA or Tat aptamer, Rev protein and RRE RNA or Rev aptamer, U1A spliceosomal protein and U1A spliceosomal protein aptamers or U1A Sn RNA , zinc finger protein or a variant thereof and which it is like to recognize RNA. また、MS2コートタンパク質とそれに対応する特異的結合モチーフのRNA配列を本発明に用いることも可能である。 It is also possible to use in the present invention the RNA sequence of the specific binding motifs and corresponding MS2 coat protein.

なお、Tat-TAR 又はTat aptamerについては、A novel RNA motif that binds efficiently and specifically to the Ttatprotein of HIV and inhibits the trans-activation by Tat of transcription in vitro and in vivo. Genes Cells. 2000 May;5(5):371-88に記載され、Rev-RRE複合体については、A structural model for the HIV-1 Rev-RRE complex deduced from altered-specificity rev variants isolated by a rapid genetic strategy. Cell. 1996 Oct 4;87(1):115-25に記載され、U1A spliceosomal protein については、Crystal structure at 1.92 A resolution of the RNA-binding domain of the U1A spliceosomal protein complexed with an RNA hairpin. Nature. 1994 Dec 1;372(6505):432-8に記載されている。 It is to be noted that the Tat-TAR or Tat aptamer, A novel RNA motif that binds efficiently and specifically to the Ttatprotein of HIV and inhibits the trans-activation by Tat of transcription in vitro and in vivo Genes Cells 2000 May;.. 5 (5 ):.. 371-88 are described in, for the Rev-RRE complex, a structural model for the HIV-1 Rev-RRE complex deduced from altered-specificity rev variants isolated by a rapid genetic strategy Cell 1996 Oct 4; 87 (1):.. 115-25 are described in, for U1A spliceosomal protein, Crystal structure at 1.92 a resolution of the RNA-binding domain of the U1A spliceosomal protein complexed with an RNA hairpin Nature 1994 Dec 1; 372 (6505) : it is described in the 432-8.

また、Zn Fingerタンパク質とRNAの相互作用に関する文献としては、Friesen WJ, et al. Specific RNA binding proteins constructed from zinc fingers. Nat Struct Biol. 1998 Jul;5(7):543-6;McColl DJ, et al. Structure-based design of an RNA-binding zinc finger. Proc Natl Acad Sci US A. 1999 Aug 17;96(17):9521-6; Friesen WJ, et al. Phage display of RNA binding zinc fingers from transcription factor IIIA. J Biol Chem. 1997 Apr 25;272(17):10994-7; Theunissen O, et al. RNA and DNA binding zinc fingers in Xenopus TFIIIA. Cell. 1992 Nov 13;71(4):679-90; Clemens KR, et al. Molecular basis for specific recognition of both RNA and DNA by a zinc finger protein. Science. 1993 Apr 23;260(5107):530-3;及び Joho KE, et al. A finger protein structurally similar to TFIIIA that binds exclusively to 5S RNA in Xenopus. Cell. 1990 Apr 20;61(2):293-300などが挙げられる。 As the literature on the interaction of Zn Finger proteins and RNA, Friesen WJ, et al Specific RNA binding proteins constructed from zinc fingers Nat Struct Biol 1998 Jul; 5 (7):... 543-6; McColl DJ, et .. al Structure-based design of an RNA-binding zinc finger Proc Natl Acad Sci US A. 1999 Aug 17; 96 (17):. 9521-6; Friesen WJ, et al Phage display of RNA binding zinc fingers from transcription factor . IIIA J Biol Chem 1997 Apr 25; 272 (17):. 10994-7; Theunissen O, et al RNA and DNA binding zinc fingers in Xenopus TFIIIA Cell 1992 Nov 13; 71 (4):... 679-90; .. Clemens KR, et al Molecular basis for specific recognition of both RNA and DNA by a zinc finger protein Science 1993 Apr 23; 260 (5107):.. 530-3; and Joho KE, et al A finger protein structurally similar to .. TFIIIA that binds exclusively to 5S RNA in Xenopus Cell 1990 Apr 20; 61 (2): 293-300, and the like.

本発明のDNA構築物の他の好ましい態様においては、該DNA構築物から発現する融合された転写産物が終止コドンを欠損するように該DNA構築物が改変されている。 In another preferred embodiment of the DNA construct of the present invention, the DNA construct as a fusion transcripts expressed from the DNA construct lacking a termination codon is modified. これにより転写産物と翻訳産物を含む複合体からのリボソームの遊離を遅延させ、複合体を安定化することができる。 Thus delaying the release of the ribosome from the complex comprising the transcript translation product, it is possible to stabilize the complex.

上記本発明のDNA構築物は、例えば、転写産物と翻訳産物の複合体を安定化させる機能を有するDNAを、任意のポリペプチドをコードするDNAを含むベクターに挿入することにより調製することができる。 The DNA construct of the present invention, for example, can be prepared by inserting a complex of transcripts and translation products of DNA having the function of stabilizing, a vector comprising DNA encoding any polypeptide. また、転写産物と翻訳産物の複合体を安定化させる機能を有するDNAと該任意のポリペプチドをコードするDNAのクローニング部位とを含むベクターの該クローニング部位に、任意のポリペプチドをコードするDNAを挿入することにより調製することもできる。 Further, to the cloning site of a vector containing a cloning site of the DNA encoding the DNA and said any polypeptide having a function of stabilizing a complex of transcripts and translation products, the DNA encoding any polypeptide It can also be prepared by inserting.

本発明は、また、このようにして上記DNA構築物を調製するために用いる、<1>任意のポリペプチドをコードするDNAの転写産物と翻訳産物の複合体を安定化させる機能を有するDNAを含むDNA構築物、および<2>任意のポリペプチドをコードするDNAの転写産物と翻訳産物の複合体を安定化させる機能を有するDNAと、該任意のポリペプチドをコードするDNAのクローニング部位とを含むDNA構築物、を提供する。 The present invention is also, in this way used to prepare the DNA construct comprises a DNA having a function of stabilizing a complex of <1> any transcript of DNA encoding a polypeptide translation product DNA comprising the DNA construct, and <2> and DNA having the function of stabilizing the complex of any transcript of DNA encoding a polypeptide translation product, and a cloning site of a DNA encoding the any polypeptide It constructs, to provide.

本発明における、mRNAとDNAとからなる核酸構築物は、(i)DNA結合タンパク質をコードするRNAと任意のポリペプチドをコードするRNAとの融合mRNAと、(ii)(i)の融合mRNAの翻訳産物が結合するDNA領域を含むDNAとの複合体である。 In the present invention, a nucleic acid construct comprising the mRNA and DNA is, (i) and fusion mRNA with RNA encoding RNA and any polypeptide encoding the DNA binding protein, translation fusion mRNA of (ii) (i) product is a complex with DNA that contains the DNA regions that bind. 該核酸構築物における(i)のmRNAと(ii)のDNAは、好ましくはハイブリダイズ(水素結合)することにより複合体を形成している。 DNA of the nucleic acid construct and mRNA of (i) (ii) are preferably form a complex by hybridization (hydrogen bonding). ハイブリダイズする塩基対の数は、該核酸構築物における(i)のmRNAと(ii)のDNAとが安定的に結合しうる限り特に制限はないが、好ましくは10塩基対以上である。 The number of hybridizing base pairs is not particularly limited as long as the nucleic acid construct and mRNA of (i) and DNA of (ii) can bind stably, preferably 10 or more base pairs.

該核酸構築物における(i)のmRNAを鋳型に逆転写反応を行えば、該mRNAに対応するDNAを合成することができる。 In the nucleic acid construct of mRNA (i) by performing a reverse transcription reaction as a template, it can be synthesized DNA corresponding to the mRNA. これにより転写産物と翻訳産物に加えて、それらをコードするDNAを複合体の構成要素とすることができる。 Thus in addition to the transcript and translation product, the DNA encoding them may be a component of the complex.

該核酸構築物が、(i)のmRNAの3'側領域と(ii)のDNAの3'側領域がハイブリダイズしている核酸構築物として調製されている場合には、(i)のmRNAを鋳型に(ii)のDNAをプライマーとした逆転写反応を行うことが可能である。 The nucleic acid construct, if they are prepared as a nucleic acid construct which side region 3 'of the DNA of the side region and (ii)' is hybridized 3 of the mRNA of (i) is a template mRNA for (i) DNA it is possible to carry out the reverse transcription reaction as a primer of the (ii).

(ii)のDNAを逆転写反応のプライマーとせず、他のプライマーを用いる場合には、核酸構築物において(i)のmRNAと(ii)のDNAの3'側領域同士がハイブリダイズしている必要はなく、5'側領域同士がハイブリダイズしてもよい。 Without primer for the reverse transcription reaction the DNA of (ii), in the case of using the other primer must in the nucleic acid construct 3 'side region between the DNA of the mRNA (ii) of (i) hybridizing rather, 5 'each other side region may hybridize. この場合、逆転写反応を行うためには、反応系にプライマー((i)のmRNAに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド)を添加することが必要である。 In this case, in order to carry out the reverse transcription reaction, it is necessary to add the primer ((oligonucleotide that hybridizes specifically to the mRNA of i)) to the reaction system.

本発明のmRNAとDNAとからなる核酸構築物の調製のための、mRNAとDNAとの結合に関しては、文献(FEBS Lett 2001 Nov 23;508(3):309-12)を参照のこと。 For the preparation of nucleic acid constructs comprising a mRNA and the DNA of the present invention, for binding to the mRNA and DNA are literature (FEBS Lett 2001 Nov 23; 508 (3): 309-12) See.

(2)転写産物と翻訳産物の複合体の製造方法 本発明は、また、上記した転写産物と翻訳産物の複合体を製造する方法を提供する。 (2) TECHNICAL FIELD The present invention of a complex transcripts and translation products, also provides a method for producing a complex of the transcription product and translation product. この製造方法の一つの態様においては、上記DNA構築物を適当な転写・翻訳系に添加または導入することにより、(i)任意のポリペプチドをコードするDNAと(ii)該DNAの転写産物と翻訳産物の複合体を安定化させる機能を有するDNAとの融合DNAを発現させることを特徴とする。 In one embodiment of this manufacturing method, by adding or introducing the DNA construct into an appropriate transcription-translation system, DNA and (ii) the DNA of transcripts encoding any polypeptide (i) Translation characterized in that the expression of the fusion DNA with DNA having a function of stabilizing a complex product. この融合DNAの発現で生じる転写産物と翻訳産物は、翻訳産物に含まれるリボソームを不活性化するポリペプチドの作用により、あるいは、翻訳産物に含まれるRNA結合タンパク質と転写産物に含まれるその結合部位との相互作用により、安定的な複合体を形成する。 And translation product transcripts generated in the expression of the fusion DNA, its binding site by the action of a polypeptide that inactivates ribosomes contained in the translation product, or contained in the RNA-binding protein transcript contained translation products by interaction with, to form a stable complex.

この製造方法の他の態様においては、上記RNAとDNAとからなる核酸構築物を適当な転写・翻訳系に添加または導入することにより、該核酸構築物における(i)のmRNAを翻訳させ、その翻訳産物を該核酸構築物における(ii)のDNAに結合させることを特徴とする。 In another embodiment of this manufacturing method, by adding or introducing a nucleic acid construct comprising the above RNA and DNA in a suitable transcription and translation system, to translate the mRNA of the nucleic acid constructs (i), its translation product the characterized in that to bind to DNA in the nucleic acid construct (ii). 翻訳産物に含まれるDNA結合タンパク質と該核酸構築物における(ii)のDNAとの相互作用により、安定的な複合体が形成される。 By interaction with the DNA of the DNA binding protein and the nucleic acid construct is contained in the translation product (ii), a stable complex is formed. 該複合体における(i)のmRNAを鋳型に逆転写反応を行い、(ii)のDNAを伸長させることにより、該mRNAに対応するDNAを合成することができる。 MRNA of (i) in the complex by reverse transcription reaction as a template, by extending the DNA of (ii), it is possible to synthesize DNA corresponding to the mRNA. (i)のmRNAの3'側領域と(ii)のDNAの3'側領域がハイブリダイズしている核酸構築物を用いた場合には、(ii)のDNAをプライマーとして逆転写反応を行うことができる。 If the side region 3 'of the DNA of the side region and (ii) the 3' mRNA of (i) was used nucleic acid construct that hybridized, carrying out the reverse transcription reaction as a primer the DNA of (ii) can.

本方法で用いる転写・翻訳系としては、無細胞転写・翻訳系又は生細胞などが挙げられる。 The transcription-translation system used in this method, such as a cell-free transcription and translation system or live cells. 無細胞転写・翻訳系又は生細胞などは、本発明の核酸構築物を添加し又は導入することによって、該核酸構築物からの転写産物および翻訳産物の発現(mRNAとDNAとからなる核酸構築物を用いる場合には、翻訳産物の発現)を保証するものである限り制限されない。 If such cell-free transcription-translation system or living cells, by adding or introducing a nucleic acid construct of the present invention, using nucleic acid construct comprising a expression of transcription and translation products from the nucleic acid constructs (the mRNA and DNA the not limited as long as it guarantees the translational expression of the product). 本方法では、好ましくは無細胞の転写・翻訳系、特に好ましくは、細胞抽出物から構成される転写・翻訳系を使用することができる。 In this method, preferably transcription-translation system cell-free, particularly preferably, it is possible to use transfer-translation systems composed from a cell extract.

無細胞転写・翻訳系としては、原核又は真核生物の抽出物により構成される無細胞転写・翻訳系、例えば大腸菌、ウサギ網状赤血球、小麦胚芽抽出物などが使用できる。 The cell-free transcription-translation systems, cell-free transcription-translation system constituted by extracts of prokaryotic or eukaryotic, such as Escherichia coli, rabbit reticulocytes, wheat germ extract, can be used. また、生細胞翻訳系としては、原核又は真核生物、例えば大腸菌の細胞などが使用できる。 As the raw translation systems, prokaryotic or eukaryotic, such as Escherichia coli cells can be used.

本方法により得られる、転写産物と翻訳産物を含む複合体も本発明の範囲内である。 Obtained by the present method, the complex containing transcripts and translation products are within the scope of the present invention. このような複合体は安定に存在することができ、後述するように特定の標的物質と相互作用するポリペプチドやそれをコードするmRNA若しくはDNAのスクリーニングなどに供することができる。 Such complexes can be stably present, it can be subjected to such a specific target substance that interacts with a polypeptide or mRNA or DNA screening encoding it as described below.

(3)特定の標的物質に結合するポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードするmRNA若しくはDNAのスクリーニング方法 本発明は、また、特定の標的物質に結合するポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードするmRNA若しくはDNAをスクリーニングする方法を提供する。 (3) Screening The present invention is of a particular mRNA or DNA encoding the polypeptide or said polypeptide binds to a target substance, also, mRNA or DNA encoding the polypeptide or said polypeptide to bind to a particular target substance It provides a method of screening.

本発明の方法の第一の態様は、本発明のDNA構築物を用いる態様である。 First embodiment of the method of the present invention is a mode of using the DNA construct of the present invention. この態様においては、まず、上記DNA構築物における(i)任意のポリペプチドをコードするDNAと(ii)該DNAの転写産物と翻訳産物の複合体を安定化させる機能を有するDNAとの融合DNAを発現させ、該融合DNAの転写産物と翻訳産物を含む複合体を形成させ(工程(a))、次いで、特定の標的物質と、工程(a)で形成された複合体とを接触させ(工程(b))、次いで、該標的物質に結合した複合体を回収する(工程(c))。 In this embodiment, first, a fusion DNA with DNA having a function of stabilizing a complex of DNA and (ii) the DNA of the transcription product and translation product encoding the (i) any polypeptide in the DNA construct expressed, to form a complex comprising a transcription product and translation product of the fusion DNA (step (a)), then contacted with a specific target substance, formed in step (a) the complex (step (b)), then recovered complex bound to the target substance (step (c)).

本発明の方法の第二から第四の態様は、本発明のmRNAとDNAとからなる核酸構築物を用いる態様である。 Second from the fourth embodiment of the method of the present invention is a mode of using a nucleic acid construct comprising a mRNA and the DNA of the present invention.

第二の態様は、逆転写反応を行う工程を含まない態様である。 The second mode is a mode that does not include a step of performing a reverse transcription reaction. 第二の態様においては、まず、本発明のmRNAとDNAとからなる核酸構築物における(i)のmRNAを翻訳させることにより、翻訳産物を該核酸構築物における(ii)に記載のDNAに結合させ、該翻訳産物と該核酸構築物を含む複合体を形成させ(工程(a))、次いで、該特定の標的物質と、工程(a)で形成された複合体とを接触させ(工程(b))、次いで、該標的物質に結合した複合体を回収する(工程(c))。 In a second aspect, first, by translation in a nucleic acid construct comprising a mRNA and the DNA of the present invention the mRNA of (i), to bind to DNA as described in (ii) in the nucleic acid construct translation product, to form a complex containing the translation product and the nucleic acid construct (process (a)), then the said particular target substance is brought into contact with the complex formed in step (a) (step (b)) , then recovered complex bound to the target substance (step (c)).

本発明の方法の第三および第四の態様は逆転写反応を行う工程を含む態様である。 Third and fourth aspects of the method of the present invention are embodiments comprising the step of performing a reverse transcription reaction. 第三の態様は、標的物質と複合体との結合前に、逆転写反応を行う態様であり、第四の態様は、標的物質と複合体との結合後に、逆転写反応を行う態様である。 Third aspect, before binding to the target substance and the complex is an embodiment of performing a reverse transcription reaction, the fourth aspect, after binding to the target substance and the complex, it is a manner of performing a reverse transcription reaction .

本発明の方法の第三の態様においては、まず、本発明のmRNAとDNAとからなる核酸構築物における(i)のmRNAを翻訳させ、翻訳産物を該核酸構築物における(ii)に記載のDNAに結合させることにより、該翻訳産物と該核酸構築物とを含む複合体を形成させ(工程(a))、次いで、工程(a)で形成された複合体に逆転写酵素を接触させて、該複合体における(i)のmRNAを鋳型に、逆転写反応を行うことにより、該複合体における(ii)のDNAを伸長させ(工程(b))、次いで、該特定の標的物質と、工程(b)で形成された複合体とを接触させ(工程(c))、次いで、該標的物質に結合した複合体を回収する(工程(d))。 In a third aspect of the method of the present invention, firstly, in the nucleic acid construct consisting of mRNA and DNA of the present invention the mRNA of (i) is translated, the DNA according to the translation product in (ii) in the nucleic acid construct by binding to form a complex containing the said translation product and the nucleic acid construct (process (a)), then contacted a reverse transcriptase complex formed in step (a), the said composite in the body of mRNA (i) as a template by performing the reverse transcription reaction, it is extended to the DNA of (ii) in the complex (step (b)), then the said particular target substance, the step (b ) is the contact between the complex formation in (step (c)), then recovered complex bound to the target substance (step (d)).

本発明の方法の第四の態様においては、本発明のmRNAとDNAとからなる核酸構築物における(i)のmRNAを翻訳させ、翻訳産物を該核酸構築物における(ii)に記載のDNAに結合させることにより、該翻訳産物と該核酸構築物とを含む複合体を形成させ(工程(a))、次いで、該特定の標的物質と、工程(a)で形成された複合体とを接触させ(工程(b))、次いで、該標的物質に結合した複合体に逆転写酵素を接触させて、該複合体における(i)のmRNAを鋳型に逆転写反応を行うことにより、該複合体における(ii)のDNAを伸長させ(工程(c))、次いで、該標的物質に結合している複合体を回収する(工程(d))。 In a fourth aspect of the method of the present invention, in the nucleic acid construct consisting of an mRNA with the DNA of the present invention the mRNA of (i) it is translated, to bind to the DNA according to (ii) in the nucleic acid construct translation product by, to form a complex containing the said translation product and the nucleic acid construct (process (a)), then contacted with the specific target substance, formed in step (a) the complex (step (b)), then contacted a reverse transcriptase complex bound to the target substance, by performing a reverse transcription reaction of mRNA in the complex (i) as a template, (ii in the complex DNA is the elongation) (step (c)), then recovered complex bound to the target material (step (d)).

本発明の方法の第三または第四の態様において、(i)のmRNAの3'側領域と(ii)のDNAの3'側領域がハイブリダイズしている核酸構築物を用いた場合には、逆転写反応を(ii)のDNAをプライマーとして簡便に行うことができる。 In the third or fourth aspect of the method of the present invention, when a nucleic acid construct side region 3 'of the DNA of the side region and (ii)' is hybridized 3 of the mRNA of (i) is DNA of the reverse transcription reaction (ii) can be carried out easily as primers.

本発明の方法における、標的物質としては特に限定されず、スクリーニングの目的に応じて種々の標的物質を用いることができる。 In the method of the present invention is not particularly restricted but includes the target substance, it is possible to use various target substances according to the purpose of screening. 標的物質の具体例としては、ペプチド、タンパク質、低分子化合物、リガンド、酵素、抗体、又は環境汚染物質などが挙げられる。 Specific examples of the target substance is a peptide, protein, small molecule compounds, ligands, enzymes, antibodies, or environmental pollution substances. 標的物質として、例えば、リガンドを用いれば、該リガンドに結合する受容体をスクリーニングすることができ、オーファン受容体のリガンドの同定などに有用である。 As a target substance, for example, the use of the ligand can be screened a receptor that binds to the ligand, it is useful for such identification of ligands of orphan receptors. 複合体の回収を容易にするために、標的物質を担体に固定しておくことが好適である。 To facilitate recovery of the complex, the target substance it is preferable to be fixed to the carrier. また、目的に応じて、複数種の標的物質が配置された基盤を用いて、スクリーニングを行ってもよい。 Also, depending on the purpose, with a foundation for a plurality of types of target substances are placed, it may be carried out screening.

