JP2007300927A - Anti-glypican 3 antibody - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、抗グリピカン3抗体、ならびにかかる抗体を有効成分とする細胞増殖抑制剤および抗癌剤に関する。 The present invention relates to an anti-glypican 3 antibody, and a cytostatic and anticancer agent containing such an antibody as an active ingredient.
グリピカン3(GPC3)は、細胞表面上に存在するヘパラン硫酸プロテオグリカンのファミリーの1つであり、発生における細胞分裂や、癌細胞の増殖に関与している可能性があることが示唆されているが、その機能はまだよく解明されていない。 Glypican 3 (GPC3) is one of the family of heparan sulfate proteoglycans existing on the cell surface, and it has been suggested that it may be involved in cell division during development and proliferation of cancer cells. Its function is not well understood.
GPC3に結合するある種の抗体が、ADCC(抗体依存性細胞障害)活性およびCDC(補体依存性細胞障害)活性により細胞増殖抑制作用を有することが見いだされている(WO2003/000883)。また、GPC3が生体内で切断されて分泌型GPC3として血中に分泌され、これを検出しうる抗体を用いて癌の診断が可能であることが示唆されている(WO2004/022739、WO03/100429、WO2004018667)。 Certain antibodies that bind to GPC3 have been found to have cytostatic effects due to ADCC (antibody dependent cytotoxicity) activity and CDC (complement dependent cytotoxicity) activity (WO2003 / 000883). In addition, it has been suggested that GPC3 is cleaved in vivo and secreted into the blood as secretory GPC3, and cancer can be diagnosed using an antibody capable of detecting this (WO2004 / 022739, WO03 / 100429). , WO2004018667).
抗体の細胞傷害活性を利用した抗癌剤を開発する場合、用いられる抗体は高いADCC活性又はCDC活性を有していることが好ましい為、GPC3を認識する抗体として高い細胞傷害活性を有する抗GPC3抗体が望まれていた。 When developing an anticancer agent utilizing the cytotoxic activity of an antibody, it is preferable that the antibody used has high ADCC activity or CDC activity. Therefore, an anti-GPC3 antibody having high cytotoxic activity is an antibody that recognizes GPC3. It was desired.
本発明は、従来の抗体と比較して高いADCC活性およびCDC活性を有する抗GPC3抗体を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide an anti-GPC3 antibody having higher ADCC activity and CDC activity than conventional antibodies.
本発明者らは従来の抗グリピカン3抗体と比較して高い細胞傷害活性を有する抗体の取得に成功した。さらに、それらの抗体のエピトープを解析することにより、高い細胞傷害活性を発揮する抗体が認識するGPC3上の部位を見出すことに成功した。 The present inventors have succeeded in obtaining an antibody having a higher cytotoxic activity than the conventional anti-glypican 3 antibody. Furthermore, by analyzing epitopes of these antibodies, the inventors succeeded in finding a site on GPC3 that is recognized by an antibody that exhibits high cytotoxic activity.
本発明は、以下の(1)−(12)のいずれか;
(1) 配列番号123に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号124に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号125に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3;
(2) 配列番号109に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号110に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号111に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3;
(3) 配列番号106に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号107に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号108に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3;
(4) 配列番号132に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号133に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号134に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3;
(5) 配列番号106に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号135に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号136に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3;
(6) 配列番号126に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号127に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号128に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3;
(7) 配列番号129に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号130に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号131に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3;
(8) 配列番号103に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号104に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号105に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3;
(9) 配列番号118に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号121に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号122に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3;
(10) 配列番号115に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号116に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号117に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3;
(11) 配列番号112に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号113に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号114に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3;または
(12) 配列番号118に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号119に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および120配列番号に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3
を有する重鎖可変領域を含む抗体を提供する。
Any of the following (1) to (12):
(1) CDR1 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 123, CDR2 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 124, and CDR3 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 125;
(2) CDR1 containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 109, CDR2 containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 110, and CDR3 containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 111;
(3) CDR1 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 106, CDR2 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 107, and CDR3 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 108;
(4) CDR1 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 132, CDR2 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 133, and CDR3 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 134;
(5) CDR1 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 106, CDR2 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 135, and CDR3 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 136;
(6) CDR1 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 126, CDR2 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 127, and CDR3 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 128;
(7) CDR1 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 129, CDR2 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 130, and CDR3 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 131;
(8) CDR1 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 103, CDR2 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 104, and CDR3 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 105;
(9) CDR1 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 118, CDR2 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 121, and CDR3 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 122;
(10) CDR1 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 115, CDR2 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 116, and CDR3 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 117;
(11) CDR1 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 112, CDR2 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 113, and CDR3 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 114; or (12) SEQ ID NO: 118 CDR comprising the amino acid sequence described in 1; CDR2 comprising the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 119; and CDR3 comprising the amino acid sequence described in 120 SEQ ID NO:
An antibody comprising a heavy chain variable region having is provided.
別の観点においては、本発明は、以下の(1)−(13)のいずれか:
(1) 配列番号143に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号144に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号158に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3;
(2) 配列番号143に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号144に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号145に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3;
(3) 配列番号140に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号141に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号142に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3;
(4) 配列番号167に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号168に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号169に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3;
(5) 配列番号170に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号144に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号171に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3;
(6) 配列番号159に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号160に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号161に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3;
(7) 配列番号162に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号147に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号163に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3;
(8) 配列番号164に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号165に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号166に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3;
(9) 配列番号137に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号138に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号139に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3;
(10) 配列番号155に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号156に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号157に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3;
(11) 配列番号149に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号150に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号151に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3;
(12) 配列番号146に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号147に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号148に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3;または
(13) 配列番号152に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号153に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号154に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3
を有する軽鎖可変領域を含む抗体を提供する。
In another aspect, the present invention provides any of the following (1) to (13):
(1) CDR1 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 143, CDR2 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 144, and CDR3 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 158;
(2) CDR1 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 143, CDR2 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 144, and CDR3 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 145;
(3) CDR1 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 140, CDR2 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 141, and CDR3 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 142;
(4) CDR1 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 167, CDR2 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 168, and CDR3 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 169;
(5) CDR1 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 170, CDR2 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 144, and CDR3 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 171;
(6) CDR1 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 159, CDR2 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 160, and CDR3 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 161;
(7) CDR1 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 162, CDR2 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 147, and CDR3 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 163;
(8) CDR1 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 164, CDR2 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 165, and CDR3 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 166;
(9) CDR1 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 137, CDR2 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 138, and CDR3 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 139;
(10) CDR1 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 155, CDR2 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 156, and CDR3 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 157;
(11) CDR1 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 149, CDR2 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 150, and CDR3 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 151;
(12) CDR1 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 146, CDR2 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 147, and CDR3 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 148; or (13) SEQ ID NO: 152 CDR comprising the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1, CDR2 comprising the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 153, and CDR3 comprising the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 154
There is provided an antibody comprising a light chain variable region having
好ましくは、本発明の抗体は、以下の(1)−(13):
(1) それぞれ配列番号123,124および125に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する重鎖可変領域,およびそれぞれ配列番号143,144および158に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(2) それぞれ配列番号109,110および111に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する重鎖可変領域,およびそれぞれ配列番号143,144および145に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(3) それぞれ配列番号106,107および108に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する重鎖可変領域,およびそれぞれ配列番号140,141および142に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(4) それぞれ配列番号132,133および134に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する重鎖可変領域,およびそれぞれ配列番号167,168および169に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(5) それぞれ配列番号106,135および136に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する重鎖可変領域,およびそれぞれ配列番号170,144および171に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(6) それぞれ配列番号126,127および128に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する重鎖可変領域,およびそれぞれ配列番号159,160および161に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(7) それぞれ配列番号129,130および131に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する重鎖可変領域,およびそれぞれ配列番号162,147および163に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(8) それぞれ配列番号129,130および131に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する重鎖可変領域,およびそれぞれ配列番号164,165および166に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(9) それぞれ配列番号103,104および105に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する重鎖可変領域,およびそれぞれ配列番号137,138および139に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(10) それぞれ配列番号118,121および122に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する重鎖可変領域,およびそれぞれ配列番号155,156および157に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(11) それぞれ配列番号115,116および117に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する重鎖可変領域,およびそれぞれ配列番号149,150および151に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する軽鎖可変領域,を含む抗体;
(12) それぞれ配列番号112,113および114に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する重鎖可変領域,およびそれぞれ配列番号146,147および148に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;および
(13) それぞれ配列番号118,119および120に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する重鎖可変領域,およびそれぞれ配列番号152,153および154に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体
からなる群より選択される。
Preferably, the antibody of the present invention has the following (1) to (13):
(1) a heavy chain variable
(2) a heavy chain variable
(3) a heavy chain variable region having CDR1, 2 and 3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 106, 107 and 108, respectively, and CDR1, comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 140, 141 and 142, respectively An antibody comprising a light chain variable region having 2 and 3;
(4) a heavy chain variable
(5) a heavy chain variable
(6) heavy chain variable regions having CDR1, 2 and 3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 126, 127 and 128, respectively, and CDR1, comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 159, 160 and 161, respectively An antibody comprising a light chain variable region having 2 and 3;
(7) a heavy chain variable
(8) a heavy chain variable region having CDR1, 2 and 3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 129, 130 and 131, respectively, and CDR1, comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 164, 165 and 166, respectively. An antibody comprising a light chain variable region having 2 and 3;
(9) a heavy chain variable region having CDR1, 2 and 3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 103, 104 and 105, respectively, and CDR1, comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 137, 138 and 139, respectively An antibody comprising a light chain variable region having 2 and 3;
(10) a heavy chain variable
(11) a heavy chain variable region having CDR1, 2 and 3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 115, 116 and 117, respectively, and CDR1, comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 149, 150 and 151, respectively An antibody comprising a light chain variable region having 2 and 3;
(12) a heavy chain variable
さらに別の観点においては、本発明は、以下の(1)〜(7)のいずれかに記載の重鎖可変領域:
(1) 配列番号84に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;
(2) 配列番号85に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;
(3) 配列番号86に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;
(4) 配列番号87に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;
(5) 配列番号88に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;
(6) 配列番号89に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;または
(7) 配列番号90に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;
を有する抗体を提供する。
In still another aspect, the present invention provides the heavy chain variable region according to any one of the following (1) to (7):
(1) a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 84;
(2) a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 85;
(3) a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 86;
(4) a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 87;
(5) a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 88;
(6) a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 89; or (7) a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 90;
An antibody is provided.
また別の観点においては、本発明は、配列番号92に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する抗体を提供する。 In another aspect, the present invention provides an antibody having a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 92.
好ましくは、本発明の抗体は、以下の(1)〜(7)の抗体:
(1) 配列番号84に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号92に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体;
(2) 配列番号85に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号92に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体;
(3) 配列番号86に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号92に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体;
(4) 配列番号87に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号92に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体;
(5) 配列番号88に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号92に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体;
(6) 配列番号89に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号92に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体;および
(7) 配列番号90に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号92に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体;
からなる群より選択される。
Preferably, the antibody of the present invention has the following antibodies (1) to (7):
(1) an antibody comprising a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 84 and a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 92;
(2) an antibody comprising a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 85 and a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 92;
(3) an antibody comprising a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 86 and a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 92;
(4) an antibody comprising a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 87 and a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 92;
(5) an antibody comprising a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 88 and a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 92;
(6) an antibody comprising a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 89 and a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 92; and (7) comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 90 An antibody comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 92;
Selected from the group consisting of
さらに別の観点においては、本発明は以下の(1)−(15)のいずれか:
(1) 配列番号174に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号144に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号158に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3;
(2) 配列番号175に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号144に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号158に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3;
(3) 配列番号176に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号144に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号158に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3;
(4) 配列番号177に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号144に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号158に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3;
(5) 配列番号178に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号144に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号158に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3;
(6) 配列番号179に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号144に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号158に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3;
(7) 配列番号180に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号144に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号158に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3;
(8) 配列番号181に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号144に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号158に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3;
(9) 配列番号182に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号144に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号158に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3;
(10) 配列番号183に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号144に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号158に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3;
(11) 配列番号184に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号144に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号158に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3;
(12) 配列番号185に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号144に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号158に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3;
(13) 配列番号186に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号144に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号158に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3;
(14) 配列番号187に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号144に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号158に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3;または
(15) 配列番号188に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号144に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号158に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3;
を有する軽鎖可変領域を含む抗体を提供する。
In still another aspect, the present invention provides any of the following (1) to (15):
(1) CDR1 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 174, CDR2 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 144, and CDR3 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 158;
(2) CDR1 containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 175, CDR2 containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 144, and CDR3 containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 158;
(3) CDR1 containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 176, CDR2 containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 144, and CDR3 containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 158;
(4) CDR1 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 177, CDR2 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 144, and CDR3 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 158;
(5) CDR1 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 178, CDR2 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 144, and CDR3 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 158;
(6) CDR1 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 179, CDR2 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 144, and CDR3 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 158;
(7) CDR1 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 180, CDR2 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 144, and CDR3 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 158;
(8) CDR1 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 181, CDR2 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 144, and CDR3 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 158;
(9) CDR1 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 182, CDR2 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 144, and CDR3 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 158;
(10) CDR1 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 183, CDR2 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 144, and CDR3 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 158;
(11) CDR1 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 184, CDR2 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 144, and CDR3 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 158;
(12) CDR1 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 185, CDR2 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 144, and CDR3 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 158;
(13) CDR1 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 186, CDR2 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 144, and CDR3 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 158;
(14) CDR1 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 187, CDR2 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 144, and CDR3 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 158; or (15) SEQ ID NO: 188 A CDR comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 144, a CDR2 comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 144, and a CDR3 comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 158;
There is provided an antibody comprising a light chain variable region having
さらに別の観点においては、本発明は以下の(1)−(15):
(1) それぞれ配列番号123,124および125に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する重鎖可変領域,およびそれぞれ配列番号174,144および158,に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(2) それぞれ配列番号123,124および125に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する重鎖可変領域,およびそれぞれ配列番号175,144および158に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(3) それぞれ配列番号123,124および125に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する重鎖可変領域,およびそれぞれ配列番号176,144および158に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(4) それぞれ配列番号123,124および125に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する重鎖可変領域,およびそれぞれ配列番号177,144および158に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(5) それぞれ配列番号123,124および125に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する重鎖可変領域,およびそれぞれ配列番号178,144および158に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(6) それぞれ配列番号123,124および125に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する重鎖可変領域,およびそれぞれ配列番号179,144および158に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(7) それぞれ配列番号123,124および125に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する重鎖可変領域,およびそれぞれ配列番号180,144および158に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(8) それぞれ配列番号123,124および125に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する重鎖可変領域,およびそれぞれ配列番号181,144および158に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(9) それぞれ配列番号123,124および125に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する重鎖可変領域,およびそれぞれ配列番号182,144および158に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(10) それぞれ配列番号123,124および125に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する重鎖可変領域,およびそれぞれ配列番号183,144および158に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(11) それぞれ配列番号123,124および125に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する重鎖可変領域,およびそれぞれ配列番号184,144および158に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(12) それぞれ配列番号123,124,および125に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する重鎖可変領域,およびそれぞれ配列番号185,144および158に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する軽鎖可変領域,を含む抗体;
(13) それぞれ配列番号123,124,および125に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する重鎖可変領域,およびそれぞれ配列番号186,144および158に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(14) それぞれ配列番号123,124および125に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する重鎖可変領域,およびそれぞれ配列番号187,144および158に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;および
(15) それぞれ配列番号123,124および125に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する重鎖可変領域,およびそれぞれ配列番号188,144および158に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体,
からなる群より選択される抗体を提供する。
In still another aspect, the present invention provides the following (1) to (15):
(1) A heavy chain variable
(2) a heavy chain variable region having CDR1, 2 and 3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 123, 124 and 125, respectively, and CDR1, comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 175, 144 and 158, respectively An antibody comprising a light chain variable region having 2 and 3;
(3) a heavy chain variable region having CDR1, 2 and 3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 123, 124 and 125, respectively, and CDR1, comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 176, 144 and 158, respectively An antibody comprising a light chain variable region having 2 and 3;
(4) a heavy chain variable
(5) a heavy chain variable region having CDR1, 2 and 3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 123, 124 and 125, respectively, and CDR1, comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 178, 144 and 158, respectively An antibody comprising a light chain variable region having 2 and 3;
(6) a heavy chain variable
(7) a heavy chain variable
(8) a heavy chain variable
(9) a heavy chain variable
(10) a heavy chain variable region having CDR1, 2 and 3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 123, 124 and 125, respectively, and CDR1, comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 183, 144 and 158, respectively An antibody comprising a light chain variable region having 2 and 3;
(11) a heavy chain variable
(12) a heavy chain variable
(13) a heavy chain variable
(14) a heavy chain variable
An antibody selected from the group consisting of:
さらに別の観点においては、本発明は以下の(1)〜(15):
(1) 配列番号191に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(2) 配列番号192に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(3) 配列番号193に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(4) 配列番号194に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(5) 配列番号195に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(6) 配列番号196に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(7) 配列番号197に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(8) 配列番号198に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(9) 配列番号199に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(10) 配列番号200に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(11) 配列番号201に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(12) 配列番号202に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(13) 配列番号203に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(14) 配列番号204に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;および
(15) 配列番号205に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
からなる群より選択される軽鎖可変領域を有する抗体を提供する。
In still another aspect, the present invention provides the following (1) to (15):
(1) a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 191;
(2) a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 192;
(3) a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 193;
(4) a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 194;
(5) a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 195;
(6) a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 196;
(7) a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 197;
(8) a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 198;
(9) a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 199;
(10) a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 200;
(11) a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 201;
(12) a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 202;
(13) a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 203;
(14) a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 204; and (15) a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 205;
An antibody having a light chain variable region selected from the group consisting of:
さらに別の観点においては、本発明は、以下の(1)〜(15)からなる群より選択される軽鎖可変領域:
(1) 配列番号191に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(2) 配列番号192に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(3) 配列番号193に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(4) 配列番号194に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(5) 配列番号195に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(6) 配列番号196に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(7) 配列番号197に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(8) 配列番号198に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(9) 配列番号199に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(10) 配列番号200に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(11) 配列番号201に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(12) 配列番号202に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(13) 配列番号203に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(14) 配列番号204に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;および
(15) 配列番号205に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
および、以下の(1)〜(7)からなる群より選択される重鎖可変領域:
(1) 配列番号84に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;
(2) 配列番号85に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;
(3) 配列番号86に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;
(4) 配列番号87に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;
(5) 配列番号88に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;
(6) 配列番号89に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;および
(7) 配列番号90に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;
を有する抗体を提供する。
In still another aspect, the present invention provides a light chain variable region selected from the group consisting of the following (1) to (15):
(1) a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 191;
(2) a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 192;
(3) a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 193;
(4) a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 194;
(5) a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 195;
(6) a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 196;
(7) a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 197;
(8) a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 198;
(9) a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 199;
(10) a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 200;
(11) a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 201;
(12) a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 202;
(13) a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 203;
(14) a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 204; and (15) a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 205;
And a heavy chain variable region selected from the group consisting of the following (1) to (7):
(1) a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 84;
(2) a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 85;
(3) a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 86;
(4) a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 87;
(5) a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 88;
(6) a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 89; and (7) a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 90;
An antibody is provided.
本発明の好ましい抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域、ならびにこれらのCDR1,2および3のアミノ酸配列と、配列番号との対応を以下の一覧表に示す。
The correspondence between the heavy chain variable region and light chain variable region of the preferred antibodies of the present invention and the amino acid sequences of these
また、上述のいずれかに記載の抗体のアミノ酸配列において1または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入され、かつその抗体と同等の活性を有する抗体も本発明の範囲内である。好ましくは、本発明の抗体はヒト化抗体である。すなわち、別の観点においては、本発明はグリピカン3に結合するヒト化抗体を提供する。
In addition, an antibody in which one or more amino acids are substituted, deleted, added and / or inserted in the amino acid sequence of any of the above-described antibodies and has an activity equivalent to that of the antibody is also within the scope of the present invention. . Preferably, the antibody of the present invention is a humanized antibody. That is, in another aspect, the present invention provides a humanized antibody that binds to
さらに別の観点においては、本発明は、グリピカン3のアミノ酸残基524〜563の配列を有するペプチドに結合する抗体を提供する。好ましくは、本発明の抗体は、グリピカン3のアミノ酸残基537〜563の配列を有するペプチドに結合する。また好ましくは、本発明の抗体は、グリピカン3のアミノ酸残基550〜563の配列からなるペプチドに結合しないことを特徴とする。好ましくは、本発明の抗体は、グリピカン3のアミノ酸残基544〜553の配列を有するペプチドに結合し、また好ましくは、グリピカン3のアミノ酸残基546〜551の配列を有するペプチドに結合する。
In yet another aspect, the present invention provides an antibody that binds to a peptide having the sequence of amino acid residues 524-563 of
また別の観点においては、本発明は、それぞれ配列番号123,124および125に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する重鎖可変領域,およびそれぞれ配列番号143,144および158に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体が結合しうるエピトープに結合することができる抗体、すなわち、抗原との結合において競合する抗体を提供する。
In another aspect, the invention provides heavy chain variable
さらに別の観点においては、本発明は、グリピカン3に結合し、かつグリピカン3を発現する細胞に対して高いCDC活性を有する抗体、ならびに、グリピカン3に結合し、かつグリピカン3を発現する細胞に対して高いADCC活性を有する抗体を提供する。
In still another aspect, the present invention relates to an antibody that binds to glypican 3 and has high CDC activity against cells that express
さらに別の観点においては、本発明は、上述の本発明のいずれかの抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは、配列番号11−21、33−43、55−59、65−70、77−83のいずれかに記載の塩基配列を有する。 In yet another aspect, the present invention provides a polynucleotide encoding the heavy chain variable region or light chain variable region of any of the antibodies of the present invention described above. The polynucleotide of the present invention preferably has the nucleotide sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 11-21, 33-43, 55-59, 65-70, 77-83.
別の観点においては、本発明は、上述の本発明の抗体を有効成分とする細胞増殖抑制剤および抗癌剤を提供する。好ましくは、本発明の抗癌剤は、肝細胞癌を治療するために用いられる。 In another aspect, the present invention provides a cell growth inhibitor and an anticancer agent comprising the above-described antibody of the present invention as an active ingredient. Preferably, the anticancer agent of the present invention is used for treating hepatocellular carcinoma.
さらに別の観点においては、グリピカン3のアミノ酸残基524〜563のアミノ酸配列からなるペプチド、グリピカン3のアミノ酸残基537〜563のアミノ酸配列からなるペプチド、グリピカン3のアミノ酸残基544〜553のアミノ酸配列からなるペプチド、又はグリピカン3のアミノ酸残基546〜551のアミノ酸配列からなるペプチドを提供する。
In yet another aspect, a peptide comprising the amino acid sequence of amino acid residues 524 to 563 of
抗体
本発明は、下記の(I)〜(XI)に記載の抗体を提供する。
(I) 以下の(1)〜(12)のいずれかの配列番号に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する重鎖可変領域を含む抗体:
(1) 配列番号123、124、125(GC33)
(2) 配列番号109、110、111(M11F1)
(3) 配列番号106、107、108(M3B8)
(4) 配列番号132、133、134(GC199)
(5) 配列番号106、135、136(GC202)
(6) 配列番号126、127、128(GC179)
(7) 配列番号129、130、131(GC194)
(8) 配列番号103、104、105(M13B3)
(9) 配列番号118、121、122(L9G11)
(10) 配列番号115、116、117(M6B1)
(11) 配列番号112、113、114(M5B9)
(12) 配列番号118、119、120(M10D2)。
Antibodies The present invention provides the antibodies described in (I) to (XI) below.
(I) An antibody comprising a heavy chain variable
(1) SEQ ID NOs: 123, 124, 125 (GC33)
(2) SEQ ID NOs: 109, 110, 111 (M11F1)
(3) SEQ ID NO: 106, 107, 108 (M3B8)
(4) SEQ ID NOs: 132, 133, 134 (GC199)
(5) SEQ ID NO: 106, 135, 136 (GC202)
(6) SEQ ID NOs: 126, 127, 128 (GC179)
(7) SEQ ID NOS: 129, 130, 131 (GC194)
(8) SEQ ID NO: 103, 104, 105 (M13B3)
(9) SEQ ID NO: 118, 121, 122 (L9G11)
(10) SEQ ID NOs: 115, 116, 117 (M6B1)
(11) SEQ ID NO: 112, 113, 114 (M5B9)
(12) SEQ ID NOs: 118, 119, 120 (M10D2).
上記(1)〜(12)の抗体の中で好ましいものは(1)〜(8)の抗体であり、さらに好ましいものは(1)〜(5)の抗体であり、特に好ましい抗体は(1)の抗体である。上記(1)〜(8)の抗体はグリピカン3のC末端側ペプチド(グリピカン3の374番目のアミノ酸から580番目のアミノ酸までのペプチド)を認識し、治療用抗体として有用である。また、上記(9)〜(12)の抗体はグリピカン3のN末端側ペプチド(グリピカン3の1番目のアミノ酸から373番目のアミノ酸までのペプチド)を認識し、診断用抗体として有用である。 Among the antibodies (1) to (12) above, preferred are the antibodies (1) to (8), more preferred are the antibodies (1) to (5), and particularly preferred antibodies are (1 ) Antibody. The antibodies (1) to (8) above recognize the C-terminal peptide of glypican 3 (peptides from the 374th amino acid to the 580th amino acid of glypican 3) and are useful as therapeutic antibodies. The antibodies (9) to (12) recognize the N-terminal peptide of glypican 3 (peptides from the first amino acid to the 373rd amino acid of glypican 3) and are useful as diagnostic antibodies.
(II) 以下の(1)〜(13)のいずれかの配列番号に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する軽鎖可変領域を含む抗体:
(1) 配列番号143、144、158(GC33)
(2) 配列番号143、144、145(M11F1)
(3) 配列番号140、141、142(M3B8)
(4) 配列番号167、168、169(GC199)
(5) 配列番号170、144、171(GC202)
(6) 配列番号159、160、161(GC179)
(7) 配列番号162、147、163(GC194(1))
(8) 配列番号164、165、166(GC194(2))
(9) 配列番号137、138、139(M13B3)
(10) 配列番号155、156、157(L9G11)
(11) 配列番号149、150、151(M6B1)
(12) 配列番号146、147、148(M5B9)
(13) 配列番号152、153、154(M10D2)。
(II) An antibody comprising a light chain variable
(1) SEQ ID NOs: 143, 144, 158 (GC33)
(2) SEQ ID NOs: 143, 144, 145 (M11F1)
(3) SEQ ID NO: 140, 141, 142 (M3B8)
(4) SEQ ID NOs: 167, 168, 169 (GC199)
(5) SEQ ID NOs: 170, 144, 171 (GC202)
(6) SEQ ID NOs: 159, 160, 161 (GC179)
(7) SEQ ID NO: 162, 147, 163 (GC194 (1))
(8) SEQ ID NOs: 164, 165, 166 (GC194 (2))
(9) SEQ ID NOs: 137, 138, 139 (M13B3)
(10) SEQ ID NOs: 155, 156, 157 (L9G11)
(11) SEQ ID NOs: 149, 150, 151 (M6B1)
(12) SEQ ID NOs: 146, 147, 148 (M5B9)
(13) SEQ ID NOs: 152, 153, 154 (M10D2).
上記(1)〜(13)の抗体の中で好ましいものは(1)〜(8)の抗体であり、さらに好ましいものは(1)〜(5)の抗体であり、特に好ましい抗体は(1)の抗体である。上記(1)〜(8)の抗体はグリピカン3のC末端側ペプチド(グリピカン3の374番目のアミノ酸から580番目のアミノ酸までのペプチド)を認識し、治療用抗体として有用である。また、上記(9)〜(13)の抗体はグリピカン3のN末端側ペプチド(グリピカン3の1番目のアミノ酸から373番目のアミノ酸までのペプチド)を認識し、診断用抗体として有用である。 Among the antibodies (1) to (13) above, preferred are the antibodies (1) to (8), more preferred are the antibodies (1) to (5), and particularly preferred antibodies are (1 ) Antibody. The antibodies (1) to (8) above recognize the C-terminal peptide of glypican 3 (peptides from the 374th amino acid to the 580th amino acid of glypican 3) and are useful as therapeutic antibodies. The antibodies (9) to (13) above recognize the N-terminal peptide of glypican 3 (peptides from the first amino acid to the 373rd amino acid of glypican 3) and are useful as diagnostic antibodies.
