JP2007332048A - Aquaporin 5 development promoter - Google Patents

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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide an aquaporin 5 development promoter which is useful as a medicine for preventing and/or treating diseases caused by aquaporin 5 dysfunctions, such as thirst, dry eyes, and hemorrhages accompanying nasal dryness, itch sense caused by skin dryness, or pulmonary edema.
SOLUTION: This aquaporin 5 development promoter contains retinoic acid or its salt as an active ingredient. The medicine for preventing and/or treating diseases caused by aquaporin 5 dysfunctions contains retinoic acid or its salt as an active ingredient.
COPYRIGHT: (C)2008,JPO&INPIT

Description

本発明は、アクアポリン5の発現亢進剤、並びにアクアポリン5の機能異常に起因する疾患の予防及び/又は治療のための医薬に関する。 The present invention relates to expression enhancer of aquaporin 5, and to a medicament for the prevention and / or treatment of functional diseases caused by abnormal aquaporin 5.

外分泌腺からの水分泌の不足は、口渇、ドライアイ、鼻腔乾燥に伴う出血、皮膚乾燥による掻痒感など様々な症状を引き起こし、QOLの著しい低下を引き起こす。 The lack of water secretion from exocrine glands, dry mouth, dry eye, bleeding associated with nasal drying, causing various symptoms such as itching by skin drying, causes a significant decrease in QOL. これらの症状は、シェーグレン症候群の患者の代表的な症状であるが、健常者にもしばしば見られる。 These symptoms, is a typical symptom of Sjogren's syndrome patients, often seen in healthy subjects. これらの外分泌機能異常に対する現行の治療は、人工涙や人工唾液により目や口腔の乾燥を防ぐのが一般的であり、これらの乾燥症状との共存を前提としている。 Current treatments for these exocrine dysfunction, prevent dry eyes and mouth by artificial tears and artificial saliva are common, it presupposes coexistence with these drying conditions.

アクアポリン(aquaporin:以下AQPと略すことがある)は、アグレにより1992年に発見された膜6回貫通蛋白で、細胞内の水分量を調節する水チャネルとして機能する重要な蛋白である。 Aquaporin (aquaporin: sometimes hereinafter referred AQP) is a discovered membrane 6 times transmembrane protein in 1992 by Aggregation is an important protein which functions as a water channel for adjusting the amount of water in the cell. アクアポリンは細菌から哺乳類に至るまで普遍的に存在しており、これまでに哺乳類で、AQP0からAQP12まで13種類のアクアポリンが確認されている。 Aquaporin is present universally up to a mammal from bacteria, in mammals so far, 13 different aquaporins from AQP0 to AQP12 has been confirmed.

一般に外分泌腺の上皮細胞は、電解質の細胞外放出によって受動的に水分を放出しているが、細胞膜上に水チャネルアクアポリン5(aquaporin-5;AQP5)をもち、これを通じて水の透過速度を高め、分泌の効率化を行っている。 Epithelial cells generally exocrine glands, although emit passively moisture by extracellular release of electrolyte, on the cell membrane water channel aquaporin 5; has the (aquaporin-5 AQP5), through which increase the permeation rate of water , we have done the efficiency of secretion. 従って、AQP5の機能を亢進する薬物あるいはその発現を促進する薬物には、種々の乾燥症状を緩和する作用が期待できる。 Therefore, the drugs that promote drug or its expression enhances the function of AQP5, act to mitigate the various drying conditions can be expected. しかし、AQP類には一般的なイオンチャネル類のような開閉機構がないと考えられており、機能亢進薬は理論的に難しい。 However, opening and closing mechanism such as a typical ion channels such the AQP compounds are considered to have no, hyperactivity agent theoretically difficult. また、AQP5の発現を亢進する薬物も今までに全く知られていなかった。 In addition, drugs that enhance the expression of AQP5 also was not known until now.

AQP類の機能調節剤の例としては、特許文献1に、アクアポリン5を発現した細胞及びアクアポリン4を発現した細胞では、水分吸収がマンガンイオンの添加により抑えられることが記載されており、マンガンイオンを含むアクアポリン機能調節剤が開示されている。 Examples of functional modifier of AQP compounds, in Patent Document 1, in the cells expressing the cell and Aquaporin 4 that expressed aquaporin 5, is described that water absorption is suppressed by the addition of manganese ions, manganese ions aquaporin functional modifier comprising is disclosed. しかしながら、特許文献1には、アクアポリン5の発現を亢進する物質については何ら記載がない。 However, Patent Document 1, there is no no description substance enhancing the expression of aquaporin 5.

特開2005−325047号公報 JP 2005-325047 JP

本発明は、口渇、ドライアイ、鼻腔乾燥に伴う出血、皮膚乾燥による掻痒感、又は肺水腫などのアクアポリン5の機能異常に起因する疾患の予防及び/又は治療のための医薬として有用なアクアポリン5の発現亢進剤を提供することを解決すべき課題とした。 The present invention, dry mouth, dry eye, bleeding associated with nasal drying, itching by dry skin, or useful as a medicament for prophylactic and / or therapeutic treatment of dysfunction caused by diseases of aquaporin 5, such as pulmonary edema aquaporin providing 5 expression enhancers was an object to be achieved.

本発明者らは、AQP5遺伝子の5'-末端プロモーターの機能解析に関する研究を行い、本遺伝子の転写調節にはSp1転写因子が重要であることを見出した。 The present inventors have conducted studies on functional analysis of the 5'-end a promoter of AQP5 gene, the transcriptional regulation of this gene was found to be Sp1 transcription factor is important. そこで、Sp1転写因子の活性化に繋がると想定される種々の刺激によるAQP5発現に対する作用を調べ、ビタミンAの活性代謝物であるレチノイン酸が著明にAQP5の遺伝子およびタンパク質発現を促進することを見出した。 Therefore, examined the effect on AQP5 expression by various stimuli that is assumed to lead to the activation of the Sp1 transcription factor, that is retinoic acid, the active metabolite of vitamin A promoting gene and protein expression of AQP5 markedly heading was. AQP5は上記の外分泌腺細胞だけでなく、肺胞内腔の大部分を占める肺胞I型上皮細胞にも多く存在しており、肺胞内滲出液のクリアランスにも関与すると考えられている。 AQP5 well above exocrine cells, are present much in alveolar type I epithelial cells occupying most of the alveolar lumen, believed also involved in the alveoli exudate clearance. また、本発明者らは、AQP5が水だけでなくCO 2ガスの透過性をも亢進させることをアフリカツメガエル卵母細胞発現系を用いた実験により見出している(2002年11月 第55回日本薬理学会西南部会プログラム・講演要旨集 p68)。 Further, the present inventors, Japan 55th November headings are (2002 Experiments using Xenopus oocyte expression system that AQP5 also enhances the permeability of the CO 2 gas well water pharmacological Society of Southwest Division program Abstracts p68). すなわち、AQP5の発現亢進物質は,水分代謝異常だけでなく、呼吸すなわちガス交換の効率化により、呼吸不全治療薬としても有用である。 In other words, increased expression substance AQP5 is not only water metabolism disorder, the efficiency of the respiratory i.e. gas exchange is also useful as a respiratory dysfunction medications. 本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。 The present invention has been completed based on these findings.

即ち、本発明によれば、レチノイン酸又はその塩を有効成分として含む、アクアポリン5の発現亢進剤が提供される。 That is, according to the present invention, comprising retinoic acid or a salt thereof as an active ingredient, expression enhancers of aquaporin 5 is provided.

本発明の別の側面によれば、レチノイン酸又はその塩を有効成分として含む、アクアポリン5の機能異常に起因する疾患の予防及び/又は治療のための医薬が提供される。 According to another aspect of the present invention include retinoic acid or a salt thereof as an active ingredient, medicament is provided for the prevention and / or treatment of functional diseases caused by abnormal aquaporin 5.