本発明のスクリーニングの一例としては、以下の方法を挙げることができる。 As one example of screening of the present invention, there can be mentioned the following method. 本発明の核酸構築物を転写・翻訳後(mRNAとDNAとからなる核酸構築物を用いる場合には、翻訳後)、アガロース等の固相担体に結合した標的物質の懸濁液を添加し、一定期間保持することにより標的物質と目的遺伝子の産物とを結合させる。 After transcription and translation of the nucleic acid constructs of the present invention (in the case of using a nucleic acid construct comprising the mRNA and DNA are post-translationally), a suspension of the target substance bound to a solid support such as agarose was added, a period of time to bind the product of the target substance and the target gene by retaining. 未結合のmRNAとタンパク質を含む上清を、混合液から除去し、適当な緩衝液で固相担体を洗浄する。 The supernatant containing unbound mRNA and protein, were removed from the mixture, washing the solid phase carrier with a suitable buffer. 固相担体に結合したmRNA(またはDNA)を、尿素を含む溶液で高温にて溶出させることにより単離することができる。 The mRNA bound to a solid support (or DNA), can be isolated by eluting at elevated temperature with a solution containing urea.

また、本発明は、本発明のスクリーニングに用いるためのキットを提供する。 The present invention also provides a kit for use in screening of the present invention. 本発明のDNA構築物を用いたスクリーニングのためのキットには、例えば、<1>本発明のDNA構築物、<2>本発明のDNA構築物を調製するための、(i)任意のポリペプチドをコードするDNAの転写産物と翻訳産物の複合体を安定化させる機能を有するDNAを含むDNA構築物または(ii)任意のポリペプチドをコードするDNAの転写産物と翻訳産物の複合体を安定化させる機能を有するDNAと該任意のポリペプチドをコードするDNAのクローニング部位とを含むDNA構築物、<3>本発明のDNA構築物の発現により形成される複合体、のいずれか一つまたは複数の評品を含むことができる。 To a kit for the screening using a DNA construct of the present invention, for example, <1> DNA constructs of the present invention, for preparing a DNA construct of <2> present invention, (i) encode any polypeptide the function of stabilizing the complex of transcript and translation product of the DNA construct comprising a DNA having a function of stabilizing a complex or (ii) any transcript of a DNA encoding the polypeptide translation product of DNA DNA construct comprising a cloning site of the DNA encoding the DNA and said any polypeptide having, including <3> complex formed by expression of a DNA construct of the present invention, any one or more of commentary articles be able to.

また、本発明のmRNAとDNAとからなる核酸構築物を用いたスクリーニングのためのキットには、例えば、<1>本発明のmRNAとDNAとからなる核酸構築物、<2>本発明のmRNAとDNAとからなる核酸構築物の発現により形成される複合体(逆転写反応を行うことにより複合体中のmRNAに対応するDNAが合成されたものを含む)、のいずれか一つまたは双方の評品を含むことができる。 Further, the kit for mRNA and screened using a nucleic acid construct comprising a DNA of the present invention, for example, <1> A nucleic acid construct comprising a mRNA and the DNA of the present invention, mRNA and DNA in <2> the present invention comprising complexes formed by expression of a nucleic acid construct (by performing a reverse transcription reaction, including those DNA corresponding to the mRNA in the complex has been synthesized), one of or both of the commentary article from the it can be included.

以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例によって限定されることはない。 Illustrate the invention the following examples, but the present invention is not limited by the following examples.
[実施例1] [Example 1]
A. A. 方法 Method
(A−1)3種のタンパク質[DHFR-(RE) n ]の調製 Preparation of (A-1) 3 kinds of proteins [DHFR- (RE) n]
DHFR-(RE) 1-3融合タンパク質の調製に際して、プラスミドpTZDHFR20由来(Blakley, RL In Folates and Pterins; Blakley, RL; Benkovic, S. J,, Eds.;Wiley: New York, 1985; pp. 191-253)の、PstI部位をその3'末端に有するDHFRの遺伝子を、プラスミドpET30a(Novagen、Madison、WI)に挿入した。 DHFR- In (RE) 1-3 Preparation of a fusion protein, derived from plasmid pTZDHFR20 (Blakley, RL In Folates and Pterins; Blakley, RL; Benkovic, S. J ,, Eds; Wiley:.. New York, 1985; pp 191 of -253), the gene of DHFR with PstI site at its 3 'end, was inserted plasmid pET30a (Novagen, Madison, the WI). REペプチド(38アミノ酸;RKKRR QRRRP PQGSQ TBQVS LSKQP TSQSR GDPTG PKE(配列番号3))をコードするセンスおよびアンチセンスのオリゴヌクレオチドを合成し、アニーリングさせ、rTaqポリメラーゼ(Takara Shuzo Co., Kyoto, Japan)を用いて伸長した。 RE peptide; was synthesized (38 amino acids RKKRR QRRRP PQGSQ TBQVS LSKQP TSQSR GDPTG PKE (SEQ ID NO: 3)) encoding the sense and antisense oligonucleotides, annealed, rTaq polymerase (Takara Shuzo Co., Kyoto, Japan) and It was extended using. 得られたdsDNAをPstI部位とEcoT22I部位で切断して、PstI部位でDHFR遺伝子の3'側に挿入した。 The resulting dsDNA is cut with PstI site and EcoT22I site was inserted at the 3 'end of the DHFR gene in the PstI site. PstIとEcoT22Iの制限部位は連結し、連結した部位はPstIまたはEcoT22Iのいずれでも切断されないので、REペプチドをコードする配列をDHFRの遺伝子の3'末端にあるPstI部位に連続的に結合させて、pDHFR-(RE) 1からpDHFR-(RE) 3までを得た。 Restriction sites PstI and EcoT22I is connected, so linked sites is not cut either PstI or EcoT22I, continuously coupled to form a sequence encoding the RE peptide into the PstI site at the 3 'end of the gene of DHFR, pDHFR- was obtained (RE) from 1 to pDHFR- (RE) 3. これらのプラスミドを用いて大腸菌NovaBlue(DE3)(Novagen)にトランスフェクションし、得られた菌をLB培地500ml中で30℃にてインキュベートした。 Transfected into E. coli NovaBlue (DE3) (Novagen) by using these plasmids, obtained cells were incubated at 30 ° C. in LB medium 500 ml. 対数増殖期に、IPTG(イソプロピル-1-チオ-β-D-ガラクトシド)を1mM添加して、30℃で4時間インキュベートした。 The logarithmic growth phase, IPTG (isopropyl-1-thio-beta-D-galactoside) was added 1 mM, was incubated for 4 h at 30 ° C.. タンパク質は、ポリヒスチジンタグを付加したポリペプチドとして発現させた。 Protein was expressed as a polypeptide obtained by adding a poly-histidine tag. HisTrap TMキレーティングキット(Amersham Pharmacia Biotech Uppsala, Sweden)を取扱説明書に従って使用して、タンパク質を精製し、HiTrap TM脱塩システム(Amersham Pharmacia Biotech)を用いて低分子物質を除いた。 HisTrap TM Chelating kit (Amersham Pharmacia Biotech Uppsala, Sweden) and used in accordance with the instruction manual, and protein was purified to remove low molecular substances by using a HiTrap TM desalination system (Amersham Pharmacia Biotech). さらに、分解されたタンパク質を除くために、HiTrap TM SP (Amersham Pharmacia Biotech)陽イオン交換HPLCを行った。 Furthermore, in order to remove the decomposed protein, HiTrap TM SP (Amersham Pharmacia Biotech ) was performed cation exchange HPLC. タンパク質の純度は、SDS-PAGEで調べた。 The purity of the protein was examined by SDS-PAGE. 結果を図1に示す。 The results are shown in Figure 1. 精製タンパク質の濃度は、BCAアッセイキット(Pierce、Rockford, IL)で測定した。 The concentration of purified protein was determined by BCA assay kit (Pierce, Rockford, IL).

(A−2)3種のタンデムRNAアプタマー[(Apt) n ]の調製 Preparation of (A-2) 3 types of tandem RNA aptamers [(Apt) n]
タンデムTatアプタマー[(Apt) 1-3 ]の調製のために、センスとアンチセンスのオリゴヌクレオチド(5'-AAA AAA CGA AGC TTG ATC CCG TTT GCC GGT CGA TCG CTT CG-3'(配列番号4)および5'-TTT TTT CGA AGC GAT CGA CCG GCA AAC GGG ATC AAG CTT C-3'(配列番号5))を合成した。 Tandem Tat aptamer for the preparation of [(Apt) 1-3], sense and antisense oligonucleotide (5'-AAA AAA CGA AGC TTG ATC CCG TTT GCC GGT CGA TCG CTT CG-3 '( SEQ ID NO: 4) and 5'-TTT TTT CGA AGC GAT CGA CCG GCA AAC GGG ATC AAG CTT C-3 '(SEQ ID NO: 5)) was synthesized. これらのオリゴヌクレオチドをアニールさせて、DNAライゲーションキットバージョン2(Takara Shuzo Co.)を用いて連結することにより、タンデムにつながったTatアプタマー[(Apt) 1-3 ]を得た。 These oligonucleotides were annealed, by coupling with a DNA Ligation Kit Version 2 (Takara Shuzo Co.), to obtain a Tat aptamer that led to tandem [(Apt) 1-3]. 1〜3個のTatアプタマーをコードする連結したDNA配列を、クローニング(TA Clonign Kit, Invitrogen Carlsbad, CA)した後、単離した。 The DNA sequence linked coding 1-3 Tat aptamer, cloned (TA Clonign Kit, Invitrogen Carlsbad, CA) and then, was isolated. 1〜3個のアプタマーをコードするDNAを、T7 Ampliscribeキット(Epicentre Technologies, Madison, WI)を用いて、転写した。 DNA encoding the 1-3 aptamers, T7 Ampliscribe kit (Epicentre Technologies, Madison, WI) was used to transfer.

(A−3)解離定数(K d )の測定 (A-3) Measurement of the dissociation constant (K d)
ゲル移動度シフトアッセイのために、各々の転写アプタマー[(Apt) 1-3 ]を15%ポリアクリルアミド変性ゲルによるPAGEにより単離して、アルカリホスファターゼ(E.coli A19; Takara Syuzo Co., Kyoto, Japan)で37℃で1時間処理して、5'末端を脱リン酸化した。 For gel mobility shift assay, isolated by PAGE respective transfer aptamers [(Apt) 1-3] by 15% polyacrylamide denaturing gel, alkaline phosphatase (E.coli A19; Takara Syuzo Co., Kyoto, and 1 hour at 37 ° C. in japan), to dephosphorylate 5 'ends. その後、T4ポリヌクレオチドキナーゼを37℃で1時間作用させて、該アプタマーを32 Pで標識し、PAGE(15%ポリアクリルアミド)により精製した。 Then, by the action 1 hour at 37 ° C. with T4 polynucleotide kinase to label the aptamer with 32 P, it was purified by PAGE (15% polyacrylamide). 一定の濃度の5'末端標識化アプタマーに40 nMのtRNAを加えて、Tat結合緩衝液[10 mM Tris-HCl(pH 8.0),70 mM NaCl,2 mM EDTA,および0.1% Nonidet P-40]中で95℃で3分間処理して変性させ、室温に放置して再生させ、続いて、Tat結合緩衝液中の過剰濃度範囲内のDHFR-(RE) 1-3を総容量が10μlになるように混合し、30℃で一時間以上処理した。 Adding 40 nM of the tRNA to the 5 'end-labeled aptamer constant concentration, Tat binding buffer [10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 70 mM NaCl, 2 mM EDTA, and 0.1% Nonidet P-40] was treated for 3 minutes to denature at 95 ° C. in a medium, is reproduced left at room temperature, followed by the total capacity of DHFR- (RE) 1-3 in excess concentration range of Tat binding buffer becomes 10μl It was mixed so was treated over one hour at 30 ° C.. 遊離のRNA、および、タンパク質に結合したRNA、またはペプチドに結合したRNAは、5〜15%の非変性ポリアクリルアミドゲルを用いて0.5×TBE(Tris-ホウ酸/EDTA)緩衝液中で電気泳動することにより分離し、解析した。 Free RNA, and, RNA bound to the protein or peptide bound to the RNA, is, 0.5 × TBE (Tris- Borate / EDTA) electrophoresis buffer using a 5-15% non-denaturing polyacrylamide gels separated by and analyzed.

(A−4)pDHFR-(RE) 3 -(Apt) 3 (野生型)、pMuDHFR-(RE) 3 -(Apt) 3 (変異型)、pDHFR-(RE) 3 (対照)の構築 (A-4) pDHFR- (RE ) 3 - Construction of (Apt) 3 (variant), pDHFR- (RE) 3 (Control) - (Apt) 3 (wild-type), pMuDHFR- (RE) 3
DHFRのコア領域に部位特異的変異を導入するために、4つのオリゴヌクレオチド(5'-ACA ATT CCC CTC TAG AAA TA-3'(配列番号6)、5'-GTG GTG GTG CTC GAG AAT TC-3'(配列番号7)、5'-CCT GCC GCC CTC GCC TGG GCC AAA CGC AAC ACC TTA AAT AAA-3'(配列番号8)、および5'-GCG TTT GGC CCA GGC GAG GGC GGC AGG CAG GTT CCA CGG-3'(配列番号9))を調製した。 To introduce site-specific mutations in the core region of the DHFR, 4 one oligonucleotide (5'-ACA ATT CCC CTC TAG AAA TA-3 '(SEQ ID NO: 6), 5'-GTG GTG GTG CTC GAG AAT TC- 3 '(SEQ ID NO: 7), 5'-CCT GCC GCC CTC GCC TGG GCC AAA CGC AAC ACC TTA AAT AAA-3' (SEQ ID NO: 8), and 5'-GCG TTT GGC CCA GGC GAG GGC GGC AGG CAG GTT CCA CGG-3 '(SEQ ID NO: 9)) was prepared. これらのオリゴヌクレオチドとメガプライマーPCR突然変異誘発法を用いて、DHFRの遺伝子に2つの変異を導入することにより、pMuDHFR-(RE) 3を構築した。 Using these oligonucleotides and megaprimer PCR mutagenesis, by introducing two mutations in the gene of DHFR, was constructed pMuDHFR- (RE) 3. 次に、タンデムの3つのアプタマー配列(Apt) 3を、pDHFR-(RE) 3とpMuDHFR-(RE) 3内のREペプチドの下流にあるEco RI部位に導入し、pDHFR-(RE) 3 -(Apt) 3 (野生型)、およびpMuDHFR-(RE) 3 -(Apt) 3 (変異型)を得た。 Next, three of the aptamer sequence of the tandem (Apt) 3, was introduced into the Eco RI site downstream of pDHFR- (RE) 3 and pMuDHFR- (RE) 3 in the RE peptide, pDHFR- (RE) 3 - (Apt) 3 (wild-type), and pMuDHFR- (RE) 3 - was obtained (Apt) 3 (variant).

(A−5)(Apt) 3 と(RE) 3 との相互作用による、遺伝子型と表現型の連結 Due to the interaction of (A-5) (Apt) 3 and (RE) 3, coupling of genotype and phenotype
32 Pで標識されたキャップ化(キャップ構造アナログ;New England Bio Labs, Beverly, MA)mRNAを得るために、直鎖状プラスミド[pDHFR-(RE) 3 -(Apt) 3 (野生型)、pMuDHFR-(RE) 3 -(Apt) 3 (変異型)、pDHFR-(RE) 3 (対照)]を、T7Ampliscribe TMキット(Epicentre Technologies, Madison, WI)を用いて37℃で2時間処理して、in vitroで転写させた。 32 P-labeled were capped (cap structure analog; New England Bio Labs, Beverly, MA) to obtain the mRNA, linear plasmid [pDHFR- (RE) 3 - ( Apt) 3 ( wild-type), pMuDHFR - (RE) 3 - (Apt ) 3 ( variant), PDHFR- the (RE) 3 (control)], T7Ampliscribe TM kit (Epicentre Technologies, Madison, WI) and 2 hours at 37 ° C. using a It was transcribed in in vitro. 標識化mRNAをNICK TMカラム(Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)で精製した。 Labeled mRNA NICK TM column (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden ) was purified. DHFR-(RE) 3 (野生型)、またはMuDHFR-(RE) 3 (変異型)をコードするキャップ化mRNA 1μgを、30℃で20分間ウサギ網状赤血球細胞溶解液20μl中で翻訳させた(Rabbit Reticulocyte Lysate System; Promega, Madison, WI)。 DHFR- (RE) 3 (wild-type), or MuDHFR- capped mRNA 1 [mu] g encoding (RE) 3 (mutant) were translated in 20 minutes rabbit reticulocyte cell lysate 20μl at 30 ° C. (by Rabbit Reticulocyte Lysate System; Promega, Madison, WI). 対照として、アプタマーを含まないmRNAを翻訳させた(対照)。 As a control, was the translation of the mRNA that does not contain the aptamer (control). それぞれのタンパク質は、 35 Sで標識した。 Each protein was labeled with 35 S. 翻訳後、結合緩衝液[10 mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)、70 mM NaCl、10μl tRNA] 180μlと、無水コハク酸で予め処理してMTX-アガロースビーズ(Sigma, St Louis, MO)の正電荷を中和しておいたMTX-アガロースビーズ懸濁液20μlとを細胞溶解液に添加し、30分間4℃にて結合させた。 After translation, binding buffer [10 mM sodium phosphate buffer (pH7.5), 70 mM NaCl, 10μl tRNA] 180μl and, previously treated with succinic anhydride MTX- agarose beads (Sigma, St Louis, MO) and MTX- agarose bead suspension 20μl which had been neutralized positive charge was added to the cell lysate and allowed to bind for 30 minutes at 4 ° C. for. 未結合のmRNAとタンパク質を含む上清200μlを、混合液から除去し、結合緩衝液180μlで2回MTX-ビーズを洗浄した。 The supernatant 200μl containing unbound mRNA and protein, were removed from the mixture and washed twice MTX- beads with the binding buffer 180 [mu] l. 結合したmRNAとタンパク質を、SDSを含む溶液と一緒に高温(95℃)で溶出させることによりMTX-ビーズから単離した。 Bound mRNA and protein were isolated from MTX- beads by eluting with a high temperature (95 ° C.) with a solution containing SDS. その後、各サンプルを15%ゲルにてSDS-PAGEに供した。 Then subjected to SDS-PAGE of each sample at 15% gel.

(A−6)ストレプトアビジンmRNAとDHFR mRNAの混合物のプールから、ストレプトアビジンをコードするmRNAのin vitroでの選択 From the pool of (A-6) a mixture of streptavidin mRNA and DHFR mRNA, the selection of the in vitro of mRNA encoding streptavidin
pDHFR-(CQ) 3 -(Apt) 3の構築は、pDHFR-(RE) 3 -(Apt) 3の構築に準じて行った。 pDHFR- (CQ) 3 - (Apt ) 3 of the building, pDHFR- (RE) 3 - was carried out in accordance with the construction of (Apt) 3. 簡単に述べると、CQペプチド(36アミノ酸;CFTTK ALGIS YGRKK RRQRR RPPQG SQTBQ VSLSK Q)(配列番号10)をコードするセンスとアンチセンスのオリゴヌクレオチドを合成し、得られたCQペプチドを含む断片をDHFR配列とアプタマー配列の間に導入した。 Briefly, CQ peptide (36 amino acids; CFTTK ALGIS YGRKK RRQRR RPPQG SQTBQ VSLSK Q) (SEQ ID NO: 10) was synthesized sense and antisense oligonucleotides encoding fragments of DHFR sequences containing the obtained CQ peptide and it was introduced between the aptamer sequence. ストレプトアビジンをコードする鋳型DNAは既報である。 Template DNA encoding the streptavidin is previously reported. ストレプトアビジン遺伝子を含むDNA断片はCQペプチド配列の上流にDHFR遺伝子と置換して挿入した。 DNA fragments containing the streptavidin gene was inserted by replacing the DHFR gene upstream of CQ peptide sequence. それぞれの32 Pで標識したRNA[ストレプトアビジン-(CQ) 3 -(Apt) 3とDHFR-(CQ) 3 -(Apt) 3 ]は上記の通り調製した。 Labeled RNA in each 32 P [streptavidin - (CQ) 3 - (Apt ) 3 and DHFR- (CQ) 3 - (Apt ) 3] was prepared as described above. 3種のmRNAの組み合わせ(ストレプトアビジンまたはDHFRをコードするmRNAをそれぞれ1:1の比で混合したmRNA、または、対照としていずれかのmRNA)(各組み合わせにおいて、総量1.25μg)を、30℃で20分間細胞溶解液中(25μl)にて翻訳させた。 Three mRNA combinations (mRNA encoding streptavidin or DHFR, respectively 1: mixed mRNA 1 ratio, or either mRNA as a control) (in each combination, the total amount 1.25 [mu] g) and, at 30 ° C. It was translated in 20 min cell lysate (25 [mu] l). 翻訳後、結合緩衝液[20 mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH8.0)、70 mM NaCl, 10μl tRHA] 180μlと、ビオチン-アガロースビーズ(Sigma, St Louis, MO)の懸濁液20μlとを細胞溶解液に添加し、10分間氷上にて結合させた。 After translation, binding buffer [20 mM sodium phosphate buffer (pH8.0), 70 mM NaCl, 10μl tRHA] and 180 [mu] l, biotin - agarose beads (Sigma, St Louis, MO) and a suspension 20μl cells It was added to the solution and allowed to bind on ice for 10 minutes. 未結合のmRNAとタンパク質を含む上清(200μl)を、混合液から除去し、結合緩衝液180μlでビオチン-ビーズを2回洗浄した。 The supernatant (200 [mu] l) containing unbound mRNA and protein, were removed from the mixture, biotin binding buffer 180 [mu] l - washing the beads twice. 結合したmRNAを、尿素を含む溶液とともに高温(95℃)にて溶出させることによりビオチン-ビーズから単離した。 Isolated from the beads - bound mRNA, biotin by eluting with a solution containing urea at a high temperature (95 ° C.). その後、各サンプルを、4%ゲルの変性PAGEに供した。 Thereafter, each sample was subjected to denaturing PAGE 4% gel.