(III) 以下の(1)〜(13)の抗体:
(1) 配列番号123、124、125に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する重鎖可変領域、および配列番号143、144、158に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する軽鎖可変領域を含む抗体(GC33)
(2) 配列番号109、110、111に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する重鎖可変領域、および配列番号143、144、145に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する軽鎖可変領域を含む抗体(M11F1)
(3) 配列番号106、107、108に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する重鎖可変領域、および配列番号140、141、142に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する軽鎖可変領域を含む抗体(M3B8)
(4) 配列番号132、133、134に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する重鎖可変領域、および配列番号167、168、169に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する軽鎖可変領域を含む抗体(GC199)
(5) 配列番号106、135、136に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する重鎖可変領域、および配列番号170、144、171に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する軽鎖可変領域を含む抗体(GC202)
(6) 配列番号126、127、128に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する重鎖可変領域、および配列番号159、160、161に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する軽鎖可変領域を含む抗体(GC179)
(7) 配列番号129、130、131に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する重鎖可変領域、および配列番号162、147、163に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する軽鎖可変領域を含む抗体(GC194(1))
(8) 配列番号129、130、131に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する重鎖可変領域、および配列番号164、165、166に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する軽鎖可変領域を含む抗体(GC194(2))
(9) 配列番号103、104、105に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する重鎖可変領域、および配列番号137、138、139に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する軽鎖可変領域を含む抗体(M13B3)
(10) 配列番号118、121、122に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する重鎖可変領域、および配列番号155、156、157に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する軽鎖可変領域を含む抗体(L9G11)
(11) 配列番号115、116、117に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する重鎖可変領域、および配列番号149、150、151に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する軽鎖可変領域を含む抗体(M6B1)
(12) 配列番号112、113、114に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する重鎖可変領域、および配列番号146、147、148に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する軽鎖可変領域を含む抗体(M5B9)
(13) 配列番号118、119、120に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する重鎖可変領域、および配列番号152、153、154に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する軽鎖可変領域を含む抗体(M10D2)からなる群より選択される抗体。
(III) The following antibodies (1) to (13):
(1) A heavy chain variable region having CDR1, 2, 3 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 123, 124, 125, and CDR1, 2, 3 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 143, 144, 158 Antibody comprising a light chain variable region having (GC33)
(2) a heavy chain variable region having CDR1, 2, 3 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 109, 110, 111, and CDR1, 2, 3 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 143, 144, 145 Antibody (M11F1) comprising light chain variable region having
(3) a heavy chain variable region having CDR1, 2, 3 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 106, 107, 108, and CDR1, 2, 3 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 140, 141, 142 Antibody comprising light chain variable region having (M3B8)
(4) a heavy chain variable region having CDR1, 2, 3 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 132, 133, 134, and CDR1, 2, 3 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 167, 168, 169 Antibody comprising a light chain variable region having (GC199)
(5) a heavy chain variable region having CDR1, 2, 3 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 106, 135, 136, and CDR1, 2, 3 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 170, 144, 171 Antibody (GC202) comprising light chain variable region having
(6) a heavy chain variable region having CDR1, 2, 3 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 126, 127, 128, and CDR1, 2, 3 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 159, 160, 161 Antibody (GC179) comprising light chain variable region having
(7) a heavy chain variable region having CDR1, 2, 3 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 129, 130, 131, and CDR1, 2, 3 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 162, 147, 163, Antibody comprising a light chain variable region having (GC194 (1))
(8) a heavy chain variable region having CDR1, 2, 3 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 129, 130, 131, and CDR1, 2, 3 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 164, 165, 166 Antibody comprising a light chain variable region having (GC194 (2))
(9) a heavy chain variable region having CDR1, 2, 3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 103, 104, 105, and CDR1, 2, 3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 137, 138, 139 Antibody comprising light chain variable region having (M13B3)
(10) a heavy chain variable region having CDR1, 2, 3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 118, 121, 122, and CDR1, 2, 3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 155, 156, 157, Antibody comprising light chain variable region having (L9G11)
(11) a heavy chain variable region having CDR1, 2, 3 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 115, 116, 117, and CDR1, 2, 3 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 149, 150, 151 Antibody comprising a light chain variable region having (M6B1)
(12) a heavy chain variable region having CDR1, 2, 3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 112, 113, 114, and CDR1, 2, 3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 146, 147, 148 Antibody comprising a light chain variable region having (M5B9)
(13) a heavy chain variable region having CDR1, 2, 3 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 118, 119, 120, and CDR1, 2, 3 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 152, 153, 154 An antibody selected from the group consisting of an antibody (M10D2) comprising a light chain variable region.
上記(1)〜(13)の抗体の中で好ましいものは(1)〜(8)の抗体であり、さらに好ましいものは(1)〜(5)の抗体であり、特に好ましい抗体は(1)の抗体である。上記(1)〜(8)の抗体はグリピカン3のC末端側ペプチド(グリピカン3の374番目のアミノ酸から580番目のアミノ酸までのペプチド)を認識し、治療用抗体として有用である。また、上記(9)〜(13)の抗体はグリピカン3のN末端側ペプチド(グリピカン3の1番目のアミノ酸から373番目のアミノ酸までのペプチド)を認識し、診断用抗体として有用である。 Among the antibodies (1) to (13) above, preferred are the antibodies (1) to (8), more preferred are the antibodies (1) to (5), and particularly preferred antibodies are (1 ) Antibody. The antibodies (1) to (8) above recognize the C-terminal peptide of glypican 3 (peptides from the 374th amino acid to the 580th amino acid of glypican 3) and are useful as therapeutic antibodies. The antibodies (9) to (13) above recognize the N-terminal peptide of glypican 3 (peptides from the first amino acid to the 373rd amino acid of glypican 3) and are useful as diagnostic antibodies.
(IV) 以下の(1)〜(7)のいずれかに記載の重鎖可変領域:
(1) 配列番号84に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(GC33 VH ver.a);
(2) 配列番号85に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(GC33 VH ver.c);
(3) 配列番号86に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(GC33 VH ver.f);
(4) 配列番号87に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(GC33 VH ver.h);
(5) 配列番号88に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(GC33 VH ver.i);
(6) 配列番号89に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(GC33 VH ver.j);
(7) 配列番号90に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(GC33 VH ver.k);
を有する抗体。
(IV) The heavy chain variable region according to any one of (1) to (7) below:
(1) a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 84 (GC33 VH ver.a);
(2) a heavy chain variable region (GC33 VH ver.c) comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 85;
(3) a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 86 (GC33 VH ver.f);
(4) heavy chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 87 (GC33 VH ver.h);
(5) heavy chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 88 (GC33 VH ver.i);
(6) a heavy chain variable region (GC33 VH ver.j) comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 89;
(7) heavy chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 90 (GC33 VH ver.k);
An antibody having
上記(1)〜(7)の抗体の中で特に好ましい抗体は(2)〜(7)の抗体である。 Among the antibodies (1) to (7), particularly preferred antibodies are the antibodies (2) to (7).
(V) 配列番号92に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(GC33 VL ver.a)を有する抗体。 (V) An antibody having a light chain variable region (GC33 VL ver.a) comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 92.
(VI) 以下の(1)〜(7)の抗体:
(1) 配列番号84に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(GC33 VH ver.a)および配列番号92に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(GC33 VL ver.a)を有する抗体;
(2) 配列番号85に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(GC33 VH ver.c)および配列番号92に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(GC33 VL ver.a)を有する抗体;
(3) 配列番号86に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(GC33 VH ver.f)および配列番号92に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(GC33 VL ver.a)を有する抗体;
(4) 配列番号87に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(GC33 VH ver.h)および配列番号92に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(GC33 VL ver.a)を有する抗体;
(5) 配列番号88に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(GC33 VH ver.i)および配列番号92に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(GC33 VL ver.a)を有する抗体;
(6) 配列番号89に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(GC33 VH ver.j)および配列番号92に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(GC33 VL ver.a)を含む抗体;
(7) 配列番号90に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(GC33 VH ver.k)および配列番号92に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(GC33 VL ver.a)を含む抗体;
からなる群より選択される抗体。
(VI) The following antibodies (1) to (7):
(1) an antibody having a heavy chain variable region containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 84 (GC33 VH ver.a) and a light chain variable region containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 92 (GC33 VL ver.a);
(2) an antibody having a heavy chain variable region (GC33 VH ver.c) containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 85 and a light chain variable region (GC33 VL ver. A) containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 92;
(3) an antibody having a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 86 (GC33 VH ver.f) and a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 92 (GC33 VL ver. A);
(4) an antibody having a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 87 (GC33 VH ver. H) and a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 92 (GC33 VL ver. A);
(5) an antibody having a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 88 (GC33 VH ver.i) and a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 92 (GC33 VL ver.a);
(6) an antibody comprising a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 89 (GC33 VH ver. J) and a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 92 (GC33 VL ver. A);
(7) an antibody comprising a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 90 (GC33 VH ver.k) and a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 92 (GC33 VL ver.a);
An antibody selected from the group consisting of:
上記(1)〜(7)の抗体の中で特に好ましい抗体は(2)〜(7)の抗体である。
(VII) 以下の(1)〜(15)のいずれかの抗体:
(1) 配列番号174、144、158に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(2) 配列番号175、144、158に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(3) 配列番号176、144、158に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(4) 配列番号177、144、158に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(5) 配列番号178、144、158に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(6) 配列番号179、144、158に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(7) 配列番号180、144、158に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(8) 配列番号181、144、158に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(9) 配列番号182、144、158に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(10) 配列番号183、144、158に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(11) 配列番号184、144、158に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(12) 配列番号185、144、158に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(13) 配列番号186、144、158に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(14) 配列番号187、144、158に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(15) 配列番号188、144、158に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する軽鎖可変領域を含む抗体。
Among the antibodies (1) to (7), particularly preferred antibodies are the antibodies (2) to (7).
(VII) Any of the following antibodies (1) to (15):
(1) an antibody comprising a light chain variable
(2) an antibody comprising a light chain variable region having CDR1, 2, 3 consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 175, 144, 158;
(3) an antibody comprising a light chain variable
(4) an antibody comprising a light chain variable
(5) an antibody comprising a light chain variable
(6) an antibody comprising a light chain variable region having CDR1, 2, 3 consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 179, 144, 158;
(7) an antibody comprising a light chain variable
(8) an antibody comprising a light chain variable
(9) an antibody comprising a light chain variable
(10) an antibody comprising a light chain variable
(11) an antibody comprising a light chain variable
(12) an antibody comprising a light chain variable
(13) an antibody comprising a light chain variable
(14) an antibody comprising a light chain variable
(15) An antibody comprising a light chain variable
上記(1)〜(15)の抗体の中で好ましい抗体は(15)の抗体である。
(VIII) 以下の(1)〜(15)いずれかの抗体:
(1) 配列番号123、124、125に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する重鎖可変領域、および配列番号174、144、158に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(2) 配列番号123、124、125に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する重鎖可変領域、および配列番号175、144、158に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(3) 配列番号123、124、125に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する重鎖可変領域、および配列番号176、144、158に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(4) 配列番号123、124、125に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する重鎖可変領域、および配列番号177、144、158に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(5) 配列番号123、124、125に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する重鎖可変領域、および配列番号178、144、158に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(6) 配列番号123、124、125に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する重鎖可変領域、および配列番号179、144、158に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(7) 配列番号123、124、125に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する重鎖可変領域、および配列番号180、144、158に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(8) 配列番号123、124、125に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する重鎖可変領域、および配列番号181、144、158に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(9) 配列番号123、124、125に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する重鎖可変領域、および配列番号182、144、158に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(10) 配列番号123、124、125に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する重鎖可変領域、および配列番号183、144、158に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(11) 配列番号123、124、125に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する重鎖可変領域、および配列番号184、144、158に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(12) 配列番号123、124、125に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する重鎖可変領域、および配列番号185、144、158に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(13) 配列番号123、124、125に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する重鎖可変領域、および配列番号186、144、158に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(14) 配列番号123、124、125に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する重鎖可変領域、および配列番号187、144、158に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(15) 配列番号123、124、125に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する重鎖可変領域、および配列番号188、144、158に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する軽鎖可変領域を含む抗体。
Among the antibodies (1) to (15), a preferred antibody is the antibody (15).
(VIII) Any of the following antibodies (1) to (15):
(1) A heavy chain variable region having CDR1, 2, 3 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 123, 124, 125, and CDR1, 2, 3 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 174, 144, 158 An antibody comprising a light chain variable region having;
(2) a heavy chain variable region having CDR1, 2, 3 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 123, 124, 125, and CDR1, 2, 3 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 175, 144, 158 An antibody comprising a light chain variable region having;
(3) a heavy chain variable region having CDR1, 2, 3 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 123, 124, 125, and CDR1, 2, 3 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 176, 144, 158 An antibody comprising a light chain variable region having;
(4) a heavy chain variable region having CDR1, 2, 3 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 123, 124, 125, and CDR1, 2, 3 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 177, 144, 158 An antibody comprising a light chain variable region having;
(5) a heavy chain variable region having CDR1, 2, 3 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 123, 124, 125, and CDR1, 2, 3 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 178, 144, 158, An antibody comprising a light chain variable region having;
(6) a heavy chain variable region having CDR1, 2, 3 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 123, 124, 125, and CDR1, 2, 3 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 179, 144, 158, An antibody comprising a light chain variable region having;
(7) a heavy chain variable region having CDR1, 2, 3 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 123, 124, 125, and CDR1, 2, 3 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 180, 144, 158, An antibody comprising a light chain variable region having;
(8) a heavy chain variable region having CDR1, 2, 3 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 123, 124, 125, and CDR1, 2, 3 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 181, 144, 158 An antibody comprising a light chain variable region having;
(9) a heavy chain variable region having CDR1, 2, 3 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 123, 124, 125, and CDR1, 2, 3 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOS: 182, 144, 158 An antibody comprising a light chain variable region having;
(10) a heavy chain variable region having CDR1, 2, 3 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 123, 124, 125, and CDR1, 2, 3 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 183, 144, 158 An antibody comprising a light chain variable region having;
(11) a heavy chain variable region having CDR1, 2, 3 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 123, 124, 125, and CDR1, 2, 3 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 184, 144, 158, An antibody comprising a light chain variable region having;
(12) a heavy chain variable region having CDR1, 2, 3 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 123, 124, 125, and CDR1, 2, 3 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 185, 144, 158 An antibody comprising a light chain variable region having;
(13) a heavy chain variable region having CDR1, 2, 3 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOS: 123, 124, 125, and CDR1, 2, 3 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOS: 186, 144, 158 An antibody comprising a light chain variable region having;
(14) a heavy chain variable region having CDR1, 2, 3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 123, 124, 125, and CDR1, 2, 3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 187, 144, 158, An antibody comprising a light chain variable region having;
(15) a heavy chain variable region having CDR1, 2, 3 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOS: 123, 124, 125, and CDR1, 2, 3 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOS: 188, 144, 158, An antibody comprising a light chain variable region.
上記(1)〜(15)の抗体の中で好ましい抗体は(15)の抗体である。
(IX) 以下の(1)〜(15)のいずれかに記載の抗体:
(1)配列番号191に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する抗体;
(2)配列番号192に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する抗体;
(3)配列番号193に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する抗体;
(4)配列番号194に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する抗体;
(5)配列番号195に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する抗体;
(6)配列番号196に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する抗体;
(7)配列番号197に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する抗体;
(8)配列番号198に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する抗体;
(9)配列番号199に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する抗体;
(10)配列番号200に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する抗体;
(11)配列番号201に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する抗体;
(12)配列番号202に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する抗体;
(13)配列番号203に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する抗体;
(14)配列番号204に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する抗体;
(15)配列番号205に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する抗体。
Among the antibodies (1) to (15), a preferred antibody is the antibody (15).
(IX) The antibody according to any one of (1) to (15) below:
(1) an antibody having a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 191;
(2) an antibody having a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 192;
(3) an antibody having a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 193;
(4) an antibody having a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 194;
(5) an antibody having a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 195;
(6) an antibody having a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 196;
(7) an antibody having a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 197;
(8) an antibody having a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 198;
(9) an antibody having a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 199;
(10) an antibody having a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 200;
(11) an antibody having a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 201;
(12) an antibody having a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 202;
(13) an antibody having a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 203;
(14) an antibody having a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 204;
(15) An antibody having a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 205.
上記(1)〜(15)の抗体の中で好ましい抗体は(15)の抗体である。
(X) 以下の(1)〜(15)からなる群より選択される軽鎖可変領域:
(1)配列番号191に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(2)配列番号192に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(3)配列番号193に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(4)配列番号194に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(5)配列番号195に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(6)配列番号196に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(7)配列番号197に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(8)配列番号198に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(9)配列番号199に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(10)配列番号200に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(11)配列番号201に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(12)配列番号202に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(13)配列番号203に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(14)配列番号204に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(15)配列番号205に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
および、以下の(1)〜(7)からなる群より選択される重鎖可変領域:
(1) 配列番号84に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;
(2) 配列番号85に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;
(3) 配列番号86に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;
(4) 配列番号87に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;
(5) 配列番号88に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;
(6) 配列番号89に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;
(7) 配列番号90に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;
を有する抗体。
Among the antibodies (1) to (15), a preferred antibody is the antibody (15).
(X) A light chain variable region selected from the group consisting of the following (1) to (15):
(1) a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 191;
(2) a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 192;
(3) a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 193;
(4) a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 194;
(5) a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 195;
(6) a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 196;
(7) a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 197;
(8) a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 198;
(9) a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 199;
(10) a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 200;
(11) a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 201;
(12) a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 202;
(13) a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 203;
(14) a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 204;
(15) a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 205;
And a heavy chain variable region selected from the group consisting of the following (1) to (7):
(1) a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 84;
(2) a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 85;
(3) a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 86;
(4) a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 87;
(5) a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 88;
(6) a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 89;
(7) a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 90;
An antibody having
上記の抗体の中で好ましい抗体は、配列番号205に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域および配列番号90に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を有する抗体である。 A preferable antibody among the above-mentioned antibodies is an antibody having a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 205 and a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 90.
(XI) 上記の(I)〜(X)のいずれかに記載のアミノ酸配列において1または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入され、かつ(I)〜(X)のいずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体。 (XI) One or more amino acids are substituted, deleted, added and / or inserted in the amino acid sequence of any one of (I) to (X) above, and any one of (I) to (X) An antibody having the same activity as the antibody described in 1.
本発明において、(I)〜(X)のいずれかに記載の抗体と同等の活性とは、ヒトグリピカン3抗体への結合活性、またはヒトグリピカン3を発現する細胞(例えば、HepG2またはヒトグリピカン3発現組換えCHO細胞、など)への細胞傷害活性が同等であることをいう。
In the present invention, the activity equivalent to that of the antibody described in any one of (I) to (X) is a binding activity to
ヒト化抗体
本発明における抗体の好ましい態様の一つとして、グリピカン3に結合するヒト化抗体を挙げることができる。ヒト化抗体は既知の方法を用いて製造することができる。
Humanized antibody One preferred embodiment of the antibody in the present invention is a humanized antibody that binds to
ヒト化抗体は、再構成(reshaped)ヒト抗体とも称され、これは、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス抗体の相補性決定領域(CDR; complementarity determining region)をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている(欧州特許出願公開番号EP 125023号公報、WO 96/02576 号公報参照)。 A humanized antibody is also referred to as a reshaped human antibody, which transplants the complementarity determining region (CDR) of a non-human mammal such as a mouse antibody into the complementarity determining region of a human antibody. A general genetic recombination technique is also known (see European Patent Application Publication No. EP 125023, WO 96/02576).
具体的には、例えばCDRがマウス抗体由来である場合には、マウス抗体のCDRとヒト抗体のフレームワーク領域(framework region;FR)とを連結するように設計したDNA配列を、CDRおよびFR両方の末端領域にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてPCR法により合成する(WO98/13388号公報に記載の方法を参照)。 Specifically, for example, when the CDR is derived from a mouse antibody, a DNA sequence designed so as to link the CDR of the mouse antibody and the framework region (FR) of the human antibody, The oligonucleotide is synthesized by PCR using several oligonucleotides prepared so as to have a portion overlapping with the terminal region (see the method described in WO98 / 13388).
CDRと連結されるヒト抗体のフレームワーク領域は、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように、抗体の可変領域におけるフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい(Sato, K.etal., CancerRes.(1993)53, 851-856)。 As the framework region of the human antibody to be linked to the CDR, a region in which the complementarity determining region forms a favorable antigen binding site is selected. If necessary, the amino acid of the framework region in the variable region of the antibody may be substituted so that the complementarity determining region of the reshaped human antibody forms an appropriate antigen binding site (Sato, K. etal., CancerRes (1993) 53, 851-856).
キメラ抗体およびヒト化抗体のC領域には、ヒト抗体のものが使用され、例えばH鎖では、Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4を、L鎖ではCκ、Cλを使用することができる。また、抗体またはその産生の安定性を改善するために、ヒト抗体C領域を修飾してもよい。ヒト化の際に用いられるヒト抗体は、IgG、IgM、IgA、IgE、IgDなど如何なるアイソタイプのヒト抗体でもよいが、本発明においてはIgGを用いることが好ましく、さらにIgG1又はIgG3が好ましく、特にIgG1が好ましい。IgG1は高い細胞傷害活性を有している点で抗体を抗癌剤として利用する場合に有効である(Chemical immunology, 65:88 (1997))。 For the C region of the chimeric antibody and humanized antibody, human antibodies are used. For example, Cγ1, Cγ2, Cγ3, Cγ4 can be used for the H chain, and Cκ, Cλ can be used for the L chain. In addition, the human antibody C region may be modified in order to improve the stability of the antibody or its production. Human antibodies used for humanization may be human antibodies of any isotype such as IgG, IgM, IgA, IgE, IgD, but in the present invention, IgG is preferably used, IgG1 or IgG3 is more preferable, and IgG1 is particularly preferable. Is preferred. IgG1 is effective when an antibody is used as an anticancer agent because it has high cytotoxic activity (Chemical immunology, 65:88 (1997)).
なお、ヒト化抗体を作製した後に、可変領域(例えば、FR)や定常領域中のアミノ酸を他のアミノ酸で置換等してもよい。 In addition, after producing a humanized antibody, amino acids in the variable region (eg, FR) or constant region may be substituted with other amino acids.
ヒト化抗体におけるCDRの由来は特に限定されず、どのような動物由来でもよい。例えば、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ラクダ抗体などの配列を用いることが可能であるが、好ましくはマウス抗体のCDR配列である。 The origin of CDR in the humanized antibody is not particularly limited and may be derived from any animal. For example, sequences of mouse antibody, rat antibody, rabbit antibody, camel antibody and the like can be used, but the CDR sequence of mouse antibody is preferable.
抗体のヒト化において、通常、由来となった抗体のアゴニスト活性を維持したままヒト化を行うことは困難であるが、本発明においては、由来となったマウス抗体と同等のアゴニスト活性を有するヒト化抗体の取得に成功した。ヒト化抗体はヒト体内における抗原性が低下しているため、治療目的などでヒトに投与する場合に有用である。 In humanization of antibodies, it is usually difficult to perform humanization while maintaining the agonist activity of the derived antibody. However, in the present invention, a human having an agonist activity equivalent to that of the derived mouse antibody. We succeeded in obtaining conjugated antibodies. Since humanized antibodies have reduced antigenicity in the human body, they are useful when administered to humans for therapeutic purposes.
本発明においてヒト化抗グリピカン3抗体の好ましい例としては、例えば、配列番号84(GC33 VH ver.a)、配列番号85(GC33 VH ver.c)、配列番号86(GC33 VH ver.f)、配列番号87(GC33 VH ver.h)、配列番号88(GC33 VH ver.i)、配列番号89(GC33 VH ver.j)または配列番号90(GC33 VH ver.k)に記載の重鎖可変領域を有する抗体、または配列番号92(GC33 VL ver.a)に記載の軽鎖可変領域を有する抗体を挙げることができる。特に好ましい例としては、配列番号84(GC33 VH ver.a)、配列番号85(GC33 VH ver.c)、配列番号86(GC33 VH ver.f)、配列番号87(GC33 VH ver.h)、配列番号88(GC33 VH ver.i)、配列番号89(GC33 VH ver.j)または配列番号90(GC33 VH ver.k)に記載の重鎖可変領域と、配列番号92(GC33 VL ver.a)に記載の軽鎖可変領域とを有する抗体を挙げることができる。 Preferred examples of the humanized anti-glypican 3 antibody in the present invention include, for example, SEQ ID NO: 84 (GC33 VH ver.a), SEQ ID NO: 85 (GC33 VH ver.c), SEQ ID NO: 86 (GC33 VH ver.f), The heavy chain variable region described in SEQ ID NO: 87 (GC33 VH ver.h), SEQ ID NO: 88 (GC33 VH ver.i), SEQ ID NO: 89 (GC33 VH ver.j) or SEQ ID NO: 90 (GC33 VH ver.k) Or an antibody having the light chain variable region set forth in SEQ ID NO: 92 (GC33 VL ver.a). Particularly preferred examples include SEQ ID NO: 84 (GC33 VH ver.a), SEQ ID NO: 85 (GC33 VH ver.c), SEQ ID NO: 86 (GC33 VH ver.f), SEQ ID NO: 87 (GC33 VH ver.h), The heavy chain variable region set forth in SEQ ID NO: 88 (GC33 VH ver.i), SEQ ID NO: 89 (GC33 VH ver.j) or SEQ ID NO: 90 (GC33 VH ver.k), and SEQ ID NO: 92 (GC33 VL ver.a) And an antibody having a light chain variable region described in).
さらに、本発明のヒト化抗グリピカン3抗体の好ましい例としては、配列番号90に記載の重鎖可変領域と配列番号205に記載の軽鎖可変領域とを有する抗体を挙げることができる。 Furthermore, preferred examples of the humanized anti-glypican 3 antibody of the present invention include an antibody having a heavy chain variable region set forth in SEQ ID NO: 90 and a light chain variable region set forth in SEQ ID NO: 205.
本発明における抗体の好ましい態様の一つとして、以下の(1)〜(8)のいずれかに記載の抗体:
(1) 配列番号62に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号73に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体(GC33);
(2) 配列番号26に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号48に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体((M11F1);
(3) 配列番号25に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号47に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体((M3B8);
(4) 配列番号60に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号71に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体((GC199);
(5) 配列番号61に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号72に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域(GC202);
(6) 配列番号63に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号74に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域(GC179);
(7) 配列番号64に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号75に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域(GC194(1));
(8) 配列番号64に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号76に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域(GC194(2));
が結合するエピトープに結合する抗体を挙げることができる。さらに好ましくは(1)〜(5)のいずれかに記載の抗体が結合するエピトープに結合する抗体であり、特に好ましくは(1)に記載の抗体が結合するエピトープに結合する抗体である。
As one of preferred embodiments of the antibody in the present invention, the antibody according to any one of the following (1) to (8):
(1) an antibody (GC33) having a heavy chain variable region having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 62 and a light chain variable region having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 73;
(2) an antibody having a heavy chain variable region having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 26 and a light chain variable region having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 48 ((M11F1);
(3) an antibody having a heavy chain variable region having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 25 and a light chain variable region having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 47 ((M3B8);
(4) an antibody having a heavy chain variable region having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 60 and a light chain variable region having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 71 ((GC199);
(5) a heavy chain variable region having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 61 and a light chain variable region having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 72 (GC202);
(6) a heavy chain variable region having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 63 and a light chain variable region having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 74 (GC179);
(7) a heavy chain variable region having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 64 and a light chain variable region having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 75 (GC194 (1));
(8) a heavy chain variable region having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 64 and a light chain variable region having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 76 (GC194 (2));
And antibodies that bind to the epitope to which is bound. More preferred is an antibody that binds to the epitope to which the antibody according to any one of (1) to (5) binds, and particularly preferred is an antibody that binds to the epitope to which the antibody according to (1) binds.
上記いずれかの抗体が結合するエピトープに結合する抗体は、特に高い細胞傷害活性を有する点で有用である。 An antibody that binds to an epitope to which any of the above antibodies binds is useful in that it has a particularly high cytotoxic activity.
上記(1)〜(7)いずれかに記載の抗体はヒトグリピカン3の524番目のアミノ酸から580番目のアミノ酸までの領域に結合し、特に524番目のアミノ酸から563番目のアミノ酸までの領域に結合する。上記(1)〜(5)いずれかに記載の抗体はヒトグリピカン3の537番目のアミノ酸から563番目の領域に結合する。上記(1)に記載の抗体は、544番目のアミノ酸から553番目のアミノ酸の領域に結合し、特に546番目のアミノ酸から551番目の領域に結合する。
The antibody according to any one of the above (1) to (7) binds to a region from human 524th amino acid to 580th amino acid of
上記エピトープを認識する抗体は、高い細胞傷害活性を有するので癌などの疾患の治療用として有用である。特に、546番目のアミノ酸から551番目の領域に結合する抗体は特に細胞傷害活性が高いので有用である。 The antibody recognizing the above epitope is useful for treating diseases such as cancer because it has high cytotoxic activity. In particular, an antibody that binds to the 551st region from the 546th amino acid is particularly useful because of its high cytotoxic activity.
従って、本発明は、ヒトグリピカン3の524番目のアミノ酸から580番目のアミノ酸までの領域、好ましくは524番目のアミノ酸から563番目のアミノ酸までの領域、さらに好ましくは537番目のアミノ酸から563番目のアミノ酸までの領域、さらに好ましくは544番目のアミノ酸から553番目のアミノ酸までの領域、特に好ましくは546番目のアミノ酸から551番目のアミノ酸までの領域をエピトープとして、それらの領域に結合する抗体を含む。
Accordingly, the present invention relates to a region from human 524th amino acid to 580th amino acid of
本発明において好ましい他の態様としては、ヒトグリピカン3の524番目のアミノ酸から563番目のアミノ酸までの領域を認識し、かつ、537番目のアミノ酸から563番目のアミノ酸までの領域を認識しない抗体を挙げることができる。 Another preferred embodiment of the present invention includes an antibody that recognizes the region from human amino acid 524 to amino acid 563 and does not recognize the region from amino acid 537 to amino acid 563. Can do.
さらに、本発明において好ましい他の態様としては、ヒトグリピカン3の537番目のアミノ酸から563番目のアミノ酸までの領域を認識し、かつ、550番目のアミノ酸から563番目のアミノ酸までの領域を認識しない抗体を挙げることができる。
Furthermore, in another preferred embodiment of the present invention, an antibody that recognizes the region from human amino acid 537 to amino acid 563 and does not recognize the region from
抗体が認識するエピトープの解析は当業者に公知の方法により行うことが可能であり、例えば実施例記載のウェスタンブロッティング法などにより行うことが可能である。 Analysis of the epitope recognized by the antibody can be performed by a method known to those skilled in the art, for example, the Western blotting method described in the Examples.
