JP2007215416A - Knot-specific gene expression promotor of plant and utilization of the same - Google Patents

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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a promotor of a plant, knot-specifically regulating the expression of a gene, an expression vector containing the promotor, a transformed plant or plant body containing the expression vector, a method for producing them, and a method for expressing a desired gene at the knot by using the promotor. <P>SOLUTION: This DNA is provided by consisting of a specific base sequence and having a potent promotor activity at the knot and between the knots of a rice plant. By preparing a structural body of joining the DNA with a GA2 oxidase gene and introducing the same into the rice plant, the rice plant presents a semi-dwarf character, and it is possible to increase its yield. Also, by a promotor analysis by using a GUS gene, it is possible to strongly express the GUS gene at the knot under the regulation of the above DNA, and also it is possible to utilize the promotor DNA for expressing the desired gene at the knot of the plant. <P>COPYRIGHT: (C)2007,JPO&INPIT

Description

本発明は、植物の節においてプロモーター活性を有するDNA、および該DNAを利用し、植物の節において外来遺伝子を発現させる方法に関する。   The present invention relates to DNA having promoter activity in a plant section, and a method for expressing a foreign gene in a plant section using the DNA.

イネ等の作物に半矮性形質を導入すると、倒伏しにくくなり、耐肥性が増す。また、半矮性形質の導入は茎葉に対する子実の割合が高くなるために、より多収性となる。実際、緑の革命で知られるように、イネや小麦における半矮性品種の導入は単位面積あたりの収量を画期的に向上させた。   Introducing a semi-dwarf trait into crops such as rice makes it difficult to lodging and increases fertilization resistance. In addition, the introduction of semi-dwarf traits is more yielding because of the higher proportion of grain to foliage. In fact, as known in the Green Revolution, the introduction of semi-dwarf varieties in rice and wheat has dramatically improved yield per unit area.

ジベレリンは草丈の制御にかかわる植物ホルモンの一種であり、緑の革命に利用された半矮性遺伝子がジベレリンのシグナリングや生合成に関わる遺伝子をコードすることが明らかとされている（非特許文献１、２）。このことは人為的に内生ジベレリン量をコントロールしてやれば、半矮性作物を作出することが可能であることを示しており、イネにGA2酸化酵素遺伝子（OsGA2ox1）を遺伝子導入することにより、矮性植物の作出が可能であることが示された（非特許文献３、４）。GA2酸化酵素は活性型ジベレリン及びその前駆体を不活性型に代謝する酵素であり、GA2酸化酵素の遺伝子はイネでもクローニングされている（非特許文献３）。一方、ジベレリンは茎葉伸長を制御するのみならず、発芽や花芽形成など多くの生理現象の制御に関わるため、アクチンプロモーターにより構成的にOsGA2ox1を発現させたイネは種子をつけることができなくなる（非特許文献３）。坂本らは、イネ（品種：日本晴）にGA3酸化酵素遺伝子OsGA3ox2のプロモーター（D18プロモーター）の制御下でOsGA2ox1を発現させることにより、種子形成が異常になることを回避しつつ、半矮性形質を導入することを可能にした（非特許文献４）。D18プロモーターが使用されたのは、OsGA3ox2のnull突然変異体であるd18突然変異体が強い矮性を示すのに対し種子形成は正常なため、OsGA3ox2は茎葉の伸長には関わるが、生殖器官の発達には必要ではないと考えられたためである。また、OsGA3ox2の発現はジベレリンによるフィードバック制御を受けるが、D18プロモーターの利用によりジベレリンの合成と代謝に関わる酵素量のバランスをとることが可能になると考えられた。   Gibberellin is a kind of plant hormone involved in the control of plant height, and it has been clarified that the semi-fertile gene used in the green revolution encodes a gene involved in gibberellin signaling and biosynthesis (Non-Patent Document 1, 2). This indicates that if the amount of endogenous gibberellin is artificially controlled, it is possible to produce semi-dwarf crops. By introducing the GA2 oxidase gene (OsGA2ox1) into rice, It was shown that it is possible to produce (Non-Patent Documents 3 and 4). GA2 oxidase is an enzyme that metabolizes active gibberellin and its precursor to an inactive form, and the gene of GA2 oxidase has also been cloned in rice (Non-patent Document 3). On the other hand, gibberellin not only controls stem and leaf elongation, but also controls many physiological phenomena such as germination and flower bud formation, so that rice that constitutively expresses OsGA2ox1 by the actin promoter cannot seed. Patent Document 3). Sakamoto et al. Introduced semi-fertile traits in rice (variety: Nihonbare) by expressing OsGA2ox1 under the control of the GA3 oxidase gene OsGA3ox2 promoter (D18 promoter) while avoiding abnormal seed formation. (Non-patent Document 4). The D18 promoter was used because the d18 mutant, which is a null mutant of OsGA3ox2, shows strong fertility, while seed formation is normal, so OsGA3ox2 is involved in stem and leaf elongation, but development of the reproductive organs This is because it was considered unnecessary. The expression of OsGA3ox2 is subject to feedback control by gibberellin, but it was thought that the use of the D18 promoter could balance the amount of enzymes involved in the synthesis and metabolism of gibberellin.

D18プロモーターの利用により、種子形成が正常なまま半矮性形質を導入することが可能となったが、イネ（品種：どんとこい）にD18プロモーターの制御下に置いたOsGA2ox1を遺伝子導入した場合、半矮性形質の導入に伴い、種子数の減少が観察されることも報告されている（非特許文献５）。これはD18プロモーターに制御されたOsGA2ox1が穂でも作用することに起因すると考えられる。実際にOsGA3ox2は穂や花器官の発達時に発現していることが明らかとなっている（非特許文献６、７）。
Peng J, Richards DE, Hartley NM, Murphy GP, Devos KM, et al (1999) 'Green revolution' genes encode mutant gibberellin response modulators. Nature 400: 256-261 Sasaki A, Ashikari M, Ueguchi-Tanaka M, Itoh H, Nishimura A, et al (2002) A mutant gibberellin-synthesis gene in rice. Nature 416: 701-702 Sakamoto T, Kobayashi M, Itoh H, Tagiri A, Kayano T, et al (2001) Expression of a gibberellin 2-oxidase gene around the shoot apex is related to phase transition in rice. Plant Physiol. 125: 1508-1516 Sakamoto T, Morinaka Y, Ishiyama K, Kobayashi M, Itoh H, et al (2003) Genetic manipulation of gibberellin metabolism in transgenic rice. Natue Biotech. 21: 909-913 森中洋一、坂本知昭、古賀保徳、蒲池伸一郎、萱野暁明ら（2002）ジベレリン２酸化酵素遺伝子導入によるイネ矮性育種素材の開発。育種学研究 第４巻、別冊２号: 216 Kaneko M, Itoh H, Inukai Y, Sakamoto T, Ueguchi-Tanaka M, et al (2003) Where do gibberellin biosynthesis and gibberellin signaling occur in rice plants? Plant J 35: 104-115 Sakamoto T, Miura K, Itoh H, Tatsumi T, Ueguchi-Tanaka M, et al (2004) An overview of gibberellin metabolism enzyme genes and their related mutants in rice. Plant Physiol. 134: 1642-1653 The use of the D18 promoter allowed the introduction of a semi-fertile trait with normal seed formation, but when OsGA2ox1 placed under the control of the D18 promoter was introduced into rice (variety: Dontokoi), It has also been reported that a decrease in the number of seeds is observed with the introduction of fertile traits (Non-Patent Document 5). This is thought to be due to OsGA2ox1 controlled by the D18 promoter also acting in the ear. Actually, it has been revealed that OsGA3ox2 is expressed during the development of ears and flower organs (Non-patent Documents 6 and 7).
Peng J, Richards DE, Hartley NM, Murphy GP, Devos KM, et al (1999) 'Green revolution' genes encode mutant gibberellin response modulators.Nature 400: 256-261 Sasaki A, Ashikari M, Ueguchi-Tanaka M, Itoh H, Nishimura A, et al (2002) A mutant gibberellin-synthesis gene in rice.Nature 416: 701-702 Sakamoto T, Kobayashi M, Itoh H, Tagiri A, Kayano T, et al (2001) Expression of a gibberellin 2-oxidase gene around the shoot apex is related to phase transition in rice.Plant Physiol. 125: 1508-1516 Sakamoto T, Morinaka Y, Ishiyama K, Kobayashi M, Itoh H, et al (2003) Genetic manipulation of gibberellin metabolism in transgenic rice. Natue Biotech. 21: 909-913 Yoichi Morinaka, Tomoaki Sakamoto, Yasunori Koga, Shinichiro Konoike, Toshiaki Kanno et al. (2002) Development of rice dwarf breeding material by gene transfer of gibberellin oxidase. Breeding Studies Vol. 4, Supplement 2: 216 Kaneko M, Itoh H, Inukai Y, Sakamoto T, Ueguchi-Tanaka M, et al (2003) Where do gibberellin biosynthesis and gibberellin signaling occur in rice plants? Plant J 35: 104-115 Sakamoto T, Miura K, Itoh H, Tatsumi T, Ueguchi-Tanaka M, et al (2004) An overview of gibberellin metabolism enzyme genes and their related mutants in rice.Plant Physiol. 134: 1642-1653

本発明は、植物の節特異的に遺伝子発現を制御するプロモーター、該プロモーターを含有する発現ベクター、該発現ベクターを含む形質転換植物もしくは植物体、およびその製造方法、並びに、該プロモーターを用いて所望の遺伝子を節にて発現させる方法の提供を課題とする。   The present invention relates to a promoter that controls gene expression in a plant node-specific manner, an expression vector containing the promoter, a transformed plant or plant containing the expression vector, a method for producing the same, and a desired method using the promoter. It is an object of the present invention to provide a method for expressing the gene in a node.

本発明者らは、イネの節および節間にて強く発現する遺伝子のライブラリーを作製し、節および節間特異的に発現する遺伝子を同定した。そして、該遺伝子のプロモーター領域のDNAを単離することに成功した。該DNAにイネのGA2酸化酵素遺伝子(OsGA2ox1)をつないだ構造体を作製しイネに導入したところ、該イネは半矮性形質を呈し、かつ、収量性が増加することが判明した。本発明のプロモーターDNAは、特に、半矮性形質の導入に適したプロモーターであることが分った。   The present inventors made a library of genes that are strongly expressed between rice nodes and between nodes, and identified genes that are expressed specifically between nodes and between nodes. And it succeeded in isolating DNA of the promoter region of the gene. When a structure in which the rice GA2 oxidase gene (OsGA2ox1) was linked to the DNA was prepared and introduced into rice, it was found that the rice exhibited a semi-dwarf character and increased yield. It has been found that the promoter DNA of the present invention is a promoter particularly suitable for the introduction of semi-fertile traits.

また、GUS遺伝子を用いたプロモーター解析により、本発明のDNAの制御下においてGUS遺伝子が節にて非常に強く発現することが明らかとなった。即ち、本発明のプロモーターDNAは、植物の節において所望の遺伝子を発現させるために利用することが可能であることが確認された。   In addition, promoter analysis using the GUS gene revealed that the GUS gene is very strongly expressed in nodes under the control of the DNA of the present invention. That is, it was confirmed that the promoter DNA of the present invention can be used for expressing a desired gene in a plant section.

上述の如く本発明者らは、植物の節特異的に発現する遺伝子プロモーターを見出すことに成功し、本発明を完成させた。   As described above, the present inventors have succeeded in finding a gene promoter that is expressed specifically in a node of a plant, and completed the present invention.