好ましくは、アクアポリン5の機能異常に起因する疾患は、水分代謝異常を伴う疾患、又は呼吸不全を伴う疾患である。 Preferably, the functional diseases caused by abnormal aquaporin 5 is a disease with a disease involving water metabolism, or respiratory failure.
好ましくは、アクアポリン5の機能異常に起因する疾患は、口渇、ドライアイ、鼻腔乾燥に伴う出血、皮膚乾燥による掻痒感、気道乾燥による咳及び痰、又は肺水腫である。 Preferably, the functional diseases caused by abnormal aquaporin 5, dry mouth, dry eye, bleeding associated with nasal drying, itching by skin drying, a cough and sputum, or pulmonary edema caused by airway drying.

本発明のさらに別の側面によれば、アクアポリン5の発現を亢進する方法であってレチノイン酸又はその塩を細胞に接触させる方法;及び、アクアポリン5の機能異常に起因する疾患の予防及び/又は治療方法であってヒトを含む哺乳類動物に有効量のレチノイン酸又はその塩を投与する工程を含む方法が提供される。 According to yet another aspect of the present invention, a method to retinoic acid or a salt thereof A method for enhancing the expression of aquaporin 5 in contact with the cells; and prevention of dysfunction caused by diseases of aquaporin 5 and / or mETHOD a method of treatment comprising the step of administering retinoic acid or its salt effective amount to a mammal including man.

本発明のさらに別の側面によれば、アクアポリン5の発現亢進剤を製造するためのレチノイン酸又はその塩の使用、及びアクアポリン5の機能異常に起因する疾患の予防及び/又は治療のための医薬を製造するためのレチノイン酸又はその塩の使用が提供される。 According to yet another aspect of the present invention, the use of retinoic acid or a salt thereof for manufacturing expression enhancer of aquaporin 5, and prevention of dysfunction caused by diseases of aquaporin 5 and / or therapeutic medicament for the use of retinoic acid or its salt for the preparation are provided.

本発明によりアクアポリン5の発現亢進に用いるためのレチノイン酸又はその塩が提供される。 The present invention retinoic acid or a salt thereof for use in enhanced expression of aquaporin 5 is provided by. レチノイン酸又はその塩を有効成分として含むアクアポリン5の機能異常に起因する疾患の予防及び/又は治療のための医薬は、口渇、ドライアイ、鼻腔乾燥に伴う出血、皮膚乾燥による掻痒感、気道乾燥による咳及び痰、又は肺水腫などの、アクアポリン5の機能異常に起因する疾患の予防及び/又は治療のための医薬として有用である。 Medicament for the prevention and / or treatment of functional diseases caused by abnormal aquaporin 5 containing retinoic acid or a salt thereof as an active ingredient, the dry mouth, dry eye, bleeding associated with nasal drying, itching by skin dryness, respiratory tract cough due to drying and sputum, or the like pulmonary edema, which is useful as medicaments for prophylactic and / or therapeutic treatment of dysfunction caused by diseases of aquaporin 5.

以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。 It will be described in detail embodiments of the present invention.
細胞膜の水分輸送を促進する水チャネルの一種であるaquaporin 5 (AQP5) は、唾液腺、涙腺、汗腺および気管支腺を始めとした種々の腺組織に存在し、水の外分泌の効率化に関わっている。 aquaporin 5 (AQP5) is a kind of water channels that promote water transport of cellular membranes, present in the salivary glands, lacrimal gland, various glandular tissues including sweat glands and bronchial glands are involved in efficient exocrine water . また、肺胞内腔の大部分を覆う肺胞I型上皮細胞にも発現しており肺胞内の水分のクリアランスにも関わっていると考えられている。 Also thought to be involved in the majority of alveolar type I epithelial cells to moisture is expressed in the alveoli even cover the clearance of alveolar lumen. 従って、AQP5の発現量を増加させる薬物は、例えばシェーグレン症候群の患者に生じるドライアイ、口渇などの種々の乾燥症状を緩和し、気道の滋潤化により咳や痰を鎮め、また肺水腫の治療に有効と考えられるが、これまでにAQP5の発現促進物質は知られていない。 Thus, drugs that increase the expression of AQP5, for example dry occur in Sjogren's syndrome patients eye, alleviate various drying conditions, such as dry mouth, relieve cough and phlegm by airways Shigeru Junka and treatment of pulmonary edema Although considered effective, the expression-promoting substance of AQP5 so far not known.

本発明では、マウス肺胞上皮細胞株 (MLE-12) を用いて、AQP5発現に対するレチノイン酸の効果およびその作用機序の解明を行った。 In the present invention, by using a mouse lung epithelial cell line (MLE-12), it was performed to elucidate the effect and mechanism of action of retinoic acid on AQP5 expression. その結果、AQP5 mRNAおよびタンパク質量はともにレチノイン酸の濃度(0.01〜10 μM)および時間(6〜48時間)依存的に増加した。 As a result, AQP5 mRNA and protein level were both concentrations of retinoic acid (0.01 to 10 [mu] M) and time (6-48 hours) dependently increased. ラットAQP5 プロモーターを用いたレポータージーンアッセイでも、レチノイン酸はAQP5のプロモーター活性を著明に亢進し、本作用がAQP5の転写促進に基づくと考えられた。 Even reporter gene assay using rat AQP5 promoter, retinoic acid will enhance markedly the promoter activity of AQP5, the effect was considered to be based on transcription promoting the AQP5. レチノイン酸のAQP5プロモーター活性化作用はpromoter DNA配列上のSp1/Sp3 binding element (SBE) の変異により消失したことや、EMSA法により調べたSp1転写因子のDNA結合能が増加したことから、レチノイン酸がSp1転写因子を介してAQP5の転写を促進すると考えられた。 And the AQP5 promoter activation action of retinoic acid disappeared by mutations in Sp1 / Sp3 binding element (SBE) on promoter A promoter DNA sequence, since the DNA binding ability of Sp1 transcription factor was investigated by EMSA method is increased, retinoic acid There was thought to promote transcription of AQP5 through the Sp1 transcription factor. しかし、核内のSp1およびSp3転写因子の量には著明な作用は認められず、レチノイン酸はSp1の活性を調節すると推定された。 However, a marked effect on the amount of Sp1 and Sp3 transcription factors in the nucleus was not observed and retinoic acid was estimated to modulate the activity of Sp1. さらに、マウスに10 mg/kgのレチノイン酸を1日1回、5日間、腹腔内投与し、肺ホモジネート中のAQP5量を測定すると、著明な増加が生じた。 Furthermore, once a day retinoic acid 10 mg / kg in mice, 5 days, intraperitoneally, as measured the AQP5 content in lung homogenates, a marked increase has occurred. 上記の結果より、レチノイン酸が上記の種々の乾燥症状や肺水腫に対する治療薬として有用であることが実証された。 From the above results, it retinoic acid is useful as a therapeutic agent against various drying conditions and pulmonary edema described above was demonstrated. また、AQP5類は水分子の他にCO 2ガスの透過をも亢進させることから、レチノイン酸を用いることにより生体におけるガス分子の代謝調節を行うことも可能である。 Moreover, AQP5 acids from causing also enhance the transmission in addition to CO 2 gas of water molecules, it is also possible to carry out the metabolic regulation of the gas molecules in vivo by the use of retinoic acid.

本発明によるアクアポリン5の発現亢進剤、及びアクアポリン5の機能異常に起因する疾患の予防及び/又は治療のための医薬は、レチノイン酸又はその塩を有効成分として含む。 Expression enhancer of aquaporin 5 according to the invention and medicaments for the prophylaxis and / or treatment of functional diseases caused by abnormal aquaporin 5 comprises retinoic acid or a salt thereof as an active ingredient.

本発明で用いるレチノイン酸はどのような形態でもよく、例えば、遊離した酸の形態でもよいし、又は塩の形態でもよい(以下、レチノイン酸という場合には、遊離した酸の形態でもよいし、又は塩の形態の両方を包含するものとする)。 Retinoic acid used in the present invention may be in any form, for example, may be in the form of free acid or may be in the form of a salt (hereinafter, when referred to retinoic acid may be in the form of free acid, or it is intended to encompass both forms of salt). 塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、又は亜鉛塩等が挙げられる。 The salt, sodium salt, alkali metal salts, magnesium salts or potassium salts, alkaline earth metal salts such as calcium salts, aluminum salts or zinc salts, and the like.