上記の領域をエピトープとして認識する抗体は、当業者に公知の方法により得ることが可能であり、例えば、ヒトグリピカン3のアミノ酸配列を基に目的の領域のアミノ酸配列を含むペプチドを作製し、該ペプチドを免疫原として抗体を作製することにより、または、通常の方法で抗体を作製した後、得られた抗体が認識するエピトープを決定し、目的のエピトープを認識する抗体を選択することにより得ることが可能である。
An antibody that recognizes the above region as an epitope can be obtained by a method known to those skilled in the art. For example, a peptide containing the amino acid sequence of the target region is prepared based on the amino acid sequence of
本発明の抗グリピカン3抗体の好ましい例としては、グリピカン3を発現する細胞に対して高いADCC活性を有する抗体または高いCDC活性を有する抗体を挙げることができる。
Preferable examples of the anti-glypican 3 antibody of the present invention include an antibody having high ADCC activity or an antibody having high CDC activity against
本発明において高いADCC活性または高いCDC活性とは、公知の抗グリピカン3抗体よりも高いADCC活性または高いCDC活性を有することをいう。公知のグリピカン3抗体としては、WO2004/22739に記載されているM3C11またはM1E07を挙げることができる。
In the present invention, high ADCC activity or high CDC activity refers to having higher ADCC activity or higher CDC activity than known anti-glypican 3 antibodies. Examples of known
ADCC活性またはCDC活性の測定方法は、当業者に公知の方法により行うことが可能であり、例えば、クロム遊離試験により行うことが可能である。ADCC活性を測定する際のクロム遊離試験の具体的な条件としては、特に限定されないが、例えば、実施例記載の条件を用いて測定することができる。 The ADCC activity or CDC activity can be measured by a method known to those skilled in the art, for example, by a chromium release test. Although it does not specifically limit as specific conditions of the chromium release test at the time of measuring ADCC activity, For example, it can measure using the conditions of an Example description.
グリピカン3を発現する細胞としては、例えば、HepG2などの肝癌細胞、グリピカン3をコードする遺伝子を組み込まれたCHO細胞などを挙げることができる。ADCC活性を測定する場合にはHepG2細胞を用いることが好ましく、CDC活性を測定する場合にはGPC3発現組換えCHO細胞を用いることが好ましい。GPC3発現組換えCHO細胞は如何なる方法により作製されてもよいが、例えば実施例に記載の方法により作製することが可能である。
Examples of cells that express
抗グリピカン3抗体を抗癌剤として用いる場合には、配列番号62に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号73に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体(GC33)と同程度のADCC活性を有していることが好ましい。抗グリピカン3抗体を抗癌剤として用いる場合には、配列番号62に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号73に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体(GC33)と同程度のCDC活性を有していることが好ましい。 When anti-glypican 3 antibody is used as an anticancer agent, it is the same as the antibody (GC33) having the heavy chain variable region having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 62 and the light chain variable region having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 73. It preferably has a degree of ADCC activity. When anti-glypican 3 antibody is used as an anticancer agent, it is the same as the antibody (GC33) having the heavy chain variable region having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 62 and the light chain variable region having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 73. It preferably has a degree of CDC activity.
さらに本発明はグリピカン3への結合活性が高い抗体を含む。
Further, the present invention includes an antibody having a high binding activity to
本発明において、グリピカン3への結合活性は、当業者に公知の手段を使用して測定することができる。例えば、BIAcoreを用いた表面プラズモン共鳴を利用して測定することが可能である。すなわちセンサーチップ上にグリピカン3タンパク質を固定して抗体と反応させ、測定値から抗体とグリピカン3の相互作用を反応速度定数として算出することができる。また、結合活性の評価には、ELISA(酵素結合免疫吸着検定法)、EIA(酵素免疫測定法)、RIA(放射免疫測定法)あるいは蛍光抗体法を用いることができる。例えば、酵素免疫測定法を用いる場合、被験抗体が結合する抗原をコーティングしたプレートに、被験抗体を含む試料、例えば、被験抗体産生細胞の培養上清や精製抗体を加える。アルカリフォスファターゼ等の酵素で標識した二次抗体を添加し、プレートをインキュベートし、洗浄した後、p-ニトロフェニル燐酸などの酵素基質を加えて吸光度を測定することで抗原結合活性を評価することができる。結合活性の上限は特に限定されないが、例えば、当業者が技術的に作製可能な範囲の上限を設定することができる。しかしながら、技術的に作製可能な範囲は、技術の進歩により拡大されることが理解されるであろう。
In the present invention, the binding activity to
さらに、本発明においては、抗体の安定性を増加させる等の目的で脱アミド化されるアミノ酸若しくは脱アミド化されるアミノ酸に隣接するアミノ酸を他のアミノ酸に置換することにより脱アミド化を抑制してもよい。脱アミド化されるアミノ酸としてはアスパラギン、グルタミンを挙げることができるが、好ましくはアスパラギンである。アスパラギンに隣接するアミノ酸としては、特に限定されずどのようなアミノ酸でもよいが、アスパラギン−グリシン配列は特に脱アミド化されやすいことが知られているので、アスパラギンに隣接するアミノ酸としてはグリシンが好ましい。置換後のアミノ酸としては、アスパラギンおよびグルタミン以外であれば特に限定されず、如何なるアミノ酸でもよいが、好ましくはバリン、プロリン以外のアミノ酸であることが好ましい。従って、本発明においては、抗体の脱アミド化を目的とする場合には、アスパラギン、グルタミン、バリン、プロリン以外のアミノ酸に置換することが好ましい。アミノ酸置換による脱アミド化の抑制については、例えばWO03/057881を参考に行うことが可能である。脱アミド化抑制を目的にアミノ酸置換を行う場合には、置換前の抗原結合活性を維持していることが好ましい。 Furthermore, in the present invention, deamidation is suppressed by substituting an amino acid adjacent to the amino acid deamidated or deamidated with another amino acid for the purpose of increasing the stability of the antibody. May be. Examples of amino acids to be deamidated include asparagine and glutamine, and asparagine is preferred. The amino acid adjacent to asparagine is not particularly limited and may be any amino acid. However, since the asparagine-glycine sequence is known to be particularly easily deamidated, glycine is preferable as the amino acid adjacent to asparagine. The amino acid after substitution is not particularly limited as long as it is other than asparagine and glutamine, and any amino acid may be used, but amino acids other than valine and proline are preferable. Therefore, in the present invention, when deamidation of an antibody is intended, substitution with an amino acid other than asparagine, glutamine, valine or proline is preferred. Suppression of deamidation by amino acid substitution can be performed with reference to, for example, WO03 / 057881. When amino acid substitution is performed for the purpose of suppressing deamidation, it is preferable to maintain the antigen-binding activity before substitution.
さらに、抗体安定化の他の態様として、グルタミン酸の他のアミノ酸への置換を挙げることができる。また、本発明では、抗体重鎖の6番目がグルタミン酸である場合、該グルタミン酸をグルタミンに置換することにより、顕著に抗体を安定化できることを見いだした。したがって、本発明は、抗体重鎖の6番目のグルタミン酸をグルタミンに置換することにより抗体を安定化する方法に関する。抗体中のアミノ酸番号は当業者に公知である(例えば、Kabat, E. A. et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Dept. Health and Human Services 1983)。 Furthermore, as another aspect of antibody stabilization, substitution of glutamic acid with another amino acid can be mentioned. Further, in the present invention, it has been found that when the sixth antibody heavy chain is glutamic acid, the antibody can be remarkably stabilized by replacing the glutamic acid with glutamine. Therefore, the present invention relates to a method for stabilizing an antibody by replacing the sixth glutamic acid in the antibody heavy chain with glutamine. The amino acid number in the antibody is known to those skilled in the art (eg, Kabat, EA et al., “Sequences of Proteins of Immunological Interest”, US Dept. Health and Human Services 1983).
本発明の抗体は、ポリエチレングリコール(PEG)、放射性物質、トキシン等の各種分子と結合したコンジュゲート抗体でもよい。このようなコンジュゲート抗体は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。本発明における抗体にはこれらのコンジュゲート抗体も包含される。 The antibody of the present invention may be a conjugated antibody bound to various molecules such as polyethylene glycol (PEG), radioactive substances, and toxins. Such a conjugated antibody can be obtained by chemically modifying the obtained antibody. Antibody modification methods have already been established in this field. These conjugate antibodies are also included in the antibody of the present invention.
又、本発明に使用する抗体は二種特異性抗体(bispecific antibody)でもよい(例えば、Journal of Immunology, 1994, 152, 5368-5374、など)。二種特異性抗体は一方がグリピカン3を認識し、他方が他の抗原を認識してもよいし、グリピカン3分子上の異なるエピトープを認識してもよい。
The antibody used in the present invention may be a bispecific antibody (for example, Journal of Immunology, 1994, 152, 5368-5374, etc.). One bispecific antibody may recognize
また本発明の抗体は、そのN末端あるいはC末端に他のタンパク質を融合してもよい(Clinical Cancer Research, 2004, 10, 1274-1281)。融合するタンパク質は当業者が適宜選択することができる。 The antibody of the present invention may be fused with another protein at its N-terminus or C-terminus (Clinical Cancer Research, 2004, 10, 1274-1281). Those skilled in the art can appropriately select the protein to be fused.
さらに、本発明の抗体は細胞障害活性が増強された抗体でもよい。細胞障害活性が増強された抗体としては、例えば、フコースが欠損した抗体、糖鎖にバイセクティング(bisecting)N−アセチルグルコサミン(GlcNAc)が付加した抗体、Fc領域のアミノ酸を置換することによりFcγ受容体との結合活性を変化させた抗体などを挙げることができる。これら細胞障害活性が増強された抗体は当業者に公知の方法で作製することができる。 Furthermore, the antibody of the present invention may be an antibody with enhanced cytotoxic activity. Examples of antibodies with enhanced cytotoxic activity include antibodies lacking fucose, antibodies in which bisecting N-acetylglucosamine (GlcNAc) is added to the sugar chain, and Fcγ receptor by substituting amino acids in the Fc region. Examples thereof include antibodies whose binding activity with the body has been changed. These antibodies with enhanced cytotoxic activity can be prepared by methods known to those skilled in the art.
抗体の作成方法
グリピカン3に結合する抗体は当業者に公知の方法により作成することができる。例えば、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、グリピカン3タンパク質またはグリピカン3発現細胞を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって哺乳動物を免疫する。得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞を選択することができる。
Antibody Production Method Antibodies that bind to
具体的には、モノクローナル抗体を作製するには次のようにすればよい。まず、配列番号3および4に示されるグリピカン3遺伝子/アミノ酸配列にしたがってグリピカン3タンパク質を取得し、これを抗体取得の感作抗原として使用する。すなわち、グリピカン3をコードする遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中または培養上清中から目的のヒトグリピカン3タンパク質を公知の方法で精製する。
Specifically, the monoclonal antibody can be produced as follows. First,
次に、この精製グリピカン3タンパク質を感作抗原として用いる。あるいは、グリピカン3の部分ペプチドを感作抗原として使用することもできる。この際、部分ペプチドはヒトグリピカン3のアミノ酸配列にしたがって化学合成により得ることも可能である。
Next, this
本発明の抗グリピカン3抗体の認識するグリピカン3分子上のエピトープは特定のものに限定されず、グリピカン3分子上に存在するエピトープならばどのエピトープを認識してもよい。従って、本発明の抗グリピカン3抗体を作製するための抗原は、グリピカン3分子上に存在するエピトープを含む断片ならば、如何なる断片も用いることが可能である。
The epitope on the
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター、あるいはウサギ、サル等が使用される。 The mammal to be immunized with the sensitizing antigen is not particularly limited, but is preferably selected in consideration of compatibility with the parent cell used for cell fusion. Animals such as mice, rats, hamsters, rabbits, monkeys and the like are used.
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内または皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をPBS(Phosphate-Buffered Saline)や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものに所望により通常のアジュバント、例えばフロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に4-21日毎に数回投与する。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することもできる。 In order to immunize an animal with a sensitizing antigen, a known method is performed. For example, as a general method, a sensitizing antigen is injected into a mammal intraperitoneally or subcutaneously. Specifically, the sensitizing antigen is diluted to an appropriate amount with PBS (Phosphate-Buffered Saline), physiological saline or the like, mixed with an appropriate amount of an ordinary adjuvant, for example, Freund's complete adjuvant, if necessary, and emulsified. Administer to mammals several times every 4-21 days. In addition, an appropriate carrier can be used during immunization with the sensitizing antigen.
このように哺乳動物を免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を採取し、細胞融合に付される。好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。 Thus, after immunizing a mammal and confirming that a desired antibody level rises in serum, immune cells are collected from the mammal and subjected to cell fusion. Preferable immune cells include spleen cells.
前記免疫細胞と融合すべき親細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞を用いる。このミエローマ細胞は、公知の種々の細胞株、例えば、P3(P3x63Ag8.653)(J. Immnol.(1979)123, 1548-1550)、 P3x63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology(1978)81, 1-7)、 NS-1 (Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol.(1976)6, 511-519)、MPC-11(Margulies. D.H. et al., Cell(1976)8, 405-415)、SP2/0 (Shulman, M. et al., Nature(1978)276, 269-270)、FO(deSt. Groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods(1980)35, 1-21)、S194(Trowbridge, I. S. J. Exp. Med.(1978)148, 313-323)、R210(Galfre, G. et al., Nature(1979)277, 131-133)等が好適に使用される。 Mammalian myeloma cells are used as parent cells to be fused with the immune cells. This myeloma cell is a known cell line such as P3 (P3x63Ag8.653) (J. Immnol. (1979) 123, 1548-1550), P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511-519), MPC-11 (Margulies. DH et al., Cell (1976) 8 405-415), SP2 / 0 (Shulman, M. et al., Nature (1978) 276, 269-270), FO (deSt. Groth, SF et al., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21), S194 (Trowbridge, ISJ Exp. Med. (1978) 148, 313-323), R210 (Galfre, G. et al., Nature (1979) 277, 131-133) are preferably used. The
前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、基本的には公知の方法、たとえば、ケーラーとミルステインらの方法(Kohler. G. and Milstein, C.、Methods Enzymol.(1981)73, 3-46)等に準じて行うことができる。 The cell fusion between the immune cells and myeloma cells is basically performed by a known method such as the method of Kohler and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3- 46) etc.
より具体的には、前記細胞融合は、例えば細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール(PEG)、センダイウイルス(HVJ)等が使用され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。 More specifically, the cell fusion is performed in a normal nutrient culture medium in the presence of a cell fusion promoter, for example. As the fusion accelerator, for example, polyethylene glycol (PEG), Sendai virus (HVJ) or the like is used, and an auxiliary agent such as dimethyl sulfoxide can be added and used to increase the fusion efficiency as desired.
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定することができる。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を1-10倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なRPMI1640培養液、MEM培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清(FCS)等の血清補液を併用することもできる。 The use ratio of immune cells and myeloma cells can be arbitrarily set. For example, the number of immune cells is preferably 1 to 10 times that of myeloma cells. As the culture medium used for the cell fusion, for example, RPMI1640 culture medium suitable for growth of the myeloma cell line, MEM culture medium, and other normal culture liquids used for this type of cell culture can be used. Serum supplements such as fetal calf serum (FCS) can be used in combination.
細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め37℃程度に加温したPEG溶液(例えば平均分子量1000-6000程度)を通常30-60%(w/v)の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞(ハイブリドーマ)を形成する。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去する。 In cell fusion, a predetermined amount of the immune cells and myeloma cells are mixed well in the culture medium, and a PEG solution (for example, an average molecular weight of about 1000 to 6000) preliminarily heated to about 37 ° C. is usually 30-60% ( The target fusion cell (hybridoma) is formed by adding at a concentration of w / v) and mixing. Subsequently, cell fusion agents and the like that are undesirable for the growth of the hybridoma are removed by sequentially adding an appropriate culture medium and centrifuging to remove the supernatant.
このようにして得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えばHAT培養液(ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液)で培養することにより選択される。上記HAT培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞(非融合細胞)が死滅するのに十分な時間(通常、数日〜数週間)継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニングを行う。 The hybridoma thus obtained is selected by culturing in a normal selective culture solution, for example, a HAT culture solution (a culture solution containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine). The culture in the HAT culture solution is continued for a sufficient time (usually several days to several weeks) for cells other than the target hybridoma (non-fusion cells) to die. Subsequently, a normal limiting dilution method is performed, and screening and single cloning of a hybridoma that produces the target antibody are performed.
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫してハイブリドーマを得る方法の他に、ヒトリンパ球をin vitroでグリピカン3に感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞と融合させ、グリピカン3への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる(特公平1-59878号公報参照)。さらに別の方法では、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原となるグリピカン3を投与して抗グリピカン3抗体産生細胞を取得し、これを不死化させ、その細胞からグリピカン3に対するヒト抗体を取得することができる(国際特許出願公開番号WO 94/25585 号公報、WO 93/12227 号公報、WO92/03918号公報、WO 94/02602 号公報参照)。
In addition to immunization of non-human animals with antigens to obtain hybridomas, human lymphocytes are sensitized to
このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。 The hybridoma producing the monoclonal antibody thus produced can be subcultured in a normal culture solution, and can be stored for a long time in liquid nitrogen.
当該ハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法にしたがい培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。 In order to obtain a monoclonal antibody from the hybridoma, the hybridoma is cultured according to a usual method and obtained as a culture supernatant thereof, or the hybridoma is administered to a mammal compatible therewith to proliferate, and its ascites The method obtained as follows is adopted. The former method is suitable for obtaining highly pure antibodies, while the latter method is suitable for mass production of antibodies.
抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型の抗体を作製することも可能である(例えば、Vandamme, A. M. et al., Eur. J. Biochem.(1990)192, 767-775, 1990参照)。 An antibody gene can be cloned from a hybridoma, incorporated into an appropriate vector, introduced into a host, and a recombinant antibody produced using genetic recombination technology can be produced (for example, Vandamme, AM et al., Eur. J. Biochem. (1990) 192, 767-775, 1990).
具体的には、抗グリピカン3抗体を産生するハイブリドーマから、抗グリピカン3抗体の可変(V)領域をコードするmRNAを単離する。mRNAの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法(Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry(1979)18, 5294-5299)、AGPC法(Chomczynski, P.et al., Anal. Biochem.(1987)162, 156-159)等により行って全RNAを調製し、mRNA Purification Kit (Pharmacia製)等を使用して目的のmRNAを調製する。また、QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia製)を用いることによりmRNAを直接調製することもできる。 Specifically, mRNA encoding the variable (V) region of anti-glypican 3 antibody is isolated from the hybridoma producing anti-glypican 3 antibody. Isolation of mRNA is performed by a known method such as guanidine ultracentrifugation (Chirgwin, JM et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299), AGPC method (Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159), etc. to prepare total RNA, and the target mRNA is prepared using mRNA Purification Kit (Pharmacia). Alternatively, mRNA can be directly prepared by using QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia).
得られたmRNAから逆転写酵素を用いて抗体V領域のcDNAを合成する。cDNAの合成は、AMVReverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit(生化学工業社製)等を用いて行う。また、cDNAの合成および増幅を行うには、5'-Ampli FINDER RACE Kit(Clontech製)およびPCRを用いた5'-RACE法(Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1988)85, 8998-9002、Belyavsky, A.et al., Nucleic Acids Res.(1989)17, 2919-2932)等を使用することができる。 The cDNA of the antibody V region is synthesized from the obtained mRNA using reverse transcriptase. The synthesis of cDNA is performed using AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (manufactured by Seikagaku Corporation). In order to synthesize and amplify cDNA, 5'-Ampli FINDER RACE Kit (Clontech) and 5'-RACE method using PCR (Frohman, MA et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA) (1988) 85, 8998-9002, Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932) and the like can be used.
得られたPCR産物から目的とするDNA断片を精製し、ベクターDNAと連結する。さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。そして、目的とするDNAの塩基配列を公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法等により確認する。 The target DNA fragment is purified from the obtained PCR product and ligated with vector DNA. Further, a recombinant vector is prepared from this, introduced into Escherichia coli, etc., and colonies are selected to prepare a desired recombinant vector. Then, the base sequence of the target DNA is confirmed by a known method such as the dideoxynucleotide chain termination method.
目的とする抗グリピカン3抗体のV領域をコードするDNAを得たのち、これを、所望の抗体定常領域(C領域)をコードするDNAを含有する発現ベクターへ組み込む。 After obtaining DNA encoding the V region of the desired anti-glypican 3 antibody, this is incorporated into an expression vector containing DNA encoding the desired antibody constant region (C region).
本発明で使用される抗グリピカン3抗体を製造するには、抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより、宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させる。 In order to produce the anti-glypican 3 antibody used in the present invention, an antibody gene is incorporated into an expression vector so as to be expressed under the control of an expression control region such as an enhancer or promoter. Next, host cells are transformed with this expression vector to express the antibody.
抗体遺伝子の発現は、H鎖またはL鎖をコードするポリヌクレオチドを別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を同時形質転換させてもよいし、あるいはH鎖およびL鎖をコードするポリヌクレオチドを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換させてもよい(WO 94/11523 号公報参照)。 The expression of the antibody gene may be achieved by separately integrating the polynucleotides encoding the H chain or L chain into an expression vector and co-transforming the host cell, or by using a single polynucleotide encoding the H chain and L chain. The host cell may be transformed by incorporating it into the expression vector (see WO 94/11523).
ポリヌクレオチド
別の観点においては、本発明は、本発明の抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを提供する。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号11−21、33−43、55−59、65−70、77−83のいずれかに記載の塩基配列を有する。また、該ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ本発明の抗体と同等の活性を有する抗体をコードするポリヌクレオチドも本発明の範囲内である。
In another aspect of the polynucleotide , the present invention provides a polynucleotide encoding the heavy chain variable region or the light chain variable region of the antibody of the present invention. Preferably, the polynucleotide of the present invention has the base sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 11-21, 33-43, 55-59, 65-70, 77-83. A polynucleotide encoding an antibody that hybridizes with the polynucleotide under stringent conditions and has the same activity as the antibody of the present invention is also within the scope of the present invention.
本発明のポリヌクレオチドは、本発明の抗体をコードする限り、特に限定されず、複数のデオキシリボ核酸(DNA)またはリボ核酸(RNA)等のヌクレオチドからなる重合体である。天然以外の塩基を含んでいてよい。本発明のポリヌクレオチドは、抗体を遺伝子工学的な手法により製造するために使用することができる。また本発明の抗体と同等な機能を有する抗体をスクリーニングするために、プローブとして用いることもできる。即ち本発明の抗体をコードするポリヌクレオチド、またはその一部をプローブとして用い、ハイブリダイゼーション、遺伝子増幅技術(例えばPCR)等の技術により、該ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ本発明の抗体と同等の活性を有する抗体をコードするDNAを得ることができる。このようなDNAも本発明のポリヌクレオチドに含まれる。 The polynucleotide of the present invention is not particularly limited as long as it encodes the antibody of the present invention, and is a polymer composed of a plurality of nucleotides such as deoxyribonucleic acid (DNA) or ribonucleic acid (RNA). Non-natural bases may be included. The polynucleotide of the present invention can be used for producing an antibody by genetic engineering techniques. Moreover, it can also be used as a probe for screening an antibody having a function equivalent to that of the antibody of the present invention. That is, a polynucleotide encoding the antibody of the present invention, or a part thereof, is used as a probe, hybridized with the polynucleotide under stringent conditions by a technique such as hybridization, gene amplification technique (eg, PCR), and the like, DNA encoding an antibody having an activity equivalent to that of the antibody of the present invention can be obtained. Such DNA is also included in the polynucleotide of the present invention.
ハイブリダイゼーション技術(Sambrook,J et al., Molecular Cloning 2nd ed., 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. press, 1989)は当業者によく知られた技術である。ハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、低ストリンジェントな条件が挙げられる。低ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、例えば42℃、0.1×SSC、0.1%SDSの条件であり、好ましくは50℃、0.1×SSC 、0.1%SDSの条件である。より好ましいハイブリダイゼーションの条件としては、高ストリンジェントな条件が挙げられる。高ストリンジェントな条件とは、例えば65℃、5×SSCおよび0.1%SDSの条件である。これらの条件において、温度を上げる程に高い相同性を有するポリヌクレオチドが効率的に得られることが期待できる。但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。 Hybridization techniques (Sambrook, J et al., Molecular Cloning 2nd ed., 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) are techniques well known to those skilled in the art. Examples of hybridization conditions include low stringency conditions. Low stringent conditions are, for example, conditions of 42 ° C., 0.1 × SSC and 0.1% SDS in washing after hybridization, and preferably conditions of 50 ° C., 0.1 × SSC and 0.1% SDS. More preferable hybridization conditions include highly stringent conditions. Highly stringent conditions are, for example, conditions of 65 ° C., 5 × SSC and 0.1% SDS. Under these conditions, it can be expected that a polynucleotide having high homology can be efficiently obtained as the temperature is increased. However, a plurality of factors such as temperature and salt concentration can be considered as factors affecting the stringency of hybridization, and those skilled in the art can realize the same stringency by appropriately selecting these factors. .
これらハイブリダイゼーション技術や遺伝子増幅技術により得られるポリヌクレオチドがコードする、本発明の抗体と機能的に同等な抗体は、通常、これら抗体とアミノ酸配列において高い相同性を有する。本発明の抗体には、本発明の抗体と機能的に同等であり、かつ該抗体のアミノ酸配列と高い相同性を有する抗体も含まれる。高い相同性とは、アミノ酸レベルにおいて、通常、少なくとも50%以上の同一性、好ましくは75%以上の同一性、さらに好ましくは85%以上の同一性、さらに好ましくは95%以上の同一性を指す。ポリペプチドの相同性を決定するには、文献(Wilbur, W. J. and Lipman, D. J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80, 726-730)に記載のアルゴリズムにしたがえばよい。 Antibodies functionally equivalent to the antibodies of the present invention encoded by polynucleotides obtained by these hybridization techniques and gene amplification techniques usually have high homology in amino acid sequences with these antibodies. The antibody of the present invention includes an antibody functionally equivalent to the antibody of the present invention and having high homology with the amino acid sequence of the antibody. High homology generally refers to at least 50% identity, preferably 75% identity, more preferably 85% identity, more preferably 95% identity at the amino acid level. . To determine the homology of a polypeptide, the algorithm described in the literature (Wilbur, W. J. and Lipman, D. J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80, 726-730) may be used.
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。このようなベクターは、本発明の抗体を製造するために用いることができる。本発明のベクターとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合には、ベクターを大腸菌(例えば、JM109、DH5α、HB101、XL1Blue)などで大量に増幅させ大量調製するために、大腸菌で増幅されるための「ori」をもち、さらに形質転換された大腸菌の選抜遺伝子(例えば、なんらかの薬剤(アンピシリンやテトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフェニコール)により判別できるような薬剤耐性遺伝子)を有すれば特に制限はない。ベクターの例としては、M13系ベクター、pUC系ベクター、pBR322、pBluescript、pCR-Scriptなどが挙げられる。また、cDNAのサブクローニング、切り出しを目的とした場合、上記ベクターの他に、例えば、pGEM-T、pDIRECT、pT7などが挙げられる。 The present invention also provides a vector comprising the polynucleotide of the present invention. Such a vector can be used to produce the antibody of the present invention. As the vector of the present invention, for example, when Escherichia coli is used as a host, the vector is amplified in Escherichia coli in order to amplify it in large quantities in Escherichia coli (for example, JM109, DH5α, HB101, XL1Blue), etc. There is no particular limitation as long as it has a selected gene of E. coli that is transformed and has a selected gene (for example, a drug resistance gene that can be discriminated by any drug (ampicillin, tetracycline, kanamycin, chloramphenicol)). . Examples of vectors include M13 vectors, pUC vectors, pBR322, pBluescript, pCR-Script, and the like. In addition, for the purpose of subcloning and excision of cDNA, in addition to the above vector, for example, pGEM-T, pDIRECT, pT7 and the like can be mentioned.
本発明のベクターとしては、特に、発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、例えば、大腸菌での発現を目的とした場合は、ベクターが大腸菌で増幅されるような上記特徴を持つほかに、宿主をJM109、DH5α、HB101、XL1-Blueなどの大腸菌とした場合においては、大腸菌で効率よく発現できるようなプロモーター、例えば、lacZプロモーター(Wardら, Nature (1989) 341, 544-546;FASEB J. (1992) 6, 2422-2427)、araBプロモーター(Betterら, Science (1988) 240, 1041-1043 )、またはT7プロモーターなどを持っていることが不可欠である。このようなベクターとしては、上記ベクターの他にpGEX-5X-1(ファルマシア社製)、「QIAexpress system」(キアゲン社製)、pEGFP、またはpET(この場合、宿主はT7 RNAポリメラーゼを発現しているBL21が好ましい)などが挙げられる。 An expression vector is particularly useful as the vector of the present invention. As an expression vector, for example, for the purpose of expression in E. coli, in addition to the above characteristics that the vector is amplified in E. coli, the host is E. coli such as JM109, DH5α, HB101, XL1-Blue, etc. In some cases, promoters that can be efficiently expressed in E. coli, such as the lacZ promoter (Ward et al., Nature (1989) 341, 544-546; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427), araB promoter (Better et al. , Science (1988) 240, 1041-1043), or the T7 promoter or the like. In addition to the above vectors, such vectors include pGEX-5X-1 (Pharmacia), “QIAexpress system” (Qiagen), pEGFP, or pET (in this case, the host expresses T7 RNA polymerase). BL21 is preferred).