(A−7)機能性タンパク質の選択における、リボゾームディスプレイ系と(RE) 3 と(Apt) 3 との強い相互作用の組み合わせ In the selection of (A-7) a functional protein, a combination of strong interaction with ribosome display systems (RE) 3 and (Apt) 3
上記の、DHFR遺伝子(pDHFR)を含むpET30aとpDHFR-(RE) 3 -(Apt) 3のプラスミドを、各々 32 Pで標識したmRNA[DHFR-(RE) 3 -(Apt) 3、 DHFR+Stop、およびDHFR-Stop mRNA]を調製するための鋳型として使用した。 Above, DHFR gene pET30a and pDHFR- (RE) 3 containing (pDHFR) - (Apt) 3 plasmids, each 32 P-labeled mRNA [DHFR- (RE) 3 - (Apt) 3, DHFR + Stop and DHFR-Stop mRNA] was used as a template to prepare. 32 Pで標識したmRNAを翻訳し、上述と同様、MTX-ビーズによる選択に供した。 32 The labeled mRNA was translated in P, as described above, they were subjected to selection by MTX- beads. 結合したmRNAを、高温にて溶出し、MTX-ビーズから単離した。 Bound mRNA, and eluted at a high temperature, it was isolated from MTX- beads. 選択されたmRNAの相対量は、 32 Pで標識したmRNAのカウントおよびRT-PCRにより検出した。 The relative amounts of selected mRNA was detected by counting and RT-PCR of the labeled mRNA with 32 P.

p(Apt) 3 -(RE) 3 -DHFRをpDHFR-(RE) 3 -(Apt) 3と同様の方法で構築した。 p (Apt) 3 - (RE ) a 3 -DHFR pDHFR- (RE) 3 - was constructed in the same manner as in (Apt) 3. in vitroでの転写に用いる直鎖状DNAは、T7プロモーター配列を含有する各鋳型プラスミド[p(Apt) 3 -(RE) 3 -DHFR、およびpDHFR]からのPCR産物として調製した。 linear DNA used for in vitro transcription, each template plasmid containing the T7 promoter sequence - was prepared as a PCR product from [p (Apt) 3 (RE ) 3 -DHFR, and pDHFR]. mRNAは、上述の方法で調製した。 mRNA was prepared by the method described above. 大腸菌の各終結因子(大腸菌のRE1〜RE3)についてポリクローナルIgG抗体を別々に調製した。 Polyclonal IgG antibodies were prepared separately for each termination factor of E. coli (RE1~RE3 E. coli). 最初のプールのmRNA総量は、2μgであった。 mRNA total amount of the first pool was 2μg. そして、直鎖状鋳型用大腸菌抽出液系(Promega, Madison, WI)を用いて、in vitroでの翻訳を37℃で10分間行った。 The linear template for E. coli extract based (Promega, Madison, WI) was performed using a 10 minutes at 37 ° C. The translation in in vitro. 翻訳反応を止めるために、翻訳産物を氷上で1分間静置して、上述の通り、MTX-ビーズを用いたin vitro選択を行った。 To stop the translation reaction, to stand 1 minute translation products on ice, as described above, we were subjected to in vitro selection using MTX- beads. 回収されたmRNAをRNeasy mini kit(QIAGEN, Hilden, Germany)により精製し、MMLV逆転写酵素(Promega)により逆転写を行った。 The recovered mRNA was RNeasy mini kit purification (QIAGEN, Hilden, Germany) by, were subjected to reverse transcription with MMLV reverse transcriptase (Promega). この逆転写されたサンプル、つまりcDNAをPCR(ExTaq;Takara)で増幅し、2.0%のアガロース電気泳動によって分析した。 The reverse transcribed samples, i.e. a cDNA PCR; amplified in (ExTaq Takara), and analyzed by 2.0% agarose electrophoresis. 半定量分析を行うために、アガロースゲルをSYBR Green I(Molecular Probes)で染色し、Fluoro Imager 595 (Molecular Dynamics)により解析した。 To perform semi-quantitative analysis, the agarose gel was stained with SYBR Green I (Molecular Probes), were analyzed by Fluoro Imager 595 (Molecular Dynamics). (RE) 3と(Apt) 3との相互作用の強度は、RT-PCR産物として回収されたmRNAの相対量に基づいて、推定した。 The intensity of interaction of (RE) 3 and (Apt) 3, based on the relative amount of recovered mRNA as RT-PCR products were estimated.

B. B. 結果及び考察 Results and Discussion
(B−1)タンデムにつながったアプタマーとTat由来ペプチドとの相互作用の増強 Enhancement of the interaction between (B-1) aptamer and Tat-derived peptides led to tandem
機能性タンパク質のモデルとして、ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)を選択した。 As a model for the functional protein, were selected dihydrofolate reductase (DHFR). その理由はその性質が良く解析されているためである(Blakley, RL他New York, 1985, pp.191-253. Taira, K. 他 J. Trends Biochem. Sci. 1987, 12, 275-278. Taira, K. 他 J. Med. Chem. 1988, 31, 129-137. Iwakura, M. 他 J. Biochem. 1995, 117, 480-488. Fujita, S. 他 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94, 391-396. Hamada, M. 他 J. Biochem. 1998, 123, 684-692)。 The reason is because the properties are well analyzed (Blakley, RL other New York, 1985, pp.191-253. Taira, K. other J. Trends Biochem. Sci. 1987, 12, 275-278. taira, K. other J. Med. Chem. 1988, 31, 129-137. Iwakura, M. other J. Biochem. 1995, 117, 480-488. Fujita, S. other Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94, 391-396. Hamada, M. other J. Biochem. 1998, 123, 684-692). 数個のアプタマーとTat由来ペプチド(RE)の結合親和力への影響を調べるために、3種のタンパク質[DHFR-(RE) n ](図1)と、3種のタンデムRNAアプタマー[(Apt) n ](図2A)を調製した。 To investigate the effect of the binding affinity of several aptamer and Tat-derived peptides (RE), three proteins [DHFR- (RE) n] (Fig. 1) and, three tandem RNA aptamers [(Apt) n] was prepared (Fig. 2A). この場合の「n」は1〜3の範囲内であり、それぞれのモチーフのコピー数に相当する。 "N" in this case is in the range of 1 to 3, corresponding to the number of copies of each motif. 精製タンパク質のSDS-PAGE後のバンドを図1に示した。 The band after SDS-PAGE of purified protein shown in Figure 1. 各タンパク質が予想通りDHFR活性を有していることを確認し、REペプチドモチーフの結合が、DHFRドメインの正確なフォールディングを干渉しないことを証明した。 Ensure that each protein has a predictably DHFR activity, binding of RE peptide motif was demonstrated to not interfere with the correct folding of the DHFR domain. それぞれのアプタマーの適切な二次構造を維持するため、Tatアプタマーを6つのアデノシンヌクレオチドを介して互いにタンデムに結合させて、(Apt) 2と(Apt) 3を得た。 To maintain the appropriate secondary structure for each aptamer, by binding to the tandem to each other via six adenosine nucleotides Tat aptamer to give (Apt) 2 and (Apt) 3. 非変性ゲルを用いたPAGEの後の精製RNAを、図2Aの対照のレーン(C)に示す。 Purified RNA after PAGE using non-denaturing gel, shown in lane (C) of the control of FIG. 2A. 図2Aのゲルは、TatアプタマーはDHFRと相互作用しないことを示している。 Figure 2A of the gel, Tat aptamer shows that does not interact with DHFR. このゲルは、濃度を増加させた野生型DHFR(個々の場合において、ゲルの上に三角形で示す通り、Cのレーンから右へ、DHFRの濃度を増加させた。)と混合してもアプタマーの移動度は変化しなかったことを示す。 This gel (in individual cases, as indicated by triangles on top of the gel, to the right from C lane, increasing concentrations of DHFR.) Wild-type DHFR increasing concentrations and be mixed aptamers mobility indicates not changed.

アプタマー(Apt) 1-3のゲル移動度は、融合タンパク質DHFR-(RE) 1-3と混合すると、変化した(図2B〜2D)。 Gel mobility aptamer (Apt) 1-3 is mixed with the fusion protein DHFR- (RE) 1-3, it has changed (Figure 2B-2D). これらの実験で、 32 P標識化アプタマー(最終濃度30pM)を過剰量の各融合タンパク質と混合し、形成した複合体の量をイメージアナライザーで定量した。 In these experiments, was mixed with 32 P-labeled aptamer each fusion protein (final concentration 30 pM) excess, the amount of the formed complexes was quantified by an image analyzer. 見かけのK d値は、n=1、n=2、およびn=3で、それぞれ、24 nM、200 pM、および16 pM未満と計算された。 K d values of the apparent, with n = 1, n = 2, and n = 3, respectively, was calculated to 24 nM, 200 pM, and 16 less than pM. 試験した組み合わせの中で、(Apt) 3とDHFR-(RE) 3との相互作用が最も強かった[K d(apt) <16 pM]。 Among the combinations tested, (Apt) interaction of 3 and DHFR- (RE) 3 was the strongest [K d (apt) <16 pM]. この複合体は、複数のコンホメーションをとるようであったが、アプタマーとREペプチドの両方の数が増加すると、より強い相互作用が得られた。 This complex, but were to take a plurality of conformations, the number of both the aptamer and RE peptides increases, stronger interaction was obtained. RNA-タンパク質複合体の安定性の維持、即ち、RNAとタンパク質との極めて強い相互作用が、遺伝子型と表現型との連結において重要な因子であるため、(Apt) 3とDHFR-(RE) 3 Maintaining the stability of RNA- protein complexes, i.e., for a very strong interaction between the RNA and protein, is an important factor in connection between a genotype and a phenotype, (Apt) 3 and DHFR- (RE) 3
のモチーフを用いて、以下の実験を行った。 Using the motif, the following experiment was performed.

(B−2)(Apt) 3 と(RE) 3 との相互作用による遺伝子型と表現型の連結 (B-2) (Apt) 3 and (RE) 3 connecting the genotype and phenotype by interaction with
(Apt) 3とDHFR-(RE) 3を利用できるどうかを確かめるために、2種類のプラスミドを調製した。 To confirm whether available (Apt) 3 and DHFR- the (RE) 3, were prepared two plasmids. プラスミドは、野生型および変異型のDHFR-(RE) 3融合タンパク質をコードするもので、コードされるmRNAと翻訳されるタンパク質を、図3Aに示した[野生型,pDHFR-(RE) 3 -(Apt) 3 ;変異型,pMuDHFR-(RE) 3 -(Apt) 3 ]。 Plasmids, one that encodes wild-type and mutant forms of DHFR- (RE) 3 fusion protein, a protein that is translated mRNA encoded, shown in Figure 3A [wild-type, pDHFR- (RE) 3 - (Apt) 3; variants, pMuDHFR- (RE) 3 - ( Apt) 3].

それぞれのプラスミドは、タンデムにつながった3つのREペプチド[(RE) 3 ]を有するDHFRをコードする配列、ならびにタンデムにつながった3つのTatアプタマー(Apt) 3の配列を含んでいる。 Each plasmid contains the DHFR coding sequence, and three Tat aptamer (Apt) 3 sequence led to tandem with three RE peptides led to tandem [(RE) 3]. pMuDHFR-(RE) 3 -(Apt) 3に由来する変異型タンパク質 [MuDHFR-(RE) 3 ]は、DHFRの活性部位でAsp27からAla27、および、Phe31からAla31というアミノ酸置換を2箇所に有している点で、pDHFR-(RE) 3 -(Apt) 3に由来する野生型のタンパク質[DHFR-(RE) 3 ]と異なる。 pMuDHFR- (RE) 3 - (Apt ) 3 mutant proteins [MuDHFR- (RE) 3] derived from has from Asp27 in the active site of DHFR Ala27, and the amino acid substitutions that Ala31 from Phe31 to two places and the point is, pDHFR- (RE) 3 - differ from the wild-type proteins from the (Apt) 3 [DHFR- (RE ) 3]. これらの変異により、メトトレキセート(MTX)への結合能が喪失する(Blakley, RL他New York, 1985, pp.191-253. Taira, K. 他 J. Trends Biochem. Sci. 1987, 12, 275-278. Taira, K. 他 J. Med. Chem. 1988, 31, 129-137. Iwakura, M. 他 J. Biochem. 1995, 117, 480-488. Fujita, S. 他 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94, 391-396. Hamada, M. 他 J. Biochem. 1998, 123, 684-692.)。 By these variations, the loss of ability to bind to methotrexate (MTX) (Blakley, RL other New York, 1985, pp.191-253. Taira, K. other J. Trends Biochem. Sci. 1987, 12, 275- 278. Taira, K. other J. Med. Chem. 1988, 31, 129-137. Iwakura, M. other J. Biochem. 1995, 117, 480-488. Fujita, S. other Proc. Natl. Acad. Sci . USA 1997, 94, 391-396. Hamada, M. other J. Biochem. 1998, 123, 684-692.). 第二の対照として、野生型のDHFR-(RE) 3融合タンパク質をコードし、アプタマー配列をコードしないプラスミド(pDHFR-(RE) 3 )を調製した。 As a second control, it encodes the wild-type DHFR- (RE) 3 fusion protein was prepared a plasmid not encoding aptamer sequence (pDHFR- (RE) 3). この翻訳産物であるDHFR-(RE) 3は、そのmRNAと相互作用できない(図3A、右)。 In some DHFR- (RE) 3 This translation product, it can not interact with the mRNA (Fig. 3A, right).

遺伝子型と表現型の連結のために、(Apt) 3 -(RE) 3間の相互作用を利用できる場合には、野生型の系(図3A、左)においてのみ、翻訳後にその反応液をMTX-アガロースビーズと混合すると、タンパク質(DHFR)とそのmRNAの両方が、MTX-アガロースビーズに結合して回収されるはずである。 For connection genotype and phenotype, (Apt) 3 - (RE) if available the interaction between 3 wild-type systems (Figure 3A, left) only at, The reaction was post-translationally When mixed with MTX- agarose beads, both protein (DHFR) and its mRNA is should be recovered bound to MTX- agarose beads. 対照的に、変異体の系(図3A、真中)では、変異型DHFRは、MTXに結合できないように設計されているために、MTX−アガロースビーズへ結合させてもタンパク質(DHFR)とそのmRNAは何れも回収されないはずである。 In contrast, the system of the mutant (Fig. 3A, middle), the mutant DHFR is because it is designed so that it can not bind to MTX, MTX-agarose beads to bind and not be protein (DHFR) and its mRNA it should not be any recovery. また、第2の対照の系(図3A、右)では、(Apt) 3アプタマーがないために、DHFR-(RE) 3は、そのmRNAと相互作用できないので、MTXアガロースビーズへ結合させた場合、タンパク質(DHFR)だけが回収され、mRNAは回収されないはずである。 In the second control system (Fig. 3A, right), in order (Apt) no 3 aptamers, DHFR- (RE) 3, so can not interact with the mRNA, when combined to MTX-agarose beads only protein (DHFR) is recovered, mRNA should not recovered.

T7ポリメラーゼを用いてそれぞれのプラスミドから、 32 Pで標識した3種のキャップ化mRNAを調製し、それらを鋳型として用いて、ウサギ網状赤血球細胞溶解液中で各タンパク質に翻訳させた。 From each plasmid using T7 polymerase, were prepared three kinds of capped mRNA labeled with 32 P, they used as a template in a rabbit reticulocyte cell lysate is translated into protein. 翻訳の際、各タンパク質は、 35 S-メチオニンで標識した。 During translation, the protein was labeled with 35 S- methionine. 翻訳後、適切な結合緩衝液とMTX-アガロースビーズを、各細胞溶解液に添加して、4℃で30分間結合反応を進行させた(この場合低温で行うのは、細胞溶解液中のRNaseによりmRNAの分解率を減らすためである)。 After translation, the appropriate binding buffer and MTX- agarose beads were added to each cell lysate was allowed to proceed for 30 minutes the binding reaction at 4 ° C. (performed in this case at a low temperature, RNase in the cell lysate in order to reduce the degradation rate of the mRNA is) by. 結合していないmRNAとタンパク質を含む、結合溶液の上清を除いて、MTX-アガロースビーズを結合緩衝液で二回洗浄した。 Including mRNA and protein unbound, except supernatants binding solution was washed twice MTX- agarose beads in binding buffer. 溶出緩衝液中で加熱(95℃)してビーズから溶出させた産物を、SDS-PAGEにより分析した。 The product was eluted from the beads heated (95 ° C.) to an elution buffer and analyzed by SDS-PAGE. 翻訳後の各細胞溶解液を調べることにより、翻訳されたタンパク質と投入したmRNAの量は、どの場合でも一致する(図3B、レーン1〜3)ことを確認した。 By examining each cell lysate after translation, the amount of translated protein and introduced to the mRNA is, all cases consistent (Figure 3B, lanes 1-3) was confirmed to be.

溶出した産物の分析は、予測どおり、DHFRは野生型および対照の系(図3B、レーン4および6)で検出され、変異型タンパク質はほとんど検出されなかった(図3B、レーン5)。 Analysis of the eluted product is expected, DHFR was detected in the wild type and control system (Fig. 3B, lanes 4 and 6), the mutant protein was hardly detected (Fig. 3B, lane 5). 野生型DHFRおよび対照DHFRの回収率は、それぞれ、変異型DHFRの回収率の9倍および16倍高かった(図3C、左)。 Recovery of wild-type DHFR and control DHFR, respectively, was 9-fold and 16-fold higher recovery of mutant DHFR (Fig. 3C, left). さらに、MTXとの結合後はMTXビーズは幾分か正電荷を帯びているので、本実験においては、mRNAのMTXビーズへの非特異的結合を完全に防ぐことはできなかったが(図3B、レーン5と6)、野生型の系でのみ、mRNAが検出された(図3B、レーン4)。 Furthermore, since after binding with MTX is tinged with MTX beads somewhat positive charge, but in this experiment, it was not possible to completely prevent the non-specific binding to MTX beads mRNA (Fig. 3B lanes 5 and 6), only the wild-type systems, mRNA was detected (Fig. 3B, lane 4). 野生型のmRNAの収量は、バックグランド(つまり、非特異的に結合した変異mRNAおよび対照mRNA)の量に対して2.5倍高いだけであった(図3C、右図)。 The yield of the wild-type mRNA is background (i.e., mutated mRNA and control mRNA nonspecifically bound) was only 2.5 times higher than the amount of (FIG. 3C, right panel). バンドを定量すると、タンパク質とmRNAの量がバックグラウンドのレベルをかなり上回っていることが明らかになった。 When quantifying the band, the amount of protein and mRNA were found to have well above the level of the background. これらの結果は、図3Aに模式的に示した相互作用の有効性を実証するものである。 These results demonstrates the effectiveness of the interaction shown schematically in Figure 3A.