本発明は、植物の節特異的に遺伝子発現を制御するプロモーター、該プロモーターを含有する発現ベクター、該発現ベクターを含む形質転換植物もしくは植物体、およびその製造方法、並びに、該プロモーターを用いて所望の遺伝子を節にて発現させる方法に関し、より具体的には、
〔１〕 下記の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のプロモーター活性を有するDNA、
（ａ）配列番号：１〜３のいずれかに記載の塩基配列からなるDNA
（ｂ）配列番号：１〜３のいずれかに記載の塩基配列において１もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるDNA
（ｃ）配列番号：１〜３のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下にてハイブリダイズするDNA
〔２〕 植物の節においてプロモーター活性を有することを特徴とする、〔１〕に記載のDNA、
〔３〕 前記植物がイネ科植物である、〔１〕または〔２〕に記載のDNA、
〔４〕 〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のDNAの制御下に、外来遺伝子が機能的に結合した構造を有するDNA、
〔５〕 〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載のDNAを含むベクター、
〔６〕 植物の節において外来遺伝子を発現させるためのプロモーターとして利用されるDNA薬剤であって、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のDNA、または該DNAを含むベクターを有効成分とする、遺伝子発現誘導剤、
〔７〕 〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載のDNA、または〔５〕に記載のベクターを含む、形質転換細胞、
〔８〕 微生物である、〔７〕に記載の形質転換細胞、
〔９〕 植物細胞である、〔７〕に記載の形質転換細胞、
〔１０〕 〔９〕に記載の細胞を含む、形質転換植物体、
〔１１〕 〔１０〕に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体、
〔１２〕 〔１０〕または〔１１〕に記載の形質転換植物体の繁殖材料、
〔１３〕 〔１０〕または〔１１〕に記載の形質転換植物体の作製方法であって、〔４〕に記載のDNA、または〔５〕に記載のベクターを植物細胞へ導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む方法、
〔１４〕 植物の節において外来遺伝子を発現させる方法であって、〔４〕に記載のDNA、または〔５〕に記載のベクターを該植物の細胞へ導入する工程を含む方法、
〔１５〕 外来タンパク質が節に含まれる植物の製造方法であって、〔４〕に記載のDNA、または〔５〕に記載のベクターを植物の細胞へ導入する工程を含む方法、
〔１６〕 植物の節において外来遺伝子を発現させることを特徴とする半矮性植物の製造方法であって、〔４〕に記載のDNA、または〔５〕に記載のベクターを植物の細胞へ導入する工程を含む方法、
〔１７〕 植物の節において外来遺伝子を発現させることを特徴とする収量性が向上した植物の製造方法であって、〔４〕に記載のDNA、または〔５〕に記載のベクターを植物の細胞へ導入する工程を含む方法、
〔１８〕 前記外来遺伝子がジベレリン代謝酵素遺伝子（ジベレリンの代謝に関わる酵素をコードする遺伝子）、またはジベレリン生合成酵素遺伝子の発現を抑制する遺伝子である、〔１６〕または〔１７〕に記載の方法、
〔１９〕 植物の節において外来遺伝子を発現させることを特徴とする耐病性植物の製造方法であって、〔４〕に記載のDNA、または〔５〕に記載のベクターを植物の細胞へ導入する工程を含む方法、
〔２０〕 前記外来遺伝子が、ディフェンシン遺伝子、キチナーゼ遺伝子、グルカナーゼ遺伝子、またはＢｔ遺伝子である、〔１９〕に記載の方法、
〔２１〕 下記の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のDNAのプロモーター活性を調節する化合物のスクリーニング方法、
（ａ）〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のDNAの制御下に、レポーター遺伝子が機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞または細胞抽出液と、被験化合物を接触させる工程、
（ｂ）該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程、
（ｃ）該レポーター遺伝子の発現レベルを変化させる化合物を選択する工程
を、提供するものである。 The present invention relates to a promoter that controls gene expression in a plant node-specific manner, an expression vector containing the promoter, a transformed plant or plant containing the expression vector, a method for producing the same, and a desired method using the promoter. More specifically, a method for expressing the gene of
[1] DNA having promoter activity according to any of the following (a) to (c),
(A) DNA consisting of the base sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 3
(B) DNA consisting of a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 3
(C) DNA that hybridizes under stringent conditions with the DNA comprising the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 3
[2] The DNA according to [1], which has promoter activity in a plant section,
[3] The DNA according to [1] or [2], wherein the plant is a gramineous plant,
[4] DNA having a structure in which a foreign gene is functionally linked under the control of the DNA according to any one of [1] to [3],
[5] A vector comprising the DNA according to any one of [1] to [4],
[6] A DNA drug used as a promoter for expressing a foreign gene in a plant section, wherein the DNA according to any one of [1] to [3] or a vector containing the DNA is used as an active ingredient A gene expression inducer,
[7] A transformed cell comprising the DNA according to any one of [1] to [4] or the vector according to [5],
[8] The transformed cell according to [7], which is a microorganism,
[9] The transformed cell according to [7], which is a plant cell,
[10] A transformed plant comprising the cell according to [9],
[11] A transformed plant that is a descendant or clone of the transformed plant according to [10],
[12] A propagation material for the transformed plant according to [10] or [11],
[13] A method for producing a transformed plant according to [10] or [11], wherein the DNA according to [4] or the vector according to [5] is introduced into a plant cell, A method comprising a step of regenerating a plant from
[14] A method for expressing a foreign gene in a plant section, the method comprising introducing the DNA according to [4] or the vector according to [5] into a cell of the plant,
[15] A method for producing a plant wherein a foreign protein is contained in a node, the method comprising introducing the DNA according to [4] or the vector according to [5] into a plant cell,
[16] A method for producing a semi-dwarf plant, comprising expressing a foreign gene in a plant section, wherein the DNA according to [4] or the vector according to [5] is introduced into a plant cell A method comprising steps,
[17] A method for producing a plant with improved yield, characterized by expressing a foreign gene in a plant section, wherein the DNA according to [4] or the vector according to [5] A method comprising a step of introducing into
[18] The method according to [16] or [17], wherein the foreign gene is a gibberellin metabolizing enzyme gene (a gene encoding an enzyme involved in gibberellin metabolism) or a gene that suppresses the expression of a gibberellin biosynthetic enzyme gene. ,
[19] A method for producing a disease-resistant plant characterized by expressing a foreign gene in a plant section, wherein the DNA according to [4] or the vector according to [5] is introduced into a plant cell A method comprising steps,
[20] The method according to [19], wherein the foreign gene is a defensin gene, a chitinase gene, a glucanase gene, or a Bt gene,
[21] A screening method for a compound that regulates the promoter activity of the DNA according to any one of [1] to [3], comprising the following steps (a) to (c):
(A) a step of contacting a test compound with a cell or a cell extract containing DNA having a structure in which a reporter gene is functionally linked under the control of the DNA according to any one of [1] to [3],
(B) measuring the expression level of the reporter gene;
(C) A step of selecting a compound that changes the expression level of the reporter gene is provided.

本発明によって得られた植物の節特異的に発現する遺伝子のプロモーターを利用することで、収量性を維持したまま半矮性形質を付与することが可能となった。また、半矮性形質導入により、耐肥性が増し多収性となり、収量性の向上が期待される。また、当該プロモーターを利用して耐病性の付与が可能な遺伝子を節にて発現させることにより、植物に耐病性を付与することが可能である。   By using the promoter of a plant-specific gene expressed by the present invention, it became possible to impart a semi-dwarf character while maintaining the yield. In addition, semi-fertile transduction increases fertilization resistance and yields, and is expected to improve yield. Moreover, disease resistance can be imparted to a plant by expressing a gene capable of imparting disease resistance in a node using the promoter.

以下本発明を詳細に説明する。本発明者らは、イネの節および節間で強く発現する遺伝子のcDNAライブラリーを作製し、ディファレンシャルスクリーニングにより節および節間特異的に発現する遺伝子の選抜を行った。選抜された遺伝子から、3種類のクローンSC1-34、SC1-84、SC2-34を選択した。そしてイネゲノムデータベースより、SC1-34、SC1-84、SC2-34のコーディング領域上流約2 kbpのプロモーター領域の塩基配列を調べ、プロモーター増幅用プライマーを作製し、イネ（品種：日本晴）のゲノムDNAを鋳型として、プロモーター増幅用プライマーを用いたPCRにより、各プロモーター配列の遺伝子配列を増幅し、該プロモーターDNAをクローニングすることに成功した。   The present invention will be described in detail below. The present inventors prepared a cDNA library of genes that are strongly expressed between rice nodes and between nodes, and selected genes that are specifically expressed between nodes and between nodes by differential screening. Three clones SC1-34, SC1-84, and SC2-34 were selected from the selected genes. Then, from the rice genome database, the nucleotide sequence of the promoter region about 2 kbp upstream of the coding region of SC1-34, SC1-84, and SC2-34 was examined, primers for promoter amplification were prepared, and rice (variety: Nipponbare) genomic DNA As a template, the gene sequence of each promoter sequence was amplified by PCR using a promoter amplification primer, and the promoter DNA was successfully cloned.

発明者らによって単離されたプロモーターの名称、およびその配列番号を以下に示す。
SC1-34P（配列番号：１）
SC1-84P（配列番号：２）
SC2-34P（配列番号：３） The name of the promoter isolated by the inventors and its SEQ ID NO are shown below.
SC1-34P (SEQ ID NO: 1)
SC1-84P (SEQ ID NO: 2)
SC2-34P (SEQ ID NO: 3)

本発明は、植物の節において発現プロモーター活性を有するDNAを提供する。本発明のDNAの好ましい態様としては、下記の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のプロモーター活性を有するDNAである。
（ａ）配列番号：１〜３のいずれかに記載のプロモーター活性を有するDNA
（ｂ）配列番号：１〜３のいずれかに記載の塩基配列において１もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるDNA
（ｃ）配列番号：１〜３のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下にてハイブリダイズするDNA The present invention provides a DNA having an expression promoter activity in a plant section. A preferred embodiment of the DNA of the present invention is a DNA having promoter activity described in any of the following (a) to (c).
(A) DNA having promoter activity according to any one of SEQ ID NOs: 1 to 3
(B) DNA consisting of a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 3
(C) DNA that hybridizes under stringent conditions with the DNA comprising the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 3

本発明の「プロモーター活性を有するDNA（プロモーターDNA）」とは、DNAを鋳型としたmRNAの合成（転写）の開始に必要な特定塩基配列を含むDNAを意味し、自然界に存在するDNAの他、組換えなどの人工的な改変操作により作成されたDNAを含む。
プロモーター活性は、当業者においては公知の方法（例えば、後述のレポーター遺伝子を用いて該遺伝子の発現を指標に測定する方法）によって適宜、評価することができる。 The term “DNA having promoter activity (promoter DNA)” in the present invention means DNA containing a specific base sequence necessary for initiation of mRNA synthesis (transcription) using DNA as a template, in addition to DNA existing in nature. Including DNA prepared by artificial modification such as recombination.
The promoter activity can be appropriately evaluated by those skilled in the art by a known method (for example, a method of measuring expression of the gene using a reporter gene described later as an indicator).

本発明のプロモーターDNAは、配列番号：１〜３のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAだけでなく、配列番号：１〜３のいずれかに記載の塩基配列において１もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつ植物プロモーターとして作用する能力を有するDNA、または、配列番号：１〜３のいずれかに記載の塩基配列において、その3'末端に翻訳効率を上げる塩基配列などを付加したものや、プロモーター活性を失うことなく、その5'末端を欠失したものを含む。   The promoter DNA of the present invention lacks not only DNA consisting of the base sequence described in any of SEQ ID NOs: 1 to 3, but also one or more bases in the base sequence described in any of SEQ ID NOs: 1 to 3. Increased translation efficiency at the 3 ′ end of a DNA comprising a deleted, substituted or added nucleotide sequence and having the ability to act as a plant promoter, or the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 3 Includes those with a base sequence added and those lacking the 5 ′ end without losing promoter activity.

上記DNAを調製するために、当業者によりよく知られた方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Southern, EM., J Mol Biol, 1975, 98, 503.）やポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術（Saiki, RK. et al., Science, 1985, 230, 1350.、Saiki, RK. et al., Science, 1988, 239, 487.）の他に、例えば、該DNAに対し、site-directed mutagenesis法（Kramer, W. & Fritz, HJ., Methods Enzymol, 1987, 154, 350.）により変異を導入する方法が挙げられる。   In order to prepare the DNA, methods well known by those skilled in the art include hybridization technology (Southern, EM., J Mol Biol, 1975, 98, 503.) and polymerase chain reaction (PCR) technology (Saiki, RK. Et al., Science, 1985, 230, 1350., Saiki, RK. Et al., Science, 1988, 239, 487.), for example, the site-directed mutagenesis method (Kramer , W. & Fritz, HJ., Methods Enzymol, 1987, 154, 350.).

本発明において欠失、置換等の変異が導入される塩基の数は、変異を導入されたDNAがプロモーター活性を有する限り、特に制限されないが、通常、20塩基対以内、好ましくは10塩基対以内、より好ましくは5塩基対以内、最も好ましくは3塩基対以内である。   In the present invention, the number of bases into which mutations such as deletion and substitution are introduced is not particularly limited as long as the DNA into which the mutation is introduced has promoter activity, but is usually within 20 base pairs, preferably within 10 base pairs. More preferably within 5 base pairs, most preferably within 3 base pairs.