また、ベクターには、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよい。タンパク質分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、pelBシグナル配列(Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379)を使用すればよい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法を用いて行うことができる。 The vector may contain a signal sequence for polypeptide secretion. As a signal sequence for protein secretion, the pelB signal sequence (Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379) may be used in the case of producing it in the periplasm of E. coli. Introduction of a vector into a host cell can be performed using, for example, a calcium chloride method or an electroporation method.
大腸菌以外にも、例えば、本発明のベクターとしては、哺乳動物由来の発現ベクター(例えば、pcDNA3 (インビトロゲン社製)や、pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res.1990, 18(17),p5322)、pEF 、pCDM8)、昆虫細胞由来の発現ベクター(例えば「Bac-to-BAC baculovirus expression system」(ギブコBRL社製)、pBacPAK8)、植物由来の発現ベクター(例えばpMH1、pMH2)、動物ウィルス由来の発現ベクター(例えば、pHSV、pMV、pAdexLcw)、レトロウィルス由来の発現ベクター(例えば、pZIPneo)、酵母由来の発現ベクター(例えば、「Pichia Expression Kit」(インビトロゲン社製)、pNV11、SP-Q01)、枯草菌由来の発現ベクター(例えば、pPL608、pKTH50)が挙げられる。 In addition to E. coli, for example, the vectors of the present invention include mammalian-derived expression vectors (for example, pcDNA3 (manufactured by Invitrogen), pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res. 1990, 18 (17), p5322) , PEF, pCDM8), insect cell-derived expression vectors (eg, “Bac-to-BAC baculovirus expression system” (manufactured by Gibco BRL), pBacPAK8), plant-derived expression vectors (eg, pMH1, pMH2), animal virus-derived Expression vectors (eg, pHSV, pMV, pAdexLcw), retrovirus-derived expression vectors (eg, pZIPneo), yeast-derived expression vectors (eg, “Pichia Expression Kit” (Invitrogen), pNV11, SP-Q01) And an expression vector derived from Bacillus subtilis (for example, pPL608, pKTH50).
CHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばSV40プロモーター(Mulliganら, Nature (1979) 277, 108)、MMTV-LTRプロモーター、EF1αプロモーター(Mizushimaら, Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322)、CMVプロモーターなどを持っていることが不可欠であり、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子(例えば、薬剤(ネオマイシン、G418など)により判別できるような薬剤耐性遺伝子)を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13などが挙げられる。 When intended for expression in animal cells such as CHO cells, COS cells, NIH3T3 cells, etc., a promoter necessary for expression in the cells, such as the SV40 promoter (Mulligan et al., Nature (1979) 277, 108), It is essential to have MMTV-LTR promoter, EF1α promoter (Mizushima et al., Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322), CMV promoter, etc., and genes for selecting transformation into cells (for example, More preferably, it has a drug resistance gene that can be discriminated by a drug (neomycin, G418, etc.). Examples of such a vector include pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV, and pOP13.
さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を目的とする場合には、核酸合成経路を欠損したCHO細胞にそれを相補するDHFR遺伝子を有するベクター(例えば、pCHOIなど)を導入し、メトトレキセート(MTX)により増幅させることができる。また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、SV40 T抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つCOS細胞を用いてSV40の複製起点を持つベクター(pcDなど)で形質転換することができる。複製開始点としては、また、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス(BPV)等の由来のものを用いることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ(APH)遺伝子、チミジンキナーゼ(TK)遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Ecogpt)遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素(dhfr)遺伝子等を含むことができる。 Furthermore, when the gene is stably expressed and the purpose is to amplify the copy number of the gene in the cell, a vector having a DHFR gene complementary to the CHO cell lacking the nucleic acid synthesis pathway (for example, , PCHOI, etc.) can be introduced and amplified with methotrexate (MTX). In addition, for the purpose of transient expression of the gene, transform with a vector having SV40 replication origin (such as pcD) using COS cells that have the SV40 T antigen-expressing gene on the chromosome. Can do. As the replication origin, those derived from polyoma virus, adenovirus, bovine papilloma virus (BPV) and the like can also be used. Furthermore, for gene copy number amplification in host cell systems, the expression vectors are selectable markers: aminoglycoside transferase (APH) gene, thymidine kinase (TK) gene, E. coli xanthine guanine phosphoribosyltransferase (Ecogpt) gene, dihydrofolate reductase ( dhfr) gene and the like.
本発明の抗体を製造するためには、該ベクターを宿主細胞に導入する。ベクターが導入される宿主細胞としては特に制限はなく、例えば、大腸菌や種々の動物細胞などを用いることが可能である。宿主細胞は、例えば、本発明の抗体の製造や発現のための産生系として使用することができる。ポリペプチド製造のための産生系は、in vitroおよびin vivoの産生系がある。in vitroの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。 In order to produce the antibody of the present invention, the vector is introduced into a host cell. The host cell into which the vector is introduced is not particularly limited, and for example, E. coli and various animal cells can be used. The host cell can be used, for example, as a production system for production and expression of the antibody of the present invention. Production systems for producing polypeptides include in vitro and in vivo production systems. Examples of in vitro production systems include production systems that use eukaryotic cells and production systems that use prokaryotic cells.
真核細胞を使用する場合、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を宿主に用いることができる。動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、CHO(J. Exp. Med. (1995) 108, 945)、COS、3T3、ミエローマ、BHK(baby hamster kidney)、HeLa、Vero、両生類細胞、例えばアフリカツメガエル卵母細胞(Valle, et al., Nature (1981) 291, 358-340)、あるいは昆虫細胞、例えば、Sf9、Sf21、Tn5が挙げられる。本発明においては、CHO-DG44、CHO-DXB11、COS7細胞、BHK細胞が好適に用いられる。動物細胞において、大量発現を目的とする場合には特にCHO細胞が好ましい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、カチオニックリボソームDOTAP(ベーリンガーマンハイム社製)を用いた方法、エレクトロポーレーション法、リポフェクションなどの方法で行うことが可能である。 When eukaryotic cells are used, for example, animal cells, plant cells, and fungal cells can be used as the host. Animal cells include mammalian cells such as CHO (J. Exp. Med. (1995) 108, 945), COS, 3T3, myeloma, BHK (baby hamster kidney), HeLa, Vero, amphibian cells such as Xenopus eggs Examples include mother cells (Valle, et al., Nature (1981) 291, 358-340) or insect cells such as Sf9, Sf21, and Tn5. In the present invention, CHO-DG44, CHO-DXB11, COS7 cells, and BHK cells are preferably used. In animal cells, CHO cells are particularly preferred for mass expression purposes. Introduction of a vector into a host cell can be performed by, for example, a calcium phosphate method, a DEAE dextran method, a method using a cationic ribosome DOTAP (Boehringer Mannheim), an electroporation method, a lipofection method, or the like.
植物細胞としては、例えば、ニコチアナ・タバカム(Nicotiana tabacum)由来の細胞がタンパク質生産系として知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス(Saccharomyces)属、例えば、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、サッカロミセス・ポンベ(Saccharomyces pombe)糸状菌、例えば、アスペルギルス(Aspergillus)属、例えば、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)が挙げられる。 As plant cells, for example, cells derived from Nicotiana tabacum are known as protein production systems, and these may be cultured in callus. Fungal cells include yeasts such as Saccharomyces, such as Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pombe filamentous fungi such as Aspergillus, such as Aspergillus sperm. niger).
原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系を使用することができる。細菌細胞としては、大腸菌(E. coli)、例えば、JM109、DH5α、HB101等、および枯草菌が挙げられる。 When using prokaryotic cells, production systems using bacterial cells can be used. Bacterial cells include E. coli, such as JM109, DH5α, HB101, and Bacillus subtilis.
組換え抗体の製造
本発明の抗体は、上記宿主細胞を培養することにより製造することができる。目的とするポリヌクレオチドにより形質転換された細胞をin vitroで培養することにより、抗体が得られる。培養は、公知の方法に従い行うことができる。例えば、動物細胞の培養液として、例えば、DMEM、MEM、RPMI1640、IMDMを使用することができる。その際、FBS、牛胎児血清(FCS)等の血清補液を併用することもできるし、無血清培養してもよい。培養時のpHは、約6〜8であるのが好ましい。培養は、通常、約30〜40℃で約15〜200時間行い、必要に応じて培地の交換、通気、攪拌を加える。
Production of Recombinant Antibody The antibody of the present invention can be produced by culturing the above host cell. An antibody can be obtained by culturing cells transformed with the polynucleotide of interest in vitro. The culture can be performed according to a known method. For example, DMEM, MEM, RPMI1640, and IMDM can be used as the culture medium for animal cells. In that case, serum supplements such as FBS and fetal calf serum (FCS) can be used in combination, or serum-free culture can be performed. The pH during culture is preferably about 6-8. Culture is usually performed at about 30 to 40 ° C. for about 15 to 200 hours, and medium exchange, aeration, and agitation are added as necessary.
一方、in vivoでポリペプチドを産生させる系としては、例えば、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。これらの動物または植物に目的とするポリヌクレオチドを導入し、動物または植物の体内でポリペプチドを産生させ、回収する。本発明における「宿主」とは、これらの動物、植物を包含する。 On the other hand, examples of a system for producing a polypeptide in vivo include a production system using animals and a production system using plants. A target polynucleotide is introduced into these animals or plants, and the polypeptide is produced in the body of the animals or plants and recovered. The “host” in the present invention includes these animals and plants.
動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系がある。哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシを用いることができる(Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993)。また、哺乳類動物としてトランスジェニック動物を用いることができる。 When animals are used, there are production systems using mammals and insects. As mammals, goats, pigs, sheep, mice and cows can be used (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). A transgenic animal can be used as the mammal.
例えば、目的とするポリヌクレオチドを、ヤギβカゼインのような乳汁中に固有に産生されるポリペプチドをコードする遺伝子との融合遺伝子として調製する。次いで、この融合遺伝子を含むDNA断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ移植する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギまたはその子孫が産生する乳汁から、目的の抗体を得ることができる。トランスジェニックヤギから産生される抗体を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい(Ebert, K.M. et al., Bio/Technology (1994) 12, 699-702)。 For example, the target polynucleotide is prepared as a fusion gene with a gene encoding a polypeptide inherently produced in milk such as goat β casein. Next, a DNA fragment containing the fusion gene is injected into a goat embryo, and the embryo is transferred to a female goat. The antibody of interest can be obtained from the milk produced by a transgenic goat born from a goat that has received the embryo or its offspring. Hormones may be used in transgenic goats as appropriate to increase the amount of milk containing antibodies produced from transgenic goats (Ebert, KM et al., Bio / Technology (1994) 12, 699-702). .
また、昆虫としては、例えばカイコを用いることができる。カイコを用いる場合、目的の抗体をコードするポリヌクレオチドを挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させることにより、このカイコの体液から目的の抗体を得ることができる(Susumu, M. et al.,Nature (1985) 315, 592-594)。 Moreover, as an insect, a silkworm can be used, for example. When a silkworm is used, the target antibody can be obtained from the body fluid of the silkworm by infecting the silkworm with a baculovirus into which a polynucleotide encoding the target antibody is inserted (Susumu, M. et al., Nature ( 1985) 315, 592-594).
さらに、植物を使用する場合、例えばタバコを用いることができる。タバコを用いる場合、目的とする抗体をコードするポリヌクレオチドを植物発現用ベクター、例えばpMON 530に挿入し、このベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)のようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えば、ニコチアナ・タバカム(Nicotiana tabacum)に感染させ、本タバコの葉より所望の抗体を得ることができる(Julian K.-C. Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138)。 Furthermore, when using plants, for example, tobacco can be used. When tobacco is used, a polynucleotide encoding an antibody of interest is inserted into a plant expression vector, such as pMON 530, and this vector is introduced into a bacterium such as Agrobacterium tumefaciens. This bacterium can be infected with tobacco, for example Nicotiana tabacum, and the desired antibody can be obtained from the leaves of this tobacco (Julian K.-C. Ma et al., Eur. J. Immunol. ( 1994) 24, 131-138).
以上のようにして得られた抗体は、宿主細胞内または細胞外(培地など)から単離し、実質的に純粋で均一な抗体として精製することができる。抗体の分離、精製は、通常のポリペプチドの精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせればポリペプチドを分離、精製することができる。 The antibody obtained as described above can be isolated from the inside of the host cell or outside the cell (such as a medium) and purified as a substantially pure and homogeneous antibody. For separation and purification of the antibody, separation and purification methods used in usual polypeptide purification may be used. For example, chromatography column, filter, ultrafiltration, salting out, solvent precipitation, solvent extraction, distillation, immunoprecipitation, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing, dialysis, recrystallization, etc. are appropriately selected, When combined, polypeptides can be separated and purified.
クロマトグラフィーとしては、例えばアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる(Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996)。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー、例えばHPLC、FPLC等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインAカラム、プロテインGカラムが挙げられる。例えば、プロテインAを用いたカラムとして、Hyper D, POROS, Sepharose F. F. (Pharmacia)等が挙げられる。 Examples of chromatography include affinity chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration, reverse phase chromatography, and adsorption chromatography (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel). R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). These chromatography can be performed using liquid phase chromatography, for example, liquid phase chromatography such as HPLC and FPLC. Examples of the column used for affinity chromatography include a protein A column and a protein G column. Examples of the column using protein A include Hyper D, POROS, Sepharose F. F. (Pharmacia) and the like.
なお、抗体の精製前または精製後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり部分的にペプチドを除去することもできる。タンパク質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グルコシダーゼなどが用いられる。 In addition, the peptide can be arbitrarily modified or partially removed by allowing an appropriate protein modifying enzyme to act before or after purification of the antibody. Examples of protein modifying enzymes include trypsin, chymotrypsin, lysyl endopeptidase, protein kinase, glucosidase, and the like.
診断方法
別の観点においては、本発明は、本発明の抗体を用いて被検試料中のGPC3タンパク質を検出し、癌などの疾患の診断を行う方法を提供する。
In another aspect of the diagnostic method , the present invention provides a method for diagnosing diseases such as cancer by detecting GPC3 protein in a test sample using the antibody of the present invention.
検出とは、定量的または非定量的な検出を含み、例えば、非定量的な検出としては、単にGPC3タンパク質が存在するか否かの測定、GPC3タンパク質が一定の量以上存在するか否かの測定、GPC3タンパク質の量を他の試料(例えば、コントロール試料など)と比較する測定などを挙げることができ、定量的な検出としては、GPC3タンパク質の濃度の測定、GPC3タンパク質の量の測定などを挙げることができる。 Detection includes quantitative or non-quantitative detection.For example, non-quantitative detection includes simply measuring whether GPC3 protein is present, whether GPC3 protein is present in a certain amount or more. Measurement, measurement of comparing the amount of GPC3 protein with other samples (for example, control samples, etc.), etc., and quantitative detection includes measurement of the concentration of GPC3 protein, measurement of the amount of GPC3 protein, etc. Can be mentioned.
被検試料とは、GPC3タンパク質が含まれる可能性のある試料であれば特に制限されないが、哺乳類などの生物の体から採取された試料が好ましく、さらに好ましくはヒトから採取された試料である。被検試料の具体的な例としては、例えば、血液、間質液、血漿、血管外液、脳脊髄液、滑液、胸膜液、血清、リンパ液、唾液、などを挙げることができるが、好ましいものは血液、血清、血漿である。また、生物の体から採取された細胞の培養液などの、被検試料から得られる試料も本発明の被検試料に含まれる。 The test sample is not particularly limited as long as it may contain GPC3 protein, but a sample collected from the body of an organism such as a mammal is preferable, and a sample collected from a human is more preferable. Specific examples of the test sample include, for example, blood, interstitial fluid, plasma, extravascular fluid, cerebrospinal fluid, synovial fluid, pleural fluid, serum, lymph fluid, saliva, and the like. Things are blood, serum and plasma. A sample obtained from a test sample, such as a culture solution of cells collected from the body of an organism, is also included in the test sample of the present invention.
診断される癌は、特に制限されず、具体的には、肝癌、膵臓癌、肺癌、大腸癌、乳癌、前立腺癌、白血病、リンパ腫などを挙げることができるが、好ましいものは肝癌である。検出するGPC3は、特に限定されず、全長GPC3でも、その断片でもよい。GPC3断片を検出する場合には、N端断片でもC端断片でもよいが、好ましくはN端断片である。また、ヘパラン硫酸などが付加されたGPC3タンパク質でも、GPC3コアタンパク質でもよい。 The cancer to be diagnosed is not particularly limited, and specific examples include liver cancer, pancreatic cancer, lung cancer, colorectal cancer, breast cancer, prostate cancer, leukemia, lymphoma, and the like, but preferable is liver cancer. GPC3 to be detected is not particularly limited, and may be full-length GPC3 or a fragment thereof. When detecting a GPC3 fragment, it may be an N-terminal fragment or a C-terminal fragment, but is preferably an N-terminal fragment. Further, it may be a GPC3 protein to which heparan sulfate or the like is added or a GPC3 core protein.
被検試料に含まれるGPC3タンパク質の検出方法は特に限定されないが、抗GPC3抗体を用いた免疫学的方法により検出することが好ましい。免疫学的方法としては、例えば、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、発光イムノアッセイ、免疫沈降法、免疫比濁法などを挙げることができるが、好ましくはエンザイムイムノアッセイであり、特に好ましいものは酵素結合免疫吸着定量法(enzyme-linked immunosorbent assay:ELISA)(例えば、sandwich ELISA)である。ELISAなどの上述した免疫学的方法は当業者に公知の方法により行うことが可能である。 Although the detection method of GPC3 protein contained in a test sample is not particularly limited, it is preferably detected by an immunological method using an anti-GPC3 antibody. Examples of the immunological method include radioimmunoassay, enzyme immunoassay, fluorescent immunoassay, luminescence immunoassay, immunoprecipitation method, immunoturbidimetric method, and the like, preferably enzyme immunoassay, and particularly preferable is enzyme binding. It is an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) (for example, sandwich ELISA). The above-described immunological methods such as ELISA can be performed by methods known to those skilled in the art.
抗GPC3抗体を用いた一般的な検出方法としては、例えば、抗GPC3抗体を支持体に固定し、ここに被検試料を加え、インキュベートを行い抗GPC3抗体とGPC3タンパク質を結合させた後に洗浄して、抗GPC3抗体を介して支持体に結合したGPC3タンパク質を検出することにより、被検試料中のGPC3タンパク質の検出を行う方法を挙げることができる。 As a general detection method using an anti-GPC3 antibody, for example, an anti-GPC3 antibody is immobilized on a support, a test sample is added to the support, and incubation is performed to bind the anti-GPC3 antibody and the GPC3 protein, followed by washing. Thus, there can be mentioned a method of detecting GPC3 protein in a test sample by detecting GPC3 protein bound to a support via an anti-GPC3 antibody.
抗GPC3抗体とGPC3タンパク質との結合は、通常、緩衝液中で行われる。緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、Tris緩衝液などが使用される。また、インキュベーションの条件としては、すでによく用いられている条件、例えば、4℃〜室温にて1時間〜24時間のインキュベーションが行われる。インキュベート後の洗浄は、GPC3タンパク質と抗GPC3抗体の結合を妨げないものであれば何でもよく、例えば、Tween20等の界面活性剤を含む緩衝液などが使用される。
The binding between the anti-GPC3 antibody and the GPC3 protein is usually performed in a buffer solution. As the buffer solution, for example, phosphate buffer solution, Tris buffer solution and the like are used. Incubation is performed under conditions that are already often used, for example, incubation at 4 ° C. to room temperature for 1 to 24 hours. The washing after the incubation may be anything as long as it does not interfere with the binding between the GPC3 protein and the anti-GPC3 antibody. For example, a buffer containing a surfactant such as
本発明のGPC3タンパク質検出方法においては、GPC3タンパク質を検出したい被検試料の他に、コントロール試料を設置してもよい。コントロール試料としては、GPC3タンパク質を含まない陰性コントロール試料やGPC3タンパク質を含む陽性コントロール試料などがある。この場合、GPC3タンパク質を含まない陰性コントロール試料で得られた結果、GPC3タンパク質を含む陽性コントロール試料で得られた結果と比較することにより、被検試料中のGPC3タンパク質を検出することが可能である。また、コントロール試料および被検試料の検出結果を数値として得、それらの数値を比較することにより、被検試料に含まれるGPC3タンパク質を定量的に検出することも可能である。 In the GPC3 protein detection method of the present invention, a control sample may be installed in addition to the test sample for which GPC3 protein is to be detected. Examples of the control sample include a negative control sample not containing GPC3 protein and a positive control sample containing GPC3 protein. In this case, the GPC3 protein in the test sample can be detected by comparing the result obtained with the negative control sample not containing GPC3 protein and the result obtained with the positive control sample containing GPC3 protein. . It is also possible to quantitatively detect the GPC3 protein contained in the test sample by obtaining the detection results of the control sample and the test sample as numerical values and comparing the numerical values.
抗GPC3抗体を介して支持体に結合したGPC3タンパク質の検出の好ましい態様として、標識物質で標識された抗GPC3抗体を用いる方法を挙げることができる。例えば、支持体に固定された抗GPC3抗体に被検試料を接触させ、洗浄後に、GPC3タンパク質を特異的に結合する標識抗体を用いてGPC3を検出することができる。 As a preferred embodiment of the detection of the GPC3 protein bound to the support through the anti-GPC3 antibody, a method using an anti-GPC3 antibody labeled with a labeling substance can be mentioned. For example, GPC3 can be detected using a labeled antibody that specifically binds to GPC3 protein after contacting a test sample with an anti-GPC3 antibody immobilized on a support and washing.
抗GPC3抗体の標識は通常知られている方法により行うことが可能である。標識物質としては、蛍光色素、酵素、補酵素、化学発光物質、放射性物質などの当業者に公知の標識物質を用いることが可能であり、具体的な例としては、ラジオアイソトープ(32P、14C、125I、3H、131Iなど)、フルオレセイン、ローダミン、ダンシルクロリド、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、β-グルコシダーゼ、ホースラディッシュパーオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、ビオチンなどを挙げることができる。標識物質としてビオチンを用いる場合には、ビオチン標識抗体を添加後に、アルカリホスファターゼなどの酵素を結合させたアビジンをさらに添加することが好ましい。 The labeling of the anti-GPC3 antibody can be performed by a generally known method. As the labeling substance, a labeling substance known to those skilled in the art, such as a fluorescent dye, an enzyme, a coenzyme, a chemiluminescent substance, and a radioactive substance, can be used. As specific examples, radioisotopes ( 32 P, 14 C, 125 I, 3 H, 131 I , etc.), fluorescein, rhodamine, dansyl chloride, umbelliferone, luciferase, peroxidase, alkaline phosphatase, beta-galactosidase, beta-glucosidase, horseradish peroxidase, glucoamylase, lysozyme, saccharide Examples include oxidase, microperoxidase, and biotin. When biotin is used as the labeling substance, it is preferable to further add avidin to which an enzyme such as alkaline phosphatase is bound after adding the biotin-labeled antibody.
具体的には、抗GPC3抗体を含む溶液をプレートなどの支持体に加え、抗GPC3抗体を固定する。プレートを洗浄後、タンパク質の非特異的な結合を防ぐため、例えばBSAなどでブロッキングする。再び洗浄し、被検試料をプレートに加える。インキュベートの後、洗浄し、標識抗GPC3抗体を加える。適度なインキュベーションの後、プレートを洗浄し、プレートに残った標識抗GPC3抗体を検出する。タンパク質の検出は当業者に公知の方法により行うことができ、例えば、放射性物質による標識の場合には液体シンチレーションやRIA法により検出することができる。酵素による標識の場合には基質を加え、基質の酵素的変化、例えば発色を吸光度計により検出することができる。蛍光物質の場合には蛍光光度計により検出することができる。 Specifically, a solution containing an anti-GPC3 antibody is added to a support such as a plate, and the anti-GPC3 antibody is immobilized. After washing the plate, it is blocked with, for example, BSA to prevent nonspecific binding of proteins. Wash again and add the test sample to the plate. After incubation, wash and add labeled anti-GPC3 antibody. After moderate incubation, the plate is washed and the labeled anti-GPC3 antibody remaining on the plate is detected. Protein detection can be performed by methods known to those skilled in the art. For example, in the case of labeling with a radioactive substance, it can be detected by liquid scintillation or RIA. In the case of labeling with an enzyme, a substrate is added, and an enzymatic change of the substrate, for example, color development, can be detected with an absorptiometer. In the case of a fluorescent substance, it can be detected by a fluorometer.
本発明のGPC3タンパク質検出方法の特に好ましい態様として、ビオチンで標識された抗GPC3抗体およびアビジンを用いる方法を挙げることができる。具体的には、抗GPC3抗体を含む溶液をプレートなどの支持体に加え、抗GPC3抗体を固定する。プレートを洗浄後、タンパク質の非特異的な結合を防ぐため、例えばBSAなどでブロッキングする。再び洗浄し、被検試料をプレートに加える。インキュベートの後、洗浄し、ビオチン標識抗GPC3抗体を加える。適度なインキュベーションの後、プレートを洗浄し、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼなどの酵素と結合したアビジンを加える。インキュベーション後、プレートを洗浄し、アビジンに結合している酵素に対応した基質を加え、基質の酵素的変化などを指標にGPC3タンパク質を検出する。 A particularly preferred embodiment of the GPC3 protein detection method of the present invention includes a method using an anti-GPC3 antibody labeled with biotin and avidin. Specifically, a solution containing an anti-GPC3 antibody is added to a support such as a plate, and the anti-GPC3 antibody is immobilized. After washing the plate, it is blocked with, for example, BSA to prevent nonspecific binding of proteins. Wash again and add the test sample to the plate. After incubation, wash and add biotin-labeled anti-GPC3 antibody. After moderate incubation, the plate is washed and avidin conjugated with an enzyme such as alkaline phosphatase or peroxidase is added. After incubation, the plate is washed, a substrate corresponding to the enzyme bound to avidin is added, and GPC3 protein is detected using the enzymatic change of the substrate as an indicator.
本発明のGPC3タンパク質検出方法の他の態様として、GPC3タンパク質を特異的に結合する一次抗体、および該一次抗体を特異的に結合する二次抗体を用いる方法を挙げることができる。例えば、支持体に固定された抗GPC3抗体に被検試料を接触させ、インキュベーションした後、洗浄し、洗浄後に結合しているGPC3タンパク質を、一次抗GPC3抗体および該一次抗体を特異的に結合する二次抗体により検出する。この場合、二次抗体は好ましくは標識物質により標識されている。 As another embodiment of the GPC3 protein detection method of the present invention, a method using a primary antibody that specifically binds the GPC3 protein and a secondary antibody that specifically binds the primary antibody can be mentioned. For example, a test sample is brought into contact with an anti-GPC3 antibody immobilized on a support, incubated, washed, and GPC3 protein bound after washing specifically binds the primary anti-GPC3 antibody and the primary antibody. Detect with secondary antibody. In this case, the secondary antibody is preferably labeled with a labeling substance.
具体的には、抗GPC3抗体を含む溶液をプレートなどの支持体に加え、抗GPC3抗体を固定する。プレートを洗浄後、タンパク質の非特異的な結合を防ぐため、例えばBSAなどでブロッキングする。再び洗浄し、被検試料をプレートに加える。インキュベートの後、洗浄し、一次抗GPC3抗体を加える。適度なインキュベーションの後、プレートを洗浄し、次いで一次抗体を特異的に結合する二次抗体を加える。適度なインキュベーションの後、洗浄して、プレートに残った二次抗体を検出する。二次抗体の検出は前述の方法により行うことができる。 Specifically, a solution containing an anti-GPC3 antibody is added to a support such as a plate, and the anti-GPC3 antibody is immobilized. After washing the plate, it is blocked with, for example, BSA to prevent nonspecific binding of proteins. Wash again and add the test sample to the plate. After incubation, wash and add primary anti-GPC3 antibody. After moderate incubation, the plate is washed and then a secondary antibody that specifically binds the primary antibody is added. After moderate incubation, wash to detect any secondary antibody remaining on the plate. Detection of the secondary antibody can be performed by the method described above.
医薬組成物
別の観点においては、本発明は、本発明の抗体を含有する医薬組成物を提供する。本発明の抗体を含有する医薬組成物は癌などの細胞増殖に関連する疾患の治療および/または予防に有用であり、特に肝癌の治療および/または予防に有用である。本発明の抗体を医薬組成物として用いる場合には、当業者に公知の方法で製剤化することが可能である。例えば、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量を投与しうるよう選択する。
In another aspect of the pharmaceutical composition , the present invention provides a pharmaceutical composition containing the antibody of the present invention. The pharmaceutical composition containing the antibody of the present invention is useful for the treatment and / or prevention of diseases associated with cell proliferation such as cancer, and is particularly useful for the treatment and / or prevention of liver cancer. When the antibody of the present invention is used as a pharmaceutical composition, it can be formulated by methods known to those skilled in the art. For example, it can be used parenterally in the form of a sterile solution with water or other pharmaceutically acceptable liquid, or an injection in suspension. For example, a pharmacologically acceptable carrier or medium, specifically, sterilized water, physiological saline, vegetable oil, emulsifier, suspension, surfactant, stabilizer, flavoring agent, excipient, vehicle, preservative It is conceivable to formulate by combining with a binder or the like as appropriate and mixing in a unit dosage form generally required for pharmaceutical practice. The amount of active ingredient in these preparations is selected so that an appropriate dose within the indicated range can be administered.
注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。 Sterile compositions for injection can be formulated according to normal pharmaceutical practice using a vehicle such as distilled water for injection.
注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばD-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート80(TM)、HCO-50と併用してもよい。 Aqueous solutions for injection include, for example, isotonic solutions containing physiological saline, glucose and other adjuvants such as D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol and sodium chloride, and suitable solubilizers such as You may use together with alcohol, specifically ethanol, polyalcohol, for example, propylene glycol, polyethylene glycol, nonionic surfactant, for example, polysorbate 80 (TM), HCO-50.