レチノイン酸はアクアポリン5の発現亢進作用を有するため、アクアポリン5の機能異常に起因する疾患の予防及び/又は治療のための医薬のための医薬の有効成分として有用である。 Retinoic acid for whose expression enhancing effect of aquaporin 5, is useful as an active ingredient of a medicament for of a medicament for the prevention and / or treatment of functional diseases caused by abnormal aquaporin 5. アクアポリン5の機能異常とは、健常な組織内の細胞のアクアポリン5の状態とは異なる病態下の組織内細胞でのアクアポリン5の状態をいい、アクアポリン5の機能減退、細胞におけるアクアポリン5の数の減少などを含む。 Dysfunction The aquaporin 5, means a state of aquaporin 5 in tissue cells in different condition of the state of aquaporin 5 healthy tissue cells, functional decline of aquaporin 5, number of aquaporin 5 in a cell decrease, and the like.

アクアポリン5の機能異常に起因する疾患の例としては、例えば、水分代謝異常を伴う疾患、又は呼吸不全を伴う疾患を挙げることができ、より具体的には、口渇、ドライアイ、鼻腔乾燥に伴う出血、皮膚乾燥による掻痒感、気道乾燥による咳及び痰、又は肺水腫などを挙げることができる。 Examples of functional diseases caused by abnormal aquaporin 5, for example, diseases accompanied by moisture metabolic disorders, or respiratory failure can be mentioned disease with, more specifically, dry mouth, dry eyes, nasal drying accompanied bleeding, can be cited itching by skin dryness, cough and sputum by airway drying, or pulmonary edema and the like. しかしながら、本発明の医薬は、これらの用途のみに限定されず、AQP5の発現する組織や器官の疾病治療を目的とする医薬組成物として、ヒト又は動物に投与することができる。 However, the medicament of the present invention is not limited to these applications, as a pharmaceutical composition for the treatment of disease of the tissues and organs that express the AQP5, can be administered to a human or animal.

本発明の医薬は、経口で投与してもよいし、非経口で投与してもよい。 The medicament of the present invention may be administered orally may be administered parenterally. 投与剤型としては、例えば、注射剤、点眼液や眼軟膏等の点眼剤、粉末剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、及び錠剤等を挙げることができる。 The dosage form, for example, injections, eye drops, such as eye drops and eye ointments, powders, fine granules, granules, mention may be made of capsules, and tablets and the like.

本発明の医薬は、例えば、患部に直接注射で投与する場合は、注射剤の1成分として、レチノイン酸を溶解した薬剤であることが好ましい。 The medicament of the present invention, for example, when administered directly injected into the affected area, as a component of an injection, it is preferred that the drug was dissolved retinoic acid. レチノイン酸を投与する際の注射剤は、生理食塩水を主成分とし、必要に応じて他の水溶性の添加剤、薬液等を配合したものを用いることができる。 Injections for administering retinoic acid is mainly composed of saline, other water-soluble additives as necessary, it can be used blended with drug solution or the like. 添加剤としては、例えば、カリウム、マグネシウム等のアルカリ金属イオン、乳酸、各種アミノ酸、脂肪、グルコース、フラグトース、サッカロース等の糖質等の栄養剤、ビタミンA、B、C、D等のビタミン類リン酸イオン、塩素イオン、ホルモン剤、アルブミン等の血漿蛋白、及び、デキストリンン、ヒドロキシエチルスターチ等の高分子多糖類等を挙げることができる。 As the additive, for example, potassium, alkali metal ions such as magnesium, lactate, various amino acids, fat, glucose, Furagutosu, nutritional carbohydrates such saccharose, etc., vitamin A, B, C, phosphorus vitamins such as D acid ion, chloride ion, hormonal agents, plasma proteins such as albumin and dextrin down, the polymeric polysaccharides such as hydroxyethyl starch.

本発明の医薬を点眼剤として投与する場合には、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム等の緩衝化剤、塩化ナトリウム等の等張化剤、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等の界面活性剤、クエン酸ナトリウム等の安定化剤、塩化ベンザルコニウム等の防腐剤を適宜用いて製剤化することができる。 When administering the pharmaceutical of the present invention as eye drops, sodium phosphate, buffering agents such as sodium acetate, isotonic agents such as sodium chloride, polyoxyethylene sorbitan monooleate, and polyoxyethylene hardened castor oil surfactants, stabilizers such as sodium citrate, may be formulated with preservatives such as benzalkonium chloride as appropriate. 点眼剤のpHは特に限定されないが、pH4〜8程度が好ましい。 The pH of the eye drops is not particularly limited, preferably about pH 4-8.

本発明の医薬を、固形剤として生体に投与する場合の固形剤としては、粉末剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、及び錠剤等を挙げることができる。 The medicament of the present invention, the solid agent when administered to a living body as a solid, powders, fine granules, granules, mention may be made of capsules, and tablets and the like. このような固形剤の中では、嚥下しやすい錠剤やカプセル剤が好ましい。 Thus in the solid dosage, easy-to-swallow tablets or capsules are preferred. 本発明の医薬を錠剤とする場合の賦形剤及び結合剤としてはオリゴ糖等の公知のものを使用することができる。 The medicament of the present invention as excipients and binders in the case of a tablet can be a known such as oligosaccharides. 錠剤の直径は2〜10mm、厚さは1〜5mmの範囲にあることが好ましい。 Tablet diameter is 2 to 10 mm, the thickness is preferably in the range of 1 to 5 mm. レチノイン酸を含む予防及び/又は治療薬は、他の薬剤と混合されていてもよい。 Prevention and / or therapeutic agent containing retinoic acid, may be mixed with other agents.

固形剤には通常用いられる種々の添加剤を配合することができる。 The solid dosage may be blended usual various additives used. このような添加剤としては、例えば、安定剤、界面活性剤、可塑剤、甘味剤、抗酸化剤、着香剤、着色剤、及び保存剤等を挙げることができる。 Such additives, such as stabilizers, surfactants, plasticizers, sweeteners, antioxidants, may be mentioned flavoring agents, coloring agents, and preservatives, and the like.

上記固形剤において、レチノイン酸の濃度は固形剤100重量%に対して0.01重量%以上、好ましくは0.1〜10重量%であることが好ましい。 In the solid agent, the concentration of retinoic acid is 0.01 wt% or more of the solid dosage 100% by weight, preferably preferably from 0.1 to 10% by weight.

また、本発明の医薬は、噴霧薬として生体に投与することができる。 The pharmaceutical of the present invention can be administered to a living body as a spray agent. すなわち、レチノイン酸の粉体、水分散微粒子、又は有機溶媒分散体を気体の圧力で微細化して、鼻、気管内に投与することができる。 That is, the powder of retinoic acid, water-dispersible particulates, or an organic solvent dispersion was finely divided by the pressure of the gas it can be administered nasal, intratracheally. 噴霧薬として用いることのできる分散体は、例えば、レチノイン酸を溶媒に溶解したものを、水溶性高分子もしくは界面活性剤を含有する水と混合、又は水中に高速ミキサー等で撹拌混合し、さらに超音波により分散処理した後、溶媒を蒸発除去する方法により製造することができる。 Dispersion can be used as a spray agent is, for example, the retinoic acid which is dissolved in a solvent, mixed with water containing a water-soluble polymer or surfactant, or stir-mixed in a high speed mixer or the like in water, further followed by dispersing by ultrasonic, it may be produced by a method of evaporating the solvent is removed.

このような水分散体の調製に用いることのできる水溶性高分子としては、例えば、ポリアミドアミン、ポリビニルアルコール、ポリリンゴ酸、ポリ(ω−ヒドロキシアルキル)アクリレート及びメタクリレート、水酸基含有モノマー単位を含むコポリマー、ポリ−L−グルタミン酸、ポリ−L−アスパラギン酸等の合成水溶性ポリマー、デキストラン、キトサン、ペクチン、ヒアロン酸、セルロース、スターチ、プルラン、イヌリン、ヘパリン等の天然水溶性ポリマー等を挙げることができる。 The water-soluble polymers that can be used in the preparation of such aqueous dispersions, for example, copolymers containing polyamidoamines, polyvinyl alcohol, polymalic acid, poly (.omega.-hydroxyalkyl) acrylates and methacrylates, hydroxyl-containing monomer units, It may be mentioned poly -L- glutamic acid, synthetic water-soluble polymers of poly -L- aspartic acid, dextran, chitosan, pectin, Hiaron acid, cellulose, starch, pullulan, inulin, natural water-soluble polymers such as heparin or the like.