さらに、本発明のプロモーターDNAは、配列番号：１〜３のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAを含む。ここで、ストリンジェントな条件とは、特に制限されるものではないが、例えば42℃、2×SSC（300mM NaCl、30mMクエン酸）、0.1％SDSの条件であり、好ましくは50℃、2×SSC 、0.1％SDSの条件であり、さらに好ましくは、65℃、0.1×SSCおよび0.1％SDSの条件である。これらの条件において、温度を上げる程に高い相同性を有するDNAが効率的に得られることが期待できる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。   Furthermore, the promoter DNA of the present invention includes DNA that hybridizes under stringent conditions with the DNA consisting of the nucleotide sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 1 to 3. Here, stringent conditions are not particularly limited, but are, for example, 42 ° C., 2 × SSC (300 mM NaCl, 30 mM citric acid), 0.1% SDS, preferably 50 ° C., 2 × The conditions are SSC and 0.1% SDS, and more preferably 65 ° C., 0.1 × SSC and 0.1% SDS. Under these conditions, it can be expected that DNA having high homology can be efficiently obtained as the temperature is increased. A plurality of factors such as temperature and salt concentration can be considered as factors affecting the stringency of hybridization, and those skilled in the art can realize the same stringency by appropriately selecting these factors.

本発明のプロモーターDNAは、通常、節においてプロモーター活性を有するDNAであるが、より好ましくは、節もしくは節間におけるプロモーター活性が穂における場合より強いことを特徴とするプロモーターDNAであり、節もしくは節間において実質的に有意に高い活性を示すプロモーターDNA（節特異的プロモーターDNA）である。   The promoter DNA of the present invention is usually a DNA having a promoter activity in a node, but more preferably a promoter DNA characterized in that the promoter activity between nodes or between nodes is stronger than that in ears. It is a promoter DNA (node-specific promoter DNA) that exhibits substantially significantly higher activity.

さらに本発明は、本発明のプロモーター活性を有するDNAの制御下に、外来遺伝子が機能的に結合した構造を有するDNAを提供する。本発明において外来遺伝子とは、特に制限されず、所望の遺伝子を用いることができる。
上記外来遺伝子としては、例えば、ジベレリンの代謝に関わる酵素をコードする遺伝子を挙げることができる。該遺伝子としては、「ジベレリン２酸化酵素遺伝子」を例示することができる。ジベレリンは、イネの節間を伸長させる植物ホルモンであることから、本発明のプロモーターDNAを利用して上記ジベレリン代謝酵素遺伝子を節において発現させることにより、ジベレリン含量を低下させ植物を矮化させることが可能である。 Furthermore, the present invention provides a DNA having a structure in which a foreign gene is functionally linked under the control of the DNA having the promoter activity of the present invention. In the present invention, the foreign gene is not particularly limited, and a desired gene can be used.
Examples of the foreign gene include a gene encoding an enzyme involved in gibberellin metabolism. Examples of the gene include “gibberellin dioxidase gene”. Since gibberellin is a plant hormone that extends the internodes of rice, the gibberellin metabolizing enzyme gene is expressed in the knot using the promoter DNA of the present invention to reduce the gibberellin content and hatch the plant. Is possible.

また、節においてジベレリン生合成酵素遺伝子の発現を抑制することによっても、植物を矮化させることが可能である。   It is also possible to hatch a plant by suppressing the expression of the gibberellin biosynthetic enzyme gene in the node.

即ち、ジベレリン生合成遺伝子の発現を抑制する遺伝子（アンチセンス法、コサプレッション法、RNAi法等）の導入により矮化および収量性の向上が起こることが期待される。ジベレリン生合成酵素遺伝子としては、例えば、「ジベレリン３酸化酵素遺伝子」、「ジベレリン２０酸化酵素遺伝子」、「カウレン酸酸化酵素遺伝子」、「カウレン酸化酵素遺伝子」、「カウレン合成酵素遺伝子」、「コパリルピロリン酸合成酵素遺伝子」等が挙げられる。ほかに、ブラシノステロイド生合成にかかわる酵素遺伝子の発現を抑制する遺伝子（アンチセンス法、コサプレッション法、RNAi法等）や、ブラシノステロイド受容体の発現や機能を抑制する遺伝子（アンチセンス法、コサプレッション法、RNAi法、ドミナントネガティブ）などの導入によっても矮化が可能と考えられる。ブラシノステロイドも、イネの節間を伸長させる植物ホルモンであることから、本発明のプロモーターDNAを利用して上記ブラシノステロイドの作用を抑制させる遺伝子を節において発現させることにより、植物を矮化させることが可能である。
また、上記外来遺伝子として、例えば、後述のディフェンシン遺伝子、キチナーゼ遺伝子、グルカナーゼ遺伝子、またはBt(Bacillus thuringiensis)遺伝子等も好適に示すことができる。 That is, it is expected that hatching and yield improvement will occur by introducing a gene (antisense method, cosuppression method, RNAi method, etc.) that suppresses the expression of the gibberellin biosynthesis gene. Examples of the gibberellin biosynthetic enzyme gene include “gibberellin 3 oxidase gene”, “gibberellin 20 oxidase gene”, “kaurenoic acid oxidase gene”, “kaurene oxidase gene”, “kaurene synthase gene”, “copa Ril pyrophosphate synthase gene "and the like. In addition, genes that suppress the expression of enzyme genes involved in brassinosteroid biosynthesis (antisense method, cosuppression method, RNAi method, etc.) and genes that suppress the expression and function of brassinosteroid receptors (antisense method) , Co-suppression method, RNAi method, dominant negative) can be used for hatching. Since brassinosteroids are plant hormones that extend the internodes of rice, plants are hatched by expressing genes that suppress the action of brassinosteroids in the nodes using the promoter DNA of the present invention. It is possible to make it.
In addition, as the foreign gene, for example, a defensin gene, a chitinase gene, a glucanase gene, or a Bt (Bacillus thuringiensis) gene described later can be suitably shown.

本発明における「抑制」には、標的となる遺伝子（例えば、ジベレリン生合成遺伝子等）の発現が完全に抑制されている場合、および、該遺伝子の発現量が有意に低下している場合等が含まれる。   The “suppression” in the present invention includes a case where the expression of a target gene (for example, gibberellin biosynthesis gene) is completely suppressed and a case where the expression level of the gene is significantly reduced. included.

また、本発明の上記DNAは、外来遺伝子に加えてさらにターミネーターが連結した構造であってもよい。該ターミネーターは、通常、植物由来ターミネーター（植物ターミネーター）を指し、本発明のプロモーターの近傍に配置されるDNA配列であり、例えば、カリフラワーモザイクウイルス由来のターミネーター、あるいはノパリン合成酵素遺伝子由来のターミネーター等を例示することができるが、ターミネーターとしての機能を有するものであれば、これらに特に制限されない。   The DNA of the present invention may have a structure in which a terminator is further linked in addition to a foreign gene. The terminator usually refers to a plant-derived terminator (plant terminator), which is a DNA sequence arranged in the vicinity of the promoter of the present invention. For example, a terminator derived from a cauliflower mosaic virus or a terminator derived from a nopaline synthase gene is used. Although it can illustrate, if it has a function as a terminator, it will not restrict | limit in particular in these.

本発明において「機能的に連結」とは、本発明のプロモーターDNAの制御下にある外来遺伝子が、本発明のプロモーターDNAからの転写を受けるように、該プロモーターDNAと結合している状態を指す。プロモーター活性を有するDNAおよび外来遺伝子を「機能的に連結」させることは、当業者においては一般的な遺伝子工学技術を用いて、簡便に行い得ることである。   In the present invention, “functionally linked” refers to a state in which a foreign gene under the control of the promoter DNA of the present invention is bound to the promoter DNA so as to receive transcription from the promoter DNA of the present invention. . “Functionally linking” a DNA having a promoter activity and a foreign gene can be easily performed by those skilled in the art using general genetic engineering techniques.

また本発明は、本発明のプロモーターDNAを含むベクター、本発明のDNAの制御下に外来遺伝子が機能的に結合した構造を有するDNAを含むベクター、および、本発明のプロモーターの下流に遺伝子挿入部位を有する構造のDNAを含むベクター、並びに、上記ベクターにさらにターミネーターを担持するベクターを提供する。   The present invention also includes a vector comprising the promoter DNA of the present invention, a vector comprising a DNA having a structure in which a foreign gene is functionally linked under the control of the DNA of the present invention, and a gene insertion site downstream of the promoter of the present invention. And a vector carrying a terminator on the vector.

本発明のベクターは、通常、本発明のプロモーターDNAを各種細胞内で複製可能なベクターに挿入したものである。この複製可能なベクターとしては、公知の種々のベクターを用いることができる。例えば、pUC誘導体などの大腸菌で増幅可能なベクター、pPZP2H-lacなどの大腸菌とアグロバクテリウムの双方で増幅可能なシャトルベクターなどが挙げられる。また、植物ウイルス、例えば、カリフラワーモザイクウイルスを利用することもできる。当業者においては、植物細胞内で複製可能なベクターを、各々の宿主細胞に応じて適宜選択することができる。なお、本発明のプロモーターDNAをベクターに挿入する方法は、通常の遺伝子をベクターに挿入する常法に従う。   The vector of the present invention is usually the one in which the promoter DNA of the present invention is inserted into a vector that can replicate in various cells. Various known vectors can be used as the replicable vector. Examples include vectors that can be amplified in E. coli such as pUC derivatives, shuttle vectors that can be amplified in both E. coli and Agrobacterium, such as pPZP2H-lac. Also, plant viruses such as cauliflower mosaic virus can be used. A person skilled in the art can appropriately select a vector capable of replicating in a plant cell according to each host cell. In addition, the method for inserting the promoter DNA of the present invention into a vector follows the usual method for inserting a normal gene into the vector.

本発明のプロモーターDNAが適用可能な植物としては、特に制限されないが、例えば、イネ科植物を挙げることができる。イネ化植物の例としては、イネ、コムギ、オオムギ、トウモロコシやシバ等が挙げられる。   The plant to which the promoter DNA of the present invention can be applied is not particularly limited, and examples thereof include grasses. Examples of rice plants include rice, wheat, barley, corn, and buckwheat.

イネの茎は節と節間の区別が明瞭でとくに稈と呼ばれ、節間伸長により稈が伸びる。このような茎の構造・発生様式はイネ科に特徴的である。本発明のプロモーターはイネの節での遺伝子発現を制御するものであるが、イネの茎と同様の構造・発生様式を示すイネ科植物でも本発明のプロモーターが節発現プロモーターとして機能するものと考えられる。   Rice stalks are clearly distinguished from each other by nodes and are called cocoons. Such stem structure / development pattern is characteristic of Gramineae. Although the promoter of the present invention controls gene expression in rice nodes, it is considered that the promoter of the present invention functions as a node expression promoter even in gramineous plants showing the same structure and developmental pattern as rice stalks. It is done.

また本発明は、本発明のプロモーターDNA、または該DNAを有するベクターを含む、形質転換細胞を提供する。
本発明の細胞は特に制限されるものではないが、好ましくは微生物細胞あるいは植物細胞である。 The present invention also provides a transformed cell comprising the promoter DNA of the present invention or a vector having the DNA.
The cell of the present invention is not particularly limited, but is preferably a microbial cell or a plant cell.

本発明の形質転換植物細胞は、本発明のDNAもしくはベクターを宿主細胞に導入し、形質転換させた植物細胞である。宿主細胞としては、例えば葉、根、茎、花および種子中の胚盤等の植物細胞、カルス、懸濁培養細胞等が挙げられる。細胞の由来する植物種としては、特に制限されるものではないが、例えば、イネ科の植物が好ましい。イネ科の植物としては、例えば、イネ、コムギ、オオムギ、トウモロコシ、シバ等が挙げられる。尚、本発明における最も好ましい例として、イネを挙げることができる。   The transformed plant cell of the present invention is a plant cell transformed by introducing the DNA or vector of the present invention into a host cell. Examples of host cells include plant cells such as scutellum in leaves, roots, stems, flowers and seeds, callus, suspension culture cells and the like. Although it does not restrict | limit especially as a plant species from which a cell originates, For example, the plant of Gramineae is preferable. Examples of gramineous plants include rice, wheat, barley, corn, and buckwheat. In addition, rice can be mentioned as the most preferable example in this invention.