油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。 Examples of the oily liquid include sesame oil and soybean oil, which may be used in combination with benzyl benzoate or benzyl alcohol as a solubilizing agent. Moreover, you may mix | blend with buffer, for example, phosphate buffer, sodium acetate buffer, a soothing agent, for example, procaine hydrochloride, stabilizer, for example, benzyl alcohol, phenol, antioxidant. The prepared injection solution is usually filled into a suitable ampoule.
投与は好ましくは非経口投与であり、具体的には、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型などが挙げられる。注射剤型の処方は、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身または局部的に投与することができる。 Administration is preferably parenteral administration, and specific examples include injection, nasal administration, pulmonary administration, and transdermal administration. The injection-type formulation can be administered systemically or locally by, for example, intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection and the like.
また、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。抗体または抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する医薬組成物の投与量としては、例えば、一回につき体重1kgあたり0.0001mgから1000mgの範囲で選ぶことが可能である。あるいは、例えば、患者あたり0.001〜100000mg/bodyの範囲で投与量を選ぶことができるが、これらの数値に必ずしも制限されるものではない。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。 The administration method can be appropriately selected depending on the age and symptoms of the patient. The dosage of the pharmaceutical composition containing the antibody or the polynucleotide encoding the antibody can be selected, for example, in the range of 0.0001 mg to 1000 mg per kg body weight. Alternatively, for example, the dose can be selected in the range of 0.001 to 100000 mg / body per patient, but is not necessarily limited to these values. The dose and administration method vary depending on the weight, age, symptoms, etc. of the patient, but can be appropriately selected by those skilled in the art.
本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。また,本出願が有する優先権主張の基礎となる出願である日本特許出願2004−203637号の明細書および図面に記載の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。 The contents of all patents and references explicitly cited herein are hereby incorporated by reference as part of the present specification. In addition, the contents described in the specification and drawings of Japanese Patent Application No. 2004-203637, which is the application on which the priority of the present application is based, are cited herein as a part of this specification.
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。 EXAMPLES The present invention will be described below in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。 EXAMPLES The present invention will be described below in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
実施例1
ヒトグリピカン3(GPC3)のcDNAクローニング
ヒトGPC3をコードする全長cDNAは、大腸癌細胞株Caco2より常法により調製した1st strand cDNAを鋳型とし、Advantage2 kit(CLONTECH社)を用いたPCR反応により増幅した。
Example 1
CDNA cloning of human glypican 3 (GPC3) Full-length cDNA encoding human GPC3 was amplified by PCR using Advantage2 kit (CLONTECH) using 1st strand cDNA prepared from colon cancer cell line Caco2 by a conventional method as a template.
すなわち、2 μlのCaco2由来cDNA、1μlのセンスプライマー(GATATC-ATGGCCGGGACCGTGCGCACCGCGT:配列番号1)、1μlのアンチセンスプライマー(GCTAGC-TCAGTGCACCAGGAAGAAGAAGCAC:配列番号2)、5μlのAdvantage2 10xPCR buffer、8μlのdNTP mix (1.25 mM)、1.0μlのAdvantage polymerase Mixを含む50μlの反応液を、94 ℃で1分、63 ℃で30秒、68 ℃で3分からなるサイクルを35回行った。PCR反応による増幅産物はpGEM-T Easy VectorSystem I(Promega社)を用いてTAベクターpGEM-T easyに挿入した。ABI3100 DNAシーケンサーを用い配列の確認を行った結果、ヒトGPC3の全長をコードするcDNAを単離した。配列番号3で表される配列はヒトGPC3遺伝子の塩基配列を、配列番号4で表される配列はヒトGPC3タンパク質のアミノ酸配列を示す。 Namely, 2 μl of Caco2-derived cDNA, 1 μl of sense primer (GATATC-ATGGCCGGGACCGTGCGCACCGCGT: SEQ ID NO: 1), 1 μl of antisense primer (GCTAGC-TCAGTGCACCAGGAAGAAGAAGCAC: SEQ ID NO: 2), 5 μl of Advantage2 10xPCR buffer, 8 μl of dNTP mix (1.25 mM) and 50 μl of a reaction solution containing 1.0 μl of Advantage polymerase mix were subjected to 35 cycles of 94 ° C. for 1 minute, 63 ° C. for 30 seconds, and 68 ° C. for 3 minutes. The amplification product by the PCR reaction was inserted into the TA vector pGEM-T easy using pGEM-T Easy VectorSystem I (Promega). As a result of sequence confirmation using the ABI3100 DNA sequencer, cDNA encoding the full length of human GPC3 was isolated. The sequence represented by SEQ ID NO: 3 represents the base sequence of the human GPC3 gene, and the sequence represented by SEQ ID NO: 4 represents the amino acid sequence of the human GPC3 protein.
実施例2
可溶型GPC3の作製
抗GPC3抗体作製のための免疫タンパク質として、C末端側の疎水性領域(564-580アミノ酸)を欠損させた可溶型GPC3タンパク質を作製した。
Example 2
Production of soluble GPC3 A soluble GPC3 protein lacking the C-terminal hydrophobic region (564-580 amino acids) was produced as an immunity protein for the production of anti-GPC3 antibodies.
完全長ヒトGPC3 cDNAを鋳型としてアンチセンスプライマー(ATA GAA TTC CAC CAT GGCCGG GAC CGT GCG C:配列番号5)とEcoRI認識配列、Kozak配列を加えたセンスプライマー(ATA GGA TCC CTT CAG CGG GGA ATG AAC GTT C:配列番号6)を用いてPCRを行った。得られたPCR断片(1711bp)をpCXND2-Flagにクローニングした。pCXND2-Flagは、pCXN2(Niwaら、Gene 1991;108;193-199)のHindIII部位にpCHOI(Hirataら、FEBS letter 1994;356;244−248)のDHFR遺伝子発現領域を挿入し、また、マルチクローニングサイトの下流にFlagタグ配列を付加し、Flagタグ付加タンパクとして発現されるよう設計した。作製された発現プラスミドDNAをCHO細胞DXB11株へ導入し、500μg/mL Geneticin での選抜により、可溶型GPC3高発現CHO株を得た。1700 cm2ローラーボトルを用い可溶型GPC3高発現CHO株の大量培養を行い、培養上清を回収し精製を行った。培養上清をDEAE sepharose Fast Flow (Amersham社)にチャージし、洗浄後、500mM NaClを含むバッファにより溶出した。次に、Anti-Flag M2 agarose affinity gel(SIGMA社)を用いてアフィニティー精製を行った。溶出は200μg/mLのFLAGペプチドにより行った。Centriprep-10(Millipore社)による濃縮後、Superdex 200 HR 10/30(Amersham社)によるゲルろ過を行いFLAGペプチドを除去した。最後にDEAE sepharose Fast Flowカラムを用いて濃縮し、同時にTween20を含まないPBS(500mMのNaClを含む)で溶出を行うことによりバッファ置換を行った。
Sense primer (ATA GGA TCC CTT CAG CGG GGA ATG AAC GTT) with antisense primer (ATA GAA TTC CAC CAT GGCCGG GAC CGT GCG C: SEQ ID NO: 5), EcoRI recognition sequence, and Kozak sequence using full-length human GPC3 cDNA as a template C: PCR was performed using SEQ ID NO: 6). The obtained PCR fragment (1711 bp) was cloned into pCXND2-Flag. pCXND2-Flag inserts the DHFR gene expression region of pCHOI (Hirata et al., FEBS letter 1994; 356; 244-248) into the HindIII site of pCXN2 (Niwa et al., Gene 1991; 108; 193-199) A Flag tag sequence was added downstream of the cloning site, and it was designed to be expressed as a Flag tag added protein. The produced expression plasmid DNA was introduced into CHO cell DXB11 strain, and selection with 500 μg / mL Geneticin gave a soluble GPC3 highly expressing CHO strain. A large amount of soluble GPC3 highly expressing CHO strain was cultured using a 1700 cm 2 roller bottle, and the culture supernatant was collected and purified. The culture supernatant was charged into DEAE sepharose Fast Flow (Amersham), washed and then eluted with a buffer containing 500 mM NaCl. Next, affinity purification was performed using Anti-Flag M2 agarose affinity gel (SIGMA). Elution was performed with 200 μg / mL FLAG peptide. After concentration with Centriprep-10 (Millipore), gel filtration with Superdex 200
実施例3
可溶型GPC3コアタンパク質の作製
GPC3はヘパラン硫酸による修飾を受け巨大分子となる。抗GPC3抗体のスクリーニングにおいてヘパラン硫酸に対する抗体を排除する為、ヘパラン硫酸付加部位に点変異を導入した可溶型GPC3コアタンパク質を作製し、スクリーニングに用いた。
Example 3
Production of soluble GPC3 core protein
GPC3 is modified by heparan sulfate to become a macromolecule. In order to eliminate antibodies against heparan sulfate in screening for anti-GPC3 antibody, a soluble GPC3 core protein having a point mutation introduced at the heparan sulfate addition site was prepared and used for screening.
上記可溶型GPC3(1-563)を鋳型とし、アッセンブリーPCR法によって495番目と509番目のSerをAlaに置換させたcDNAを作製した。この際、C末端にHisタグが付加されるようにプライマーを設計し、得られたcDNAをpCXND3ベクターにクローニングした。pCXND3は、pCXN2のHindIII部位にpCHOIのDHFR遺伝子発現部位を挿入して作製した。作製された発現プラスミドDNAをDXB11株へ導入し、500μg/mL Geneticin での選抜により、可溶型GPC3コアタンパク質高発現CHO株を得た。 Using the soluble GPC3 (1-563) as a template, cDNA in which the 495th and 509th Sers were replaced with Ala was prepared by assembly PCR. At this time, primers were designed so that a His tag was added to the C-terminus, and the resulting cDNA was cloned into the pCXND3 vector. pCXND3 was prepared by inserting the DHFR gene expression site of pCHOI into the HindIII site of pCXN2. The prepared expression plasmid DNA was introduced into the DXB11 strain, and selection with 500 μg / mL Geneticin gave a soluble GPC3 core protein highly expressing CHO strain.
1700 cm2ローラーボトルを用い大量培養を行い、培養上清を回収し精製を行った。培養上清をQ sepharose Fast Flow (Amersham社)にチャージし、洗浄後、500mM NaClを含むリン酸バッファにより溶出した。次に、Chelating sepharose Fast Flow (Amersham社)を用いてアフィニティー精製を行った。10〜150mMのイミダゾールでグラジエント溶出を行った。最後にQ sepharose Fast Flow を用いて濃縮し、500mM NaClを含むリン酸バッファにより溶出した。 Mass culture was performed using a 1700 cm 2 roller bottle, and the culture supernatant was collected and purified. The culture supernatant was charged into Q sepharose Fast Flow (Amersham), washed and then eluted with a phosphate buffer containing 500 mM NaCl. Next, affinity purification was performed using Chelating sepharose Fast Flow (Amersham). Gradient elution was performed with 10-150 mM imidazole. Finally, it was concentrated using Q sepharose Fast Flow and eluted with a phosphate buffer containing 500 mM NaCl.
還元条件下にてSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果、70kDa、40kDa、30kDaの3つのバンドが得られた。ABI492 protein sequencer(Applied Biosystems社)を用いてアミノ酸シークエンスを行った結果、30kDaのバンドはGPC3の359番目以降、もしくは375番目以降のアミノ酸配列と一致し、GPC3はArg358とSer359の間、若しくはLys374とVal375の間で切断を受け、40kDaのN末端断片と30kDaのC末端側断片に分割していることが判明した。 As a result of SDS polyacrylamide gel electrophoresis under reducing conditions, three bands of 70 kDa, 40 kDa and 30 kDa were obtained. As a result of amino acid sequencing using ABI492 protein sequencer (Applied Biosystems), the 30 kDa band coincided with the amino acid sequence of GPC3 after 359 or 375, and GPC3 was between Arg358 and Ser359, or Lys374 and It was found that it was cleaved between Val375 and divided into a 40 kDa N-terminal fragment and a 30 kDa C-terminal fragment.
実施例4
全長ヒトGPC3発現CHO細胞株の作製
フローサイトメトリを用いた結合活性評価用の細胞株を得るために、全長GPC3を発現するCHO細胞株の樹立を行った。
Example 4
Preparation of full length human GPC3-expressing CHO cell line In order to obtain a cell line for evaluation of binding activity using flow cytometry, a CHO cell line expressing full length GPC3 was established.
10μgの全長ヒトGPC3遺伝子発現ベクターと60μLのSuperFect(QIAGEN社)を混合し、複合体を形成させた後に、CHO細胞DXB11株に添加することにより、遺伝子導入を行った。CO2インキュベーターで24時間培養後、終濃度0.5mg/mLのGeneticinおよび10% FBSを含むαMEM(GIBCO BRL社)を用いて、選抜を開始した。得られたGeneticin耐性コロニーを集め、限界希釈法により細胞のクローニングを行った。それぞれの細胞クローンを可溶化し、抗GPC3抗体を用いたウエスタンブロットにより全長ヒトGPC3の発現を確認し、安定発現細胞株を取得した。 10 μg of the full-length human GPC3 gene expression vector and 60 μL of SuperFect (QIAGEN) were mixed to form a complex, and then added to the CHO cell DXB11 strain for gene introduction. After culturing in a CO 2 incubator for 24 hours, selection was started using αMEM (GIBCO BRL) containing Geneticin and 10% FBS at a final concentration of 0.5 mg / mL. The obtained Geneticin resistant colonies were collected, and the cells were cloned by the limiting dilution method. Each cell clone was solubilized, and expression of full-length human GPC3 was confirmed by Western blot using an anti-GPC3 antibody to obtain a stable expression cell line.
実施例5
ELISAによる結合活性の評価
可溶型GPC3コアタンパク質を1μg/mLとなるようにコーティングバッファ(0.1mol/L NaHCO3 (pH9.6), 0.02%(w/v) NaN3)で希釈したものをイムノプレートに加え、4℃にて一晩放置しコーティングした。希釈バッファ (50 mmol/L Tris-HCl(pH8.1), 1 mmol/L MgCl2,150 mmol/L NaCl, 0.05%(v/v) Tween 20, 0.02%(w/v) NaN3, 1%(w/v) BSA)にてブロッキング処理を行った後、抗GPC3抗体を加え、室温で1時間放置した。リンスバッファ(0.05%(v/v) Tween 20, PBS)にて洗浄後、アルカリホスファターゼ標識した抗マウスIgG抗体(ZYMED社)を加え、室温で1時間放置した。リンスバッファにて洗浄後、SIGMA104(SIGMA社)を1 mg/mLとなるように基質バッファ(50mmol/L NaHCO3(pH9.8), 10 mmol/L MgCl2)に希釈したものを添加し、室温で1時間発色させた後、Benchmark Plus (BIO-RAD)を用いて吸光度(405nm, 参照波長655nm)を測定した。
Example 5
Evaluation of binding activity by ELISA Diluted soluble GPC3 core protein with coating buffer (0.1 mol / L NaHCO 3 (pH 9.6), 0.02% (w / v) NaN 3 ) to 1 μg / mL In addition to the immunoplate, the coating was allowed to stand overnight at 4 ° C. Dilution buffer (50 mmol / L Tris-HCl (pH 8.1), 1 mmol / L MgCl 2 , 150 mmol / L NaCl, 0.05% (v / v)
実施例6
可溶型GPC3の免疫およびハイブリドーマの選抜
ヒトGPC3とマウスGPC3のホモロジーはアミノ酸レベルで94%の高い相同性を示すため、通常のマウスに免疫しても抗GPC3抗体を得難い可能性を考え、自己免疫疾患マウスであるMRL/MpJUmmCrj-lpr/lprマウス(以下、MRL/lprマウス、日本チャールズ・リバーより購入)を免疫動物として用いた。7週齢、もしくは8週齢より免疫を開始し、初回免疫には可溶型GPC3を100μg/headとなるように調製し、フロイント完全アジュバント(FCA、ベクトンディッキンソン社)を用いてエマルジョン化したものを皮下に投与した。2週間後に50μg/headとなるように調製したものをフロイント不完全アジュバント(FIA、ベクトンディッキンソン社)でエマルジョン化したものを皮下に投与した。以降1週間間隔で追加免疫を合計5回行った。その内2匹に対し、最終免疫として50μg/headとなるようにPBSに希釈し尾静脈内に投与した。最終免疫の4日後、脾臓細胞を摘出し、マウスミエローマ細胞P3-X63Ag8U1(P3U1、ATCCより購入)と2:1になるように混合し、PEG1500(ロシュ・ダイアグノスティック社)を徐々に加える事により細胞融合を行った。慎重にRPMI1640培地(GIBCO BRL社)を加えPEG1500を希釈し、遠心操作によりPEG1500を除去した後、10%FBS入りRPMI1640にて懸濁したものを100μL /ウエルとなるように96穴培養プレートに播種した。翌日、100μL /ウエルとなるように10%FBS、1 x HAT media supplement (SIGMA社)、0.5 x BM-Condimed H1 Hybridoma cloning supplement (ロシュ・ダイアグノスティック社)を含むRPMI1640 (以降、HAT培地)を添加した。2, 3, 5日後に培養液の半分をHAT培地に置き換え、7日後の培養上清を用いてスクリーニングを行った。スクリーニングは可溶型GPC3コアタンパク質を固相化したイムノプレートを用いたELISAにより行った。陽性クローンについては限界希釈法によりモノクローン化した。その結果、GPC3に対して強い結合活性を有する抗体を11クローン(M3C11、M13B3、M1E7、M3B8、M11F1、L9G11、M19B11、M6B1、M18D4、M5B9、M10D2)取得した。
Example 6
For immunization and homology screening human GPC3 and mouse GPC3 hybridoma soluble GPC3 is showing high homology 94% at the amino acid level, immunized consider the possibility is difficult to obtain an anti-GPC3 antibody even in normal mice, self MRL / MpJUmmCrj-lpr / lpr mice (hereinafter referred to as MRL / lpr mice, purchased from Charles River, Japan), which are immune disease mice, were used as immunized animals. Immunization started at 7 or 8 weeks of age. For initial immunization, soluble GPC3 was prepared to 100 μg / head and emulsified using Freund's complete adjuvant (FCA, Becton Dickinson) Was administered subcutaneously. What was prepared to become 50 μg / head after 2 weeks was emulsified with Freund's incomplete adjuvant (FIA, Becton Dickinson) and administered subcutaneously. Thereafter, booster immunization was performed 5 times in total at 1-week intervals. Two of them were diluted in PBS so that the final immunization was 50 μg / head and administered into the tail vein. Four days after the final immunization, spleen cells are removed, mixed with mouse myeloma cells P3-X63Ag8U1 (P3U1, purchased from ATCC) at a ratio of 2: 1, and PEG1500 (Roche Diagnostics) is gradually added. The cell fusion was performed. Carefully add RPMI1640 medium (GIBCO BRL), dilute PEG1500, remove PEG1500 by centrifugation, and then inoculate the suspension in RPMI1640 with 10% FBS into a 96-well culture plate at 100 μL / well. did. The next day, RPMI1640 (hereinafter referred to as HAT medium) containing 10% FBS, 1 x HAT media supplement (SIGMA), 0.5 x BM-Condimed H1 Hybridoma cloning supplement (Roche Diagnostics) to 100 μL / well Added. Half of the culture solution was replaced with HAT medium after 2, 3, and 5 days, and screening was performed using the culture supernatant after 7 days. Screening was performed by ELISA using an immunoplate on which soluble GPC3 core protein was immobilized. Positive clones were monocloned by the limiting dilution method. As a result, 11 clones (M3C11, M13B3, M1E7, M3B8, M11F1, L9G11, M19B11, M6B1, M18D4, M5B9, M10D2) having strong binding activity to GPC3 were obtained.
実施例7
抗GPC3抗体のアイソタイプの決定、および精製
アイソタイプは、Immunopure Monoclonal Antibody Isotyping Kit I (PIERCE社)を用いた抗原依存的ELISAにより決定した。抗体の精製は、FBS(Ultra low IgG)(GIBCO BRL社)を添加したHAT培地にて培養したハイブリドーマの培養上清を、Hi Trap ProteinG HP(Amersham社)に吸着させた後、結合バッファ(20mM Sodium phosphate (pH7.0))にて洗浄後、溶出バッファ(0.1M Glycine-HCl (pH2.7))で溶出した。溶出液は直ちに中和バッファ(1M Tris-HCl(pH9.0))で中和した。PBSで一昼夜透析を行いバッファ置換した。
Example 7
Determination of the isotype of the anti-GPC3 antibody and the purified isotype were determined by antigen-dependent ELISA using Immunopure Monoclonal Antibody Isotyping Kit I (PIERCE). For antibody purification, the culture supernatant of hybridoma cultured in HAT medium supplemented with FBS (Ultra low IgG) (GIBCO BRL) was adsorbed to Hi Trap Protein G HP (Amersham), and then binding buffer (20 mM). After washing with sodium phosphate (pH 7.0), elution was performed with an elution buffer (0.1 M Glycine-HCl (pH 2.7)). The eluate was immediately neutralized with a neutralization buffer (1M Tris-HCl (pH 9.0)). Dialysis was performed overnight with PBS to replace the buffer.
実施例8
ELISAによる結合活性の評価
取得された抗GPC3抗体の結合活性を簡便に評価する為、可溶型GPC3コアタンパク質を固相化したイムノプレートに対する抗体濃度依存的な結合を検出した。精製抗体を10μg/mLから3倍ずつ12段階に希釈したものを加え、2次抗体として抗マウスIgG抗体を添加し、SIGMA104による発色を行った。発色の程度は発色時間により変化するので、データは正確に1時間後に測定したものを解析した。各抗体は全て濃度依存的な発色を示した。抗体濃度と発色の程度との相関をプロットし、解析ソフトGraphPad Prismを用いて近似曲線を作成し、そのEC50値を結合活性の指標として決定した。図16に全クローンのEC50値を示した。
Example 8
Evaluation of binding activity by ELISA In order to conveniently evaluate the binding activity of the obtained anti-GPC3 antibody, antibody concentration-dependent binding to an immunoplate on which soluble GPC3 core protein was immobilized was detected. The purified antibody was diluted 3 times from 10 μg / mL to 12 levels, anti-mouse IgG antibody was added as a secondary antibody, and color development with SIGMA104 was performed. Since the degree of color development varies depending on the color development time, the data were analyzed exactly after 1 hour. Each antibody showed concentration-dependent color development. The correlation between the antibody concentration and the degree of color development was plotted, an approximate curve was created using the analysis software GraphPad Prism, and the EC50 value was determined as an index of binding activity. FIG. 16 shows EC50 values of all clones.
実施例9
フローサイトメトリによる結合活性の評価
1mM EDTA pH8.0 (GIBCO社)/ PBSにて細胞を剥離し、1x106細胞/mLになるようにFACS バッファ (1% FBS/PBS)に懸濁した。100μL/ウエルとなるようにMultiscreen - HV Filter Plates (Millipor社)に分注し、遠心操作にて上清を除去した。適当な濃度に希釈した抗GPC3抗体を加え、氷上にて30分間反応させた。細胞をFACS バッファにて1回洗浄し、FITC標識抗マウスIgG抗体を添加し、氷上にて30分間反応させた。反応後、500rpmで1分間遠心し、上清を除き、FACS バッファ 400μLに懸濁し、フローサイトメトリーに供した。フローサイトメーターはEPICS ELITE ESP (Beckman Coulter)を用いた。前方散乱光(forward scatter)および側方散乱光(side scatter)のヒストグラムにて生細胞集団にゲートを設定した。図1に示すように抗GPC3抗体(M3C11、M11F1)はGPC3を発現させたCHO細胞に強く結合し、親株であるCHO細胞には結合しない事から、細胞膜上に提示されたGPC3に特異的に結合する事が判明した。また、肝癌細胞株であるHepG2(ATCCより購入)、HuH-7(ヒューマンサイエンス研究資源バンクより購入)に対して結合を示したことから、肝細胞癌を特異的に認識する可能性が示された。可溶型GPC3免疫マウス由来クローンのフローサイトメトリによる結合活性については抗体濃度5μg/mLにおけるヒストグラムのX-mode値を図16に示す。
Example 9
Evaluation of binding activity by flow cytometry
The cells were detached with 1 mM EDTA pH 8.0 (GIBCO) / PBS and suspended in FACS buffer (1% FBS / PBS) to 1 × 10 6 cells / mL. The solution was dispensed to Multiscreen-HV Filter Plates (Millipor) at 100 μL / well, and the supernatant was removed by centrifugation. Anti-GPC3 antibody diluted to an appropriate concentration was added and allowed to react on ice for 30 minutes. The cells were washed once with FACS buffer, FITC-labeled anti-mouse IgG antibody was added, and reacted on ice for 30 minutes. After the reaction, the mixture was centrifuged at 500 rpm for 1 minute, the supernatant was removed, suspended in 400 μL of FACS buffer, and subjected to flow cytometry. EPICS ELITE ESP (Beckman Coulter) was used as the flow cytometer. A gate was set on the live cell population in a histogram of forward scatter and side scatter. As shown in FIG. 1, anti-GPC3 antibodies (M3C11, M11F1) bind strongly to CHO cells expressing GPC3, but do not bind to the parent CHO cell, and therefore specifically to GPC3 displayed on the cell membrane. It turns out that they combine. In addition, binding to the hepatoma cell lines HepG2 (purchased from ATCC) and HuH-7 (purchased from the Human Science Research Resource Bank) showed the possibility of specifically recognizing hepatocellular carcinoma. It was. FIG. 16 shows the X-mode value of the histogram at the antibody concentration of 5 μg / mL for the binding activity by flow cytometry of clones derived from soluble GPC3 immunized mice.
実施例10
競合ELISAによるエピトープ分類
得られた抗体についてエピトープによる分類を行う為、競合ELISAを実施した。抗体のビオチン化はBiotin Labeling Kit(Roche社)を用いて行った。可溶型GPC3コアタンパク質を1μg/mLとなるようにコーティングバッファで希釈したものを100μL/ウエルとなるように加え、一晩4℃で保管しコーティングした。翌日200μLの基質バッファを加えブロッキングを行った。4℃で一晩以上放置したプレートへ抗GPC3抗体を100μL/ウエルとなるように加え、室温で1時間反応させた。その後プレートの洗浄なしに10μg/mLのビオチン標識した抗GPC3抗体10μLを加えさらに1時間反応させた。300μL/ウエルのリンスバッファで3回洗浄し、希釈バッファで1000倍に希釈したAP-ストレプトアビジンコンジュゲート(ZYMED社)を100μL/ウエルとなるように加え、室温で1時間反応させた。300μL/ウエルのリンスバッファで5回洗浄し、SIGMA104を1mg/mLとなるように基質バッファで希釈したものを100μL/ウエルとなるように加えた。1時間室温でインキュベートした後、吸光度(405nm, 参照波長 655nm)を測定した。
Example 10
Epitope classification by competitive ELISA In order to classify the obtained antibodies by epitope , a competitive ELISA was performed. The biotinylation of the antibody was performed using Biotin Labeling Kit (Roche). A soluble GPC3 core protein diluted with a coating buffer to 1 μg / mL was added to 100 μL / well, and stored overnight at 4 ° C. for coating. The next day, 200 μL of substrate buffer was added for blocking. Anti-GPC3 antibody was added at 100 μL / well to a plate that had been left overnight at 4 ° C. and allowed to react at room temperature for 1 hour. Thereafter, 10 μL of 10 μg / mL biotin-labeled anti-GPC3 antibody was added without washing the plate, and the mixture was further reacted for 1 hour. After washing 3 times with 300 μL / well rinse buffer, AP-streptavidin conjugate (ZYMED) diluted 1000-fold with dilution buffer was added to 100 μL / well and allowed to react at room temperature for 1 hour. The plate was washed 5 times with 300 μL / well rinse buffer, and SIGMA104 diluted with substrate buffer to 1 mg / mL was added to 100 μL / well. After incubation at room temperature for 1 hour, the absorbance (405 nm,
図2に競合ELISAの結果を示す。ビオチン化抗体の結合を50%以上競合的に阻害した抗体については、エピトープが立体的に近傍であると判断した。8種類のビオチン化抗体の結合に対する競合的な発色の阻害のパターンによりグループ分けした結果、可溶型GPC3免疫マウス由来の11クローンは5つのグループ(a, b, c, d, e)に分類された(図16)。 FIG. 2 shows the result of the competitive ELISA. For antibodies that competitively inhibited biotinylated antibody binding by 50% or more, the epitope was judged to be sterically close. As a result of grouping by the pattern of competitive color development inhibition for the binding of 8 types of biotinylated antibodies, 11 clones derived from soluble GPC3 immunized mice were classified into 5 groups (a, b, c, d, e) (FIG. 16).
実施例11
ウエスタンブロッティングによるエピトープ分類
可溶型GPC3コアタンパク質を還元条件下にて10%SDS-PAGE mini (TEFCO社)にチャージし電気泳動後、Trans−Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell (BIO-RAD社)を用いてイモビロン-P(Millipore社)へ移した。膜をTBS-T(0.05% Tween20, TBS)で軽く洗った後、5%スキムミルク入りTBS-Tで1時間振とうした。TBS-Tで約10分間振とうした後、1%スキムミルク入りTBS-Tで希釈した各抗GPC3抗体を加え1時間振とうした。TBS-Tで洗った後1%スキムミルク入りTBS-Tで希釈したHRP-抗マウスIgG抗体(Amersham社)で1時間振とう後、TBS-Tで洗った。発色はECL-Plus (Amersham社)を用いて行い、Hyperfilm ECL(Amersham社)を用いて検出した。
Example 11
Epitope classification by Western blotting Soluble GPC3 core protein was charged to 10% SDS-PAGE mini (TEFCO) under reducing conditions, electrophoresed, and then Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell (BIO-RAD) Was transferred to Immobilon-P (Millipore). The membrane was lightly washed with TBS-T (0.05% Tween20, TBS) and then shaken with TBS-T containing 5% skim milk for 1 hour. After shaking with TBS-T for about 10 minutes, each anti-GPC3 antibody diluted with TBS-T containing 1% skim milk was added and shaken for 1 hour. After washing with TBS-T, the mixture was shaken with HRP-anti-mouse IgG antibody (Amersham) diluted with TBS-T containing 1% skim milk for 1 hour, and then washed with TBS-T. Color development was performed using ECL-Plus (Amersham) and detected using Hyperfilm ECL (Amersham).