(B−3)in vitroでのストレプトアビジンに結合したmRNAの選択 Selection of (B-3) mRNA bound to streptavidin in the in vitro
標的タンパク質の選択において、(Apt) 3とDHFR-(RE) 3が適切に機能するならば、識別可能な2種のmRNAを同時に翻訳した場合、それぞれのタンパク質は、そのmRNAと特異的に結合するはずである。 In the selection of the target protein, if (Apt) 3 and DHFR- (RE) 3 to function properly, if at the same time translating the identifiable two mRNA, each protein specifically binds to its mRNA you should be. MTXアガロースビーズは、正電荷を帯びており、関係のないmRNAの非特異的結合を完全に排除できないため(図3Bおよび図3C)、代わりに、ビオチン-アガロ−スビーズを試した。 MTX-agarose beads has a positive charge, can not completely eliminate non-specific binding of unrelated mRNA (FIGS. 3B and 3C), instead, the biotin - tried Subizu - agarose. 陽性対照としては、pDHFR-(CQ) 3 -(Apt) 3プラスミド内のDHFRの遺伝子をストレプトアビジンの遺伝子で置換した新しいプラスミド、pStreptavidin-(CQ) 3 -(Apt) 3を構築した(REおよびCQは共にTat-由来ペプチドであり、同じ機能を有する)(Yamamoto, R. 他 Genes Cells 2000, 5, 371-388.)。 As a positive control, pDHFR- (CQ) 3 - ( Apt) 3 plasmid in the new plasmid genes DHFR was replaced with the gene of streptavidin, pStreptavidin- (CQ) 3 - ( Apt) 3 were constructed (RE and CQ are both Tat- derived peptides, have the same function) (Yamamoto, R. other Genes Cells 2000, 5, 371-388.). この系(図4)では、pStreptavidin-(CQ) 3 -(Apt) 3とpDHFR-(CQ) 3 -(Apt) 3に由来するmRNAの混合物を最初に用いて行った場合、DHFRではなく、翻訳されたストレプトアビジンがビオチン-アガロースビーズに結合するはずである(Green, NM 他 Adv. Protein Chem. 1975, 29, 85-133)。 In this system (Fig. 4), pStreptavidin- (CQ) 3 - (Apt) 3 and pDHFR- (CQ) 3 - (Apt ) when performed with the first a mixture of mRNA derived from 3, rather than DHFR, translated streptavidin biotin - should bind to agarose beads (.. Green, NM other Adv Protein Chem 1975, 29, 85-133).

pStreptavidin-(CQ) 3 -(Apt) 3とpDHFR-(CQ) 3 -(Apt) 3から、T7ポリメラーゼを用いて、2種類の32 Pで標識したキャップ化mRNAを調製した。 pStreptavidin- (CQ) 3 - (Apt ) 3 and pDHFR- (CQ) 3 - from (Apt) 3, using T7 polymerase and a labeled capped mRNA was prepared in two 32 P. 転写されたmRNAを細胞溶解液中で別々に翻訳し(図4B、レーン1と2)、あるいは1:1の比率で混合したものを翻訳して(図4B、レーン3)、それぞれのmRNAをビオチン-アガロースビーズで選択した。 The transcribed mRNA separately translated in cell lysates (Figure 4B, lanes 1 and 2), or 1: translate a mixture 1 ratio (Figure 4B, lane 3), the respective mRNA biotin - was selected in the agarose beads. この工程は、図3に示した実験で用いた工程と基本的に同様であり、翻訳後に適切な結合緩衝液とビオチン-アガロースビーズを各細胞溶解液に添加して、4℃で10分間結合反応を進行させた。 This step is a step basically the same as that used in the experiment shown in FIG. 3, an appropriate binding buffer and biotin after translation - agarose beads were added to each cell lysate, bound 10 minutes at 4 ° C. reaction was allowed to proceed. その後、結合していないmRNAとタンパク質を含む結合溶液の上清を除いて、ビオチン-アガロースビーズを結合緩衝液で二回洗浄した。 Thereafter, with the exception of the supernatant of the coupling solution containing the mRNA and protein unbound biotin - agarose beads were washed twice with the binding buffer. 高温(95℃)で溶出緩衝液によりビーズから結合産物を溶出し、選択されたmRNAを同定するために、4%変性PAGEにより分析した(図4B)。 The coupling product from the beads was eluted by elution buffer at high temperature (95 ° C.), in order to identify the selected mRNA, were analyzed by a 4% denaturing PAGE (Figure 4B).

ビオチンビーズに結合した各mRNAを定量すると、結合したストレプトアビジンをコードするmRNA(Streptavidin-(CQ) 3 -(Apt) 3 mRNA)の収量が、DHFRをコードするmRNA(DHFR-(CQ) 3 -(Apt) 3 mRNA;レーン1と2)の収量よりも3倍高かった。 When quantifying the mRNA bound to the biotin bead, mRNA encoding the bound streptavidin (Streptavidin- (CQ) 3 - ( Apt) 3 mRNA) yield is, mRNA encoding DHFR (DHFR- (CQ) 3 - (Apt) 3 mRNA; it was three times higher than the yield of lanes 1 and 2). それぞれのmRNAを1:1で混合した群からビオチンビーズに結合したmRNAを単離した場合、pStreptavidin-(CQ) 3 -(Apt) 3 mRNAが選択された(レーン3)。 Each mRNA 1: If mixed with mRNA bound to biotin beads from the group isolated in 1, pStreptavidin- (CQ) 3 - (Apt) 3 mRNA is selected (lane 3). この結果は、その強いRNA-タンパク質間の相互作用が、機能性タンパク質の選択に有効であることを実証する。 This result, interaction between the strong RNA- protein, demonstrating that it is effective in the selection of functional proteins.

(B−4)機能性タンパク質の選択における、リボゾームディスプレイ系と(RE) 3 と(Apt) 3 との強い相互作用の組み合わせ In the selection of the (B-4) a functional protein, a combination of strong interaction with ribosome display systems (RE) 3 and (Apt) 3
RNA-タンパク質間の強い相互作用を用いて、機能的ストレプトアビジンが選択できたので(図4)、リボゾームディスプレイ系と組み合わせることにより、さらに改良できないかを検討した。 With a strong interaction between RNA- protein, since functional streptavidin could be selected (FIG. 4), combined with ribosome display system, was investigated whether not be further improved. リボゾームディスプレイ系では、終止コドンの欠損により複合体からのタンパク質の遊離が遅れるので(Hanes, J. 他 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94, 4937-4942. He, M. 他 Nuclelic Acids Res. 1997, 25, 5132-5134.)、リボゾームは、翻訳したタンパク質、およびそのそれぞれのmRNAと比較的安定な複合体を形成する。 The ribosome display systems, since delayed release of proteins from complex by a deficiency of the stop codon (Hanes, J. Other Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94, 4937-4942. He, M. other Nuclelic Acids Res. 1997, 25, 5132-5134.), ribosome forms translated proteins, and a relatively stable complex with its respective mRNA. 本発明の系で終止コドンの削除の影響を調べるために、終止コドンが欠損したDHFR mRNA(DHFR-Stop mRNA, 図5Aの右図)を調製した。 To examine the effect of deletion of the stop codon in the system of the present invention, DHFR mRNA that stop codon is deficient (DHFR-Stop mRNA, right view of FIG. 5A) was prepared. 対照として、終止コドンを有するDHFR mRNA(DHFR+Stop mRNA, 図5Aの中図)を用いた。 As a control, DHFR mRNA with a stop codon was used (DHFR + Stop mRNA, Figure in Figure 5A).

細胞溶解液中で翻訳して選択した後、MTX-ビーズに結合したmRNAの量を3種のmRNA(即ち、DHFR-(RE) 3 -(Apt) 3 、DHFR+Stop、およびDHFR-Stop)について比較した。 After selection and translated in the cell lysates, MTX-of mRNA bound to the beads amount to three mRNA (i.e., DHFR- (RE) 3 - ( Apt) 3, DHFR + Stop, and DHFR-Stop) They were compared. 翻訳の際に、終止コドンを有するDHFR-(RE) 3 -(Apt) 3 mRNAは、(RE) 3と(Apt) 3間の相互作用により、翻訳されたDHFRタンパク質と結合する。 During translation, DHFR- (RE) 3 having a termination codon - (Apt) 3 mRNA is by the interaction between the (RE) 3 and (Apt) 3, binds translated DHFR protein. また、終止コドンが存在するのでリボゾームはmRNAから遊離するため、このタンパク質-mRNA複合体には、リボゾームは関与していない。 Further, since ribosome liberated from mRNA since termination codon exists, this protein -mRNA complex, ribosomes are not involved. これら3種のmRNAを、ウサギ網状赤血球細胞溶解液中で翻訳し、図3に記載したのと同じ条件下でMTX-アガロースビーズに露出した。 These three mRNA, and translated in a rabbit reticulocyte cell lysates were exposed to MTX- agarose beads under the same conditions described in Figure 3. 選択されたmRNAの相対量は、 32 Pで標識したRT-PCR産物と、元の結合したmRNAのカウントから検出した(図5Bおよび図5C)。 The relative amounts of the selected mRNA is a labeled RT-PCR products with 32 P, was detected from the count of the original bound mRNA (FIGS. 5B and 5C). PCR産物の分析(図5B)は一度しか行わなかったので、図5Cに示したmRNAのレベルの定量の方が信頼性が高い。 Since analysis of the PCR product (Fig 5B) was not carried out only once found the following quantification of the level of mRNA shown in FIG. 5C reliable. 図5Cに示した結果は、4回の独立して行った実験の平均である。 The results shown in FIG. 5C is the average of four independent and went experiment. 平均すると、DHFR+Stop mRNA(図5C、レーン2)のバックグランドのレベルより、選択されたDHFR-(RE) 3 -(Apt) 3 mRNA(図5C、レーン1)は2.5倍高濃度であり、一方、DHFR-Stop mRNAの濃度は1.4倍であった(図5C、レーン3)。 On average, DHFR + Stop mRNA (Figure 5C, lane 2) than the level of background, the selected DHFR- (RE) 3 - (Apt ) 3 mRNA ( Figure 5C, lane 1) is 2.5 times higher concentration , whereas the concentration of DHFR-Stop mRNA was 1.4-fold (Fig. 5C, lane 3). 従って、この系では、各mRNAとその産物との複合体の安定性においては、(RE) 3 -(Apt) 3相互作用が、終止コドンの削除より効果的であった。 Thus, in this system, in the stability of the complex between the mRNA and its product, (RE) 3 - (Apt ) 3 interaction was more effective than deletion of the stop codon.

リボゾームディスプレイ法は、機能性抗体を各々の抗原に対して選択する場合には、かなり有効に機能する(Hanes, J. 他 Nat. Biotechnol. 2000, 18, 1287-1292.)。 Ribosome display methods, when selecting functional antibody against each antigen, which functions quite effectively (Hanes, J. Other Nat. Biotechnol. 2000, 18, 1287-1292.). しかし、今回の結果(図5C)は、終止コドンの削除により形成するリボゾーム-mRNA-タンパク質複合体の安定性は、DHFRのような一般的なタンパク質の選択には十分でないことを示唆する。 However, our results (Figure 5C), the stability of the ribosome -mRNA- protein complex formed by the deletion of the stop codon, suggesting that it is not sufficient for the selection of common protein such as DHFR. リボゾームディスプレイ系において適切な抗体を短時間に選択するには、抗体とその抗原とのかなり強い相互作用が必要なのかもしれない。 To select the appropriate antibodies in a short period of time in the ribosome display system, the antibody and is not may be necessary quite strong interaction with the antigen.

(RE) 3 -(Apt) 3相互作用と、リボゾームディスプレイ系を組み合わせることは、各mRNAとその産物の複合体の安定性を向上させるのに有利である。 (RE) 3 - and (Apt) 3 interaction, combining the ribosome display system is advantageous in improving the stability of the complex of the mRNA and its products. この目的のために、(Apt) 3 -(RE) 3領域がDHFRの遺伝子の上流に位置する別のプラスミドを調製した(図6)。 For this purpose, (Apt) 3 - (RE ) 3 region was prepared separate plasmid located upstream of the gene of DHFR (Fig. 6). さらに、終止コドンの削除により複合体をさらに安定化させるために、終結因子である大腸菌のRF1、RF2、およびRF3に対するポリクローナルIgG抗体を調製した(Moffat, JG他Biochimie 1991, 73, 1113-1120.)。 Furthermore, in order to further stabilize the complex by the deletion of the stop codon, termination of E. coli is a factor RF1, RF2, and RF3 were prepared polyclonal IgG antibodies to (Moffat, JG other Biochimie 1991, 73, 1113-1120. ). (Apt) 3 -(RE) 3領域にある終止コドンが3'末端にくることを避けるために、(Apt) 3 -(RE) 3領域を5'末端に設定したので、本発明では、各mRNAの翻訳を(Apt) 3と(RE) 3の間にSD配列を配置することにより、大腸菌S30抽出液中で行った。 'In order to avoid coming to the end, (Apt) 3 - (RE ) 3 region 5' (RE) stop codon in the 3 regions 3 - (Apt) 3 since the set terminal, in the present invention, each by placing the SD sequence between the translation of mRNA (Apt) 3 and the (RE) 3, it was carried out in E. coli S30 extract solution.

終結因子に対するポリクローナルIgG抗体の存在下(図6のレーン1と3)、および非存在下(図6のレーン2と4)で、MTX-ビーズに結合したmRNAの量を、2種のmRNA、つまりDHFR-Stop mRNA(図6のレーン1と2)および(Apt) 3 -(RE) 3 DHFR-Stop mRNA(図6のレーン3と4)について比較した。 In the presence of polyclonal IgG antibodies to termination factors (lanes 1 and 3 of FIG. 6), and in the absence (lanes 2 and 4 in FIG. 6), the amount of mRNA bound to MTX- beads, two mRNA, That DHFR-Stop mRNA (lane 1 of FIG. 6 and 2) and (Apt) 3 - were compared for (RE) 3 DHFR-Stop mRNA ( lanes 3 and 4 in FIG. 6). 翻訳されたmRNAは、図3に記載したのと同じ条件で、MTX-アガロース-ビーズの選択に供した。 Translated mRNA in the same conditions as described in FIG. 3, MTX-agarose - were subjected to selection of the beads. 選択されたmRNAの相対量は、RT-PCR(図6Bおよび図6C)により検出した。 The relative amounts of selected mRNA was detected by RT-PCR (FIGS. 6B and 6C). 図6Cに示した結果は、独立して行った2回の実験の平均である。 The results shown in FIG. 6C is an average of 2 times was performed independent experiments. これらの結果は、(RE) 3 -(Apt) 3相互作用とリボゾームディスプレイ系の組み合わせが、特に終結因子に対するポリクローナルIgG抗体の存在下では、mRNA-リボゾーム複合体の安定化に有効であることを実証する。 These results, (RE) 3 - that (Apt) 3 the combination of interacting with the ribosome display system, in the presence of polyclonal IgG antibodies to particular termination factor, is effective in stabilizing the mRNA- ribosome complex to demonstrate.

(B−5)RNA−タンパク質ネットワークの存在の可能性 Possible presence of (B-5) RNA- protein network
上記した実験結果から、アプタマー/ペプチド間の強い相互作用がリボソームディスプレイ複合体を安定化させ、この種の相互作用が機能性タンパク質の選択に有用であることが実証された。 From experimental results described above, a strong interaction between the aptamer / peptide stabilizes the ribosome display complexes, it was demonstrated this type of interaction is useful in the selection of functional proteins. しかし、in vitro結合アッセイの結果から見て(図2)、タンパク質の選択の効率はそれほど高くはないことが予想される。 However, as seen from the results of the in vitro binding assay (FIG. 2), the efficiency of the protein of choice is expected that not so high. 即ち、図7Aの上の図に示すようなRNA−タンパク質ネットワークの形成により、ライブラリーからのタンパク質の選択は困難になる可能性がある。 That is, the formation of RNA- protein network such as shown in the upper diagram of FIG. 7A, the selection of proteins from the library can be difficult. この問題は、図7Aの下の図に示すようなアプタマーとペプチドの異なる組み合わせを使用することにより解消することができる。 This problem can be solved by using aptamers and different peptide combinations as shown in the lower diagram of Figure 7A.

[実施例2] [Example 2]
A. A. 材料と方法 Materials and Methods
(A−1)Ricin-A 鎖がfusion したジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)、グルタチオン−5−トランスフェラーゼ(GST)、及びストレプトアビジン(StAv)発現ベクターの構築 (A-1) Ricin-A dihydrofolate reductase chains are fusion (DHFR), glutathione-5-transferase (GST), and construction of streptavidin (Stav) expression vector
PTZDHFR20由来のDHFR遺伝子を pET30aのマルチクローニングサイトに挿入し、pDHFRを構築した。 PTZDHFR20 the DHFR gene derived from and inserted into the multiple cloning site of pET30a, was constructed pDHFR. さらにpCANTABE5(Pharmacia)由来のgeneIII(geneIII配列については、In vitro selection and evolution of functional proteins by using ribosome display. Proc Natl Acad Sci US A. 1997 May 13;94(10):4937-42)配列のうち、1-404番目までのアミノ酸(long spacer)と195-315番目までを含むアミノ酸(short spacer)をコードする2種類の配列を下記のプライマーで増幅し、EcoT22I及びPstIで切断し、それぞれDHFR遺伝子の下流のPst I部位に挿入した。 Further (for geneIII sequence, In vitro selection and evolution of functional proteins by using ribosome display Proc Natl Acad Sci US A. 1997 May 13; 94 (10).: 4937-42) pCANTABE5 (Pharmacia) derived from geneIII of the sequences , amino acids (short spacer) 2 types of sequences encoding up to and including the 195-315 th amino acids (long location spacer) to 1-404 th amplified with the following primers was cut with EcoT22I and PstI, DHFR respectively genes of it was inserted into the downstream of the Pst I site. 用いたプライマーはlong spacer up primer: 5'-GTG GCG ATG CAT CGA CTG TTG AAA GTT GTT TAG CAA AAC −3'(配列番号11), long spacer down primer: 5'-TTC TTA CTG CAG AGA CTC CTT ATT ACG CAG TAT GTTAG-3'(配列番号12), short spacer up primer:5'-GTG GCG ATG CAT CGG ATC CAT TCG TTT GTG AAT ATCAAG-3'(配列番号13), short spacer down primer:5'-TTC TTA CTG CAG ACC AGT AGC ACC ATT ACC ATT AGC AA-3'(配列番号14)。 The primers used were long spacer up primer: 5'-GTG GCG ATG CAT CGA CTG TTG AAA GTT GTT TAG CAA AAC -3 '(SEQ ID NO: 11), long spacer down primer: 5'-TTC TTA CTG CAG AGA CTC CTT ATT ACG CAG TAT GTTAG-3 '(SEQ ID NO: 12), short spacer up primer: 5'-GTG GCG ATG CAT CGG ATC CAT TCG TTT GTG AAT ATCAAG-3' (SEQ ID NO: 13), short spacer down primer: 5'- TTC TTA CTG CAG ACC AGT AGC ACC ATT ACC ATT AGC AA-3 '(SEQ ID NO: 14). 次にlinkerとしてgeneIII配列の212-258番目のグリシン及びセリンをコードする配列を下記のプライマーで増幅し、ScaI及びEcoRVで切断し、DHFR遺伝子とspacerの間のEcoRVサイトに挿入した。 Then the 212-258 th glycine and serine encoding the sequence of the geneIII sequence was amplified with the following primers as linker, was cut with ScaI and EcoRV, followed by insertion into the DHFR gene and EcoRV sites between location spacer. このリンカーの上流には新たにNheIサイトが、下流にはNcoIサイトが挿入された。 New NheI site upstream of the linker, the downstream was inserted NcoI site. 用いたプライマーはup primer: 5'-ACT CGG AGT ACT TGC TAG CCC TGT CAA TGC TGG CGG CG-3'(配列番号15), down primer:5'-GCT ACG GAT ATC CCG CTT GTA ACA GGA GTG CTC CAT GGA TAA TCA AAA TCA CCG GAA CCG −3'(配列番号16)。 The primers used were up primer: 5'-ACT CGG AGT ACT TGC TAG CCC TGT CAA TGC TGG CGG CG-3 '(SEQ ID NO: 15), down primer: 5'-GCT ACG GAT ATC CCG CTT GTA ACA GGA GTG CTC CAT GGA TAA TCA AAA TCA CCG GAA CCG -3 '(SEQ ID NO: 16). 次にpUTA(Texas Univ. Prof. Rpbertus J.)由来のリシンA鎖をコードする配列を下記のプライマーで増幅し、NcoI及びEcoRVで切断し、DHFR遺伝子とspacerの間のNcoI及びEcoRVに挿入した。 Then pUTA (Texas Univ. Prof. Rpbertus J.) ricin A chain encoding sequence from amplified with the following primers was digested with NcoI and EcoRV, and inserted into NcoI and EcoRV between DHFR gene and spacer . 用いたプライマーはup primer:5'-CGC GCG CCA TGG ATG TTT CCC AAA CAA TAC CCA AT-3'(配列番号17), down primer: 5'-GGG GCG GAT ATC CCA AAC TGT GAG CTC GGT GGA GGC GCG-3'(配列番号18)。 The primers used were up primer: 5'-CGC GCG CCA TGG ATG TTT CCC AAA CAA TAC CCA AT-3 '(SEQ ID NO: 17), down primer: 5'-GGG GCG GAT ATC CCA AAC TGT GAG CTC GGT GGA GGC GCG -3 '(SEQ ID NO: 18). リシンを不活性化するような変異(Glu-177, Arg-180, Glu-208 をGln-177, His-180, Asp-208)を加えたものも同様に挿入した(pDLRS, pDLRL)。 Mutation that inactivates lysine (Glu-177, Arg-180, Glu-208 to Gln-177, His-180, Asp-208) was also inserted in the same manner plus (pDLRS, pDLRL). 最後にDHFRをGST及びStAvに置換するために、pGEX−4t-3(Pharmacia)由来のGST遺伝子及びpGSH由来のStreptavidin遺伝子を増幅し、XbaI及びNheIサイトで切断し、プラスミドのXbaI及びNheIサイトに挿入した(pGLRS, pGLmRS, pSLRS, pSLRL, pSLmRS)。 Finally the DHFR to replace the GST and Stav, it amplifies the Streptavidin gene from GST gene and pGSH of pGEX-4t-3 (Pharmacia) derived, was digested with XbaI and NheI sites, the XbaI and NheI sites of the plasmid inserted (pGLRS, pGLmRS, pSLRS, pSLRL, pSLmRS). 用いたプライマーはGST用として、up primer:5'-GGC CGG TCT AGA AAT AAT TTT GTT TAA CTT TAA GAA GGA GAT ATA CAT ATG TCC CCT ATA CTA GGT TAT TG(配列番号19)、down primer:5'-CGG TGG GCT AGC CAG ATC CGA TTT TGG AGG ATG GTC GC(配列番号20)、StAv用として、up primer: 5'−GGC CGG TCT AGA AAT AAT TTT GTT TAA CTT TAA GAA GGA GAT ATA CAT ATG CAC CAT CAT CAT CAT CAT TC −3'(配列番号21), down primer: 5'−CGG TGG GCT AGC CCG CCG CTC CAG AAT CTC AAA GCA−3'(配列番号22)。 The primers used for the GST, up primer: 5'-GGC CGG TCT AGA AAT AAT TTT GTT TAA CTT TAA GAA GGA GAT ATA CAT ATG TCC CCT ATA CTA GGT TAT TG (SEQ ID NO: 19), down primer: 5'- CGG TGG GCT AGC CAG ATC CGA TTT TGG AGG ATG GTC GC (SEQ ID NO: 20), for the StAv, up primer: 5'-GGC CGG TCT AGA AAT AAT TTT GTT TAA CTT TAA GAA GGA GAT ATA CAT ATG CAC CAT CAT CAT CAT CAT TC -3 '(SEQ ID NO: 21), down primer: 5'-CGG TGG GCT AGC CCG CCG CTC CAG AAT CTC AAA GCA-3' (SEQ ID NO: 22).

pSLRL(Streptavidin-Linker-Ricin-GeneIII(long))のDNA配列を配列表の配列番号1に示し、pSLRS(Streptavidin-Linker-Ricin-GeneIII(Short))のDNA配列を配列表の配列番号2に示す。 pSLRL (Streptavidin-Linker-Ricin-GeneIII (long)) the DNA sequence shown in SEQ ID NO: 1 of, in SEQ ID NO: 2 of the DNA sequence sequence listing pSLRS (Streptavidin-Linker-Ricin-GeneIII (Short)) show.