水分散体製造においては、好ましくは水中に界面活性剤を添加する。 In the aqueous dispersion prepared preferably a surfactant is added to water. このような界面活性剤としては、高級脂肪酸石鹸;アルキル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、アシルN−メチルタウリン塩、アルキルエーテルリン酸エステル塩、N−アシルアミノ酸塩等のアニオン界面活性剤;塩化アルキルトリメチルアンモニウム、塩化ジアルキルジメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム等のカチオン界面活性剤;アルキルジメチルアミノ酢酸ベタイン、アルキルアミドジメチルアミノ酢酸ベタイン、2−アルキル−N−カルボキシ−N−ヒドロキシイミダゾリニウムベタイン等の両性界面活性剤;及びポリオキシエチレン型、多価アルコールエステル型、エチレンオキシド・プロピレンオキシドブロック共重合体等の非イオン界面活性剤等を挙げることができる。 Examples of such surfactants, higher fatty acid soaps, alkyl sulfates, polyoxyethylene alkyl ether sulfates, acyl N- methyl taurine salts, alkyl ether phosphate salts, N- acylamino acid salts of anionic surfactants agent; alkyltrimethylammonium chloride, dialkyldimethylammonium chloride, a cationic surfactant such as benzalkonium chloride, alkyl dimethylamino acetic acid betaine, alkylamido betaine, 2-alkyl -N- carboxy -N- hydroxy imidazolinium amphoteric surfactants such as betaine; and polyoxyethylene type, polyhydric alcohol ester type, mention may be made of nonionic surfactants such as ethylene oxide-propylene oxide block copolymer.

レチノイン酸を含む水分散体には、通常用いられる種々の添加剤を配合することができる。 The aqueous dispersion containing retinoic acid, can contain various additives commonly used. このような添加剤としては、例えば、安定剤、界面活性剤、可塑剤、甘味剤、抗酸化剤、着香剤、着色剤、乳化剤、及び保存剤等を挙げることができる。 Such additives, such as stabilizers, surfactants, plasticizers, sweeteners, antioxidants, flavoring agents, coloring agents include emulsifiers, and preservatives, and the like. 噴霧薬におけるレチノイン酸の濃度は、0.01〜1000 mg/Lの範囲とすることが好ましい。 Concentration of retinoic acid in the spray agent, preferably in the range of 0.01 to 1000 mg / L.

本発明の医薬は、外用薬として例えば、乳液状、クリーム状もしくはジェル状の軟膏、又は貼付剤として患部に供することができる。 The medicament of the present invention, for example as ointments, can be subjected to the affected area as an emulsion, cream or gel-type ointment, or patch. 該外用薬では、レチノイン酸以外に、油性原料、界面活性剤、無機充填剤、増粘剤、紫外線吸収剤、酸化防止剤、防腐剤、栄養剤、色剤、香料、美白剤、血行促進剤、局所刺激剤、抗炎症剤、収斂剤、清涼剤、肌荒れ防止剤、制汗剤、ビタミン類、ホルモン類、又は抗ヒスタミン剤等の各種薬剤を用途に応じて適宜配合することができる。 The external drugs, in addition to retinoic acid, an oily material, surface active agents, inorganic fillers, thickeners, UV absorbers, antioxidants, preservatives, nutrients, coloring agent, perfume, whitening agents, blood circulation promoters , topical stimulants, anti-inflammatory agents, astringents, fresheners, skin roughness inhibitors, antiperspirants, vitamins, hormones, or may be blended in accordance with various drugs such as antihistamines applications.

上記の油性原料としては、例えば、オリーブ油、ツバキ油、マカデミアナッツ油、ヒマシ油等の油脂類;カルナバロウ、キャンデリラロウ、ホホバ油、ミツロウ、ラノリン等のロウ類;流動パラフィン、パラフィン、ワセリン、セレシン、マイクロクリスタリンワックス、スクワラン等の炭化水素類;脂肪酸類;セチルアルコール、ステアリルアルコール、イソステアリルアルコール、2−オクチルドデカノール等の高級アルコール;ミリスチン酸イソプロピル、ミリスチン酸2−オクチルドデシル、2−エチルヘキサンン酸セチル、リンゴ酸ジイソステアリル等のエステル類;及びシリコーン油等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。 As the oily material, such as olive oil, camellia oil, macadamia nut oil, fats such as castor oil; carnauba wax, candelilla wax, jojoba oil, beeswax, wax and lanolin; liquid paraffin, paraffin, vaseline, ceresin, fatty acids; microcrystalline wax, hydrocarbons such as squalane, cetyl alcohol, stearyl alcohol, isostearyl alcohol, 2-octyl higher alcohols dodecanol and the like; isopropyl myristate, 2-octyldodecyl myristate, 2-ethylhexanoic down cetyl esters such as diisostearyl malate; and silicone oil, and the like, but is not limited thereto.

上記の界面活性剤としては、例えば、高級脂肪酸石鹸;アルキル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、アシルN−メチルタウリン塩、アルキルエーテルリン酸エステル塩、N−アシルアミノ酸塩等のアニオン界面活性剤;塩化アルキルトリメチルアンモニウム、塩化ジアルキルジメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム等のカチオン界面活性剤;アルキルジメチルアミノ酢酸ベタイン、アルキルアミドジメチルアミノ酢酸ベタイン、2−アルキル−N−カルボキシ−N−ヒドロキシイミダゾリニウムベタイン等の両性界面活性剤;及びポリオキシエチレン型、多価アルコールエステル型、エチレンオキシド・プロピレンオキシドブロック共重合体等の非イオン界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されるも Examples of the surfactants include higher fatty acid soaps, alkyl sulfates, polyoxyethylene alkyl ether sulfates, acyl N- methyl taurine salts, alkyl ether phosphate salts, anionic surface such as N- acylamino acid salt active agents; alkyltrimethylammonium chloride, dialkyldimethylammonium chloride, a cationic surfactant such as benzalkonium chloride, alkyl dimethylamino acetic acid betaine, alkylamido betaine, 2-alkyl -N- carboxy -N- hydroxy imidazolinium amphoteric surfactants such as betaine; and polyoxyethylene type, polyhydric alcohol ester type, is also non-ionic surfactants such as ethylene oxide-propylene oxide block copolymers, it is limited to ではない。 Not.

上記の無機充填剤は、粘度調整、及び感触改良等の目的のため配合され、例えば、タルク、マイカ又は二酸化チタン等を用いることができる。 The inorganic filler is compounded for the purpose of viscosity adjustment, and texture modifier, for example, can be used talc, mica or titanium dioxide.

上記の増粘剤としては、例えば、カルボキシセルロース、エチルセルロース、可溶性デンプン、ポリビニルアルコール、キサンタンガム、カラギーナン、ゼラチン、及びポリアクリル酸エステル共重合体等を挙げることができる。 Examples of the thickener include, for example, carboxymethyl cellulose, ethyl cellulose, soluble starch, polyvinyl alcohol, xanthan gum, carrageenan, gelatin, and polyacrylic ester copolymer.

上記の紫外線吸収剤としては、例えば、パラアミノ安息香酸及びその誘導体、ブチルメトキシベンゾイルメタン、パラメトキシケイ皮酸誘導体、サリチル酸誘導体、ベンゾフェノン誘導体、イミダゾリン誘導体等を挙げることができる。 Examples of the ultraviolet absorber may include, for example, para-aminobenzoic acid and its derivatives, butyl methoxybenzoyl methane, para-methoxy cinnamic acid derivatives, salicylic acid derivatives, benzophenone derivatives, imidazoline derivatives and the like.