図3に示すように、L9G11は40kDa付近のバンドに結合することからN端側結合抗体であると判断された。M3C11は30kDa付近のバンドに結合することからC端側に結合する抗体と判断した。競合ELISAでc, d, eに属する抗体は全てN末端に結合し、a、bは全てC末端に結合した(図16)。L9G11は他のN端側結合抗体と比較してウエスタンブロッティングの検出感度が高く、N端側断片をウエスタンブロッティングにより検出するにあたって有用な抗体であると考えられた。 As shown in FIG. 3, L9G11 was determined to be an N-terminal binding antibody because it binds to a band around 40 kDa. Since M3C11 binds to a band around 30 kDa, it was determined to be an antibody that binds to the C-terminal side. In the competitive ELISA, all the antibodies belonging to c, d, and e bound to the N-terminus, and a and b all bound to the C-terminus (FIG. 16). L9G11 had higher detection sensitivity of Western blotting than other N-terminal binding antibodies, and was considered to be a useful antibody for detecting the N-terminal fragment by Western blotting.
実施例12
分泌型GPC3の検出
GPC3が358番目のアミノ酸部位、若しくは374番目のアミノ酸部位で切断される事実を見出し、分泌型GPC3が肝癌患者の血中に分泌されるという仮説を立てた。そこで分泌型GPC3を検出する為、GPC3サンドイッチELISA系を構築した。
Example 12
Detection of secreted GPC3
We found the fact that GPC3 is cleaved at amino acid position 358 or 374, and hypothesized that secreted GPC3 is secreted into the blood of patients with liver cancer. To detect secreted GPC3, a GPC3 sandwich ELISA system was constructed.
イムノプレートに10μg/mLとなるように抗GPC3抗体をコートし、基質バッファを用いてブロッキングを行った。室温で数時間後、あるいは4℃で一晩保管後、HepG2の培養上清を加え1時間室温でインキュベートした。300μL/ウェルのリンスバッファで3回洗浄後、10μg/mLとなるように希釈したビオチン標識した抗GPC3抗体を加え1時間室温でインキュベートした。300μL/ウェルのリンスバッファで3回洗浄後、AP-ストレプトアビジンを加え、1時間室温でインキュベートした。300μL/ウエルのリンスバッファで5回洗浄した後、添付のプロトコールに従いAMPAK(DAKO社)を用いて発色させ、マイクロプレートリーダーで吸光度を測定した。N端断片に結合する抗体(M6B1、M19B11、M18D4)とC端断片に結合する抗体(M3C11、M13B3、M3B8)を組み合わせ5種類のサンドイッチELISA系を構築した。いずれの組み合わせも分泌型GPC3を用いたスタンダード曲線では同等の感度を示した。HepG2の培養上清を用いて評価した結果、N端断片に結合する抗体の組み合わせで1μg/mL程度と高濃度で分泌型GPC3が検出された(図4)。C端に結合する抗体の組み合わせでは検出濃度が低かった事から、分泌型GPC3ではN端断片が優位に存在すると考えられた。 The immunoplate was coated with an anti-GPC3 antibody so that the concentration was 10 μg / mL, and blocking was performed using a substrate buffer. After several hours at room temperature or overnight at 4 ° C., the culture supernatant of HepG2 was added and incubated for 1 hour at room temperature. After washing 3 times with 300 μL / well rinse buffer, biotin-labeled anti-GPC3 antibody diluted to 10 μg / mL was added and incubated at room temperature for 1 hour. After washing 3 times with 300 μL / well rinse buffer, AP-streptavidin was added and incubated for 1 hour at room temperature. After washing 5 times with 300 μL / well rinse buffer, the color was developed using AMPAK (DAKO) according to the attached protocol, and the absorbance was measured with a microplate reader. Five types of sandwich ELISA systems were constructed by combining antibodies that bind to the N-terminal fragment (M6B1, M19B11, M18D4) and antibodies that bind to the C-terminal fragment (M3C11, M13B3, M3B8). All the combinations showed the same sensitivity in the standard curve using secretory GPC3. As a result of evaluation using the culture supernatant of HepG2, secretory GPC3 was detected at a high concentration of about 1 μg / mL with the combination of antibodies binding to the N-terminal fragment (FIG. 4). Since the detection concentration was low in the combination of antibodies binding to the C-terminal, it was considered that the N-terminal fragment predominates in secreted GPC3.
次に、抗GPC3抗体を用いてHepG2の培養上清の免疫沈降を行い、分泌型GPC3の検出を行った。N端断片に結合するM10D2を用いた場合、40kDaの分泌型GPC3が検出された(図5)。それに対しC端断片に結合するM1E7を用いた場合、分泌型GPC3は検出されなかった。取得した全GPC3抗体について免疫沈降実験を行った結果、N端断片に結合する全ての抗体は分泌型GPC3を強く検出し、C端断片に結合する抗体では検出されないか、弱く検出された(図16)。免疫沈降により分泌型GPC3を検出し得る抗体は肝細胞癌の診断用抗体として有用であると考えられる。また、分泌型GPC3を検出しにくい抗体は、ADCC活性、CDC活性を有する治療用抗体として開発する上で、血液中の分泌型GPC3にトラップされずに肝細胞癌へ移行し得る点で有用であると考えられた。 Next, the culture supernatant of HepG2 was immunoprecipitated using an anti-GPC3 antibody to detect secreted GPC3. When M10D2 binding to the N-terminal fragment was used, a 40 kDa secreted GPC3 was detected (FIG. 5). In contrast, secretory GPC3 was not detected when M1E7 bound to the C-terminal fragment was used. As a result of immunoprecipitation experiments for all the GPC3 antibodies obtained, all antibodies that bound to the N-terminal fragment detected secreted GPC3 strongly, but were not detected or weakly detected by the antibody that bound to the C-terminal fragment (Fig. 16). Antibodies capable of detecting secreted GPC3 by immunoprecipitation are considered useful as antibodies for diagnosing hepatocellular carcinoma. In addition, antibodies that are difficult to detect secretory GPC3 are useful in developing as therapeutic antibodies with ADCC activity and CDC activity, because they can migrate to hepatocellular carcinoma without being trapped by secretory GPC3 in the blood. It was thought that there was.
実施例13
抗GPC3抗体可変領域のクローニング
抗GPC3抗体産生ハイブリドーマより抽出したTotal RNAを用いて、抗GPC3抗体可変領域をRT-PCR法によって増幅した。Total RNAは、RNeasy Plant Mini Kits(QIAGEN社)を用いて1×107細胞のハイブリドーマより抽出した。1μgのTotal RNAを使用して、SMART RACE cDNA Amplification Kit(CLONTECH社)、以下の合成オリゴヌクレオチド:マウスIgG1定常領域配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドMHC-IgG1GGG CCA GTG GAT AGACAG ATG(配列番号7)マウスIgG2a定常領域配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドMHC-IgG2aCAG GGG CCA GTG GAT AGA CCG ATG(配列番号8)マウスIgG2b定常領域配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドMHC-IgG2bCAG GGG CCA GTG GAT AGA CTG ATG(配列番号9)またはマウスκ鎖定常領域塩基配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドkappaGCT CAC TGG ATG GTG GGA AGA TG(配列番号10)を用い、5’末端側遺伝子断片を増幅した。
Example 13
Cloning of anti -GPC3 antibody variable region The anti-GPC3 antibody variable region was amplified by RT-PCR using total RNA extracted from the anti-GPC3 antibody-producing hybridoma. Total RNA was extracted from a hybridoma of 1 × 10 7 cells using RNeasy Plant Mini Kits (QIAGEN). Using 1 μg of total RNA, SMART RACE cDNA Amplification Kit (CLONTECH), the following synthetic oligonucleotide: synthetic oligonucleotide complementary to mouse IgG1 constant region sequence MHC-IgG1GGG CCA GTG GAT AGACAG ATG (SEQ ID NO: 7) Synthetic oligonucleotide complementary to mouse IgG2a constant region sequence MHC-IgG2aCAG GGG CCA GTG GAT AGA CCG ATG (SEQ ID NO: 8) Synthetic oligonucleotide complementary to mouse IgG2b constant region sequence MHC-IgG2bCAG GGG CCA GTG GAT AGA CTG ATG ( The 5 ′ terminal gene fragment was amplified using the synthetic oligonucleotide kappaGCT CAC TGG ATG GTG GGA AGA TG (SEQ ID NO: 10) complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9) or mouse κ chain constant region.
逆転写反応は42℃で1時間30分間反応した。PCR溶液50μLは、5μLの10×Advantage 2PCR Buffer、5μLの10×Universal Primer A Mix、0.2mM dNTPs(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)、1μLのAdvantage 2 Polymerase Mix(以上、CLONTECH社製)、2.5μLの逆転写反応産物、10 pmoleの合成オリゴヌクレオチドMHC-IgG1、MHC-IgG2a、MHC-IgG2bまたはkappaを含有した。PCRは、94℃の初期温度にて30秒間そして94℃にて5秒間、72℃にて3分間のサイクルを5回反復し、94℃にて5秒間、70℃にて10秒間、72℃にて3分間のサイクルを5回反復し、さらに94℃にて5秒間、68℃にて10秒間、72℃にて3分間のサイクルを25回反復した。最後に反応産物を72℃で7分間加熱した。各PCR産物はQIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN社製)を用いて、アガロースゲルから精製した後、pGEM-T Easyベクター(Promega社製)へクローニングし、塩基配列を決定した。
The reverse transcription reaction was performed at 42 ° C. for 1 hour and 30 minutes. 50 μL of PCR solution is 5 μL of 10 ×
M3C11、M13B3、M1E7、M3B8、M11F1、M19B11、M6B1、M18D4、M5B9、M10D2、L9G11のH鎖可変領域の塩基配列をそれぞれ配列番号11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21に、アミノ酸配列をそれぞれ配列番号22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32に、L鎖可変領域の塩基配列を配列番号33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43に、アミノ酸配列をそれぞれ配列番号44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54に示す。 The base sequences of the H chain variable regions of M3C11, M13B3, M1E7, M3B8, M11F1, M19B11, M6B1, M18D4, M5B9, M10D2, and L9G11 are respectively SEQ ID NOS: 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 20, 21 are the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, and 32, and the base sequences of the L chain variable regions are SEQ ID NOs: 33, 34, and 35, respectively. , 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 and the amino acid sequences are shown in SEQ ID NOs: 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, respectively.
実施例14
GST融合蛋白を用いたエピトープ分類
C端断片に結合する抗体についてはエピトープの詳細な解析を行う為、段階的に短くしたGPC3C端断片ペプチドとGSTの融合タンパク質GC-1(Ser495からLys563)、GC-2(Gly510からLys563)、GC-3(Ala524からLys563)GC-4(Gly537からLys563)、GC-5(Ser550からLys563)を作製した。GPC3 C末端領域をpGEX-4T-3(Amersham社)へクローニングしGSTのC末端側にGPC3 C末端領域を連結したプラスミドDNAを構築した。プラスミドDNAをDH5αへ導入し形質転換体を得、対数増殖期にある形質転換体の培養物に1mMとなるようにIPTGを加えることによりGST融合タンパク質の発現を誘導し、2時間培養後に菌体を回収した。超音波処理により破砕後、XL-80 超遠心分離機(Beckman, ロータ 70.1Ti)を用い35,000rpmで30分遠心後の培養上清を回収し、GST Purification Modules (Amersham社)を用いて精製した。このようにして精製したGST融合タンパク質を還元条件下にてSDS-PAGEにより分離後、抗GPC3抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った(図6)。M3C11、M1E7はGC-1、2を検出し、GC-3、4、5を検出しなかった。これら抗体のエピトープは、GC-2の領域に含まれており、GC-3の領域では不十分な領域であるといえる。M3B8、M11F1はGC-1、2、3、4を検出し、GC-5を検出しなかった。これら抗体のエピトープは、GC-4の領域に含まれており、GC-5の領域では不十分な領域であるといえる。各抗体の結合し得るGST融合蛋白の最小領域について図16のウエスタンブロッティングの項に記載した。
Example 14
Epitope classification using GST fusion proteins
GPC3 C-terminal fragment peptide and GST fusion proteins GC-1 (Ser495 to Lys563), GC-2 (Gly510 to Lys563) GC-3 (Ala524 to Lys563) GC-4 (Gly537 to Lys563) and GC-5 (Ser550 to Lys563) were prepared. The GPC3 C-terminal region was cloned into pGEX-4T-3 (Amersham) to construct a plasmid DNA in which the GPC3 C-terminal region was linked to the C-terminal side of GST. Plasmid DNA is introduced into DH5α to obtain a transformant, and the expression of GST fusion protein is induced by adding IPTG to the transformant culture in the logarithmic growth phase so that the concentration becomes 1 mM. Was recovered. After disruption by sonication, the culture supernatant after centrifugation at 35,000 rpm for 30 minutes using an XL-80 ultracentrifuge (Beckman, Rotor 70.1Ti) was collected and purified using GST Purification Modules (Amersham) . The GST fusion protein thus purified was separated by SDS-PAGE under reducing conditions, and then Western blotting was performed using an anti-GPC3 antibody (FIG. 6). M3C11 and M1E7 detected GC-1 and 2, but GC-3, 4, and 5 were not detected. The epitopes of these antibodies are contained in the GC-2 region, and it can be said that the GC-3 region is insufficient. M3B8 and M11F1 detected GC-1, 2, 3, and 4, but did not detect GC-5. These antibody epitopes are contained in the GC-4 region, and it can be said that the GC-5 region is insufficient. The minimum region of GST fusion protein to which each antibody can bind is described in the section of Western blotting in FIG.
実施例15
抗GPC3マウス−ヒトキメラ抗体の作製
抗GPC3抗体のH鎖およびL鎖可変領域配列をヒトIgG1およびκ鎖定常領域配列に連結した。各抗体のH鎖可変領域の5’末端側塩基配列に相補的でコザック配列を有する合成オリゴヌクレオチドおよびNheI部位を有する3’末端側塩基配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いてPCRを行い、得られたPCR産物をヒトIgG1定常領域がpBluescript KS+ベクター(東洋紡社)に挿入されているpB-CHベクターにクローニングした。NheI部位により、マウスH鎖可変領域とヒトH鎖(γ1鎖)定常領域が連結している。作製されたH鎖遺伝子断片を発現ベクターpCXND3にクローニングした。また、各抗体のL鎖可変領域の5’末端側塩基配列に相補的でコザック配列を有する合成オリゴヌクレオチドおよびBsiWI部位を有する3’末端側塩基配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いてPCRを行い、得られたPCR産物をヒトkappa鎖定常領域がpBluescript KS+ベクター(東洋紡社)に挿入されているpB-CLベクターにクローニングした。BsiWI部位により、ヒトL鎖可変領域と定常領域が連結している。作製されたL鎖遺伝子断片を発現ベクターpUCAGクローニングした。本ベクターpUCAGは、pCXN(Niwaら、Gene 1991;108:193-200)を制限酵素BamHIで消化して得られる2.6kbpの断片をpUC19ベクター(東洋紡社)の制限酵素BamHI部位に連結し、クローニングしたベクターである。
Example 15
Preparation of anti -GPC3 mouse-human chimeric antibody The heavy chain and light chain variable region sequences of the anti-GPC3 antibody were linked to human IgG1 and κ chain constant region sequences. PCR was performed using a synthetic oligonucleotide having a Kozak sequence that was complementary to the 5 'terminal base sequence of the H chain variable region of each antibody and a synthetic oligonucleotide complementary to the 3' terminal base sequence having an NheI site, The obtained PCR product was cloned into a pB-CH vector in which a human IgG1 constant region was inserted into a pBluescript KS + vector (Toyobo). The mouse H chain variable region and the human H chain (γ1 chain) constant region are linked by the NheI site. The prepared heavy chain gene fragment was cloned into the expression vector pCXND3. In addition, PCR was performed using a synthetic oligonucleotide having a Kozak sequence complementary to the 5 ′ terminal base sequence of the L chain variable region of each antibody and a synthetic oligonucleotide complementary to the 3 ′ terminal base sequence having a BsiWI site. The PCR product obtained was cloned into the pB-CL vector in which the human kappa chain constant region was inserted into the pBluescript KS + vector (Toyobo). The human L chain variable region and the constant region are linked by the BsiWI site. The prepared L chain gene fragment was cloned into the expression vector pUCAG. This vector pUCAG was cloned by ligating the 2.6 kbp fragment obtained by digesting pCXN (Niwa et al., Gene 1991; 108: 193-200) with the restriction enzyme BamHI into the restriction enzyme BamHI site of the pUC19 vector (Toyobo). Vector.
抗GPC3マウス―ヒトキメラ抗体発現ベクターを作製するために、L鎖遺伝子断片が挿入されたpUCAGベクターを制限酵素HindIII(宝酒造社)で消化して得られる遺伝子断片をH鎖遺伝子が挿入されたpCXND3の制限酵素HindIII切断部位に連結し、クローニングした。本プラスミドは動物細胞内でネオマイシン耐性遺伝子、DHFR遺伝子、抗GPC3マウス―ヒトキメラ抗体遺伝子を発現する。 In order to produce an anti-GPC3 mouse-human chimeric antibody expression vector, the pUCAG vector into which the L chain gene fragment was inserted was digested with the restriction enzyme HindIII (Takara Shuzo Co., Ltd.), and the pCXND3 into which the H chain gene was inserted. It was ligated to the restriction enzyme HindIII cleavage site and cloned. This plasmid expresses neomycin resistance gene, DHFR gene, and anti-GPC3 mouse-human chimeric antibody gene in animal cells.
抗体を安定に発現するCHO細胞(DG44株)の作製は次のようにして行った。Gene PulserII(Bio Rad社製)を用いたエレクトロポレーション法により細胞に遺伝子を導入した。25μgの各抗GPC3マウス―ヒトキメラ抗体発現ベクターとPBSに懸濁したCHO細胞(1×107細胞/ml)の0.75mlを混合したものを氷上で10分間冷却し、キュベットに移した後に1.5kV、25μFDの容量にてパルスを与えた。室温にて10分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を、HT supplement(Invitrogen社)を1倍濃度で含むCHO-S-SFMII培地(Invitrogen社)40mLに懸濁した。同様の培地で50倍希釈溶液を作製し、96ウェル培養用プレートに100μl/ウェルで分注した。CO2インキュベーター(5%CO2)で24時間培養後、Geneticin(Invitrogen社)を0.5mg/mLになるように添加して2週間培養した。Geneticin耐性を示す形質転換細胞のコロニーが観察されたウェルの培養上清中を取り出し、IgG量について以下に示す濃度定量法で測定した。高産生細胞株を順次拡大培養し、抗GPC3マウス―ヒトキメラ抗体安定発現細胞株を取得し、大量培養を行い、培養上清を得た。各抗GPC3マウス―ヒトキメラ抗体の精製は、Hi Trap ProteinG HP(Amersham社)を用いて行った。 Preparation of CHO cells (DG44 strain) that stably expresses the antibody was performed as follows. Genes were introduced into cells by electroporation using Gene PulserII (Bio Rad). A mixture of 25 μg of each anti-GPC3 mouse-human chimeric antibody expression vector and 0.75 ml of CHO cells (1 × 10 7 cells / ml) suspended in PBS was cooled on ice for 10 minutes, transferred to a cuvette, and then 1.5 kV The pulse was given with a capacity of 25 μFD. After a 10-minute recovery period at room temperature, the electroporated cells were suspended in 40 mL of CHO-S-SFMII medium (Invitrogen) containing 1-fold concentration of HT supplement (Invitrogen). A 50-fold diluted solution was prepared with the same medium, and dispensed at 100 μl / well into a 96-well culture plate. After culturing for 24 hours in a CO 2 incubator (5% CO 2 ), Geneticin (Invitrogen) was added to a concentration of 0.5 mg / mL, followed by culturing for 2 weeks. The culture supernatant of a well in which a colony of transformed cells exhibiting geneticin resistance was observed was taken out, and the amount of IgG was measured by the following concentration determination method. High-producing cell lines were sequentially expanded and cultured to obtain an anti-GPC3 mouse-human chimeric antibody stable expression cell line, mass culture was performed, and a culture supernatant was obtained. Each anti-GPC3 mouse-human chimeric antibody was purified using Hi Trap ProteinG HP (Amersham).
実施例16
補体依存性細胞障害活性(CDC活性)の測定16.1 ヒトアルブミン・ベロナール・バッファ(HAVB)の作製
NaCl(特級、和光純薬工業株式会社)12.75 g、Na-バルビタール(特級、和光純薬工業株式会社)0.5625 g、バルビタール(特級、和光純薬工業株式会社)0.8625 gをミリQ水に溶解し200 mLとした後、オートクレーブ処理(121℃、20分間)した。オートクレーブ処理した100 mLの温ミリQ水を加え、pH7.43を確認した(推奨pH7.5)。これを5×ベロナールバッファとした。CaCl2・2H2O(特級、純正化学株式会社)0.2205 gを50 mLミリQ水に溶解し0.03 mol/Lとし、CaCl2溶液とした。MgCl2・6H2O(特級、純正化学株式会社)1.0165 gを50 mLミリQ水に溶解し0.1 mol/Lとし、MgCl2溶液とした。5×ベロナールバッファ100 mL、ヒト血清アルブミン(ブミネート(登録商標)25%、ヒト血清アルブミン濃度250 mg/mL、バクスター株式会社)4 mL、CaCl2溶液2.5 mL、MgCl2溶液 2.5 mL、KCl(特級、純正化学株式会社)0.1 g、グルコース (D(+)-グルコース、ブドウ糖無水、特級、和光純薬工業株式会社) 0.5 gをミリQ水に溶解し500 mLとした。これをHAVBとした。ろ過滅菌後、設定温度5℃にて保存した。
Example 16
Measurement of complement-dependent cytotoxic activity (CDC activity) 16.1 Preparation of human albumin, veronal buffer (HAVB)
NaCl (special grade, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 12.75 g, Na-barbital (special grade, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 0.5625 g, barbital (special grade, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 0.8625 g are dissolved in Milli-Q water. After making it 200 mL, it was autoclaved (121 ° C., 20 minutes).
16.2 標的細胞の調製
実施例4で作製された全長ヒトGPC3発現CHO細胞は、10%FBSと0.5mg/mL Geneticin(GIBCO)を添加したα-MEM核酸(+)培地(GIBCO)で培養し、細胞剥離緩衝液(InvitrogenCorp)を用いてディッシュから剥離して、96ウェル平底プレート(Falcon)の各ウェルに1×104細胞/ウェルで分注し、3日間培養した。培養後、5.55MBqのクロム-51を加え、5%炭酸ガスインキュベータ中37℃ 1時間培養し、この細胞をHAVBで2回洗浄し、50μLのHAVBを加え標的細胞とした。
16.2 Preparation of target cells Full-length human GPC3-expressing CHO cells prepared in Example 4 were cultured in α-MEM nucleic acid (+) medium (GIBCO) supplemented with 10% FBS and 0.5 mg / mL Geneticin (GIBCO). Then, the cells were detached from the dish using a cell detachment buffer (Invitrogen Corp), dispensed at 1 × 10 4 cells / well into each well of a 96-well flat bottom plate (Falcon), and cultured for 3 days. After culturing, 5.55 MBq of chromium-51 was added and cultured in a 5% carbon dioxide incubator at 37 ° C. for 1 hour. The cells were washed twice with HAVB, and 50 μL of HAVB was added to serve as target cells.
16.3 クロム遊離試験(CDC活性)
各キメラ抗体をHAVBで希釈して40μg/mLの抗体溶液とした。標的細胞に抗体溶液を50 μLずつ添加し、氷上にて15分間静置した。続いて、各ウェルにHAVBにて希釈した、健常者ボランティア末梢血由来ヒト血清を終濃度25%になるよう100 μLずつ添加し(抗体の終濃度10μg/mL)、5%炭酸ガスインキュベーター中に37℃で90分間静置した。プレートを遠心分離後、各ウェルより上清を100μLずつ回収し、ガンマカウンターにて放射活性を測定した。下式により特異的クロム遊離率を求めた。
特異的クロム遊離率(%)= (A-C)×100/(B-C)
Aは各ウェルにおける放射活性(cpm)、Bは標的細胞に2% NP-40水溶液(Nonidet P-40、Code No.252-23、ナカライテスク株式会社)を100 μL、HAVBを50 μL添加したウェルにおける放射活性(cpm)の平均値、Cは標的細胞にHAVBを150 μL添加したウェルにおける放射活性(cpm)の平均値を示す。試験は三重に行い、CDC活性(%)について平均値および標準偏差を算出した。
16.3 Chromium release test (CDC activity)
Each chimeric antibody was diluted with HAVB to obtain a 40 μg / mL antibody solution. 50 μL of the antibody solution was added to each target cell and allowed to stand on ice for 15 minutes. Subsequently, 100 μL each of human serum derived from healthy volunteers' peripheral blood diluted in HAVB was added to each well to a final concentration of 25% (
Specific chromium release rate (%) = (AC) x 100 / (BC)
A is radioactivity (cpm) in each well, B is 100 μL of 2% NP-40 aqueous solution (Nonidet P-40, Code No.252-23, Nacalai Tesque, Inc.) and 50 μL of HAVB are added to the target cells. Average value of radioactivity (cpm) in the well, C indicates the average value of radioactivity (cpm) in the well in which 150 μL of HAVB was added to the target cells. The test was performed in triplicate, and the average value and standard deviation were calculated for CDC activity (%).
その結果を図7に示した。9種類の抗GPC3キメラ抗体のうち、C末端認識抗体であるM3B8とM11F1がGPC3発現CHO細胞に対し強いCDC活性を示したのに対し、その他の抗体ではCDC活性が認められなかった。M3B8とM11F1はCompetition ELISAにおいて「b」と呼ばれるグループに属しており、強いCDC活性を示すのに重要なエピトープを見出す事ができた。 The results are shown in FIG. Among the 9 types of anti-GPC3 chimeric antibodies, C3 terminal recognition antibodies M3B8 and M11F1 showed strong CDC activity against GPC3-expressing CHO cells, whereas other antibodies did not show CDC activity. M3B8 and M11F1 belonged to a group called “b” in the competition ELISA, and we were able to find an epitope important for showing strong CDC activity.
実施例17
ヒト末梢血由来PBMCを用いたADCC活性の測定17.1 ヒトPBMC溶液の調製
健常人よりヘパリン加採血した末梢血を、PBS(-)で2倍に希釈し、Ficoll-Paque TM PLUS (Amersham社)に重層した。これを遠心(500×g、30分間、20℃)した後、単核球画分である中間層を分取した。3回洗浄後、10% FBS/RPMIに懸濁し、ヒトPBMC溶液とした。
Example 17
Measurement of ADCC activity using PBMC derived from human peripheral blood 17.1 Preparation of human PBMC solution Peripheral blood sampled with heparin from healthy individuals was diluted 2-fold with PBS (-) and Ficoll-Paque ™ PLUS (Amersham) ). This was centrifuged (500 × g, 30 minutes, 20 ° C.), and the intermediate layer, which was a mononuclear cell fraction, was collected. After washing 3 times, it was suspended in 10% FBS / RPMI to obtain a human PBMC solution.
17.2 標的細胞の調製
10%FBS/RPMI1640培地で培養したHepG2細胞を、トリプシン-EDTA(Invitrogen社)を用いてディッシュから剥離し、96ウェルU字底プレート(Falcon)の各ウェルに1×104細胞/ウェルで分注し、2日間培養した。実施例4で作製された全長ヒトGPC3発現CHO細胞は、10%FBSと0.5mg/mL Geneticin(GIBCO)を添加したα-MEM核酸(+)培地(GIBCO)で培養し、細胞剥離緩衝液(Invitrogen Corp)を用いてディッシュから剥離して、96ウェル平底プレート(Falcon)の各ウェルに1×104細胞/ウェルで分注し、3日間培養した。両細胞は培養後、それぞれ5.55MBqのクロム-51を加え、5%炭酸ガスインキュベータ中37℃で1時間培養し、この細胞を培地で1回洗浄し、50μLの10% FBS/RPMI 1640培地を加え標的細胞とした。
17.2 Target cell preparation
HepG2 cells cultured in 10% FBS / RPMI1640 medium were detached from the dish using trypsin-EDTA (Invitrogen) and distributed to each well of a 96-well U-bottom plate (Falcon) at 1 × 10 4 cells / well. Note and cultured for 2 days. The full length human GPC3-expressing CHO cells prepared in Example 4 were cultured in α-MEM nucleic acid (+) medium (GIBCO) supplemented with 10% FBS and 0.5 mg / mL Geneticin (GIBCO), and a cell detachment buffer ( Invitrogen Corp.) was detached from the dish and dispensed at 1 × 10 4 cells / well into each well of a 96-well flat bottom plate (Falcon) and cultured for 3 days. After culturing both cells, 5.55 MBq of chromium-51 is added to each cell and cultured in a 5% carbon dioxide incubator for 1 hour at 37 ° C. The cells are washed once with medium, and 50 μL of 10% FBS / RPMI 1640 medium is added. In addition, target cells were obtained.