配列番号1の塩基配列の構成は以下の通りである。 Configuration of the base sequence of SEQ ID NO: 1 is as follows.
Translation Position; 5076−8155 Translation Position; 5076-8155
T7 promoter;4987−5004 T7 promoter; 4987-5004
lac operator;5007−5030 lac operator; 5007-5030
SD sequence; 5061−5067 SD sequence; 5061-5067
Steptacidin sequence; 5121−5600 Steptacidin sequence; 5121-5600
Linker; 5601−5768 Linker; 5601-5768
Ricin A chain; 5769−6572 Ricin A chain; 5769-6572
Spacer (containing GeneIII(L) sequences); 6573−7856 Spacer (containing GeneIII (L) sequences); 6573-7856

配列番号2の塩基配列の構成は以下の通りである。 Configuration of the base sequence of SEQ ID NO: 2 is as follows.
Translation Position;5076−7007 Translation Position; 5076-7007
T7 promoter;4987−5004 T7 promoter; 4987-5004
lac operator;5007−5030 lac operator; 5007-5030
SD sequence;5061−5067 SD sequence; 5061-5067
Steptacidin sequence;5121−5600 Steptacidin sequence; 5121-5600
Linker;5601−5768 Linker; 5601-5768
Ricin A chain;5769−6572 Ricin A chain; 5769-6572
Spacer (containing GeneIII(S) sequences) ;6573−7007 Spacer (containing GeneIII (S) sequences); 6573-7007

(A−2)Biotinアフィニティカラム及びGlutathioneアフィニティーカラムによるmRNAの結合及び選択 Binding and selection of the mRNA by (A-2) Biotin affinity column and Glutathione affinity column
各プラスミド(pDLRS, pDLRL, pSLRS, pSLRL, pSLmRS, pGLRS, pGLmRS)はXhoIで切断された後、Cap Analog存在下でAmpliScribe T7 Transcription Kit(Epicentre Technologies)を用いてT7 promoterより転写された。 Each plasmid (pDLRS, pDLRL, pSLRS, pSLRL, pSLmRS, pGLRS, pGLmRS) after being cut with XhoI, and is transcribed from the T7 promoter A promoter with AmpliScribe T7 Transcription Kit (Epicentre Technologies) in the presence of Cap Analog. 場合によってはα 32 P-CTPによってアイソトープ標識した。 Sometimes it isotope labeled with α 32 P-CTP. これらのmRNAはRabit Reticulocyte Lysate System(Promega)を用いて翻訳した。 These mRNA was translated using the Rabit Reticulocyte Lysate System (Promega). 反応は25μlのスケールでRNA、1μgを翻訳した。 The reaction was translated RNA, a 1μg on a scale of 25μl. 溶液の組成は添付のプロトコルに従った。 The composition of the solution according to the attached protocol. 30℃で10分間インキュペーションし、反応溶液20μlにSample Buffer(ストレプトアビジンの選択の場合、50mM Potassium phoshate buffer(pH7.9), 300mM NaCl, 0.05% Tween 20, 2% Block Ace(Yukizirushi);GSTの選択の場合、pH 7.4, 10 mM Na 2 HPO 4 , 1.8 mM KH 2 PO 4 , 2.7 mM KCl, 140mM NaCl and 1% Triton X-100)を80μl加え、あらかじめSample Bufferで数回洗浄したBiotin-Agarose(Sigma)を10μl加えた。 30 Incubate Persson 10 minutes at ° C., when the Sample Buffer (streptavidin selection to the reaction solution 20μl, 50mM Potassium phoshate buffer (pH7.9), 300mM NaCl, 0.05% Tween 20, 2% Block Ace (Yukizirushi); GST for selection, pH 7.4, 10 mM Na 2 HPO 4, 1.8 mM KH 2 PO 4, 2.7 mM KCl, 140mM NaCl and 1% Triton X-100) was added 80 [mu] l, and washed several times with pre-Sample Buffer Biotin- Agarose (Sigma) was added 10μl of. 場合によっては、結合及び洗浄のステップの後に結合しているRNAの量をアイソトープのカウントにより定量した。 In some cases, the amount of RNA bound after step the binding and washing was quantified by counting isotope. 室温で10分間インキュペーションした後、上澄みを取り除き、200μlのSample Bufferで3回洗浄した。 After 10 minutes Incubate Persson at room temperature, removing the supernatant, washed 3 times with Sample Buffer of 200 [mu] l. その後、結合しているRNAを回収するために100μlのElution Buffer(ストレプトアビジンの選択の場合、50mM Potassium phoshate buffer(pH7.9), 300mM NaCl, 0.05% Tween20, 2% Block Ace, 3M Guanisine, 50mM EDTA;GSTの選択の場合、pH 7.4, 10 mM Na 2 HPO 4 , 1.8 mM KH 2 PO 4 , 2.7 mM KCl, 140mM NaCl and 1% Triton X-100, 3 M guanidine and 250 mMEDTA)を加え、室温で10分激しく撹拌し、遠心して、上澄みを回収した。 Then, in the case of 100 [mu] l Elution Buffer (streptavidin choice to recover the RNA bound, 50mM Potassium phoshate buffer (pH7.9), 300mM NaCl, 0.05% Tween20, 2% Block Ace, 3M Guanisine, 50mM EDTA; for GST selection, pH 7.4, 10 mM Na 2 HPO 4, 1.8 mM KH 2 PO 4, 2.7 mM KCl, the 140mM NaCl and 1% Triton X- 100, 3 M guanidine and 250 mMEDTA) was added, at room temperature in 10 minutes with vigorous stirring, and centrifuged to collect a supernatant. この操作を2回繰り返した。 This operation was repeated twice. 回収したRNAはRNeasy minin kit(QIAGEN)により精製した。 The recovered RNA was purified by RNeasy minin kit (QIAGEN). 精製したRNAはRiverse Transcription System (Promega)のプロトコルに従って5μMのdown primerで逆転写され、Ex Taq polymerase(TAKARA)によってPCRを行った。 Purified RNA is reverse transcribed with 5μM of down primer according to the protocol of Riverse Transcription System (Promega), PCR was carried out by Ex Taq polymerase (TAKARA). up及びdown primerは1μM加えた。 up and down primer was added 1 [mu] M. 用いたプライマーはup primer:5'-CTT TAA GAA GGA GAT ATA CAT ATG-3'(配列番号23), down primer:5'-CTC CTC CGG TCG ACG ATA TC-3'(配列番号24)。 The primers used were up primer: 5'-CTT TAA GAA GGA GAT ATA CAT ATG-3 '(SEQ ID NO: 23), down primer: 5'-CTC CTC CGG TCG ACG ATA TC-3' (SEQ ID NO: 24).

B. B. 結果と考察 Results and discussion
(B−1)リシンA鎖がフュージョンしたジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)、グルタチオン−5−トランスフェラーゼ(GST) 及びストレプトアビジン(StAv)発現ベクターの構築 Construction of (B-1) dihydrofolate reductase ricin A chain is fusion (DHFR), glutathione-5-transferase (GST) and streptavidin (Stav) expression vector
DHFR、GST、StAvタンパク質はその性質がよく研究されているタンパク質である。 DHFR, GST, StAv protein is a protein whose nature has been well studied. DHFRはStAvとBiotinの結合のnegative controlとして用いるために挿入された。 DHFR was inserted for use as negative control for binding of StAv and Biotin. LinkerはDHFR、GST及びStAvとリシンが立体障害により、foldingが阻害されるのを避けるために導入した。 Linker was introduced in order to avoid DHFR, by GST and StAv and lysine sterically hindered, that the folding is inhibited. この配列はGeneIII遺伝子上にコードする配列でグリシン及びセリンを多くコードする。 This sequence is often encoding glycine and serine in the sequence encoding on GeneIII gene. リシンはリボソームを不活性化させるドメインであるA鎖のみを導入した。 Lysine was introduced only A chain is a domain that inactivates the ribosomes. 変異リシンは28S rRNAに存在するα−サリシン部位のN−グルコシド結合を加水分解する活性が完全に失われている。 Mutation lysine and N- glucosidic bonds of α- salicin sites present in 28S rRNA hydrolyzing activity is completely lost. リシンの下流にはGeneIII遺伝子により挿入した配列がSpacerとして挿入された。 Downstream of lysine sequences were inserted by GeneIII gene was inserted as Spacer. これはリボソームによるタンパク質の翻訳が終了する前にリシンがリボソームをcisで攻撃できるようにするためである。 This is because to make ricin before of the protein by the ribosome translation is completed, can attack the ribosome in cis. long及びshortの2種類のSpacerを挿入したプラスミドを構築した(図9A)。 Were constructed two Spacer inserts the plasmid long and short (Fig. 9A).

(B−2)リシンA鎖による翻訳阻害 (B-2) translation inhibition by ricin A chain
リシンA鎖が活性を持ち、リボソームの翻訳活性を阻害し、リボソームを停止させることが出来るかどうか確かめるために、上記にて構築したプラスミド(pSLmRS, pSLRS, pSLmRL, pSLRL)をテンプレートとして転写、翻訳を行った。 Ricin A chain has activity to inhibit ribosome translation activity, in order to verify whether ribosomes can be stopped, transfer plasmids constructed in above (pSLmRS, pSLRS, pSLmRL, pSLRL) as a template, translation It was carried out. まずプラスミドのSpacer配列の下流にあるXhoIサイトで切断し、直鎖状のdsDNAにし、T7ポリメラーゼを用いてmRNAを転写した。 First cut with XhoI site downstream of plasmid Spacer sequence, the linear dsDNA, and transcribing an mRNA using a T7 polymerase. Lysate中で翻訳できるように5'末端にキャップを導入した。 It was introduced cap at the 5 'end to translate in Lysate. 4種類のmRNAをそれぞれ適切な条件下で翻訳し、生成したタンパク質をSDS-PAGEにより検出した(図9のB及びC)。 Four mRNA was translated in suitable conditions, respectively, the resulting proteins were detected by SDS-PAGE (B and C in FIG. 9). その結果、リシン配列に変異を加えた、活性のないリシンを融合したタンパク質の発現量が野生型のリシンを融合したタンパク質の発現量より多かった(SLmRS, SLmRL)。 As a result, adding a mutation to lysine sequences, expression levels of proteins fused ricin no activity was greater than the expression level of proteins fused to wild-type lysine (SLmRS, SLmRL). これはリシンがリボソームを阻害したため、タンパク質の翻訳量が少なくなっていると考えられる。 This is because the lysine inhibited the ribosome, is considered a translation amount of protein is low. よって本発明者が構築したリシン融合タンパク質はリボソームを停止させる活性を持っていることが間接的に確認された。 Therefore lysine fusion protein present inventor has constructed and it was confirmed indirectly have activity for stopping the ribosome. また、Spacerの配列が長くなるとタンパク質の発現が少なくなる事が分かった。 Further, it was found that the protein expression of the sequence of the Spacer is increased is reduced.

(B−3)BiotinアフィニティカラムによるmRNAの結合 Binding of mRNA by (B-3) Biotin affinity column
pDLRS, pSLRS, pSLmRSを上記と同様に、Spacer配列の下流にあるXhoIサイトで切断し、直鎖上のdsDNAにし、T7ポリメラーゼを用いてmRNAを転写した。 pDLRS, pSLRS, similarly to the above the PSLmRS, was cut with XhoI site downstream of the Spacer sequence, the dsDNA on linear and transcribing an mRNA using a T7 polymerase. Lysate中で翻訳できるように5'末端にキャップを導入し、またRNAの定量のためにα−CTPでボディーラベルした。 Introducing a cap at the 5 'end to translate in Lysate, it was also body labeled with alpha-CTP for RNA quantitation. 3種類のmRNAをそれぞれ適切な条件下で翻訳し、Biotinが結合したアガロース(Biotin-Agarose)と結合させた。 Three mRNA was translated in suitable conditions, respectively, coupled with agarose Biotin bound (Biotin-Agarose). 数回Biotin-Agaroseの洗浄を繰り返し、結合していないmRNAを取り除いた。 Repeatedly washed several times Biotin-Agarose, removal of the mRNA that is not bound. また結合、及び洗浄のステップにおいてBiotin-Agaroseと結合したmRNAを定量した。 The coupling, and the bound mRNA with Biotin-Agarose in the washing step was quantified. BiotinはStAvと高い親和性を持つ。 Biotin has a StAv and high affinity.

DLRS mRNAが翻訳された場合、リシンがリボソームを停止させ、タンパク質−mRNA複合体が形成されるが、DHFRはBiotinと結合しないため、mRNAがほとんどBiotin-Agaroseに結合しないと考えられる(図10Bの左)。 If DLRS mRNA is translated, lysine stops the ribosome, but protein -mRNA complex is formed, the DHFR does not bind Biotin, mRNA is considered not bind to most Biotin-Agarose (in FIG. 10B left). その一方でSLRS mRNAはStAvがBiotin-Agaroseに結合し、mRNAが回収されると期待される(図10Bの真中)。 Meanwhile SLRS mRNA has StAv binds to Biotin-Agarose, is expected to mRNA is recovered (middle of FIG. 10B). SLmRS mRNAは活性を持たないリシンが挿入されているため、StAvはBiotin-Agaroseに結合するが、mRNA上のOpen Reading Frame(ORF)の末端に終止コドンが入っているため、mRNAとタンパク質が複合体を形成しにくくなると考えられる(図10Bの右)。 Since SLmRS mRNA is lysine having no activity is inserted, Stav binds to Biotin-Agarose, for the Open Reading end of Frame (ORF) on the mRNA containing the termination codon, mRNA and protein complexes It is considered to be difficult to form a body (right in FIG. 10B). もし上記で述べたようにSLRS mRNAのみが選択的に回収されるなら、本発明のシステムはタンパク質の選択に非常に有効であると考えられる。 If only SLRS mRNA as described above are selectively recovered, the system of the present invention are believed to be highly effective in the selection of proteins.

洗浄を繰り返し、非特異的にアガロースに結合しているmRNAを取り除いていくと、SLRS mRNAが選択的に結合した(図10C)。 Repeated washing and gradually removing the mRNA bound to the nonspecific agarose, SLRS mRNA was selectively bind (Figure 10C). SLRS mRNAの30%がビオチンアガロースに結合し、回収された。 30% of SLRS mRNA is bound to biotin agarose was recovered. これは従来より行われているリボソームディスプレイによるmRNAの回収率の0.015%の2000倍の効率であり、ランダムプールの多様性を確保するために大きな利点があると考えられる。 This is the 0.015% of 2000 times more efficient recovery of mRNA by ribosomal display, as conventionally performed, it is considered that there is great advantage in order to ensure the diversity of the random pool. その一方で、DLRS mRNA及びSLmRS mRNAは0.3%以下しか結合しなかった。 On the other hand, DLRS mRNA and SLmRS mRNA did not bind only 0.3% or less. さらにリシンを不活性化するとmRNAの回収効率がDLRS mRNAの場合と同じレベルまで落ちることから、リシンがリボソームを停止させることでタンパク質−mRNA複合体をより安定にしていると考えられる。 More inactivate lysine recovery efficiency of the mRNA from the drop to the same level as in the DLRS mRNA, it is believed lysine is more stable protein -mRNA complex by stopping the ribosome. またLysateを用いているため大腸菌の系に比べてRNAの分解が少ないのかもしれない。 The RNA degradation might small compared to the E. coli systems due to the use of Lysate. また3回の洗浄によってSLRS mRNAはDLRS mRNA及びSLmRS mRNAに対して100倍以上濃縮される(図10C)。 The SLRS mRNA by 3 washes are concentrated 100-fold or more relative to DLRS mRNA and SLmRS mRNA (Figure 10C). これはリボソームディスプレイの濃縮効率と同等の濃縮効率である。 This is the concentration efficiency equivalent concentration efficiency of ribosome display. 即ち、本発明のシステムはリボソームディスプレイ法と比べて同等以上の効率でタンパク質を選択できる系であることを示唆している。 That is, the system of the present invention suggest that in comparison with the ribosome display method is a system capable of selecting proteins with equal or greater efficiency.

さらに異なる選択モデルについても検証した。 It was also examined further different selection model. 上記にて構築したプラスミド(pGLRS, pSLRS, pSLmRS)より転写して得られたGLRS mRNA,SLRS mRNA,SLmRS mRNAを用いて上記と同様の手法に従って翻訳しその産物をそれぞれBiotin-Agaroseに結合させた(図11)。 Plasmid constructed in the above (pGLRS, pSLRS, pSLmRS) GLRS mRNA obtained by transcription from, SLRS mRNA, the products were translated according to the same procedure as described above using SLmRS mRNA respectively were coupled to Biotin-Agarose (Figure 11). もしタンパク質の選択システムが正しく働いているならばSLRS mRNAのみがBiotin-Agaroseに結合すると考えられる(図11A真中)。 If selection system protein is working correctly only SLRS mRNA is believed to bind to the Biotin-Agarose (Figure 11A middle). 又、(pSLRS, pGLRS, pGLmRS)より転写して得られたSLRS mRNA, GLRS mRNA, GLmRS mRNAを用いて上記と同様の手法に従って翻訳し、その産物をそれぞれGlutathione-Sepharoseに結合させた(図12)。 Further, (pSLRS, pGLRS, pGLmRS) SLRS mRNA obtained by transcription from, GLRS mRNA, translated according to the same procedure as described above using GLmRS mRNA, the products were each allowed to bind to Glutathione-Sepharose (Fig. 12 ). この場合は、GLRS mRNAのみがGlutathione-Sepharoseに結合すると考えられる(図12Aの真中)。 This case, it is considered that only GLRS mRNA binds to Glutathione-Sepharose (middle of FIG. 12A). 洗浄を繰り返し、非特異的に結合しているmRNAを取り除いていくと、それぞれSLRS mRNAとGLRS mRNAが選択的に結合していることが分かる(図11B及び図12B)。 Repeated washing and gradually remove the mRNA non-specifically bound, it can be seen that SLRS mRNA and GLRS mRNA respectively selectively coupling (FIGS. 11B and 12B). それぞれの場合に置いて、mRNAの回収率は5.1%(Biotin-Agarose)及び1.3%(Glutathione-Sepharose)だった。 Placed in each case, recovery of mRNA was 5.1% (Biotin-Agarose) and 1.3% (Glutathione-Sepharose). 濃縮効率はそれぞれ>25倍、>6倍だった。 Each concentration efficiency is> 25-fold,> was 6 times. よってこれらの結果からも本発明のシステムはリボソームディスプレイ法と比べて同等以上の効率でタンパク質を選択できることが示唆され、また様々なタンパク質に応用できるという可能性が示唆された。 Thus the system also present invention these results, it is suggested to choose a protein ribosome display method and compared over comparable with efficiency, also suggesting the possibility that can be applied to various proteins.