上記の酸化防止剤としては、例えば、ブチルヒドロキシアニソール(BHA)、ブチルヒドロキシトルエン(BHT)、及びノルジヒドログアヤレチック酸(NDGA)等が挙げられる。 The antioxidant described above, for example, butylated hydroxyanisole (BHA), butylated hydroxytoluene (BHT), and nordihydroguaiaretic acid (NDGA), and the like.

上記の防腐剤としては、例えば、安息香酸及びその塩、サリチル酸及びその塩、デヒドロ酢酸及びその塩、ヘキサクロロフェン、ホウ酸、レゾルシン、ジンクピリチオン、ヒノキチオール等を挙げることができる。 Examples of the preservatives include, for example, benzoic acid and salts thereof, salicylic acid and its salts, dehydroacetic acid and its salts, hexachlorophene, boric acid, resorcin, zinc pyrithione, and hinokitiol.

上記の栄養剤としては、ビタミンA及びその誘導体、ビタミンB類、ビタミンE類、ビタミンD類、ビタミンH、パントテン酸等の各種ビタミンやアミノ酸等を挙げることができる。 Examples of the nutrient, vitamin A and its derivatives, vitamin B, vitamin E, vitamin D, vitamin H, can include various vitamins and amino acids such as pantothenic acid.

上記の美白剤としては、例えば、液状ラノリン、コガネバナ根抽出エキス、トリアジン誘導体等のアスコルビン酸及びその誘導体、甘草エキス、茶抽出物、トコフェノール及びその誘導体、トラネキサム酸及びその塩、アズレン、γ−ヒドロキシ酪酸等を挙げることができる。 Examples of the whitening agents, for example, liquid lanolin, Scutellaria root extract, ascorbic acid and its derivatives such as triazine derivatives, licorice extract, tea extract, tocopherol and derivatives thereof, tranexamic acid and its salts, azulene, .gamma. hydroxybutyric acid, and the like can be given.

血行促進剤としては、例えばニコチン酸アミド、グリチルレチン酸及びその誘導体、サポニン類、トラネキサム酸、セファランジン、センブリエキス等を挙げることができる。 The blood circulation promoter, such as nicotinic acid amide, glycyrrhetinic acid and its derivatives, saponins, tranexamic acid, Sefaranjin, can be mentioned assembly extract, and the like.

上記の局所刺激剤としては、例えば、トウガラシチンキ、カンタリスチンキ、ニコチン酸ベンジルエステル等を挙げることができる。 Examples of the topical stimulant include, for example, capsicum tincture, cantharides tincture, nicotinic acid benzyl ester.

上記の抗炎症剤としては、例えば、グリチルリチン酸誘導体、アズレン、アミノカプロン酸、ヒドロコルチゾン等を挙げることができる。 As the antiinflammatory agents, for example, it can be mentioned glycyrrhizic acid derivatives, azulene, aminocaproic acid, hydrocortisone and the like.

上記の収斂剤としては、例えば、酸化亜鉛、硫酸亜鉛、塩化アルミニウム、タンニン酸、及び没食子酸等を挙げることができる。 Examples of the astringent, for example, zinc oxide, zinc sulfate, aluminum chloride, tannic acid, and gallic acid. 上記の清涼剤としては、例えばメントール、カンフル等を挙げることができる。 Examples of the refreshing agent include menthol, camphor and the like.

本発明の医薬の投与量及び投与回数は特に限定されず、予防及び/又は治療の目的、疾患の種類、患者の体重や年齢、疾患の重篤度などの条件に応じて、適宜選択することができる。 The amount and frequency of administration of the medicament of the present invention is not particularly limited, prophylaxis and / or treatment purposes, type of disease, in accordance with the conditions such as the severity of the patient's weight and age, disease, be appropriately selected can. 一般的には、経口投与における成人一日あたりの投与量は有効成分であるレチノイン酸の重量として0.1〜1000 mg程度であり、一日1回又は数回に分けて、あるいは数日ごとに投与することができる。 In general, the dose per adult a day in oral administration is 0.1 to 1000 mg approximately as the weight of retinoic acid, the active ingredient, each in single or divided doses per day, or days it can be administered to. 該医薬を注射剤として用いる場合には、成人に対して有効成分質量として、一日0.1〜1000 mgを連続投与又は間欠投与することが望ましい。 When the medicament is used as an injection, as the weight of an active ingredient for an adult, administrations may preferably be performed continuously or intermittently administer the daily 0.1 to 1000 mg.

以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。 Further illustrate the present invention by the following examples, but the present invention is not limited by the examples.

(A)実験材料および方法(1)実験材料 マウス肺胞上皮細胞株MLE-12細胞は米国細胞バンクAmerican Type Culture Collection (ATCC)より入手した。 (A) Experimental materials and methods (1) Experimental Materials Mice alveolar epithelial cell line MLE-12 cells were obtained from American Cell Bank American Type Culture Collection (ATCC). 培養には、10% 牛胎仔血清 (FBS)および抗生物質(penicillin 100 unit/mL,streptomycin 100 μg/mL)を含む培地DMEMを用い、炭酸ガス培養器内に5% CO 2 、37℃下に静置培養した。 The culture, 10% fetal bovine serum (FBS) and antibiotics in a medium DMEM containing (penicillin 100 unit / mL, streptomycin 100 μg / mL), in a 5% CO 2, 37 under the ℃ CO 2 incubator It was allowed to stand culture. なお,本実施例で用いたレチノイン酸はSigma社より購入したretinoic acid (Cat#: R2625)を用いた。 Incidentally, retinoic acid was used in this example retinoic acid purchased from Sigma (Cat #: R2625) was used. ICR系雄性マウス(6週齢)は、日本チャールズリバー社より購入し、25℃下、自由飲水、自由摂食にて飼育した。 ICR male mice (6 weeks old) were purchased from Charles River Japan, under 25 ℃, free drinking water, were housed in free feeding.

(2)Cell lysateの調整およびWestern blotting (2) Cell lysate of adjustment and Western blotting
細胞をRIPA buffer (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 5 mM EDTA, 1% NP-40, 0.1% SDS, 0.5% Deoxycholate, 1% proteinase inhibitor cocktail)により可溶化し、遠心 (14,000 xg, 4(C, 10 min) した上清を試料とした。各サンプルは12%アクリルアミドゲルを用いて電気泳動し、PVDF膜に転写、5% スキムミルクを含むPBSで室温、1時間ブロッキングを行った。その後、0.1% Tweenを含むPBS (0.1% tween-PBS)で洗浄し、一次抗体(抗AQP5抗体,Alomon社;4℃,8時間)および二次抗体(抗ウサギ抗体;室温,1時間)を行い、ECL western blotting detection reagent (Amersham社) を用いて免疫複合体を化学発光させ、バイオイメージングアナライザー(LAS1000, Fuji Film社)により検出した。 Cells RIPA buffer and solubilized by (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 5 mM EDTA, 1% NP-40, 0.1% SDS, 0.5% Deoxycholate, 1% proteinase inhibitor cocktail), centrifuged ( 14,000 xg, 4 a (C, 10 min) supernatant was used as a sample. each sample was subjected to electrophoresis using 12% acrylamide gels, transferred to PVDF membranes at room temperature with PBS containing 5% skim milk, 1 h blocking went then washed with PBS (0.1% tween-PBS) containing 0.1% Tween, the primary antibody. (anti AQP5 antibody, Alomon Corporation; 4 ° C., 8 hours) and secondary antibody (anti-rabbit antibody; RT, 1 performs time), ECL western blotting detection reagent (Amersham Co.) is chemiluminescence immune complex was used to detect the Bio-imaging analyzer (LAS1000, loaded with Fuji Film Co.).