17.3 クロム遊離試験(ADCC活性)
標的細胞に各濃度に調製した抗体溶液50μLを添加し、氷上で15分反応させた後に、ヒトPBMC溶液100μL(5×105細胞/ウェル)を加え、5%炭酸ガスインキュベータ中37℃4時間培養し、培養後、プレートを遠心分離し、培養上清100μL中の放射活性をガンマカウンターで測定した。下式により特異的クロム遊離率を求めた。
特異的クロム遊離率(%)=(A-C)×100/(B-C)
Aは各ウェルにおける放射活性(cpm)の平均値、Bは標的細胞に2% NP-40水溶液(Nonidet P-40、Code No.252-23、ナカライテスク株式会社)を100 μL、10%FBS/RPMI培地を50 μL添加したウェルにおける放射活性(cpm)の平均値、Cは標的細胞に10%FBS/RPMI培地を150 μL添加したウェルにおける放射活性(cpm)の平均値を示す。試験は三重に行い、ADCC活性(%)について平均値および標準偏差を算出した。その結果を図8に示した。9種類の抗GPC3キメラ抗体のうち、C末端認識抗体が強いADCC活性を示す傾向が認められた。
17.3 Chromium release test (ADCC activity)
After adding 50 μL of the antibody solution prepared at each concentration to the target cells and reacting on ice for 15 minutes, add 100 μL of human PBMC solution (5 × 10 5 cells / well), and in a 5% carbon dioxide incubator at 37 ° C. for 4 hours. After culturing, the plate was centrifuged, and the radioactivity in 100 μL of the culture supernatant was measured with a gamma counter. The specific chromium release rate was calculated by the following formula.
Specific chromium release rate (%) = (AC) x 100 / (BC)
A is the average value of radioactivity (cpm) in each well, B is 100 μL of 2% NP-40 aqueous solution (Nonidet P-40, Code No.252-23, Nacalai Tesque, Inc.), 10% FBS The average value of radioactivity (cpm) in wells to which 50 μL of / RPMI medium was added, and C represents the average value of radioactivity (cpm) in wells to which 150 μL of 10% FBS / RPMI medium was added to target cells. The test was performed in triplicate, and the average value and standard deviation were calculated for ADCC activity (%). The results are shown in FIG. Among 9 types of anti-GPC3 chimeric antibodies, the C-terminal recognition antibody tended to show strong ADCC activity.
実施例18
GC-3の免疫およびハイブリドーマの選抜
得られた抗GPC3抗体のうち、M11F1、M3B8のみが強いCDC活性を示したことから、CDC活性にはエピトープ依存性があることが判明した。ADCC活性、CDC活性を併せもつ抗体の取得を目的とし、M11F1、M3B8のエピトープを含むGST融合タンパク質であるGC-3を用いて免疫を行った。GC-3は上記方法により大量に精製し、Superdex75(Amersham社)を用いてゲルろ過を行い、バッファをPBSに置換したものを免疫蛋白として使用した。Balb/c (日本チャールズリバーより購入)3匹、MRL/lpr 3匹を、上記方法に従いGC-3で免疫した。初回免疫にはGC-3を100μg/headとなるように調製し、FCAを用いてエマルジョン化したものを皮下に投与した。2週間後に50μg/headとなるように調製したものをFIAでエマルジョン化したものを皮下に投与した。5回免疫の後、全マウスに対し最終免疫(50μg/head)を尾静脈内に行った。細胞融合を行い、可溶型GPC3コアタンパク質を固相化したイムノプレートを用いたELISAによりスクリーニングを行った。陽性クローンについては限界希釈法によりモノクローン化した。その結果、GPC3に対して強い結合活性を有する抗体を5クローン(GC199、GC202、GC33、GC179、GC194)取得した。
Example 18
Among the anti-GPC3 antibodies obtained by immunization with GC-3 and selection of hybridomas , only M11F1 and M3B8 showed strong CDC activity, indicating that CDC activity is epitope-dependent. For the purpose of obtaining an antibody having both ADCC activity and CDC activity, immunization was performed using GC-3 which is a GST fusion protein containing epitopes of M11F1 and M3B8. GC-3 was purified in large quantities by the above method, gel filtration was performed using Superdex75 (Amersham), and the buffer was replaced with PBS and used as an immune protein. Three Balb / c (purchased from Nippon Charles River) and three MRL / lpr were immunized with GC-3 according to the method described above. For initial immunization, GC-3 was prepared to 100 μg / head and emulsified with FCA and administered subcutaneously. What was prepared so that it might become 50 microgram /
ハイブリドーマの培養上清よりHi Trap ProteinG HPを用いて抗体を精製し、上記方法に従い解析を行った。可溶型GPC3コアタンパク質を固相化したイムノプレートを用いたELISAによりEC50値を算出し、フローサイトメトリにより5μg/mLでのヒストグラムのX-mode値を測定した(図17)。競合ELISAによるエピトープ分類の結果、bに属するもの(GC199、GC202、GC33)と新しいエピトープグループf(GC179、GC194)に分類された。GST融合タンパク質を用いたエピトープ分類の結果、GC199、GC202、GC33はGC-1、2、3、4を検出し、GC-5を検出しなかった。これら抗体のエピトープは、M11F1、M3B8のエピトープと同様に、GC-4の領域に含まれており、GC-5の領域では不十分な領域であるといえる。一方、GC179、GC194はGC-1、2、3を検出し、GC-4、5を検出しなかった。これら抗体のエピトープは、GC-3の領域に含まれており、GC-4の領域では不十分な領域であるといえる。各抗体の結合し得るGST融合蛋白の最小領域について図17のウエスタンブロッティングの項に記載した。 The antibody was purified from the culture supernatant of the hybridoma using Hi Trap Protein G HP and analyzed according to the above method. EC50 values were calculated by ELISA using an immunoplate on which soluble GPC3 core protein was immobilized, and the X-mode value of the histogram at 5 μg / mL was measured by flow cytometry (FIG. 17). As a result of epitope classification by competitive ELISA, it was classified into those belonging to b (GC199, GC202, GC33) and new epitope group f (GC179, GC194). As a result of epitope classification using the GST fusion protein, GC199, GC202, and GC33 detected GC-1, 2, 3, and 4 and did not detect GC-5. Similar to the epitopes of M11F1 and M3B8, these antibody epitopes are contained in the GC-4 region, and the GC-5 region is insufficient. On the other hand, GC179 and GC194 detected GC-1, 2, and 3 and did not detect GC-4 and 5. The epitopes of these antibodies are contained in the GC-3 region, and it can be said that the region of GC-4 is insufficient. The minimum region of GST fusion protein to which each antibody can bind is described in the section of Western blotting in FIG.
GC199、GC202、GC33、GC179、GC194について上記方法に従いH鎖、L鎖の可変領域をクローニングし、配列を決定した。GC194のL鎖については2種類の配列がクローニングされた。GC199、GC202、GC33、GC179、GC194のH鎖可変領域の塩基配列をそれぞれ配列番号55、56、57、58、59に、アミノ酸配列をそれぞれ配列番号60、61、62、63、64に示す。GC199、GC202、GC33、GC179、GC194(1)、GC194(2)のL鎖可変領域の塩基配列をそれぞれ配列番号65、66、67、68、69、70に、アミノ酸配列をそれぞれ配列番号71、72、73、74、75、76に示す。 For GC199, GC202, GC33, GC179, and GC194, the variable regions of the H chain and L chain were cloned according to the above method, and the sequences were determined. Two types of sequences were cloned for the L chain of GC194. The nucleotide sequences of the heavy chain variable regions of GC199, GC202, GC33, GC179, and GC194 are shown in SEQ ID NOs: 55, 56, 57, 58, and 59, respectively, and the amino acid sequences are shown in SEQ ID NOs: 60, 61, 62, 63, and 64, respectively. The base sequence of the L chain variable region of GC199, GC202, GC33, GC179, GC194 (1), GC194 (2) is SEQ ID NO: 65, 66, 67, 68, 69, 70, respectively, and the amino acid sequence is SEQ ID NO: 71, respectively. 72, 73, 74, 75, 76.
さらに、これらのアミノ酸配列を既知の抗体のアミノ酸配列のデータベースと比較して相同性を調べることにより、CDR領域を以下のとおり決定した。 Furthermore, by comparing these amino acid sequences with a database of known antibody amino acid sequences to examine homology, the CDR regions were determined as follows.
実施例19
マウス骨髄由来エフェクター細胞を用いたADCC活性の測定19.1 マウス骨髄由来エフェクター細胞溶液の調製
SCIDマウス(日本クレア・オス・10週齢)の大腿骨から骨髄細胞を採取し、10% FBS/RPMI 1640培地中5×105個/mLとなるよう懸濁し、マウスGM-CSF(PeproTech)およびヒトIL-2(PeproTech)をそれぞれ10ng/mL、50ng/mLとなるよう添加し、5%炭酸ガスインキュベータ中37℃で5日培養した。培養後スクレーパーではがして培地で1回洗浄し、10% FBS/RPMI 1640培地中5×106/mLとなるよう懸濁し、マウス骨髄由来エフェクター細胞溶液とした。
Example 19
Measurement of ADCC activity using mouse bone marrow derived effector cells 19.1 Preparation of mouse bone marrow derived effector cell solution
Bone marrow cells were collected from the femur of SCID mice (Claire male, Japan, 10 weeks old), suspended in 10% FBS / RPMI 1640 medium at 5 × 10 5 cells / mL, and mouse GM-CSF (PeproTech) And human IL-2 (PeproTech) were added at 10 ng / mL and 50 ng / mL, respectively, and cultured at 37 ° C. in a 5% carbon dioxide incubator for 5 days. After culturing, it was peeled off with a scraper, washed once with a medium, suspended in 10% FBS / RPMI 1640 medium at 5 × 10 6 / mL, and used as a mouse bone marrow-derived effector cell solution.
19.2 標的細胞の調製
ヒト肝癌細胞株HuH-7は10%FBS(ThermoTrace社製)を含むDMEM培地(SIGMA社製)にて維持継代し、Cell Dissociation Buffer (Invitrogen社)を用いてディッシュから剥離し、96ウェルU字底プレート(Falcon)の各ウェルに1×104細胞/ウェルで分注し、1日間培養した。培養後、5.55MBqのクロム-51を加え、5%炭酸ガスインキュベータ中37℃で1時間培養し、この細胞を培地で1回洗浄し、50μLの10%FBS/RPMI1640培地を加え標的細胞とした。
19.2 Preparation of target cells The human hepatoma cell line HuH-7 is maintained and subcultured in DMEM medium (SIGMA) containing 10% FBS (ThermoTrace) and dished using Cell Dissociation Buffer (Invitrogen). And then dispensed to each well of a 96-well U-shaped bottom plate (Falcon) at 1 × 10 4 cells / well and cultured for 1 day. After culturing, 5.55 MBq of chromium-51 was added and cultured in a 5% carbon dioxide incubator for 1 hour at 37 ° C. The cells were washed once with medium, and 50 μL of 10% FBS / RPMI1640 medium was added to serve as target cells. .
19.3 クロム遊離試験(ADCC活性)
標的細胞に各濃度に調製した抗体溶液50μLを添加し、氷上で15分反応させた後に、マウス骨髄由来エフェクター細胞溶液100μL(5×105 細胞/ウェル)を加え、5%炭酸ガスインキュベータ中37℃4時間培養し、培養後、プレートを遠心分離し、培養上清100μL中の放射活性をガンマカウンターで測定した。下式により特異的クロム遊離率を求めた。
特異的クロム遊離率(%)=(A-C)×100/(B-C)
Aは各ウェルにおける放射活性(cpm)の平均値、Bは標的細胞に2% NP-40水溶液(Nonidet P-40、Code No.252-23、ナカライテスク株式会社)を100 μL、10%FBS/RPMI培地を50 μL添加したウェルにおける放射活性(cpm)の平均値、Cは標的細胞に10%FBS/RPMI培地を150 μL添加したウェルにおける放射活性(cpm)の平均値を示す。試験は三重に行い、ADCC活性(%)について平均値および標準偏差を算出した。
19.3 Chromium release test (ADCC activity)
After adding 50 μL of the antibody solution prepared at each concentration to the target cells and reacting on ice for 15 minutes, 100 μL of mouse bone marrow-derived effector cell solution (5 × 10 5 cells / well) was added, and 37% in a 5% carbon dioxide incubator. After culturing at 4 ° C. for 4 hours, the plate was centrifuged, and the radioactivity in 100 μL of the culture supernatant was measured with a gamma counter. The specific chromium release rate was calculated by the following formula.
Specific chromium release rate (%) = (AC) x 100 / (BC)
A is the average value of radioactivity (cpm) in each well, B is 100 μL of 2% NP-40 aqueous solution (Nonidet P-40, Code No.252-23, Nacalai Tesque, Inc.), 10% FBS The average value of radioactivity (cpm) in wells to which 50 μL of / RPMI medium was added, and C represents the average value of radioactivity (cpm) in wells to which 150 μL of 10% FBS / RPMI medium was added to target cells. The test was performed in triplicate, and the average value and standard deviation were calculated for ADCC activity (%).
その結果を図9に示した。GC33抗体は0.1μg/mL以上の抗体濃度においてADCC活性を示し、GC199抗体と比較して強い活性を示すことが明らかとなった。 The results are shown in FIG. The GC33 antibody showed ADCC activity at an antibody concentration of 0.1 μg / mL or more, and was found to exhibit a stronger activity than the GC199 antibody.
実施例20
GC33抗体のヒト肝癌移植マウスモデルに対する抗腫瘍活性20.1 ヒト肝癌移植マウスモデルの作製
ヒト肝癌細胞株HuH-7は、DMEM培地とMATRIGEL(BD Bioscience社製)を1:1で含む溶液にて5×107個/mLになるように調製した。前日に抗アシアロGM1抗体(和光純薬社製、1バイアルを1mLの注射用蒸留水で溶解後4mLの生理的食塩水を添加)100μLを腹腔内へ投与したSCIDマウス(オス、5週齢)(日本クレア)の腹部皮下へ上記細胞懸濁液100μL(5×106個/マウス)を移植した。
Example 20
Antitumor activity of GC33 antibody against mouse model transplanted with human liver cancer 20.1 Preparation of mouse model transplanted with human liver cancer Human liver cancer cell line HuH-7 is a 1: 1 solution containing DMEM medium and MATRIGEL (BD Bioscience). It prepared so that it might become 5 * 10 < 7 > piece / mL. SCID mice (male, 5 weeks old) administered 100 μL intraperitoneally with anti-asialo GM1 antibody (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, 1 vial dissolved in 1 mL of distilled water for injection and added with 4 mL of physiological saline) the day before 100 μL (5 × 10 6 cells / mouse) of the above cell suspension was transplanted subcutaneously into the abdomen of (CLEA Japan).
20.2 抗体調製および投与
ヒト肝癌移植マウスモデルに対し、投与当日にPBS(−)で0.5 mg/mL(5 mg/kg投与群)および0.1 mg/mL(1 mg/kg投与群)になるように調製した抗体溶液を、細胞移植後20日目より、週に1回、3週間、10 mL/kgにて、尾静脈より投与した。陰性対照として、PBS(−)(Vehicle)を同様に週に1回、3週間、10 mL/kgにて、尾静脈より投与した。いずれの群も、1群6匹で行った。
20.2 Preparation and administration of antibodies For mouse models transplanted with human liver cancer, PBS (-) will be 0.5 mg / mL (5 mg / kg administration group) and 0.1 mg / mL (1 mg / kg administration group) on the day of administration. The antibody solution thus prepared was administered from the tail vein at 10 mL / kg once a week for 3 weeks from the 20th day after cell transplantation. As a negative control, PBS (−) (Vehicle) was similarly administered once a week for 3 weeks at 10 mL / kg from the tail vein. All groups were performed with 6 animals per group.
20.3 抗腫瘍効果の評価
GC33抗体のヒト肝癌移植マウスモデルにおける抗腫瘍効果については腫瘍体積の経時変化および最終投与日より一週間後の腫瘍重量で評価した。腫瘍体積は以下の式にて算出した。
腫瘍体積=長径×短径×短径/2
その結果、図10に示すとおり、GC33抗体投与群ではVehicle投与群と比較して有意な腫瘍増殖の抑制が認められた。
以上より、GC33抗体がヒト肝癌移植マウスモデルに対して、抗腫瘍効果を有することが示された。
20.3 Evaluation of antitumor effects
The antitumor effect of the GC33 antibody in a mouse model transplanted with human liver cancer was evaluated based on changes in tumor volume over time and tumor weight one week after the last administration day. Tumor volume was calculated by the following formula.
Tumor volume = major axis x minor axis x minor axis / 2
As a result, as shown in FIG. 10, significant suppression of tumor growth was observed in the GC33 antibody administration group as compared to the Vehicle administration group.
From the above, it was shown that the GC33 antibody has an antitumor effect against a mouse model transplanted with human liver cancer.
実施例21
GC33マウス−ヒトキメラ抗体の作製
GC33のH鎖、L鎖は、5’末端側塩基配列に相補的でコザック配列、HindIII部位を有する合成オリゴヌクレオチド、および3’末端側塩基配列に相補的でBamHI部位を有する合成オリゴヌクレオチドを用いてPCRにより増幅した。得られたPCR産物をHindIII、BamHI消化後、ヒトIgG1定常領域がクローニングされた発現ベクターHEFgγ1、およびヒトκ鎖定常領域がクローニングされた発現ベクターHEFgκへクローニングした(Satoら、Mol Immunol. 1994;371-381)。上記方法に従いCHO細胞(DG44株)へ導入し安定発現細胞株を樹立した。培養上清よりHi Trap ProteinG HP(Amersham社)を用いて抗体を精製した。培養上清中のIgG濃度の測定は、ヤギ抗ヒトIgG (BIOSOURCE社)とヤギ抗ヒトIgG アルカリホスファターゼコンジュゲート(BIOSOURCE社)を用いたヒトIgGサンドイッチELISAを行い、市販の精製ヒトIgG(Cappel社)との比較により定量した。
Example 21
Preparation of GC33 mouse-human chimeric antibody
GC33 H and L chains use a synthetic oligonucleotide with a Kozak sequence and HindIII site that is complementary to the 5'-end base sequence, and a synthetic oligonucleotide that is complementary to the 3'-end base sequence and has a BamHI site. Amplified by PCR. The obtained PCR product was digested with HindIII and BamHI, and then cloned into an expression vector HEFgγ1 in which the human IgG1 constant region was cloned, and an expression vector HEFgκ in which the human κ chain constant region was cloned (Sato et al., Mol Immunol. 1994; 371). -381). According to the above method, the cells were introduced into CHO cells (DG44 strain) to establish a stable expression cell line. The antibody was purified from the culture supernatant using Hi Trap ProteinG HP (Amersham). The IgG concentration in the culture supernatant was measured by conducting a human IgG sandwich ELISA using goat anti-human IgG (BIOSOURCE) and goat anti-human IgG alkaline phosphatase conjugate (BIOSOURCE), and commercially available purified human IgG (Cappel) ) And quantitatively.
実施例22
GC33マウス−ヒトキメラ抗体を用いたCDC活性、ADCC活性の測定
実施例16および17に記載した方法に従ってGC33、 M3C11、およびM1E7マウス−ヒトキメラ抗体のCDC活性およびADCC活性測定を行った。標的細胞として、CDC活性は全長GPC3発現CHO細胞を、ADCC活性はHepG2をそれぞれ用いた。それぞれの結果を図11、図12に示す。いずれの実験系においてもGC33は他2抗体と比較して強いCDC活性およびADCC活性を示すことが明らかとなった。
Example 22
Measurement of CDC activity and ADCC activity using GC33 mouse-human chimeric antibody CDC activity and ADCC activity of GC33, M3C11, and M1E7 mouse-human chimeric antibodies were measured according to the methods described in Examples 16 and 17. As target cells, CDC activity used full-length GPC3-expressing CHO cells, and ADCC activity used HepG2. The respective results are shown in FIGS. In any experimental system, it was revealed that GC33 showed stronger CDC activity and ADCC activity than the other two antibodies.
実施例23
GC33のエピトープ解析
GC33についてはエピトープを詳細に決定するため、さらに短いGPC3C末端ペプチドとGSTの融合タンパク質を作製し、ウエスタンブロッティングにより解析した。作製したGST融合タンパク質に含まれるGPC3由来ペプチド配列を図13に示す。GC33はGC-4 (aa 537-563)に結合し、GC-5 (aa 550-563)に結合できない事から、エピトープがaa 537 - 550の領域を少なくとも一部含む領域であると考えられた。始めにGC-6(G N S Q Q A T P K D N E I S(配列番号93))、GC-7(G N S Q Q A T P(配列番号94))、GC-8(Q Q A T P K D N(配列番号95))、GC-9(T P K D N E I S(配列番号96))を作製した。5'端にEcoRI、3'端にSalI認識配列の切断端が付加されるように設計したフォワードオリゴDNAとリバースオリゴDNAを作製した。オリゴDNAはエスペックオリゴ株式会社に合成を委託し、C-18カートリッジ精製され、5'末端リン酸化したものを使用した。10μMのフォワードオリゴDNA 25μLと10μMのリバースオリゴDNA 25μLを混合し、94°Cで5分間の後、37°Cで10分間、室温で15分間反応させた後、4°Cで10分放置し、フォワードオリゴDNAとリバースオリゴDNAをアニールさせた。吸光度測定により濃度を決定した後、インサート:ベクターのモル比が3:1となるように、EcoRI、SalI消化したpGEX4T-3にクローニングした。塩基配列を確認した後、上記方法に従いGST融合タンパク質を調製し、Gluthatione Sepharose 4Bを用いて精製した。これを還元条件下にてSDS-PAGEにより分離し、GC33を用いるウエスタンブロッティングにより解析した。いずれのGST融合タンパク質も強くは検出できず、GC33による結合はさらにC末端側の配列が必要である事が予想された(図14)。そこで、GC-11(A T P K D N E I S T(配列番号97))、GC-12(P K D N E IS T F H(配列番号98))、GC-13(D N E I S T F H NL(配列番号99))、GC-14(E I S T F H N L G N(配列番号100))を作製し同様に評価した結果、GC-11、GC-12、GC-13がGC33により強く結合された。この結果より、GC33はGPC3のC末端544番目から553番目の配列(P K D N E I S T F H)内にそのエピトープが存在すると考えられる。
Example 23
Epitope analysis of GC33
In order to determine the epitope of GC33 in detail, a shorter GPC3C terminal peptide and GST fusion protein was prepared and analyzed by Western blotting. FIG. 13 shows a GPC3-derived peptide sequence contained in the prepared GST fusion protein. Since GC33 binds to GC-4 (aa 537-563) and cannot bind to GC-5 (aa 550-563), it was considered that the epitope was a region containing at least part of the region of aa 537-550 . First, GC-6 (GNSQQATPKDNEIS (SEQ ID NO: 93)), GC-7 (GNSQQATP (SEQ ID NO: 94)), GC-8 (QQATPKDN (SEQ ID NO: 95)), GC-9 (TPKDNEIS (SEQ ID NO: 96)) Produced. A forward oligo DNA and a reverse oligo DNA designed so that EcoRI was added to the 5 ′ end and a cut end of the SalI recognition sequence were added to the 3 ′ end were prepared. Oligo DNA was consigned to Espec Oligo Co., Ltd., purified using a C-18 cartridge and phosphorylated at the 5 ′ end.
実施例24
GC33のヒト化
公開されているKabat Database (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/kabat/) 、およびImMunoGeneTics Database (IMGT)より抗体の配列データを入手し、H鎖可変領域、L鎖可変領域に分けてホモロジー検索を行った。その結果、H鎖可変領域はDN13(Smithsonら、Mol Immunol. 1999;36:113-124)と高い相同性を持つことが分かった。また、L鎖可変領域はAccession number AB064105のhomo sapiens IGK mRNA for immunoglobulin kappa light chain VLJ region, partial cds, clone:K64と高い相同性を持つことが分かった。また、L鎖のシグナル配列についてはAB064105と相同性の高いAccession Number S40357のシグナル配列を利用した。これらのヒト抗体のフレームワーク領域(以下、FR)にGC33の相補性抗原決定領域(以下、CDR)を移植して、ヒト化抗体を作製した。
Example 24
Obtain antibody sequence data from the GC33 humanized Kabat Database (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/kabat/) and ImMunoGeneTics Database (IMGT). The homology search was performed separately for the L chain variable region. As a result, it was found that the heavy chain variable region has high homology with DN13 (Smithson et al., Mol Immunol. 1999; 36: 113-124). The L chain variable region was found to have high homology with homo sapiens IGK mRNA for immunoglobulin kappa light chain VLJ region, partial cds, clone: K64 of Accession number AB064105. The signal sequence of Accession Number S40357 having high homology with AB064105 was used for the signal sequence of the L chain. A humanized antibody was prepared by grafting a complementary antigen-determining region (hereinafter, CDR) of GC33 into the framework region (hereinafter, FR) of these human antibodies.
具体的には、50base程度の合成オリゴDNAを約20base程度ハイブリダイズするように設計し、これらの合成オリゴDNAをPCR法によりアッセンブリさせて各可変領域をコードする遺伝子を作製した。5’端の合成オリゴDNAの末端に挿入したHindIII部位、および3’端の合成オリゴDNAの末端に挿入したBamHI部位で切断し、ヒトIgG1定常領域がクローニングされた発現ベクターHEFgγ1、ヒトκ鎖定常領域がクローニングされた発現ベクターHEFgκへクローニングした(Satoら、Mol Immunol. 1994;371-381)。このようにして作製したヒト化GC33はH鎖、L鎖それぞれver.aと命名した。H鎖、L鎖ともにver.aのヒト化GC33(ver.a / ver.a)はマウスGC33可変領域の抗体(mouse / mouse)と比較して結合活性が低くかった(図15)。H鎖とL鎖についてマウスGC33配列とver.a配列をキメラに組み合わせた抗体(mouse / ver.a、ver.a / mouse)を作製し結合活性を評価した結果、ver.a / mouseで結合活性の低下が認められ、アミノ酸置換による結合活性の低下はH鎖に起因する事が判明した。そこで、H鎖の改変体ver.c、ver.f、ver.h、ver.i、ver.j、ver.kを作製した。これらの全てのヒト化GC33はマウスGC33可変領域を有するキメラ抗体と同等の結合活性を示した(図15)。ヒト化GC33H鎖可変領域ver.a、ver.c、ver.f、ver.h、ver.i、ver.j、ver.kの塩基配列を配列番号77、78、79、80、81、82、83に、アミノ酸配列を配列番号84、85、86、87、88、89、90に示す。ヒト化GC33L鎖可変領域ver.aの塩基配列を配列番号91に、アミノ酸配列を配列番号92に示す。ヒト化GC33H鎖可変領域ver.i、ver.j、ver.kでは、6番目のグルタミン酸がグルタミンに置換されているが、これらの抗体は熱安定性が顕著に増加していた。 Specifically, about 50 bases of synthetic oligo DNA were designed to hybridize about 20 bases, and these synthetic oligo DNAs were assembled by the PCR method to produce genes encoding each variable region. Expression vector HEFgγ1, which is cleaved at the HindIII site inserted at the end of the synthetic oligo DNA at the 5 ′ end and the BamHI site inserted at the end of the synthetic oligo DNA at the 3 ′ end, and the human IgG1 constant region is cloned, human kappa chain constant It was cloned into the expression vector HEFgκ in which the region was cloned (Sato et al., Mol Immunol. 1994; 371-381). The humanized GC33 thus prepared was named ver.a for each of the H and L chains. Humanized GC33 (ver.a / ver.a) of ver.a for both the H chain and L chain had lower binding activity than the mouse GC33 variable region antibody (mouse / mouse) (FIG. 15). As a result of producing antibodies (mouse / ver.a, ver.a / mouse) that combine mouse GC33 sequence and ver.a sequence in a chimera for H chain and L chain and evaluating binding activity, binding with ver.a / mouse A decrease in activity was observed, and it was found that the decrease in binding activity due to amino acid substitution was due to the H chain. Thus, H chain variants ver.c, ver.f, ver.h, ver.i, ver.j, and ver.k were prepared. All these humanized GC33s showed binding activity equivalent to that of the chimeric antibody having the mouse GC33 variable region (FIG. 15). The nucleotide sequences of humanized GC33 heavy chain variable regions ver.a, ver.c, ver.f, ver.h, ver.i, ver.j, ver.k are represented by SEQ ID NOs: 77, 78, 79, 80, 81, 82. 83, the amino acid sequences are shown in SEQ ID NOs: 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90. The nucleotide sequence of the humanized GC33 L chain variable region ver.a is shown in SEQ ID NO: 91, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 92. In the humanized GC33 heavy chain variable regions ver.i, ver.j, and ver.k, the sixth glutamic acid was replaced with glutamine, but these antibodies showed a marked increase in thermal stability.
実施例25
ヒト化GC33L鎖の改変
蛋白質の脱アミド化については一次配列依存的な脱アミド化の反応速度定数が知られており、Asn-Glyが特に脱アミド化し易い配列として知られている(Rocinsonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001;98;944-949.)。配列番号91に示されるヒト化GC33L鎖ver.a可変領域のCDR1内にあるAsn33については、一次配列がAsn-Glyであることから、脱アミド化が容易に起きやすい配列である事が予想された。
Example 25
Regarding the deamidation of the modified protein of humanized GC33 L chain , the reaction rate constant of primary sequence-dependent deamidation is known, and Asn-Gly is known as a particularly easily deamidated sequence (Rocinson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001; 98; 944-949.). Asn33 in CDR1 of the humanized GC33 L chain ver.a variable region shown in SEQ ID NO: 91 is predicted to be a sequence that easily undergoes deamidation because the primary sequence is Asn-Gly. It was.