(B−4)Biotinアフィニティカラムによるタンパク質のSelection Selection of (B-4) Biotin affinity column with a protein
前記したように4種類のプラスミド(pSLRL, pDLRL, pSLRS, pDLRS)より4種類のmRNA(SLRL mRNA, DLRL mRNA, SLRS mRNA, DLRS mRNA)を転写した。 Wherein the way the four plasmids were transferred (pSLRL, pDLRL, pSLRS, pDLRS) than four mRNA (SLRL mRNA, DLRL mRNA, SLRS mRNA, DLRS mRNA) a. SLRL mRNA, DLRL mRNAではリシンの下流に、より長いspacerを挿入した。 SLRL mRNA, downstream of lysine in DLRL mRNA, was inserted a longer location spacer. これらのmRNAをそれぞれ適切な条件下で翻訳し、Biotinが結合したアガロースと結合させた(図13のA)。 These mRNA respectively translated in appropriate conditions, coupled with agarose Biotin is bound (A in Figure 13). またSLRL mRNAとDLRL mRNA、SLRS mRNAとDLRS mRNAをそれぞれ1:1の量で混合し(各0.5μg)これらも同様に適切な条件下で翻訳し、Biotinが結合したアガロースと結合させた。 The SLRL mRNA and DLRL mRNA, respectively SLRS mRNA and DLRS mRNA 1: 1 was mixed in an amount translated in (each 0.5 [mu] g) are also similarly suitable conditions, coupled with agarose Biotin is bound. 3回アガロースを洗浄した後、mRNAをElution Bufferによって分離した。 After washing three times agarose was separated mRNA by Elution Buffer. このmRNAを精製し、逆転写、PCRによって増幅した。 The mRNA was purified, reverse transcribed, and amplified by PCR. その結果、StAvをコードするcDNAが15cycleのPCRで選択的に増幅した(図13のB)。 As a result, cDNA encoding StAv was selectively amplified by PCR of 15cycle (B in Figure 13). DHFRをコードするcDNAはPCRを25cycle行っても増幅が見られなかった。 cDNA encoding DHFR is amplified even if 25cycle the PCR was observed. また1:1で混合した場合においてもStAvをコードするcDNAが選択的に増幅した。 The 1: cDNA encoding StAv even when the mixing is selectively amplified in 1. 即ち、本発明のシステムにおいてStAvタンパク質が正常に選択され、その遺伝子が回収されていることが示唆される。 That is, in the system of the present invention are selected StAv protein normally, suggesting that the gene is recovered. またタンパク質とphenotypeに相当するgenotypeのmRNAが正しく結合していることを示している。 Also it shows that mRNA of the genotype corresponding to protein and phenotype are correctly coupled. 興味のある点として、SLRS mRNAの方がSLRL mRNAに比べて効率よくアガロースに結合している。 As a point of interest, those of SLRS mRNA is bound to efficiently agarose compared to SLRL mRNA.

コントロールとしてそれぞれのmRNAを一定量(0.025μg)逆転写、PCRした。 Constant amount (0.025) reverse transcription of each mRNA as a control, and PCR. またSLRL mRNAとDLRL mRNA、SLRS mRNAとDLRS mRNAをそれぞれ1:1の量で混合し(各0.0125μg)同様に逆転写、PCRした。 The SLRL mRNA and DLRL mRNA, respectively SLRS mRNA and DLRS mRNA 1: 1 was mixed in an amount (each 0.0125) Similarly reverse transcription and PCR. これによってcDNAの増幅が濃度に依存していることが確かめられた。 This amplification of cDNA was confirmed to be dependent on the concentration. またmRNAを逆転写せずにPCRのみを行った場合cDNAは増幅しなかったため、DNAのContaminationはないことが確かめられた。 Also because when subjected only to PCR without reverse transcription mRNA cDNA was amplified, it was confirmed that no Contamination of DNA.

また同様の選択の手法に従ってGLRS mRNA,SLRS mRNAをそれぞれ1:1の量で混合したプールを適切な条件下で翻訳し、Biotin-Agarose又はGlutathione-Sepharoseと結合させた。 The GLRS mRNA according to procedures similar selection, respectively SLRS mRNA 1: The combined pooled translated under suitable conditions in an amount of 1, coupled with Biotin-Agarose or Glutathione-Sepharose. Biotin-Agaroseに結合させた場合、SLRS mRNAが選択され(図14A)、Glutathione-Sepharoseに結合させた場合、GLRS mRNAが選択されると考えられる(図14B)。 When attached to a Biotin-Agarose, SLRS mRNA is selected (Fig. 14A), when attached to a Glutathione-Sepharose, believed GLRS mRNA is selected (FIG. 14B). コントロールとしてSLRS mRNA, SLmRS mRNA, GLRS mRNAをそれぞれ転写してBiotin-Agaroseに結合させ(図14A)、又、GLRS mRNA, GLmRS mRNA, SLRS mRNAをそれぞれ転写してGlutathione-Sepharoseに結合させた(図14B)。 SLRS mRNA as a control, SLmRS mRNA, and transferring each GLRS mRNA bound to Biotin-Agarose (Figure 14A), also, GLRS mRNA, was GLmRS mRNA, was bound to Glutathione-Sepharose was transferred respectively SLRS mRNA (Fig. 14B). 3回アガロースを洗浄した後、mRNAをElution Bufferによって分離した。 After washing three times agarose was separated mRNA by Elution Buffer. このmRNAを精製し、逆転写、PCRによって増幅した。 The mRNA was purified, reverse transcribed, and amplified by PCR. その結果、1:1で混合したGLRS mRNA,SLRS mRNAのプールを用いて翻訳し、Biotin-Agaroseに結合させた場合StAvをコードするcDNAがPCRで選択的に増幅し、Glutathione-Sepharoseに結合させた場合、GSTをコードするcDNAがPCRで選択的に増幅した。 As a result, 1: mixed GLRS mRNA in 1, using a pool of SLRS mRNA translated, cDNA encoding StAv when attached to a Biotin-Agarose is selectively amplified by PCR, bound to Glutathione-Sepharose If, cDNA encoding GST was selectively amplified by PCR. よってこの結果からもタンパク質とphenotypeに相当するgenotypeのmRNAが正しく結合していることを示された。 Thus mRNA of genotype corresponding to protein and phenotype From this result was shown that it is properly coupled.

[実施例3] [Example 3]
リボソームディスプレイシステムの一般的な適用可能性を評価するために、本発明者はリボソーム-mRNA複合体の安定性を、停止コドンの存在下および非存在下、さらにはリボソーム-mRNA複合体の内部における翻訳されたペプチドとそのmRNAとの間の追加的な相互作用の存在下および非存在下で検討した。 To assess the general applicability of ribosome display system, the present inventors have stability ribosome -mRNA complex, in the interior of the presence and absence, furthermore ribosome -mRNA complex stop codon It was studied in the presence and absence of additional interactions between the translated peptide and its mRNA.

本発明者が利用した追加的な相互作用は、直列式に融合したMS2コートタンパク質(MSp)二量体と、それに対応する特異的結合モチーフのRNA配列(Cバリアント(またはCv)と命名)との間の相互作用である。 Additional interactions present inventor has utilized the MS2 coat protein fused in series fashion (MSp) dimer, an RNA sequence of the specific binding motifs corresponding (C variant (or Cv) named) it is the interaction between.
具体的には、図16に示す構築物をin vitroで転写・翻訳し、これにより形成された複合体をNi-NTAアガロースを用いて選択した。 Specifically, the construct shown in Figure 16 was transcribed and translated in in vitro, the thereby formed complexes was selected using Ni-NTA agarose.
その結果、mMSp-Cv相互作用を追加的に導入することにより、システムの効率が改善され(図18)、選択後のmRNAの回収率は、3回の反復洗浄後で0.46%であり、mMSp-Cv相互作用のない場合の回収率0.24%に比べて明らかに優位であった。 As a result, by additionally introducing MMSP-Cv interaction, the efficiency of the system is improved (FIG. 18), the recovery of mRNA after selection, 0.46% after three repeated washing, MMSP If no -Cv interaction was clearly superior compared to the recovery of 0.24% of the. 本発明者は、定量的RT-PCRによって評価される、ヒスチジンタグをコードするmRNAの量とヒスチジンタグをコードしないmRNAの量との比として選択性を定義したが、算出された選択性は3(Cvなし)から6(Cvあり)に高まった。 The present inventor is assessed by quantitative RT-PCR, it has been defined selectivity as the ratio of the amount of mRNA that does not encode the amount and histidine tag of the mRNA encoding the histidine tag, the calculated selectivity 3 It has increased from (Cv None) to 6 (with Cv). したがって、mMSp-Cv相互作用の導入により、標的mRNAの収率だけでなく、ポリソームディスプレイシステムの選択性も改善された。 Therefore, the introduction of MMSP-Cv interaction, not only the yield of the target mRNA, was also improved selectivity of the polysome display system.

TatアプタマーとTat由来ペプチド(REとCQ)に対するリンカーを選択した結果、RNAとタンパク質との極めて強い相互作用が、ネットワーク構造を避けることにより、遺伝子型と表現型の結合に利用できる可能性が実証された。 Tat aptamer and Tat-derived peptides (RE and CQ) result of selecting the linker to a very strong interaction between the RNA and protein, by avoiding a network structure, is demonstrated potential use for binding genotype and phenotype It has been. このような相互作用を利用することにより強いRNA-タンパク質間相互作用を選択でき、操作できるはずである。 You can select a strong RNA- protein-protein interactions by utilizing such interactions should be operated. さらに、より長い半減期をも有するタンパク質とmRNAの複合体を生成でき、選択がかなり容易になる。 Furthermore, to generate a longer protein also has a half-life and mRNA complex, selection is made considerably easier. リボゾームディスプレイ系などの他の手法は、リボゾーム-mRNA複合体の天然の半減期を変えることは困難である。 Other techniques, such as ribosome display system, it is difficult to change the half-life of the native ribosomal -mRNA complex.

さらに、本発明の手法は、単に融合遺伝子から終止コドンを削除することによってリボゾームディスプレイ系と組み合わせることができる。 Furthermore, the method of the present invention can be combined with ribosome display system by simply deleting the stop codon from the fusion gene. その結果、図6のレーン3に示したように、2つの部位で結合する結果として、有意により安定なタンパク質-mRNA複合体が得られる。 As a result, as shown in lane 3 of Figure 6, as a result of binding at two sites, stable protein -mRNA complex is obtained by significantly.
また、本発明の選択手法は操作が単純で直接的であるという利点を有する。 The selection method of the present invention has the advantage that the operation is simple and straightforward.

リシン遺伝子をStAv遺伝子の下流に接続することでリシンによりリボソームを停止させ、効率よくgenotypeとphenotypeを結合させることが本発明により実証された。 Connecting the ricin gene downstream of StAv gene ribosome was stopped by lysine, it is bound efficiently genotype and phenotype has been demonstrated by the present invention. これによって極めて高い効率で目的のmRNAを選択することができる。 This makes it possible to select the desired mRNA at very high efficiency. リシン遺伝子の下流にあるspacer配列はlong及びshortの2種類構築したが、短いspacer配列を挿入したほうが効率よくmRNAが回収されることがわかった。 spacer sequence downstream of the ricin gene was two building long and short, but better to insert a short spacer sequence was found to efficiently mRNA is recovered. SLRS mRNAの場合、回収効率は30%でこれは従来にないほどの高回収率だった。 For SLRS mRNA, recovery efficiency by 30 percent was high recovery of about unprecedented. またこの選択システムによってSLRS mRNAはDLRS mRNAに対して100倍以上濃縮されることが示された。 The SLRS mRNA This selection system has been shown to be enriched 100-fold or more relative to DLRS mRNA.

上記した本発明のシステムを用いることによりランダムDNAプールより新規機能タンパク質を効率よくスクリーニングすることが可能である。 It is possible to efficiently screen a novel functional protein than random DNA pool by using the system of the present invention described above.