また本発明は、本発明のDNAまたはベクターを植物細胞へ導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む方法を提供する。
本発明のDNAもしくはベクターを宿主植物細胞中に導入するために、さまざまな手法を用いることができる。これらの手法には、形質転換因子としてアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)または、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）を用いたT-DNAによる植物細胞の形質転換、プロトプラストへの直接導入(インジェクション法、エレクトロポレーション法など)、パーティクルガン法などや、その他の公知の方法が含まれる。 The present invention also provides a method comprising the steps of introducing the DNA or vector of the present invention into a plant cell and regenerating the plant from the plant cell.
Various techniques can be used to introduce the DNA or vector of the present invention into a host plant cell. These methods include transformation of plant cells with T-DNA using Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes as a transforming factor, and direct introduction into protoplasts (injection). Method, electroporation method, etc.), particle gun method, and other known methods.

また、本発明のDNAまたはベクターを導入する植物細胞は、外植片の細胞であってもよく、これらの植物細胞から培養細胞を調製し、得られた培養細胞に導入してもよい。例えば葉、根、茎、花および種子中の胚盤等の植物細胞、プロトプラスト、カルス、懸濁培養細胞等が挙げられる。   The plant cell into which the DNA or vector of the present invention is introduced may be an explant cell, or a cultured cell may be prepared from these plant cells and introduced into the obtained cultured cell. Examples thereof include plant cells such as scutellum in leaves, roots, stems, flowers and seeds, protoplasts, callus, suspension cultured cells and the like.

プロトプラストへの直接導入では、通常、特別に必要とされるベクターはない。例えば、pUC誘導体のような単純なプラスミドを用いることができる。目的の遺伝子を植物細胞に導入する方法によっては、他のDNA配列が必要になることもある。例えばTiまたはRiプラスミドを植物細胞の形質転換に用いる場合には、TiおよびRiプラスミドのT-DNA領域の少なくとも右端の配列、大抵は両側の端の配列を、導入されるべき遺伝子の隣接領域となるように接続しなければならない。   For direct introduction into protoplasts, there are usually no specially required vectors. For example, a simple plasmid such as a pUC derivative can be used. Depending on the method of introducing the gene of interest into the plant cell, other DNA sequences may be required. For example, when a Ti or Ri plasmid is used for transformation of plant cells, at least the rightmost sequence of the T-DNA region of the Ti and Ri plasmids, usually the sequences on both ends, are adjacent to the adjacent region of the gene to be introduced. Must be connected so that

アグロバクテリウム属菌を形質転換に用いる場合には、導入すべき遺伝子を、特別のプラスミド、すなわち中間ベクターまたはバイナリーベクターの中にクローニングする必要がある。中間ベクターはアグロバクテリウム属菌の中では複製されない。中間ベクターは、ヘルパープラスミドあるいはエレクトロポレーションによってアグロバクテリウム属菌の中に移行される。中間ベクターは、T-DNAの配列と相同な領域をもつため、相同的組換えによって、アグロバクテリウム属菌のTiまたはRiプラスミド中に取り込まれる。宿主として使われるアグロバクテリウム属菌には、vir領域が含まれている必要がある。通常TiまたはRiプラスミドにvir領域が含まれており、その働きにより、T-DNAを植物細胞に移行させることができる。   When Agrobacterium is used for transformation, it is necessary to clone the gene to be introduced into a special plasmid, that is, an intermediate vector or a binary vector. Intermediate vectors are not replicated in Agrobacterium. The intermediate vector is transferred into Agrobacterium by a helper plasmid or electroporation. Since the intermediate vector has a region homologous to the sequence of T-DNA, it is incorporated into an Agrobacterium Ti or Ri plasmid by homologous recombination. Agrobacterium used as a host must contain a vir region. Usually, the Ti or Ri plasmid contains the vir region, and T-DNA can be transferred to plant cells by its function.

一方、バイナリーベクターはアグロバクテリウム属菌の中で複製、維持され得るので、ヘルパープラスミドあるいはエレクトロポレーション法あるいは凍結溶解法によってアグロバクテリウム属菌中に取り込まれると、宿主のvir領域の働きによって、バイナリーベクター上のT-DNAを植物細胞に移行させることができる。
なお、このようにして得られた中間ベクターまたはバイナリーベクター、およびこれを含む大腸菌やアグロバクテリウム属菌等の微生物も本発明の対象である。 On the other hand, binary vectors can be replicated and maintained in Agrobacterium, so when incorporated into Agrobacterium by a helper plasmid, electroporation method or freeze-thaw method, the action of the host vir region The T-DNA on the binary vector can be transferred to plant cells.
The intermediate vector or binary vector thus obtained and microorganisms such as Escherichia coli and Agrobacterium belonging to the vector are also objects of the present invention.

また、本発明のDNAもしくはベクターの導入によって形質転換された植物細胞を効率的に選択するために、上記ベクターは、適当な選抜マーカー遺伝子を含む、もしくは選抜マーカー遺伝子を含むプラスミドベクターとともに植物細胞へ導入することが好ましい。この目的に使用される選抜マーカー遺伝子は、例えば、抗生物質ハイグロマイシン耐性であるハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、カナマイシンまたはゲンタマイシン耐性であるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、および除草剤ホスフィノスリシン耐性であるアセチルトランスフェラーゼ遺伝子等を挙げることができる。   In addition, in order to efficiently select plant cells transformed by introduction of the DNA or vector of the present invention, the above vector contains an appropriate selection marker gene or a plasmid vector containing a selection marker gene into plant cells. It is preferable to introduce. Selectable marker genes used for this purpose include, for example, the hygromycin phosphotransferase gene resistant to the antibiotic hygromycin, the neomycin phosphotransferase resistant to kanamycin or gentamicin, and the acetyltransferase gene resistant to the herbicide phosphinothricin. Can be mentioned.

上記ベクターを導入した植物細胞は、導入した選抜マーカーに応じた選抜用薬剤を含む選抜用培地に置床し培養する。これにより、形質転換された植物細胞を得ることができる。   Plant cells into which the vector has been introduced are placed on a selection medium containing a selection agent according to the introduced selection marker and cultured. Thereby, transformed plant cells can be obtained.

本発明の形質転換植物体とは、本発明の形質転換植物細胞から再生された形質転換植物体である。形質転換された植物細胞から個体を再生する方法は植物細胞の種類により異なるが、例えばイネではFujimuraら（Fujimuraら(1995), PlantTissue Culture Lett., vol.2:p74-）の方法、トウモロコシでは、Shillitoら（Shillitoら(1989), Bio/Technology, vol.7:p581-）の方法、ジャガイモでは、Visserら（Visserら(1989), Theor. Appl. Genet., vol.78:p589-）の方法、シロイヌナズナではAkamaらの方法（Akamaら(1992), Plant Cell Rep., vol.12:p7-）が挙げられる。これらの方法により作出された形質転換植物体またはその繁殖材料（例えば種子、果実、塊茎、切穂、塊根、株、カルス、プロトプラストなど）から得た形質転換植物体も本発明の対象である。一旦、染色体内に本発明のプロモーター(DNA)が導入された形質転換植物体が得られれば、該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。   The transformed plant of the present invention is a transformed plant regenerated from the transformed plant cell of the present invention. The method of regenerating an individual from transformed plant cells varies depending on the type of plant cell. For example, the method of Fujimura et al. (Fujimura et al. (1995), PlantTissue Culture Lett., Vol.2: p74-) is used for rice, , Shillito et al. (Shillito et al. (1989), Bio / Technology, vol.7: p581-), in potatoes, Visser et al. (Visser et al. (1989), Theor. Appl. Genet., Vol.78: p589-) In Arabidopsis, the method of Akama et al. (Akama et al. (1992), Plant Cell Rep., Vol. 12: p7-) can be mentioned. A transformed plant produced by these methods or a propagation material thereof (for example, seed, fruit, tuber, cut ear, tuberous root, strain, callus, protoplast, etc.) is also an object of the present invention. Once a transformed plant having the promoter (DNA) of the present invention introduced into its chromosome is obtained, offspring can be obtained from the plant by sexual reproduction or asexual reproduction. It is also possible to obtain a propagation material from the plant body, its descendants or clones, and mass-produce the plant body based on them.

本発明の植物体を作製する方法の好ましい態様においては、本発明のDNAまたはベクターを宿主細胞に導入して形質転換植物細胞を得て、該形質転換植物細胞から形質転換植物体を再生し、得られた形質転換植物体から植物種子を得て、該植物種子から植物体を生産する工程を含む。   In a preferred embodiment of the method for producing a plant of the present invention, a transformed plant cell is obtained by introducing the DNA or vector of the present invention into a host cell, and the transformed plant cell is regenerated from the transformed plant cell. A step of obtaining a plant seed from the obtained transformed plant body and producing the plant body from the plant seed is included.

植物体の再生は植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である（Toki. et al., Plant Physiol, 1995, 100, 1503-1507.）。例えばイネにおいては、形質転換植物体を作出する手法については、ポリエチレングリコールによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（インド型イネ品種が適している）を再生させる方法（Datta, S K. et al., In Gene Transfer To Plants (Potrykus I and Spangenberg Eds.), 1995, 66-74.）、電気パルスによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（日本型イネ品種が適している）を再生させる方法（Toki. et al., Plant Physiol, 1992, 100, 1503-1507.）、パーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し、植物体を再生させる方法（Christou, et al., Bio/technology, 1991, 9, 957-962.）およびアグロバクテリウムを介して遺伝子を導入し、植物体を再生させる方法（Hiei. et al., Plant J, 1994, 6, 271-282.）等、いくつかの技術が既に確立し、本願発明の技術分野において広く用いられている。本発明においては、これらの方法を好適に用いることができる。形質転換細胞から再生させた植物体は、次いで順化用培地で培養する。その後、順化した再生植物体を、通常の栽培条件で栽培すると、植物体が得られ、成熟して結実して種子を得ることができる。   Plant regeneration can be performed by methods known to those skilled in the art depending on the type of plant cells (Toki. Et al., Plant Physiol, 1995, 100, 1503-1507.). For example, in rice, as a method for producing a transformed plant body, a method of regenerating a plant body (suitable for Indian rice varieties) by introducing a gene into protoplasts using polyethylene glycol (Datta, S K. et al. , In Gene Transfer To Plants (Potrykus I and Spangenberg Eds.), 1995, 66-74., Gene transfer to protoplasts by electric pulses to regenerate plants (Japanese rice varieties are suitable) (Toki et al., Plant Physiol, 1992, 100, 1503-1507.), a method of directly introducing genes into cells by the particle gun method to regenerate plants (Christou, et al., Bio / technology, 1991, 9 , 957-962.) And a method of introducing a gene through Agrobacterium to regenerate the plant body (Hiei. Et al., Plant J, 1994, 6, 271-282.) Already established and widely used in the technical field of the present invention . In the present invention, these methods can be suitably used. The plant body regenerated from the transformed cells is then cultured in an acclimation medium. Thereafter, when the acclimatized regenerated plant body is cultivated under normal cultivation conditions, the plant body is obtained, and matured and fruited to obtain seeds.

形質転換植物体から植物種子を得る工程とは、例えば、形質転換植物体を発根培地から採取し、水を含んだ土を入れたポットに移植し、一定温度下で生育させて、花を形成させ、最終的に種子を形成させる工程をいう。また、種子から植物体を生産する工程とは、例えば、形質転換植物体上で形成された種子が成熟したところで、単離して、水を含んだ土に播種し、一定温度、照度下で生育させることにより、植物体を生産する工程をいう。   The step of obtaining plant seeds from a transformed plant is, for example, collecting a transformed plant from a rooting medium, transplanting it into a pot containing water-containing soil, growing it at a constant temperature, and The step of forming and finally forming seeds. In addition, the step of producing a plant from seeds is, for example, when the seed formed on the transformed plant has matured, isolated, sown in soil containing water, and grown under constant temperature and illuminance. This is a process for producing a plant body.

なお、このように再生され、かつ栽培した形質転換植物体中の導入された外来DNAまたは核酸の存在は、公知のPCR法やサザンハイブリダイゼーション法によって、または植物体中の核酸の塩基配列を解析することによって確認することができる。この場合、形質転換植物体からのDNAまたは核酸の抽出は、公知のJ.Sambrookらの方法（Molecular Cloning, 第2版, Cold SpringHarbor laboratory Press, 1989）に準じて実施することができる。   The presence of introduced foreign DNA or nucleic acid in the transformed and cultivated transformed plant body is analyzed by a known PCR method or Southern hybridization method, or by analyzing the nucleotide sequence of the nucleic acid in the plant body. It can be confirmed by doing. In this case, extraction of DNA or nucleic acid from the transformed plant body can be performed according to a known method of J. Sambrook et al. (Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor laboratory Press, 1989).