Asn33の脱アミド化による結合活性に対する影響を評価する為に、Asn33をAspに置換した改変抗体を作製した。点変異の導入には、Quick Change Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene社)を使用した。すなわち、125ngのセンスプライマー(CTT GTA CAC AGTGAC GGA AAC ACC TAT:配列番号172)、125ngのアンチセンスプライマー(ATA GGT GTT TCC GTC ACT GTG TAC AAG:配列番号173)、5μLの10x reaction buffer、1μLのdNTP mix、10ngのヒト化GC33L鎖ver.aがクローニングされたHEFgκ、1μLのPfu Turbo DNA Polymeraseを含む50uLの反応液を用い、95℃で30秒、55℃で1分、68℃で9分からなるサイクルを12回のPCRを行った。その後制限酵素DpnIを加え37℃で2時間消化したものをキットに添付のXL1-Blueコンピテント細胞に導入し形質転換体を得た。正しく変異の導入されたクローンについて、可変領域を切り出し、再度HEFgκへクローニングし直した。これをヒト化GC33H鎖ver.kがクローニングされたHEFgγ1と共にFugene6(Roche社)を用いてCOS7細胞へ導入し、一過性に発現させた抗体を培養上清から回収した。抗ヒトIgG抗体を用いたサンドイッチELISAにより抗体濃度を定量し、可溶型GPC3コア蛋白質を固相化したイムノプレートを用いたELISAにより改変抗体の結合活性を評価した。図18に示すようにAsn33をAspに置換した改変抗体(N33D)では結合活性が消失しており、Asn33で脱アミド化が起きた場合結合活性に与える影響は大きいと考えられた。 In order to evaluate the effect of Asn33 deamidation on the binding activity, a modified antibody in which Asn33 was replaced with Asp was prepared. For the introduction of the point mutation, Quick Change Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) was used. That is, 125 ng sense primer (CTT GTA CAC AGTGAC GGA AAC ACC TAT: SEQ ID NO: 172), 125 ng antisense primer (ATA GGT GTT TCC GTC ACT GTG TAC AAG: SEQ ID NO: 173), 5 μL of 10 × reaction buffer, 1 μL of dNTP mix, HEFgκ with 10 ng of humanized GC33 L chain ver.a cloned, 50 μL reaction solution containing 1 μL of Pfu Turbo DNA Polymerase, 30 seconds at 95 ° C, 1 minute at 55 ° C, 9 minutes at 68 ° C This cycle was performed 12 times. Thereafter, a restriction enzyme DpnI was added and digested at 37 ° C. for 2 hours, and then introduced into XL1-Blue competent cells attached to the kit to obtain a transformant. The variable region was excised from the clone in which the mutation was correctly introduced, and cloned again into HEFgκ. This was introduced into COS7 cells using Fugene6 (Roche) together with HEFgγ1 in which the humanized GC33 H chain ver.k was cloned, and the transiently expressed antibody was recovered from the culture supernatant. The antibody concentration was quantified by sandwich ELISA using an anti-human IgG antibody, and the binding activity of the modified antibody was evaluated by ELISA using an immunoplate on which a soluble GPC3 core protein was immobilized. As shown in FIG. 18, in the modified antibody (N33D) in which Asn33 was substituted with Asp, the binding activity disappeared, and it was considered that the effect on binding activity was large when deamidation occurred in Asn33.
Asn33の脱アミド化を抑制する方法として、Gly34を他のアミノ酸に改変する方法が報告されている(WO03057881A1)。上記方法に従い、Quick Change Site-Directed Mutagenesis Kitを用い、Gly34をCys、Metを除く他の17アミノ酸に置換して、一連の改変抗体G34A、G34D、G34E、G34F、G34H、G34N、G34P、G34Q、G34I、G34K、G34L、G34V、G34W、G34Y、G34R、G34S、G34Tを作製した。これをCOS7細胞で一過性に発現させ、その培養上清を用いて結合活性の評価を行った。その結果、Pro(G34P)、Val(G34V)以外ではG34を他のアミノ酸に置換しても結合活性が維持されている事が判明した。 As a method for suppressing the deamidation of Asn33, a method of modifying Gly34 to another amino acid has been reported (WO03057881A1). According to the above method, using Quick Change Site-Directed Mutagenesis Kit, replacing Gly34 with 17 other amino acids except Cys and Met, a series of modified antibodies G34A, G34D, G34E, G34F, G34H, G34N, G34P, G34Q, G34I, G34K, G34L, G34V, G34W, G34Y, G34R, G34S, and G34T were prepared. This was expressed transiently in COS7 cells, and the binding activity was evaluated using the culture supernatant. As a result, it was found that, except for Pro (G34P) and Val (G34V), the binding activity was maintained even when G34 was replaced with another amino acid.
上述の改変抗体の軽鎖CDR1のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号174(G34A)、配列番号175(G34D)、配列番号176(G34E)、配列番号177(G34F)、配列番号178(G34H)、配列番号179(G34N)、配列番号180(G34T)、配列番号181(G34Q)、配列番号182(G34I)、配列番号183(G34K)、配列番号184(G34L)、配列番号185(G34S)、配列番号186(G34W)、配列番号187(G34Y)、配列番号188(G34R)、配列番号189(G34V)、配列番号190(G34P)に記載する。また、上述の改変抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号191(G34A)、配列番号192(G34D)、配列番号193(G34E)、配列番号194(G34F)、配列番号195(G34H)、配列番号196(G34N)、配列番号197(G34T)、配列番号198(G34Q)、配列番号199(G34I)、配列番号200(G34K)、配列番号201(G34L)、配列番号202(G34S)、配列番号203(G34W)、配列番号204(G34Y)、配列番号205(G34R)、配列番号206(G34V)、配列番号207(G34P)に記載する。 The amino acid sequence of the light chain CDR1 of the modified antibody described above is represented by SEQ ID NO: 174 (G34A), SEQ ID NO: 175 (G34D), SEQ ID NO: 176 (G34E), SEQ ID NO: 177 (G34F), SEQ ID NO: 178 (G34H), SEQ ID NO: 179 (G34N), SEQ ID NO: 180 (G34T), SEQ ID NO: 181 (G34Q), SEQ ID NO: 182 (G34I), SEQ ID NO: 183 (G34K), SEQ ID NO: 184 (G34L), SEQ ID NO: 185 (G34S), SEQ ID NO: 186 (G34W), SEQ ID NO: 187 (G34Y), SEQ ID NO: 188 (G34R), SEQ ID NO: 189 (G34V), and SEQ ID NO: 190 (G34P). In addition, the amino acid sequences of the light chain variable regions of the above-described modified antibodies are shown in SEQ ID NO: 191 (G34A), SEQ ID NO: 192 (G34D), SEQ ID NO: 193 (G34E), SEQ ID NO: 194 (G34F), SEQ ID NO: 195 (G34H), respectively. ), SEQ ID NO: 196 (G34N), SEQ ID NO: 197 (G34T), SEQ ID NO: 198 (G34Q), SEQ ID NO: 199 (G34I), SEQ ID NO: 200 (G34K), SEQ ID NO: 201 (G34L), SEQ ID NO: 202 (G34S) SEQ ID NO: 203 (G34W), SEQ ID NO: 204 (G34Y), SEQ ID NO: 205 (G34R), SEQ ID NO: 206 (G34V), and SEQ ID NO: 207 (G34P).
実施例26
全長ヒトGPC3発現ヒト肝癌細胞株(SK−03)の作製
抗GPC3抗体の生物活性評価用の細胞株を得るために、全長GPC3を発現するヒト肝癌細胞株の樹立を行った。
Example 26
Preparation of full-length human GPC3-expressing human liver cancer cell line (SK-03) In order to obtain a cell line for evaluating the biological activity of anti-GPC3 antibody, a human hepatoma cell line expressing full-length GPC3 was established.
PvuIで処理した1μgの全長ヒトGPC3遺伝子発現ベクターを、2μLのFuGENE(Roche社)と混合し、複合体を形成させた後に、SK-HEP-1細胞(ATCCより購入)に添加することにより、遺伝子導入を行った。CO2インキュベーターで24時間培養後、終濃度1 mg/mLのGeneticinおよび10% FBSを含むダルベッコMEM(D-MEM, SIGMA社)を用いて、GPC3発現株を選抜した。得られたGeneticin耐性コロニーを集め、限界希釈法により細胞のクローニングを行った。それぞれの細胞クローンのヒトGPC3の発現はキメラGC33抗体とFITC標識ヤギ抗ヒトIgG抗体(ICN社)を用いたフローサイトメトリにより確認し、安定発現細胞株SK-03を取得した。 By mixing 1 μg of full-length human GPC3 gene expression vector treated with PvuI with 2 μL of FuGENE (Roche) to form a complex, it was added to SK-HEP-1 cells (purchased from ATCC), Gene transfer was performed. After culturing in a CO 2 incubator for 24 hours, GPC3 expression strains were selected using Dulbecco MEM (D-MEM, SIGMA) containing Geneticin and 10% FBS at a final concentration of 1 mg / mL. The obtained Geneticin resistant colonies were collected, and the cells were cloned by the limiting dilution method. Expression of human GPC3 in each cell clone was confirmed by flow cytometry using a chimeric GC33 antibody and a FITC-labeled goat anti-human IgG antibody (ICN) to obtain a stable expression cell line SK-03.
実施例27
マウス−ヒトキメラ抗体を用いたCDC活性、ADCC活性の比較
実施例22で示したGC33、M3C11、およびM1E7マウス−ヒトキメラ抗体のCDC活性およびADCC活性を直接比較する目的で、3抗体のADCC、CDC活性の測定を同一実験系で実施例16および17に記載した方法に従って行った。標的細胞として、CDC活性は全長GPC3発現CHO細胞を、ADCC活性はSK-03をそれぞれ用いた。それぞれの結果を図19、図20に示す。いずれの実験系においてもGC33は他2抗体と比較して強いCDC活性およびADCC活性を示すことが確認された。
Example 27
Comparison of CDC activity and ADCC activity using mouse-human chimeric antibody For the purpose of directly comparing CDC activity and ADCC activity of GC33, M3C11 and M1E7 mouse-human chimeric antibodies shown in Example 22, ADCC and CDC activity of 3 antibodies Was measured according to the method described in Examples 16 and 17 in the same experimental system. As target cells, full length GPC3-expressing CHO cells were used for CDC activity, and SK-03 was used for ADCC activity. The respective results are shown in FIGS. In any experimental system, it was confirmed that GC33 showed stronger CDC activity and ADCC activity than the other two antibodies.
本発明の抗体は、細胞増殖抑制剤として、抗癌剤として、および癌の診断薬として用いることができる。 The antibody of the present invention can be used as a cell growth inhibitor, as an anticancer agent, and as a diagnostic agent for cancer.
Claims (32)
(1) 配列番号123に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号124に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号125に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3;
(2) 配列番号109に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号110に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号111に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3;
(3) 配列番号106に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号107に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号108に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3;
(4) 配列番号132に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号133に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号134に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3;
(5) 配列番号106に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号135に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号136に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3;
(6) 配列番号126に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号127に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号128に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3;
(7) 配列番号129に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号130に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号131に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3;
(8) 配列番号103に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号104に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号105に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3;
(9) 配列番号118に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号121に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号122に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3;
(10) 配列番号115に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号116に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号117に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3;
(11) 配列番号112に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号113に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号114に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3;または
(12) 配列番号118に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号119に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号120に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3
のCDR1,2および3を有する重鎖可変領域を含む抗体。 Any of the following (1)-(12);
(1) CDR1 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 123, CDR2 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 124, and CDR3 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 125;
(2) CDR1 containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 109, CDR2 containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 110, and CDR3 containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 111;
(3) CDR1 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 106, CDR2 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 107, and CDR3 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 108;
(4) CDR1 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 132, CDR2 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 133, and CDR3 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 134;
(5) CDR1 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 106, CDR2 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 135, and CDR3 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 136;
(6) CDR1 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 126, CDR2 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 127, and CDR3 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 128;
(7) CDR1 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 129, CDR2 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 130, and CDR3 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 131;
(8) CDR1 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 103, CDR2 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 104, and CDR3 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 105;
(9) CDR1 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 118, CDR2 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 121, and CDR3 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 122;
(10) CDR1 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 115, CDR2 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 116, and CDR3 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 117;
(11) CDR1 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 112, CDR2 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 113, and CDR3 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 114; or (12) SEQ ID NO: 118 CDR comprising the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1, CDR2 comprising the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 119, and CDR3 comprising the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 120
An antibody comprising a heavy chain variable region having the CDRs 1, 2 and 3.
(1) 配列番号143に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号144に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号158に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3;
(2) 配列番号143に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号144に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号145に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3;
(3) 配列番号140に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号141に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号142に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3;
(4) 配列番号167に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号168に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号169に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3;
(5) 配列番号170に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号144に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号171に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3;
(6) 配列番号159に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号160に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号161に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3;
(7) 配列番号162に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号147に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号163に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3;
(8) 配列番号164に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号165に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号166に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3;
(9) 配列番号137に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号138に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号139に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3;
(10) 配列番号155に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号156に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号157に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3;
(11) 配列番号149に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号150に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号151に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3;
(12) 配列番号146に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号147に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号148に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3;または
(13) 配列番号152に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号153に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号154に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3
のCDR1,2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体。 Any of the following (1)-(13):
(1) CDR1 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 143, CDR2 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 144, and CDR3 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 158;
(2) CDR1 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 143, CDR2 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 144, and CDR3 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 145;
(3) CDR1 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 140, CDR2 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 141, and CDR3 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 142;
(4) CDR1 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 167, CDR2 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 168, and CDR3 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 169;
(5) CDR1 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 170, CDR2 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 144, and CDR3 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 171;
(6) CDR1 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 159, CDR2 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 160, and CDR3 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 161;
(7) CDR1 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 162, CDR2 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 147, and CDR3 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 163;
(8) CDR1 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 164, CDR2 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 165, and CDR3 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 166;
(9) CDR1 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 137, CDR2 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 138, and CDR3 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 139;
(10) CDR1 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 155, CDR2 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 156, and CDR3 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 157;
(11) CDR1 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 149, CDR2 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 150, and CDR3 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 151;
(12) CDR1 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 146, CDR2 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 147, and CDR3 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 148; or (13) SEQ ID NO: 152 CDR comprising the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1, CDR2 comprising the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 153, and CDR3 comprising the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 154
An antibody comprising a light chain variable region having CDRs 1, 2 and 3.
(1) それぞれ配列番号123,124および125に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する重鎖可変領域,およびそれぞれ配列番号143,144および158に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(2) それぞれ配列番号109,110および111に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する重鎖可変領域,およびそれぞれ配列番号143,144および145に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(3) それぞれ配列番号106,107および108に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する重鎖可変領域,およびそれぞれ配列番号140,141および142に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(4) それぞれ配列番号132,133および134に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する重鎖可変領域,およびそれぞれ配列番号167,168および169に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(5) それぞれ配列番号106,135および136に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する重鎖可変領域,およびそれぞれ配列番号170,144および171に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(6) それぞれ配列番号126,127および128に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する重鎖可変領域,およびそれぞれ配列番号159,160および161に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(7) それぞれ配列番号129,130および131に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する重鎖可変領域,およびそれぞれ配列番号162,147および163に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(8) それぞれ配列番号129,130および131に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する重鎖可変領域,およびそれぞれ配列番号164,165および166に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(9) それぞれ配列番号103,104および105に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する重鎖可変領域,およびそれぞれ配列番号137,138および139に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(10) それぞれ配列番号118,121および122に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する重鎖可変領域,およびそれぞれ配列番号155,156および157に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(11) それぞれ配列番号115,116および117に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する重鎖可変領域,およびそれぞれ配列番号149,150および151に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する軽鎖可変領域,を含む抗体;
(12) それぞれ配列番号112,113および114に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する重鎖可変領域,およびそれぞれ配列番号146,147および148に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;および
(13) それぞれ配列番号118,119および120に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する重鎖可変領域,およびそれぞれ配列番号152,153および154に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体
からなる群より選択される抗体。 The following (1)-(13):
(1) a heavy chain variable region having CDRs 1, 2 and 3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 123, 124 and 125, respectively, and CDR1, comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 143, 144 and 158, respectively An antibody comprising a light chain variable region having 2 and 3;
(2) a heavy chain variable region having CDRs 1, 2 and 3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 109, 110 and 111, respectively, and CDR1, comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 143, 144 and 145, respectively An antibody comprising a light chain variable region having 2 and 3;
(3) a heavy chain variable region having CDR1, 2 and 3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 106, 107 and 108, respectively, and CDR1, comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 140, 141 and 142, respectively An antibody comprising a light chain variable region having 2 and 3;
(4) a heavy chain variable region having CDRs 1, 2 and 3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 132, 133 and 134, respectively, and CDR1, comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 167, 168 and 169, respectively. An antibody comprising a light chain variable region having 2 and 3;
(5) a heavy chain variable region having CDRs 1, 2 and 3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 106, 135 and 136, respectively, and CDR1, comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 170, 144 and 171 respectively. An antibody comprising a light chain variable region having 2 and 3;
(6) heavy chain variable regions having CDR1, 2 and 3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 126, 127 and 128, respectively, and CDR1, comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 159, 160 and 161, respectively An antibody comprising a light chain variable region having 2 and 3;
(7) a heavy chain variable region having CDRs 1, 2 and 3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 129, 130 and 131, respectively, and CDR1, comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 162, 147 and 163, respectively. An antibody comprising a light chain variable region having 2 and 3;
(8) a heavy chain variable region having CDR1, 2 and 3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 129, 130 and 131, respectively, and CDR1, comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 164, 165 and 166, respectively. An antibody comprising a light chain variable region having 2 and 3;
(9) a heavy chain variable region having CDR1, 2 and 3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 103, 104 and 105, respectively, and CDR1, comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 137, 138 and 139, respectively An antibody comprising a light chain variable region having 2 and 3;
(10) a heavy chain variable region having CDRs 1, 2 and 3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 118, 121 and 122, respectively, and CDR1, comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 155, 156 and 157, respectively An antibody comprising a light chain variable region having 2 and 3;
(11) a heavy chain variable region having CDR1, 2 and 3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 115, 116 and 117, respectively, and CDR1, comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 149, 150 and 151, respectively An antibody comprising a light chain variable region having 2 and 3;
(12) a heavy chain variable region having CDR1, 2 and 3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 112, 113 and 114, respectively, and CDR1, comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 146, 147 and 148, respectively An antibody comprising a light chain variable region having 2 and 3; and (13) a heavy chain variable region having CDRs 1, 2 and 3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 118, 119 and 120, respectively, and SEQ ID NO: 152, respectively. , 153 and 154. An antibody selected from the group consisting of antibodies comprising a light chain variable region having CDRs 1, 2 and 3 comprising the amino acid sequences described in 154 and 154.
(1) 配列番号84に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;
(2) 配列番号85に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;
(3) 配列番号86に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;
(4) 配列番号87に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;
(5) 配列番号88に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;
(6) 配列番号89に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;または
(7) 配列番号90に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;
を有する抗体。 The heavy chain variable region according to any one of the following (1) to (7):
(1) a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 84;
(2) a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 85;
(3) a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 86;
(4) a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 87;
(5) a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 88;
(6) a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 89; or (7) a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 90;
An antibody having
(1) 配列番号84に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号92に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体;
(2) 配列番号85に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号92に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体;
(3) 配列番号86に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号92に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体;
(4) 配列番号87に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号92に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体;
(5) 配列番号88に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号92に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体;
(6) 配列番号89に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号92に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体;および
(7) 配列番号90に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号92に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体;
からなる群より選択される抗体。 The following antibodies (1) to (7):
(1) an antibody comprising a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 84 and a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 92;
(2) an antibody comprising a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 85 and a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 92;
(3) an antibody comprising a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 86 and a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 92;
(4) an antibody comprising a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 87 and a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 92;
(5) an antibody comprising a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 88 and a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 92;
(6) an antibody comprising a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 89 and a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 92; and (7) comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 90 An antibody comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 92;
An antibody selected from the group consisting of:
(1) 配列番号174に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号144に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号158に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3;
(2) 配列番号175に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号144に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号158に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3;
(3) 配列番号176に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号144に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号158に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3;
(4) 配列番号177に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号144に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号158に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3;
(5) 配列番号178に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号144に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号158に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3;
(6) 配列番号179に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号144に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号158に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3;
(7) 配列番号180に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号144に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号158に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3;
(8) 配列番号181に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号144に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号158に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3;
(9) 配列番号182に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号144に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号158に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3;
(10) 配列番号183に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号144に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号158に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3;
(11) 配列番号184に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号144に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号158に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3;
(12) 配列番号185に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号144に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号158に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3;
(13) 配列番号186に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号144に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号158に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3;
(14) 配列番号187に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号144に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号158に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3;または
(15) 配列番号188に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,配列番号144に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2,および配列番号158に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3;
のCDR1,2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体。 Any of the following (1) to (15):
(1) CDR1 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 174, CDR2 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 144, and CDR3 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 158;
(2) CDR1 containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 175, CDR2 containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 144, and CDR3 containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 158;
(3) CDR1 containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 176, CDR2 containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 144, and CDR3 containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 158;
(4) CDR1 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 177, CDR2 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 144, and CDR3 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 158;
(5) CDR1 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 178, CDR2 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 144, and CDR3 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 158;
(6) CDR1 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 179, CDR2 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 144, and CDR3 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 158;
(7) CDR1 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 180, CDR2 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 144, and CDR3 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 158;
(8) CDR1 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 181, CDR2 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 144, and CDR3 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 158;
(9) CDR1 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 182, CDR2 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 144, and CDR3 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 158;
(10) CDR1 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 183, CDR2 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 144, and CDR3 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 158;
(11) CDR1 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 184, CDR2 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 144, and CDR3 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 158;
(12) CDR1 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 185, CDR2 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 144, and CDR3 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 158;
(13) CDR1 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 186, CDR2 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 144, and CDR3 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 158;
(14) CDR1 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 187, CDR2 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 144, and CDR3 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 158; or (15) SEQ ID NO: 188 A CDR comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 144, a CDR2 comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 144, and a CDR3 comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 158;
An antibody comprising a light chain variable region having CDRs 1, 2 and 3.
(1) それぞれ配列番号123,124および125に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する重鎖可変領域,およびそれぞれ配列番号174,144および158,に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(2) それぞれ配列番号123,124および125に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する重鎖可変領域,およびそれぞれ配列番号175,144および158に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(3) それぞれ配列番号123,124および125に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する重鎖可変領域,およびそれぞれ配列番号176,144および158に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(4) それぞれ配列番号123,124および125に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する重鎖可変領域,およびそれぞれ配列番号177,144および158に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(5) それぞれ配列番号123,124および125に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する重鎖可変領域,およびそれぞれ配列番号178,144および158に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(6) それぞれ配列番号123,124および125に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する重鎖可変領域,およびそれぞれ配列番号179,144および158に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(7) それぞれ配列番号123,124および125に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する重鎖可変領域,およびそれぞれ配列番号180,144および158に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(8) それぞれ配列番号123,124および125に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する重鎖可変領域,およびそれぞれ配列番号181,144および158に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(9) それぞれ配列番号123,124および125に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する重鎖可変領域,およびそれぞれ配列番号182,144および158に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(10) それぞれ配列番号123,124および125に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する重鎖可変領域,およびそれぞれ配列番号183,144および158に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(11) それぞれ配列番号123,124および125に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する重鎖可変領域,およびそれぞれ配列番号184,144および158に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(12) それぞれ配列番号123,124,および125に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する重鎖可変領域,およびそれぞれ配列番号185,144および158に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する軽鎖可変領域,を含む抗体;
(13) それぞれ配列番号123,124,および125に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する重鎖可変領域,およびそれぞれ配列番号186,144および158に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(14) それぞれ配列番号123,124および125に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する重鎖可変領域,およびそれぞれ配列番号187,144および158に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;および
(15) それぞれ配列番号123,124および125に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する重鎖可変領域,およびそれぞれ配列番号188,144および158に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1,2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体,
からなる群より選択される抗体。 The following (1)-(15):
(1) A heavy chain variable region having CDRs 1, 2 and 3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 123, 124 and 125, respectively, and CDR1 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 174, 144 and 158, respectively. An antibody comprising a light chain variable region having, 2 and 3;
(2) a heavy chain variable region having CDR1, 2 and 3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 123, 124 and 125, respectively, and CDR1, comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 175, 144 and 158, respectively An antibody comprising a light chain variable region having 2 and 3;
(3) a heavy chain variable region having CDR1, 2 and 3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 123, 124 and 125, respectively, and CDR1, comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 176, 144 and 158, respectively An antibody comprising a light chain variable region having 2 and 3;
(4) a heavy chain variable region having CDRs 1, 2 and 3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 123, 124 and 125, respectively, and CDR1, comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 177, 144 and 158, respectively. An antibody comprising a light chain variable region having 2 and 3;
(5) a heavy chain variable region having CDR1, 2 and 3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 123, 124 and 125, respectively, and CDR1, comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 178, 144 and 158, respectively An antibody comprising a light chain variable region having 2 and 3;
(6) a heavy chain variable region having CDRs 1, 2 and 3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 123, 124 and 125, respectively, and CDR1, comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 179, 144 and 158, respectively An antibody comprising a light chain variable region having 2 and 3;
(7) a heavy chain variable region having CDRs 1, 2 and 3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 123, 124 and 125, respectively, and CDR1, comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 180, 144 and 158, respectively. An antibody comprising a light chain variable region having 2 and 3;
(8) a heavy chain variable region having CDRs 1, 2 and 3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 123, 124 and 125, respectively, and CDR1, comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 181, 144 and 158, respectively. An antibody comprising a light chain variable region having 2 and 3;
(9) a heavy chain variable region having CDRs 1, 2 and 3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 123, 124 and 125, respectively, and CDR1, comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 182, 144 and 158, respectively. An antibody comprising a light chain variable region having 2 and 3;
(10) a heavy chain variable region having CDR1, 2 and 3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 123, 124 and 125, respectively, and CDR1, comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 183, 144 and 158, respectively An antibody comprising a light chain variable region having 2 and 3;
(11) a heavy chain variable region having CDRs 1, 2 and 3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 123, 124 and 125, respectively, and CDR1, comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 184, 144 and 158, respectively An antibody comprising a light chain variable region having 2 and 3;
(12) a heavy chain variable region having CDRs 1, 2 and 3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 123, 124 and 125, respectively, and CDR1 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 185, 144 and 158, respectively. , 2 and 3 light chain variable region,
(13) a heavy chain variable region having CDRs 1, 2 and 3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 123, 124 and 125, respectively, and CDR1 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 186, 144 and 158, respectively. An antibody comprising a light chain variable region having, 2 and 3;
(14) a heavy chain variable region having CDRs 1, 2 and 3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 123, 124 and 125, respectively, and CDR1, comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 187, 144 and 158, respectively. An antibody comprising a light chain variable region having 2 and 3; and (15) a heavy chain variable region having CDRs 1, 2 and 3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 123, 124 and 125, respectively, and SEQ ID NO: 188, respectively. An antibody comprising a light chain variable region having CDRs 1, 2 and 3 comprising the amino acid sequences set forth in.
An antibody selected from the group consisting of:
(1) 配列番号191に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(2) 配列番号192に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(3) 配列番号193に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(4) 配列番号194に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(5) 配列番号195に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(6) 配列番号196に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(7) 配列番号197に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(8) 配列番号198に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(9) 配列番号199に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(10) 配列番号200に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(11) 配列番号201に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(12) 配列番号202に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(13) 配列番号203に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(14) 配列番号204に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;および
(15) 配列番号205に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
を有する抗体。 A light chain variable region selected from the group consisting of the following (1) to (15):
(1) a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 191;
(2) a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 192;
(3) a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 193;
(4) a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 194;
(5) a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 195;
(6) a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 196;
(7) a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 197;
(8) a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 198;
(9) a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 199;
(10) a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 200;
(11) a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 201;
(12) a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 202;
(13) a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 203;
(14) a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 204; and (15) a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 205;
An antibody having
(1) 配列番号191に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(2) 配列番号192に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(3) 配列番号193に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(4) 配列番号194に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(5) 配列番号195に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(6) 配列番号196に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(7) 配列番号197に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(8) 配列番号198に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(9) 配列番号199に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(10) 配列番号200に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(11) 配列番号201に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(12) 配列番号202に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(13) 配列番号203に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(14) 配列番号204に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;および
(15) 配列番号205に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
および、以下の(1)〜(7)からなる群より選択される重鎖可変領域:
(1) 配列番号84に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;
(2) 配列番号85に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;
(3) 配列番号86に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;
(4) 配列番号87に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;
(5) 配列番号88に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;
(6) 配列番号89に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;および
(7) 配列番号90に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;
を有する抗体。 A light chain variable region selected from the group consisting of the following (1) to (15):
(1) a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 191;
(2) a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 192;
(3) a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 193;
(4) a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 194;
(5) a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 195;
(6) a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 196;
(7) a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 197;
(8) a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 198;
(9) a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 199;
(10) a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 200;
(11) a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 201;
(12) a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 202;
(13) a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 203;
(14) a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 204; and (15) a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 205;
And a heavy chain variable region selected from the group consisting of the following (1) to (7):
(1) a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 84;
(2) a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 85;
(3) a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 86;
(4) a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 87;
(5) a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 88;
(6) a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 89; and (7) a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 90;
An antibody having
The antibody according to any one of claims 28 to 31, which is a humanized antibody.
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