図1は、精製したDHFR-(RE) 1-3融合タンパク質および野生型(wt)DHFRを示す模式図とSDS-PAGE後のゲルの写真である。 Figure 1 is a gel photograph of the schematic diagram and after SDS-PAGE showing purified DHFR- (RE) 1-3 fusion protein and wild type (wt) DHFR. 精製した組換え型タンパク質(約100μg)をSDS-PAGEに供し、クマシーブルーで染色して可視化した。 The purified recombinant protein (about 100μg) were subjected to SDS-PAGE, and visualized by staining with Coomassie blue. レーン1、マーカー; レーン2、野生型DHFR; レーン3、DHFR-(RE) 1 ; レーン4、DHFR-(RE) 2 ; レーン5、DHFR-(RE) 3左側にマーカータンパク質の分子量を示す。 Lane 1, marker; lane 2, wild-type DHFR; lane 3, DHFR- (RE) 1; lane 4, DHFR- (RE) 2; lane 5, DHFR- (RE) indicating the molecular weight of the marker proteins in 3 left. DHFRと一つ目のREペプチドの間と、REと隣接するREペプチドの間に、ポリグリシンリンカーを挿入した。 And between the DHFR and one eye RE peptide, between the RE peptide and the adjacent RE, it was inserted poly-glycine linker. 精製のためにポリヒスチジン(His)をDHFRのN末端に連結した。 The polyhistidine (His) for purification and ligated to the N-terminus of the DHFR. 図2は、解離定数(K d )の測定の結果を示す図および写真である。 Figure 2 is a diagram and photographs showing the results of measurement of the dissociation constant (K d). それぞれのレーンCには、アプタマーのみをロードした。 Each lane C, were loaded with only aptamer. 黒い矢印は、タンパク質-RNA複合体を示し、白い矢印は遊離のRNAを指す。 The black arrows indicate protein -RNA complexes, the white arrow points to the free RNA. 複合体と遊離のRNAの相対量は、 32 Pの放射能から計算した。 The relative amounts of free RNA complexes were calculated from the radioactivity of 32 P. 平衡解離定数は、ペプチドの濃度に対する遊離のRNAまたは複合体のRNAの濃度から最小二乗法により求めた理論曲線から決定した。 The equilibrium dissociation constants were determined from the theoretical curve obtained by the least square method from the concentration of RNA of free RNA or complex to the concentration of the peptide. ひし形は、遊離のRNAの相対量を示し、四角形は複合体の相対量を示す。 Diamonds indicates the relative amount of free RNA, squares indicate the relative weight of the complex. 各パネルにおいて、細長い黒い三角形は、タンパク質の濃度の上昇を示している。 In each panel, elongated black triangle shows the increase in the concentration of the protein. (A)(Apt) 1-3と野生型DHFRとの相互作用の欠如を示す写真である。 (A) (Apt) 1-3 and is a photograph showing a lack of interaction with the wild type DHFR. それぞれのレーンCには1 nMの(Apt) 1-3をロードし、細長い三角形で示すように、20、100、500 nMの野生型DHFRを加えた。 Each lane C loads a 1 nM of (Apt) 1-3, as indicated by an elongated triangle, plus wild-type DHFR of 20,100,500 nM. (B) (Apt) 1とDHFR-(RE) 1の結合を示す図および写真である。 (B) (Apt) are diagrams and photographs showing 1 DHFR- the (RE) 1 binding. 30 pMの(Apt) 1 (レーンC)に、細長い三角形で示すとおり、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32 nMのDHFR-(RE) 1を混合した。 In the 30 pM (Apt) 1 (lane C), as indicated by an elongated triangle, it was mixed 0.25,0.5,1,2,4,8,16,32 of nM DHFR- (RE) 1. (CおよびD)(Apt) 2-3とDHFR-(RE) 2-3タンパク質の結合を示す図および写真である。 Diagrams and photographs showing the binding of (C and D) (Apt) 2-3 and DHFR- (RE) 2-3 protein. 30 pMの(Apt) 2または(Apt) 3 RNA(レーンC)に、細長い三角形で示すように、0.03、0.06、0.12、0.25、0.5、1、2、4、8、16 nMのタンパク質を混合した。 To 30 pM of (Apt) 2 or (Apt) 3 RNA (lane C), as indicated by an elongated triangle, mixed 0.03,0.06,0.12,0.25,0.5,1,2,4,8,16 nM protein did. 図3は、in vitro における(Apt) 3と(RE) 3との相互作用を用いる機能性タンパク質の選択のモデルを示す図および写真である。 Figure 3 is a diagram and photographs illustrating the selection of a model of a functional protein using the interaction in in vitro (Apt) 3 and (RE) 3. (A)転写されたRNAと翻訳されたタンパク質とメトトレキセート結合アガロースビーズ(MTXリガンド)との相互作用の模式図である。 It is a schematic diagram of the interaction with (A) RNA transcribed and translated protein and methotrexate binding agarose beads (MTX ligand). (B)MTX-ビーズによるDHFR-(RE) 3タンパク質およびmRNA(野生型)の濃縮を示すSDS-PAGEの結果の写真である。 (B) MTX-beads by DHFR- (RE) 3 protein and mRNA is a result photograph of SDS-PAGE showing the concentration of (wild-type). 各サンプルは、15%ゲルのSDS-PAGEに供した。 Each sample was subjected to SDS-PAGE 15% gel. レーン1〜3、それぞれの翻訳反応の後、1μlの細胞溶解液をロードした。 Lanes 1-3, after each translation reaction were loaded with 1μl of cell lysate. レーン4〜6、MTX-ビーズに結合したmRNAおよびタンパク質を含む溶出液を10 μlロードした。 Lanes 4-6 were 10 [mu] l loading the eluate containing mRNA and protein bound to MTX- beads. レーン1と4は野生型タンパク質を示す;レーン2および5は変異型タンパク質を示す;そしてレーン3と6には対照サンプルをロードした。 Lanes 1 and 4 show the wild-type protein; loaded the control sample in and lanes 3 and 6; lanes 2 and 5 show the mutant protein. (C) (B)に示したタンパク質とmRNAの定量結果を示す図である。 Is a diagram showing the quantitative results of (C) (B) to indicate the protein and mRNA. 図4は、ストレプトアビジンとDHFR mRNAの混合物のプールからのストレプトアビジンをコードするmRNAのin vitroにおける選択を示す図および写真である。 4 is a diagram and photographs illustrating the selection of in vitro of mRNA encoding streptavidin from a pool of a mixture of streptavidin and DHFR mRNA. (A)転写されたRNAと翻訳されたタンパク質とビオチン結合アガロースビーズ(ビオチンリガンド)との相互作用の模式図である。 (A) RNA transcribed and translated protein and biotin binding agarose beads is a schematic diagram of the interaction of (biotin ligand). (B)ビオチンアガロースビーズによるストレプトアビジン-(RE) 3 -(Apt) 3 mRNAの濃縮を示す変性PAGEの結果の写真である。 (B) streptavidin with biotin-agarose beads - (RE) 3 - (Apt ) is the result photograph of denaturing PAGE showing the concentration of 3 mRNA. 翻訳およびその後の選択の後、各サンプルを4%ゲルにおける変性PAGEに供した。 After translation and subsequent selection were subjected to each sample to denaturing PAGE in 4% gel. レーン1;単離したストレプトアビジン-(CQ) 3 -(Apt) 3 mRNA。 Lane 1; isolated streptavidin - (CQ) 3 - (Apt ) 3 mRNA. ストレプトアビジンをコードするmRNA(1.25 μg)を細胞溶解液中で翻訳し、ビオチンビーズで選択した。 mRNA encoding streptavidin (1.25 [mu] g) was translated in cell lysates were selected on biotin beads. レーン2;単離したDHFR-(CQ) 3 -(Apt) 3 mRNA。 Lane 2; isolated DHFR- (CQ) 3 - (Apt ) 3 mRNA. DHFRをコードするmRNA(1.25 μg)を細胞溶解液中で翻訳し、ビオチンビーズで選択した。 The mRNA (1.25 [mu] g) was translated in cell lysate encoding DHFR, it was selected with biotin beads. DHFRはビオチンビーズと相互作用しないと予想されるため、結合したDHFR-(CQ) 3 -(Apt) 3 mRNAのレベルは、非特異的な(バックグランドの)相互作用のレベルを示す。 Since DHFR is not expected to interact with the biotin beads bound DHFR- (CQ) 3 - (Apt ) 3 mRNA levels are indicative of the level of non-specific (background) interaction. レーン3;単離したストレプトアビジン-(CQ) 3 -(Apt) 3とDHFRのmRNA(上のバンド;DHFR mRNA、下のバンド;ストレプトアビジン)。 Lane 3; isolated streptavidin - (CQ) 3 - (Apt ) 3 and DHFR of mRNA (upper band; DHFR mRNA, the lower band; streptavidin). ストレプトアビジンまたはDHFRのそれぞれをコードするmRNAを1:1の比で混合したものを溶解液中で翻訳し、ビオチンビーズで選択した。 MRNA encoding the respective streptavidin or DHFR 1: a mixture in a ratio translated in lysates were selected on biotin beads. 図5は、ウサギ網状赤血球細胞溶解液中の機能性DHFRの選択における、(RE) 3 -(Apt) 3とリボゾームディスプレイ系との相互作用の強度の比較を示す図および写真である。 5, in the selection of functional DHFR rabbit reticulocyte cell lysate, (RE) 3 - are diagrams and photographs illustrating a comparison of the intensity of the interaction between (Apt) 3 and ribosome display systems. (A)転写されたRNAと翻訳されたタンパク質とメトトレキセート結合アガロースビーズ(MTXリガンド)との相互作用の模式図である。 It is a schematic diagram of the interaction with (A) RNA transcribed and translated protein and methotrexate binding agarose beads (MTX ligand). (B)DHFR-(RE) 3 -(Apt) 3 、DHFR-StopまたはDHFR+Stop mRNAのMTX-ビーズでの濃縮を示すための、RT-PCR産物を2%アガロースで電気泳動した結果を示す写真である。 (B) DHFR- (RE) 3 - (Apt) shows a 3, DHFR-Stop or to indicate the concentration in MTX- beads DHFR + Stop mRNA, results of electrophoresis of RT-PCR products on a 2% agarose is a photograph. PCR反応は、20サイクル行った。 PCR reaction was carried out 20 cycles. 各サンプルを、2%のSea Kem GTG アガロースゲル(FMC,Riceland, Maine USA)に供した。 Each sample of 2% Sea Kem GTG agarose gel (FMC, Riceland, Maine USA) was subjected to. レーン1、DHFR-(RE) 3 -(Apt) 3 mRNAからのPCR産物;レーン2、DHFR+Stop mRNAからのPCR産物;レーン3、DHFR-Stop mRNAからのPCR産物。 PCR products from lanes 2, DHFR + Stop mRNA;; lane 3, PCR products from DHFR-Stop mRNA - Lane 1, DHFR- (RE) 3 ( Apt) PCR products from 3 mRNA. PCR産物の分析を一度行ったが、図5Cに示すmRNAのレベルの定量の方が、より信頼性が高い。 Although the analysis of the PCR products was performed once found the following quantification of the level of mRNA shown in FIG. 5C, more reliable. (C)濃縮されたmRNAの定量の結果を示す図である。 (C) is a graph showing the results of quantification of the concentrated mRNA. 選択されたmRNAの相対量は、 32 P標識化mRNAのカウントにより検出した。 The relative amounts of selected mRNA was detected by counting the 32 P-labeled mRNA. それぞれのレーンの番号は、図5Bのレーンの番号に相当する。 Number of each lane corresponds to the number of lanes in Figure 5B. 結果は、独立して行った4回の実験の平均である。 Results are the mean of four experiments performed independently. 図6は、大腸菌S30株抽出液中における、(RE) 3 -(Apt) 3の相互作用とリボゾームディスプレイ系とを組み合わせることによる、各mRNAとその産物の複合体の安定性の増大を示す図および写真である。 6, in E. coli S30 strain extract, (RE) 3 - shows an increase in the (Apt) by combining the 3 interacts with ribosome display systems, stability of the complex of the mRNA and its product and a photograph. (A)転写されたRNAと翻訳されたタンパク質とメトトレキセート結合アガロースビーズ(MTXリガンド)との相互作用の模式図である。 It is a schematic diagram of the interaction with (A) RNA transcribed and translated protein and methotrexate binding agarose beads (MTX ligand). (B)終結因子(大腸菌のRF1、RF2、およびRF3)に対するポリクローナルIgG抗体の存在下(レーン1およびレーン3)、または非存在化(レーン2およびレーン4)の、DHFR-Stop mRNA(レーン1およびレーン2)および(Apt) 3 -(RE) 3 -DHFR-Stop mRNA(レーン3およびレーン4)の、MTX-ビーズでの濃縮を示すための、RT-PCR産物を2%アガロースで電気泳動した結果を示す写真である。 (B) of the release factors (E. coli RF1, RF2, and RF3) the presence of polyclonal IgG antibodies to (lanes 1 and 3), or absence of (lanes 2 and 4), DHFR-Stop mRNA (lane 1 and lane 2) and (Apt) 3 - (RE) 3 -DHFR-Stop mRNA (lane 3 and lane 4), for indicating the concentration in MTX- beads, electrophoresis RT-PCR products on a 2% agarose is a photograph showing the results. 選択されたmRNAは、図5に記したものと同様の条件で、MTX-アガロースビーズに供した。 The selected mRNA is under the same conditions as those noted in Figure 5, was subjected to MTX- agarose beads. (C)(B)に示したRT-PCR産物の定量の結果を示す図である。 Is a diagram showing the results of quantification of (C) (B) to the indicated RT-PCR products. 結果は、独立して行った2回の実験の平均である。 The results are the average of the two was performed independent experiments. 図7Aは、RNA-タンパク質間の結合のネットワーク化の可能性を示す図である。 Figure 7A is a diagram showing the potential of the network of bonds between RNA- protein. 原理的にはタンデムに結合させたTat(RE)ペプチドとアプタマーは分子内だけではなく、分子間でも結合する。 Principle, the Tat bound to tandem (RE) peptide aptamers are not only the molecule also binds intermolecularly. 分子間で結合した場合、RNA-タンパク質の結合がネットワーク化してしまう。 When bound by intermolecular, RNA-binding proteins will be networked. 同じペプチド及びアプタマーをタンデムに連結するのではなく、異なるペプチド及びアプタマーを連結することでこの分子間の相互作用を最小限に抑える事ができる。 The same peptides and aptamers rather than linked in tandem, can be suppressed to a minimum interaction between the molecule by connecting the different peptides and aptamers. 図7Bは、in vitroにおける機能性タンパク質の選択方法の第1の実施態様の模式図である。 Figure 7B is a schematic view of a first embodiment of the selection method of functional proteins in in vitro. 結合性タンパク質が生成され、転写、翻訳、親和性選択、そしてPCRという工程を何度も繰り返すことにより濃縮される。 Binding proteins are produced, transcription, translation, affinity selection, and is concentrated by a process that is repeated many times as PCR. 翻訳工程において、タンデムアプタマー(Apt) 3は、タンデムREペプチド(RE) 3と、きわめて高い親和性により結合する。 In the translation process, tandem aptamer (Apt) 3 includes a tandem RE peptide (RE) 3, are linked by very high affinity. 該結合が、タンパク質とそのmRNAを結合させる。 Said binding is to bind protein and its mRNA. 実施例1においては、DHFRおよびストレプトアビジンを選択ステップの標的として用いたが、任意のタンパク質をタンデムアプタマー(Apt) 3およびタンデムREペプチド(RE) 3と組み合せて用いることができる。 In Example 1, was used DHFR and streptavidin as the target of the selection step can be used in combination with any protein tandem aptamer (Apt) 3 and tandem RE peptide (RE) 3. 図8は、リシンを用いたIn vitroでのタンパク質選択システムのモデルを示す図である。 Figure 8 is a diagram showing a model of the protein selection system in In vitro using lysine. DNAのランダムライブラリーもしくはcDNAライブラリーを用意する。 To prepare a random library or cDNA library of DNA. この配列の3'末端側にはリシンの配列及びスペーサー配列が挿入されている。 Sequence and the spacer sequence of ricin is inserted into the 3 'end of this sequence. 転写・翻訳を行うと、ライブラリーのタンパク質に続いてリシンが翻訳され、このリシンが分子内反応でリボソームを不活性化し、リボソームの翻訳を停止させる。 Doing transcription and translation, lysine is translated following the protein library, the lysine inactivate ribosomes in intramolecular reaction is stopped ribosome translation. その結果RNA-リボソーム-タンパク質複合体が形成される。 Consequently RNA- ribosome - protein complex is formed. この複合体のRNAはタンパク質の遺伝情報をコードしているので、特定の機能タンパク質を選択すると、そのタンパク質の遺伝情報を持ったRNAを共に回収することができる。 This RNA complex encodes the genetic information of the protein, selecting a particular functional protein, it is possible to both collect the RNA having genetic information of the protein. このRNAを逆転写・PCRすることで増幅し、その遺伝情報を読みとることで選択されたタンパク質の配列を知ることが出来る。 The RNA was amplified by reverse transcription · PCR, it is possible to know the sequence of the selected protein by reading the genetic information. 又、より選択圧をかけるために上記のサイクルを繰り返すことができる。 Further, it is possible to repeat the above cycle to place a more selective pressure. 図9Aは、タンパク質の選択システムのモデル系に用いたDNA配列を示す図である。 Figure 9A is a diagram showing the DNA sequence used for the model system selection system of the protein. 5'側よりT7プロモーター、ストレプトアビジン若しくはGST配列、リンカー配列、リシンA鎖配列若しくはリシンA鎖配列の一部に変異を加えた不活性型リシンA鎖の配列、M13ファージGene III遺伝子由来のスペーサー配列(360bp若しくは1212bp)の順に遺伝子が挿入されている。 5 'side of the T7 promoter, streptavidin or GST sequence, a linker sequence, ricin A chain sequence or variant sequence of inactive ricin A chain were added to a portion of the ricin A chain sequence, M13 phage Gene III gene derived from the spacer gene is inserted in the order of sequence (360 bp or 1212bp). ストレプトアビジン及びGST配列は選択の対象となるタンパク質。 Streptavidin and GST sequence is the selection of the protein of interest. リンカー配列はペプチドリンカーをコードし、ストレプトアビジン及びGSTとリシンA鎖の立体障害を解消するために挿入した。 The linker sequence encodes a peptide linker was inserted to eliminate the streptavidin and GST and steric hindrance of the ricin A chain. スペーサー配列はリボソームが他のタンパク質のfoldingや活性が阻害されないようにするため挿入した。 Spacer sequence was inserted so that the ribosome is not inhibited is folding or activity of other proteins. 図9Bは、SLmRS,SLRS,SLmRL,SLRL遺伝子の翻訳を示す模式図である。 9B is a schematic diagram showing SLmRS, SLRS, SLmRL, translation of SLRL gene. SLmRS, SLmRL遺伝子はリシンが機能しないため、RNA-リボソーム-タンパク質複合体が形成されない。 SLmRS, since SLmRL gene lysine does not function, RNA-ribosome - protein complex is not formed. よって、タンパク質がリボソームから解離し、効率よくタンパク質が創られる。 Thus, proteins are dissociated from the ribosome efficiently protein is created. 図9Cは、SLmRS,SLRS,SLmRL,SLRL遺伝子から翻訳されたタンパク質を示す写真である。 Figure 9C is a photograph showing SLmRS, SLRS, SLmRL, a protein translated from SLRL gene. S35-メチオニンでラベルし、10%SDS-PAGEでタンパク質を検出した。 Labeled with S35- methionine, proteins were detected by 10% SDS-PAGE. リンカーが短い方がタンパク質が多く創られた。 Linker is better it has been created many protein short. リシンが不活性化している場合、より多くのタンパク質が創られた。 If lysine is inactivated, more protein was created. SLRL遺伝子からはほとんどタンパク質が検出されなかった。 Most proteins from SLRL gene was not detected. 図10Aは、ビオチンアガロースによるストレプトアビジンタンパク質をコードしたmRNA(SLRS)の選択を示す模式図である。 Figure 10A is a schematic diagram illustrating the selection of mRNA encoding streptavidin protein with biotin agarose (SLRS). 一方、DHFRをコードしたmRNAはビオチンアガロースに結合しない(DLRS)。 Meanwhile, mRNA encoding a DHFR does not bind to biotin agarose (DLRS). またリシンを不活性化した場合もストレプトアビジンタンパク質をコードしたmRNAはビオチンアガロースに結合しない(SLmRS)。 Also mRNA encoding a streptavidin protein may inactivate the lysine does not bind to biotin agarose (SLmRS). 図10Bは、ビオチンアガロースによるストレプトアビジンタンパク質をコードしたmRNAの回収量を示す図である。 Figure 10B is a diagram illustrating the recovery of the mRNA encoding a streptavidin protein with biotin agarose. 翻訳後、ビオチンアガロースに結合させた後、結合していないmRNAを洗浄し、残ったmRNAの量を測定した。 After translation, after binding to biotin agarose, washed mRNA unbound, to determine the amount of the remaining mRNA. SLRS mRNAは3回の洗浄後、翻訳に使用したmRNAの量の30%がビオチンアガロースに結合した。 After SLRS mRNA's 3 washes, 30% of the amount of mRNA was used in the translation is bound to biotin agarose. 一方、DLRS、SLmRS mRNAは3回の洗浄後、ほとんど結合が見られなかった。 On the other hand, DLRS, after SLmRS mRNA is of 3 washes, most binding was observed. SLRS mRNAは3回の洗浄後、100倍以上濃縮された。 SLRS mRNA after three washes were concentrated 100-fold or more. 図11Aは、ビオチンアガロースによるストレプトアビジンタンパク質をコードしたmRNA(SLRS)の選択を示す模式図である。 Figure 11A is a schematic diagram illustrating the selection of mRNA encoding streptavidin protein with biotin agarose (SLRS). 一方、GSTをコードしたmRNAはビオチンアガロースに結合しない(GLRS)。 Meanwhile, mRNA encoding a GST does not bind to biotin agarose (GLRS). またリシンを不活性化した場合もストレプトアビジンタンパク質をコードしたmRNAはビオチンアガロースに結合しない(SLmRS)。 Also mRNA encoding a streptavidin protein may inactivate the lysine does not bind to biotin agarose (SLmRS). 図11Bは、ビオチンアガロースによるストレプトアビジンタンパク質をコードしたmRNAの回収量を示す図である。 Figure 11B is a diagram illustrating the recovery of the mRNA encoding a streptavidin protein with biotin agarose. 翻訳後、ビオチンアガロースに結合させた後、結合していないmRNAを洗浄し、残ったmRNAの量を測定した。 After translation, after binding to biotin agarose, washed mRNA unbound, to determine the amount of the remaining mRNA. SLRS mRNAは4回の洗浄後、翻訳に使用したmRNAの量の5%がビオチンアガロースに結合した。 After SLRS mRNA is four washes, 5% of the amount of mRNA used in translation is bound to biotin agarose. 一方、GLRS、SLmRS mRNAは4回の洗浄後、ほとんど結合が見られなかった。 On the other hand, GLRS, after SLmRS mRNA's 4 washes, most binding was observed. SLRS mRNAは4回の洗浄後、25倍以上濃縮された。 SLRS mRNA after four washes were concentrated 25-fold or more. 図12Aは、グルタチオンセファロースによるGSTタンパク質をコードしたmRNA(GLRS)の選択を示す模式図である。 Figure 12A is a schematic diagram illustrating the selection of mRNA encoding GST proteins by glutathione sepharose (GLRS). 一方、ストレプトアビジンをコードしたmRNAはグルタチオンセファロースに結合しない(SLRS)。 Meanwhile, mRNA encoding a streptavidin does not bind to glutathione Sepharose (SLRS). またリシンを不活性化した場合もGSTタンパク質をコードしたmRNAはグルタチオンセファロースに結合しない(GLmRS)。 Also mRNA encoding a GST protein may inactivate the lysine does not bind to glutathione sepharose (GLmRS). 図12Bは、グルタチオンセファロースによるGSTタンパク質をコードしたmRNAの回収量を示す図である。 Figure 12B is a diagram illustrating the recovery of the mRNA encoding a GST protein by Glutathione Sepharose. 翻訳後、グルタチオンセファロースに結合させた後、結合していないmRNAを洗浄し、残ったmRNAの量を測定した。 After translation, after binding to glutathione sepharose, washed mRNA unbound, to determine the amount of the remaining mRNA. GLRS mRNAは4回の洗浄後、翻訳に使用したmRNAの量の1.2%がグルタチオンセファロースに結合した。 After GLRS mRNA's 4 washes, 1.2% of the amount of mRNA used in translation was bound to glutathione sepharose. 一方、SLRS、GLmRS mRNAは4回の洗浄後、ほとんど結合が見られなかった(0.2%以下)。 On the other hand, SLRS, after GLmRS mRNA's 4 washes, most binding was observed (0.2%). GLRS mRNAは4回の洗浄後、6倍以上濃縮された。 GLRS mRNA after four washes were concentrated 6 times or more. 図13Aは、ビオチンアガロースによるストレプトアビジンタンパク質をコードしたmRNA(SLRS、SLRL)の選択を示す模式図である。 Figure 13A is a schematic diagram illustrating the selection of mRNA encoding streptavidin protein with biotin agarose (SLRS, SLRL). 一方、DHFRをコードしたmRNAはビオチンアガロースに結合しない(DLRS, SLRL)。 Meanwhile, mRNA encoding a DHFR does not bind to biotin agarose (DLRS, SLRL). SLRS, DLRSのスペーサーの長さはSLRL, DLRLのスペーサーの長さに比べて短い。 SLRS, the length of the spacer DLRS is shorter than SLRL, the length of the spacer DLRL. 図13Bは、ストレプトアビジン及びDHFRタンパク質をコードしたmRNA(SLRS+DLRS及びSLRL+DLRL)の混合プールからビオチンアガロースによるストレプトアビジンタンパク質(SLRSおよびSLRL)をコードしたmRNAの選択を示す写真である。 Figure 13B is a photograph showing a selected from a mixed pool of mRNA encoding streptavidin and DHFR protein (SLRS + DLRS and SLRL + DLRL) of mRNA encoding streptavidin protein with biotin-agarose (SLRS and SLRL). mRNAのプールを翻訳し、ビオチンアガロースに結合させた後、結合したmRNAをRT-PCRによって増幅した。 Translating mRNA pool, after binding to biotin agarose, and bound mRNA was amplified by RT-PCR. その結果、SLRS mRNA及びSLRL mRNAが増幅した。 As a result, SLRS mRNA and SLRL mRNA was amplified. 一方、SLmRS(L) mRNA及び DLRS(L) mRNAはRT-PCRによって増幅しなかった。 On the other hand, SLmRS (L) mRNA and DLRS (L) mRNA was amplified by RT-PCR. SLRS(L) mRNAとDLRS(L) mRNAを1:1で混合したプールを翻訳し、ビオチンアガロースに結合させた後、RT-PCRを行ったところ、SLRS(L) mRNAが選択的に増幅した。 SLRS (L) an mRNA DLRS (L) mRNA 1: mixed pooled translated in 1, after binding to biotin agarose was subjected to RT-PCR, SLRS (L) mRNA was selectively amplified . スペーサーが短い方が効率よく選択ができた。 If the spacer is short it could be efficiently selected. 図14Aは、ストレプトアビジン及びGSTタンパク質をコードしたmRNA(SLRS+GLRS)の混合プールからビオチンアガロースによるストレプトアビジンタンパク質(SLRS)をコードしたmRNAの選択を示す写真である。 Figure 14A is a photograph showing a selected from a mixed pool of mRNA encoding streptavidin and GST proteins (SLRS + GLRS) of mRNA encoding streptavidin protein with biotin agarose (SLRS). SLRS mRNAを翻訳し、ビオチンアガロースに結合させた後、結合したmRNAをRT-PCRによって増幅した。 Translate the SLRS mRNA, after binding to biotin agarose, and bound mRNA was amplified by RT-PCR. その結果、SLRS mRNAが増幅した。 As a result, SLRS mRNA was amplified. 一方、SLmRS mRNA及び GLRS mRNAはRT-PCRによって増幅しなかった。 On the other hand, SLmRS mRNA and GLRS mRNA was amplified by RT-PCR. SLRS mRNAとGLRS mRNAを1:1で混合したプールを翻訳し、ビオチンアガロースに結合させた後、RT-PCRを行ったところ、SLRS mRNAが選択的に増幅した。 The SLRS mRNA and GLRS mRNA 1: mixed pooled translated in 1, after binding to biotin agarose was subjected to RT-PCR, SLRS mRNA was selectively amplified. 図14Bは、ストレプトアビジン及びGSTタンパク質をコードしたmRNA(SLRS+GLRS)の混合プールからグルタチオンアガロースによるGSTタンパク質(GLRS)をコードしたmRNAの選択を示す写真である。 Figure 14B is a photograph showing a selection of mRNA encoding GST protein (GLRS) by glutathione agarose from a mixed pool of mRNA encoding streptavidin and GST proteins (SLRS + GLRS). GLRS mRNAを翻訳し、グルタチオンアガロースに結合させた後、結合したmRNAをRT-PCRによって増幅した。 Translate GLRS mRNA, after binding to glutathione agarose, and bound mRNA was amplified by RT-PCR. その結果、GLRS mRNAが増幅した。 As a result, GLRS mRNA was amplified. 一方、GLmRS mRNA及び SLRS mRNAはRT-PCRによって増幅しなかった。 On the other hand, GLmRS mRNA and SLRS mRNA was amplified by RT-PCR. SLRS mRNAとGLRS mRNAを1:1で混合したプールを翻訳し、ビオチンアガロースに結合させた後、RT-PCRを行ったところ、GLRS mRNAが選択的に増幅した。 The SLRS mRNA and GLRS mRNA 1: mixed pooled translated in 1, after binding to biotin agarose was subjected to RT-PCR, GLRS mRNA was selectively amplified. 図15は、想定される環状化ポリソームディスプレイシステムの予想図である。 Figure 15 is a prospective view of a cyclized polysome display system envisioned. 図16Aは、本発明者の新規選択システムのためのin vitro転写用のテンプレートとして調製した構築物を示す図である。 Figure 16A is a diagram showing a construct prepared as a template for in vitro transcription for the new selection system of the present inventors. 以下のテンプレートDNAを設計した:dCvH(+)mM2D(+),(I);dCvH(-)mM2D(+),(II);dCvH(+)mM2D(-),(III);dCvH(-)mM2D(-),(IV)。 It was designed following Template DNA: dCvH (+) mM2D (+), (I); dCvH (-) mM2D (+), (II); dCvH (+) mM2D (-), (III); dCvH (- ) mM2D (-), (IV). dCvH(+)mM2D(+)とdCvH(-)mM2D(+)にはいずれも終止コドンがあるが、dCvH(+)mM2D(-)とdCvH(-)mM2D(-)にはない。 dCvH (+) mM2D (+) and dCvH (-) mM2D (+) in it is also stop codon Any, dCvH (+) mM2D (-) and dCvH (-) mM2D (-) not in. 予想される長さはそれぞれ1786bp(I)、1723bp(II)、1716bp(III)および1653bp(IV)であった。 Each length expected 1786bp (I), was 1723bp (II), 1716bp (III) and 1653bp (IV). 図16Bは、in vitro翻訳の確認結果を示す写真である。 FIG. 16B is a photograph showing the confirmation results of the in vitro translation. レーン1、rCvH(+)mM2D(+)の翻訳産物;レーン2、rCvH(-)mM2D(+)の翻訳産物;レーン3、rCvH(+)mM2D(-)の翻訳産物;レーン4、rCvH(-)mM2D(-)の翻訳産物。 Lane 1, rCvH (+) mM2D of (+) translation product; lane 2, rCvH (-) mM2D (+) of the translation product; Lane 3, rCvH (+) mM2D (-) of the translation product; lane 4, rCvH ( -) mM2D (-) of the translation product. 予想される分子量はそれぞれ55.7kDa(レーン1および3)と53.5kDa(レーン2および4)であった。 The expected molecular weight were respectively 55.7KDa (lanes 1 and 3) and 53.5KDa (lanes 2 and 4). 図17は、本発明者の新規システムの効率を評価するために行ったin vitro選択の結果を示す写真である。 Figure 17 is a photograph showing the results of in vitro selection was performed to evaluate the efficiency of the new system of the present inventor. RT-PCR産物のアガロースゲル電気泳動後のパターンを示している。 It shows a pattern after agarose gel electrophoresis of RT-PCR products. レーン1〜3およびレーン5〜7は、in vitro選択後に各mRNAプールから増幅されたRT-PCR産物を示している。 Lanes 1-3 and lanes 5-7 show the RT-PCR products amplified from the mRNA pool after in vitro selection. レーン1、初期mRNAプールがrCvH(+)mM2D(+)のみを含むもの;レーン5、初期mRNAプールがrCvH(+)mM2D(-)のみを含むもの。 Lane 1, the initial mRNA pool rCvH (+) mM2D (+) those containing only; lane 5, the initial mRNA pool rCvH (+) mM2D (-) include only. 以上のレーンは選択に関する陽性対照となる。 Or more of the lane is a positive control for selection. レーン2、初期mRNAプールがrCvH(-)mM2D(+)のみを含むもの;レーン6、初期mRNAプールがrCvH(-)mM2D(-)のみを含むもの。 Lane 2, the initial mRNA pool rCvH (-) mM2D (+) those containing only; lane 6, the initial mRNA pool rCvH (-) mM2D (-) include only. この2つのレーンは選択に関する陰性対照となる。 The two lanes is a negative control for the selected. レーン3、初期mRNAプールがrCvH(+)mM2D(+)とrCvH(-)mM2D(+)の1:1混合物であったもの;レーン7、初期mRNAプールがrCvH(+)mM2D(-)とrCvH(-)mM2D(-)の1:1混合物であったもの。 Lane 3, the initial mRNA pool and rCvH (+) mM2D (+) rCvH (-) 1 of mM2D (+): 1 what was a mixture; lane 7, the initial mRNA pool rCvH (+) mM2D - and () rCvH (-) mM2D (-) of 1: what was 1 mixture. この2つのレーンは選択効率を示す。 The two lanes show the selection efficiency. レーン4、in vitro選択前のrCvH(+)mM2D(+)とrCvH(-)mM2D(+)の1:1混合物から増幅されたRT-PCR産物;レーン8、in vitro選択前のrCvH(+)mM2D(-)とrCvH(-)mM2D(-)の1:1混合物から増幅されたRT-PCR産物。 Lane 4, in vitro selection before rCvH (+) mM2D (+) and rCvH (-) mM2D of (+) 1: 1 is amplified from a mixture the RT-PCR products; Lane 8, in vitro selection before RCvH (+ ) mM2D (-) and rCvH (-) mM2D (-) of 1: 1 amplified RT-PCR products from the mixture. 図18は、システムにmMS2p-Cv相互作用を含めることとin vitro選択との間の相関を示す図である。 Figure 18 is a diagram showing the correlation between the inclusion of Mms2p-Cv interaction system and in vitro selection. 横軸は、選択の溶出ステップ前のペレット化したNi-NTAアガロースに伴う放射能と投入した放射標識mRNAの放射能との比として定義した収率を示す。 The horizontal axis shows the defined as the ratio of the radioactivity of labeled mRNA which supplied the radioactivity associated with Ni-NTA agarose was pelleted before elution step selection yields. 各mRNAの収率は2つの独立した実験による結果の平均値である。 The yield of the mRNA is the average of results of two independent experiments. (I)ヒスチジンタグを持つ陽性対照。 (I) a positive control that has a histidine tag. Cvを持つがMSpは持たない(rCvH(+)D(+))。 But with a Cv MSp I do not have (rCvH (+) D (+)). (II)ヒスチジンタグを持つ陽性対照。 (II) a positive control that has a histidine tag. CvとMSpを一つづつ持つ(rCvH(+)mM1D(+))。 The Cv and MSp with one one tsuzuic (rCvH (+) mM1D (+)). (III)ヒスチジンタグを持つ陽性対照。 (III) a positive control that has a histidine tag. Cvを一つ、MSpをニつ持つ(rCvH(+)mM2D(+))。 One Cv, with Nitsu the MSp (rCvH (+) mM2D (+)). (IV)ヒスチジンタグを持たない陰性対照。 (IV) negative control that does not have a histidine tag. CvとMSpを二つ持つ(rCvH(-)mM2D(+))。 With two of the Cv and MSp (rCvH (-) mM2D (+)).