(3)総細胞RNAの抽出および RT-PCR法によるmRNAの検出 細胞からのRNAの抽出には、Trizol試薬(Gibco BRL社)を用いた。 (3) the extraction of RNA from the detection cell of mRNA by extraction and RT-PCR method of total cellular RNA, using Trizol reagent (Gibco BRL Inc.). 抽出操作は、全て本試薬のマニュアルに準じ、得られたRNAの収量および純度は260 nmおよび280 nmのUV吸収により算出し、OD260/OD280比が1.8以上の高純度のものだけを用いた。 Extraction operation, all pursuant to this reagent manual, yield and purity of the resulting RNA was calculated by UV 260 nm absorption and 280 nm, OD260 / OD280 ratio using only the 1.8 or more high purity. 抽出したRNA 1μgを鋳型とし、RNA PCR KIT Ver.2 (Takara社)を用いて、逆転写およびDNA増幅しAQP5および内部標準としてのGAPDHを検出した。 Extracted RNA 1 [mu] g as a template, using the RNA PCR KIT Ver.2 (Takara Co.) to detect GAPDH as reverse transcription and DNA amplification by AQP5 and the internal standard. 本キットに含まれるoligo-dT プライマーを用いて、42℃、60分間反応させRNAをDNA化し、下記に示すプライマーを用いたDNA増幅反応によってAQP5および内部標準としてのGAPDHを増幅した。 Using oligo-dT primers in the kit, 42 ° C., the RNA was reacted for 60 minutes turned into DNA, was amplified GAPDH as AQP5 and internal standard by DNA amplification reaction using the primers shown below. 得られたDNA断片は、1.5%アガロースゲル電気泳動をethidium bromide 染色により可視化した。 The resulting DNA fragment, a 1.5% agarose gel electrophoresis and visualized by ethidium bromide staining.

AQP5 Forward;5'-GGC CAC ATC AAT CCA GCC ATT-3'(配列番号1) AQP5 Forward; 5'-GGC CAC ATC AAT CCA GCC ATT-3 '(SEQ ID NO: 1)
AQP5 Reverse;5'-GGC TGG GTT CAT GGA ACA GCC-3' (配列番号2) AQP5 Reverse; 5'-GGC TGG GTT CAT GGA ACA GCC-3 '(SEQ ID NO: 2)
GAPDH Forward;5'-CGG GAA GCT TGT GAT CAA TGG-3' (配列番号3) GAPDH Forward; 5'-CGG GAA GCT TGT GAT CAA TGG-3 '(SEQ ID NO: 3)
GAPDH Reverse;5'-GGC AGT GAT GGC ATG GAC TG-3' (配列番号4) GAPDH Reverse; 5'-GGC AGT GAT GGC ATG GAC TG-3 '(SEQ ID NO: 4)

(4)AQP5プロモーター活性の測定 (4) AQP5 promoter activity measurement of
AQP5プロモータは、ラットのゲノムよりLA Taq polymerase (Takara社)を用いたPCRによりクローニングした-160/+69の229 bp断片を用いた。 AQP5 promoter, was used 229 bp fragment was cloned by PCR using LA Taq polymerase (Takara Co.) than rat genomes -160 / + 69. クローニングしたゲノムDNA断片をpGL2 basic ベクター(Promega社)のルシフェラーゼ配列の上流に挿入した。 The cloned genomic DNA fragment was inserted upstream of the luciferase sequence of pGL2 basic vector (Promega Corp.). プロモーター上に存在するSp1結合部位の点変異体は、Quick change II XL site-directed mutagenesis kit (Stratagene社)を用いて作成した。 Point mutants of Sp1 binding sites present on the promoter was prepared using Quick change II XL site-directed mutagenesis kit (Stratagene, Inc.).

作成した各プロモーターを含むルシフェラーゼベクターは、TransFast試薬(Promega社)を用いて、MLE-1細胞に導入した。 Luciferase vector containing each promoter created using TransFast reagent (Promega, Inc.) was introduced into MLE-1 cells. 12well培養皿上で、70-80%コンフルエントまで成育したMLE-12細胞に、遺伝子導入試薬Transfast (Promega社)を用いて1μg/wellのDNAを導入し、さらに48時間培養後に細胞を可溶化しルシフェラーゼアッセイに供した。 On 12well culture dishes, to MLE-12 cells were grown to 70-80% confluency, introducing DNA of 1 [mu] g / well using a transfection reagent Transfast (Promega Corp.), further cells are solubilized after 48 hours incubation They were subjected to luciferase assay. ルシフェラーゼアッセイには、Dual luciferase assay kit (Promega社) を用い、上記のルシフェラーゼ遺伝子導入時に非特異的プロモーターをもつphRL-TK(Renilla ルシフェラーゼをコードする遺伝子)を同時に導入し、内部標準とした. Luciferase assays, Dual luciferase assay using the kit (Promega Corp.), said simultaneously introduced phRL-TK with nonspecific promoter (gene encoding Renilla luciferase) when luciferase gene transfer as an internal standard. AQP5プロモーター活性は、ルシフェラーゼ/Renilla ルシフェラーゼ比として現し、この比の上昇をもって活性化亢進と見なした。 AQP5 promoter activity, expressed as luciferase / Renilla luciferase ratio was considered activated enhanced with an increase in this ratio.

(5)核タンパク質の抽出およびElectrophoretic mobility shift assay (EMSA) (5) Extraction of nuclear proteins and Electrophoretic mobility shift assay (EMSA)
レチノイン酸処理したMLE-12細胞をPBSで洗浄し、遠心(1000 X g for 5 min, at 4°C)にて集め、100μlの緩衝液(10 mM HEPES-KOH (pH 7.9), 10 mM KCl, 1.5 mM MgCl 2 , 0.5 mM dithiothreitol, 1 mM sodium orthovanadate, 30 mM β-glycerophosphate and 1%v/v protease inhibitor cocktail (Sigma))に懸濁した。 The MLE-12 cells treated retinoic acid washing with PBS, collected by centrifugation (1000 X g for 5 min, at 4 ° C), buffer 100μl (10 mM HEPES-KOH (pH 7.9), 10 mM KCl , 1.5 mM MgCl 2, and suspended in 0.5 mM dithiothreitol, 1 mM sodium orthovanadate , 30 mM β-glycerophosphate and 1% v / v protease inhibitor cocktail (Sigma)). これを凍結後氷上で10分間溶かし、6 μlの10% Nonidet P-40を加えてvoltex mixerを用いて30秒間激しく攪拌した。 Dissolve 10 minutes on ice after freezing which was 30 seconds vigorously stirred with a voltex mixer by adding 10% Nonidet P-40 of 6 [mu] l. その後、遠心(15000 X g for 15 s, at 4°C)して、沈渣として得られた核に50μlの緩衝液(20 mM HEPES-KOH (pH 7.9), 1.5 mM MgCl 2 , 0.42 M NaCl, 0.2 mM EDTA (pH 8.0), 25% glycerol, 0.5 mM dithiothreitol, 1 mM sodium orthovanadate, 30 mMβ-glycerophosphate and 1%v/v protease inhibitor cocktail)を加え、再び30秒間激しく攪拌した。 Then centrifuged (15000 X g for 15 s, at 4 ° C), buffer 50μl nuclear obtained as sediments (20 mM HEPES-KOH (pH 7.9), 1.5 mM MgCl 2, 0.42 M NaCl, 0.2 mM EDTA (pH 8.0), 25% glycerol, 0.5 mM dithiothreitol, 1 mM sodium orthovanadate, 30 mMβ-glycerophosphate and 1% v / v protease inhibitor cocktail), and the mixture was vigorously stirred again for 30 seconds. その後、遠心(15000 X g for 15 s, at 4°C)により上清を回収し、核抽出物とした。 Thereafter, the supernatant was collected by centrifugation (15000 X g for 15 s, at 4 ° C), and the nuclear extract.