本発明のDNAには、天然あるいは単離・精製されたゲノムDNA、および化学合成DNAが含まれる。ゲノムDNAの調製は、当業者にとって常套手段を利用して行うことが可能である。
本発明のDNAは、目的とする植物、例えば、イネの組織よりゲノムDNAを抽出し精製し、得られたDNAを鋳型としてPCRによって単離することができる。 The DNA of the present invention includes natural or isolated / purified genomic DNA and chemically synthesized DNA. Genomic DNA can be prepared by those skilled in the art using conventional means.
The DNA of the present invention can be isolated by PCR by extracting and purifying genomic DNA from the target plant, for example, rice tissue, and using the obtained DNA as a template.

本発明における、配列番号：１〜３のいずれかに記載の塩基配列からなるDNA、およびこれとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするプロモーター活性を有するDNAを単離するためには、例えば、配列番号：１〜３のいずれかに記載の塩基配列からなるDNA上の配列であって、本発明のプロモーターDNAを増幅するためのプライマーセットを用いることができる。このプライマーセットを用いて、植物のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行い、その後、得られた増幅DNA断片をプローブとして用いて、同じ植物のゲノムライブラリーをスクリーニングすることができる。   In order to isolate DNA having the nucleotide sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 1 to 3 and DNA having promoter activity that hybridizes with this under stringent conditions, for example, the sequence A primer set for amplifying the promoter DNA of the present invention, which is a sequence on DNA consisting of the base sequence described in any of Nos. 1 to 3. Using this primer set, PCR can be performed using plant genomic DNA as a template, and then the obtained plant DNA library can be used as a probe to screen the same plant genomic library.

PCRは、市販のキットおよび装置の製造者の指針に基づいて行うか、当業者に周知の手法で行い得る。遺伝子ライブラリーの作製法、および遺伝子のクローニング法なども当業者に周知である。例えば、「クローニングとシークエンス」（渡辺格監修、杉浦昌弘編集、農村文化社（1989年））や、「Molecular Cloning（Sambrookら(1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press）」などの実験書を参照のこと。得られた遺伝子の塩基配列は、当該分野で公知のヌクレオチド配列解析法または市販されている自動シーケンサーを利用して決定し得る。PCR技術やハイブリダイゼーション技術によって単離し得る、配列番号：１〜３のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAとハイブリダイズするDNAもまた、本発明のDNAに含まれる。   PCR can be performed based on the manufacturer's guidelines for commercially available kits and devices, or by techniques well known to those skilled in the art. Methods for preparing gene libraries and gene cloning methods are also well known to those skilled in the art. For example, refer to experiments such as “Cloning and Sequence” (supervised by Watanabe, edited by Masahiro Sugiura, Rural Bunkasha (1989)) and “Molecular Cloning (Sambrook et al. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press)”. thing. The base sequence of the obtained gene can be determined using a nucleotide sequence analysis method known in the art or a commercially available automatic sequencer. DNA that hybridizes with DNA consisting of the base sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 3 that can be isolated by PCR technique or hybridization technique is also included in the DNA of the present invention.

上記のようなスクリーニングによって単離および同定されたプロモーターDNA（すなわち、配列番号：１〜３のいずれかに示されるプロモーター活性を有するDNA、またはそのホモログ）が節特異的遺伝子発現誘導性を示すことは、以下のようにして解析することが可能である。   Promoter DNA isolated and identified by screening as described above (that is, DNA having the promoter activity shown in any of SEQ ID NOs: 1 to 3 or a homolog thereof) exhibits node-specific gene expression inducibility. Can be analyzed as follows.

上記の配列を、例えば、βグルクロニダーゼ（GUS）などのレポーター遺伝子の上流に連結する。レポーター遺伝子としては、GUS遺伝子の他にクロラムフェニコール アセチルトランスフェラーゼ（CAT）遺伝子や、ルシフェラーゼ（LUC）遺伝子、GFP遺伝子なども利用が可能である。   The above sequence is linked upstream of a reporter gene such as, for example, β-glucuronidase (GUS). As a reporter gene, a chloramphenicol acetyltransferase (CAT) gene, a luciferase (LUC) gene, a GFP gene, and the like can be used in addition to the GUS gene.

上記のようにして作成されたキメラ遺伝子構築物は、例えば、アグロバクテリウムを介してイネなどの植物に導入してその機能を解析することが可能である。pBI-Hmをベクターとして用いた場合は、キメラ遺伝子を含む組換えプラスミドを、例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのEHA105株に凍結溶解法を用いて導入し、得られた形質転換菌を、例えば、超迅速形質転換法によりイネなどの植物体に感染させる。感染処理した植物より得られた種子を、ハイグロマイシンなど用いたベクターに適した薬剤を含む培地に播種し、得られた薬剤耐性個体を用いてGUS活性について解析する。顕微鏡で観察することにより、GUS活性が節で特異的に検出されることが期待される。   The chimeric gene construct prepared as described above can be introduced into a plant such as rice via Agrobacterium and analyzed for function. When pBI-Hm is used as a vector, a recombinant plasmid containing a chimeric gene is introduced into, for example, Agrobacterium tumefaciens strain EHA105 using a freeze lysis method. Infect plants such as rice by ultra-rapid transformation. Seeds obtained from infected plants are sown in a medium containing a drug suitable for a vector using hygromycin and the like, and GUS activity is analyzed using the obtained drug-resistant individuals. By observing under a microscope, it is expected that GUS activity is specifically detected in nodes.

本発明のプロモーターDNAまたはそれを含む発現ベクターは、以下のようにして利用することが可能である。本発明のプロモーターDNAの下流に目的の遺伝子、例えば、OsGA2ox1遺伝子を連結したキメラ遺伝子を、例えば、pBI-Hmに挿入し発現ベクターを構築する。このベクターをアグロバクテリウムを介してイネなどの植物体に導入する。得られた形質転換植物においては、本発明のプロモーターDNAの働きにより、節においてOsGA2ox1遺伝子が特異的に発現し、収量性を維持したまま半矮性化形質が導入されることが期待される。この場合、35Sプロモーター等のように不要な組織においても発現することがないため、他の好ましくない形質が現れないことが期待される。   The promoter DNA of the present invention or the expression vector containing it can be used as follows. A chimeric gene in which a target gene, for example, OsGA2ox1 gene is linked downstream of the promoter DNA of the present invention is inserted into, for example, pBI-Hm to construct an expression vector. This vector is introduced into plants such as rice through Agrobacterium. In the resulting transformed plant, it is expected that the OsGA2ox1 gene is specifically expressed in the node by the action of the promoter DNA of the present invention, and a semi-dwarfed character is introduced while maintaining the yield. In this case, since it is not expressed even in an unnecessary tissue such as a 35S promoter, it is expected that other undesirable traits will not appear.

本発明のプロモーターDNAで制御可能な遺伝子（外来遺伝子）としては、上記のOsGA2ox1遺伝子に限定されない。節において特異的に発現させたい所望の遺伝子を利用することが可能である。   The gene (foreign gene) that can be controlled by the promoter DNA of the present invention is not limited to the OsGA2ox1 gene. It is possible to utilize a desired gene that is desired to be specifically expressed in a node.

また、本発明のプロモーターDNAに他の発現制御配列を連結して本発明のプロモーターDNAの機能を改変することが可能である。このような発現制御配列としては、エンハンサー配列やリプレッサー配列などが挙げられる。例えば薬剤に応答して抑制が解除されるリプレッサー配列を本発明のプロモーターDNAと連結したキメラプロモーターを作成し、その下流に目的の遺伝子を連結した構築物を植物に導入すると、得られた形質転換体では、薬剤が存在しない条件下では目的遺伝子の発現が抑制されているが、薬剤を投与することによって抑制が解除され、目的遺伝子が節で発現するようになることが期待される。   It is also possible to modify the function of the promoter DNA of the present invention by linking other expression control sequences to the promoter DNA of the present invention. Examples of such expression control sequences include enhancer sequences and repressor sequences. For example, when a chimeric promoter in which a repressor sequence that is derepressed in response to a drug is linked to the promoter DNA of the present invention is created and a construct in which the target gene is linked downstream is introduced into a plant, the resulting transformation In the body, the expression of the target gene is suppressed under the absence of the drug. However, it is expected that the target gene is expressed in the node by releasing the suppression by administering the drug.

なお、本発明における植物細胞の形質転換方法としては、上記のアグロバクテリウムを介した方法の他に、プロトプラストに電気パルス処理してプラスミドを植物細胞へ導入するエレクトロポレーション法や、小細胞、細胞、リソソームなどとプロトプラストとの融合法、マイクロインジェクション法、ポリエチレングリコール法、あるいは、パーティクルガン法などの方法が挙げられる。   The plant cell transformation method in the present invention includes, in addition to the above-described Agrobacterium-mediated method, electroporation method in which a protoplast is electrically pulsed to introduce a plasmid into a plant cell, a small cell, Examples of the method include a fusion method of cells, lysosomes and the like with protoplasts, a microinjection method, a polyethylene glycol method, and a particle gun method.

また、植物ウイルスをベクターとして利用することによって、目的遺伝子を植物体に導入することができる。利用可能な植物ウイルスとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルスが挙げられる。すなわち、まず、ウイルスゲノムを大腸菌由来のベクターなどに挿入して組換え体を調製した後、ウイルスのゲノム中に、これらの目的遺伝子を挿入する。このようにして修飾されたウイルスゲノムを制限酵素によって該組換え体から切り出し、植物体に接種することによって、これらの目的遺伝子を植物体に導入することができる。   Moreover, a target gene can be introduced into a plant body by using a plant virus as a vector. Examples of plant viruses that can be used include cauliflower mosaic virus. That is, first, a virus genome is inserted into a vector derived from E. coli to prepare a recombinant, and then these target genes are inserted into the virus genome. These target genes can be introduced into a plant body by excising the viral genome thus modified from the recombinant with a restriction enzyme and inoculating the plant body.

また本発明は、植物の節において外来遺伝子を発現させる方法を提供する。本発明の好ましい態様においては、本発明のプロモーターDNAの制御下に外来遺伝子が機能的に結合した構造を有するDNA、または本発明のプロモーターDNAを含むベクターを該植物の細胞へ導入する工程を含む方法である。本方法においては、該DNAを、植物細胞へ導入し、該細胞を植物へ再生させることによっても行うことができる。該DNAの植物もしくは植物細胞への導入は、上述の方法によって実施することができる。   The present invention also provides a method for expressing a foreign gene in a plant section. In a preferred embodiment of the present invention, the method comprises a step of introducing a DNA having a structure in which a foreign gene is operably linked under the control of the promoter DNA of the present invention, or a vector containing the promoter DNA of the present invention, into the cells of the plant. Is the method. This method can also be carried out by introducing the DNA into plant cells and regenerating the cells into plants. The DNA can be introduced into a plant or plant cell by the above-described method.

また本発明は、外来タンパク質が節に含まれる植物の製造方法を提供する。本発明の好ましい態様においては、本発明のプロモーター活性を有するDNAの制御下に外来遺伝子が機能的に結合した構造を有するDNA、または本発明のプロモーターDNAを含むベクターを植物の細胞へ導入する工程を含む方法である。   The present invention also provides a method for producing a plant in which a foreign protein is contained in a node. In a preferred embodiment of the present invention, a step of introducing a DNA having a structure in which a foreign gene is functionally linked under the control of a DNA having a promoter activity of the present invention, or a vector containing the promoter DNA of the present invention into a plant cell. It is a method including.

また本発明は、植物の節において外来遺伝子を発現させることを特徴とする半矮性植物、収量性が向上した植物、あるいは耐病性植物の製造方法を提供する。本発明の好ましい態様においては、本発明のプロモーターDNAの制御下に外来遺伝子が機能的に結合した構造を有するDNAを植物細胞へ導入する工程を含む方法である。
上記外来遺伝子としては、例えば、OsGA2ox1遺伝子を好適に挙げることができる。 The present invention also provides a method for producing a semi-dwarf plant, a plant with improved yield, or a disease-resistant plant characterized by expressing a foreign gene in a plant section. In a preferred embodiment of the present invention, the method comprises the step of introducing into a plant cell a DNA having a structure in which a foreign gene is functionally linked under the control of the promoter DNA of the present invention.
Preferred examples of the foreign gene include the OsGA2ox1 gene.