Claims (30)

  1. 下記(i)および(ii)のDNAを含み、かつ、下記(i)および(ii)のDNAが、融合された転写産物および翻訳産物を発現するように結合されている、DNA構築物。 It includes DNA of following (i) and (ii), and, DNA of following (i) and (ii) is coupled to express the fused transcription and translation products, DNA construct.
    (i)任意のポリペプチドをコードするDNA (I) DNA encoding any polypeptide
    (ii)(i)のDNAの転写産物と翻訳産物を含む複合体を安定化させる機能を有するポリペプチドをコードするDNA (Ii) DNA encoding a polypeptide having a function of stabilizing a complex comprising a transcription product and translation product of the DNA of (i)
  2. (ii)のDNAが、リボソームを不活性化する機能を有するポリペプチドをコードするDNAである、請求項1に記載のDNA構築物。 DNA of (ii) is a ribosome is a DNA encoding a polypeptide having a function to inactivate, DNA construct according to claim 1.
  3. リボソームを不活性化する機能を有するポリペプチドをコードするDNAの下流にスペーサーペプチドをコードするDNAが結合されている、請求項2に記載のDNA構築物。 DNA encoding the spacer peptide downstream of DNA encoding a polypeptide having the function of inactivating the ribosomes are bound, DNA construct of claim 2.
  4. 任意のポリペプチドをコードするDNAとリボソームを不活性化する機能を有するポリペプチドをコードするDNAの間にリンカーペプチドをコードするDNAが挿入されている、請求項2に記載のDNA構築物。 Any DNA encoding a linker peptide between the DNA encoding the polypeptide DNA and ribosomes which encodes a polypeptide having the ability to inactivate is inserted, DNA construct of claim 2.
  5. (ii)のDNAが、RNA結合タンパク質をコードするDNAと該RNA結合タンパク質が結合するRNAをコードするDNAとの組み合わせである、請求項1に記載のDNA構築物。 DNA of (ii) is a combination of a DNA encoding an RNA DNA and the RNA binding protein coding RNA binding protein binds, DNA construct of claim 1.
  6. (i)および(ii)のDNAの融合された転写産物が終止コドンを欠損するように改変されている、請求項5に記載のDNA構築物。 (I) and fusion transcripts of the DNA of (ii) is modified to lack a termination codon, DNA construct according to claim 5.
  7. RNA結合タンパク質をコードするDNAが複数個並置されており、かつ該RNA結合タンパク質が結合するRNAをコードするDNAが複数個並置されている、請求項5に記載のDNA構築物。 DNA encoding RNA binding proteins have been several juxtaposed and DNA in which the RNA binding protein encoding RNA binding is plural juxtaposed DNA construct according to claim 5.
  8. 複数個並置されたRNA結合タンパク質をコードするDNAが、互いに異なる複数個のRNA結合タンパク質をコードするDNAであり、かつ、複数個並置されたRNA結合タンパク質が結合するRNAをコードするDNAが互いに異なる複数個のRNA結合タンパク質が結合するRNAをコードするDNAである、請求項7に記載の核酸構築物。 DNA encoding a plurality juxtaposed RNA binding protein is different a DNA encoding a plurality of RNA binding proteins, and DNA encoding an RNA which a plurality juxtaposed RNA binding proteins that bind different from each other a DNA encoding an RNA plurality of RNA binding protein binds, the nucleic acid construct of claim 7.
  9. 下記(i)のmRNAと下記(ii)のDNAの複合体である核酸構築物。 mRNA and nucleic acid constructs a complex of DNA below (ii) below (i).
    (i)DNA結合タンパク質をコードするRNAと任意のポリペプチドをコードするRNAとの融合mRNA (I) a fusion mRNA with RNA encoding RNA and any polypeptide encoding the DNA binding protein
    (ii)(i)の融合mRNAの翻訳産物が結合するDNA領域を含むDNA (Ii) (i) DNA translation product of the fusion mRNA contains a DNA region which binds the
  10. (i)のmRNAと(ii)のDNAがハイブリダイズすることにより複合体を形成している、請求項9に記載の核酸構築物。 DNA of (i) of the mRNA (ii) form a complex by hybridization, nucleic acid construct of claim 9.
  11. (i)のmRNAの3'側領域と(ii)のDNAの3'側領域がハイブリダイズしている、請求項9に記載の核酸構築物。 Side region 3 'of the DNA of the side region and (ii) the 3' mRNA of (i) is hybridized, the nucleic acid construct of claim 9.
  12. 請求項1に記載のDNA構築物の調製に用いるための、下記(i)または(ii)のDNA構築物。 For use in the preparation of the DNA construct according to claim 1, the DNA construct following (i) or (ii).
    (i)任意のポリペプチドをコードするDNAの転写産物と翻訳産物の複合体を安定化させる機能を有するDNAを含むDNA構築物 (ii)任意のポリペプチドをコードするDNAの転写産物と翻訳産物の複合体を安定化させる機能を有するDNAと、該任意のポリペプチドをコードするDNAのクローニング部位とを含むDNA構築物 (I) any DNA construct comprising a DNA having a function of stabilizing a complex of transcript and translation product of the DNA encoding the polypeptide (ii) any transcript of DNA encoding a polypeptide with the translation product a DNA having a function of stabilizing a complex, DNA construct comprising a cloning site of a DNA encoding the any polypeptide
  13. 請求項1に記載のDNA構築物における(i)および(ii)のDNAを発現させることを特徴とする、(i)および(ii)のDNAの転写産物と翻訳産物を含む複合体を製造する方法。 How claim 1 (i) and in the DNA construct according to, characterized in that for the expression of DNA (ii), to produce a complex comprising a transcription product and translation product of the DNA of (i) and (ii) .
  14. 請求項9に記載の核酸構築物における(i)のmRNAを翻訳させ、翻訳産物を請求項9に記載の核酸構築物における(ii)のDNAに結合させることを特徴とする、該翻訳産物と請求項9に記載の核酸構築物との複合体を製造する方法。 mRNA was translated in (i) in the nucleic acid construct according to claim 9, characterized in that to bind to DNA of (ii) in the nucleic acid construct according to the translation product to claim 9, claim and said translation product method for producing a complex of a nucleic acid construct according to 9.
  15. (i)のmRNAと(ii)のDNAがハイブリダイズすることにより複合体を形成している核酸構築物を用いる、請求項14に記載の方法。 DNA of (i) of the mRNA (ii) is used a nucleic acid construct that forms a complex by hybridization method according to claim 14.
  16. (i)のmRNAの3'側領域と(ii)のDNAの3'側領域がハイブリダイズしている核酸構築物を用いる、請求項14に記載の方法。 Side region 3 'of the DNA of the side region and (ii) the 3' mRNA of (i) is used a nucleic acid construct hybridizing A method according to claim 14.
  17. 請求項15に記載の方法により製造された複合体における(ii)のDNAの3'側領域を伸長する方法であって、該複合体に逆転写酵素を接触させて、(i)のmRNAを鋳型に逆転写反応を行うことを含む方法。 A method of extending the 3 'side region of the DNA of (ii) in the complex produced by the method of claim 15, contacting the reverse transcriptase complex, the mRNA of (i) the method comprising performing a reverse transcription reaction as a template.
  18. 請求項16に記載の方法により製造された複合体における(ii)のDNAを伸長する方法であって、該複合体に逆転写酵素を接触させて、(i)のmRNAを鋳型に(ii)のDNAをプライマーとして逆転写反応を行うことを含む方法。 A method of extending the DNA of the complex produced by the method according to claim 16 (ii), contacting the reverse transcriptase complex, mRNA as a template of (i) (ii) the method comprising performing a reverse transcription reaction of a DNA as a primer.
  19. 無細胞系で行われる、請求項13から18のいずれかに記載の方法。 Carried out in a cell-free system, the method according to any of claims 13 18.
  20. 請求項13に記載の方法により製造される複合体。 Complex produced by the method of claim 13.
  21. 請求項14から18のいずれかに記載の方法により製造される複合体。 Complex produced by the method according to any of claims 14 18.
  22. 特定の標的物質に結合するポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードするmRNAをスクリーニングする方法であって、下記(a)から(c)の工程を含む方法。 A method of screening for mRNA encoding the polypeptide or said polypeptide to bind to a particular target substance, comprising the step from below (a) (c).
    (a)請求項1に記載のDNA構築物における(i)および(ii)のDNAを発現させることにより、(i)および(ii)のDNAの転写産物と翻訳産物を含む複合体を形成させる工程(b)該特定の標的物質と、工程(a)で形成された複合体とを接触させる工程(c)該標的物質に結合した複合体を回収する工程 (A) by expressing the DNA of the DNA construct according to claim 1 (i) and (ii), a step of forming a complex comprising a transcription product and translation product of the DNA of (i) and (ii) (b) recovering the said particular target substance, the complex bound to the step (c) the target substance to the contacting the complex formed in step (a)
  23. 特定の標的物質に結合するポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードするmRNAをスクリーニングする方法であって、下記(a)から(c)の工程を含む方法。 A method of screening for mRNA encoding the polypeptide or said polypeptide to bind to a particular target substance, comprising the step from below (a) (c).
    (a)請求項9に記載の核酸構築物における(i)のmRNAを翻訳させ、翻訳産物を請求項9に記載の核酸構築物における(ii)に記載のDNAに結合させることにより、該翻訳産物と請求項9に記載の核酸構築物を含む複合体を形成させる工程(b)該特定の標的物質と、工程(a)で形成された複合体とを接触させる工程(c)該標的物質に結合した複合体を回収する工程 (A) to translate the mRNA of (i) in the nucleic acid construct of claim 9, by binding to the DNA according to (ii) in the nucleic acid construct according to the translation product to claim 9, with said translation product and step (b) the specific target substance to form a complex comprising a nucleic acid construct according to claim 9, bound to the step (c) the target substance to the contacting the complex formed in step (a) recovering the complex
  24. 特定の標的物質に結合するポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードするmRNA若しくはDNAをスクリーニングする方法であって、下記(a)から(d)の工程を含む方法。 A method of screening for mRNA or DNA encoding the polypeptide or said polypeptide to bind to a particular target substance, comprising the step from below (a) (d).
    (a)請求項10に記載の核酸構築物における(i)のmRNAを翻訳させ、翻訳産物を請求項10に記載の核酸構築物における(ii)に記載のDNAに結合させることにより、該翻訳産物と請求項10に記載の核酸構築物とを含む複合体を形成させる工程(b)工程(a)で形成された複合体に逆転写酵素を接触させて、該複合体における(i)のmRNAを鋳型に逆転写反応を行うことにより、該複合体における(ii)のDNAを伸長する工程(c)該特定の標的物質と、工程(b)で形成された複合体とを接触させる工程(d)該標的物質に結合した複合体を回収する工程 (A) to translate the mRNA of (i) in the nucleic acid construct of claim 10, by binding to the DNA according to (ii) in the nucleic acid construct according to the translation product in claim 10, with said translation product contacting the reverse transcriptase complex formed in step (b) step (a) to form a complex containing the nucleic acid construct of claim 10, the template mRNA of (i) in the complex step by performing a reverse transcription reaction, contacting a target substance DNA process of the extension (c) the identification of the complex (ii), and a complex formed in step (b) in (d) of recovering the complex bound to the target substance
  25. 特定の標的物質に結合するポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードするmRNA若しくはDNAをスクリーニングする方法であって、下記(a)から(d)の工程を含む方法。 A method of screening for mRNA or DNA encoding the polypeptide or said polypeptide to bind to a particular target substance, comprising the step from below (a) (d).
    (a)請求項11に記載の核酸構築物における(i)のmRNAを翻訳させ、翻訳産物を請求項11に記載の核酸構築物における(ii)に記載のDNAに結合させることにより、該翻訳産物と請求項11に記載の核酸構築物とを含む複合体を形成させる工程(b)工程(a)で形成された複合体に逆転写酵素を接触させて、該複合体における(i)のmRNAを鋳型に、該複合体における(ii)のDNAをプライマーとして逆転写反応を行うことにより、該複合体における(ii)のDNAの3'側領域を伸長する工程(c)該特定の標的物質と、工程(b)で形成された複合体とを接触させる工程(d)該標的物質に結合した複合体を回収する工程 (A) to translate the mRNA of (i) in the nucleic acid construct of claim 11, by binding to the DNA according to (ii) in the nucleic acid construct according to the translation product to claim 11, with said translation product contacting the reverse transcriptase complex formed in step (b) step (a) to form a complex containing the nucleic acid construct of claim 11, the template mRNA of (i) in the complex to, by performing a reverse transcription reaction the DNA of (ii) in the complex as a primer, a step (c) the specific target substance to extend the 3 'side region of the DNA of (ii) in the complex, step (b) the formed step of contacting a complex (d) recovering the complex bound to the target substance
  26. 特定の標的物質に結合するポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードするmRNA若しくはDNAをスクリーニングする方法であって、下記(a)から(d)の工程を含む方法。 A method of screening for mRNA or DNA encoding the polypeptide or said polypeptide to bind to a particular target substance, comprising the step from below (a) (d).
    (a)請求項10に記載の核酸構築物における(i)のmRNAを翻訳させ、翻訳産物を請求項10に記載の核酸構築物における(ii)に記載のDNAに結合させることにより、該翻訳産物と請求項10に記載の核酸構築物とを含む複合体を形成させる工程(b)該特定の標的物質と、工程(a)で形成された複合体とを接触させる工程(c)該標的物質に結合した複合体に逆転写酵素を接触させて、該複合体における(i)のmRNAを鋳型に逆転写反応を行うことにより、該複合体における(ii)のDNAを伸長する工程(d)該標的物質に結合している複合体を回収する工程 (A) to translate the mRNA of (i) in the nucleic acid construct of claim 10, by binding to the DNA according to (ii) in the nucleic acid construct according to the translation product in claim 10, with said translation product bond and a step (b) the specific target substance to form a complex comprising a nucleic acid construct, in step (c) the target substance to the contacting the complex formed in step (a) of claim 10 was contacting the reverse transcriptase complex, said plurality mRNA by the performing reverse transcription reaction as a template of (i) in the polymer, DNA and extending step (d) target of (ii) in the complex recovering the complex bound to the substance
  27. 特定の標的物質に結合するポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードするmRNA若しくはDNAをスクリーニングする方法であって、下記(a)から(d)の工程を含む方法。 A method of screening for mRNA or DNA encoding the polypeptide or said polypeptide to bind to a particular target substance, comprising the step from below (a) (d).
    (a)請求項11に記載の核酸構築物における(i)のmRNAを翻訳させ、翻訳産物を請求項11に記載の核酸構築物における(ii)に記載のDNAに結合させることにより、該翻訳産物と請求項11に記載の核酸構築物とを含む複合体を形成させる工程(b)該特定の標的物質と、工程(a)で形成された複合体とを接触させる工程(c)該標的物質に結合した複合体に逆転写酵素を接触させて、該複合体における(i)のmRNAを鋳型に、該複合体における(ii)のDNAをプライマーとして逆転写反応を行うことにより、該複合体における(ii)のDNAの3'側領域を伸長する工程(d)該標的物質に結合している複合体を回収する工程 (A) to translate the mRNA of (i) in the nucleic acid construct of claim 11, by binding to the DNA according to (ii) in the nucleic acid construct according to the translation product to claim 11, with said translation product bond and a step (b) the specific target substance to form a complex comprising a nucleic acid construct, in step (c) the target substance to the contacting the complex formed in step (a) of claim 11 It was contacting the reverse transcriptase complex, the mRNA of (i) in the complex as a template by performing the reverse transcription reaction the DNA of (ii) in the complex as a primer, in the complex ( recovering the complex bound to step (d) the target substance to extend the 3 'side region of the DNA of ii)
  28. 該標的物質が担体に固定されている、請求項22から27のいずれかに記載の方法。 Target substance is immobilized on a carrier, the method according to any of claims 22 27.
  29. 請求項1もしくは12に記載のDNA構築物、または請求項20に記載の複合体を含む、請求項21に記載のスクリーニング方法に用いるためのキット。 DNA construct according to claim 1 or 12, or a complex according to claim 20, a kit for use in the screening method of claim 21.
  30. 請求項9に記載の核酸構築物、または請求項21に記載の複合体を含む、請求項23から27のいずれかに記載のスクリーニング方法に用いるためのキット。 The nucleic acid construct of claim 9, or a conjugate of claim 21, a kit for use in the screening method of any of claims 23 27.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO1999054458A1 (en) * 1998-04-17 1999-10-28 Whitehead Institute For Biomedical Research Use of a ribozyme to join nucleic acids and peptides
US6214553B1 (en) * 1997-01-21 2001-04-10 Massachusetts General Hospital Libraries of protein encoding RNA-protein fusions

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6214553B1 (en) * 1997-01-21 2001-04-10 Massachusetts General Hospital Libraries of protein encoding RNA-protein fusions
WO1999054458A1 (en) * 1998-04-17 1999-10-28 Whitehead Institute For Biomedical Research Use of a ribozyme to join nucleic acids and peptides

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