Sp1転写因子のEMSAには、[γ−32P] ATPでラベルしたSp1結合配列を含む oligo DNAを用いた。 The EMSA of the Sp1 transcription factor, using oligo DNA comprising the Sp1 binding sequence labeled with [γ-32P] ATP. 10μg の核抽出物に2μg の poly(dI-dC)・(dI-dC) (Amersham Pharmacia Biotech)、非標識oligo DNAおよびSp1抗体(Santa Cruz Biotechnology社)を加え、10分間氷上で前処理した後に、標識 oligo DNA(5 X 10 4 cpm)を含む緩衝液(10 mM HEPES-KOH (pH 7.9), 50 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl 2 , 1 mM dithiothreitol and 10% glycerol)を加えて、10分間室温で反応させた。 10 [mu] g poly of 2μg nuclear extracts (dI-dC) · (dI-dC) (Amersham Pharmacia Biotech), unlabeled oligo DNA and Sp1 antibodies (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) was added, after pretreatment with ice for 10 minutes , buffer containing labeled oligo DNA (5 X 10 4 cpm ) (10 mM HEPES-KOH (pH 7.9), 50 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl 2, 1 mM dithiothreitol and 10% glycerol) was added It was reacted at room temperature for 10 minutes. その後、反応液を4%ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動に供し、放射標識されたバンドをイメージアナライザーBAS2000(Fiji Film社)で可視化した。 Thereafter, the reaction solution was subjected to electrophoresis using 4% polyacrylamide gels and visualized radiolabeled band image analyzer BAS2000 (Fiji Film Co.).

7匹のマウスのうち4匹に10 mg/kgのレチノイン酸を、他の3匹には対照として8 ml/kgのsesame oilを1日1回、5日間、腹腔内投与した。 Retinoic acid 10 mg / kg in 4 of 7 mice, once a day sesame oil of 8 ml / kg as a control in the other three animals, 5 days, was administered intraperitoneally. 5日目の投与から6時間後に、マウスより肺を摘出し、ポリトロンホモジナイザーを用いてホモジナイズし、遠心後(600 xg, 10 min)上清を採取して、上記のWestern blottingに供した。 After 5 days 6 hours from the administration of, and the lungs removed from the mouse, and homogenized using a Polytron homogenizer, and after centrifugation the (600 xg, 10 min) the supernatant was collected and subjected to the above Western Blotting. Western blottingにより得られたAQP5のバンドは、バイオイメージングアナライザー(LAS1000, Fuji Film社)により解析、各バンドの濃さを定量化した。 Band AQP5 obtained by Western blotting is analyzed by Bio-imaging Analyzer (LAS1000, loaded with Fuji Film Co., Ltd.) to quantify the density of each band. これを基に、レチノイン酸投与群と対照群の各平均値と標準誤差を求めるとともに、Student's T-test 法により有意差の有無を統計学的に判定した。 Based on this, together with obtaining the respective mean and standard error of the control group retinoic acid administration group was determined whether a significant difference statistically by Student's T-test method.

(B)実験結果(1)肺上皮細胞株MLE-12のAQP5 mRNA発現量に対するレチノイン酸の作用(図1) (B) Experimental Results (1) effect of retinoic acid on AQP5 mRNA expression levels in lung epithelial cell line MLE-12 (Fig. 1)
MLE-12細胞の培養液に、レチノイン酸(10μM)を加え、その後、6、12、24および48時間培養しRNAを抽出、上記のRT-PCRによりAQP5 mRNAを検出した(図1のA)。 The MLE-12 culture cells, added retinoic acid (10 [mu] M), then extracted 6, 12, 24 and 48-hr cultured RNA, were detected AQP5 mRNA by the above RT-PCR (A in FIG. 1) . レチノイン酸は時間依存的にAQP5のmRNAA量を増加させた。 Retinoic acid increased the mRNAA amount of time-dependent manner AQP5. なお、各試料間のRNAが一定であることをGAPDH mRNAを同時に増幅、検出することにより確認した。 It was confirmed by RNA between each sample simultaneously amplifying, detecting the GAPDH mRNA to be constant.

また、レチノイン酸(0.01,0.1,1あるいは10 μM)をMLE-12細胞の培養液に加え、24時間後のAQP5 mRNAをRT-PCR法により調べた(図1のB)。 In addition to retinoic acid (0.01, 0.1, 1 or 10 [mu] M) to the culture of MLE-12 cells was examined AQP5 mRNA after 24 hours by an RT-PCR method (B in FIG. 1). レチノイン酸は、濃度依存的にAQP5 mRNA量を増加させた。 Retinoic acid was concentration-dependently increased the AQP5 mRNA amount.

これらの結果より,レチノイン酸はAQP5のmRNA発現を促進することが実証された。 These results, retinoic acid has been demonstrated to promote mRNA expression of AQP5.

(2)肺上皮細胞株MLE-12のAQP5 タンパク質発現量に対するレチノイン酸の作用(図2) (2) effect of retinoic acid on AQP5 protein expression level in lung epithelial cell line MLE-12 (Fig. 2)
MLE-12細胞の培養液に、レチノイン酸(10μM)を加え、その後、6、12、24および48時間培養しcell lysate を調製、上記のWestern blot法によりAQP5タンパク質を検出した(図2のA)。 The culture of MLE-12 cells, added retinoic acid (10 [mu] M), then preparing a cell lysate and cultured 6, 12, 24 and 48 hours were detected AQP5 protein by the above Western blot method (in FIG. 2 A ). レチノイン酸は時間依存的にAQP5のタンパク質量を増加させた。 Retinoic acid increased the amount of protein in a time-dependent manner AQP5. なお、抗体反応の陽性対照として、ラット唾液腺のホモジネートを同時に処理した(Lane P)。 As a positive control antibody reaction were simultaneously treated homogenate of the rat salivary glands (Lane P). なお、各試料間のタンパク質量が一定であることをβ-actinの抗体を用いて確認した(panel 下段)。 It was confirmed by using the antibody of the beta-actin that protein content between the samples is constant (panel lower).

レチノイン酸(0.01,0.1,1あるいは10μM)をMLE-12細胞の培養液に加え、24時間後のAQP5 タンパク量をWestern blot法により調べた(図2のB)。 Adding retinoic acid (0.01, 0.1, 1 or 10 [mu] M) to the culture of MLE-12 cells, the AQP5 protein amount after 24 hours was examined by Western blot method (B in FIG. 2). レチノイン酸は、濃度依存的にAQP5 タンパク質量を増加させた。 Retinoic acid increased the concentration-dependent manner AQP5 protein content. なお、各試料間のタンパク質量が一定であることをβ-actinの抗体を用いて確認した(panel 下段)。 It was confirmed by using the antibody of the beta-actin that protein content between the samples is constant (panel lower).

これらの結果より,レチノイン酸はAQP5のタンパク質量を増加させることが実証された。 These results, retinoic acid has been demonstrated to increase the protein content of AQP5.

(3)レチノイン酸によるAQP5プロモーターの活性化にはSp1結合モチーフが必要である(図3) (3) The activation of AQP5 promoter by the retinoic acid is necessary Sp1 binding motif (Fig. 3)
AQP5プロモーター(-160/+69)および本プロモーターに含まれる三ヶ所のSp1/Sp3転写因子結合部位を点変異させたプロモーター(mut1, mut2およびmut3)を用いたルシフェラーゼレポータージーンアッセイを行った。 AQP5 promoter (-160 / + 69) and the promoter three places of Sp1 / Sp3 transcription factor binding sites were point mutations promoter contained (mutl, mut2 and mut3) proceeded with luciferase reporter gene assay was used. ルシフェラーゼレポーター遺伝子を導入したMLE-12細胞にレチノイン酸(10μM)を加え、48時間後に、ルシフェラーゼ活性を測定した(図3)。 Retinoic acid (10 [mu] M) was added to the MLE-12 cells transfected with the luciferase reporter gene, after 48 hours, luciferase activity was measured (Fig. 3). AQP5プロモーター上には、レチノイン酸受容体の特異的結合配列はないが、AQP5プロモーター活性を著明に亢進した(-160/+69の実験結果より)。 On AQP5 promoter, but not the specific binding sequence of retinoic acid receptor, (from the experimental results of the -160 / + 69) was enhanced markedly the AQP5 promoter activity. 従って、レチノイン酸は、AQP5の転写を亢進することが実証された。 Thus, retinoic acid has been demonstrated to enhance the transfer of AQP5.

レチノイン酸のプロモーター活性亢進作用はmut1およびmut3では野生型と同様に認められたが,mut2では消失した。 Promoter activity-enhancing effect of retinoic acid was observed as with wild-type In mut1 and mut3 but disappeared in mut2.