また、耐病性植物を製造する場合には、上記外来遺伝子として、例えば、ディフェンシン遺伝子、キチナーゼ遺伝子、グルカナーゼ遺伝子、またはBt(Bacillus thuringiensis)遺伝子を挙げることができる。ディフェンシン遺伝子の発現はイネにいもち病菌や白葉枯病菌に対する複合病害抵抗性を付与することが報告されている。その他キチナーゼやグルカナーゼのような抗菌性タンパク質を本プロモーターで発現させた場合、茎での病害抵抗性が向上すると考えられ、葉で発現するプロモーター等と組み合わせることにより、更なる抵抗性を付与できると考えられる。また、Bt遺伝子を発現させることにより、茎を食害するニカメイチュウ等の害虫に対する抵抗性を付与できると考えられる。   In the case of producing a disease-resistant plant, examples of the foreign gene include a defensin gene, a chitinase gene, a glucanase gene, or a Bt (Bacillus thuringiensis) gene. Expression of the defensin gene has been reported to confer combined disease resistance to rice blast fungus and white leaf blight fungus. When antibacterial proteins such as chitinase and glucanase are expressed with this promoter, disease resistance in stems is considered to be improved, and when combined with a promoter that is expressed in leaves, further resistance can be imparted. Conceivable. In addition, expression of the Bt gene is considered to provide resistance to insect pests such as Nikameichu that damage the stem.

さらに本発明は、下記の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、本発明のプロモーターDNAのプロモーター活性を調節する化合物のスクリーニング方法を提供する。
（ａ）本発明のDNAの制御下に、レポーター遺伝子が機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞または細胞抽出液と、被験化合物を接触させる工程
（ｂ）該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｃ）該レポーター遺伝子の発現レベルを変化させる化合物を選択する工程 Furthermore, this invention provides the screening method of the compound which modulates the promoter activity of the promoter DNA of this invention including the following process (a)-(c).
(A) a step of bringing a test compound into contact with a cell or cell extract containing DNA having a structure in which a reporter gene is functionally linked under the control of the DNA of the present invention; (b) measuring the expression level of the reporter gene (C) selecting a compound that changes the expression level of the reporter gene

本発明のスクリーニング方法に用いられる被験化合物としては、特に制限はなく、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチド等の単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、原核細胞抽出物、真核単細胞抽出物もしくは動物細胞抽出物等を挙げることができる。   The test compound used in the screening method of the present invention is not particularly limited. For example, a single compound such as a natural compound, an organic compound, an inorganic compound, a protein, a peptide, and the expression product of a compound library or gene library. And cell extracts, cell culture supernatants, fermented microorganism products, marine organism extracts, plant extracts, prokaryotic cell extracts, eukaryotic single cell extracts, animal cell extracts, and the like.

本スクリーニング方法においては、まず、本発明のプロモーターDNAの制御下に、レポーター遺伝子が機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞または細胞抽出液と、被験化合物を接触させる。   In this screening method, first, a test compound is brought into contact with a cell or cell extract containing DNA having a structure in which a reporter gene is functionally bound under the control of the promoter DNA of the present invention.

本発明において、「機能的に結合した」とは、本発明のプロモーターDNAに転写因子が結合することにより、レポーター遺伝子の発現が誘導されるように、本発明のプロモーターDNAとレポーター遺伝子とが結合していることをいう。本スクリーニング方法における「本発明のプロモーターDNAの制御下に、レポーター遺伝子が機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞」として、例えば、上記DNAを含むベクターを導入した細胞を挙げることができる。該ベクターは、当業者に周知の方法により作製することができる。ベクターの細胞への導入は、一般的な方法、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法、リポフェクタミン法、マイクロインジェクション法等によって実施することができる。   In the present invention, “functionally linked” means that the promoter DNA of the present invention and the reporter gene are bound so that expression of the reporter gene is induced by binding of the transcription factor to the promoter DNA of the present invention. It means doing. Examples of the “cell containing a DNA having a structure in which a reporter gene is operably linked under the control of the promoter DNA of the present invention” in the present screening method include a cell into which a vector containing the DNA is introduced. The vector can be prepared by methods well known to those skilled in the art. Introduction of the vector into the cells can be performed by a general method such as calcium phosphate precipitation, electric pulse perforation, lipofectamine method, microinjection method and the like.

また、「本発明のプロモーターDNAの制御下に、レポーター遺伝子が機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞」には、染色体に該DNAが挿入された細胞も含まれる。染色体へのDNAの挿入は、当業者に一般的に用いられる方法、例えば、相同組み換えを利用した遺伝子導入法により行うことができる。   In addition, “a cell containing a DNA having a structure in which a reporter gene is functionally linked under the control of the promoter DNA of the present invention” also includes a cell in which the DNA is inserted into a chromosome. DNA can be inserted into a chromosome by a method generally used by those skilled in the art, for example, a gene introduction method using homologous recombination.

本方法における「本発明のプロモーターDNAの制御下に、レポーター遺伝子が機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞抽出液」とは、例えば、市販の試験管内転写翻訳キットに含まれる細胞抽出液に、本発明のプロモーターDNAとレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを添加したものを挙げることができる。   The “cell extract containing DNA having a structure in which a reporter gene is functionally bound under the control of the promoter DNA of the present invention” in this method refers to, for example, a cell extract contained in a commercially available in vitro transcription / translation kit. In addition, there may be mentioned those obtained by adding DNA having a structure in which the promoter DNA of the present invention and the reporter gene are functionally linked.

本スクリーニング方法における「接触」は、本発明のプロモーターDNAの制御下に、レポーター遺伝子が機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞の培養液に被験化合物を添加する、または該DNAを含む上記の市販された細胞抽出液に被験化合物を添加することにより行うことができる。被験化合物がタンパク質の場合には、例えば、該タンパク質をコードするDNAを含むベクターを、該細胞へ導入する、または該ベクターを該細胞抽出液に添加することで行うことも可能である。   “Contact” in the present screening method means that a test compound is added to a culture medium of a cell containing DNA having a structure in which a reporter gene is operably linked under the control of the promoter DNA of the present invention, or the above-mentioned containing the DNA. The test compound can be added to a commercially available cell extract. When the test compound is a protein, for example, a vector containing a DNA encoding the protein can be introduced into the cell, or the vector can be added to the cell extract.

本スクリーニング方法においては、次いで、該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する。レポーター遺伝子の発現レベルは、当業者においては、該レポーター遺伝子の種類を考慮して、測定することができる。   In this screening method, the expression level of the reporter gene is then measured. The expression level of the reporter gene can be measured by those skilled in the art in consideration of the type of the reporter gene.

本スクリーニング方法においては、被験化合物の非存在下において測定した場合（対照）と比較して、被験化合物がレポーター遺伝子の発現レベルを変化させた場合に、被験化合物が本発明のDNAのプロモーター活性を調節する化合物であると判定される。   In this screening method, the test compound exhibits the promoter activity of the DNA of the present invention when the test compound changes the expression level of the reporter gene as compared with the case where the test compound is measured in the absence (control). It is determined that the compound is a modulating compound.

さらに、本発明においては、上記スクリーニング方法を利用して、複数の被験化合物について、本発明のDNAのプロモーター活性を調節するか否かを評価し、プロモーター活性を調節する化合物を選択することにより、効率的にプロモーター活性を調節する化合物をスクリーニングすることができる。該スクリーニング方法によって取得される化合物は、遺伝子の節特異的な発現を制御することが可能であり、非常に有用である。
また、本発明のDNAもしくはベクターを、所望の植物体へ導入することにより、節において外来遺伝子の発現を誘導させることが可能である。 Furthermore, in the present invention, using the screening method described above, for a plurality of test compounds, whether or not to regulate the promoter activity of the DNA of the present invention, and by selecting a compound that regulates the promoter activity, Compounds that efficiently modulate promoter activity can be screened. The compound obtained by the screening method can control the node-specific expression of a gene and is very useful.
In addition, by introducing the DNA or vector of the present invention into a desired plant body, it is possible to induce the expression of a foreign gene in a node.

従って本発明は、植物の節において外来遺伝子を発現させるためのプロモーターとして利用されるDNA薬剤であって、本発明のプロモーターDNA、または該DNAを含むベクターを有効成分とする、遺伝子発現誘導剤を提供する。   Therefore, the present invention provides a DNA agent used as a promoter for expressing a foreign gene in a plant section, the gene expression inducer comprising the promoter DNA of the present invention or a vector containing the DNA as an active ingredient. provide.

本発明における「遺伝子発現誘導剤」は、所望の外来遺伝子を植物の節において発現させることを用途とする、本発明のDNAもしくはベクターを有効成分とする物質、または組成物（混合物）を指す。   The “gene expression inducer” in the present invention refers to a substance or composition (mixture) containing the DNA or vector of the present invention as an active ingredient for use in expressing a desired foreign gene in a plant section.

本発明の薬剤においては、有効成分であるDNAまたはベクター以外に、例えば、滅菌水、生理食塩水、植物油、界面活性剤、脂質、溶解補助剤、緩衝剤、保存剤等が必要に応じて混合されていてもよい。   In the drug of the present invention, in addition to DNA or vector as an active ingredient, for example, sterilized water, physiological saline, vegetable oil, surfactant, lipid, solubilizer, buffer, preservative, etc. are mixed as necessary. May be.

本発明の上記スクリーニング方法によって取得される化合物は、例えば、気象条件や肥料等の栽培条件により、徒長もしくは矮化しすぎた場合に、本発明のプロモーターの活性を制御可能な化合物として有用である。該化合物を植物に添加することによって、栽培現場において草丈の調節が可能になると考えられる。また、シバ等の長さの調節にも利用可能である。   The compound obtained by the above screening method of the present invention is useful as a compound capable of controlling the activity of the promoter of the present invention when, for example, it is overgrown or hatched due to weather conditions or cultivation conditions such as fertilizer. It is considered that the plant height can be adjusted at the cultivation site by adding the compound to the plant. It can also be used to adjust the length of the shiba or the like.

以下本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。   EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention in detail, this invention is not restrict | limited to these Examples.

〔実験材料および方法〕 [Experimental materials and methods]

（１）植物材料
D18プロモーター::OsGA2ox1を導入した形質転換イネ（品種：どんとこい）の自殖後代種子（T4種子）は田中宥司博士より供与していただいた。野生型イネ（品種：日本晴及びどんとこい）と形質転換イネは２８℃の閉鎖系温室で栽培した。 (1) Plant material
Dr. Junji Tanaka provided a self-propagating seed (T4 seed) of transgenic rice (variety: Dontokoi) into which D18 promoter :: OsGA2ox1 was introduced. Wild type rice (variety: Nipponbare and Dontokoi) and transformed rice were cultivated in a closed greenhouse at 28 ° C.

（２）RNA抽出およびDNA抽出
total RNAはISOGEN（ニッポンジーン）により抽出した。Poly(A)+ RNAはPolyATtract(R) mRNA Isolation System III（Promega）によりtotal RNAより精製した。ゲノムDNAはISOPLANT II（ニッポンジーン）により抽出した。 (2) RNA extraction and DNA extraction
Total RNA was extracted with ISOGEN (Nippon Gene). Poly (A) + RNA was purified from total RNA by PolyATtract® mRNA Isolation System III (Promega). Genomic DNA was extracted by ISOPLANT II (Nippon Gene).