これらの結果より、mut2部位に結合する転写因子すなわちSp1またはSp3がレチノイン酸によるAQP5の転写亢進作用に関与すると推定された。 These results, transcription factors i.e. Sp1 or Sp3 that bind to mut2 site was estimated to be involved in transcription enhancing effect of AQP5 by retinoic acid.

(4)レチノイン酸はSp1およびSp3の核内発現量に著明な影響を与えない(図4) (4) Retinoic acid not have a marked effect on the nuclear expression of Sp1 and Sp3 (FIG. 4)
レチノイン酸(10μM)で48時間処理したMLE−12細胞から、上記の方法により各抽出物を調製し、これを試料としてSp1およびSp3転写因子の量をWestern blot法により調べた(図4)。 From MLE-12 cells treated for 48 hours with retinoic acid (10 [mu] M), each extract was prepared by the method described above, which was the amount of Sp1 and Sp3 transcription factor as a sample examined by Western blot method (Fig. 4). レチノイン酸は、これらの転写因子の発現量に著明な影響を与えなかった。 Retinoic acid did not have a significantly affect the expression of these transcription factors.

(5)レチノイン酸はSp1のDNA結合を促進する(図5) (5) retinoic acid promotes DNA binding of Sp1 (Fig. 5)
レチノイン酸(10μM)で48時間処理したMLE−12細胞から、上記の方法により各抽出物を調製し、これを試料としてSp1/Sp3の結合配列をもつoligo DNAプローブを用いたEMSAを行った(図5)。 From MLE-12 cells treated for 48 hours with retinoic acid (10 [mu] M), each extract was prepared by the method described above, was performed EMSA using oligo DNA probes with binding sequence of Sp1 / Sp3 this as a sample ( Figure 5). MLE-12細胞の核抽出物には、Sp1およびSP3と考えられる2本のバンド(Panel A, →で示した)が検出された。 The nuclear extract of MLE-12 cells, two bands considered Sp1 and SP3 (Panel A, indicated by →) is detected. このうち、高分子側の主要なバンドはSp1抗体の処理によって消失し、本プロモーターに結合する主要な転写因子がSp1であると考えられた。 Of these, the major bands of the polymer side lost by treatment Sp1 antibody, major transcription factor that binds to the promoter was considered to be Sp1. 細胞をレチノイン酸(10μM)で48時間処理すると、Sp1に相当するバンドが著明に増加した。 When cells were treated for 48 hours with retinoic acid (10 [mu] M), a band corresponding to the Sp1 increased markedly. (4)の実験結果と併せて考えると、レチノイン酸は、Sp1転写因子の量を変えることなく、DNA結合能を増加させたと考えられた. Taken together with the results of experiments (4), retinoic acid, without changing the amount of Sp1 transcription factor, was considered to have increased the DNA binding ability.

(6)レチノイン酸はin vivoでマウス肺のAQP5発現量を増加させる(図6) (6) retinoic acid increases the AQP5 expression of mouse lung in vivo (Figure 6)
レチノイン酸10 mg/kgを1日1回5日間投与したマウス肺のAQP5発現量を、上記の方法により、対照としてsesame oilを投与したマウスと比較検討した(図6)。 The AQP5 expression level of mouse lung treated with retinoic acid 10 mg / kg 1 time a day for 5 days, by the above method were compared to mice administered sesame oil as a control (Figure 6). 対照群のAQP5発現量の平均値を100%として表すと、レチノイン酸を投与したマウス肺のAQP5発現量は約140%に増加した。 Denoting the average value of the AQP5 expression level of the control group as 100%, AQP5 expression level of mouse lung treated with retinoic acid increased to about 140%. この増加は、Student's T-testにより危険率0.0018をもって有意な変化と判定された。 This increase was determined to be significant changes with risk rate 0.0018 by Student's T-test.

これらの結果より、レチノイン酸はin vivoでもAQP5発現を亢進することが実証された。 These results, retinoic acid has been demonstrated to enhance AQP5 expression even in vivo.

図1は、肺上皮細胞株MLE-12のAQP5 mRNA発現量に対するレチノイン酸の作用を示す実験結果である。 Figure 1 shows the experimental results showing the effect of retinoic acid on AQP5 mRNA expression levels in lung epithelial cell line MLE-12. 図2は、肺上皮細胞株MLE-12のAQP5 タンパク質発現量に対するレチノイン酸の作用を示す実験結果である。 Figure 2 shows the experimental results showing the effect of retinoic acid on AQP5 protein expression level in lung epithelial cell line MLE-12. 図3は、レチノイン酸によるAQP5プロモーターの活性化にはSp1結合モチーフが必要であることを示す実験結果である。 3, the activation of AQP5 promoter by the retinoic acid is an experimental result indicating that it is necessary to Sp1 binding motif. 図4は、レチノイン酸はSp1およびSp3の核内発現量に著明な影響を与えないことを示す実験結果である。 4, retinoic acid is the experimental results show that not have a marked effect on the nuclear expression of Sp1 and Sp3. 図5は、レチノイン酸はSp1のDNA結合を促進することを示す実験結果である。 Figure 5 is a retinoic acid is an experimental result showing that promote DNA binding Sp1. 図6は、マウス肺のAQP5タンパク質発現量に対する腹腔内投与したレチノイン酸の作用を示す実験結果である。 Figure 6 shows the experimental results showing the effect of retinoic acid administered intraperitoneally for AQP5 protein expression of mouse lung.

[配列表] [Sequence Listing]
SEQUENCE LISTING SEQUENCE LISTING
<110> Kumamoto University <110> Kumamoto University
<120> An agent for increasing expression of aquaporinn-5 <120> An agent for increasing expression of aquaporinn-5
<130> A61423A <130> A61423A
<160> 4 <160> 4
<210> 1 <210> 1
<211> 21 <211> 21
<212> DNA <212> DNA
<213> Artificial Sequence <213> Artificial Sequence
<220> <220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 1 <400> 1
ggccacatca atccagccat t 21 ggccacatca atccagccat t 21
<210> 2 <210> 2
<211> 21 <211> 21
<212> DNA <212> DNA
<213> Artificial Sequence <213> Artificial Sequence
<220> <220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 2 <400> 2
ggctgggttc atggaacagc c 21 ggctgggttc atggaacagc c 21
<210> 3 <210> 3
<211> 21 <211> 21
<212> DNA <212> DNA
<213> Artificial Sequence <213> Artificial Sequence
<220> <220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 3 <400> 3
cgggaagctt gtgatcaatg g 21 cgggaagctt gtgatcaatg g 21
<210> 4 <210> 4
<211> 20 <211> 20
<212> DNA <212> DNA
<213> Artificial Sequence <213> Artificial Sequence
<220> <220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 4 <400> 4
ggcagtgatg gcatggactg 20 ggcagtgatg gcatggactg 20

Claims (4)

  1. レチノイン酸又はその塩を有効成分として含む、アクアポリン5の発現亢進剤。 Retinoic acid or a salt thereof as an active ingredient, expression enhancers of aquaporin 5.
  2. レチノイン酸又はその塩を有効成分として含む、アクアポリン5の機能異常に起因する疾患の予防及び/又は治療のための医薬。 Comprising retinoic acid or a salt thereof as an active ingredient, the prevention of dysfunction caused by diseases of aquaporin 5 and / or therapeutic medicament for the.
  3. アクアポリン5の機能異常に起因する疾患が、水分代謝異常を伴う疾患、又は呼吸不全を伴う疾患である、請求項2に記載の医薬。 Dysfunction caused by diseases of aquaporin 5 is a disease with a disease involving water metabolism, or respiratory failure, medicament according to claim 2.
  4. アクアポリン5の機能異常に起因する疾患が、口渇、ドライアイ、鼻腔乾燥に伴う出血、皮膚乾燥による掻痒感、気道乾燥による咳及び痰、又は肺水腫である、請求項2又は3に記載の医薬。 Dysfunction caused by diseases of aquaporin 5, bleeding associated with dry mouth, dry eyes, nasal drying, itching by skin drying, a cough and sputum, or pulmonary edema caused by airway drying, according to claim 2 or 3 pharmaceutical.
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