（３）節及び節間特異的に発現する遺伝子のクローニング
イネ（品種：日本晴）の伸長中の第２から第４節間（節を含む）より単離したpoly(A)+ RNAをdriver、全長2 cmから15 cmの発達途中の穂のpoly(A)+ RNA をtesterとして、PCR-select cDNA Subtraction kit（Clontech）により、穂に比べ節および節間で強く発現する遺伝子のcDNAライブラリーを作製した。得られたｃDNAはTOPO-TA Cloning Kit（Invitrogen）によりクローニングした。各クローンのインサートcDNA領域をPCRにより増幅し、GeneScreen Plus membrane（NEN Life Science Products）へブロッティングし、各クローンより、節及び節間特異的に発現する遺伝子のｃDNAを含むクローンを、PCR-Select Differential Screening kit（Clontech）により選抜した。プローブはtesterとdriverのcDNAそれぞれにアダプターを付加した後、PCRで増幅し、32Pで標識した。ハイブリダイゼーション及び洗浄の条件はPCR-Select Differential Screening kitのマニュアルに従った。 (3) Cloning of genes expressed specifically between nodes and internodes Driver of poly (A) + RNA isolated from the 2nd to 4th nodes (including nodes) during the elongation of rice (variety: Nipponbare) Using a poly (A) + RNA in the developing ear with a total length of 2 cm to 15 cm as a tester, a cDNA library of genes that are strongly expressed between nodes and between nodes using the PCR-select cDNA Subtraction kit (Clontech) Produced. The obtained cDNA was cloned by TOPO-TA Cloning Kit (Invitrogen). The insert cDNA region of each clone was amplified by PCR, blotted to a GeneScreen Plus membrane (NEN Life Science Products), and a clone containing the cDNA of a gene expressed specifically between nodes and between nodes was selected from each clone by PCR-Select Differential. Selected with Screening kit (Clontech). Probes were amplified by PCR after adding an adapter to each of tester and driver cDNAs and labeled with 32 P. Hybridization and washing conditions were in accordance with the PCR-Select Differential Screening kit manual.

（４）RNA gel blot分析
total RNAは0.66 Mフォルムアルデヒドを含む1.2 %アガロースゲルを用いた電気泳動で分離した後、GeneScreen Plus membrane（NEN Life Science Products）へブロッティングした。各cDNAプローブはEcoRIで切断したプラスミドの電気泳動ゲルより精製し、Multiprime DNA Labeling System (Amersham)により[α-32P]dCTPを用いて標識した。ハイブリダイゼーションはマニュアルの条件に従い、洗浄は2 x SSC、室温で５分間を２回、2 x SSC、1% SDS、65℃、30分を２回行った。 (4) RNA gel blot analysis
Total RNA was separated by electrophoresis using 1.2% agarose gel containing 0.66 M formaldehyde, and then blotted onto GeneScreen Plus membrane (NEN Life Science Products). Each cDNA probe was purified from an electrophoresis gel of a plasmid cleaved with EcoRI and labeled with [α- 32 P] dCTP by Multiprime DNA Labeling System (Amersham). Hybridization was performed according to the conditions of the manual, and washing was performed at 2 × SSC, twice for 5 minutes at room temperature, and twice at 2 × SSC, 1% SDS, 65 ° C. for 30 minutes.

（５）プロモーターのクローニング
イネゲノムのデータベースを基に、プロモーター配列を増幅するためのSC1-34プロモーター増幅用プライマー[5'-gaagctttgtgtggtcggtgcagtagtagt-3'（配列番号：４）及び5'-agtcgaccattggtgagacgcggccaagat-3'（配列番号：５）]、SC1-84プロモーター増幅用プライマー[5'-ataagcttgcagtgctgaacaaggcccttca-3'（配列番号：６）及び5'-tggtcgacggttgctttgctgttcttgttct-3'（配列番号：７）]、SC2-34プロモーター増幅用プライマー[5'-ataagcttttccatctcgcagtggcctgtggta-3'（配列番号：８）及び5'-aatctagatggctgcaaatgaagaagtgtctct-3'（配列番号：９）]を作製した。各プロモーターはイネ（品種：日本晴）のゲノムDNAを鋳型としてPCRにより増幅した。PCRはKOD-Plus DNA polymerase (TOYOBO)を用いて行った。PCR産物はTOPO-TA Cloning Kit（Invitrogen）によりクローニングし、塩基配列決定を行い、PCRエラーが無いことを確認した。 (5) Cloning of promoter SC1-34 promoter amplification primer [5'-gaagctttgtgtggtcggtgcagtagtagt-3 '(SEQ ID NO: 4) and 5'-agtcgaccattggtgagacgcggccaagat-3' ( SEQ ID NO: 5)], SC1-84 promoter amplification primer [5′-ataagcttgcagtgctgaacaaggcccttca-3 ′ (SEQ ID NO: 6) and 5′-tggtcgacggttgctttgctgttcttgttct-3 ′ (SEQ ID NO: 7)], SC2-34 promoter amplification Primers [5′-ataagcttttccatctcgcagtggcctgtggta-3 ′ (SEQ ID NO: 8) and 5′-aatctagatggctgcaaatgaagaagtgtctctct-3 ′ (SEQ ID NO: 9)] were prepared. Each promoter was amplified by PCR using rice (variety: Nipponbare) genomic DNA as a template. PCR was performed using KOD-Plus DNA polymerase (TOYOBO). The PCR product was cloned using the TOPO-TA Cloning Kit (Invitrogen), the nucleotide sequence was determined, and it was confirmed that there were no PCR errors.

（６）形質転換用コンストラクトの作製およびイネの形質転換
レポーター遺伝子を用いた遺伝子発現解析を行うために、各プロモーター配列をそれぞれ適当な制限酵素で切り出し、pBI-HmのGUSレポーター遺伝子の前に挿入した形質転換用コンストラクト（プロモーター::GUS）を作製した。さらに、プロモーター::OsGA2ox1を作製するために、プロモーター::GUSのGUS遺伝子をOsGA2ox1に置き換えたコンストラクトを作製した。各コンストラクトをAgrobacterium tumefacience strain EHA105に導入し、超迅速形質転換法によりイネ（品種：どんとこい）に遺伝子導入を行った。再分化体はハイグロマイシンを含む培地で選抜し、選抜した個体が導入遺伝子を持つことをPCR法により確認した。形質転換体は閉鎖系温室でポット栽培し、自家受粉によりT１種子を採取した。 (6) Production of transformation construct and transformation of rice In order to analyze gene expression using a reporter gene, each promoter sequence is excised with an appropriate restriction enzyme and inserted before the GUS reporter gene of pBI-Hm. A transforming construct (promoter :: GUS) was prepared. Furthermore, in order to produce promoter :: OsGA2ox1, a construct in which the GUS gene of promoter :: GUS was replaced with OsGA2ox1 was produced. Each construct was introduced into Agrobacterium tumefacience strain EHA105, and the gene was introduced into rice (variety: Dontokoi) by ultra-rapid transformation. Redifferentiated cells were selected on a medium containing hygromycin, and it was confirmed by PCR that the selected individual had a transgene. Transformants were cultivated in pots in a closed system greenhouse and the T 1 seeds harvested by self-pollination.

（７）GUS染色
閉鎖系温室で栽培したプロモーター::GUS形質転換イネの苗条を100 mMリン酸バッファー（pH 7.0）で洗浄した。苗条をGUS染色液（0.5 mg/ml X-gluc、0.5 mM フェリシアン化カリウム、0.5 mM フェロシアン化カリウム、0.3 % Triton X-100、20 % メタノール、100 mM リン酸バッファー (pH 7.0) ）に浸し、脱気した後、37℃、一晩インキュベートした。苗条を70 % エタノールに浸し、室温で一晩脱色を行い、実態顕微鏡で観察した。 (7) GUS staining Promoters grown in a closed greenhouse were washed with 100 mM phosphate buffer (pH 7.0). Immerse the shoots in GUS stain (0.5 mg / ml X-gluc, 0.5 mM potassium ferricyanide, 0.5 mM potassium ferrocyanide, 0.3% Triton X-100, 20% methanol, 100 mM phosphate buffer (pH 7.0)) And then incubated overnight at 37 ° C. The shoots were soaked in 70% ethanol, decolorized overnight at room temperature, and observed with a microscope.

〔実施例１〕 イネの節及び節間特異的に発現する遺伝子のプロモーターのクローニング
穂に比べ、節および節間で強く発現する遺伝子のライブラリーを作製するために、約2 cmから15 cmまでの様々な長さの穂より抽出したpoly(A)+ RNAをtester、第２から第４までの節および伸長中の節間より抽出したpoly(A)+ RNAをdriverとして、suppression subtractive hybridizationを行った。得られたｃDNAをクローニングし、differential screeningにより節および節間特異的に発現する遺伝子の選抜を行った。選抜された遺伝子の発現をRNA gel blot分析により調べ、穂に比べ顕著に節及び節間で発現する３種類のクローンSC1-34、SC1-84、SC2-34を選択した（図１）。 [Example 1] Cloning of promoters of genes specifically expressed between nodes and internodes of rice To produce a library of genes that are strongly expressed between nodes and internodes compared to ears, about 2 cm to 15 cm poly extracted from bristles of varying lengths of (a) + RNA of the tester, poly extracted from internodes in section and extending from the second to the fourth of (a) + RNA as a driver, the suppression subtractive Hybridization went. The obtained cDNA was cloned, and the genes specifically expressed between nodes and between nodes were selected by differential screening. The expression of the selected gene was examined by RNA gel blot analysis, and three types of clones SC1-34, SC1-84, and SC2-34 that were significantly expressed between nodes and between the ears were selected (FIG. 1).

イネゲノムのデータベースより、SC1-34、SC1-84、SC2-34のコーディング領域上流約2 kbpのプロモーター領域の塩基配列を調べ、プロモーター増幅用プライマーを作製した。イネ（品種：日本晴）のゲノムDNAを鋳型として、プロモーター増幅用プライマーを用いたPCRにより、各プロモーター配列を遺伝子増幅し、クローニングした。クローニングしたプロモーターの配列を以下に示す。
SC1-34P（配列番号：１、全長2099 bp、カッコ内はクローニング時に付加した制限酵素サイト）
SC1-84P（配列番号：２、全長2023 bp）
SC2-34P（配列番号：３、全長2155 bp） From the rice genome database, the base sequence of the promoter region of about 2 kbp upstream of the coding region of SC1-34, SC1-84 and SC2-34 was examined, and a primer for promoter amplification was prepared. Using the genomic DNA of rice (variety: Nipponbare) as a template, each promoter sequence was amplified and cloned by PCR using primers for promoter amplification. The sequence of the cloned promoter is shown below.
SC1-34P (SEQ ID NO: 1, full length 2099 bp, parentheses are restriction enzyme sites added during cloning)
SC1-84P (SEQ ID NO: 2, full length 2023 bp)
SC2-34P (SEQ ID NO: 3, total length 2155 bp)

〔実施例２〕 プロモーターの発現解析
各プロモーターの発現制御特性を明らかにするために、各プロモーターをGUS遺伝子の上流につないだコンストラクトを作製し、イネ（品種：どんとこい）に形質転換を行った。形質転換体当代（T0）および自殖後代（T1）の稈と穂におけるGUS活性を組織化学的に調べた（図２）。稈における発現を調べた結果、SC1-34プロモーターでは、節近傍の冠根の発根部位で発現していた。SC1-84プロモーターでは節部隔壁で発現しており、SC2-34プロモーターでは節部隔壁と葉鞘枕で発現していた。一方、穂における発現はSC2-34プロモーターではまったく認められなかったが、SC1-84プロモーターでは外頴と内頴で発現しており、SC1-34プロモーターでは外頴、内頴で発現するとともに、枝梗でも発現していた。また、雌ずい及び雄ずいでは、いずれのプロモーターでも発現は認められなかった。 [Example 2] Expression analysis of promoters In order to clarify the expression control characteristics of each promoter, a construct in which each promoter was connected to the upstream of the GUS gene was prepared and transformed into rice (variety: Dontokoi). . The GUS activity in the pupae and ears of the transformant generation (T0) and the inbred progeny (T1) was examined histochemically (FIG. 2). As a result of examining the expression in the cocoon, the SC1-34 promoter was expressed at the rooting site of the crown root near the node. In the SC1-84 promoter, it was expressed in the nodal septum and in the SC2-34 promoter, it was expressed in the nodal septum and the leaf sheath pillow. On the other hand, expression in the ear was not observed at all in the SC2-34 promoter, but in the SC1-84 promoter, it was expressed in the outer and inner wings. It was also expressed in the infarction. Moreover, expression was not recognized by any promoter in the pistil and the stamen.

〔実施例３〕 GA2酸化酵素遺伝子を導入した形質転換イネの作出
SC1-34プロモーター及びSC1-84プロモーター、SC2-34プロモーターにイネのGA2酸化酵素遺伝子（OsGA2ox1）をつないだコンストラクトを作製し、イネ（品種：どんとこい）に導入した。再分化個体は導入遺伝子の存在を確認した後、成熟するまで閉鎖系温室で栽培した。SC1-34、SC1-84、SC2-34の３種類のプロモーターを用いた形質転換体の全てで、半矮性を含むさまざまなサイズの個体が得られたため、半矮性個体を選抜し、その自殖後代の種子を得た。T1植物の中で導入遺伝子の存在が確認されたものを、閉鎖系温室で栽培し、形態や収量性について調査した（表１）。また、コントロールとして、非形質転換体（品種：どんとこい）とD18プロモーターの制御下でOsGA2ox1を発現させた形質転換イネ２系統（矮性系統と半矮性系統）を同時に栽培し、系統間での比較を行った。その結果、いずれのプロモーターを用いても、OsGA2ox1を導入した半矮性形質転換イネの後代は安定した半矮性形質を示し、草丈、稈長ともに野生型に比べ短くなった（表１：野生型と形質転換イネの形態的特長）。一方、１個体当たりの総頴花数・総種子数は系統間で異なり、SC1-84プロモーターやSC2-34プロモーターの制御下でOsGA2ox1を発現させた場合、野生型に比べ、総頴花数・総種子数ともに増加するのにたいし、D18プロモーターやSC1-34プロモーターを用いた場合には、野生型と変わらない、もしくは、減少する結果となった（表１）。以上の結果は、SC1-84プロモーターやSC2-34プロモーターが、矮性形質を導入し、且つ、収量性を増加させるのに適したプロモーターであることを示している。一方、D18プロモーターやSC1-34プロモーターはともに枝梗で発現するプロモーターであり、枝梗でのOsGA2ox1の発現が頴花数および種子数の減少の一因である可能性が示唆された。 [Example 3] Production of transgenic rice introduced with GA2 oxidase gene
A construct in which the rice GA2 oxidase gene (OsGA2ox1) was connected to the SC1-34 promoter, SC1-84 promoter, and SC2-34 promoter was prepared and introduced into rice (variety: Dontokoi). After confirming the presence of the transgene, the redifferentiated individuals were cultivated in a closed greenhouse until they matured. All of the transformants using three types of promoters, SC1-34, SC1-84, and SC2-34, have obtained individuals of various sizes, including semi-fertile. Progeny seeds were obtained. The T1 plants in which the presence of the transgene was confirmed were cultivated in a closed greenhouse and examined for morphology and yield (Table 1). In addition, as a control, non-transformants (variety: Dontokoi) and two transformed rice lines (dwarf lines and semi-dwarf lines) that expressed OsGA2ox1 under the control of the D18 promoter were cultivated at the same time. Went. As a result, regardless of which promoter was used, the progeny of the semi-dwarf transgenic rice introduced with OsGA2ox1 showed a stable semi-dwarf character, and both plant height and culm length were shorter than the wild type (Table 1: Wild type and traits). Morphological features of convertible rice). On the other hand, the total number of spikelets and total seeds per individual differ between lines. When OsGA2ox1 is expressed under the control of the SC1-84 promoter or SC2-34 promoter, the total spikelet count / While the total number of seeds increased, when the D18 promoter or SC1-34 promoter was used, the results were the same as or decreased from the wild type (Table 1). The above results indicate that the SC1-84 promoter and the SC2-34 promoter are suitable promoters for introducing fertile traits and increasing yield. On the other hand, both the D18 promoter and the SC1-34 promoter are promoters expressed in branch shoots, suggesting that OsGA2ox1 expression in branch shoots may contribute to a decrease in the number of spikelets and seeds.

全てのデータは６個体の平均値±s.e.で表示している。稈長と穂長の測定は各個体あたり５つの稈で行った。野生型との間にそれぞれ５％（*）及び１％（**）水準で有意差あり（Dunnettの両側検定）。 All data are displayed as the average value ± se of 6 individuals. The measurement of culm length and panicle length was performed with 5 cocoons per individual. There is a significant difference from the wild type at 5% (*) and 1% (**) levels, respectively (Dunnett's two-sided test).

また、各プロモーターの配列をPLACE(A Database of Plant Cis-acting Regulatory DNA Elements [http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/])のPLACE Web Signal Scanにかけた。   Each promoter sequence was subjected to PLACE Web Signal Scan of PLACE (A Database of Plant Cis-acting Regulatory DNA Elements [http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/]).

〔実施例４〕 プロモーターの有効性について
RNA gel blot分析及びレポーター遺伝子（GUS遺伝子）を用いたプロモーター解析により、SC1-84プロモーター及びSC2-34プロモーターは節特異的発現を制御するプロモーターであることが明らかとなった。さらに、これらのプロモーターの制御下でGA2酸化酵素を発現させた形質転換イネは半矮性形質の導入とともに収量の増加が認められた。これらの結果より、SC1-84及びSC2-34プロモーターは、従来のプロモーターと比較して、矮性形質の導入に適したプロモーターであることが明らかとなった。 [Example 4] Effectiveness of promoter
RNA gel blot analysis and promoter analysis using a reporter gene (GUS gene) revealed that the SC1-84 promoter and the SC2-34 promoter are promoters that control node-specific expression. Furthermore, in rice plants that expressed GA2 oxidase under the control of these promoters, the yield increased with the introduction of semi-dwarfing traits. From these results, it was revealed that the SC1-84 and SC2-34 promoters are suitable promoters for introduction of fertile traits as compared to conventional promoters.

一方、GUS遺伝子を用いたプロモーター解析により、SC1-34プロモーターの制御下では穂（枝梗及び頴）でも発現が誘導されたが、RNA gel blot分析の結果、この穂での発現に比べ節で非常に強く発現することが明らかとなっている。よって、SC1-34プロモーターも含め本研究で得られたプロモーターは節での遺伝子発現に利用でき、例えば、抗菌性タンパク質などの耐病性に関わる遺伝子等を発現させることなどに利用されることが期待される。   On the other hand, promoter analysis using the GUS gene also induced expression in the ears (branch and buds) under the control of the SC1-34 promoter. It is clear that it is very strongly expressed. Therefore, the promoters obtained in this study, including the SC1-34 promoter, can be used for gene expression in nodes, and are expected to be used, for example, to express genes related to disease resistance such as antibacterial proteins. Is done.

選抜したクローンとOsGA3ox2のRNA gel blot分析結果を示す写真である。It is the photograph which shows the RNA gel blot analysis result of the selected clone and OsGA3ox2. 各器官におけるSC1-34、SC1-84、SC2-34プロモーターの制御下でのGUS活性の局在を示す写真である。It is a photograph which shows the localization of GUS activity under control of SC1-34, SC1-84, and SC2-34 promoter in each organ.

Claims (21)

下記の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のプロモーター活性を有するDNA。
（ａ）配列番号：１〜３のいずれかに記載の塩基配列からなるDNA
（ｂ）配列番号：１〜３のいずれかに記載の塩基配列において１もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるDNA
（ｃ）配列番号：１〜３のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下にてハイブリダイズするDNA DNA having promoter activity according to any of the following (a) to (c).
(A) DNA consisting of the base sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 3
(B) DNA consisting of a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 3
(C) DNA that hybridizes under stringent conditions with the DNA comprising the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 3 植物の節においてプロモーター活性を有することを特徴とする、請求項１に記載のDNA。   The DNA according to claim 1, wherein the DNA has promoter activity in a plant section. 前記植物がイネ科植物である、請求項１または２に記載のDNA。   The DNA according to claim 1 or 2, wherein the plant is a gramineous plant. 請求項１〜３のいずれかに記載のDNAの制御下に、外来遺伝子が機能的に結合した構造を有するDNA。   A DNA having a structure in which a foreign gene is functionally linked under the control of the DNA according to any one of claims 1 to 3. 請求項１〜４のいずれかに記載のDNAを含むベクター。   A vector comprising the DNA according to claim 1. 植物の節において外来遺伝子を発現させるためのプロモーターとして利用されるDNA薬剤であって、請求項１〜３のいずれかに記載のDNA、または該DNAを含むベクターを有効成分とする、遺伝子発現誘導剤。   A DNA drug used as a promoter for expressing a foreign gene in a plant section, wherein the gene according to any one of claims 1 to 3 or a vector containing the DNA is used as an active ingredient Agent. 請求項１〜４のいずれかに記載のDNA、または請求項５に記載のベクターを含む、形質転換細胞。   A transformed cell comprising the DNA according to any one of claims 1 to 4 or the vector according to claim 5. 微生物である、請求項７に記載の形質転換細胞。   The transformed cell according to claim 7, which is a microorganism. 植物細胞である、請求項７に記載の形質転換細胞。   The transformed cell according to claim 7, which is a plant cell. 請求項９に記載の細胞を含む、形質転換植物体。   A transformed plant comprising the cell according to claim 9. 請求項１０に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体。   A transformed plant that is a descendant or clone of the transformed plant according to claim 10. 請求項１０または１１に記載の形質転換植物体の繁殖材料。   The propagation material of the transformed plant body of Claim 10 or 11. 請求項１０または１１に記載の形質転換植物体の作製方法であって、請求項４に記載のDNA、または請求項５に記載のベクターを植物細胞へ導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む方法。   A method for producing a transformed plant according to claim 10 or 11, wherein the DNA according to claim 4 or the vector according to claim 5 is introduced into a plant cell, and the plant is regenerated from the plant cell. The method including the process to make. 植物の節において外来遺伝子を発現させる方法であって、請求項４に記載のDNA、または請求項５に記載のベクターを該植物の細胞へ導入する工程を含む方法。   A method for expressing a foreign gene in a plant section, comprising the step of introducing the DNA according to claim 4 or the vector according to claim 5 into a cell of the plant. 外来タンパク質が節に含まれる植物の製造方法であって、請求項４に記載のDNA、または請求項５に記載のベクターを植物の細胞へ導入する工程を含む方法。   A method for producing a plant wherein a foreign protein is contained in a node, the method comprising introducing the DNA according to claim 4 or the vector according to claim 5 into a plant cell. 植物の節において外来遺伝子を発現させることを特徴とする半矮性植物の製造方法であって、請求項４に記載のDNA、または請求項５に記載のベクターを植物の細胞へ導入する工程を含む方法。   A method for producing a semi-dwarf plant, wherein a foreign gene is expressed in a plant section, comprising the step of introducing the DNA according to claim 4 or the vector according to claim 5 into a plant cell. Method. 植物の節において外来遺伝子を発現させることを特徴とする収量性が向上した植物の製造方法であって、請求項４に記載のDNA、または請求項５に記載のベクターを植物の細胞へ導入する工程を含む方法。   A method for producing a plant with improved yield, characterized by expressing a foreign gene in a plant section, wherein the DNA according to claim 4 or the vector according to claim 5 is introduced into a plant cell. A method comprising the steps. 前記外来遺伝子がジベレリン代謝酵素遺伝子、またはジベレリン生合成酵素遺伝子の発現を抑制する遺伝子である、請求項１６または１７に記載の方法。   The method according to claim 16 or 17, wherein the foreign gene is a gene that suppresses the expression of a gibberellin metabolic enzyme gene or a gibberellin biosynthetic enzyme gene. 植物の節において外来遺伝子を発現させることを特徴とする耐病性植物の製造方法であって、請求項４に記載のDNA、または請求項５に記載のベクターを植物の細胞へ導入する工程を含む方法。   A method for producing a disease-resistant plant, characterized in that a foreign gene is expressed in a plant section, comprising the step of introducing the DNA according to claim 4 or the vector according to claim 5 into a plant cell. Method. 前記外来遺伝子が、ディフェンシン遺伝子、キチナーゼ遺伝子、グルカナーゼ遺伝子、またはＢｔ遺伝子である、請求項１９に記載の方法。   The method according to claim 19, wherein the foreign gene is a defensin gene, a chitinase gene, a glucanase gene, or a Bt gene. 下記の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、請求項１〜３のいずれかに記載のDNAのプロモーター活性を調節する化合物のスクリーニング方法。
（ａ）請求項１〜３のいずれかに記載のDNAの制御下に、レポーター遺伝子が機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞または細胞抽出液と、被験化合物を接触させる工程、
（ｂ）該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程、
（ｃ）該レポーター遺伝子の発現レベルを変化させる化合物を選択する工程 The screening method of the compound which regulates the promoter activity of DNA in any one of Claims 1-3 containing following process (a)-(c).
(A) contacting a test compound with a cell or cell extract containing DNA having a structure in which a reporter gene is functionally linked under the control of the DNA according to any one of claims 1 to 3;
(B) measuring the expression level of the reporter gene;
(C) selecting a compound that changes the expression level of the reporter gene
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